CN103739694A - 一种从白色霞水母触手中分离毒素蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种从白色霞水母触手中分离致血管通透性增大的毒素蛋白的方法。将新鲜超低温冷冻的白色霞水母触手经超低温冷冻后低温解冻，少量缓冲液冲洗，收集缓冲液离心取上清作为水母粗毒，依次经离子色谱柱和凝胶色谱柱分离，得到致血管通透性增大的毒素蛋白CnP45，分子量为45kD。本发明简化了水母毒素的提取过程，减少了杂质蛋白的干扰，为进一步分离和纯化水母毒素成分提供重要的方法指导。

Description

一种从白色霞水母触手中分离毒素蛋白的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种从白色霞水母触手中分离致血管通透性增大的毒素蛋白的方法
背景技术
白色霞水母(Cyanea nozakii Kishinouye)是我国沿海常见的灾害性水母，触手有大量的刺细胞，在受到刺激后可释放毒素，每年有大量的游客，渔民被蜇伤，受害者出现皮肤红肿，刺痛，甚至过敏死亡，因此深入研究水母毒素对水母蛰伤的防治有着重要的现实意义。水母毒素主要是蛋白类物质，其活性包括酶活性，溶血活性，肝毒性，心血管活性，致死活性，皮肤致炎活性等等。目前水母毒素研究面临的难点之一是毒素收集困难，多采用破碎刺细胞的方法进行毒素的提取，操作繁琐，耗时长，毒素不稳定易降解，且引入大量杂蛋白不利于进一步的分离纯化。
发明内容
本发明目的在于提供一种从白色霞水母触手中分离致血管通透性增大的毒素蛋白的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种从白色霞水母触手中分离毒素蛋白的方法，
1)首先制备水母粗毒:将新鲜超低温冷冻的白色霞水母触手于含NaCl的预冷缓冲液中，搅拌融化，低温离心，收集上清液，浓缩得到水母粗毒。
2）将步骤1）得到的水母粗毒经微孔滤膜过滤后，用离子色谱柱DEAESepharose Fast Flow（2.6x10cm）分离，采用分步洗脱，流速为1-3ml/min,收集900-1080ml段的洗脱液于0～6℃下用3～10K的超滤管进行浓缩；
洗脱液为含不同浓度NaCl的pH7.0～7.4Tris-HCl；
3)将步骤2）得到的浓缩液用凝胶色谱柱SephadexG-200（1.6x70cm）进行分离，以含NaCl的pH7.0～7.4Tris-HCl作为洗脱液，在0.3-0.5ml/min的流速下洗脱,收集90-120ml洗脱液，0～6℃下用3～10K的超滤管进行浓缩，得到毒素活性蛋白CnP45。
所述步骤1）白色霞水母粗毒的制备，取超低温冷冻的白色霞水母触手，0～6℃下加入触手0.5～4倍重量（m/m）的含0.1～0.3mol/L NaCl的10～30mmol/L,pH7.0～7.4Tris-HCl缓冲液，搅拌至触手融化，0～6℃下8000～15000g离心5～20min,收集上清缓冲液，0～6℃下用3～10K的超滤管进行浓缩。
所述步骤1）触手冷冻的温度为－80～－20℃，冷冻时间在24h以上。
所述步骤2）将步骤1）所得到的粗毒浓缩液过滤所用微孔滤膜孔径为0.45μm。
所述步骤2）和步骤3）的色谱柱分离均在0～6℃下进行。
将上述各步骤所得浓缩以及最终产物分别进行SDS-PAGE电泳检测其分子量和纯度；同时各步骤所得浓缩以及最终产物用伊文思蓝法检测所得毒素蛋白对小鼠背部血管通透性影响，
伊文思蓝法检测，具体方法如下：
将6只昆明鼠随机分为2组，每组3只。实验前1d，用8%硫化钠将小鼠背部脱毛。配制0.5%伊文思蓝溶液，由尾静脉注射伊文思蓝溶液5ml/Kg，5min后，空白对照组背部皮下注射0.1～0.3mol/L NaCl,10～30mmol/L,pH7.0～7.4Tris-HCl缓冲液200μL，实验组注射分离毒素蛋白200μL（0.893mg/ml），120min后，小鼠脱臼处死，取注射部位皮肤，观察伊文思蓝渗漏情况。剪取注射部位皮肤，各称取0.30g，剪碎后加入丙酮-生理盐水（7:3）溶液5ml，浸泡48h后离心（3000r/min，10min），取上清液，测定波长610nm处吸光度值（A），以检测尹文思蓝渗出量。实验结果显示实验组背部皮肤较空白对照组有明显的伊文思蓝渗出，A610值亦明显高于空白对照组，证明此蛋白有致血管通透性增大的活性。
本发明的优点：
本发明采用将超低温冷冻水母触手加入缓冲液解冻，收集缓冲液制备水母毒素的方法，无需破坏刺细胞，简化了毒素提取的过程，减少了非毒素杂蛋白的混入，有利于之后的蛋白分离纯化，且超低温环境有利于毒素活性的保持，为更好的研究水母毒素蛋白提供了重要方法指导。
进而采用本发明方法收集水母毒素，无需破坏刺细胞，简化了水母毒素提取步骤，提高了毒素纯度，有利于进一步的分离纯化；同时分离得到白色霞水母中致血管通透性增大的毒素蛋白，为进一步研究此蛋白及作用机理奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实施例提供的超低温处理前后触手刺细胞显微照片。
图2为本发明实施例提供的水母粗毒SDS-PAGE图谱。
图3为本发明实施例提供的DEAE Sepharose Fast Flow分离白色霞水母粗毒洗脱层析图及E峰SDS-PAGE图谱。
图4为本发明实施例提供的SephadexG-200分离E峰组分的洗脱层析图及最终分离得到活性蛋白SDS-PAGE图谱。
图5为本发明实施例提供的伊文思蓝法检测分离蛋白血管通透活性中小鼠背部皮肤照片及A610值对照图。
具体实施例
下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。
实施例1：
1）白色霞水母粗毒的制备：取白色霞水母触手100g,置于-80℃超低温冰箱中24h,0～6℃下加入400g含NaCl的pH7.0Tris-HCl缓冲液，NaCl浓度为0.1mol/L，pH7.0Tris-HCl浓度为10mmol/L，搅拌至触手融化，0～6℃下8000g离心5min,收集上清缓冲液，0～6℃下用3K的超滤管进行浓缩至5ml。
2）将步骤1）中所得的粗毒用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后上DEAESepharose Fast Flow（2.6x10cm）分离，采用分步洗脱，洗脱液为含不同NaCl浓度的pH7.0Tris-HCl，流速为3ml/min,收集900-1080ml段的洗脱液，0～6℃下用3K的超滤管进行浓缩至2ml。
洗脱液为分别含0、0.1、0.2、0.5mol/L的NaCl的10mmol/L,pH7.0Tris-HCl。
层析图谱参见附图3：共有7个洗脱峰，其中0.2mol/L的NaCl的10mmol/L,pH7.0Tris-HCl洗脱的150-180ml峰（E峰）为活性峰。
3）步骤2）中所得浓缩液用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后上SephadexG-200（1.6x70cm）进行分离，洗脱液为0.1mol/LNaCl,10mmol/L,pH7.0Tris-HCl，流速为0.5ml/min,收集90-120ml段的洗脱液，0～6℃下用3K的超滤管进行浓缩到1ml，得到活性蛋白CnP45。
层析图谱参加附图4：共有3个洗脱峰，其中90-120ml洗脱峰（C峰）为活性峰。
4）将步骤1），2），3）分离所得浓缩液进行SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色。
检测结果参见附图2，3b,4b：可见最终分离的蛋白成分仅显示一条45KD的蛋白条带，纯度较高。
5）采用伊文思蓝法检测上述各所得组分对小鼠背部血管通透性影响。具体方法如下：
将6只昆明鼠随机分为2组，每组3只。实验前1d，用8%硫化钠将小鼠背部脱毛。配制0.5%伊文思蓝溶液，由尾静脉注射伊文思蓝溶液5ml/Kg，5min后，空白对照组背部皮下注射含0.1mol/L NaCl,10mmol/L的pH7.0Tris-HCl缓冲液200μL，实验组注射分离毒素蛋白溶液（0.893mg/ml）200μL，120min后，小鼠脱臼处死，取注射部位皮肤，观察伊文思蓝渗漏情况。剪取注射部位皮肤，各称取0.30g，剪碎后加入丙酮-生理盐水（7:3）溶液5ml，浸泡48h后离心（3000r/min，10min），取上清液，测定波长610nm处吸光度值（A），以检测尹文思蓝渗出量
检测结果参见附图5：实验组背部皮肤较空白对照组有明显的伊文思蓝渗出，A610值亦明显高于空白对照组，证明此蛋白有致血管通透性增大的活性。
实施例2：
1）白色霞水母粗毒的制备：取白色霞水母触手150g,置于-80℃超低温冰箱中48h,0～6℃下加入300g含NaCl的pH7.1Tris-HCl缓冲液，NaCl浓度为0.15mol/L，搅拌至触手融化，0～6℃下10000g离心10min,收集上清缓冲液，0～6℃下用5K的超滤管进行浓缩至5ml。
2）将步骤1）中所得的粗毒用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后上DEAESepharose Fast Flow（2.6x10cm）分离，采用分步洗脱，洗脱液为：分别含不同NaCl浓度的15mmol/L,pH7.1Tris-HCl,流速为2.5ml/min,收集900-1080ml段的洗脱液，0～6℃下用5K的超滤管进行浓缩至2ml。
洗脱液为分别含0、0.1、0.2、0.5mol/L的NaCl的10mmol/L,pH7.1Tris-HCl。
3）步骤2）中所得浓缩液用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后上SephadexG-200（1.6x70cm）进行分离，洗脱液为含0.15mol/LNaCl,15mmol/L的pH7.1Tris-HCl，流速为0.45ml/min,收集90-120ml段的洗脱液，0～6℃下用5K的超滤管进行浓缩到1ml，得到活性蛋白CnP45。
4）伊文思蓝法检测步骤3）所得组分对小鼠背部血管通透性影响。具体方法参照实施例1,实验结果显示分离蛋白有明显致血管通透性增大的活性。
实施例3：
1）白色霞水母粗毒的制备：取白色霞水母触手200g,置于-80℃超低温冰箱中72h,0～6℃下加入300g含NaCl的pH7.2Tris-HCl缓冲液，NaCl浓度为0.2mol/L，搅拌至触手融化，0～6℃下10000g离心20min,收集上清缓冲液，0～6℃下用10K的超滤管进行浓缩至5ml。
2）将步骤1）中所得的粗毒用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后上DEAESepharose Fast Flow（2.6x10cm）分离，采用分步洗脱，洗脱液为：分别含不同NaCl浓度的20mmol/L,pH7.2Tris-HCl,流速为2ml/min,收集900-1080ml段的洗脱液，0～6℃下用10K的超滤管进行浓缩至2ml。
洗脱液为分别含0、0.1、0.2、0.5mol/L的NaCl的10mmol/L,pH7.2Tris-HCl。
3）步骤2）中所得浓缩液用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后上SephadexG-200（1.6x70cm）进行分离，洗脱液为含0.2mol/L NaCl的20mmol/L,pH7.2Tris-HCl，流速为0.4ml/min,收集90-120ml段的洗脱液，0～6℃下用10K的超滤管进行浓缩到1ml，得到活性蛋白CnP45。
4）伊文思蓝法检测步骤3）所得组分对小鼠背部血管通透性影响。具体方法参照实施例1，实验结果显示分离蛋白有明显致血管通透性增大的活性。
实施例4：
1）白色霞水母粗毒的制备：取白色霞水母触手250g,置于-80℃超低温冰箱中72h,0～6℃下加入250g含NaCl的pH7.3Tris-HCl缓冲液，NaCl浓度为0.25mol/L，搅拌至触手融化，0～6℃下10000g离心20min,收集上清缓冲液，0～6℃下用10K的超滤管进行浓缩至5ml。
2）将步骤1）中所得的粗毒用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后上DEAESepharose Fast Flow（2.6x10cm）分离，采用分步洗脱，洗脱液为：分别含不同NaCl浓度的25mmol/L,pH7.3Tris-HCl,流速为1.5ml/min,收集900-1080ml段的洗脱液，0～6℃下用10K的超滤管进行浓缩至2ml。
洗脱液为分别含0、0.1、0.2、0.5mol/L的NaCl的10mmol/L,pH7.3Tris-HCl。
3）步骤2）中所得浓缩液用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后上SephadexG-200（1.6x70cm）进行分离，洗脱液为含0.25mol/L NaCl的25mmol/L,pH7.3Tris-HCl，流速为0.35ml/min,收集90-120ml段的洗脱液，0～6℃下用10K的超滤管进行浓缩到1ml，得到活性蛋白CnP45。
4）伊文思蓝法检测步骤3）所得组分对小鼠背部血管通透性影响。具体方法参照实施例1，实验结果显示分离蛋白有明显致血管通透性增大的活性。
实施例5：
1）白色霞水母粗毒的制备：取白色霞水母触手300g,置于-80℃超低温冰箱中72h,0～6℃下加入150g含NaCl的pH7.4Tris-HCl缓冲液，NaCl浓度为0.3mol/L，搅拌至触手融化，0～6℃下10000g离心20min,收集上清缓冲液，0～6℃下用10K的超滤管进行浓缩至5ml。
2）将步骤1）中所得的粗毒用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后上DEAESepharose Fast Flow（2.6x10cm）分离，采用分步洗脱，洗脱液为：分别含不同NaCl浓度的30mmol/L,pH7.4Tris-HCl,流速为1ml/min,收集900-1080ml段的洗脱液，0～6℃下用10K的超滤管进行浓缩至2ml。
洗脱液为分别含0、0.1、0.2、0.5mol/L的NaCl的10mmol/L,pH7.4Tris-HCl。
3）步骤2）中所得浓缩液用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后上SephadexG-200（1.6x70cm）进行分离，洗脱液为含0.3mol/L NaCl的30mmol/L,pH7.4Tris-HCl，流速为0.3ml/min,收集90-120ml段的洗脱液，0～6℃下用10K的超滤管进行浓缩到1ml，得到活性蛋白CnP45。
4）伊文思蓝法检测步骤3）所得组分对小鼠背部血管通透性影响。具体方法参照实施例1，实验结果显示分离蛋白有明显致血管通透性增大的活性。

Claims (5)

1.一种从白色霞水母触手中分离毒素蛋白的方法，其特征在于：
1）首先制备水母粗毒:将新鲜超低温冷冻的白色霞水母触手于含NaCl的预冷缓冲液中，搅拌融化，低温离心，收集上清液，浓缩得到水母粗毒；
2）将步骤1）得到的水母粗毒经微孔滤膜过滤后，用离子色谱柱DEAESepharose Fast Flow分离，采用分步洗脱，流速为1-3ml/min,收集900-1080ml段的洗脱液于0～6℃下用3～10K的超滤管进行浓缩；
洗脱液为含不同浓度NaCl的pH7.0～7.4Tris-HCl；
3)将步骤2）得到的浓缩液用凝胶色谱柱SephadexG-200进行分离，以含NaCl的pH7.0～7.4Tris-HCl作为洗脱液，在0.3-0.5ml/min的流速下洗脱,收集90-120ml段的洗脱液，0～6℃下用3～10K的超滤管进行浓缩，得到毒素活性蛋白CnP45。
2.按权利要求1所述的从白色霞水母触手中分离毒素蛋白的方法，其特征在于：
所述步骤1）白色霞水母粗毒的制备，取超低温冷冻的白色霞水母触手，0～6℃下加入触手0.5～4倍重量（m/m）的含0.1～0.3mol/L NaCl的10～30mmol/L,pH7.0～7.4Tris-HCl缓冲液，搅拌至触手融化，0～6℃下8000～15000g离心5～20min,收集上清缓冲液，0～6℃下用3～10K的超滤管进行浓缩。
3.按权利要求1或2所述的从白色霞水母触手中分离毒素蛋白的方法，其特征在于：
所述步骤1）触手冷冻的温度为－80～－20℃，冷冻时间在24h以上。
4.按权利要求1所述的从白色霞水母触手中分离毒素蛋白的方法，其特征在于：
所述步骤2）将步骤1）所得到的粗毒浓缩液过滤所用微孔滤膜孔径为0.45μm。
5.按权利要求1所述的从白色霞水母触手中分离毒素蛋白的方法，其特征在于：
所述步骤2）和步骤3）的色谱柱分离均在0～6℃下进行。
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