CN101816789A - 抗蝰蛇蛇毒冻干血清及制备方法 - Google Patents

Abstract

抗蝰蛇蛇毒冻干血清及制备方法，属于生物医药制品，特别涉及抗蛇毒血清及制备工艺。本发明抗蛇毒血清与蝰蛇毒质量比15∶1能特异性中和注射小鼠蝰蛇毒；免疫扩散测定抗蝰蛇毒血清F(ab′)₂冻干品与蝰蛇毒比例8∶1出现免疫沉淀线；其它检测项符合2010年《中国药典》蛇毒抗血清质量标准。Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱层析结果检测：活性集中在洗脱1峰，小分子杂蛋白集中在穿透峰、洗脱2、洗脱3峰。本发明工艺以蝰蛇毒免疫马获得免疫血浆，经盐析制备IgG，再酶解、疏水柱纯化后得到F(ab′)₂活性片段。本发明特异性强、效价高，抗血清F(ab′)₂冻干品纯度高于85％。

Description

抗蝰蛇蛇毒冻干血清及制备方法

技术领域

本发明属于生物医药制品，特别涉及抗蛇毒血清及制备工艺。

背景技术

蝰蛇(Vipera russelli siamensi)属蝰科蝰亚科，是以血液循环毒素为主的剧毒蛇类。我国蝰蛇主要分布于广西、广东、福建和台湾。蝰蛇昼夜活动，蟠蜷成团，行动较迟缓，蛇性凶猛。蝰蛇毒主要含血循毒，有毒成分以凝血毒素为主，还有溶血毒素、纤维蛋白溶解毒素、抗凝血成分、血小板积聚变性成分、出血毒素等。人被咬伤后发病急、症状重，伤口肿痛，出血、引起血管内广泛凝血DIC危险症状，患者可因溶血而致贫血及黄疸、肾功能衰竭，甚至肺出血及脑出血；蝰蛇毒素还可损害心肌，造成中毒性心肌炎和心肌功能衰竭。蝰蛇咬伤致死率约为30％。相关技术领域中，发明申请号2005100303946“抗蝰蛇血清及其制备方法”提供了由园斑蝰蛇毒免疫马获得免疫血浆，经胃酶消化后用硫酸铵盐析法制得的液体或冻干免疫球蛋白制剂，每毫升血清可中和蝰蛇毒500LD₅₀以上，相当于4mg干毒，临床试验有效率为98.5％，治愈率达91％。即使以2010年版“中国药典”抗蛇毒血清F(ab′)₂片段纯度仅要求不低于60％。但是，园斑蝰蛇是蝰科蛇类亚种，不同亚种间抗原特异性差异较大，单一蛇毒免疫血浆生产的F(ab′)₂只能与相应抗原决定簇特异性结合，加之蝰蛇一次排毒量大，毒性强，因而其局限是明显的；而浓缩原液以氯仿为溶剂且含量较大(1.4-0.6％)以及明矾絮凝沉淀蛋白都对人体存在潜在损伤；另一方面，不仅血清水解盐析获得的成品纯度低(F(ab′)₂≥60％)导致抗体效价较低，而且，由于抗血清含有较多大分子量IgG和激活补体的Fc片段，成为临床发生抗血清过敏反应除个体差异外最主要的因素，因此，若要较彻底地去除这些导致过敏成分在制备中只利用盐析是远远不够的。

发明内容

本发明目的首先是提供一种高效价的、特异性中和蝰蛇毒的抗蝰蛇蛇毒血清，其次是提供一种利用疏水层析纯化盐析后的F(ab′)₂，可获得高纯度的F(ab′)₂制品，降低产品过敏反应发生率的精制抗蝰蛇毒血清方法。

本发明的目的通过以下方式达到：

(一)作为成品的抗蝰蛇蛇毒冻干血清

该抗蛇毒血清F(ab′)₂片段纯度大于85％，分子量为97000～110000Da。该抗蛇毒血清F(a b′)₂冻干品与蝰蛇毒质量比为15∶1(mg∶mg)时能特异性中和小鼠的蝰蛇毒。

该抗蛇毒血清免疫扩散测定抗蝰蛇毒血清F(ab′)₂冻干品与蝰蛇毒比例在8∶1以下时出现清晰的免疫沉淀线。

(二)一种制备抗蝰蛇蛇毒冻干血清的方法

制备工艺依次包括如下步骤：

(1)将至少两个产地不同亚种采集的蝰蛇毒混合作为免疫原免疫马得到具有特异性IgG血浆；

(2)取以上免疫血浆，用硫酸铵分步盐析获得IgG组分；

(3)用无菌水补I gG溶液体积，调pH值，加入胃蛋白酶水解IgG离心收集上清液即取得F(ab′)₂粗品；

(4)将以上F(ab′)₂粗品用3mo l/L的硫酸铵调节电导后到100-110ms/cm后上预先用1.2mol·L^-1硫酸铵+50mmol·^-1磷酸钠缓冲液(pH 7.0)平衡好的Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱，用该缓冲液淋洗1-3倍柱床体积后，用注射用水线性梯度(0％→100％，3倍柱床体积)洗脱，收集洗脱1峰，脱盐过滤冻干。

所述抗蛇毒血清Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱层析结果经活性和纯度检测，活性集中在洗脱1峰上，F(ab′)₂SDS-PAGE纯度大于85％；小分子杂蛋白质集中在小分子杂蛋白集中在穿透峰、洗脱2、洗脱3峰上。分离图谱如图1所示。

所述步骤(2)中是使硫酸铵终浓度为50％，待硫酸铵完全溶解后离心，取沉淀，以无菌水溶解后，加入硫酸铵，使硫酸铵的终浓度为33％，待硫酸铵完全溶解后离心，取沉淀，加入适量无菌水溶解，透析后离心，上清液经0.45μm膜过滤上层析柱进行纯化。

所述步骤(3)中是将以上IgG溶液用无菌水补体积至原血浆体积的一半，按每100mL加入0.2mL甲苯，以6mol·L^-1盐酸调pH值至3.5，按每1000mL加入0.1g胃蛋白酶，置31℃水浴4～6hr，然后以5mol·L^-1氢氧化钠调pH值至5.2，置57℃保持30min，待温度降至45℃以下后离心，上清为F(ab′)₂粗品。

所述步骤(4)将其收集活性峰产物经Sephadex G-25柱或8000-10000Da超滤膜超滤脱盐后0.22μm膜过滤除菌冻干，获得F(ab′)₂冻干品。

本发明经I gG提取、酶解及疏水柱纯化，F(ab′)₂片段纯度达85％以上，纯度超过目前国家药典60％的要求。通过实验证明：注入体内的I gG和Fc片段量减少甚多，且效价高，能够在保证疗效的同时较大幅度地降低不良反应发生率。

附图说明

图1为Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱层析结果。图中：1.穿透峰、2.洗脱1峰、3.洗脱2峰、4.洗脱3峰。

图2为疏水柱纯化后各峰SDS-PAGE图。图中：1.穿透峰、2.洗脱1峰、3.洗脱2峰、4.洗脱3峰、5.标准MK。SDS-PAGE电泳胶板用Bio-Rad Gel doc

EQ凝胶成像系统对电泳结果进行图像采集后，使用Quantity One 4.4凝胶分析软件测定。

以下结合附图进一步说明，但本发明保护范围包括但不限于以下实施例。

具体实施方式

2～3个蝰蛇亚种毒冻干品购自中国南方不同产地。

混合以上产地不同蝰蛇亚种毒冻干品，检测LD₅₀作为免疫原；免疫用马为2010年《中国药典》三部相关规定检疫合格的昆明矮种马；实验用鼠为昆明种小白鼠，SPF级，体重18-20g；胃蛋白酶经类A物质检验合格，比活1∶3000。

(一)马匹免疫及免疫血浆采集

马匹免疫前先用浓缩破伤风类毒素进行2次前期免疫，将蝰蛇蛇毒用甲醛渐进法脱毒后，加油佐剂(蛇毒浓度为0.2mg/ml)。免疫分为基础免疫与超免疫，基础免疫是按每匹马0.5ml的量注射两针，中间间隔3周，基础免疫完成后测免疫马的血浆效价，有明显抗体应答反应的马匹再进行超免疫，超免疫剂量从1ml直至7ml，剂量由小到大，免疫间隔为2周，注射部位为背部两侧肌肉。

试血及采血：(1)试血效价按1ml血浆与不同稀释度的蛇毒溶液等体积混合于37℃放置45min后接种昆明种小白鼠，腹腔注射，每个稀释度注射4只，雌雄各半，记录72h小鼠死亡情况，以能保护小鼠全部存活的一组作为其试血效价。试血效价达到1mL血浆能中和1mg蝰蛇毒；(2)I gG抗体滴度测定：以包被液稀释浓度为1％的蝰蛇蛇毒(1∶20)包被酶标板，每孔100μl，置4℃过夜，洗板3次，将原血浆以酶联免疫法稀释液按1mg/ml溶解，进行10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5……稀释后加入酶标板中，并以健康马血清稀释相同倍数作为阴性对照，37℃结合2小时后，洗板3次，再加入酶标记二抗(兔抗马HRP)，37℃结合2小时，洗板后加入底物液，显色30～45分钟后加入2mol·L^-1H₂SO₄中止反应，置自动酶标分析仪测定OD492值，以S/N≥2.1(S：样本光密度，N：阴性对照光密度)作为阳性。原血浆ELI SA结果：稀释至10^-5mg/ml时仍然为阳性。

以上两项都合格时时即可开始采血，离心分离血浆，保存于-20℃，累积几次血浆后，混合并制备。

(二)IgG的制备

取免疫马血浆，加入硫酸铵，使硫酸铵终浓度为50％，待硫酸铵全部溶解后，离心，取沉淀，以无菌水溶解后，加入硫酸铵，使硫酸铵终浓度为33％，完全溶解后离心，取沉淀，加入无菌水溶解，然后透析、离心，上清即为IgG。制备结果经薄层扫描分析，提纯的IgG电泳纯度为85％(如图1)。

(三)F(ab′)₂的粗提及纯化

制备的IgG用无菌水补体积到原血浆体积的一半，按0.2％的量加入甲苯，以6mol·L^-1HCl调pH至3.5，每1000ml加入0.1克胃酶，置31℃水浴5小时，然后以5MNaOH调pH至5.2，置57℃，30分钟，待温度降至45℃以下，离心，上清即为F(ab′)₂粗提品。得到的F(ab′)₂纯度在64.2％(如图2)。

F(ab′)₂的纯化：F(ab′)₂粗提品用3mol/L的硫酸铵调节电导后到100-110ms/cm后上预先用1.2mol·^-1硫酸铵+50mmol·L^-1磷酸钠缓冲液(pH7.0)平衡好的Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱，用该缓冲液淋洗1-3倍柱床体积后，用注射用水线性梯度(0％→100％，3倍柱床体积)洗脱，收集洗脱1峰，过滤冻干。分离图谱如图1所示。

如图2SDS-PAGE图显示：经Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱层析柱纯化的F(ab′)₂条带纯度为95.6％。

通过以上步骤，如果F(ab′)₂纯度低于85％，则进一步将F(ab′)₂粗提品经0.45μm膜滤后再以相同条件上Pheny1-Sepharose(low-sub)FF柱层析柱进行纯化，可提高F(ab′)₂纯度。

完成上述工艺后，为进一步去除细菌、小分子量杂蛋白和无机盐，将收集的活性峰产物经Sephadex G-25柱脱盐或8000-10000Kda超滤膜超滤脱盐后0.22μm膜过滤除菌再冻干以获得F(ab′)₂冻干品。

(四)抗蝰蛇蛇毒免疫血清F(ab′)₂效价测定及中和能力测定

(1)免疫扩散实验结果：纯化后的F(ab′)₂冻干品与蝰蛇毒在8∶1时出现免疫沉淀线。

(2)抗蝰蛇毒血清成品小鼠中和法测定抗体效价：采用Blliss简化机率单位法测得蝰蛇蛇毒LD₅₀为1.75μg/g。小鼠体外中和实验：所有实验小鼠腹腔注射蝰蛇毒量均为2LD₅₀，以硼酸盐缓冲溶液溶解抗血清与蛇毒，抗蝰蛇毒血清F(ab′)₂冻干品与蛇毒按质量比1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1……混合摇匀后置37℃结合45min后注射小鼠，每个稀释度注射6只，雌雄各半，腹腔注射，每只0.4ml；同法测定抗蝮蛇毒血清中和蝰蛇毒的效价；对照组为硼酸盐缓冲液与2LD₅₀蝰蛇毒作用，观察72h并记录小鼠死亡情况。结果精制的抗蝰蛇毒F(ab′)₂冻干品与蛇毒的中和比例为15∶1(mg∶mg)时，可保护小鼠100％存活，而抗蝮蛇毒血清70∶1中和蝰蛇毒的仍无法保护小鼠，

表1抗蝰蛇毒血清小鼠体外中和试验

(五)成品制备

称取16.83g精制抗蝰蛇毒血清冻干品，用305ml注射用水复溶，经0.22um膜过滤后分装，10ml/瓶，冻干。

最后制备的冻干抗蝰蛇毒血清成品经小鼠中和法检测每瓶能有效中和蝰蛇平均一次排毒量37.4mg，可以及时救助蝰蛇毒蛇伤患者。

(六)抗蝰蛇蛇毒免疫血清F(ab′)₂其它检测项目测定

按照2010年版《中国药典》抗蛇毒血清成品的其它项目按药典标准进行检测，检测检测结果见表2.

表2抗蝰蛇毒血清其它相关项目检验结果

Claims (7)

1.抗蝰蛇蛇毒冻干血清，其特征是该抗蛇毒血清F(ab′)₂片段纯度85％以上，分子量为97000～110000Da，该抗蛇毒血清F(ab′)₂冻干品与蝰蛇毒质量比为15∶1(mg∶mg)时能特异性中和小鼠的蝰蛇毒。

2.根据权利要求1所述的抗蝰蛇蛇毒冻干血清，其特征是该抗蛇毒血清免疫扩散测定抗蝰蛇毒血清F(ab′)₂冻干品与蝰蛇毒比例在8∶1以下时出现清晰的免疫沉淀线。

3.一种如权利要求1-3所述的制备抗蝰蛇蛇毒冻干血清的方法，依次包括如下步骤：

(1)将至少两个产地不同亚种采集的蝰蛇毒混合作为免疫原免疫马得到特异性IgG血浆；

(2)取以上免疫血浆，用硫酸铵分步盐析获得IgG组分；

(3)用无菌水补IgG溶液体积，调pH值，加入胃蛋白酶水解IgG离心收集上清液即取得F(ab′)₂粗品；

(4)将以上F(ab′)₂粗品用3mol/L的硫酸铵调节电导后到100-110ms/cm后上预先用1.2mol·L^-1硫酸铵+50mmol·L^-1磷酸钠缓冲液(pH 7.0)平衡好的Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱，用该缓冲液淋洗1-3倍柱床体积后，用注射用水线性梯度(0％→100％，3倍柱床体积)洗脱，收集洗脱1峰，脱盐过滤冻干。

4.根据权利要求3所述的制备抗蝰蛇蛇毒冻干血清的方法，其特征是该抗蛇毒血清Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱层析结果经活性和纯度检测，活性集中在洗脱1峰上，F(ab′)₂SDS-PAGE纯度大于85％；小分子杂蛋白质集中在小分子杂蛋白集中在穿透峰、洗脱2、洗脱3峰上。

5.根据权利要求3或4所述的制备抗蝰蛇蛇毒冻干血清的方法，其特征是在步骤(2)中使硫酸铵终浓度为50％，待硫酸铵完全溶解后离心，取沉淀，以无菌水溶解后，加入硫酸铵，使硫酸铵的终浓度为33％，待硫酸铵完全溶解后离心，取沉淀，加入适量无菌水溶解，透析后离心，上清液经0.45μm膜过滤上层析柱进行纯化。

6.根据权利要求3或4所述的制备抗蝰蛇蛇毒冻干血清的方法，其特征是在步骤(3)中将以上IgG溶液用无菌水补体积至原血浆体积的一半，按每100mL加入0.2mL甲苯，以6mol·L^-1盐酸调pH值至3.5，按每1000mL加入0.1g胃蛋白酶，置31℃水浴4～6hr，然后以5mol·L^-1氢氧化钠调pH值至5.2，置57℃保持30min，待温度降至45℃以下后离心，上清为F(ab′)₂粗品。

7.根据权利要求3或4所述的制备抗蝰蛇蛇毒冻干血清，其特征是将步骤(4)将收集活性峰产物经Sephadex G-25柱或8000-10000Da超滤膜超滤脱盐后0.22μm膜过滤除菌冻干，获得F(ab′)₂冻干品。

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