IT202000023809A1

IT202000023809A1 - Anatossine e anticorpi per l’uso nella prevenzione e nel trattamento della malattia da coronavirus.

Info

Publication number: IT202000023809A1
Application number: IT102020000023809A
Authority: IT
Inventors: Carlo Brogna
Original assignee: Craniomed Group S R L
Priority date: 2020-10-09
Filing date: 2020-10-09
Publication date: 2022-04-09
Also published as: WO2022074698A3; EP4225362A2; WO2022074698A2

Description

ANATOSSINE E ANTICORPI PER L?USO NELLA PREVENZIONE E

NEL TRATTAMENTO DELLA MALATTIA DA CORONAVIRUS

La presente invenzione riguarda anatossine e anticorpi per l?uso nella prevenzione e nel trattamento della malattia da coronavirus.

Pi? dettagliatamente l?invenzione riguarda anatossine e anticorpi per l?uso nella prevenzione e nel trattamento della malattia da coronavirus in cui dette anatossine sono tossine prodotte da una cellula in presenza di un coronavirus, come ad esempio SARS-CoV-2, e sono in grado di indurre una risposta immunogenica contro dette tossine.

E? noto che, dagli anni 1952 in poi, attraverso il modello di esperimento proposto da Alfred D. Hershey e Martha Chase, ? stato possibile individuare molti Batteriofagi (virus che infettano le cellule procariotiche). Tale metodologia risulta desueta e poco praticabile, per i rischi di gestione e smaltimento dei radioisotopi all?interno degli ambienti di ricerca. L?assenza di una metodologia analoga e rapida ha limitato nel corso degli ultimi decenni la scoperta di nuovi fagi e di virus patogeni nel regno animale, specie umana inclusa, che potessero avere anche dei meccanismi di replicazione e diffusione simile a quella dei fagi oltre le classiche vie molecolari conosciute.

Il numero di nuove sequenze di batteriofagi si ? espanso in modo significativo a seguito di molti studi metagenomici di popolazioni di fagi in ambienti diversi. La maggior parte di queste nuove sequenze non ha nessuna omologia confrontate con le sequenze nei database esistenti, ovvero sono nuove al punto che alcuni autori le indicano come "materia oscura virale? (Hatfull GF. 2015. Dark Matter of the Biosphere: the Amazing World of Bacteriophage Diversity. Journal of Virology 89(16):8107?8110. doi:10.1128/jvi.01340-15??? Inoltre, queste sequenze sono principalmente derivate da batteriofagi che inglobano un genoma a DNA (fagi), mentre sono pochi i fagi che inglobano un genoma a RNA. Nonostante i rapidi progressi nel sequenziamento ad alto consumo, pochi studi arricchiscono le conoscenze concernenti i virus a RNA e poco conosciuto ? il meccanismo probabile di trascrittasi inversa che permette la duplicazione e l?inserimento nel DNA batterico o del plasmide batterico, risultando difficile il tentativo di identificare i virus presenti in una comunit? microbica. Sarebbe quindi opportuno raccogliere le informazioni esistenti sui fagi a RNA al fine di fornire una visione completa di molte delle loro importanti caratteristiche biologiche. Ci? aiuterebbe la scoperta di nuovi fagi sulla base delle sequenze ribonucleiche e l?integrazione dei database. Tuttavia, in assenza di studi completi, ad oggi il significato biologico dei fagi di RNA ? stato ampiamente ignorato. Sebbene vi sia una notevole quantit? di letteratura e studi concernenti la componente batterica del sistema microbico intestinale, si conosce ancora relativamente poco sul viroma umano, e, in particolare, sulla frazione di batteriofago del microbioma (J. Callanan, S. R. Stockdale, A. Shkoporov, L. A. Draper, R. P. Ross, e C.

Hill, ?RNA Phage Biology in a Metagenomic Era?, Viruses, vol. 10, n. 7, 21 2018, doi: 10.3390/v10070386.).

E? noto che i virus appartamenti alla categoria coronavirus si dividono in cinque classi e molti di esse causano malattie gastrointestinali nei seguenti animali: suino, bovino, volatili.

In particolare, negli animali, il betacoronavirus si trasmette principalmente attraverso le vie respiratorie o le vie fecali-orali infettando le cellule epiteliali respiratorie (nasali, tracheali e polmonari) e intestinali (villi e cripte dell'ileo e del colon).

In caso di infezione da BCoV, la trasmissione all'interno della mandria ? generalmente rapida e gli animali infetti presentano diarrea con presenza o assenza di sangue nelle feci, febbre e sintomi respiratori da lievi a gravi.

E? stato accertato che il betacoronavirus umano, HCoV?OC43, associato al comune raffreddore, ? stato introdotto nella popolazione umana dal bovino.

Il virus SarS-CoV2 ha manifestato il suo potere negli ultimi 10 mesi. Attualmente circa 20 milioni di persone risultano conteggiate e pi? di ottocento mila sono morte in tutto il mondo.

Sono numerosi gli studi volti ad approfondire le conoscenze su questo virus al fine di comprendere il suo meccanismo di azione e trovare terapie efficaci.

Tra le conoscenze acquisite abbiamo trovato che il virus covid-19, virus ad RNA, presenta 5 sequenze di start trascrizione di Shine-Dalgarno, nel senso di ettura positivo 5?-3? di tipo ?AGGAGG? e 9 sequenze di start trascrizione del tipo ?GGAGGA?, di cui due nel verso negativo di lettura del mRNA virale 3?-5?(tabella 1).

Tabella 1

Come ? noto, Shine e Dalgarno videro che l?RNA 16 s ribosomiale riconosce la sequenza AGGAGG dell?RNA messaggero e partecipa direttamente all'inizio della biosintesi proteica formando diverse coppie di basi Watson-Crick (Steitz JA, Jakes K. How ribosomes select initiator regions in mRNA: base pair formation between the 3' terminus of 16S rRNA and the mRNA during initiation of protein synthesis in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 1975;72(12):4734?4738. doi:10.1073/pnas.72.12.4734). A parte l'abbinamento di base Shine-Dalgarno, un ulteriore sito di legame dei ribosomi, una sottosequenza di 5'-UGAUCC-3' (TGATCC) esiste invariabilmente nell'mRNA per i geni altamente espressi. I geni scarsamente espressi sembrano essere controllati solo dall'abbinamento di base ShineDalgarno. La Shine-Dalgarno (SD) Sequenza ? una sequenza di nucleotidi presente sull?rna messaggero formata da AGGAGG ed ? un sito di legame ribosomiale esclusivo nel batterio e dell'archea. Si trova tra le 8 e 13 basi prima del codone di inzio AUG (ATG). In questo sito si assemblano le sub-unit? ribosomiali ed esso viene letto dalla sub-unit? 16S. Il tRNA pu? aggiungere amminoacidi in sequenza come dettato dai codoni, spostandosi a valle del sito iniziale di traduzione. La sequenza Shine-Dalgarno ? comune nei batteri, ma pi? rara negli archaea. La sintesi proteica da ribosomi avviene su un substrato lineare ma a velocit? non uniformi. La pausa transitoria dei ribosomi pu? influenzare una variet? di processi cotraslazionali, tra cui il targeting proteico e il ripiegamento. Queste pause sono influenzate dalla sequenza dell'RNA messaggero. Pertanto, la ridondanza nel codice genetico consente la traduzione della stessa proteina a velocit? diverse.

In uno studio condotto da Tao Zuo et al. (2020) ? stato osservato che i pazienti con COVID-19 avevano alterazioni persistenti nel microbiota fecale durante il periodo di ricovero, rispetto ai controlli. Le alterazioni del microbiota fecale erano associate a livelli fecali di enorme carica virale da SARS-CoV-2 (T. Zuo et al., ?Alterations in Gut Microbiota of Patients With COVID-19 During Time of Hospitalization?, Gastroenterology, mag. 2020, doi: 10.1053/j.gastro.2020.05.048.)

Molti studi hanno evidenziato una forte connessione tra il virus SARS-CoV-2 e il microbiota intestinale, in base alla quale la variabilit? del microbiota intestinale pu? giocare un ruolo importante sull?outcome della malattia e sulla gravit? dei sintomi della malattia (D. Dhar e A. Mohanty, ?Gut microbiota and Covid-19- possible link and implications?, Virus Res., vol. 285, pag. 198018, ago. 2020, doi: 10.1016/j.virusres.2020.198018.)

Pur disponendo di maggiori informazioni scientifiche sul virus SARS-CoV-2 e sulla malattia da questo indotta, ad oggi non sono disponibili terapie efficaci per Covid-19 n? vaccini efficaci nella prevenzione dell?infezione da SARS-CoV-2 o per il trattamento della malattia. Sono in corso studi preclinici e clinici per la messa a punto di vaccini efficaci contro SARS-CoV-2 che, tuttavia, richiederanno ancora diversi mesi.

Alla luce di quanto sopra, appare evidente l?esigenza di poter disporre di nuovi prodotti per la prevenzione e per il trattamento della malattia da coronavirus, come ad esempio Covid-19.

In questo contesto, il Richiedente ha ora sorprendentemente trovato che il coronavirus classificato come Sars-Cov2, e i suoi congeneri, inducono le cellule dell?ospite, i batteri e le cellule eucariotiche alla produzione di tossine che agiscono su diversi tipi di recettore. Pertanto, il Richiedente ha scoperto che il coronavirus si comporta soprattutto e prima da fago che causa la liberazione delle tossine dalle cellule batteriche.

Tali molecole sono state rilevate inizialmente in tracce nel plasma di persone affette da Covid-19 e successivamente anche in colture batteriche di campioni fecali multi-batterici mediante un metodo sperimentale innovativo. E? stato, inoltre, osservato un inaspettato aumento della replicazione del virus. Tali colture batteriche da feci umane rappresentano la sorgente della produzione delle proteine o tossine. Attraverso un meccanismo epitelio-endoteliale, e probabilmente liposomico, tali molecole entrano in circolo ed effettuano la loro azione su diversi recettori tra cui quelli nicotinici e muscarinici dell?acetilcolina. Nei casi controllo non ? stato rivelato alcun fenomeno tra quelli sopra menzionati, sia nel plasma sia nei campioni fecali. Le tossine prodotte sono specifiche in quanto potenziano l?effetto tossico del virus e giustificano i segni multi sistemici presenti sia negli uomini e sia negli animali a seguito dell?infezione da coronavirus. In particolare, l?effetto tossico delle tossine indotte da coronavirus spiegano i sintomi di iposmia e ipogeusia che sono tipici di alcune malattia oggi classificate neurologiche immunitarie tra cui la malattia di Parkinson e la malattia di Alzheimer, correlati con i meccanismi dell?acetil colina.

In particolare, le tossine prodotte in presenza del virus sono simili alle tossine della famiglia delle conotossine, caratterizzate da quattro oppure cinque ponti disolfuro, contraddistinti dal motivo cisteinico C?C-CC?C, presentano mediamente la stessa forma terziaria e quaternaria, bench? possa variare leggermente la sequenza amminoacidica della sequenza primaria. Le tossine indotte da SARS-CoV-2 presentano un forte legame con i recettori dell?acetilcolina sia nicotinici sia muscarinici.

E? noto che le neurotossine sono suddivise in due categorie: neurotossine a catena corta (60-62 aminoacidi, legami quattro-disolfuro) e neurotossine a catena lunga (66-74 o pi? amminoacidi, legami a cinquedisolfuro).

Il peptide a catena lunga si lega con maggiore affinit? al recettore nicotinico dell?acetilcolina alfa 7 (Alpha7 nicotinic acetylcholine receptor o, attraverso il quinto legame disolfuro (D. Servent et al., ?Only Snake Curaremimetic Toxins with a Fifth Disulfide Bond Have High Affinity for the Neuronal 7 Nicotinic Receptor?, J. Biol. Chem., vol. 272, pagg. 24279?86, ott. 1997, doi: 10.1074/jbc.272.39.24279.) e le conotossine rinvenute presentano da 4 o 5 ponti disolfuro, simili a quelle evidenziate in letteratura.

La famiglia delle tossine a tre dita (circa 70 3FTxs: cardiotossiche e neurotossiche) sono polipeptidi composti da 60-74 residui di amminoacidi. Mostrano funzionalit? diverse pur avendo una struttura conservata. Una caratteristica strutturale distinta ? la piega unica, costituita da tre anelli (-stranded), che emergono da un core globulare idrofobico. I quattro o cinque ponti disolfuri, obbligati tra determinate Cys, stabilizzando la struttura tridimensionale. Sottili variazioni nella lunghezza dei loro anelli, conformazioni e residui di amminoacidi sono responsabili delle loro distinte funzioni biologiche (Aisha Munawar, Syed Abid Ali, Ahmed Akrem and Christian Betzel presentano una review dal titolo ?Snake Venom Peptides: Tools of Biodiscovery? Toxins 2018, 10, 474; doi:10.3390/toxins10110474).

Anche le fosfolipasi A2 tossiche interagiscono con i recettori nicotinici dell?acetil-colina. Quasi tutte queste tossine si legano con elevata affinit? alla periferia dei recettori nicotinici dell'acetilcolina (AChR) (Denis Servent

?, Val?rie Winckler-Dietrich

, Hai-Yan Hu, Pascal Kessler

, Pascal Drevet

, Daniel Bertrand and Andr? M?nez

Only Snake Curaremimetic Toxins with a Fifth Disulfide Bond Have High Affinity for the Neuronal ?7 Nicotinic Receptor* J. Biol. Chem.

272, 24279?24286).

In alcuni studi si ? visto che gli amminoacidi dell?alfa cobratossina Ala-28, Lys-35 e Cys-26-Cys-30 si legano selettivamente all'alfa 7-AChR, mentre Lys-23 e Lys-49 si legano esclusivamente all?AChR Torpedo. Pertanto, l'alfa-Cbtx si lega a due sottotipi di AChR usando residui sia comuni sia specifici. Il legame con le tossine si verifica probabilmente in regioni omologhe di AChR neuronali e muscolari (Ackermann, EJ, Ang, ETH, Kanter, JR, Tsigelny, I. e Taylor, P. (1998) J. Biol Chem. 273, 10958-10964). Le tossine a tre dita (3FTxs) bloccano la trasmissione post-sinaptica tramite recettori nicotinici (nAARTr). La notevole plasticit? della piega della tossina a tre dita si ? evoluta in modo ottimale per utilizzare diverse combinazioni di gruppi funzionali, per generare una panoplia di specificit? target, per discernere sottili differenze tra i sottotipi nAChR. (Selvanayagam Nirthanan e Matthew C.E. Gwee1, Three fingers -Neurotoxins and the nicotinic acetylcholine receptor, Forty years laterPharmacol Sci 94, 1 ? 17 (2004)). L?alfa-bungarotossina si lega ai recettori nicotinici muscolo scheletrici e bloccano la trasmissione neuromuscolare. Certe tossine possiedono una unit? fosfolipasica di base e possiedono propriet? anticoagulanti; altre inducono l'aggregazione delle piastrine, altre ancora viceversa la inibiscono. Molte tossine ?curarizzanti? con una struttura a tre dita riconoscono una proteina che si lega all'acetilcolina e bloccano i recettori nicotinici nei muscoli scheletrici provocando paralisi flaccida. Altre tossine riconoscono invece i recettori per l'acetilcolina situati sui neuroni. Le cardiotossine danneggiano il funzionamento cardiaco; esse depolarizzano le membrane di numerose cellule eccitabili e sono potenti citotossine. In totale, le tossine dotate di struttura a tre dita esercitano almeno sette funzioni differenti. Alcune tossine di veleni di serpenti non appartengono ad alcuna delle due categorie strutturali citate in precedenza. Le sarafotossine sono peptidi vasocostrittori di 21 amminoacidi, con due ponti disolfuro. Infine, le disintegrine possiedono tutte la sequenza conservata arginina-glicina-acido aspartico e inibiscono l'aggregazione delle piastrine, di cui riconoscono una delle proteine di superficie, la glicoproteina IIa/IIIb sulla superficie delle piastrine e di altre cellule. Le tossine proteinasi attivano la protrombina tra cui il simil fattore di coagulazione Xa (FXa) (Medical Use of Snake Venom Proteins, CRC Press, Boca Raton, 1990). La maggior parte delle tossine ? comunque fonte di inibitori aChE e BuChE (acetil-colinesterasi e butirrilcolinesterasi) (Masahiro Seo et all, (Prognostic Significance of Serum Cholinesterase Level in Patients With Reduced, Mid-Range and Preserved Left Ventricular Ejection Fraction With Acute Decompensated Heart Failure: A Prospective Study in Osaka Prefectural Acute Heart Failure Registry (OPAR) Circulation. 2018;138: A12826). La bassa concentrazione di aChE ? associata all?aumento di mortalit? nei pazienti con ridotta frazione d?eiezione ventricolare sinistra e il rischio di mortalit? ? aumentato per tutte le cause in cui avviene una diminuzione dei livelli delle aCh. In tutti i disturbi associati a un deficit colinergico presinaptico corticale correlato a un'estesa perdita di colina acetil-transferasi (ad esempio nella malattia di Alzheimer (AD), nel morbo di Parkinson (PD) e nella sindrome di Down) c'? una sostanziale riduzione del legame di (3H) nicotina al recettore nicotinico. Al contrario, le riduzioni di entrambi i sottotipi di muscarinici (M1 e M2) sono di misura moderata nella malattia di Alzheimer mentre sono significativamente aumentati gli stessi recettori muscarinici (apparentemente non in relazione al trattamento farmacologico anticolinergico) nel morbo di Parkinson e nei casi con demenza (E.K. Perry, R.H. Perry, C.J. Smith, D. Purohit, J. Bonham, D.J. Dick, J.M. Candy, Cholinergic Receptors inCognitive Disorders J. A. Edwardson and A. Fairbairn Can. J. Neurol. Sci. 1986; 13:521).

Una carenza non ereditaria di BuChE pu? manifestarsi in gravidanza, nei neonati o anche in caso di infezioni croniche, in caso di malnutrizione, nelle malattie del fegato e neoplasie, nell?anemia da carenza di ferro e farmaci come cocaina, morfina, codeina, succinil-colina, avvelenamento da Organo fosforo (OP) o da eccesso di inbitori di acetil-colinesterasi (che vengono assunti in caso di PD e AD). Inibire l?acetilcolinesterasi (aChE) e aumentare la disponibilit? di acetilcolina nelle sinapsi colinergiche migliora la trasmissione colinergica nel trattamento farmacologico del morbo di Alzheimer (AD). D?altro canto, l?incidenza cumulativa di polmonite ? di 51,9 per 1000, ovvero 5,19%, in soggetti over 65 anni in terapia con inibitore della colinesterasi galantamina, o rivastigmina per la demenza. Edward Chia-Cheng Lai, et al, Comparative risk of pneumonia among new users of Cholinesterase Dementia Inhibitors J Am Geriatr Soc. 2015 maggio; 63(5): 869? 876. doi: 10.1111/jgs.13380). Sebbene l?aChE predomina anche a livello neuronale, il BuChE ? ampiamente localizzato e secreto dalle cellule gliali. Particolari neuroni possiedono BuChE piuttosto che aChE e il loro ruolo nella funzione colinergica ? supportato dalla loro collocazione e/o vicinanza alla colina acetiltransferasi (ChAT), l'enzima limitatore di velocit? che catalizza la sintesi di ACh. Circa il 10%-15% dei neuroni colinergici all'interno dell'ippocampo umano e dell'amigdala sembrano esprimere BuChE piuttosto che aChE. Gli aChE e BuChE condividono circa il 65% dell'omologia della sequenza amminoacida sebbene codificate da diversi geni rispettivamente sui cromosomi umani 7 (7q22) e 3 (3q26). Tuttavia, entrambi legano e scindono altamente ed efficacemente l?ACh, sebbene con cinetiche leggermente diverse, rendendo identici i prodotti metabolici colina e acido acetico. L? ACh ? coinvolta nella modulazione degli stati infiammatori. Dati recenti hanno dimostrato che l?ACh, derivata da innervazioni parasimpatiche inibisce il rilascio del fattore di necrosi tumorale (TNF-?) e interleuchina 1 (IL-1) dai macrofagi attraverso l'attivazione di recettori nicotinici, e che supporta l'esistenza della via infiammatoria di un ?anticolinergico? (Rosas-Ballina M, Tracey KJ. Immune system neurology: Neural reflexes regulate immunity. Neurone. 2009; 64: 28?32). Nel sistema nervoso centrale, i sottotipi di recettori nicotinici e muscarinici sono presenti sia sui neuroni sia sulle cellule gliali dove mediano il controllo motorio, la regolazione della memoria, la regolazione della temperatura (ipertermia di difficile controllo), le funzioni di sinapsi e plasticit? come gli autoeterorecettori. All'interno del sistema nervoso periferico, i recettori muscarinici sembrano ampiamente coinvolti in diverse funzioni, come la contrazione della muscolatura liscia, la secrezione ghiandolare e la regolazione della frequenza cardiaca (49-50).

Tutti i tipi di cellule presenti all'interno del tratto respiratorio esprimono recettori muscarinici e nicotinici. Ipratropio e ossitropio (antagonisti per i recettori M1 / M3) e, pi? recentemente, tiotropio (non selettivo) hanno un vantaggio rispetto all'atropina o ad altri antagonisti muscarinici, derivante dalla loro farmacocinetica; la presenza di un ammonio quaternario nella loro formula chimica consente un effetto locale che ne riduce l'assorbimento da parte dei bronchi (Manual Goodman & Gilman. Le basi farmacologiche della terapia di Laurence L. Brunton, Randa Hilal-Dandan, et al. 2018).

Sulla base di quanto sopra descritto, il Richiedente ha quindi scoperto che coronavirus ? meglio definito come oro-naso-fecale e che ha un comportamento di tipo fagico. La scoperta della produzione di tossine indotta dal virus pu? spiegare la grave sintomatologia indotta dal virus nei soggetti infetti. Infatti, il meccanismo del virus induce la liberazione delle conotossine, delle fosfolifasi A2 like snake e delle proteine like la protrombina (attivante il fattore della coagulazione V A), della proteina like la bradichininafattore nautriuretico C, e le proteine appartenenti alla famiglia delle zinco metalloproteinasi.

Le tossine sopra menzionate sono state rilevate mediante spettrometria di massa nel plasma di soggetti affetti da tale patogeno e poi sono state riprodotte in vitro su coltura batterica.

Le tossine e neurotossine rinvenute e sperimentate sono state prodotte in vitro su matrice batterica e attraverso l?indagine spettrometrica di massa ? stato possibile osservare che bench? presentino variabili amminoacidiche e, in alcuni casi, siano trascritte come proteine pi? corte, mantengono il loro potere stimolante, data la natura metabolicamente attiva del trascritto proteico.

La struttura primaria delle tossine (?toxoidi?) ? leggermente difforme ad ogni ciclo produttivo, ma manifesta sempre gli stessi ripiegamenti terziari e quaternari permettendo, attraverso i processi di denaturazione, il loro utilizzo come anatossine, ovvero come molecole immunogene. Inoltre, il loro utilizzo permette di replicare in ospiti batterici, previo disegno del cDNA, derivante dalla conoscenza della loro sequenza, copie multiple da poter inoculare in animali da laboratorio per creare gli ibridomi. Da questi ? possibile sviluppare gli anticorpi monoclonali e policlonali utili per curare i soggetti, sia animali sia umani, affetti dalla malattia.

Pertanto, secondo la presente invenzione sono fornite le tossine sopra menzionate denaturate in grado di indurre un effetto immunogeno e permettere la stimolazione del sistema immunitario per la formazione spontanea di anticorpi contro SARS-CoV-2 ed altri coronavirus.

Le sequenze delle anatossine o tossoidi o tossine denaturate secondo la presente invenzione possono essere impiegate come sequenze parziali o totali, per la preparazione di vaccini per la prevenzione e per la cura della malattia indotta da coronavirus, come Sars-Cov2. La stessa applicazione pu? essere prevista per la prevenzione e il trattamento di altri coronavirus come MERS e SARS-CoV.

L?individuazione di questo nuovo meccanismo di replicazione, che si verifica non solo nella cellula eucariotica, ma anche nella cellula procariotica, o in altra cellula contente il ribosoma 16s (mitocondri, ecc) cambia e rivoluziona l?approccio terapeutico contro il patogeno virale e apre nuovi scenari e nuovi meccanismi molecolari. Tutto questo pu? portare a significativi avanzamenti nella scelta del trattamento e nel monitoraggio delle patologie sopra menzionate, ossia tutte le patologie dei tipi conosciuti di coronavirus.

Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione un prodotto per l?uso nella prevenzione e nel trattamento della malattia da coronavirus, detto prodotto consistendo in:

a) una o pi? anatossine immunogeniche di una o pi? tossine prodotte da una cellula in presenza di un coronavirus,

in cui dette una o pi? anatossine immunogeniche comprendono o consistono in una sequenza amminoacidica immonogenica

uguale alla sequenza amminoacidica di dette una o pi? tossine o a parti immunogeniche della sequenza amminoacidica di dette una o pi? tossine, o

avente una percentuale di identit? di sequenza con la sequenza amminoacidica di dette una o pi? tossine, o con parti immunogeniche della sequenza amminoacidica di dette una o pi? tossine, di almeno il 20%, preferibilmente di almeno il 50%, o di almeno il 60% o di almeno il 70%, o di almeno l?80% o di almeno il 90%, b) un anticorpo policlonale o monoclonale contro dette una o pi? tossine prodotte da una cellula in presenza di un coronavirus; o

c) una composizione farmaceutica comprendente o consistente nel prodotto come definito in a) e/o b) in associazione con uno o pi? eccipienti e/o coadiuvanti farmaceuticamente accettabili.

Secondo la presente invenzione con il termine ?una o pi? tossine prodotte da una cellula in presenza di un coronavirus? si intende una o pi? tossine prodotte naturalmente o artificialmente aventi sequenza amminoacidica uguale a quelle delle tossine prodotte da una cellula in presenza di un coronavirus, ossia da una cellula infettata da un coronavirus, come ad esempio SARS-CoV-2.

Dette una o pi? anatossine possono essere preparate a partire da una o pi? tossine direttamente prodotte da una cellula in presenza di un coronavirus o da dette una o pi? tossine prodotte per via sintetica, ad esempio per via ricombinante. Inoltre, come detto sopra, le anatossine possono avere una sequenza amminoacidica immunogenica con diverse percentuali di identit? rispetto alle sequenze amminoacidiche delle tossine prodotte da una cellula in presenza di un coronavirus. Le anatossine possono comprendere o consistere nelle sequenze amminoacidiche intere o parziali delle sequenze amminoacidiche delle tossine. Quindi le anatossine possono comprendere una sequenza amminoacidica che ? una parte o porzione immunogenica della sequenza amminoacidica delle tossine o che ha una percentuale di identit?, come definita sopra, con la parte o porzione immunogenica della sequenza amminoacidica delle tossine tale da mantenere l?immunogenicit? di questa.

Secondo la presente invenzione dette una o pi? tossine sono scelte nel gruppo che consiste in tossine in grado di legare un recettore dell?acetilcolina e/o l?acetilcolinesterasi, tossine fosfolipasi A2, tossine attivanti la protrombina, tossine aventi funzione della bradichinina-fattore nautriuretico C e tossine aventi funzione delle zinco metalloproteinasi.

Quando dette una o pi? tossine sono in grado di legare un recettore dell?acetilcolina e/o l?acetilcolinesterasi, dette una o pi? tossine comprendono un motivo cisteinico in grado di legare un recettore dell?acetilcolina, ad esempio un motivo cisteinico di una tossina scelta nel gruppo che consiste in una conotossina in grado di legare un recettore dell?acetilcolina, una tossina a tre dita in grado di legare un recettore dell?acetilcolina, come ad esempio le bungoratossine. Pertanto, secondo la presente invenzione dette una o pi? anatossine possono comprendere un motivo cisteinico delle tossine in grado di legare un recettore dell?acetilcolina, ad esempio un motivo cisteinico di una tossina scelta nel gruppo che consiste in una conotossina in grado di legare un recettore dell?acetilcolina, una tossina a tre dita in grado di legare un recettore dell?acetilcolina, come ad esempio le bungoratossine.

Secondo la presente invenzione il coronavirus pu? essere scelto nel gruppo che consiste in SARS-CoV-2, SARS-CoV, virus che causa la sindrome respiratoria mediorientale da Coronavirus o MERS-CoV, preferibilmente SARS-CoV-2.

Secondo la presente invenzione la cellula pu? essere scelta nel gruppo che consiste in cellula batterica, ad esempio dei batteri del microbiota intestinale o del tratto oro-naso-fecale del soggetto infetto da coronavirus, una cellula del soggetto infetto da coronavirus, una cellula eucariotica presente nel soggetto infetto da coronavirus.

Secondo la presente invenzione, il prodotto sopra menzionato pu? essere impiegato sia sull?uomo sia sull?animale.

Secondo forme di realizzazione specifiche della presente invenzione dette una o pi? anatossine comprendono o consistono in una sequenza amminoacidica o in una porzione immunogenica di questa, in cui detta sequenza amminoacidica ? scelta nel gruppo che consiste in (nell?elenco sotto riportato sono mostrati anche gli ID uniprot e swiss prot delle tossine presenti in frammenti, individuate nelle colture batteriche e nel plasma dei soggetti colpiti dal virus SARS-CoV-2):

D2DGD8:

LVLAIVLILM LVSLSTGAEE SGQEISMVGP PLYIWDPIPP CKQLDEDCGYGYSCCEDLSCQPLIEPDTMEITALVCQIESA (SEQ ID NO:1);

B3FIA5:

KAVQGDSDPSASLLTGDKNHDLPVKRDCTTCAGEECCGRCTCPWG (SEQ ID NO:2);

Q5K0C5:

MKLTCVLIITVLFLTASQLITADYSRDQRQYRAVRLGDEMRNFKGARDCG GQGEGCYTQPCCPGLRCRGGGTGGGACQL (SEQ ID NO:3);

A1X8B8:

MGMRMMFTMFLLVVLATTVVSINLDHAFDGRNAAANNKATDLMARTVRRF CSDPPCRISNPESCGWEP (SEQ ID NO:4);

P58811:

MFTVFLLVVLATTGVSFTLDRASDGGNAVAKKSDVTARFNWRCCLIPACR RNHKKFCG (SEQ ID NO:5);

D6C4J8:

MTAKATLLVLALVVMATSGVSSASVAGGPVVNSDTVSRSDPERLSTRGCV ANCQANQTGIDCIKYCGIGIGRRDITQQ (SEQ ID NO:6);

D2Y488:

MTFLLLLVSVCMMATGEERTKRDVCELPFEEGPCFAAIRVYAYNAETGDC EQLTYGGCEGNGNRFATLEDCDNACARY (SEQ ID NO:7);

P0C8U9:

MFTVFLLVIL ATTVVPFPSD RDPASNHENS KGSNRNAWLT PEECCAAPAC REMILEFCLA GEAFAAALDG FRR (SEQ ID NO:8);

V5V893:

MHTLEMLLLLLLLLPLALGEGDGQAVAGDRNPSEARSTHEHFLQRLIRLI HGSDCQPCGQYVCCPPWKYAEYRRFT (SEQ ID NO:9);

F5CPF1:

PAHLLVLAAV CISLSGASSI APQPLNLIQF GNMIQCTIPG SSPLLDYADY GCYCGRGGSG TPVDK (SEQ ID NO:10);

Q3C2C2:

MNFLVVIVTTVSLAGAASAGEIQNLYQFGKMVMCLGNLNVLEGLEYNGYG CYCGRGGKGTPLDDTDRCCKQHDECYERATDEMGCWSIETYATTYDYTKSKVSGK CTIKCKLESDYSRFTIRKKCKAFICECDRIGAQCFADKRSTFNRSLISYTKDKC

(SEQ ID NO:11);

Q2PG83:

MRTLWIMAVLLLGVEGGLWQFENMIMKVAKKSGILSYSAYGCYCGWGGRG TPKDATDRCCFVHDCCYGKVTGCNPKLGKYTYISENGDIICGGDGPCKEVCECDR AAAICFRDNLDTYDRKTYWKYPASNCQEDSEPC (SEQ ID NO:12);

Q9PUG8:

MYPAHLLVLLAVCVSLLGASNIPLPSLDFEQFGKMIQCTIPCEESCLAYM DYGCYCGPGGSGTPLDELDRCRQTHDNCYAEAGKLPACKAMLSEPYNDTYSYGCI ERQLTCNDDNDECKAFICNCDRAAVICFSGAPYNDSNYDIGTIEHCK (SEQ ID NO:13);

A6MEY4:

MNPAHLLVLLAVCVSLLGAANIPPQSLNLYQFKNMIQCAGTQLCVAYVKY GCYCGPGGTGTPLDQLDRCCQTHDHCYDNAKKFGNCIPYFKTYEYTCNKPDLTCT DAKGSCARNVCDCDRAAAICFAAAPYNLANFGINKETHCQ (SEQ ID NO:14);

P06860:

HLLQFRKMIKKMTGKEPIVSYAFYGCYCGKGGRGKPKDATDRCCFVHDCC YEKVTGCDPKWSYYTYSLENGDIVCGGDPYCTKVKCECDKKAAICFRDNLKTYKN RYMTFPDIFCTDPTEGC (SEQ ID NO:15);

Q9I900:

MNPAHLLILAAVCVSPLGASSNRPMPLNLYQFKNMIQCTVPNRSWWDFAD YGCYCGRGGGTPVDDLDRCCQVHDNCYGEAEKISRCWPYFKTYSYECSQGTLTCK GGNDACAAAVCDCDRLAAICFAGAPYNDNNYNIDLKARCQ (SEQ ID NO:16);

P23028:

MHPAHLLVLLGVCVSLLGAASIPRPSLNIMLFGNMIQCTIPCEQSWLGYL DYGCYCGSGSSGIPVDDVDKCCKTHDECYYKAGQIPGCSVQPNEVFNVDYSYECN EGQLTCNESNNECEM AVCNCDRAAAICFARFPYNKNYWSINTEIHCR (SEQ ID NO:17);

Q58L90:

EYVLMFSVFDESKNWYRKPSLQYTINGFANGTLPDVQACAYDHISWHLIG MSSSPEIFSVHFNGQTLEQNHYKVSTINLVGGASVTANMSVSRTGKWLISSLVAK HLQAGMYGYLNIKDCGHPNTLTRKLSFRELRRIMNWEYFIAAEEITWDYAPEIPS SVDRRYKAQYLDNFSNFIGKKYKKAVFRQYEDGNFTKPTYAIWPKERGILGPVIK AKVRDTVTIVFKNLASRPYSIYVHGVSVSKDAEGAIYPSDPKENITHGKAVEPGQ VYTYKWTVLDTDEPTVKDSECITKLYHSAVDMTRDIASGLIGPLLVCKLKALSVK GVQNKADVEQHAVFAVFDENKSWYLEDNIKKYCSNPSSVKKDDPKFYKSNVMYTL NGYASDRTEVLGFHQSEVVQWHLTSVGTVDEIVPVHLSGHTFLSKGKHQDILNLF PMSGESATVTMDNLGTWLLSSWGSCEMSNGMRLRFLDANYDDEDEGNEEEEEDDG DIFADIFSPPEVVKKKEEPVNFVPDPESDALAKELGLLDDEDNPEQSRSEQTEDD EEQLMIASVLGLRSFKGSVAEEELKHTALALEEDAHASDPRIDSNSARNSDDIAG RYLRTINRRNKRRYYIAAEEVLWDYSPIGKSQVRSLPAKTTFKKAIFRSYLDDTF QTPSTGGEYEKHLGILGPIIRAEVDDVIEVQFRNLASRPYSLHAHGLLYEKSSEG RSYDDNSPELFKKDDAIMPNGTYTYVWQVPPRSGPTDNTEKCKSWAYYSGVNPEK DIHSGLIGPILICQKGMIDKYNRTIDIREFVLFFMVFDEEKS (SEQ ID NO:18);

Q7SZN0:

KPSLQYTINGFANGTLPDVQACAYDHISWHLIGMSSSPEIFSVHFNGQTL EQNHYKVSTINLVGGASVTADMSVSR (SEQ ID NO:19);

Q593B6:

IAKELGLLDDEDNQEESHNVQTEDDEEQLMIATMLGFRSFKGSVAEEELN LTALALEEDAHASDPRIDSNSARNPDDIAGR (SEQ ID NO:20);

Q58L91:

EVWGFHQSEV VEWHLTSVGT VDEIVPVHLS GHTFLSKGKH QDILNLFPMS GESATVTMDN LGTWLLSSWG SCEMSNGMR (SEQ ID NO:21);

Q9W7J9:

MKTLLLTLVMVTIMCLDLGYTLTCYKGYHDTVVCKPHETICYEYFIPATH GNAILARGCGTSCPGGIRPVCCRTDLSNK (SEQ ID NO:22);

B5AJT2:

MDLFILTRFILFLSFFMKSIHCQYSESQESGHNRNAPDKELTTEEFQLIF HQSQTVDIEYDFINITTEMIETERKVSFTIDGKEYHLSLTPAASQSVLPYGTKIK SAIWWTDNDTHIHEEDYSDERWDSRAIYENLEIMATILVRTENGTSYYDGVFVKY SNEGVRSLPGRLMNIYGANYHFVYDSNGSVYDVVLNGQDEPAVPADMASKIIFYS ETPCTCRLLIIQDLLMKTSRRLSSISTIFWNAVNLRFRPVQHPKVNIIITGIVIA KNEAAFQHVYRARYSKNSKLVHTGRVIDNGRYFFGTNFDPYYDNYDASFTMASMD DPTGKGGATVIGGICSSSNNIAYIRDVGSYSGVKVATHELGHLLNGQHDSDTTCS EKINDNIYTIMAKQGSTKASKFVWSSCTLTAFANFSKTTSAACLKDTYRKQ (SEQ ID NO:23);

D6C4M3:

MSTLGMTLLILLLLLPLATPDDVGQPPKRDTLRNLLKIGTRGQGGCVPPG GGRCKANQACTKGGNPGTCGFQYDLCLCLRN (SEQ ID NO:24);

Q8AWI5:

RKSHDNAQLLTGINFNGPTAGLGYLGGICNPMYSAGIVQDHNKIHHLVAI

(SEQ ID NO:25);

F5CPF1:

GTPVDKLDRCCQAHDKCYTDAYRFYRCWPFLTLYSHTCSNRKVIC (SEQ ID NO:26);

P82662:

MKTLLLTLVVMTIVCLDLGYTLICFISSHDSVTCAPGENVCFLKSWCDAW CGSRGKKLSFGCAATCPKVNPGIDIECCSTDNCNPHPKLRP (SEQ ID NO:27);

P58924:

MMSKMGAMFVLLLLFTLASSLQEGDVQARKTRLKSDFYRALARDDRGCTR TCGGPKCTGTCTCTNSSKCGCRYNVHPSGWGCGCACSG (SEQ ID NO:28);

A0A1P8NVR4:

MEKLTMLVLVAAVLLSAQVMVQGDGDQPADRDAVPRDDNPGGTIGKFMYI LHGCPFQPWC (SEQ ID NO:29);

P0DM19:

MSTLKMMLLILLLLLPMATFDSDGQAIPGGGIPSAVNSRVGGDEKSGRSL EKRCRSGKTCPRVGPDVCCERSDCFCKLVPARPFWRYRCICL (SEQ ID NO:30);

P0C1N5:

MSKLGVLLTICLLLFALTAVPLDGDQPADRPAERMQDDISSERHPMFDAV RDCCPLPACPFGCNPCCG (SEQ ID NO:31);

P58786:

MGKLTILVLVAAVLLSAQVMVQGDGDQPADRNAVPRDDNPGGASGKFMNV LRRSGCPWEP (SEQ ID NO:32);

A8YPR6:

MFVSRLAASGLLLLSLLALSLDGKPLPQRQPHHIQPMEQKWLAPDAPPLE QKWLAPDAPPLEQKWLAPAAPPLEQKWLAPDAPPMEQKWLAPDAPPMEQKWLAPD APPMEQKWLAPDAPPMEQKWLAPDAAPLEQKWLAPDAPPMEQKWLAPDAPPMEQK WQPQIPSLMEQRQLSSGGTTALRQELSPRAEAASGPAVVGGGGGGGGGSKAALAL PKPPKAKGAAAATSRLMRDLRPDGKQASQKWGRLVDHDHDHHHHHHPGSSVGGGG GGGGGGARRLKGLAKKGVAKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO:33);

P0C7P5:

MFVSRLAASGLLLLALLALSLDGKPVHQSKPGRSPPISPLSAQQWMPEGR PPHPIPPLSVQQWSQGRPRSEVPPVVVQPHESPAGGTTAFREELSPGPEAASGPA APHRLPKSKGASATSAASRPMRDLRTDGKQERQKWGRMVQPDHHAAPGGGGGGGG GARRMKGLAKKAMGKGCFGH KLDRIGSTSGLGC (SEQ ID NO:34);

Q9PW56:

MVLSRLAASGLLLLALLALSVDGKPVQQWAQGGWPRPGPEIPPLKVQQWA QGGWPRPGPEIPPLTVQQWAQNWPHPQIPPLTVQQWAQWGRPPGPPIPPLTVQQW AQARPPHPPIPPAPLQKWAPVQKWAPLLQPHESPASGTTALREELSLGPEAASGV PSAGAEVGRSGSKAPAAPHRLSKSKGAAATSAASRPMRDLRPDGKQARQNWGRMV HHDHHAAVGGGGGGGGGGARRLKGLAKKGAAKGCFGLKVDRIGTMSGLGC

(SEQ ID NO:35);

Q698K8:

EDEAPKMCGVTQNWESYEPIKKASQSNLTPAHQRYIELVIVADHGMFTKY NGDSDKIREWVRQMVNTVDEIYSYMYIDVALAGLEIWSNEDLINVQPAAPHTLDS FGKWRERDLLHRIHHDNAMLLTAIDFDGPTIGLAYVGTMCKPKGSTGVVQDHSTI NLRVAVTMAHEIGHNLGIHHDTGSCSCGGYSCIMSPVISHEPSKYFSDCSYTQCW DFIMNQKPQCILNKPLRTDTVSTPVSGNELLEAGEECDCGSPGNPCCDAATCKLR QGAQCAEGLCCDQCRFMKKGTVCRIARGDDMDDYCNGISAGCPRNPFHA (SEQ ID NO:36);

Q9YGI1:

MKTLLLTLVVVTIVCLDLGYTLTCLICPEKYCNKVHTCLNGEKICFKKYD QRKLLGKGYIRGCADTCPKLQNRDVIFCCSTDKCNL (SEQ ID NO:37);

P59925:

VFINVKCTGSKQCLPACKAAVGKAAGKCMNGKCKCYT (SEQ ID NO:38);

C0JAU1:

WIMGHMVNAIGQIDEFVNLGANSIETDVSFDSNANPEYTYHGIPCDCGRN CKKWENFNDFLKGLRSATTPGDSKYKEKLVLVVFDLKTGSLYDNQANDAGKKLAK NLLQHYWNNGNNGGRAYIVLSIPDLNHYPLIKGFTDTLKQEGHPELLDKLGYDFS GNDAIGDVANACKKAGVSGHVWQSDGITNCLLRGLTRVREAVANRDSGKGYINKV YYWTVDKRASTRDALDAGVDGIMTNYPDVITDVLNEAAYKSKFRVATYDDNPWET FKK (SEQ ID NO:39);

P0C8L9:

MSLIIVLVISVLSADAVLSMDNELYLNLEPSQRSSWPVARAVRMQFSKRS EGGRESRKMQGCQILESLNDIAREALRTPRHTTKRISKDEMEFFEGRCLSVGESE RTVLGTKWCGAGNEAANYSDLGYFNNVDRCCREHDHCDNIPAGETKYGLKNEGTY TMMNCKCEKAFDKCLSDISGYFTRKAVSAVKFTYFTLYGNGCYNVKCENGRSPSN ECPNGVAEYTGETGLGAKVINFGK (SEQ ID NO:40);

Q8AY53:

MKTLLLTLVVLTIACLDLGYTKTCFNDDLANPKTTELCRHSMYFCFKNSW IAGGVERIERGCSLTCPDIKYNGKYIYCCTRDNCNA(SEQ ID NO:41);

P01485:

LVMAGVESVKDGYIVDDRNCTYFCGRNAYCNEECTKLKGESGYCQWASPY GNACYCYKVPDHVRTKGPGRCN(SEQ ID NO:42);

Q8AY46:

MSSGGLLLLLGLLTLCAELTPVSSRQRHRDCDKPPDKGNCGSVRRAFYYD TRLKTCKAFPYRGCNGNGNHFKTETLCRCECLVYP (SEQ ID NO:43);

A8QL59:

MIQPLLVAICLVVFPYQGSSTILESGKVRDYEVVYPQKIPSLPKGRLQRR EEKTKYENTMKYEFKVNGEPVVLNLEKNKRLFSKDYTETHYSPDGREITTSPPVQ DHCYYHGHIQNDADSTAVIRACDGLNGYFKSNGEMYIIEPLKLSDSEAHAVFKYE SLEKEDETPKTCGAIHNSGESDETIKKISNTFVTPEKGEEYLEAEKHIELYMVAD NLVYRKYSSNITVVRMRIFEILNYVNLYYKILNIHVVLIGLEVWSDEDKILINGS SELTVRSFAAWRHSDLLKHKRNDNAQLLTGIHFDKRVLGIAFIGGMCNNFTSVGA IQDNSIHAVLIAATMTHELGHNLGMNHDTDSCTCNTGPCIMKAALNFKPPYEFSS CSYWDFQNYIMTKSAQCILNDPLTTDIVPTAICGNGFVEEGEECDCGPPEICKNE CCEAATCKLKPEAQCASGACCEECQFRRAGELCRAAKDDCDLDELCTGQSAECPM NHFHMNGHPCQNNQGYCFRGTCPTLTKQCIALWGPDAEVAPDGCFMNNQKGNYYG YCKKKNGTNIPCEPENVKCGRLYCIDDSTEENSCKFHFSNENANSGMVQPGTKCG EGMVCGFGECIGLETALGINQ (SEQ ID NO:44);

P0DM21:

MFTVFLLVVLATAVVSFTSDRASDDGKAAASDLITLTIKGCCSRPPCIAN NPDLCG (SEQ ID NO:45);

Q2XXQ3:

MIVFILLSLAAVLQQFVADVNFESESPRRTEKQTEIVDMHNSFRRSVNPT ARNMLKMEWYPEAADNAERWAYQCIYDHSANSERVIGGIQCGENIYKSSNPRAWT EIIQSWYDEIQNFEYGVGANPPGSVIGHYTQIVWYKSYRIGCAAAYCPSYPYNYF YVCQYCPTGNMEGLTATPYTSGPTCADCPSHCDDGLCTNPCPITNTFTNCDSLLQ QNSCEDSYIKTNCGASCFCQDKII (SEQ ID NO:46);

P0CB07:

MFTVFLLVVLATTVVSFTSDRAFRGRNAAAKASGLVGLTDKRQECCSYPA CNLDHPELCG (SEQ ID NO:47);

P0DPT2:

SDGRNEAANDEASDVIELALKGCCSNPVCHLEHPNACGRRR (SEQ ID NO:48);

P0CY83:

MTSVQSATCCCLLWLVLCVQLVTPDSPATAQLSRHLTARVPVGPALAYAC SVMCAKGYDTVVCTCTRRRGVVSSSI (SEQ ID NO:49);

Q9BP60:

MSGLGIMVLTLLLLVSMATSHQDGRGKQATQRDAINVRRRRSITRTEACY EYCKEQNKTCCGISNGRPICVGGCIR (SEQ ID NO:50);

A7X3M3:

MKTLPLVLAVVAFVYLDLAHTLKCRSGNVCILGDDCSEGENVCFQRKNGT GVFGMRVVRGCAASCPSPIGGEEVSCCSTDNCNNSFSRFF (SEQ ID NO:51);

LVLAIVLILM LVSLSTGAEE SGQEISMVGP PLYIWDPIPP CKQLDEDCGYGYSCCEDL (SEQ ID NO:52);

TVVSINLDHAFDGRNAAANNKATDLMARTVRRFCSDPPCRISNPESCGW

(SEQ ID NO:53);

TADYSRDQRQYRAVRLGDEMRNFKGARDCGGQGEGCYTQPCCPGLRC

(SEQ ID NO:54);

VLATTGVSFTLDRASDGGNAVAKKSDVTARFNWRCCLIPACRRNHKKFC

(SEQ ID NO:55);

RDVCELPFEEGPCFAAIR (SEQ ID NO:56);

MFTVFLLVIL ATTVVPFPSD RDPASNHENS KGSNRNAWLT PEECCAAPAC REMILEFC (SEQ ID NO:57);

ALGEGDGQAVAGDRNPSEARSTHEHFLQRLIRLIHGSDCQPCGQYVCCP

(SEQ ID NO:58);

PAHLLVLAAV CISLSGASSI APQPLNLIQF GNMIQCTIPG SSPLLDYADY GCYCGRGG (SEQ ID NO:59);

FLVVIVTTVSLAGAASAGEIQNLYQFGK (SEQ ID NO:60);

CGWGGRGTPKDATDRCCFVHDCCYGKVTGCNPKLGKYTYISENG (SEQ ID NO:61);

AGTQLCVAYVKYGCYCGPGGTGTPLDQLDRCCQTHDHCYDNAKKFGNCIP

(SEQ ID NO:62);

TGKEPIVSYAFYGCYCGKGGRGKPKDATDRCCFVHDCCYEKVT (SEQ ID NO:63);

KNMIQCTVPNRSWWDFADYGCYCGRGGGTPVDDLDRCCQVHDNCYG

(SEQ ID NO:64);

MHPAHLLVLLGVCVSLLGAASIPRPSLNIMLFGNMIQCTIPCEQSWLGYL DYGCYCGS (SEQ ID NO:65);

TAKATLLVLALVVMATSGVSSASVAGGPVVNSDTVSRSDPERLSTRGC (SEQ ID NO:66);

KPSLQYTING FANGTLPDVQ ACAYDHISWH LIGMSSSPEI FSVHFNGQTL EQNHYKVS (SEQ ID NO:67);

IAKELGLLDDEDNQEESHNVQTEDDEEQLMIATMLGFRSFKGSVAEEELN LTALALEE (SEQ ID NO:68);

EVWGFHQSEV VEWHLTSVGT VDEIVPVHLS GHTFLSKGKH QDILNLFPMS GESATVTM (SEQ ID NO:69);

TCYKGYHDTVVCKPHETICYEYFIPATHGNAILARGCGTSCPGGIRPVCC

(SEQ ID NO:70);

FGTNFDPYYDNYDASFTMASMDDPTGKGGATVIGGICSSSNNIAYIRDVG

S (SEQ ID NO:71);

PPKRDTLRNLLKIGTRGQGGCVPPGGGRCKANQACTKGGNPGTCGFQ

(SEQ ID NO:72);

RKSHDNAQLLTGINFNGPTAGLGYLGGICNPMYSAGIVQDHNKIHHLVAI

A (SEQ ID NO:73);

HDSVTCAPGENVCFLKSWCDAWCGSRGKKLSFGCAATCPKVNPGIDIECC

S (SEQ ID NO:74);

ALARDDRGCTRTCGGPKCTGTCTCTNSSKCGCRYNVHPSGWGCGCA

(SEQ ID NO:75);

VLVAAVLLSAQVMVQGDGDQPADRDAVPRDDNPGGTIGKFMYILHGCPFQ

P (SEQ ID NO:76);

QAIPGGGIPSAVNSRVGGDEKSGRSLEKRCRSGKTCPRVGPDVCCERSDC

F (SEQ ID NO:77);

TAVPLDGDQPADRPAERMQDDISSERHPMFDAVRDCCPLPACP (SEQ ID NO:78);

LLSAQVMVQGDGDQPADRNAVPRDDNPGGASGKFMNVLRRSGCPWEPWC

(SEQ ID NO:79);

EQKWLAPDAPPLEQKWLAPDAPP LEQKWLAPAAPPLEQKWLAPDAPPM

(SEQ ID NO:80);

ESPAGGTTAFREELSPGPEAASGPAAPHRLPKSKGASATSAASRPMRD (SEQ ID NO:81);

TALREELSLGPEAASGVPSAGAEVGRSGSKAPAAPHRLSKSKGAAATSA

(SEQ ID NO:82) e/o QKPQCILNKPLRTDTVSTPVSGNELLEAGEECDCGSPGNPCCDAATCKLR

Q (SEQ ID NO:83).

Le anatossine secondo la presente invenzione possono essere ottenute ad esempio mediante denaturazione di dette una o pi? tossine prodotte da una cellula in presenza di un coronavirus, ossia da una cellula che viene infettata da un coronavirus.

Secondo la presente invenzione il prodotto pu? essere un vaccino o un antidoto.

Il vaccino secondo la presente invenzione ? utile avverso i sintomi delle neurotossine liberate a seguito del contagio con il virus SARS-CoV-2 e permette un pronto intervento nella cura, nella prevenzione e nella risoluzione della patologia sia nell?uomo sia nell?animale.

Le sequenze possono anche essere ricavate tramite clonazione di un cDNA e successiva produzione in coltura batterica, o con altri metodi. Lo studio ? ulteriormente confermato dalla presenza delle tossine e neurotossine rinvenute, sperimentate, prodotte in vitro su matrice batterica. Attraverso l?indagine spettrometrica di massa, ? stato possibile osservare che bench? le tossine presentino variabili amminoacidiche e in alcuni casi siano trascritte come proteine pi? corte, mantengono il loro potere stimolante, data la natura metabolicamente attiva del trascritto proteico. Questo dato fornisce una chiara spiegazione anche al motivo per cui il plasma iper-immune dei guariti funziona nella cura della patologia.

L?utilizzo delle sequenze rinvenute al fine di curare gli esseri viventi colpiti da tale virus risulta un metodo sicuro. La metodica proposta nell?esempio 1 non implica problematiche legate, come nel plasma iper immune, ai fattori Rh, oppure alla compatibilit? sanguigna ABO o a quella immunitaria HLA. Inoltre, l?impiego secondo la presente invenzione non implica l?utilizzo di vaccini coadiuvati da altri virus.

Come anche descritto nell?esempio 1, la denaturazione delle tossine pu? essere condotta mediante metodi noti come la denaturazione chimica, ad esempio per trattamento con sostanze chimiche tra cui l'urea, il cloruro di guanidinio e il tiocianato di guanidinio. La denaturazione pu? anche essere ottenuta mediante trattamento con formaldeide. Alternativamente alla denaturazione chimica, la denaturazione delle tossine pu? essere condotta mediante una denaturazione termica, a caldo e a freddo.

La presente invenzione concerne, inoltre, il prodotto come definito sopra per l?uso contro gli avvelenamenti da una o pi? tossine di sequenza amminoacidica da SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:85, ad esempio in conseguenza di morso o puntura di o contatto con animali, di ingestione di alimenti, di inalazione di gas o vapori contenenti dette tossine.

La presente invenzione verr? ora descritta, a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo una sua forma preferita di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati, in cui:

- la figura 1 mostra il diagramma di percentuale di replicazione virale su terreno di coltura batterico fino a 30 giorni;

- la figura 2 mostra il diagramma di frequenza in valore log-e delle tossine nei campioni fecali A, B, C: campione ?A? misto di batteri e virus Sars-Cov2, campione ?B? multi-batterico SARS-CoV-2 negativo inoculato con il surnatante e virus del campione ?A?, campione ?C? solo frazione batterica ricavato dal campione ?A? dopo prelievo e centrifuga di una sua replica.

- le figure 3-35 mostrano le spettrometrie di massa con tecnica Maldi-Tof delle tossine rinvenute nei preparati batterici positivi al virus SARS-CoV-2 e poi rinvenute in circolo nei pazienti infetti e affetti dalla patologia virale.

ESEMPIO 1: Identificazione delle tossine prodotte da cellule in presenza di SARS-CoV-2, preparazione delle tossine denaturate e studio di efficacia delle tossine denaturate secondo la presente invenzione

I campioni biologici umani utilizzati nella sperimentazione che segue sono stati raccolti con l'espresso consenso, libero e informato, al prelievo e utilizzazione, della persona da cui ? stato prelevato il materiale, in base alla normativa vigente.

La tecnologia SANIST (ionizzazione chimica attivata dalla superficie-elettrospray-NIST) ? stata utilizzata per ottenere e confrontare i profili proteomici. ? stato utilizzato un sistema LC Ultimate 3000 UPLC (ThermoFisher) per ottenere la separazione degli analiti per ciascun campione prima dell'analisi MS. ? stata utilizzata una colonna C-18 LC a fase inversa (50 ? 2,1 mm; dimensione delle particelle, 5 ?m; dimensione dei pori, 100 ?; Phenomenex, [Torrance, CA OR San Jose], USA). Il flusso di eluente era 0,25 mL / min e il volume di iniezione era 15 ?L. Le fasi mobili erano: A) acido formico allo 0,2% (v / v) (HCOOH) e B) acetonitrile (CH3CN). Il gradiente di eluizione era: 2% (v / v) B tra 0 e 2 min; Dal 2 al 30% di B tra 2 e 7 min; Dal 30 all'80% tra 7 e 9 min; 80% B tra 9 e 12 min; 80-2% di B tra 12 e 12,1 min; la colonna ? stata riequilibrata con 2% di B tra 12,1 e 17 min.

Spettrometria di massa: i campioni di plasma sono stati analizzati con uno spettrometro di massa a trappola ionica HCT (Breme, Germania) accoppiato a una sorgente di ionizzazione chimica attivata dalla superficie (SACI) / ESI e operato in modalit? di ioni positivi e negativi. Gli spettri a scansione completa sono stati acquisiti nell'intervallo 40-3500 m / z per l'analisi metabolomica/proteomica non mirata per rilevare gli analiti. Lo stesso intervallo m / z ? stato mantenuto sia per gli studi di scoperta sia per gli studi sui biomarcatori selettivi al fine di standardizzare la risposta dello strumento in tutto lo studio SANIST, principalmente in termini di velocit? di scansione. I parametri della sorgente ionica erano: tensione capillare ESI: 1500 V, tensione superficiale SACI: 47 V, gas essiccante: 2 L / min, gas nebulizzatore: 80 psi, temperatura: 40 ? C. Gli esperimenti di spettrometria di massa tandem (MS / MS) su campioni di plasma sono stati eseguiti con dissociazione indotta da collisione utilizzando l'elio come gas di collisione. Una trappola ionica ? stata impiegata per isolare e frammentare gli ioni precursori (finestre di isolamento, ? 0,3 m / z; energia di collisione, 30% del suo valore massimo, che era 5 V da picco a picco), e l'analizzatore di massa Orbitrap ? stato utilizzato per ottenere i frammenti con un rapporto m / z estremamente accurato (risoluzione 15.000; errore m / z <10 ppm).

La replicazione del virus SARS-CoV-2 all?interno di una coltura batterica mista ? stata ottenuta mediante la metodica ?Brogna-Petrillo? (domanda del 24/09/2020 n 102020000022519). Un campione ?A? misto di batteri e virus Sars-Cov2 ? stato messo su terreno di coltura multi-potente per molte specie batteriche, incluse quelle anerobiche. Sono state misurate le concentrazioni di cariche virali con il metodo Luminex tecnology (S. A. Dunbar, ?Applications of Luminex? xMAPTM technology for rapid, high-throughput multiplexed nucleic acid detection?, Clin. Chim. Acta Int. J. Clin. Chem., vol. 363, n. 1, pagg. 71?82, gen. 2006, doi: 10.1016/j.cccn.2005.06.023.). Un campione ?B? multibatterico SARS-CoV-2 negativo ? stato inoculato con il surnatante e virus del campione ?A?, previa centrifuga a 2400 G per 10 minuti. Un terzo campione denominato ?C?, con solo frazione batterica, ? stato ricavato dal campione ?A ?dopo prelievo e centrifuga di una sua replica. Il campione ?B? ? stato appositamente selezionato per essere predisposto all?inoculazione, da feci di soggetto donatore, negativo per ogni virus. Le colture sono state condotte per 30 giorni.

Oltre alla misurazione della concentrazione virale a step definiti sono state eseguite analisi MAldibiotyper al fine di individuare meglio la motilit? replicativa batterica e cercare di individuare la famiglia batterica che maggiormente si presta come substrato ideale alla replicazione virale (B. Karolski, L. O. B. Cardoso, L. H. Gracioso, C. A. O. Nascimento, e E. A. Perpetuo, ?MALDI-Biotyper as a tool to identify polymer producer bacteria?, J. Microbiol. Methods, vol.

153, pagg. 127?132, 2018, doi: 10.1016/j.mimet.2018.09.01). Il diagramma riportato in figura 1 evidenzia che a 30 giorni nel campione ?B?, negativo per la presenza di cellule eucariotiche, era presente una replicazione virale Sars-Cov2 del 1100 % e nel campione ?A?, tale replicazione raggiungeva la soglia del 500%. L?analisi ha evidenziato un aumento della replicazione virale nella coltura batterica esponenziale nei due campioni. Ad ogni giorno sono state eseguite le misurazioni, che valutavano la replicazione virale, attraverso il sistema Luminex tecnology (Dunbar, 2006).

Attraverso l?utilizzo dello spettrometria di massa con tecnologia ion-source, meglio descritta di seguito, ? stato individuato il motivo amminoacidico nelle sequenze proteiche rinvenute, C?C-CC--C- delle conotossine, sequenze delle fosfolifasi A2 like snake e delle proteine like la protrombina (attivante il fattore della coagulazione V A), della proteina like la bradichinina-fattore nautriuretico C, e le proteine appartenenti alla famiglia delle zinco metalloproteinasi. I casi controllo erano negativi e nulli per tali proteine.

Le tossine (figura 2) sono state analizzate utilizzando una tecnica di spettrometria di massa denominata SACI-CIMS.2. Quest'ultima ? basata su un approccio evoluto che permette di filtrare il fondo strumentale dai segnali analitici (Tecnologia CIMS: Mobility ionica). In questo modo la selettivit? e sensibilit? del sistema aumentano esponenzialmente.

Le figure 3-35 mostrano i grafici di spettrometria di massa relative ad alcune sequenze amminoacidiche rilevate che sono esemplificative delle numerose sequenze delle tossine rilevate nei campioni. Tutte le sequenze amminoacidiche rilevate mostravano una corrispondenza con le tossine note riportate sotto o con frammenti di queste. L'identificazione delle tossine ? stata effettuata utilizzando le proteine archiviate nella banca dati UniProtKB.3 e sono state trovate corrispondenze con le seguenti tossine note:

D2DGD8: LVLAIVLILM LVSLSTGAEE SGQEISMVGP PLYIWDPIPP CKQLDEDCGYGYSCCEDLSCQPLIEPDTMEITALVCQIESA (SEQ ID NO:1);

B3FIA5:

KAVQGDSDPSASLLTGDKNHDLPVKRDCTTCAGEECCGRCTCPWG (SEQ ID NO:2);

Q5K0C5:

A1X8B8:

P58811:

MFTVFLLVVLATTGVSFTLDRASDGGNAVAKKSDVTARFNWRCCLIPACR RNHKKFCG (SEQ ID NO:5);

D6C4J8:

D2Y488:

P0C8U9:

V5V893:

F5CPF1:

Q3C2C2:

(SEQ ID NO:11);

Q2PG83:

Q9PUG8:

A6MEY4:

P06860:

Q9I900:

P23028:

Q58L90:

Q7SZN0:

Q593B6:

Q58L91:

Q9W7J9:

B5AJT2:

MDLFILTRFILFLSFFMKSIHCQYSESQESGHNRNAPDKELTTEEFQLIF HQSQTVDIEYDFINITTEMIETERKVSFTIDGKEYHLSLTPAASQSVLPYGTKIK SAIWWTDNDTHIHEEDYSDERWDSRAIYENLEIMATILVRTENGTSYYDGVFVKY SNEGVRSLPGRLMNIYGANYHFVYDSNGSVYDVVLNGQDEPAVPADMASKIIFYS ETPCTCRLLIIQDLLMKTSRRLSSISTIFWNAVNLRFRPVQHPKVNIIITGIVIA KNEAAFQHVYRARYSKNSKLVHTGRVIDNGRYFFGTNFDPYYDNYDASFTMASMD DPTGKGGATVIGGICSSSNNIAYIRDVGSYSGVKVATHELGHLLNGQHDSDTTCS EKINDNIYTIMAKQGSTKASKFVWSSCTLTAFANFSKTTSAACLKDTYRKQ

(SEQ ID NO:23);

D6C4M3:

Q8AWI5:

RKSHDNAQLLTGINFNGPTAGLGYLGGICNPMYSAGIVQDHNKIHHLVAI

(SEQ ID NO:25);

F5CPF1:

GTPVDKLDRCCQAHDKCYTDAYRFYRCWPFLTLYSHTCSNRKVIC (SEQ ID NO:26);

P82662:

P58924:

A0A1P8NVR4:

MEKLTMLVLVAAVLLSAQVMVQGDGDQPADRDAVPRDDNPGGTIGKFMYI LHGCPFQPWC (SEQ ID NO:29);

P0DM19:

P0C1N5:

P58786:

MGKLTILVLVAAVLLSAQVMVQGDGDQPADRNAVPRDDNPGGASGKFMNV LRRSGCPWEP (SEQ ID NO:32);

A8YPR6:

P0C7P5:

Q9PW56:

(SEQ ID NO:35);

Q698K8:

Q9YGI1:

P59925:

VFINVKCTGSKQCLPACKAAVGKAAGKCMNGKCKCYT (SEQ ID NO:38);

C0JAU1:

P0C8L9:

Q8AY53:

P01485:

Q8AY46:

A8QL59:

P0DM21:

MFTVFLLVVLATAVVSFTSDRASDDGKAAASDLITLTIKGCCSRPPCIAN NPDLCG (SEQ ID NO:45);

Q2XXQ3:

P0CB07:

MFTVFLLVVLATTVVSFTSDRAFRGRNAAAKASGLVGLTDKRQECCSYPA CNLDHPELCG (SEQ ID NO:47);

P0DPT2:

SDGRNEAANDEASDVIELALKGCCSNPVCHLEHPNACGRRR (SEQ ID NO:48);

P0CY83:

Q9BP60:

A7X3M3:

MKTLPLVLAVVAFVYLDLAHTLKCRSGNVCILGDDCSEGENVCFQRKNGT GVFGMRVVRGCAASCPSPIGGEEVSCCSTDNCNNSFSRFF (SEQ ID NO:51).

Come detto sopra, le sequenze amminoacidiche delle tossine rilevate nei campioni mostravano una percentuale di identit? variabile con le sequenze SEQ ID NO:1-53 o con loro frammenti. In particolare, le sequenze delle tossine i cui diagrammi sono riportati nelle figure 3-35 hanno mostrato una identit? variabile con le seguenti sequenze amminoacidiche:

SEQ ID NO:52

LVLAIVLILM LVSLSTGAEE SGQEISMVGP PLYIWDPIPP CKQLDEDCGYGYSCCEDL;

SEQ ID NO:2 KAVQGDSDPSASLLTGDKNHDLPVKRDCTTCAGEECCGRCTCPWG;

SEQ ID NO:53 TVVSINLDHAFDGRNAAANNKATDLMARTVRRFCSDPPCRISNPESCGW; SEQ ID NO:54 TADYSRDQRQYRAVRLGDEMRNFKGARDCGGQGEGCYTQPCCPGLRC; SEQ ID NO:55 VLATTGVSFTLDRASDGGNAVAKKSDVTARFNWRCCLIPACRRNHKKFC; SEQ ID NO:56

RDVCELPFEEGPCFAAIR;

SEQ ID NO:57

MFTVFLLVIL ATTVVPFPSD RDPASNHENS KGSNRNAWLT PEECCAAPAC REMILEFC;

SEQ ID NO:58 ALGEGDGQAVAGDRNPSEARSTHEHFLQRLIRLIHGSDCQPCGQYVCCP; SEQ ID NO:59

PAHLLVLAAV CISLSGASSI APQPLNLIQF GNMIQCTIPG SSPLLDYADY GCYCGRGG;

SEQ ID NO:60

FLVVIVTTVSLAGAASAGEIQNLYQFGK;

SEQ ID NO:61

CGWGGRGTPKDATDRCCFVHDCCYGKVTGCNPKLGKYTYISENG;

SEQ ID NO:62 AGTQLCVAYVKYGCYCGPGGTGTPLDQLDRCCQTHDHCYDNAKKFGNCIP;

SEQ ID NO:63

TGKEPIVSYAFYGCYCGKGGRGKPKDATDRCCFVHDCCYEKVT;

SEQ ID NO:64 KNMIQCTVPNRSWWDFADYGCYCGRGGGTPVDDLDRCCQVHDNCYG; SEQ ID NO:65 MHPAHLLVLLGVCVSLLGAASIPRPSLNIMLFGNMIQCTIPCEQSWLGYL DYGCYCGS;

SEQ ID NO:66 TAKATLLVLALVVMATSGVSSASVAGGPVVNSDTVSRSDPERLSTRGC; SEQ ID NO:67

KPSLQYTING FANGTLPDVQ ACAYDHISWH LIGMSSSPEI FSVHFNGQTL EQNHYKVS;

SEQ ID NO:68 IAKELGLLDDEDNQEESHNVQTEDDEEQLMIATMLGFRSFKGSVAEEELN LTALALEE;

SEQ ID NO:69

EVWGFHQSEV VEWHLTSVGT VDEIVPVHLS GHTFLSKGKH QDILNLFPMS GESATVTM;

SEQ ID NO:70

TCYKGYHDTVVCKPHETICYEYFIPATHGNAILARGCGTSCPGGIRPVCC ;

SEQ ID NO:71 FGTNFDPYYDNYDASFTMASMDDPTGKGGATVIGGICSSSNNIAYIRDVG

S;

SEQ ID NO:72 PPKRDTLRNLLKIGTRGQGGCVPPGGGRCKANQACTKGGNPGTCGFQ; SEQ ID NO:73

RKSHDNAQLLTGINFNGPTAGLGYLGGICNPMYSAGIVQDHNKIHHLVAI

A;

SEQ ID NO:74 HDSVTCAPGENVCFLKSWCDAWCGSRGKKLSFGCAATCPKVNPGIDIECC

S;

SEQ ID NO:75 ALARDDRGCTRTCGGPKCTGTCTCTNSSKCGCRYNVHPSGWGCGCA; SEQ ID NO:76 VLVAAVLLSAQVMVQGDGDQPADRDAVPRDDNPGGTIGKFMYILHGCPFQ

P;

SEQ ID NO:77 QAIPGGGIPSAVNSRVGGDEKSGRSLEKRCRSGKTCPRVGPDVCCERSDC

F;

SEQ ID NO:78

TAVPLDGDQPADRPAERMQDDISSERHPMFDAVRDCCPLPACP;

SEQ ID NO:79 LLSAQVMVQGDGDQPADRNAVPRDDNPGGASGKFMNVLRRSGCPWEPWC; SEQ ID NO:80

EQKWLAPDAPPLEQKWLAPDAPP LEQKWLAPAAPPLEQKWLAPDAPPM; SEQ ID NO:81

ESPAGGTTAFREELSPGPEAASGPAAPHRLPKSKGASATSAASRPMRD; SEQ ID NO:82 TALREELSLGPEAASGVPSAGAEVGRSGSKAPAAPHRLSKSKGAAATSA; SEQ ID NO:83 QKPQCILNKPLRTDTVSTPVSGNELLEAGEECDCGSPGNPCCDAATCKLR

Q.

L'analisi e stata eseguita utilizzando un HPLC Ultimate 3000 (Thermofisher, USA). La colonna utilizzata a una Phenomenex Kinetex PFP 50x4.1 mm 2.6 pm. Le analisi sono state effettuate utilizzando un gradiente bifasico: Fase A (H20+0.2 % Acido Formico (HCOOH)) e Fase B acetonitrile (CH3CN). L'acquisizione dei dati e avvenuta mediante l'ausilio di uno spettrometro di massa HCT ULTRA (Bruker, Breme, Italy) provvisto di campo parzialmente otto-polare sull'analizzatore. La sorgente di ionizzazione utilizzata a una SACI.

Non era ovvio e per niente generico immaginare che il virus Sars-Cov-2 potesse replicarsi anche nei batteri, anzi la maggior parte della letteratura odierna non prende in considerazione questa realt? ora dal richiedente. Infatti storicamente i fagi sono considerati essere di dimensioni molto inferiori a quelle dei coronavirus, ossia dell?ordine dei nanometri, mentre il coronavirus ha dimensioni notevolmente maggiori dell?ordine dei micron. Inoltre, non era ovvio immaginare che il virus potesse replicarsi anche nei batteri del macrobiota, perch? sin dall?inizio della pandemia, esso ? stato classificato come virus aereo. Contrariamente nei test effettuati, e replicati, il virus risulta essere anche oro-naso-fecale.

Una volta individuate le molecole, ovvero i frammenti proteici, funzionali e attivi, il richiedente ha valutato se tale trascrizione dipendesse solo dai batteri in cui il virus si replica o anche da altri batteri, come meccanismo di autodifesa di tipo immunitario (E. Janik, M. Ceremuga, J. Saluk-Bijak, e M. Bijak, in ?Biological Toxins as the Potential Tools for Bioterrorism?, Int. J. Mol. Sci., vol. 20, n. 5, mar.

2019, doi: 10.3390/ijms20051181).

Il Richiedente ha osservato che alcuni antibiotici spengono sia la produzione delle tossine da parte dei batteri sia la replicazione del virus, mentre altri antibiotici non hanno per nulla effetto sulla replicazione del virus ma spengono una parte delle tossine. Tale dato suggerisce appunto un mondo immunitario dei batteri contro patogeni virali. Tale mondo pu? essere definito come la produzione di polipeptidi reattivi (domanda di brevetto numero 822020000160693 del 23/09/2020). Il problema critico per l?ospite umano e animale consiste nel meccanismo epitelio endoteliale e liposomico attraverso cui i frammenti attivi proteici/tossine entrano in circolo e creano legami di tipo reversibili o irreversibile appunto con i recettori dell?acetilcolina e della coagulazione.

A seguire ? stata estratta la frazione proteica dalla coltura batterica nel seguente modo:

centrifugazione del surnatante, prelievo della frazione pi? leggera e filtrazione su membrana batteriologica 0.22 ?m. Estratto in assenza di processo di denaturazione: Desalificazione. Precipitazione con solvente CH3CN 1:3. Risospensione con tampone NH4HCO3 50 mmol pH 7.8 (condizioni di refolding). Stabilizzante acido sorbico 1% (antibatterico).

Le tossine sono state rese immunogene attraverso il seguente modo: prelievo dopo filtrazione su membrana batteriologica 0.22 ?m. Utilizzata Urea 8M a temperatura ambiente. E? stato evitato il riscaldamento per impedire la cianilazione delle lisine. Precipitazione proteica con CH3CN aggiunto in rapporto 1:3. Precipitato ripreso con una soluzione di NH4HCO3 50 ?m Detergente denaturante SDS. Stabilizzante acido sorbico 1% (antibatterico).

La denaturazione dei preparati tossici ottenuti da surnatante delle colture batteriche pu? anche essere eseguita con metodiche convenzionali tra cui la denaturazione chimica: per trattamento delle proteine con sostanze chimiche tra cui l'urea, il cloruro di guanidinio e il tiocianato di guanidinio.

La propriet? di queste sostanze di denaturare la molecola proteica si deve alla loro capacit? di legare transientemente, attraverso legami deboli, come ad esempio legami idrogeno, i residui amminoacidici costituenti la proteina. Il legame con l'agente caotropico, preferito termodinamicamente a quello intramolecolare con altri residui, o intermolecolare con le molecole d'acqua, fa s? che la proteina non sia pi? in grado di mantenere la propria struttura tridimensionale e si denaturi.

Alternativamente alla denaturazione chimica pu? essere condotta una denaturazione termica, a caldo e a freddo. La denaturazione a caldo dovr? essere rapida e non progressiva onde evitare la nuova ricompattazione della proteina/tossina.

Un ulteriore metodo possibile ? la denaturazione con la formaldeide: l'inattivazione avviene attraverso il metodo di Ramon, messo a punto 100 anni fa ma ancora utilizzato. La tossina viene trattata con una soluzione di formaldeide al 4? per circa 30 giorni ad una temperatura di 37 ?C, fino al raggiungimento della completa detossificazione. A questo punto l?anatossina ? immunogena (?formalinized diphtheria toxoid (anatoxin)?, am. j. public health n. y. n 1912, vol. 15, n. 12, pagg. 1092?1093, dic. 1925).

L?ultima fase ? stata la semplice inoculazione in campioni animali, topi wild type, non modificati geneticamente e non sacrificati. Non ? stato preso in considerazione, volutamente e appositamente, l?over espressione del recettore ACE2, molto discusso in letteratura, per il semplice motivo che sono state testate le tossine al fine di valutare se la loro presenza ? associata alla clinica e ai sintomi ?virus like SARS-CoV-2?. Le osservazioni sono state febbre, debolezza muscolare oggettiva (intesa come difficolt? a muoversi), polmonite interstiziale (rx toraciche) e atti di dispnea/tosse, elevazione del D-dimero. ? stata rasata un?area ristretta dell?addome (circa 21-2 cm2). Prima dell?immunizzazione la pelle ? stata idratata per alcuni minuti e poi asciugata con tessuto asciutto. Il gruppo W-Ti CON antidoto ? stato immunizzato con volume di 30?L della soluzione anatossica preparata. Al Gruppo W-T non immunizzato invece ? stata somministrata giornalmente e per 5 giorni il pool tossico. Come dose letale neurotossica ? stata presa come riferimento quella della tossina tetanica, ovvero < 2,5ng/kg (WHO 2010). In base al peso del W-T ? stata praticata una dose giornaliera fino alla comparsa dei sintomi, mentre nei topi W-T immunizzati ? stata praticata una somministrazione 4 settimane prima, in attesa dell?incremento del titolo anticorpale. Nel gruppo non immunizzato sono comparsi i sintomi ?like Covid-19? e alla cessazione della somministrazione del tossico praticando il pool anatossico ? stata osservata una regressione degli stessi. Nel gruppo W-T immunizzato 4 settimane nessuna comparsa dei sintomi si ? verificata al momento e fino a 14 giorni dopo dalla somministrazione del tossico. D?altronde la letteratura ? molto ampia a riguardo dell?utilizzo sicuro delle anatossine verso le tossine al fine di immunizzare il soggetto.

Claims

RIVENDICAZIONI

1) Prodotto per l?uso nella prevenzione e nel trattamento della malattia da coronavirus, detto prodotto consistente in:

in cui dette una o pi? anatossine immunogeniche comprendono o consistono in una sequenza amminoacidica immunogenica

avente una percentuale di identit? di sequenza con la sequenza amminoacidica di dette una o pi? tossine, o con parti immunogeniche della sequenza amminoacidica di dette una o pi? tossine, detta percentuale di identit? essendo di almeno il 20%, preferibilmente di almeno il 50%, o di almeno il 60% o di almeno il 70%, o di almeno l?80% o di almeno il 90%,

b) un anticorpo policlonale o monoclonale contro dette una o pi? tossine prodotte da una cellula in presenza di un coronavirus; o

c) una composizione farmaceutica comprendente o consistente nel prodotto come definito in a) e/o b) in associazione con uno o pi? eccipienti e/o coadiuvanti.

2) Prodotto per l?uso secondo la rivendicazione 1, in cui dette una o pi? tossine sono scelte nel gruppo che consiste in tossine in grado di legare un recettore dell?acetilcolina e/o l?acetilcolinesterasi, tossine fosfolipasi A2, tossine attivanti la protrombina, tossine aventi funzione della bradichinina-fattore nautriuretico C e tossine aventi funzione delle zinco metalloproteinasi.

3) Prodotto per l?uso secondo la rivendicazione 2, in cui quando dette una o pi? tossine sono in grado di legare un recettore dell?acetilcolina e/o l?acetilcolinesterasi, dette una o pi? tossine comprendono un motivo cisteinico in grado di legare un recettore dell?acetilcolina, ad esempio un motivo cisteinico di una tossina scelta nel gruppo che consiste in una conotossina in grado di legare un recettore dell?acetilcolina, una tossina a tre dita in grado di legare un recettore dell?acetilcolina, come ad esempio le bungoratossine.

4) Prodotto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui dette una o pi? anatossine comprendono un motivo cisteinico delle tossine in grado di legare un recettore dell?acetilcolina, ad esempio un motivo cisteinico di una tossina scelta nel gruppo che consiste in una conotossina in grado di legare un recettore dell?acetilcolina, una tossina a tre dita in grado di legare un recettore dell?acetilcolina, come ad esempio le bungoratossine.

5) Prodotto per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui il coronavirus ? scelto nel gruppo che consiste in SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, preferibilmente SARS-CoV-2.

6) Prodotto per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui la cellula ? scelta nel gruppo che consiste in cellula batterica, ad esempio dei batteri del microbiota intestinale o dei batteri delle mucose orale e nasale del soggetto infetto da coronavirus, una cellula del soggetto infetto da coronavirus, una cellula eucariotica presente nel soggetto infetto da coronavirus.

7) Prodotto per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui l?uso ? sull?uomo o sull?animale.

8) Prodotto per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui dette una o pi? anatossine comprendono o consistono in una sequenza amminoacidica o in una porzione immunogenica di questa, in cui detta sequenza amminoacidica ? scelta nel gruppo che consiste in:

KAVQGDSDPSASLLTGDKNHDLPVKRDCTTCAGEECCGRCTCPWG (SEQ ID NO:2);

MFTVFLLVVLATTGVSFTLDRASDGGNAVAKKSDVTARFNWRCCLIPACR RNHKKFCG (SEQ ID NO:5);

(SEQ ID NO:11);

(SEQ ID NO:23);

RKSHDNAQLLTGINFNGPTAGLGYLGGICNPMYSAGIVQDHNKIHHLVAI

(SEQ ID NO:25);

GTPVDKLDRCCQAHDKCYTDAYRFYRCWPFLTLYSHTCSNRKVIC (SEQ ID NO:26);

MEKLTMLVLVAAVLLSAQVMVQGDGDQPADRDAVPRDDNPGGTIGKFMYI LHGCPFQPWC (SEQ ID NO:29);

MGKLTILVLVAAVLLSAQVMVQGDGDQPADRNAVPRDDNPGGASGKFMNV LRRSGCPWEP (SEQ ID NO:32);

(SEQ ID NO:35);

VFINVKCTGSKQCLPACKAAVGKAAGKCMNGKCKCYT (SEQ ID NO:38);

MFTVFLLVVLATAVVSFTSDRASDDGKAAASDLITLTIKGCCSRPPCIAN NPDLCG (SEQ ID NO:45);

MFTVFLLVVLATTVVSFTSDRAFRGRNAAAKASGLVGLTDKRQECCSYPA CNLDHPELCG (SEQ ID NO:47);

SDGRNEAANDEASDVIELALKGCCSNPVCHLEHPNACGRRR (SEQ ID NO:48);

LVLAIVLILM LVSLSTGAEE SGQEISMVGP PLYIWDPIPP CKQLDEDCGYGYSCCEDL (SEQ ID NO:52);

TVVSINLDHAFDGRNAAANNKATDLMARTVRRFCSDPPCRISNPESCGW

(SEQ ID NO:53);

TADYSRDQRQYRAVRLGDEMRNFKGARDCGGQGEGCYTQPCCPGLRC

(SEQ ID NO:54);

VLATTGVSFTLDRASDGGNAVAKKSDVTARFNWRCCLIPACRRNHKKFC

(SEQ ID NO:55);

RDVCELPFEEGPCFAAIR (SEQ ID NO:56);

MFTVFLLVIL ATTVVPFPSD RDPASNHENS KGSNRNAWLT PEECCAAPAC REMILEFC (SEQ ID NO:57);

ALGEGDGQAVAGDRNPSEARSTHEHFLQRLIRLIHGSDCQPCGQYVCCP

(SEQ ID NO:58);

PAHLLVLAAV CISLSGASSI APQPLNLIQF GNMIQCTIPG SSPLLDYADY GCYCGRGG (SEQ ID NO:59);

FLVVIVTTVSLAGAASAGEIQNLYQFGK (SEQ ID NO:60);

CGWGGRGTPKDATDRCCFVHDCCYGKVTGCNPKLGKYTYISENG (SEQ ID NO:61);

AGTQLCVAYVKYGCYCGPGGTGTPLDQLDRCCQTHDHCYDNAKKFGNCIP

(SEQ ID NO:62);

TGKEPIVSYAFYGCYCGKGGRGKPKDATDRCCFVHDCCYEKVT (SEQ ID NO:63);

KNMIQCTVPNRSWWDFADYGCYCGRGGGTPVDDLDRCCQVHDNCYG

(SEQ ID NO:64);

MHPAHLLVLLGVCVSLLGAASIPRPSLNIMLFGNMIQCTIPCEQSWLGYL DYGCYCGS (SEQ ID NO:65);

TAKATLLVLALVVMATSGVSSASVAGGPVVNSDTVSRSDPERLSTRGC

(SEQ ID NO:66);

KPSLQYTING FANGTLPDVQ ACAYDHISWH LIGMSSSPEI FSVHFNGQTL EQNHYKVS (SEQ ID NO:67);

IAKELGLLDDEDNQEESHNVQTEDDEEQLMIATMLGFRSFKGSVAEEELN LTALALEE (SEQ ID NO:68);

EVWGFHQSEV VEWHLTSVGT VDEIVPVHLS GHTFLSKGKH QDILNLFPMS GESATVTM (SEQ ID NO:69);

TCYKGYHDTVVCKPHETICYEYFIPATHGNAILARGCGTSCPGGIRPVCC

(SEQ ID NO:70);

FGTNFDPYYDNYDASFTMASMDDPTGKGGATVIGGICSSSNNIAYIRDVG

S (SEQ ID NO:71);

PPKRDTLRNLLKIGTRGQGGCVPPGGGRCKANQACTKGGNPGTCGFQ

(SEQ ID NO:72);

RKSHDNAQLLTGINFNGPTAGLGYLGGICNPMYSAGIVQDHNKIHHLVAI

A (SEQ ID NO:73);

HDSVTCAPGENVCFLKSWCDAWCGSRGKKLSFGCAATCPKVNPGIDIECC

S (SEQ ID NO:74);

ALARDDRGCTRTCGGPKCTGTCTCTNSSKCGCRYNVHPSGWGCGCA

(SEQ ID NO:75);

VLVAAVLLSAQVMVQGDGDQPADRDAVPRDDNPGGTIGKFMYILHGCPFQ

P (SEQ ID NO:76);

QAIPGGGIPSAVNSRVGGDEKSGRSLEKRCRSGKTCPRVGPDVCCERSDC

F (SEQ ID NO:77);

TAVPLDGDQPADRPAERMQDDISSERHPMFDAVRDCCPLPACP (SEQ ID NO:78);

LLSAQVMVQGDGDQPADRNAVPRDDNPGGASGKFMNVLRRSGCPWEPWC

(SEQ ID NO:79);

EQKWLAPDAPPLEQKWLAPDAPP LEQKWLAPAAPPLEQKWLAPDAPPM

(SEQ ID NO:80);

ESPAGGTTAFREELSPGPEAASGPAAPHRLPKSKGASATSAASRPMRD

(SEQ ID NO:81);

TALREELSLGPEAASGVPSAGAEVGRSGSKAPAAPHRLSKSKGAAATSA

(SEQ ID NO:82) e/o QKPQCILNKPLRTDTVSTPVSGNELLEAGEECDCGSPGNPCCDAATCKLR

Q (SEQ ID NO:83).

9) Prodotto per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui dette una o pi? anatossine sono ottenute mediante denaturazione di dette una o pi? tossine prodotte da una cellula in presenza di un coronavirus.

10) Prodotto per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto prodotto ? un vaccino o un antidoto.

11) Prodotto come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti per l?uso contro gli avvelenamenti da una o pi? tossine di sequenza amminoacidica da SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:85, ad esempio in conseguenza di morso o puntura di o contatto con animali, di ingestione di alimenti, di inalazione di gas o vapori contenenti dette tossine.