CN106117365B - 抗猪链球菌病且具有自身免疫活性的融合蛋白及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗猪链球菌病且具有自身免疫活性的融合蛋白及其制备和应用。该融合蛋白由位于氨基端的Omp1626‑168肽和位于羧基端的Sao28‑318肽组成。Sao28‑318肽是Sao蛋白分子中暴露于猪链球菌细胞外的具有免疫原性且在不同菌种及亚型间高度保守的氨基酸片段，Omp1626‑168肽是Omp16分子中暴露于布鲁氏菌细胞外的具有TLR4激活活性、且不含Lipobox(弱毒或完全无毒)的氨基酸片段。利用本发明的Omp1626‑168/Sao28‑318融合蛋白对小鼠免疫攻毒试验，表明Omp1626‑168/Sao28‑318融合蛋白具有较好的免疫保护性效果，能诱导很强的细胞免疫应答反应和体液免疫应答反应，但以Th1反应为主，且具有自身佐剂作用，是链球菌的理想疫苗抗原，在新型疫苗的开发应用方面具有重要的价值。

Description

抗猪链球菌病且具有自身免疫活性的融合蛋白及其制备和 应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种抗猪链球菌病且具有自身免疫活性的融合蛋白及其制备和应用。
背景技术
猪链球菌(Streptococcus suis)是主要的猪致病菌之一，其血清型多达35种，从临床病猪中分离到的链球菌中，2型最常见，也是致病力最强的血清型。猪链球菌病临床上主要表现为脑膜炎、淋巴结脓肿、关节炎、化脓性肺炎及败血症，在某些特定诱因作用下，发病猪群死亡率可达到80％。
近年来由于商业猪场中饲养密度不断增高，猪链球菌病呈上升趋势，常继发于某些病毒性疫病或与一些细菌性疾病混合感染，不仅给养猪生产造成严重的经济损失，也严重影响着人类公共卫生。
一直以来人们认为猪链球菌是主要的猪致病菌之一，对人的感染仅限于与猪或其产品密切接触者。然而，近几年在亚洲国家的几次流行使人们认识到，猪链球菌也是威胁人类生命和健康的主要致病菌之一。
随着耐药菌株的大量出现和抗生素疗效渐失，疫苗免疫接种成为预防猪链球菌病最佳选择。但目前猪场使用的灭活疫苗或减毒活疫苗并没有可靠的预防效果，且由于猪链球菌2型血清型复杂，大多数疫苗在不同血清型之间无交叉保护作用。
猪链球菌感染不仅造成养殖业巨大的经济损失，也严重威胁人类健康。目前猪场使用的灭活疫苗或减毒活疫苗并没有可靠的预防效果，大多数在不同血清型之间无交叉保护作用，且安全性差。
近年虽涌现出大量潜在的亚单位疫苗，但缺少理想适用的免疫佐剂，因此开发出高安全性，对多种猪链球菌亚型具有交叉保护作用，且具有自身免疫佐剂作用的亚单位疫苗，具有广阔的市场前景。
猪链球菌膜蛋白(Sao)大部分暴露于细菌细胞外，易被特异性抗体所识别和结合。Sao是一个高度保守的膜蛋白，几乎分布于猪链球菌的所有血清型，该蛋白C‐端部分为含有重复序列的可变区，不同亚型或菌种所含的重复序列不同，但N‐端肽(Sao28‐318)高度保守，其氨基酸组成在35个亚型中完全一致，因此由其诱导产生的抗体对几乎所有的血清性具有交叉保护作用；
但我们用小鼠和猪感染模型评价Sao的保护作用时发现，Sao免疫所产生的保护作用并不与其所诱导的抗体滴度成正比，而更多的与免疫反应类型有关，如当用Quil A作为免疫佐剂将Sao诱导的免疫反应转变为以Th1反应为主时，Sao的保护作用明显优于用Emulsigen作为佐剂时(Th2反应为主)的保护作用。这一现象促使我们思考如何在实际应用中使Sao能够诱导机体产生以细胞反应为主的免疫反应。
最近研究发现，一种布氏杆菌的外膜脂蛋白(Omp16)，除了具有免疫原性外，还能激活TLR4受体并诱导Th1为主的免疫反应，单独用Omp16免疫即能有效保护动物免受布氏菌的感染。体外实验发现，重组Omp1626‐168蛋白能够引起TLR4依赖的DC表面分子和其分泌的细胞因子改变，Omp1626‐1688激活的DC在与T细胞的联合培养中诱导T细胞向Th1反应分化。
因此，利用生物工程技术，制备包括Omp1626‐168和Sao28‐318的融合蛋白，从而开发出具有自身免疫佐剂作用的抗猪链球菌感染亚单位疫苗成为可能。
发明内容
本发明的目的是解决上述现有技术存在的问题，提供一种作为猪链球菌病疫苗且具有自身佐剂作用的融合蛋白及其制备和应用。利用本发明的融合蛋白制备的疫苗，可以诱导很强的针对猪链球菌的体液免疫应答和细胞免疫应答，并能诱导免疫反应向Th1偏移，表现出比传统抗原蛋白更好的有效性和安全性。
本发明具体技术方案如下：
一种抗猪链球菌病且具有自身免疫活性的融合蛋白，所述融合蛋白由位于氨基端的Omp1626‐168肽和位于羧基端的Sao28‐318肽组成，Sao28‐318肽是Sao蛋白分子中暴露于猪链球菌细胞外的具有免疫原性且在不同菌种及亚型间高度保守的氨基酸片段，Omp1626‐168肽是Omp16分子中暴露于布鲁氏菌细胞外的具有TLR4激活活性、且不含Lipobox(弱毒或完全无毒)的氨基酸片段，Omp1626‐168肽和Sao28‐318肽通过连接肽相连。
所述的Sao28‐318肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，Omp1626‐168肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
所述融合蛋白的氨基酸序列中Omp1626‐168肽和Sao28‐318肽之间的连接肽的氨基酸序列为GSGGGSGGGSGS。
所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
所述的Sao28‐318肽核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，Omp1626‐168肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
所述融合蛋白的氨基酸序列中Omp1626‐168肽和Sao28‐318肽之间的连接肽的核苷酸序列为GGTAGCGGTGGCGGTAGCGGTGGCGGTAGCGGTAGC。
编码所述的融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
所述的融合蛋白的制备方法，包括用上述的基因序列克隆至原核细胞中进行异源表达，并纯化该融合蛋白。具体包括以下步骤：
1、引物的设计合成
根据所述的融合蛋白的基因序列设计PCR扩增引物
上游引物P1
5’-CGCCCATGGCGGCGTCAAAGAAGAACCT-3’
下游引物P2
5’-CGCCTCGAGCTCTTCATTAGCTATTTGC-3’
2、PCR扩增目的片段、纯化
1)建立PCR反应体系：
在PCR热循环仪上进行以下反应：94℃预变性5min；94℃30Sec，55℃30s，72℃1min进行35个循环；72℃7min；
2)PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果与预期扩增产物目的片段大小一致，在凝胶成像系统下，用灭菌的手术刀切下目的片段琼脂块；
3)PCR产物回收纯化
用DNA凝胶回收试剂盒回收和纯化DNA；
3、回收纯化后的PCR产物与pET‐28a(+)载体的双酶切及连接转化
1)回收纯化后的PCR产物与pET‐28a(+)载体的双酶切
将回收纯化好的片段及原核表达载体pET‐28a(+)用NcoI和XhoI双酶切，37℃酶切2h，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的片段，
酶切体系如下：
2)目的片段与表达载体的连接
酶切后根据回收的产物量，计算出应加入的相应体积，于4℃连接过夜，
具体的连接体系如下：
3)化学转化
将10μL连接产物加入到E.coli DH5α感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴锅中90s，再次冰浴3min，加入800μL预热的LB液体培养基，温和震荡复苏1h，5000rpm离心3min，弃去900μL上清，余液重悬菌体后，取200μL涂布于含0.1％硫酸卡那霉素的LB固体培养基上，37℃恒温培养12‐16h；
4)鉴定阳性克隆
挑取单克隆，37℃100μg/mL卡那霉素阳性LB液体培养基摇菌培养增殖12h，集菌；使用试剂盒提取质粒，提取好的重组质粒用NcoI和XhoI双酶切，37℃酶切2h，双酶切后用0.1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶切鉴定体系如下：
4、目的蛋白诱导表达
1)诱导表达
将酶切鉴定好的重组质粒以热激法方式转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中，接种于5mL含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜震荡培养，取200μL菌液接种至新鲜配制的10mL含有100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃200rpm恒温培养3‐4h OD600≈0.6后，加入IPTG溶液，使其终浓度为1mmol/L，继续37℃培养，诱导表达6h；
2)上样和纯化
将诱导表达好的菌液用50mL的离心管，12000rpm离心2min收集菌体，加入30mLBinding buffer重悬菌体，于超声破碎仪破碎细胞，功率400W，工作8s，间隔10s，50次，至菌液变清亮；12000rpm离心10min后，上清用0.45μm微孔滤膜过滤至干净的50mL离心管中，进行镍柱亲和层析，最终用5mL washing buffer洗脱，蛋白分装冻存于‐80℃备用。
上述的融合蛋白在制备抗猪链球菌病且具有自身免疫活性的疫苗中的应用。
本发明所述猪链球菌膜蛋白包括但不限于Sao28‐318，所述布鲁氏菌外膜蛋白包括但不限于Omp1626‐168
本发明通过长期而广泛的研究发现，Sao是一个高度保守的膜蛋白，几乎分布于猪链球菌的所有血清型，其N‐端肽(Sao28‐318)高度保守，其氨基酸组成在35个亚型中完全一致，因此由其诱导产生的抗体对几乎所有的血清性具有交叉保护作用。Sao在猪链球菌表面丰度高，且在体内感染过程中仍有高表达，使其容易成为特异性免疫的攻击目标。实验表明，机体清除像猪链球菌这种带有表面粘多糖的细菌主要靠以Th1反应为主的细胞免疫反应。布氏杆菌的外膜脂蛋白(Omp16)，能激活TLR4受体并诱导Th1为主的免疫反应，单独用Omp16免疫也能有效保护动物免受布氏菌的感染。故本发明以Sao的保守区域为N‐端，设计新颖的融合蛋白，以解决当前猪链球菌病防治难，并提供一种能保护猪链球菌感染，并具有自身免疫佐剂作用的新型疫苗。
附图说明
图1为Sao28‐318、Omp1626‐168/Sao28‐318PCR扩增结果图；
图中M为DNA Marker，1为Sao28‐318基因目的片段，2为Omp1626‐168/Sao28‐318PCR基因目的片段；
图2为Sao28‐318、Omp1626‐168/Sao28‐318重组质粒酶切鉴定结果图；
图中M：DNA Marker，1：pET‐28a(+)‐Sao28‐318双酶切鉴定，2、pET‐28a(+)‐Omp1626‐168/Sao28‐318双酶切鉴定；
图3为Sao28‐318和Omp1626‐168/Sao28‐318纯化蛋白检测图
图中M:蛋白分子量标准，1：Sao28‐318蛋白，2：Omp1626‐168/Sao28‐318蛋白
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南等书中所述的条件，或遵照制造厂商所建议的条件。
【实施例1】Sao28‐318和Omp1626‐168/Sao28‐318重组蛋白的构建
1.引物的设计合成
根据GenBank上已公布的Sao28‐318(GenBank Gene ID:61969363)、Omp1626‐168(GenBank Gene ID:333601408)基因序列，经过拼接，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成获得如下序列Omp1626‐168/Sao28‐318，设计合成两对引物，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，引物的序列如下：
1)Sao28‐318基因PCR扩增引物
上游引物P1
5’-CGCCCATGGCGTCGGCACAAGAAGTAA-3’
下游引物P2
5’-CGCCTCGAGCTCTTCATTAGCTATTTGC-3’
2)Omp1626‐168/Sao28‐318基因PCR扩增引物
上游引物P1
5’-CGCCCATGGCGGCGTCAAAGAAGAACCT-3’
下游引物P2
5’-CGCCTCGAGCTCTTCATTAGCTATTTGC-3’
2.PCR(聚合酶链反应)扩增目的片段、纯化
1)建立PCR反应体系：
用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：94℃预变性5min；94℃30Sec，55℃30s，72℃1min进行35个循环；72℃7min。
2)PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果与预期扩增产物目的片段大小一致，如图1所示。在凝胶成像系统下，用灭菌的手术刀切下目的片段琼脂块。
3)PCR产物回收纯化
将PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳后，于紫外灯下切取含有目的片段的凝胶，用DNA凝胶回收试剂盒(DNA Gel Extraction Kit)回收和纯化DNA，具体过程按照说明书进行。
3.PCR产物与pET‐28a(+)载体的双酶切及连接转化
1)PCR产物与pET‐28a(+)载体的双酶切
将上述回收好的片段及原核表达载体pET‐28a(+)用NcoI和XhoI双酶切，37℃酶切2h，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的片段。
酶切体系如下：
2)目的片段与表达载体的连接
酶切后根据回收的产物量，计算出应加入的相应体积，于4℃连接过夜。具体的连接体系如下：
3)化学转化
将连接产物(10μL)加入到E.coli DH5α感受态细胞(天根生化科技有限公司)，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴锅中90s，再次冰浴3min，加入800μL预热的LB液体培养基，温和震荡复苏1h，5000rpm离心3min，弃去900μL上清，余液重悬菌体后，取200μL涂布于含0.1％硫酸卡那霉素的LB固体培养基上，37℃恒温培养12‐16h。
4)鉴定阳性克隆
挑取单克隆，37℃卡那霉素阳性LB液体培养基(100μg/mL)摇菌培养增殖12h，集菌。使用OMEGA试剂盒提取质粒，提取好的重组质粒用NcoI和XhoI双酶切，37℃酶切2h，双酶切后用0.1％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图2)
酶切鉴定体系如下：
4.目的蛋白诱导表达
1)诱导表达
将酶切鉴定好的重组质粒以热激法方式转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中，接种于5mLLB液体培养基中(卡那霉素100μg/mL)，37℃过夜震荡培养，取200μL菌液接种至10mL新鲜配制的卡那霉素阳性(卡那霉素100μg/mL)LB培养基中，于37℃200rpm恒温培养3‐4hOD600≈0.6后，加入IPTG溶液，使其终浓度为1mmol/L，继续37℃培养，诱导表达6h，收集菌体，超声裂解，过Ni柱纯化，将纯化好的蛋白进行SDS‐PAGE电泳，结果得到符合目的蛋白大小的纯化蛋白，详见图3；
2)上样和纯化
将诱导表达好的菌液用50mL的离心管，12000rpm离心2min收集菌体，加入30mLBinding buffer重悬菌体，于超声破碎仪破碎细胞(400W，工作8s，间隔10s，50次)至菌液变清亮。12000rpm离心10min后，上清用0.45μm微孔滤膜过滤至干净的50mL离心管中，进行镍柱亲和层析，最终用5mL washing buffer洗脱，蛋白分装冻存于‐80℃备用。
【实施例2】融合蛋白的抗原性鉴定
将上述制备所得的融合蛋白进行SDS‐PAGE后的凝胶用半干法转印至PVDF膜上，37℃封闭1.5h，加入一抗(二免后采集的小鼠血清稀释一定倍数)于4℃封闭过夜。将膜用TBST洗涤后加入按1:2000稀释的二抗羊抗小鼠(IgG‐HRP)，放置于摇床上室温2h，洗去二抗后用化学发光底物检测两种一抗与融合蛋白的反应情况。结果显示，在目的蛋白大小的位置出现了相应的条带，表明融合蛋白能与小鼠血清发生特异反应，有良好的免疫原性。
【实施例3】融合蛋白Omp1626‐168/Sao28‐318可以诱导较强的体液免疫应答
融合蛋白诱导的抗体水平检测
采用常规ELISA检测免疫小鼠血清中抗Omp1626‐168/Sao28‐318特异性抗体水平。具体地，以人工合成并鉴定正确的Omp1626‐168/Sao28‐318包被96孔酶标板，4℃过夜；用PBST洗板3次，加入封闭液于37℃孵育2h；PBST用洗涤3次，以PBST缓冲液1∶100稀释被检血清，37℃孵育1.5h。3次洗板后，加入HPR标记的羊抗鼠IgG-HRP于37℃孵育1h；PBST洗板5次，TMB避光显色，2mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪读取450nm的OD值，以确定血清抗体水平。结果显示融合蛋白Omp1626‐168/Sao28‐318免疫组与Omp1626‐168/Sao28‐318+弗氏佐剂组一样，可以诱导小鼠产生强烈的体液免疫应答反应，随着免疫次数的增加血清中特异性抗体的水平随之上升，相比较，Sao28‐318免疫组产生的体液免疫应答显著低于本发明所公布的融合蛋白Omp1626‐168/Sao28‐318。
【实施例4】Sao28‐318、Omp1626‐168/Sao28‐318融合蛋白腹腔免疫小鼠的蛋白疫苗效能的检测
研究2种亚单位疫苗腹腔接种小鼠所产生的免疫效果，验证对比Sao28‐318、Omp1626‐168/Sao28‐318两种蛋白免疫效能。
本发明采用BALB/c小鼠为动物模型。
将纯化蛋白Sao28‐318、Omp1626‐168/Sao28‐318进行乳化，并将二者分别与等体积的弗氏佐剂进行乳化，制备免疫原。
取100只健康雌性BALB/c小白鼠、6周龄、体重16‐18g的SPF级BALB/c小鼠(湖南斯莱克景达实验动物有限公司)随机分成5组(对照组，Sao28‐318组，Sao28‐318+弗氏完全佐剂组，Omp1626‐168/Sao28‐318组，Omp1626‐168/Sao28‐318+弗氏完全佐剂组)，腹腔注射，蛋白免疫剂量为50μg/只(100μL)，对照组每只注射100μL PBS。一免后14天进行二免，二免的剂量与一免相同。二免后9天用猪链球2型以绝对致死量进行攻毒，攻毒后观察小鼠死亡情况并记录数据，记录时间为10d。结果显示，Sao28‐318组、Sao+弗氏完全佐剂组、Omp1626‐168/Sao28‐318组、Omp1626‐168/Sao28‐318+弗氏完全佐剂组对攻毒菌株的免疫保护率分别为30％、40％、70％、80％。
以上说明，Omp1626‐168/Sao28‐318具有对链球菌的免疫保护作用，并具有一定的自身佐剂作用。

Claims (8)

1.一种抗猪链球菌病且具有自身免疫活性的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由位于氨基端的Omp1626-168肽、连接肽和位于羧基端的Sao28-318肽组成，Sao28-318肽是Sao蛋白分子中暴露于猪链球菌细胞外的具有免疫原性且在不同菌种及亚型间高度保守的氨基酸片段，Omp1626-168肽是Omp16分子中暴露于布鲁氏菌细胞外的具有TLR4激活活性、且不含Lipobox的氨基酸片段，Omp1626-168肽和Sao28-318肽通过连接肽相连；所述的Sao28-318肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示， Omp1626-168肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1 所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列中Omp1626-168肽和Sao28-318肽之间的连接肽的氨基酸序列为GSGGGSGGGSGS。
3.根据权利要求1 所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:3所示。
4.根据权利要求1 所述的融合蛋白，其特征在于，编码所述的Sao28-318肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示， 编码所述的Omp1626-168肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
5.根据权利要求1 所述的融合蛋白，其特征在于，编码所述的连接肽的核苷酸序列为GGTAGCGGTGGCGGTAGCGGTGGCGGTAGCGGTAGC。
6.编码权利要求1-5任一项所述的融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
7.权利要求1-5任一项所述的融合蛋白的制备方法，包括将权利要求6所述的基因克隆至原核细胞中进行异源表达，并纯化该融合蛋白。
8.权利要求1-5任一项所述的融合蛋白在制备抗猪链球菌病且具有自身免疫活性的疫苗中的应用。
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