CN1184320C - Mhc－ⅱ类配体作为疫苗佐剂以及lag－3用于癌症治疗的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及MHC-II类配体如CD4和LAG-3用于生产预防或治疗包括抗原特异性免疫应答的病理状态的药剂的应用，以及LAG-3在癌症免疫治疗的应用。本发明还涉及一种药物组合物，该组合物含有有效量的能诱导抗原特异性免疫应答的抗原以及有效量的MHC II类配体，其中所述MHC II类配体作为类似佐剂的制剂存在。
Description
本发明涉及LAG-3和CD4的应用，更广泛地说，涉及MHC-II类配体或MHC-II类样配体作为疫苗佐剂以加强抗原特异性免疫应答，以及LAG-3作为癌症免疫治疗中治疗剂的应用。
现在已经认识到，MHC II类区域编码的蛋白参与了免疫识别的许多方面，其中包括不同淋巴样细胞(如淋巴细胞和抗原呈递细胞)之间的相互作用。不同的观察结果还表明，不通过CD4发生的其它机制也参与了T辅助淋巴细胞的效应功能。
人CD4+和CD8+激活的T细胞和NK细胞所表达的淋巴细胞激活基因3(LAG-3)编码了503个氨基酸(aa)的I型膜蛋白，其具有四个细胞外免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域(1)，它是MHC II类分子的配体(2)。分析该序列表明，尽管整个氨基酸序列与人CD4的同源性仅高于背景水平(约20％的序列相同性)，但是有值得注意的一小段序列与CD4对应位置上发现的一段氨基酸序列相同。在LAG-3分子内，在结构域1(D1)和3(D3)之间以及结构域2(D2)和4(D4)之间发现有一些内部序列同源，这提示LAG-3象CD4一样通过预先存在的2个IgSF结构(1)基因复制而进化得到。另外，LAG-3和CD4基因在染色体12短臂远部上非常靠近(3)。因此，LAG-3和CD4可视作是IgSF中进化上的“第一代表亲”(2)。
和CD4一样，hLAG-3由结构域2和4内具有WxC特征(signature)基序的Ig样胞外结构域组成；然而，与CD4的区别是结构域1中存在额外的环序列(被17B4mAb识别)，和人LAG-3(hLAG-3)中存在胞质内富含脯氨酸基序(EP重复序列)。最近，克隆了鼠淋巴细胞激活基因3(mLAG-3)，发现其与hLAG-3有大约70％的同源性，在胞质内尾序列中有同样的富含脯氨酸的基序。
CD4+T细胞克隆在抗LAG-3单克隆抗体存在下的抗原特异性刺激，导致增殖延长并产生细胞因子(5)。已经提出，hLAG-3对CD4+T淋巴细胞激活的调节作用是通过T细胞上表达的MHC II类分子和LAG-3 Ig融合蛋白交联而致(6)。LAG-3 MHC-II类相互作用通过CD4+T细胞上表达的MHC-II类分子抑制了信号的产生(降低增殖和细胞因子的产生)，提示LAG-3和MHC-II类均是下调T辅助细胞介导的免疫应答的效应分子。发现hLAG-3 Ig融合蛋白和异源(鼠和猴)MHC-II类分子结合。另外，已经提出mLAG-3在效应细胞内转导了一个阳性信号，因为具有LAG-3无效突变的转基因小鼠缺失NK细胞区室(7)。
经工程改造表达膜分子(B7.1，B7.2，CD95L，…)或分泌型分子(IL-1、IL-12)的小鼠肿瘤细胞系通常用于研究免疫应答或抗肿瘤效应。该方法暗示，许多肿瘤细胞具有潜在的抗原性(9)，并且在表达分子时变成免疫原性。被归类为内在免疫原性的实验小鼠肿瘤，当给同系小鼠体内注射单剂非复制性细胞疫苗后，它们引发了抵抗随后致死性攻击的保护性免疫应答。没有保留该残余免疫原性的肿瘤被认为免疫原性较差或没有免疫原性。
抗肿瘤免疫应答主要由T细胞介导(12)。最近的研究暗示，有效的抗原呈递和T细胞原发性缺陷对于理想的肿瘤疫苗实践来说是成问题的。实际上，已经证实，用编码不同细胞因子(如IL-2、IL-4、IL-12或GM-CSF)的基因或编码共同刺激分子(B7)的基因转染肿瘤细胞不仅能导致对所修饰细胞的主要排斥作用，而且通常还引发了抵抗随后对未修饰肿瘤细胞攻击的保护性免疫力(13)。
就在T细胞激活所需的协同刺激信号而言，专职(professional)的抗原呈递细胞(APC)能摄取、加工和呈递抗原给T细胞，导致最佳的抗原呈递。特别是，现已知道，MHC-II+类树突细胞(DC)在抗原加工和呈递给免疫系统中起关键作用。本发明者假设，如果能修饰肿瘤来直接触发宿主抗原呈递细胞(如巨噬细胞和树突细胞)，则将提高肿瘤的免疫原性。实际上，已经报道用单克隆抗体或超抗原交联这些细胞特异表达的MHC-II类分子会转导信号，导致产生TNFα和IL-12(14，15)。他们以前报道了包埋在CD4基因座中的淋巴细胞激活基因3(LAG-3)(1，16)，它编码了以高于CD4的亲合力结合人和鼠MHC-II类分子的一种蛋白(17，6)。
本申请的发明者研究了在三种MHC-II类小鼠肿瘤(免疫原性差的肉瘤MCA205和无免疫原性的TS/A+RENCA腺癌)上hLAG-3、人CD4(hCD4)和mLAG-3的表达能否介导免疫应答来排斥小鼠肿瘤并诱导系统性免疫力。
结果发现，无论是在实体肿瘤细胞系中表达成膜蛋白还是作为可溶性蛋白接种到小鼠体内，人或鼠LAG-3均诱导了针对高度恶性鼠肿瘤的强效免疫力。该免疫力依赖于T细胞并且具有抗原特异性。
他们进一步调查了CD4的作用，并发现人CD4(hCD4)也能诱导全身性抗肿瘤应答。
发现所诱导的免疫力是由T细胞介导的，因为用缺少T淋巴细胞的裸鼠获得了相同的抗肿瘤反应。
当用显示不同内在免疫原性的不同肿瘤细胞系和表达不同MHC基因的不同小鼠株系时，也发现了抗肿瘤效应。
另外，当在远离野生型肿瘤细胞系初次接种部位处注射表达hLAG-3或hCD4的肿瘤细胞系时，观察到有hLAG-3和hCD4诱导的效应。
另外，系统性给予可溶性hLAG-3直接诱导抑制体内肿瘤生长。
所有上述结果证明，LAG-3和CD4能引发T细胞介导的抗原特异性免疫应答，并可能用作免疫治疗的工具，以预防处于危险中的群体产生癌症，或更广泛地说，可用于涉及T细胞介导的抗原特异性免疫应答的免疫治疗中，且LAG-3还可用作抑制体内肿瘤生长的工具。
本发明者还证明，可溶性LAG-3在和抗原(免疫应答所针对的)一起给予时能起疫苗佐剂的作用。
该作用可通过位于皮肤下的专职APC(树突细胞和巨噬细胞)受MHC-II类分子激发而改进了抗原呈递来解释。
因此，由于CD8+T细胞免疫力的诱导涉及病毒(如AIDS、肝炎和疱疹)和胞内寄生虫和细菌(如麻风病、结核病)感染和癌症，LAG-3特别可用于治疗性疫苗以抵抗涉及这些疾病的病原因子以及用于癌症治疗。
本发明一方面涉及MHC II类配体或MHC II类样配体在生产药物中的应用，这些药物可用来预防或治疗涉及抗原特异性免疫应答(较佳的是T细胞介导的抗原特异性免疫应答)的病理状态。
在第一个实例中，MHC II类结合分子是LAG-3以及能结合MHC类LAG-3配体的衍生物。
从本发明意义上讲，LAG-3的衍生物指LAG-3的突变体、变体或片段(即可溶的LAG-3片段)，只要他们保留了LAG-3结合MHC II类分子的能力。
因此，可采用下列形式的LAG-3：
-整个LAG-3蛋白，
-LAG-3蛋白的可溶性多肽片段，它由四个免疫球蛋白胞外结构域中的至少一个组成，即包含法国专利申请FR 90 00 126中公开的LAG-3序列氨基酸23-氨基酸448的胞外区序列的LAG-3可溶部分，
-基本上由第一和第二结构域的所有氨基酸组成的LAG-3片段，
-基本上由第一和第二结构域或所有四个结构域组成的LAG-3片段，(如WO95/30750中所述的)，例如
-包含D1和D2胞外结构域的可溶性LAG-3或其片段的突变形式，这些突变形式包括：
-下列位置之一有氨基酸替代：
·73位，ARG被GLU替代、
·75位，ARG被ALA、GLU替代、
·76位，ARG被GLU替代，
或两个或多个这些替代的组合；
-下列位置之一有氨基酸替代：
·30位，ASP被ALA替代、
·56位，HIS被ALA替代、
·77位，TYP被PHE替代、
·88位，ARG被ALA替代、
·103位，ARG被ALA替代、
·109位，ASP被GLU替代、
·115位，ARG被ALA替代、
或54位至66位之间区域的缺失、
或两个或多个这些替代的组合。
上述突变体在PNAS(1997年6月(4))中有所描述。
-或包括含D1、D2和D3的可溶性52kD蛋白的LAG-3生理性变体。
根据第二个实例，MHC II类结合蛋白是CD4或是能结合MHC II类CD4配体的它的衍生物。
CD4的衍生物例如是LAG-3的衍生物所确定的那些。即，它们是CD4的突变体、变体和片段(即，CD4的可溶性片段)，只要它们保留了CD4结合MHC II类分子的能力。
LAG-3和CD4，即hLAG-3和hCD4或如上所述的它们的衍生物可以作为表达所述分子的重组物质(例如转染的细胞或重组病毒)给予。
本发明还涉及用至少一种MHC II类配体(如CD4或LAG-3或它们的衍生物)的编码DNA转染的肿瘤细胞。
本发明还有一个目的是将至少一种MHC II类配体(如CD4或LAG-3或它们的衍生物)的编码DNA转染的细胞(象肿瘤细胞)应用于生产一种药剂，该药剂宜用于预防或治疗涉及抗原特异性免疫应答(象抗原特异性T细胞介导的免疫应答)的病理状态或治疗如癌症的病理性疾病的药剂。
转染细胞较佳的是哺乳动物细胞，特别是哺乳动物肿瘤细胞。
本发明一方面涉及一种用至少一种MHC II类配体(如CD4、LAG-3或它们的衍生物)的编码DNA转染的细胞制备方法，该方法包括下列步骤：从患者体内取出细胞，用至少一种MHC II类配体(如CD4、LAG-3或它们的衍生物)的编码DNA转染所述细胞，和回收如此转染的细胞。
对于本发明的肿瘤细胞制备，该方法可以在从患者体内取出的肿瘤细胞上再生。
然而，根据一个较佳的实例，MHC II类结合蛋白(即CD4或LAG-3或它们的衍生物)以游离形式(即以可溶形式)通过系统性接种(例如皮下、肌内或静脉内注射)来给予。
本发明的药剂可用作疫苗来预防涉及抗原特异性免疫应答、较佳的是T细胞介导的免疫应答的疾病。
为了这个目的，可以给予在合适载体中的该药剂以及一种或几种引起免疫应答的抗原。抗原可以是灭活的或减毒的传染性因子或纯化的抗原，最终通过蛋白重组程序获得，例如传染因子的抗原或肿瘤抗原，较佳的是能引发T细胞介导的免疫应答的抗原。
疫苗可用来预防对象患感染性疾病(例如病毒、细菌或寄生虫病)，这些疾病中感染性因子引发了抗原特异性免疫应答，较佳的是T细胞介导的免疫应答。
疫苗还可用来治疗患者抵抗感染性疾病(如上所述)，这些疾病涉及T细胞介导的免疫应答，即CD8+T细胞介导的免疫应答。
下表中提供了需要增强已有T细胞介导免疫力的疾病例子
表
| 病原体 | 因子 | 疾病 |
| 病毒 | HIVHBV，HCVHSV，CMV，HHVHTLV1 | AIDS肝炎移植失败，Kaposi肉瘤癌症 |
| 胞内细菌 | 李斯特杆菌分支杆菌 | 李斯特杆菌病麻风病、结核病 |
| 胞内寄生虫 | 疟原虫属等 | 疟疾 |
| 癌基因等 | 大多数癌、黑色素瘤、白血病 |
在这种情况下，抗原在细胞内被切断(chop)，对应的肽装入MHC I类分子并呈递在细胞表面被CD8+细胞识别。本发明者得到的LAG-3Ig分子能诱导动物体内有效的T细胞应答并在体外强烈刺激未成熟树突细胞和单核细胞的研究结果提示，当LAG-3交联专职APC中的MHC II类分子时，它是天然的T细胞佐剂。
疫苗还可用来预防对象避免癌症(实体肿瘤癌或白血病)。
疫苗还可用来治疗癌症患者。
在该情况下，MHC II类结合蛋白(即LAG-3或CD4)通过皮下、真皮内给予患者，或是和一种或几种能引发免疫应答(较佳的是T细胞介导的免疫应答)的抗原一起鼻喷雾给予。抗原可以是肽、脂肽、重组蛋白，或是编码这些抗原的DNA。
可以给经基因型鉴定处于危险的群体接种抗癌疫苗(预防性疫苗)，或是给携带肿瘤或在外科手术后处于高复发危险中的患者接种抗癌疫苗(治疗性疫苗)。
无论疫苗是用作常规的疫苗(预防性)还是作为治疗性疫苗，都可以以插入编码LAG-3或CD4的DNA序列(较佳的在强启动子控制下)的“裸露”质粒的形式给予(19)。
质粒最好还含有编码免疫应答所针对的抗原的DNA。
因此，本发明还有一个目的是提供一种药物组合物，该组合物含有有效量的MHCII类配体和有效量的能刺激免疫系统(较佳的是通过T细胞应答)的抗原的组合。
本发明还有一方面涉及LAG-3作为药剂对携带癌肿瘤的患者进行抗癌免疫治疗的应用。
在这种情况下，LAG-3宜作为药学上可接受载体中的游离的LAG-3蛋白或其衍生物(较佳的是上述的可溶性衍生物)来给予。
LAG-3可通过肿瘤内注射或全身性注射(例如皮下、静脉内或肌内注射)给予。
本发明还有一个目的涉及一种肿瘤基因疗法，该方法包括下列步骤：取出患者部分肿瘤细胞，用至少一种MHC II类配体(如CD4、LAG-3或它们的衍生物)的编码DNA转染所述细胞，和将所述转染的细胞重新导入患者体内。
下列实施例证实了LAG-3和CD4在预防中或在治疗涉及T细胞介导的免疫应答的病理状态中的活性。
为了更好地了解本发明，可能要参考所附附图，其中：
图1示出了接种了野生型MCA 205肿瘤细胞(MCA WT)、转染了hCD4的MCA205肿瘤细胞(MCA hCD4)和转染了hLAG-3的MCA 205肿瘤细胞(MCA hLAG-3)的C57BL/6小鼠的肿瘤平均大小；
图2示出了用野生型MCA肿瘤细胞以最小致肿瘤剂量重新攻击同一小鼠后获得的结果(肿瘤平均大小)；
图3示出了用不相关的MC 38肿瘤细胞系重新攻击同一小鼠后获得的结果(肿瘤平均大小)；
图4示出了用不同株的小鼠(BALB/c)以及野生型、转染hCD4(TS/A hCD4)或转染hLAG-3(TS/A hLAG-3)的不同肿瘤细胞系(TS/A)获得的结果(肿瘤平均大小)；
图5示出了用不同剂量的表达hLAG-3的MCA细胞处理现有肿瘤获得的结果(肿瘤平均大小)；
图6示出了可溶性LAG-3和MAC细胞(MCA野生型、MCA野生型+25微克LAG-3，以及MCA野生型+250微克LAG-3)一起注射获得的结果(肿瘤平均大小)；
图6框内数字代表患肿瘤的小鼠的百分数。
图7和8表示LAG-3在携带肾细胞癌(RCC)的5位患者(P1-P5)肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)膜上表达的结果。
图9描述了CD8+淋巴细胞介导的hLAG-3+肿瘤细胞的排斥。
a，对照(MCA205)小鼠的TIL表达CD8的FACS分析结果与hLAG-3 MCA 205小鼠的TIL作比较。b，CD8+T-细胞对控制hLAG-3 TS/A肿瘤生长有作用。小鼠于3天前、2天前、1天前、4天后和8天后腹膜内注射接受200微克纯化的CD4或CD8特异性单克隆抗体。在第0天皮下接种野生型或hLAG-3 TS/A肿瘤细胞(MTD)。数据是一个实验各组5只小鼠的平均值±平均标准偏差。这些实验进行两次，获得相似的结果。c)排斥hLAG-3/TS/A细胞的小鼠体内抗肿瘤CTL活性增加。小鼠皮下接受5×104 hLAG-3/TS/A细胞移植，在第30天用2.5×105亲代TS/A细胞重新攻击。在第60天收集无肿瘤小鼠的脾细胞，将该细胞和所示的经过辐照的靶细胞共同培育6天。在标准的4h 51Cr释放试验中以不同的效应物对靶比例(E∶T)检查对所示靶细胞的溶细胞活性。图中示出了两只小鼠的结果。在4只小鼠上进行这些试验两次，获得类似的结果。
图10表示移植了最低致肿瘤剂量的同系MCA 205肉瘤细胞的小鼠(20只C57BL/6小鼠)接受LAG-3Ig单剂疫苗注射的结果。在第6天，使4组每组5只小鼠接受单剂皮下疫苗注射(200微升)。Ag表示经过辐照(100Gy)的MCA 205细胞。
用下列材料和方法进行实施例中描述的试验。
材料和方法
1肿瘤细胞系
采用的MHC I+类和II-类肿瘤细胞系是：免疫原性差的胆蒽诱导的肉瘤MCA 205细胞系(和C57BL/6 H-2b小鼠同系)，有免疫原性的肾癌细胞系RENCA以及没有免疫原性的、未分化自发性哺乳动物腺癌TS/A细胞系(两者均与BALB/C H-2d小鼠同系)。MC38结肠癌细胞系(和C57BL/6小鼠同系)用于重新攻击试验中作为对照肿瘤。细胞维持在37℃、润湿的10％CO2气氛下完全培养基(RPMI 1640培养基，添加了谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素/链霉素、10％无内毒素胎牛血清和0.05mM 2-β巯基乙醇)中。为进行免疫染色和体内试验，用含1mM EDTA的PBS将细胞从其培养容器中取出。在皮下注射前，用冷的PBS 1×洗涤细胞三次，并重悬于同一缓冲液中。细胞培养不超过两周。
2.小鼠
6或8周龄的雌性C57BL/6小鼠购自IFFRA-CREDO Laboratories(Lyon，France)。4至8周龄的雌性BALB/c小鼠购自JANVIER Laboratoires，(France)。所有这些小鼠株均在无特定病原体的条件下生长。雌性裸鼠购自Institut Gustave Roussy动物机构，并置于保护环境下。
3.基因构建物
将hLAG-3，mLAG-3和hCD4的cDNA克隆到NT潮霉素质粒载体(hLAG-3和HCD4的克隆位点是Xbal，mLAG-3的克隆位点是Xhol，在SRα启动子控制下(18))中。将反向克隆的LAG-3 hcDNA作为阴性对照。所有肿瘤细胞系(2.5×106细胞)用Eurogentec装置(Belgium)经电穿孔转染：MCA205细胞在200伏，TS/A和RENCA细胞在300伏，1500μF和无限分流电阻。在100微克/毫升潮霉素B(Sigma)中选出MCA205转染子，在200微克/毫升中选出RENCA和TS/A转染子。用Elite细胞荧光光度计(Coulter，Hialeah，FL)鉴定表达转染分子的抗性细胞，并用有限稀释法克隆。在该研究中采用每个肿瘤细胞系中每个构建物的最佳克隆。
4.细胞荧光光度分析
通过间接免疫荧光法用饱和量、纯化的或腹水单克隆抗体染色体表达转染分子的抗性细胞。首先使细胞和下列单抗一起培育：17B4(抗-hLAG-3.1)(2)、OKT4(抗-hCD4)、用作阴性对照的家兔免疫前血清(称为PIS)和抗-mLAG-3家兔免疫血清(称为IS)。用下列单抗检测鼠MHC I和II类分子在肿瘤上的表达：H-2 Kd和Dd用34-1-2S，H-2 Kb和Db用28-8-6S，14-4-4S(Ed)，M50114(IA和IE)。
然后洗涤细胞，并和偶联FITC的山羊抗小鼠血清(GAM Coulter)或偶联FITC的山羊抗家兔血清(GAR Southern Biotechnologies Inc.)培育。为了研究肿瘤外周中浸润细胞或细胞募集(recruitement)的存在，处死一些小鼠并分离肿瘤。用17B4-FITC或下列单抗(Pharmingen)通过直接免疫荧光对细胞染色：抗-mCD4-PE(L3T4)、抗-mCD8(Ly-2和Ly-3.2)、抗-mNK(2B4)和抗-mCD22(Lyb-8.2)。用Elite细胞荧光计(Coulter)对细胞分类。
然后通过有限稀释克隆阳性细胞系，冷冻LAG-3+或CD4+克隆待用。
为了产生可溶的LAG-3分子，如(6)中所述的那样，使hLAG-3和mLAG-3的胞外结构域分别和hlgG1和mlgG2a Fc部分融合。在CHO细胞中生产得到重组蛋白hLAG-3Ig和mLAG-3Ig，并在蛋白-A柱上纯化。
5.体内肿瘤试验
5.1肿瘤生长的建立和疫苗接种
皮下建立肿瘤细胞系，对于MCA 205细胞，采用2×105细胞/小鼠的最低致肿瘤剂量(MTD)，对于TS/A，采用5×104细胞的MTD，对于RENCA，采用105细胞的MTD或5倍MTD。注射后30天，用亲代肿瘤细胞系再攻击没有肿瘤的小鼠(5×MTD)。采用105细胞的MC38结肠癌细胞系作为排斥TS/A肿瘤的C57BL/6小鼠中的对照肿瘤。用肿瘤细胞系注射年龄匹配的未做过试验(naive)的C57BL/6或BALB/c小鼠。
用测径器测量肿瘤两个垂直直径(每周2至3次)来监测肿瘤生长。在体内肿瘤试验该天，用细胞荧光光度计分析细胞并进行体外增殖试验。
5.2肿瘤治疗模型
在第0天，将野生型肿瘤细胞系以最低致肿瘤剂量皮下接种于小鼠左肋。在第0、3或6天，将LAG-3+肿瘤细胞注射到右肋(MTD或5倍MTD)以测定对于远处未转染细胞的抗肿瘤效应。如前所述监测肿瘤生长。
5.3为了进行细胞计数分析，如上所述用5×MTD肿瘤细胞皮下接种小鼠。在第8天分离肿瘤，并用CD3-PE、CD4-PE、CD8-PE、CD80-FITC、CD86-FITC、2B4-PE(NK细胞)、CD22-PE(B细胞)或hLAG-3-FITC单抗和Elite细胞荧光光度计(Coulter)分析。
5.4为了分析淋巴细胞损耗(depletion)，使小鼠在3天前、2天前、1天前、4天后和8天后腹膜内接受200微克纯化的(18)抗-CD4(YTS 191.1.2)或抗-CD8(YTS169.4.2.1)单抗。在第0天皮下接种(MTD)野生型或hLAG-3 TS/A肿瘤细胞。接受这些单抗剂量的对照小鼠的细胞荧光分析表明，脾细胞中靶细胞群减少95％以上(数据未显示)。
6.体外研究
为了进行细胞毒性试验，用混合的淋巴细胞肿瘤细胞培养物产生肿瘤特异性短命CTL。简言之，在第30天从排斥已建立肿瘤的小鼠收集3×107脾细胞。在完全培养基中用3×106经辐照的亲代肿瘤细胞刺激这些细胞4天，然后添加50IU/ml重组hIL-2(Cetus)培育2天。在第6天，在针对下列标记靶细胞的标准4h 51Cr释放试验(效靶比从25/1至200/1)中测试脾细胞的效应器功能：自身肿瘤细胞、H-2d不相关肉瘤WEHI 164和NK敏感型YAC细胞系。一式三份的裂解百分数计算成[(实验平均cpm-自发平均cpm)/(最大平均cpm-自发平均cpm)]×100。我们将裂解比(specific lysis)定义成排斥肿瘤细胞的小鼠脾细胞的裂解减去自然小鼠脾细胞的裂解。
结果
实施例I
hCD4，hLAG-3，mLAG-3和MHC分子在肿瘤细胞系上的表面表达
如2.2部分所述，对转染的肿瘤克隆染色，分析比较hCD4，hLAG-3和mLAG-3的表达水平。在该研究中采用每个构建物的最佳克隆。下列肿瘤细胞系TS/A表达高水平的MHC I类分子，MCA 205表达低水平的MHC I类分子。与转染克隆相比，亲代肿瘤细胞系上的MHC I类表达没有观察到明显的不同。
实施例II
肿瘤模型建立和疫苗接种：hCD4和hLAG-3效应的比较
进行这些实验以检查基因转染后的细胞致肿瘤性：如图1和图4所示的MCA 205和TS/A以及RENCA。将LAG-3+肿瘤诱导的抗肿瘤免疫力与亲代肿瘤细胞系作比较。
野生型MCA 205、TS/A和RENCA细胞在皮下植入同系的C57 BL/6或BALB/C小鼠或nu/nu小鼠中时呈进行性生长。在潮霉素选择后，稳定转染了反向克隆的hLAG-3 cDNA的肿瘤细胞具有相似的生长速度。
接受MCA-LAG-3的动物排斥它们的肿瘤。接受MCA-CD4的动物表现出的肿瘤生长速度低于接受野生型MCA的动物。其中两个(共5个)完全排斥肿瘤(图1)。
用mLAG-3获得相似的结果(数据未显示)。
这些结果表明，hLAG-3，mLAG-3和hCD4的异位表达提高了MCA肉瘤细胞系的免疫原性，并防止了MCA转染子形成肿瘤，即，它诱导了针对高度恶性鼠肿瘤的强效免疫力。
用TS/A肿瘤细胞在BALB/c小鼠中获得了类似的结果(图2)。
用RENCA肿瘤细胞在同系的BALB/c小鼠中也获得了类似的结果。
因此，在表达不同MHC复合物基因的不同株系小鼠中，以及采用不同的肿瘤细胞系(表现出不同的内在免疫原性，TS/A＜MCA)，均获得了抗肿瘤效果。
用野生型MCA、MCA hLAG-3和MCA hCD4型肿瘤细胞接种裸鼠(nu/nu)，转染子以类似方式生长。
这证实了这样一个事实，即系统性的、持续时间长的肿瘤特异性-hLAG-3或hCD4强化的免疫力是由T细胞介导的。
用5倍MTD亲代肿瘤细胞系或不相关的同系MC38结肠癌细胞系再攻击先前用野生型MCA、MCA hLAG-3和MCA hCD4接种的、在注射MTD 30天后没有肿瘤的小鼠。
结果显示在图2和3中。
再攻击后，接受MCA-LAG-3细胞以及MCA-CD4细胞的存活动物中的野生型MCA的生长均被延迟(图2)。
在用不相关的肿瘤MC38再攻击动物后没有观察到这样的效果(图3)。
这表明，hLAG-3和hCD4的异位表达具有佐剂一样的效应，并诱导了长期的针对未修饰亲代肿瘤的抗原特异性免疫力。
实施例III
用MCA-hLAG-3治疗C57BL/6小鼠中的野生型MCA205肿瘤
本实验采用三组小鼠，每组5只。
每组小鼠的一侧肋部接种野生型MCA，三天后，接种野生型MCA(组1)、2×105细胞的MCA-hLAG-3(组2)和1×106细胞的MCA-hLAG-3(组3)。
在30天后测量每组中肿瘤的初始大小。结果显示在图5中。
MCA-hLAG-3的注射以剂量依赖型方式延迟了肿瘤的生长。
本实验确认了LAG-3对肿瘤生长的系统性效应，并表明LAG-3代表了一种针对实体肿瘤的治疗剂。
实施例IV：
用可溶性LAG-3治疗C57BL/6小鼠中的野生型MCA205肿瘤
用悬浮在PBS中的(组1)或含25微克(组2)或250微克(组3)可溶性人LAG-3的PBS中的野生型MCA同时接种三组小鼠(每组5只)。
在30天内测量每组的肿瘤大小。
结果显示在图6中。
hLAG-3 D1D4的共同给药诱导了依赖于剂量的肿瘤生长延迟。
这证明，系统性给予可溶性hLAG-3直接诱导抑制体内肿瘤生长。
实施例V：
人肾细胞癌(RCC)肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上的LAG-3体内表达
在人体内，LAG-3在组织(即发炎的次级淋巴样器官)中表达，但是不在PBMC(即使是体内激活的CD25+、CD69+PBMC)的表面上表达(3)。激活的MHC I类限制的CD8+细胞的LAG-3表达水平高于MHC II类限制的CD4+细胞(3)，IL-12或更强效的IL2+IL-12组合所诱导的CD8+细胞上的LAG-3表达比CD4+细胞上的表达更强。LAG-3在体外和在体内是一种弱表达的激活抗原，有时很难评价新鲜分离的肿瘤中荧光标记的百分数和/或特异性。由于LAG-3可能干扰人肿瘤内的MHC II+类阳性APC，因此我们通过免疫组织化学(APAAP程序)评价了它在一系列已知受T细胞浸润的肿瘤中的表达。在所有测试样品(包括5个黑色素瘤、10个肾细胞腺癌和7个B细胞淋巴瘤)中检测到TIL上有LAG-3表达。
调查了8位患者的肾细胞癌肿瘤中肿瘤浸润淋巴细胞上的LAG-3表达。
将分离的肿瘤用于细胞荧光试验。在根据大小和颗粒性而确定的淋巴细胞群体中研究了LAG-3的表达。通过碘化丙锭染色将死亡细胞排除在研究外。TIL被17B4(一种对LAG-3外环表位有特异性的单克隆抗体)阳性染色。
患者P1-P3的结果显示在图7中，患者P4和P5的结果显示在图8中。
对于所有患者，观察到荧光峰有偏移，这表明17B4抗体结合在淋巴细胞表面。
因此，在所有患者中，无关患者RCC-TIL的很大一部分(30％)TIL确实表达了LAG-3。
在所有样品中，发现CD3+T细胞表达LAG-3(范围11-48％)，在CD8+T细胞上的表达更高。
相反，这些患者中的外周血单核细胞是LAG-3阴性的，这表明淋巴细胞上的LAG-3表达是与肿瘤中T细胞激活有关的现象。
另外，利用ELISA试验，在癌症患者血液中发现了高浓度的可溶性LAG-3(约1毫微克/毫升)。
这些数据表明，LAG-3是一种参与人体内天然存在的抗肿瘤应答的分子，并支持采用LAG-3强化人体对肿瘤细胞的免疫监视作用。
实施例VI
CD8+T细胞介导初次排斥
hLAG-3 MCA 205和TS/A转染子的排斥依赖于T淋巴细胞，因为在T细胞缺陷的nu/nu小鼠中没有观察到排斥。在注射5×MTD这些细胞后，在第8天切下直径为10mm的肿瘤，用FACS分析分离的肿瘤细胞以及肿瘤浸润淋巴细胞。野生型肿瘤以及LAG-3转染子(最初为CD80-和CD86-)在接种后仍保持这些标记阴性，而在hLAG-3肿瘤上用抗-LAG-3 17B4单克隆抗体始终检测到有LAG-3(数据未显示)。在外植移出肿瘤第8天，hLAG-3MCA 205肿瘤中CDg+细胞的百分数约为31％，而野生型MCA205肿瘤中为4％(图9a)，而在分析CD4+、B或NK细胞亚组时没有发现差别。TS/A肿瘤也获得了类似的结果(数据未显示)。最后，通过消除小鼠的这些细胞亚组，检查CD4+和CD8+T细胞各自对抗肿瘤应答的贡献。如图9b所示，在hLAG-3/TS/A MTD接种时给予CD8特异性单克隆抗体，这消除了对hLAG-3/TS/A肿瘤细胞的排斥。用CD4特异性单克隆抗体观察到的部分效应提示有CD4+辅助T细胞参与(图9b)。
实施例VII：
hLAG-3增强肿瘤特异性CTL应答
为了进一步描述LAG-3抗肿瘤活性的机制，我们评价了它对产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀死非免疫原性TS/A细胞作用的效应。从植入hLAG-3/TS/A肿瘤的小鼠收获脾细胞(该小鼠能在再攻击试验中排斥5×MTD野生型肿瘤细胞)，用辐照的TS/A细胞在体外再刺激它6天。在植入hLAG-3肿瘤细胞的小鼠脾细胞中检测到CTL活性(图9c)，而自然动物脾细胞则显示出没有细胞毒性(数据未显示)。CTL活性似乎对非免疫原性TS/A细胞有选择性，因为同系WEHI肉瘤细胞以及NK敏感的YAC细胞未被裂解(图9c)。
实施例VIII：
建立的肿瘤的治疗
本发明者已经指出，用可溶性LAG-分子作为疫苗佐剂可以控制肿瘤生长。单剂注射抗原(辐照的肿瘤细胞)加上强化剂(mLAG-3Ig，1微克或0.1微克)的混合物是有效的(图10)。
假定体内可溶性LAG-3分子能通过MHC II类分子信号传导给郎格罕细胞(或存在于疫苗部位的任何APC)来有效引导CD8+T细胞。
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Claims (22)
1.MHC II类配体在生产预防或治疗除HIV-1感染之外的感染性疾病或癌的药物中的用途，其中MHC II类配体引发抗原特异性T细胞介导的免疫应答，且所述MHCII类配体选自CD4、LAG-3、以及保留结合MHC II类分子能力的CD4或LAG-3的衍生物。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述MHC II类配体加强了已有的T-细胞介导的免疫力。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述MHC II类配体和所寻找的免疫应答所针对的抗原一起给予。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述抗原选自病毒、细菌和寄生虫抗原。
5.根据权利要求3所述的用途，其中所述抗原是肿瘤抗原。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述保留与MHC II类分子结合能力的所述LAG-3衍生物是LAG-3的突变体或可溶性片段。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述LAG-3可溶性片段选自LAG-3的D1-D2片段，以及D1-D4片段。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述感染性疾病或癌涉及依赖于CD8+T细胞的免疫应答。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述感染性疾病选自病毒疾病、细菌疾病和寄生虫疾病。
10.MHC II类配体和诱导抗原特异性免疫应答的抗原在制备用于预防或治疗病理病症的药物中的用途，所述MHC II类配体能和抗原一起加强所述抗原特异性T细胞介导的免疫应答，其中MHC II类配体是LAG-3，或保留与MHC II类分子结合能力的LAG-3的衍生物、突变体或可溶性片段。
11.根据权利要求10所述的用途，其中T细胞介导的免疫应答是CD8+T细胞所介导的免疫应答。
12.根据权利要求11所述的用途，其中病症涉及依赖于CD8+T细胞的细胞免疫力，该病症是感染性疾病。
13.根据权利要求12所述的用途，其中感染性疾病是病毒、寄生虫或细菌疾病。
14.根据权利要求10或11所述的用途，所述药物用于治疗癌症。
1 5.根据权利要求10所述的用途，其中可溶性LAG-3片段选自LAG-3的D1-D2片段和D1-D4片段。
16.根据权利要求10所述的用途，其中药物以表达MHC II类配体的转染细胞形式或该配体的可溶性分子形式包含MHC II类配体。
17.编码至少一个MHC II类配体的DNA所转染的肿瘤细胞用来生产权利要求1所述的药物的用途，其中MHC II类配体是LAG-3或保留与MHC II类分子结合能力的LAG-3的衍生物、突变体或可溶性片段。
18.根据权利要求1或10或17所述的用途，其中药物包含裸质粒形式的MHC II类配体，所述质粒中加入了编码LAG-3的DNA序列。
19.根据权利要求18所述的用途，其中质粒还含有编码所寻找的免疫应答所针对的抗原的DNA。
20.一种药物组合物，它包含有效量的能加强抗原特异性免疫应答的抗原以及有效量的能加强抗原特异性T细胞介导的免疫应答的MHC II类配体，其中MHC II类配体是LAG-3，保留与MHC II类分子结合能力的LAG-3的衍生物、突变体或可溶性片段。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述MHC II类配体是人LAG-3。
22.根据权利要求20所述的药物组合物，它包含可溶性人LAG-3。
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