KR20040022423A - 아쥬반트로서 제１형 ｉｆｎ을 포함하는 백신 및 이와관련된 방법 - Google Patents

아쥬반트로서 제１형 ｉｆｎ을 포함하는 백신 및 이와관련된 방법 Download PDF

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KR20040022423A
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필립포 벨라르델리
지오반나 쉬아포니
쥬세피나 다고스티노
엔리코 프로이에티
데이비드 에프. 터프
아그네스 르봉
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이스티투토 슈페리오레 디 사니타
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Abstract

본 발명은 생체내 보호 면역화 치료에서 백신에 대한 TH-1형 체액 면역 반응 향상용 무독성 아쥬반트 조성물의 제조를 위한, 백신 투여량 당 100.000 IU 이상의 투여량으로 사용되는 제I형 IFN의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항원의 존재와 관련된 질환의 예방 또는 치료에 개별적으로, 동시에 또는 연속적으로 사용하기 위한, 제I형 IFN을 100.000 IU 이상의 투여량으로 포함하는 무독성 아쥬반트 조성물 및 1종 이상의 항원, 및 제약상 허용가능한 담체, 비히클 또는 보조제를 포함하는 백신을 포함하는 부분들의 키트에 관한 것이다.

Description

아쥬반트로서 제１형 ＩＦＮ을 포함하는 백신 및 이와 관련된 방법 {Vaccines Including as an Adjuvant Type 1 IFN and Processes Related Thereto}
백신은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 백신은 사멸되거나 약독화된 병원체 및 아단위 백신을 포함하며, 감염성 질환의 예방, 호전 또는 치료 목적으로 투여된다.
특히, 아단위 백신은 숙주의 면역계가 매개하는 보호에서 중요한 표적으로 여겨지는 병원체 성분으로부터 유래한 항원을 기재로 하는 백신이다. 아단위 백신은 매우 안전한 것으로 입증되었지만, 상기 백신이 기재로 하는 항원의 면역원성이 불량하거나 비-면역원성이라는 사실로 인해 종종 부적절한 면역 반응을 유도한다.
따라서, 면역원성 증대를 위해서는 아단위 백신에 아쥬반트 (항원과 함께 투여했을 경우에 항원 단독 투여에 비해 더욱 효과적인 면역 반응을 일으키는 물질로 정의됨)를 포함시키거나 아단위 백신을 아쥬반트와 함께 투여할 필요가 종종 있다.
동물 모델에서 많은 유형의 아쥬반트가 사용되어 왔는데, 이의 통상적인 예로는 오일성 에멀젼, 알루미늄 또는 칼슘 염, 사포닌 및 LPS-유도 생성물 등이 있으며, 최근에는 알루미늄-기재의 무기 염이 인간에서의 백신 제제에 통상적으로 포함시키는 유일한 아쥬반트이다. 이러한 염은 안전하기는 하지만, 항체 유도용으로는 약한 아쥬반트이며, 전형적인 세포-매개 면역 반응을 자극할 수 없다.
항체 및 세포-매개 반응을 모두 유도하기 위해서는, 침입한 병원체에 대하여 이들의 전파를 제한하거나 이들의 제거를 목적으로 하는 고도로 효과적인 방어를 제공할 필요가 있다. 백신은 강력한 보호 면역 반응을 유발하기 위한 2가지 유형의 신호를 제공하거나 유도할 것이 요구된다. 첫째, 백신은 T 림프구 및 B 림프구상의 항원-특이적 수용체를 촉발하는 항원을 전달할 것이 요구된다. 둘째, 효과적인 백신은 항원 제시 세포에 의한 동시 자극 분자의 발현을 유도하여, 이것이 항원-촉발된 림프구에 의한 강력한 반응을 촉진하도록 할 것이 요구된다. 살아있는 병원체를 함유하는 백신을 사용할 경우에는 상기한 두번째 신호가 감염과 관련이 있는 인자에 의해 종종 제공되지만 아단위 백신을 사용할 경우에는 이러한 신호가 제공되지 않기 때문에 면역원성이 불량해진다. 이러한 두번째 신호에 기여할 수 있는 아쥬반트를 첨가하면, 백신의 효과가 향상되고, 유발된 유형의 면역 반응을 더욱 강화시킬 수 있다.
숙주의 면역계에 대한 상기 신호의 유익한 역할은, 주어진 감염제에 대한 전반적인 면역 반응의 유형 및 강도를 특징으로 하는 이펙터 메카니즘이 후속하여 일어나도록 한다는 것이다.
사이토킨은 항원 및 감염제에 대한 면역 반응 동안에 T 세포, B 세포, 대식세포, 수상돌기 세포 및 기타 면역 세포 사이의 의사소통에 관여하는 주요 인자를 대표한다. 마우스 및 인간 T 헬퍼 (Th) 클론에 대한 수많은 연구를 통해, Th 세포(Th1 및 Th2라 지칭됨)가 사이토킨 분비 프로필로부터 추론되는 여러가지 활성을 나타낸다는 증거가 광범위하게 제시되었다. 따라서, IFN-γ 또는 IL-4의 생산은 Th1 또는 Th2 반응 각각에 대한 전형적인 지표이다. Th1형의 면역 반응은 일반적으로 마우스에서의 IgG2a 생산 및 세포 면역의 전개와 관련이 있는 반면, Th2형 반응은 IgE 생산, 호산구 및 마스트 세포 생산과 관련이 있다. 일반적으로, Th1형 면역 반응의 유도는 바이러스 및 특정 박테리아 감염에 대한 보호 면역 반응을 일으키는데 유리하다고 여겨진다. 이와 관련하여, 알루미늄-기재의 무기 염 등과 같이 임상적으로 이용가능한 아쥬반트는 Th2형 면역 반응을 유도하는 경향이 있는 반면, 몇몇 Th1 촉진 아쥬반트의 사용은 독성과 안전성의 측면으로 인해 제한되는 것이 일반적임을 주지해야 한다.
이러한 점을 고려할 때, 매우 효과적인 아쥬반트의 부재는 백신, 특히 세포 면역을 요구하는 세포내 병원체에 대한 백신의 성공적인 개발에 상당한 장애가 된다.
따라서, 잠재적으로 효능이 있는 재조합 항원이 이용가능함에도 불구하고, 백신 접종에 대한 약한 반응성 또는 반응성 부재 및 환자 순응률이 예방적 또는 치유적 아단위 백신에 관한 주요 과제로 여전히 남아있다. 아단위 백신의 면역원성이 약한 경우에는 만족스러운 반응을 유발하기 위해서 이들 백신을 여러회에 걸쳐 투여할 필요가 있기 때문에, 환자 순응률의 부족이 상당한 문제가 된다.
따라서, 항원 면역원성을 개선시키고 강력한 면역 반응을 꾸준하게 촉진시키며 단일 투여후일지라도 혈청변환/혈청보호를 유도하는데 필요한 백신 투여의 회수를 감소시키는 아쥬반트가 오랫동안 요구되어 왔던 것이 사실이다.
이와 관련하여, 사이토킨은 상기에서 입증된 성질로 인해 당업계에서 아쥬반트로서 가능한 것으로 여겨져 왔다. 특히, 무엇보다도 인터페론 (IFN)이 약간 주목받고 있다.
오늘날, 현재의 시각으로는 IFN을 다양한 세포들이 바이러스 감염 또는 기타 자극에 대한 반응시에 분비하는 복잡한 항-바이러스 단백질 족으로 여기고 있으며, 이는 여러가지 생물학적 활성을 나타낸다. 이들은 이들의 생물학적 활성을 유도하는 수용체 시스템에 따라 다음의 2가지 주요 유형으로 분류된다:
i) 제I형 IFN: IFN-α, IFN-β 및 IFN-ω의 13종 이상의 기능적 아형 (subtype)의 IFN-α 족을 포함함.
ii) 제II형 IFN (IFN-γ라고도 명명됨)
처음에는 단순한 항-바이러스 물질이라 여겨졌던 제I형 IFN은 이후에 실험 모델 및 환자에서의 항-종양 활성 등을 비롯한 다양한 생물학적 효과를 발휘하는 것으로 밝혀졌다. 초기의 연구는 시험관내 및 생체내 면역 반응에 대한 제I형 IFN의 여러가지 효과를 보고하였다. 그러나, IFN 제제가 많은 경우에서 매우 불순하였기 때문에, 이들 연구 중 일부가 다소 의심스러웠다. 일반적으로, 중요성의 측면에서 면역 반응에 대한 제I형 IFN의 효과가 "면역 IFN"이라는 원래의 정의와 일치하게 보호성 세포-매개 면역 반응의 1차 매개자로 여겨지던 제II형 IFN에 의한 효과에 필적하지 못하는 것으로 오랫동안 추정되어 왔다.
또한, 제I형 IFN이 시험관내 항체 생산 및 T 세포 증식에서 강력한 억제효과를 발휘함이 밝혀지면서, 상기 사이토킨이 생체내에서 흥분성 방식으로 작용할지 억제성 방식으로 작용할지에 대한 의문이 제기되었다. 최근 몇몇 저자들이 제I형 IFN의 가능한 면역억제 효과들을 강조했다는 것은 언급할 가치가 있다. 이러한 개념은 질환 진행에 관련되는 추정 면역억제 인자라고 간주되는 내인성 IFN을 중화시키는 원리를 바탕으로 HIV-1 감염 환자에 임상 적용되기에 이르렀다. 반면, 최근 상이한 모델 시스템에서 얻은 전체 데이타로부터 면역 반응의 Th1형을 유도하고 특정 T 세포 소집단의 증식, 기능적 활성 및 생존을 지지함에 있어 제I형 IFN의 중요성이 지적되었다 [Belardelli F. and Gresser I. The neglected role of type I interaction in the T-cell response: implication for its clinical use. Immunol Today 17:369-372, 1996, and Tough DF, Borrow P, and Spent J. Induction of bystander T cell proliferation by viruses and type I interferon in vivo. Science 272:1947-1950, 1996].
제I형 인터페론은 임상 실행에서 통상적으로 가장 많이 사용되는 사이토킨이다. 특히, IFN-α는 몇몇 바이러스 질환 (특히, C형 간염) 및 몇몇 혈액암 (모상 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 몇몇 B 및 T 세포 림프종) 및 특정 고형암, 예를 들어 흑색종, 신장 암종 및 카포시 육종 등을 비롯한 다양한 유형의 인간 종양의 치료에 40개 국가에 걸쳐 전세계적으로 사용된다. 반면, IFN-γ는 대부분 독성 때문에 임상적 적용이 불량하다. 지난 수 년에 걸쳐, 여러 연구들은 제I형 및 제II형 IFN에 의해 발휘된 생물학적 효과가 상이한 실험 모델에서의 활성 유형면에서 실질적으로 상이할 수 있다는 증거를 제공하였다. 흑색종 및 다발성 경화증 등과 같은 몇몇 경우에는, IFN-γ의 임상적 사용이 제I형 IFN으로 달성되는 효과와 반대 효과를 야기시켰다.
제I형 IFN은 그의 광범위한 임상적 사용에도 불구하고 아직 백신 아쥬반트로서는 사용되지 않는다. 이는 면역 반응 조절에서 제I형 IFN의 중요성 및 작용에 대한 기술 단계가 혼돈스럽고 논의의 여지가 있다는 사실 때문이다.
생체내에서 백신 중의 아쥬반트로서의 IFN의 관련된 용도는 제II형 IFN (즉, IFN-γ)에 대해서만 알려져 있다. 특히 EP 0241725에는, 아쥬반트로서 IFN-γ를 포함하며 플라스모듐 요엘리 (Plasmodium yoelii)의 전염성 YM주로 감염된 마우스의 혈액 세포로부터 유래된 조 단백질 추출물을 함유하는 백신이 기재되어 있다. 백신에 포함되는 IFN-γ의 양은 투여량 당 1.000 내지 10.000 U의 범위이고, 이때 아쥬반트 효과를 일으키는 IFN-γ의 양은 100 내지 50.000 U라고 지적된다. 200 단위 미만의 투여량도 효과적이라고 지적되었으나, 사용되는 투여량은 5.000 U이다.
몇몇 선행 문서들은 아쥬반트로서 제I형 IFN의 용도를 파악했지만, 제I형 IFN이 백신 아쥬반트로서 사용되는 경우 생체내 보호 Th-1형 반응을 향상시키는데 있어 임의의 효능에 대한 어떠한 증거도 증명되거나 제안되지 않았다.
사실상, WO/8704076에는 감염성 소 비기관염 (Infectious Bovine Rhinotracheitis; IBR) 바이러스에 감염된 송아지의 감염 연구로 IFN-α를 사용하여 면역 반응을 간접적으로 향상시킬 가능성이 증대되었다는 것이 개시되어 있다.
특히 WO/8704076에 따르면, IFN-α는 1일 당 체중 1 lb 당 약 5 IU 이하, 바람직하게는 체중 1 lb 당 1 IU의 투여량으로 경구 투여하는 것이 바람직하다. 상기 양은 매우 소량이므로 본 발명에 따라 수득되는 효과를 달성할 수 없을 뿐 아니라, 본 출원의 실시예에서 보고된 결과는 5 IU/lb의 바람직한 농도 초과로의 IFN 양의 증가가 면역 반응 감소라는 반대 효과를 야기시킴을 보여준다.
스튀르클러 (Sturchler) 등 [Vaccine, Vol 7, 1989, pp 457-461]은 지원자를 항-플라스모듐 팔시파룸 백신으로 면역화시킨 후 IgG 및 IgM 항체의 생산에서 IFN-α로 야기되는 일반적인 아쥬반트 효과를 기재한다. 그러나, 시험관내에서 관찰된 IgG 및 IgM 역가에서의 완만한 증가는 생체내 보호 효과의 증거가 아니었다. 따라서, 생체내 보호 효과는 상기 문서로부터 유도될 수 없다.
또한, 스튀르클러 등은 선택적 및 무독성 방식으로 생체내 보호 Th-1형 면역 반응을 유도하는 IFN-α의 능력을 개시하거나 심지어 제안하지도 않았다.
안톤 피. (Anton P.) 등 [Cancer biotherapy and radiopharmaceuticals, Liebert, US, Vol. 11, no. 5, 1996, pp 315-318]은 비활성화 자가이식 종양 세포 및 재조합 IFN-α2a를 함유하는 항-종양 백신의 실험을 기재한다. 상기 문서는 면역화 치료에서의 특정 효과를 기재하고 있으나, 그 결과가 자가이식 세포 때문인지 IFN 때문인지를 식별하고 있지 않다. 그러므로, IFN의 아쥬반트 효과는 상기 유형의 면역 반응 수득은 고사하고 단지 단언한 것일 뿐이다. 그러므로, 본 발명의 의미에서 제I형 IFN의 아쥬반트 효과는 상이 문서로부터 추론할 수 없다.
그랍 피. 제이. (Grob P. J.) 등 [Eur. J. Clin. Microbiol., 1994, Vol. 3, no. 3, pp 195-198]은 재조합 IFN-α 및 시판되는 항-B형간염 백신을 이전 면역화에 반응하지 않았던 환자에게 투여하는 것을 기재한다. 결과는 IFN으로 처리한 환자에서 혈청변환의 낮은 빈도 및 항체 역가에서의 이러한 낮은 증가율로부터 생체내 보호 효과를 기대할 수 없음을 입증한다. 상기 경우에는 IFN-α를 백신으로부터 분리시켜 투여함이 강조되어야 한다. 개념적으로는, 상기 접근은 아쥬반트 (전형적으로는 항원과 상기 아쥬반트의 조합물을 포함함)로서 임의의 재료를 사용하는 방법과 상이하다.
상기 선행 기술과 비교할 때, 본 발명의 범위는 생체내 보호 면역화 처치에서 구체적으로는, 사멸한 병원체를 포함하는 백신으로 또는 더욱 구체적으로는, 아단위 백신으로 백신에 대한 Th-1형 체액성 면역반응을 향상시키는 안전하고 매우 효과적인 수단을 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 생체내 보호 면역화 처치에서 백신에 대한 Th-1형 체액성 면역-반응을 향상시키기 위한 비-독성 아쥬반트 조성물의 제조에 제I형 IFN을 사용하는 것이며, 이때 IFN은 백신 투여량 당 100,000 IU 이상의 투여량으로 사용한다.
이러한 향상된 체액성 면역-반응은 IgG1 및(또는) IgG2a 및(또는) IgG2b 및(또는) IgG3 및(또는) IgA 및(또는) IgM 생산을 선택적으로 유도시킨다.
무독성 아쥬반트 조성물은 피하내, 근육내 또는 피내 주사, 또는 경구 또는 점막 또는 비내 투여를 통해 전달되는 생체내 보호 면역 반응에 특히 유용하다.
특히, 본 발명의 목적은 상기 목적을 위한 무독성 아쥬반트 조성물의 제조를 위해 제I형 IFN을 사용하는 것이며, 여기서 상기 조성물은 백신이 투여 위치로 동시에 전달되도록 제제화된다. 아쥬반트 조성물 및 백신이 함께 제제화되는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 목적은 임의의 필요한 제약상 허용가능한 담체 비히클 또는 보조제와 함께, 항원과 아쥬반트 모두를 제어 방출 및 지속 방출시키기 위해 아쥬반트로서 제I형 IFN을 백신 투여량 당 100,000 IU 이상의 투여량으로 포함하는 백신이다.
또 다른 목적은 개별 투여를 위한 상기 IFN 함유 아쥬반트 조성물 및 백신 조성물을 포함하는 부분의 키트이다.
본 발명의 첫번째 이점은 항체 총 생성량의 정도로 측정되는 바와 같이, 이렇게 제조된 아쥬반트화-백신이 장기간의 항체 생성 및 면역기억을 특징으로 하는 면역 반응에서 Th-1형의 유도를 향상시킬 수 있다는 점이다.
본 발명의 두번째 이점은 제I형 IFN 조성물로 아쥬반트화된 상기 투여량의 백신이 백신을 단일 투여한 후에도 생체내 보호성 체액 및 세포-매개된 면역 반응에서 특정 Th-1형을 유도시킨다는 점이다.
또한, 세번째 이점은 어떠한 독성도 없이, 특히 CFA 또는 IFA와 같이 동물에서 Th-1형의 반응을 촉진하는 것으로 알려진 현재 이용가능한 아쥬반트에서 통상적인 독성/안정성 문제없이, 면역 보호에서 Th-1형을 빠르게 유도하는데 있어서 효능이 높다는 점이다.
제I형 IFN에 의해 유도되는 면역 반응은 특정 Igs 프로파일, 즉, 마우스에서 IgG2a 및(또는) IgA의 특정 유도를 특징으로 하는 Th-1형 반응으로, 이는 박테리아또는 바이러스와 같은 병원체 접종으로부터 보호시킨다.
본 발명의 무독성 아쥬반트 조성물에서, 제I형 IFN은 이러한 족에 속하는 임의의 인터페론일 수 있으나, 단, 상기 투여량으로 포함된다. 따라서, 인간에서 가장 효과적인 투여량은 1 ×106내지 6 ×106IU 범위이다.
바람직한 실시양태에서, 건강한 제공자의 자극된 백혈구 또는 나말와(Namalwa) 세포로부터의 림포블라스토이드 IFN-α로부터의 천연 IFN-α(상이한 IFN-α아형 또는 각각의 IFN-α아형의 혼합물), 합성 제I형 IFN-ω, 예컨대 컨센서스 IFN (CIFN) 및 IFN-β 또는 재조합 IFN-α아형, 예컨대 IFN-αa 및 IFN-αb 또는 IFN-ω, 또는 DNA 셔플링법으로 생성되는 신규 IFN 분자가 사용되나, 단, 백신 투여량에 대한 상기 투여량으로 사용된다.
페길화 제I형 IFN 아형이 사용될 수 있으며, 주사후에 대체로 더욱 현저하고 빠른 면역 반응을 달성하는데 이로운, IFN의 생체내 반감기가 더 길어진다는 이점이 있다.
수상돌기 세포를 표적화할 수 있는 모노클로날 항체와 융합된 재조합 제I형 IFN에 의해 나타나는 융합 하이브리드 단백질이 백신 제제에 포함되는 아쥬반트로서 특히 효과적일 수 있다.
본 발명의 아쥬반트 조성물은 감염제 또는 다른 공급원으로부터의 1종 이상의 항원과 아쥬반트화-백신 형태로 배합될 수 있다.
항원에는 단백질, 펩티드, 탄수화물 또는 지질 항원 및(또는) 전체 세포, 특히 항원과 혼합된 수상돌기 세포와 관련된 항원의 정제된 또는 부분 정제된 제제가 포함된다. 일반적으로, 임의의 병원체가 아쥬반트로서 제I형 IFN과 관련되는 가능한 면역원으로 고려될 수 있으며, 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
아쥬반트화-백신의 투여량 각각에서 존재하는 항원(들)의 양은 백신화된 대상체에서 보호 면역 반응을 유도할 수 있는 양으로 선택된다. 이러한 양은 특정 항원 및 존재할 수 있는 다른 유형의 아쥬반트에 따라 달라질 것이며, 당업자에 의해 확인될 수 있다. 일반적으로, 각 투여량은 항원 1 내지 1000 ㎍, 바람직하게는 10 내지 200 ㎍을 함유한다.
또한, 본 발명의 아쥬반트 조성물 또는 아쥬반트화-백신에 추가 성분들이 이롭게 존재할 수 있다. 특히, 바람직한 실시양태에서, 다른 아쥬반트, 특히 알루미늄염이 조성물에 포함된다.
형태 측면에서, 본 발명의 아쥬반트 조성물은 상기 아쥬반트와 백신이 투여 위치로 동시에 전달되도록 제제화될 수 있다. 바람직하게는, 아쥬반트 조성물 및 백신은 한 조성물내에 아쥬반트화된 백신 형태로 함께 제제화된다. 아쥬반트 조성물 또는 아쥬반트화-백신의 제제는 항원과 함께 아쥬반트를 투여하는데 적합한 것으로 당업계에 알려진 임의의 형태일 수 있다.
몇몇의 경우에서, 아쥬반트 조성물 및 백신 또는 아쥬반트화-백신은 예상되는 효과 및 사용의 용이성으로 인해 피하내 또는 근육내로 주사될 수 있다. 피내 주사는 몇몇의 백신에 대해서 효과적으로 수행될 수 있으며, 적절한 수의 수상돌기 세포를 주사 위치로 동원시키기에 적합한 다른 전달계가 고려될 수 있다.
또한, 바이러스성 호흡 감염, 예를 들어 인플루엔자 바이러스 감염과 같은 감염 경로를 통해 전달되는 감염제에 대해서는 특히 비내 및 경구 투여가 포함되어야 한다.
또한, 아쥬반트 조성물 및 백신 또는 직접 아쥬반트화-백신의 비내, 경구 또는 임의의 다른 점막 투여는 유익한 선택이며, 그 결과 백신 전달의 매우 실용적인 양상을 사용하여 유력한 보호 국부 및(또는) 전신 면역을 예상외로 유익하게 유도한다.
당업자는 항원 기능의 최적 제제화와 관련하여 백신 접종이 역작용한다는 것을 결정할 수 있다.
본 발명의 아쥬반트 조성물 또는 아쥬반트화-백신은 살균한 생리학상 상용가능 담체, 예컨대 식염수 용액, 부형제, (만약 있다면) 다른 아쥬반트, 보존제, 안정화제를 포함하는 제약 조성물로서 통상의 방식으로 제제화될 수 있다.
아쥬반트 조성물 또는 아쥬반트화된 백신은 사용하기 전에 살균 담체에 용해시키기 위해 액체 또는 동결건조 형태로 될 수 있다. 백신 제제 중의 명반 또는 리포솜-유사 입자의 존재는 또한 이들이 IFN 및 항원(들) 모두의 늦은 방출에 유용하기 때문에 가능하다. IFN-아쥬반트화된 백신의 늦은 방출을 가능하게 하는 다른 방법은 당업자에 의해 용이하게 확인되고, 본 발명의 범위에 포함된다.
제약상 허용가능한 담체 비히클 또는 보조제는 당업자에 의해 각각의 제제에 대해 용이하게 확인될 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명의 목적에 또한 항원 및 제I형 IFN과 함께 제제화하는 단계를 포함하는 본 발명의 아쥬반트화-백신의 제조 방법이 포함되며, 여기서 상기 형 IFN은 백신 투여량 당 100.000 IU 이상이다.
상기 아쥬반트화-백신은 감염성 질환 및 암의 치료를 위한 예방 및 치유 치료 모두에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 아쥬반트 조성물 또는 아쥬반트화-백신은 바이러스 및 박테리아 질환 (즉, 예방 백신)의 예방 뿐만 아니라 중증 만성 감염 질환 (즉, 치유 백신)의 치료에 사용될 수 있다. 또한, 아쥬반트 조성물 또는 아쥬반트화-백신은 적합한 항원이 사용되는 경우 암의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.
이는 인간 악성종양 (EBV, HPV 및 E.피롤리(pilori)) 또는 항원과 관련된 잘 정의된 종양, 예컨대 인간 흑색종 (MAGE 항원, 티로시네이즈 (thyrosinase) gp100, MART) 뿐만 아니라 다른 인간 종양에서 특성화된 것과 관련된 감염제에 대한 항원을 사용하여 달성될 수 있다.
특히, 본 발명의 아쥬반트 조성물 또는 아쥬반트화-백신은 소위 저- 또는 비-반응자, 예컨대 혈약 투석 유지와 같은 면역저하자 및 이식 환자의 백신 접종에 특히 적합하다. 일반적으로는, 본 발명의 아쥬반트 조성물 또는 아쥬반트화-백신은 초기 혈청변환/혈청보호가 바람직한 임의의 상황에서 감염의 높은 위험에서 개인 백신 접종에 유리하게 적합하다.
이 특성은 특히 HBV에 대한 백신 접종을 참고로 한다.
추가 실시예로서, 기재된 아쥬반트 조성물 또는 아쥬반트화-백신은 표준 백신 접종에 대해 빈약한 반응성인 중년의 개인에서 인플루엔자 바이러스에 대한 보호를 유도하는 데 특히 유익할 수 있다.
HBV 백신 뿐만 아니라 다른 바이러스 백신의 경우, 주사의 s.c. 또는 근육내 경로가 바람직한 반면, 다른 경우에 비내 투여는 호흡계를 통해 숙주를 감염시킬 수 있는 특히 매체에 대한 타협 또는 효능 및(또는) 환자 순응률에서 이점을 나타낼 수 있다.
제2 측면에 따라, 본 발명에 따른 제I형 IFN의 아쥬반트 효과는 또한 제I형 IFN 및 아단위 백신을 개별적으로 투여함으로써 얻을 수 있다.
유효하기 위해, 투여는 동일한 부위에서 활성 매체의 동시 존재를 가능하게 하는 양식으로 수행되어야 한다. 사실, 최적 효과는 제I형 IFN이 100,000 내지 200,000 IU의 범위의 투여량 또는 심지어 더 높은 투여량 (1x106- 2x106IU)에서 백식과 함께 동시주사되는 경우 동물에서 달성된다. 백신 및 아쥬반트를 최초로 동시에 투여하고, 이어서 아쥬반트 조성물 단독의 추가 투여량을 제1 백신 투여 후 제1일 또는 제1일 및 제2일에 매일 투여하는 경우 면역 반응의 여전히 더 강한 향상이 관찰된다. 매우 더 낮은 효과는 백신 투여에 대한 제-1일 또는 제+1일에 단독으로 IFN이 주어지는 경우 관찰된다 (도 11C).
따라서, 본 발명은 또한 상기 항원(들)의 존재와 관련된 질환의 치료에 개별적으로, 동시에 또는 연속적으로 사용하기 위한,
- 제I형 IFN 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 조성물;
- 항원 또는 2종 이상의 항원 (정의된 단백질 또는 펩티드)의 조합, 또는 사멸되거나 또는 불활성화된 병원체를 포함하는 백신 조성물을 포함하는 부분들의 키트가 포함된다.
본 발명의 키트의 조성물의 제제화, 형태 및 경로는 상술한 바와 같다.
본 발명은 첨부된 도면을 참고하여 더 양호하게 기술될 것이다.
본 발명은 백신, 특히 아단위 백신에 관한 것이다.
도 1은 생체 내에서 닭 γ 글로불린 (CGG)에 대한 1차 항체 반응 상의 poly IC의 효과를 나타내고 있다.
패널 A는 도표의 x-축 상에 나타낸 바와 같이 단독 CGG 또는 CGG + poly IC를 주사한 B6 마우스의 혈청 중에서 검출된 CGG-특이적 항체의 종점 역가를 나타내고 있다. 각 단일 도표는 항체의 서브클래스 (IgM, IgG1, IgG2b, IgG2a 및 IgG3)로 표지되고, 이에 대해 측정된 종점 역가를 나타내고 있다.
항체 반응은 종점 역가의 평균 ± SD로서 표현되어 있다.
패널 B는 도표의 x 축에 나타낸 바와 같이 단독 CGG 또는 CGG + poly IC를 주사한 129sv 세포주의 야생형 마우스 (백색 막대) 또는 제I형 IFN 수용체 KO (제I형 IFNR KO) 129sv 마우스 (흑색 막대)에서 얻어진 항체 반응을 나타내고 있다. 각 단일 도표는 항체의 서브클래스 (IgM, IgG1, IgG2b, IgG2a 및 IgG3)로 표지되고, 이에 대해 측정된 종점 역가를 나타내고 있다.
항체 반응은 종점 역가의 평균 ± SD로서 표현되어 있다.
도 2A 및 B는 오브알부민 (OVA) + 아쥬반트로 면역화한 마우스에서의 항체 반응을 나타내고 있다.
패널 A는 도표의 x 축에 따라 나타낸 바와 같이, 식염수, OVA, OVA + IFA 및 OVA + CFA로 처리된 야생형 (백색 막대) 또는 제I형 IFNR KO C3H/HeJ (회색 막대) 마우스에서 검출된 특이적 항체 수준을 나타내고 있다.
OVA-특이적인 전체 Igs, 또는 Ig 서브클래스 IgG2a 및 IgG1에 대해 표준 ELISA 검사법으로 측정한, 면역화 후 제24일의 마우스 혈청 중에 존재하는 종점 항체 역가를 도표 I, 도표 II 및 도표 III 상에 각각 나타내고 있다. 값들은 3 종의 개별 혈청을 2회 시험하여 얻은 평균 종점 희석 역가로서 표현되어 있다.
패널 B는 도표의 x 축에 따라 나타낸 바와 같이 식염수, 오브알부민 (OVA), OVA + CpG 및 OVA + 명반으로 처리된 야생형 (백색 막대) 또는 제I형 IFNR KO C3H/HeJ (회색 막대) 마우스에서 특이적 항체 수준을 나타내고 있다.
OVA-특이적인 전체 Igs, 또는 Ig 서브클래스 IgG2a 및 IgG1에 대해 표준 ELISA 검사법으로 측정한, 면역화 후 제24일의 마우스 혈청 중에 존재하는 종점 항체 역가를 도표 I, 도표 II 및 도표 III 상에 각각 나타내고 있다. 값들은 3 종의 개별 혈청을 2회 시험하여 얻은 평균 종점 희석 역가로서 표현되어 있다.
도 3은 생체 내에서 CGG에 대한 T 세포 반응의 poly IC 증대에서 제I형 IFN의 역할을 나타내고 있다.
패널 A는 도표의 x 축에 따라 나타낸 바와 같이 poly IC, CGG 또는 CGG + poly IC를 주사하여 프라이밍시킨 129 또는 제I형 IFNR KO 마우스로부터의 T 세포의 CGG에 대한 시험관 내 증식 반응을 나타내고 있다.
백색 및 좁은 줄무늬 막대는 CGG의 존재 (백색) 또는 부재 (좁은 줄무늬) 하에 배양된 129 마우스 배출 림프절 (DrLN)로부터의 세포 현탁액에 의한 증식을 나타내고 있다.
흑색 및 넓은 줄무늬 막대는 CGG의 존재 (흑색) 또는 부재 (넓은 줄무늬)하에 배양된 제I형 IFNR KO 마우스 DrLN로부터의 세포 현탁액에 의한 증식을 나타내고 있다.
패널 B는 도표의 x 축에 따라 나타낸 바와 같이 poly IC, CGG 또는 CGG + poly IC를 주사하여 프라이밍시킨 129 또는 제I형 IFNR KO 마우스로부터의 CD4+T 세포에 의한 IFN-γ 분비를 나타내고 있다.
백색 및 좁은 줄무늬 막대는 CGG의 존재 (백색) 또는 부재 (좁은 줄무늬)하에 배양된 선천성 비면역성 마우스로부터의 T 제거된 비장 세포와 함께 배양된 면역성 129 마우스의 DrLN로부터 정제된 CD4+T 세포에 의한 IFN-γ 분비를 나타내고 있다.
흑색 및 넓은 줄무늬 막대는 CGG의 존재 (흑색) 또는 부재 (넓은 줄무늬)하에 배양된 선천성 비면역성 마우스로부터의 T 제거된 비장 세포와 함께 배양된 면역성 I IFNR KO 마우스의 DrLN로부터 정제된 CD4+T 세포에 의한 IFN-γ 분비를 나타내고 있다.
도 4는 시험관 내 증식 동안 프라이밍 T 세포에서 및 OVA + 아쥬반트로 면역화된 마우스에서의 DTH 반응에서 내인성 제I형 IFN의 역할을 나타내고 있다.
패널 A는 도표의 x 축에 따라 나타낸 바와 같이 식염수, 오브알부민 및 CFA로 처리된 정상 (백색 막대) 또는 제I형 IFNR KO C3H/HeJ (회색 막대) 마우스로부터의 T 세포에 의한 특이적3H 티미딘 흡수를 나타내고 있다.
패널 B는 도표의 x 축에 따라 나타낸 바와 같이 식염수, 오브알부민 및 오브알부민 + CpG 또는 명반으로 처리된 정상 (백색 막대) 또는 제I형 IFNR KO C3H/HeJ (회색 막대) 마우스로부터의 T 세포에 의한 특이적3H 티미딘 흡수를 나타내고 있다.
패널 C는 도표의 x 축에 따라 나타낸 바와 같이 식염수, 오브알부민 및 오브알부민 + IFA 또는 CFA로 처리된 야생형 (백색 막대) 또는 제I형 IFN 수용체 KO C3H/HeJ (회색 막대) 마우스에서의 특이적 DTH 반응을 나타내고 있다.
패널 D는 x 축에 따라 나타낸 바와 같이 식염수, 오브알부민 및 오브알부민 + CpG 또는 명반으로 처리된 야생형 (백색 막대) 또는 제I형 IFN 수용체 KO C3H/HeJ (회색 막대) 마우스에서의 특이적 DTH 반응을 나타내고 있다.
도 5는 제I형 IFN를 주사하여 CGG에 대한 1차 항체 반응의 증대를 나타내고 있다. 모든 마우스에 CGG를 단일 주사하였다. 또한 가용성 IFN-α/β 또는 IFN-β를 수용한 마우스들을 면역화시 각각의 IFN와 함께 주사하거나 (1X), 추가 IFN를 1 일 후 (2 X) 또는 1 및 2 일 후에 (3 X) 주사하였다.
패널 A는 도표의 x 축에 따라 나타낸 바와 같이 단독 CGG로 면역화되거나, CGG로 면역화되고 IFN-α/β로 처리된 B6 마우스에서의 항체 반응을 나타내고 있다.
각 단일 도표는 항체의 서브클래스 (IgM, IgG1, IgG2b, IgG2a 및 IgG3)로 표지되고, 이에 대해 측정된 종점 역가를 나타내고 있다. 항체 반응은 종점 역가의 평균 ± SD로서 표현되어 있다.
패널 B는 CGG 단독으로 면역화되거나, CGG로 면역화되고 IFN-β로 처리된 B6 마우스에서 항체 반응을 나타낸다. 각각의 단일한 도식은 측정된 종점 역가가 의미하는 항체의 서브클래스 (IgM, IgG1 IgG2b, IgG2a 및 IgG3)로 표지된다. 항체 반응을 종점 역가의 평균 ±SD로 나타낸다.
도 6은 CGG에 대한 1차 항체 반응이 IFN-α/β+ 명반에 의해 향상됨을 나타낸다.
데이타 (흑색 막대)는, 도식의 x 축에 따라 나타낸 바와 같이, CGG를 단독으로 또는 CGG를 가용성 IFN-α/β, 명반, 또는 IFN-α/β+ 명반과의 조합으로 1회 피하 주사하여 B6 마우스를 면역화한 후 제10일에 ELISA에 의해 검출된 CGG-특이적 항체를 나타낸다. 기호 3x는 면역화 후 제1일 및 제2일에 가용성 IFN-α/β의 추가 주사를 나타낸다.
각각의 단일한 도식은 측정된 종점 역가가 의미하는 항체의 서브클래스 (IgM, IgG1 IgG2b, IgG2a 및 IgG3)로 표지된다.
데이타는 종점 역가 ±SD를 나타낸다 (그룹 당 마우스 3마리).
도 7은 제I형 IFN 및 유성 아쥬반트에 의해 향상된 항체 반응의 비교를 나타낸다.
데이타 (흑색 막대)는, 도식의 x 축에 따라 나타낸 바와 같이, CGG, CGG +IFN-α/β(IFN-α/β는 제0일에 CGG와 함께 제공되며, 이후 제1일 및 제2일에는 단독으로 제공됨), IFA (IFA는 제0일에 CGG와 함께 제공되며, 이후 제1일 및 제2일에는 단독으로 제공됨) 중 에멸젼화된 CGG, 또는 TiterMax (TiterMax는 제0일에 CGG와 함께 제공되며, 이후 제1일 및 제2일에는 단독으로 제공됨) 중 에멀젼화된 CGG를 피하 주사하여 B6 마우스를 면역화한 후 제10일에 ELISA에 의해 검출된 CGG-특이적 항체를 나타낸다.
결과를 종점 역가의 평균 ±SD로 나타낸다 (그룹 당 마우스 3마리). 각각의 단일한 도식은 측정된 종점 역가가 의미하는 항체의 서브클래스 (IgM, IgG1 IgG2b, IgG2a 및 IgG3)로 표지된다.
도 8은 가용성 IFN-α/β가 항체 반응을 내생성 제I형 IFN에 의존하는 아쥬반트성 (adjuvanticity)을 갖는 CFA와 유사한 정도로 향상시킴을 나타낸다.
도식의 x 축에 따라 나타낸 바와 같이, CGG 단독, CGG + IFN-α/β(2회 이상의 IFN-α/β주사가 면역화 후 제1일 및 제2일에 제공됨) 또는 CGG + CFA를 피하 주사하여 WT 129 (백색 막대) 또는 IFN-IR KO (흑색 막대) 마우스를 면역화한 후, 상기 마우스에서 항체 반응을 비교하였다. CGG-특이적 항체를 면역화 후 제10일에 ELISA에 의해 검출하였다. 결과를 종점 역가의 평균 ±SD로 나타낸다 (그룹 당 마우스 3마리). 각각의 단일한 도식은 측정된 종점 역가가 의미하는 항체의 서브클래스 (IgM, IgG1 IgG2b, IgG2a 및 IgG3)로 표지된다.
도 9는 장기간 항체 생산 및 면역학적 기억의 제I형 IFN 자극을 나타낸다.
패널 A는 CGG 단독 또는 CGG + IFN-α/β를 주사하여 6개월 미리 면역화시킨B6 마우스에서 종점 항체 역가를 나타낸다.
데이타 (흑색 막대)는 면역화 후 제1일 및 제2일에 CGG 단독 또는 CGG + IFN-α/β를 (2회 이상의 IFN-α/β주사가 면역화 후 제1일 및 제2일에 제공됨) 피하 주사하여 B6 마우스를 면역화한지 6개월 후에 ELISA에 의해 검출된 CGG-특이적 항체를 나타낸다.
결과를 종점 역가의 평균 ±SD로 나타낸다 (그룹 당 마우스 3마리). 각각의 단일한 도식은 측정된 종점 역가가 의미하는 항체의 서브클래스 (IgM, IgG1 IgG2b, IgG2a 및 IgG3)로 표지된다.
패널 B는, 패널 A에서와 같이, 비처리 마우스 (부재), 또는 CGG 단독 또는 CGG + IFN-α/β를 항원투여 (challenge)하기 6개월 전에 면역화한 마우스에서 CGG 단독을 항원투여한 후 제6일의 특이적 항체 반응을 나타낸다.
결과는 항원투여 전 (백색 막대), 및 항원투여 후 제6일 (흑색 막대)의 항체 종점 역가를 종점 역가의 평균 ±SD로 나타낸다 (그룹 당 마우스 3마리). 각각의 단일한 도식은 측정된 종점 역가가 의미하는 항체의 서브클래스 (IgM, IgG1 IgG2b, IgG2a 및 IgG3)로 표지된다.
도 10은 제I형 IFN에 대한 DC 반응성이 제I형 IFN에 의한 항체 생산 및 이소타입 스위칭 (isotype switching)의 향상에 있어서 충분함을 나타낸다.
데이타는 면역화 후 제10일에 표준 ELISA에 의해 검출된 CGG-특이적 항체를 나타낸다. 비장 DC를 129 마우스 (wt) 또는 제I형 IFNR KO 마우스 (도식의 x 축을 따라 나타냄)로부터 정제하고, CGG와 함께 잠시 인큐베이션하고, IFN-α/β의 존재(흑색 막대) 또는 부재 (백색 막대) 하에 제I형 IFNR KO 마우스에게 피하 주사하였다 (후자의 경우, 2회 이상의 IFN-α/β주사가 면역화 후 제1일 및 제2일에 제공됨).
결과는 종점 역가의 평균 ±SD로 나타낸다 (그룹 당 마우스 3마리). 각각의 단일한 도식은 측정된 종점 역가가 의미하는 항체의 서브클래스 (IgM, IgG1 IgG2b, IgG2a 및 IgG3)로 표지된다.
도 11은 인플루엔자 백신으로 면역화된 마우스의 항체 반응에 대한 제I형 IFN의 아쥬반트 활성을 나타낸다.
표준 면역화 스케쥴은 다음과 같다: 정제된 flu 백신 15 ㎍ 및 쥐과 동물 제I형 IFN 2 ×105U를 포함하는 제제 0.2 ml, 대조군으로서 백신 단독 또는 식염수를 7 내지 8주령의 C57BL/6 마우스에게 근육내 주사하였다. 14일 후, 마우스를 채혈하고, 혈청을 표준 ELISA에 의해 시험하여 flu-특이적 항체 수준을 측정하였다. 수치는 마우스 5마리의 혈청의 평균 ±SD를 나타낸다.
패널 A는 제I형 IFN (2 ×105, 2 ×104또는 2 ×103U)의 log10희석물과 혼합된 백신을 포함하는 여러 제제들 또는 음성 대조군으로서 백신 단독 또는 식염수를 마우스에게 근육내 투여한 투여량/반응 실험을 나타낸다. 항체 역가는 면역화 후 제7일에 측정하였다.
패널 B는 백신, 및 제I형 IFN의 단일 또는 반복 투여로 처리된 마우스에서 항체 반응에 대한 아쥬반트 효과를 나타낸다. IFN과 혼합된 flu 백신 또는 IFN과혼합된 flu 백신을 근육내 주사한 다음, 제1 접종 후 제10일에 마우스의 동일한 부위에 IFN을 추가로 주사하여 처리하였다. Flu 백신 단독 또는 식염수를 대조군으로 사용하였다.
패널 C는 flu 백신 투여 전 또는 투여 후 동시에 또는 다른 시기에 제공된 제I형 IFN의 아쥬반트 효과를 나타낸다. 백신 투여와 동시에 또는 백신 투여 전 또는 투여 후 제1일 또는 제2일에 마우스의 동일한 부위에 IFN을 근육내 주사하였다. Flu 백신 단독 또는 식염수를 대조군으로 사용하였다.
도 12: 패널 A는 제I형 IFN 및 인플루엔자 백신을 비내 투여로 제공받은 마우스의 항체 반응을 나타낸다.
7 내지 8주령의 C57BL/6 마우스를 마취시키고, 제I형 IFN 5 ×1014U를 포함하는 flu 백신 (15 ㎍) 제제 한 방울 (50 ㎕)을 비내 (i.n.) 주사하였다. 14일 후, 처리를 반복하였으며, 7일 더 지나서 혈액 샘플을 취하여 다른 flu-특이적 항체 서브클래스의 존재에 대해 표준 ELISA로 평가하였다. Flu 백신 단독 또는 식염수를 대조군으로 사용하였다. 결과를 그룹 당 마우스 5마리의 종점 역가의 평균 ±SD로 나타낸다.
패널 B는 생 인플루엔자 바이러스를 접종한 마우스에서 IFN 아쥬반트화 백신의 보호 효과를 나타낸다.
7 내지 8주령의 C57BL/6 마우스에게 flu 백신 (15 ㎍) 단독 또는 대조군으로서 제I형 IFN (2 ×105U) 또는 식염수를 포함하는 용액 0.2 ml를 근육내 백신접종하였다. 0일 및 14일째 백신을 투여하였다. 백신접종 개시 후 제50일에 마우스에게 LD5010의 생 flu 바이러스 (A/Beijing/262/95(A/H1N1) 한방울 (50 ㎕)을 비내 주사하였다. 이후, 모든 마우스를 계체하였다. 결과를 그룹 당 마우스 5마리의 평균 체중으로 나타낸다. 각 군에서 총 마우스 중 생존 마우스의 수를 표시한다.
도 13: FLU (인플루엔자) 백신 단독 또는 아쥬반트로서 제I형 IFN과 혼합된 FLU 백신으로 근육내 면역화된 대조군 마우스 및 IFN-IR KO 마우스의 FLU 특이적 항체 이소타입 분석.
0일 및 14일에 대조군 (야생형) 및 IFN-IR KO C3H/HeN 마우스에게 FLU 백신 단독, FLU 백신 + 제I형 IFN 또는 FLU 백신 + MF59 아쥬반트를 근육내 주사하였다. 제1 면역화 후 제13일 및 제2 면역화 후 제19일 (각각, 제13일 및 제33일)에 혈청을 모아서 FLU-특이적 항체 반응에 대하여 분석하였다. 데이타는 각 실험 군에 대한 혈청 5종의 특이적 항체 역가의 평균 ±s.e. (2회 반복 시험함)를 나타낸다.
* p < 0.002; ** p < 0.05 대 IFN-IR KO 마우스; NS, 유의하지 않음.
백색 막대: 대조군 야생형 마우스
흑색 막대: IFN-IR KO 마우스
도 14: FLU 백신의 비내 (i.n.) 투여시 제I형 IFN의 강력한 아쥬반트 효과.
패널 a: FLU 백신을 단독으로 또는 제I형 IFN과 혼합하여 i.n.으로 면역화시킨 C57/BL6 마우스의 FLU-특이적 HAI 역가, 혈청 항체 이소형 및 기관지-폐포 세척액 (BAL) IgA의 분석. 마우스에게 FLU 백신 50 ㎕를 단독으로 또는 제I형 IFN (105U)과 혼합하여 제0일 및 제14일에 i.n. 투여하였다. 제1 면역화 후 제14일에 혈청을 수집하였다 (좌측 그래프). 제2 면역화 후 제14일에 (우측 그래프) 마우스를 죽여, Ig 분석을 위해 혈액 샘플 및 기관지-폐포 세척액 (BAL)을 채취하였다. 데이타는 각 실험군에 대한 5개 샘플의 특이적 항체 역가에 대한 평균 ±s.e. (2회 시험함)를 나타낸다. FLU 백신 단독에 대해**P < 0.002; NS: 유의하지 않음.
백색 막대: 백신 단독
흑색 막대: 백신 + IFN
패널 b: FLU 백신을 단독으로 또는 제I형 IFN (105U)과 혼합하여, 또는 대조군으로서의 식염수를 i.n.으로 2회 투여하여 면역화되고, 그 후 제38일에 FLU 바이러스 (LD50의 10배)로 항원투여 (challenge)된 C57/BL6 마우스의 생존 시간. 데이타는 감염된 마우스의 평균 체중 변화 과정 (±s.e.) 및 동물 총 수에 대한 생존 마우스의 비율을 나타낸다. 각 군은 5마리의 마우스로 구성되었다.
흑색 원: 염수-처리한 마우스
백색 원: FLU 백신을 i.n.으로 투여한 마우스
백색 사각형: FLU 백신 + IFN을 i.n.으로 투여한 마우스
패널 c: 대조군 및 IFN-IR KO C3H/HeN 마우스에게, FLU 백신 단독, FLU 백신 + 제I형 IFN 또는 FLU 백신 + MF59 아쥬반트를 제0일 및 제14일에 i.n.으로 투여하였다. 제1 면역화 13일 후 (상단 패널) 및 제2 면역화 19일 후 (하단 패널)에, 혈청을 수집하여 FLU-특이적 항체 반응에 대해 분석하였다. 데이타는 각 실험군에대한 5개 샘플의 특이적 항체 역가에 대한 평균 ±s.e. (2회 시험함)를 나타낸다. IFN-IR KO 마우스에 대해*P < 0.004; NS: 유의하지 않음.
백색 막대: 대조군인 야생형 마우스
흑색 막대: IFN-IR KO 마우스
도 15: 1회 면역화 후 FLU 백신을 i.m. (전신) 또는 i.n. (점막)으로 백신 접종한 C57BL/6 마우스에서 제I형 IFN의 아쥬반트 효과.
패널 a는 면역화 14일 후의 항체 역가, 및 1회 i.m. 면역화 후의 마우스 생존율을 나타낸다. 근육내 면역화를 기존에 설명된 바와 같이 수행하였다. 바이러스 항원투여는 면역화 38일 후에 수행하였다.
패널 b는 면역화 14일 후의 항체 역가, 및 1회 i.n. 면역화 후의 마우스 생존율을 나타낸다. 점막 면역화를 기존에 설명된 바와 같이 수행하였다. 바이러스 항원투여는 면역화 38일 후에 수행하였다.
흑색 원: 식염수-처리한 마우스
백색 삼각형: FLU 백신을 i.m.으로 주사하거나 i.n.으로 투여한 마우스
백색 원: FLU 백신 + IFN을 i.m.으로 주사하거나, FLU 백신 + IFN을 i.n.으로 투여한 마우스
본 발명에 적합한 제I형 IFN은 IFN 족에 속하는, 단일 재조합 분자로서 또는 천연 또는 재조합 분자들의 집합체 (pool)로서 (즉, 컨센서스 IFN; CIFN)의 임의IFN이다.
인간에 사용함에 있어, 인간 제I형 IFN은 바람직한 아쥬반트이다. 이 아쥬반트는 재조합 IFN-α 또는 IFN-β 또는 IFN-γ, 건강한 기증자의 자극된 백혈구에서 유래한 천연 IFN-α (상이한 IFN-α 아형들 또는 개별 IFN-α 아형들의 혼합물) 또는 나말와 (Namalwa) 세포에서 유래한 림프구 모세포 IFN-α, 또는 CIFN, 또는 DNA 셔플링 (shuffling) 방법에 의해 시험관내에서 제조되어 생물학적 활성을 부여받은 신규 IFN 분자일 수 있다.
수의학적 용도에 있어, 제I형 IFN은 자연에서 발견되는 것들로 구성되거나, 또는 백신이 제조된 종과 밀접하게 관련되어 있다. 다시 말해, 이들 제I형 IFN은 재조합에 의해 제조되거나, 또는 적당한 동물 세포로부터 자연적으로 생성될 수 있다. 이러한 유형의 인터페론은 거의 동일한 아쥬반트 활성을 가지고 있다.
최적 아쥬반트 활성을 달성하기 위해 필요한 인터페론의 양은 항원의 유형 (즉, 항원의 면역원성)에 따라 달라지지만, 통상적으로는 백신 1회 분량 당 100,000 IU를 초과해야 한다. 마우스의 경우, 최적 효과는 제I형 IFN을 다량으로 (2×105내지 106IU) 주사함으로써 얻어진다. 인간에 있어서의 최적 투여량은 백신 1회 분량 당 106내지 6×106IU의 범위일 것으로 기대된다. 페길화된 (pegylated) 제I형 IFN 아형은 주사 후에 IFN의 시험관내 반감기를 높여주는 이점이 있으며, 이는 보다 뚜렷하고 신속한 면역 반응을 달성하는 데 유익할 수 있다.
수상돌기 세포를 표적으로 할 수 있는 모노클로날 항체 (예를 들어, 항-DEC-205 또는 항-CD11c 항체)와 융합된 재조합 제I형 IFN으로 표시되는 융합 하이브리드 단백질은 아쥬반트 조성물 또는 아쥬반트화된 백신에 포함되는 아쥬반트로서 특히 효과적일 것이다.
IFN 단백질의 투여에 더하여 또는 이를 대신하여, 아쥬반트는 하나 이상의 제I형 IFN의 구성원을 코딩하는, IFN의 올바른 발현을 위해 적당한 조절 영역이 제공된 핵산 서열 (즉, 제I형 IFN 코딩 유전자를 함유하는, 진핵 세포 시스템에서의 발현을 위해 적당한 프로모터 및 전사 종결 신호 서열의 조절 하에 있는 플라스미드)로서 제공될 수도 있다.
아쥬반트 활성은 항원 특이적 면역 반응을 향상시킬 수 있는 인터페론의 임의 부분을 지칭한다.
본 발명의 조성물은, 바람직하게는 동일한 바이알에서 생리학상 적합한 담체 (예를 들어, 생리적 pH로 완충된 멸균 식염수 용액) 중에 배합된 항원과 아쥬반트 둘 다를 함유해야 한다.
이와 관련하여, 본 발명의 아쥬반트화된 백신은 유효량의 생물학적 활성 제I형 IFN과 혼합된, 사멸 또는 약독화 병원체 뿐만 아니라 감염제 또는 기타 공급원에서 유래한 1종 이상의 항원을 포함할 수 있다. 또한, 아쥬반트화된 백신은 세포 전체를 포함할 수도 있으며, 특히 자가이식 수상돌기 세포를 포함할 수 있다.
그러한 제제를 위한 항원은 임의 유형의 천연 또는 재조합 정제 항체일 수 있으며, 여기에는 바이러스, 박테리아, 원충류 및 진균류를 비롯한 세포내 또는 세포외 병원체로부터 유래한 단백질, 펩티드, 지질 또는 탄수화물 항원, 및 종양과관련된 세포성 항원이 포함될 수 있다.
각 아쥬반트화된 백신의 1회 분량에 존재하는 항원(들)의 양은 백신 접종 대상체에서 면역보호 반응을 유도할 수 있는 양으로서 선택된다. 이 양은 항원의 종류 및 기타 통상적인 아쥬반트의 존재 여부에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 각 1회 분량은 1 내지 1000 ㎍의 항원, 바람직하게는 10 내지 200 ㎍의 항원을 함유할 것이다.
항원은 병원체 그 자체 뿐만 아니라, 세포내 또는 세포외 병원체로부터 유래한 임의 유형의 천연 또는 재조합 항원, 또는 그의 일부일 수 있으며, 상기 병원체에는 바이러스 (피코르나바이러스, 칼리시바이러스, 코로나바이러스, 아레나바이러스, 파르보바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 코로나바이러스, 라브도바이러스, 필로바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 부니아바이러스, 레트로바이러스, 파포바바이러스, 아데노바이러스, 허피스바이러스, 폭스바이러스, 헤파드나바이러스), 박테리아 (스트렙토코커스균, 스타필로코커스균, 나이세리아, 스피로헤타균, 클로스트리듐균, 코리네박테리아, 리스테리아, 에리시펠로트릭스, 안트락스, 마이코박테리아, 엔테로박테리아균, 비브리오, 캄필로박터, 헬리코박터, 헤모필러스, 보르데텔라, 브루셀라, 프란시셀라, 파스퇴렐라, 예르시니아, 클라미디아, 리케치아 및 기타 비-발효성 그람-음성 바실러스균), 마이코플라즈마 및 레지오넬라, 원충류 (사르코디나, 실리오포라, 마스티고포라, 스포로조아, 크립토스포로듐, 뉴모시스티스), 진균류 (코시디오이데스, 히스토플라즈마, 블라스토마이코세스, 크립토커스, 칸디다, 아스퍼질러스, 뮤코랄레스, 자이고마이세스)가 포함된다.
종양-관련된 항원은 흑색종 항원 (MART-1, gp100, MAGE 항원) 및 당업계에 공지된 기타 종양 항원을 포함한다.
본 발명의 아쥬반트 조성물 또는 아쥬반트화된 백신은 식염수, 부형제, (적절한 경우) 다른 아쥬반트, 방부제, 안정화제와 같은 생리학상 적합한 멸균 담체를 사용하여 통상적인 방법으로 제제화될 수 있다. 이들은 사용전 멸균 담체에 용해되는 액형 또는 동결건조형일 수 있다.
또다른 면에서, 본 발명은 항원 및 아쥬반트 둘 다를 투여 자리에 동시에 전달하기 위해, 항원 또는 병원체로부터의 그의 일부를 포함하는 아쥬반트화된 백신을 아쥬반트로 작용하는 생물학상 활성인 제I형 IFN의 유효량과 제제화하는 방법을 제공한다. IFN의 양은 국소적으로 작용하고, 충분한 시간 동안 아쥬반트 효과를 발휘하기 위해서는 충분히 많아야 한다.
상기는 함께 혼합된 항원 및 아쥬반트를 주사 후 동일한 상대 농도로 유지하고, 항원 및 아쥬반트가 이들의 관능적인 활성을 나타내는 주사 자리에 집중된 항원 제시 세포에 이들이 동시에 노출되도록 하기 위해서 아쥬반트화된 백신의 중요한 면이다.
예방적 백신의 분야에 관련된 용도 이외에, 체액성 면역 뿐만 아니라 새포-매개된 면역 반응에서 강력한 아쥬반트로 작용하는 제I형 IFN의 능력으로 인하여 본 발명은 또한 만성 질환, 예를 들어 바이러스성 만성 감염 및 암의 치료를 위한 치유적 백신의 발달에 관한 것이다.
이러한 경우, 신규한 아쥬반트화된 백신 제제는, 암 또는 만성 바이러스성 질환의 치료를 위해 환자에게 투여하려고 하는 유효량의 제I형 IFN과 혼합된 종양-관련된 항원 또는 관련된 바이러스성 항원 (또는 이러한 항원에 대한 DNA 서열 코딩)을 함유해야 한다.
사용상의 간편성으로 인해 아쥬반트 조성물 및 백신, 또는 아쥬반트화된 백신의 피하 주사가 바람직하다. 그러나, 근육내, 피내 및 점막 (예, 비내 및 경구) 경로를 비롯한 임의의 다른 투여 경로도 사용될 수 있다. 일부 바이러스성 감염을 위해서, 비내 투여는 유용한 선택일 수 있으며, 상기는 백신 전달의 매우 실질적인 양식을 사용함으로써 효능있는 보호 국소 및(또는) 전신 면역을 유발한다.
본 발명은 또한 강력한 점막 아쥬반트로서 제I형 IFN에 관한 것이다.
보호 점막 면역의 유발은 병원체 침투 자리에서 국소 면역반응을 달성하기 위해 중요하기 때문에, 점막 아쥬반트의 확인은 백신 연구에서 중요한 과제이다.
제I형 IFN이 점막 백신 접종용 아쥬반트로 사용되는 경우, 조성물은 적합한 항원와 혼합될 수 있으며, 예를 들어 경구 또는 비내 점막상에 점적주입을 통해 투여될 수 있다. 점막 투여는 일반적으로 이미 제1 면역화 (도 14a 및 14b) 후의 항체 생성 (구체적으로 IgG2a 및(또는) IgA)을 증가시킨다. 본 발명의 아쥬반트 조성물을 백신과 함께 점막 투여하는 것은 병원체 공격으로부터 생체내 완전한 국소 (점막 면역) 및(또는) 전신 면역반응을 유발한다. 그중에서도, 1995(A/Beijing/262/95(A/H1N1))에서 순환하는 H1N1 인플루엔자 바이러스의 정제에 의해 얻어진 상업상 입수가능한 백신이 마우스에 주사시 불충분하게 면역원성임이입증되었다. 실제로, 일정한 수의 마우스는 3회의 백신 주사 후에도 어떠한 상당한 항체 반응도 나타내지 않았다. 백신을 제I형 IFN과 함께 근육내 투여하는 경우, 100 ％의 마우스가 1회 면역화 후 혈청변환되고, 항체 역가는 2회 주사 후 유의하게 증가되었다.
투여량 반응 곡선은 IFN 투여량과 항체 역가간에 선형 상관이 있음을 나타내었다 (도 11). 인플루엔자 특이적 항체 이소타입은 마우스에서 보호 Th-1 면역 반응의 대표적인 마커인 IgG2a 항체 아족의 증가를 나타내었다 (도시되지 않음). 흥미롭게도, 백신 단독으로는 전혀 효과가 없었지만, 백신 및 제I형 IFN을 함유하는 제제 50 ㎕를 비내 투여한 마우스는 전신 및 점막 항체 반응을 나타내었다 (도 12a). 특히, 아쥬반트화된 백신으로 면역화된 마우스의 항체 반응은 치명적인 바이러스 공격에 대해 생체내 면역반응성인 것으로 나타났다 (도 12b). 더욱 중요하게, 바이러스의 치명적인 투여에 대한 생체내 면역반응이 면역화 방법과 상관없이 이미 1회의 면역화 후에 관찰되었다. 또한, 공격받은 동물의 생존률은 IgG 역가의 증가와 전혀 연관이 없음이 증명되었다. 실제로, 도 15에 예시한 바와 같이, 백신 단독을 사용한 면역화에 의해 IgG 역가가 상당히 증가되지만 생존률은 어떠한 상당한 증가도 없었다.
이러한 비내 투여를 위해 필요한 인터페론의 양은 피하 경로에 필요한 양과 유사하다. 예를 들어 마우스에서 인플루엔자 백신을 사용한 결과로부터 추측되는 바와 같이, 제I형 IFN의 적합한 1회 투여량은 상당한 수준의 특이적인 면역 반응을 유발하기에 충분할 수 있다. 그러나, IFN-아쥬반트화된 백신의 1회 투여 후 1 또는 2일 후 아쥬반트의 추가 투여는 면역 반응의 전체 크기를 향상시킨다.
특히, 제I형 IFN을 주사 전에 적절한 항원 및 명반과 혼합하는 것이 유리하다 (도 6).
실제로 명반3에 미리 흡착시킬 때, 마우스에서 IFN을 1회 주사하는 것은 항원 특이적 항체 반응을 가용성 IFN을 3회 주사한 것과 유사하거나 이보다 더 큰 범위로 향상시켰다 (도 6). 명반 예비-흡착의 증대 효과는 Th-1형 선택적 반응을 나타내는 IgG2a 생성의 면에서 가장 주목되었다.
따라서, 제I형 IFN 투여량이 장기간 존재하는 것은 또한 그의 아쥬반트 활성을 증가시킨다. 이러한 면에서, 페길화 제I형 IFN은 주사후 높은 반감기로 인해 몇몇 이점을 가질 수 있다. 또한, 항원 및 아쥬반트의 제어 방출 및 지연 방출을 특징으로 하는 인간 용도에 적합한 백신 조성물도 또한 포함된다. 이러한 조성물은 서방형 제제를 통해 치유적 단백질의 관능적 활성을 개선하기 위해 사용되는 통상 사용 방법을 참조한다. 상기 방법은 단백질이 생분해성 중합체 또는 리포좀으로 제조된 중심체에 캡술화되어 이로부터 천천히 방출되는 제제를 이용한다.
필요하다면, 사용된 항원의 면역원성 및 특이적 백신 접종 프로그램에 의해 수립되는 파라미터 면역화 범위에 따라 백신 투여량의 1회 투여 후, 부스트 (boost) 투여량이 치료대상에게 투여될 수 있다.
별법으로는, 비록 그 효과가 덜하긴 하지만 IFN의 아쥬반트 효과는 항원과 개별적으로 키트의 일부로 제I형 IFN을 항원 주사 자리와 매우 가깝게 동시에 투여함으로써 얻어질 수 있다. 사용의 간편성으로 인해 키트 일부의 조성물로 백신을피하 주사하는 것이 바람직하다. 그러나, 근육내 피내, 비내 및 경구 경로를 비롯한 임의의 다른 투여 경로가 사용될 수 있다. 이러한 투여 방법에 사용되는 인터페론의 양은 피하 경로에 필요한 양과 유사하다.
본 발명은 하기 예상치못한 중요한 발견을 기초로 한다:
i) 적합한 양의 제I형 IFN과 혼합된 소정량의 항체를 마우스에게 동시 주사하는 것은 면역 반응의 전형적인 Th-1형과 관련된 1차 항체 반응을 강력하게 유발하며 (도 5, 6 및 9), 이는 어떠한 독성도 유발하지 않아 통상적으로 입수가능한 아쥬반트를 사용하여 관찰된 것 (도 7)보다 뛰어나다는 점;
ii) 내인성 제I형 IFN은 기준 항원 (도 1 내지 4 및 8; 이들 모든 아쥬반트는 인간에서 사용시 관련된 안전성 문제점을 지님)과 함께 주사시 IFA, CFA, CpG와 같은 아쥬반트에 의해 유발된 Th-1 촉진 면역 반응의 주된 매개자라는 점;
iii) 상업상 입수가능한 인플루엔자 백신은 적합한 양의 제I형 IFN과 함께 마우스에게 근육내 또는 비내 투여시 매우 면역원성이며 바이러스 공격에 대해 면역반응성이 된다는 점 (도 11 및 12).
이러한 발견의 중요성 및 상세한사항을 하기 실시예에서 명백하게 설명하였다.
재료 및 방법
마우스
마우스를 챨스 리버-UK(Charles River-UK)(영국 켄트주 마게이트 소재), 챨스 리버-이탤리(Charles River-Italy)(이탈리아 칼코 소재) 또는 동물 보건 기관(the Institute for Animal Health)(영국 크롬프톤 소재)의 SPF 유니트로부터 구입하였다. C3H/HeJ 마우스는 할란 유케이사(Harlan UK Ltd)(영국 블랙톤 소재)에서 구입하였다. 129 SvEv(129) 마우스는 동물 보건 기관의 SPF 유니트에서 구입하였다. 제I형 IFN 수용체 기능(제I형 IFNR KO)에 대해 결핍된 129 배경 마우스는 초기에 비앤드케이 유니버설(B&K Universal)(영국 노쓰 험버사이드 소재)에서 구입하였고 동물 보건 기관의 SPF 유니트에서 보관 및 성장시켰다.
인터페론
고 역가 IFN-α/β×107U/㎎ 단백질을 문헌(Tovey MG, Begon-Lours J and Gresser I. A method for the large scale production of potent interferon preparations. Proc Soc Exp Biol Med 146:809-815, 1974)의 Tovey 등으로부터 적용된 방법에 따라 C243-3 세포주에서 제조하였다. 간략히, 융합성 세포를 10% FCS 및 1 mM 부티르산나트륨이 풍부한 MEM중 10 U/㎖ IFN의 첨가에 의해 프라이밍하였다. 37℃에서 배양 16시간 후, C243-3 세포를 MEM+0.5% FCS+5mM 테오필린중 뉴캐슬 질환 바이러스(1의 감염 다중도)에 의해 감염시켰다. 18시간 감염후, 배양 상청액을 수집하고 1500 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 pH 2.0으로 조정하고, IFN 적정전 0℃에서 6일 동안 유지하였다. 팔콘 마이크로플레이트중 단층 배양에서 L 세포에 대한 소포성 구내염 바이러스의 세포병변 효과의 억제에 의해 IFN을 분석하였다. 이들 IFN 제제는 pH 2.0에서의 처리시 침전된 오염 단백질의 원심분리 및 PBS에 대한 투석에 의해 제거된 후 2×106U/㎎ 단백질의 비활성을 가졌다. 문헌에서 단위는 국제 마우스 기준 단위로서 표현되었다. IFN을 황산암모늄 침전 및 PBS에 대한 투석에 의해 농축시키고 부분적으로 정제하였다. 모든 IFN 제제를 IFN에 내성인 L1210 세포주에 대한 임의의 가능한 잔류 독성에 대해 시험하기 전에 0.01 M 퍼클로르산에 대해 그후 PBS에 대해 4℃에서 24시간 동안 추가 투석시켰다. 부분적으로 정제된 이들 IFN 제제는 적어도 2×107U/㎎ 단백질의 역가를 가졌고 리물러스(Limulus) 아메바양세포 분석에 의해 분석할 때 내독소가 없었다. 이 제제는 문헌(Belardelli F et al., "Studies on the expression of spontaneous and induced interferon in mouse peritoneal macrophages by means of monoclonal antibodies to mouse interferons", J Gen Virol 68:2203-2212, 1987)에 상세히 기재된 바와 같은 IFN에 대해 mAb를 사용하는 중화 분석에 의해 평가할 때 대략 75% IFN-β 및 25% IFN-α로 구성된다는 것을 입증하였다. 고 역가 정제된 IFN-β(2×109U/㎎ 단백질)를 IFN-β에 대한 래트 모노클로날 항체와 결합된 세파로스(Sepharose) 컬럼상의 친화도 크로마토그래피에 의해 제조하였다(문헌(Kawade Y and Watanabe Y. Characterization of rat monoclonal antibodies to mouse interferon αand β. Proceedings of the third international TNO meeting on the biology of the Interferon system. In the Biology of the Interferon System, Dordrecht, 197-202, 1987)).
항원 및 아쥬반트
닭 감마 글로불린(CGG) 및 오브알부민(OVA)을 각각 영국 루톤 소재의 스트라테크 사이언티픽사(Stratech Scientific Ltd) 및 시그마 케미칼사(Sigma Chemical Co.)로부터 구입하였다. 인플루엔자 백신은 A/Beijing/262/95(H1/N1) 인플루엔자 바이러스 주로부터 제조된 아단위 X-127 일가 백신이었고 치론 코포레이션(Chiron Corporation)(미국 캘리포니아주 에머리빌 소재)에서 친절하게 제공되었다.
항원을 PBS에 용해시키고 필터 멸균하였다. 불완전(IFA) 및 완전 프로인트 아쥬반트(CFA)(Sigma Chemical Co)를 안정한 에멀젼이 형성될 때까지 2개의 유리 시린지 및 루어 로크 커넥터(luer lock connector)를 사용하여 각각 항원 용액과 1:1 v/v 비로 혼합하고 유화시켰다. 알룸(수산화알루미늄 겔, Sigma Chemical Co)을 1:20 w/v 비로 항원 용액에 용해시키고, pH를 6.5로 조정하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션후, 용액을 원심분리하고 펠렛을 앞선 부피의 식염수에 재현탁시켰다. CpG ODN(CpG)는 로쉐 다이아그노스틱사(Roche Diagnostic)(이탤리 밀란 소재)에 의해 합성되었다. CpG 200 ㎍을 OVA 200 ㎍을 함유하는 1 ㎖ 최종 부피의 용액에 용해시켰다. 이 연구에 사용된 CpG는 포스포로티오에이트 골격을 갖도록 제조하였고 서열 TsGsAsCsTsGsTsGsAsAsCsGsTsTsCsGsAsGsAsTsGsA을 가졌다. 폴리이노신-폴리시티딜산(폴리(I:C))(Sigma Chemical Co)을 10 ㎎/㎖의 농도에서 식염수에 용해시켰다. 냉동된 분취액을 각각의 실험직전에 해빙하고 폴리(I:C) 0.15 ㎎을 식염수 0.15 ㎖의 부피로 복강내 주사하였다. MF59를 피펫에 의해 항원 용액과 1:1 (v/v) 비로 혼합하여 유화시켰다.
CGG를 사용한 면역의 프로토콜
모든 면역을 CGG 100 ㎍의 sc 주사에 의해 수행하였다. 단독으로 주어지거나, 나타낸 바와 같이 폴리 IC(Sigma Chemical Co. Ltd, 영국 도르셋 소재)) 100 ㎍, IFN-αβ 105U 또는 정제된 IFN-β 105U와 혼합하는 경우, CGG를 가용성 형태(PBS중)로 투여하였다. 타이터맥스(Titermax)(CytRx Corporation, 미국 조지아주 노크로스 소재), IFA(Sigma) 또는 CFA(Sigma)를 사용하여 주사하는 경우, PBS중 동일 부피의 CGG를 주사전에 아쥬반트로 유화시켰다. 몇몇 실험에서, 제I형 IFN, 타이터맥스 또는 IFA를 수회 투여하였다. 모든 경우에, 마우스를 1차 주사 부위에서 sc 주사하였다. 기억 반응에 대해 시험하는 경우, 마우스를 CGG로 검사하기 직전에 출혈시켜 예비-검사 항체 수준을 얻었다. 동일한 마우스를 CGG 검사후 제6일에 출혈시켰다.
OVA를 사용한 면역의 프로토콜
폴리(I:C)를 제외하고, 모든 아쥬반트를 항상 OVA를 사용하거나 사용하지 않고서 50 ㎕/마우스의 부피로 i.d. 주사하였다. OVA 농도는 항상 10 ㎍/마우스이었다. 2개의 상이한 면역 프로토콜을 사용하였다. 양호한 항체 및 증식성 반응을 달성하기 위해, 마우스를 OVA+아쥬반트를 사용하여 제0일에 주사하고 10일 및 17일 후에 OVA 단독으로 추가 투여하였다. 반대로, 지연형 과민증(DTH) 분석을 위해 선택된 마우스를 0회, 및 10회 및 17회 모두로 OVA+아쥬반트로 주사하였다. 모든 면역 실험은 대조물로서 OVA 단독 및 식염수로 처리된 팔을 포함하였다. 혈액 샘플을 후속적인 항원 주사 직전에 후-안와 정맥 얼기로부터 취했다. 혈청을 수집하고추가 분석전에 -20℃에서 저장하였다.
인플루엔자(FLU) 백신을 사용한 면역의 프로토콜
근육내(i.m.) 면역을 위해, 마우스를 백신(15 ㎍)과 식염수, 또는 백신(15 ㎍)과 IFN(2×105U), 또는 식염수 단독을 함유하는 용액 200 ㎕의 최종 부피로 주사하였다. 비내(i.n.) 면역을 위해, 약간 마취된 마우스를 동일한 양의 백신과 식염수, 또는 백신과 IFN, 또는 식염수 단독을 함유하는 용액 한방울(50 ㎕)로 주입하였다. 동일한 양의 백신과 IFN을 함유하는 추가 투여량을 1차 면역후 제14일에 적용하였다.
ELISA에 의한 혈청 항체의 분석
CGG(탄산염 완충액(pH 9.6)중 5 ㎍/㎖)를 96웰 가요성 플레이트(Falcon, Becton Dickinson, 영국 옥스포드 소재)에서 실온에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 4% 분말 밀크를 함유하는 PBS로 블록킹한 후 PBS-트윈(Tween)(0.05%)에서 3회 세척하였다. PBS-1% 밀크중 혈청의 12배 연속 희석액을 실온에서 1시간 동안 웰에 가하였다. 3회 세척후, 비오티닐화 래트 항-마우스 항체[항-마우스 IgM(R6-60.2), IgG1(A85-1), IgG2a(R19-15), IgG2b(12-3), IgG3(R40-82) 또는 IgE(R35-72)(Becton Dickinson)]을 실온에서 1시간 동안 웰에 가하였다. 3회 세척후, 스트렙타비딘-HRP(Becton Dickinson)을 실온에서 1시간 동안 가하였다. OPD 정제(Sigma)를 과산화효소 기질로서 사용하였다. 가장 높은 역가 혈청의 가장 높은 희석도가 배경 위로 상승하기 전에 50 ㎕ 3M HCl을 첨가하여반응을 정지시켰다. 광학 밀도를 스펙트라맥스(SPECTRAmax)(Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 써니베일 소재)상에서 492 nm로 판독하였다. 결과를 말단점 역가의 역수로서 표현하였고 이는 엑셀(Excel)상에서 설계된 자동화 과정을 사용하여 측정하였다. 간략히, OD 값에 대한 양성도의 한계를 3개의 대조 마우스 혈청(비조작된 마우스 또는 IFN-α/β 또는 폴리 IC 단독으로 처리된 마우스로부터의 혈청)으로부터의 모든 희석액의 평균+3SD로서 각각의 항체 동종형에 대해 계산하였다. 배경 수준은 모든 희석액에 대해 매우 낮았고(통상 약 0.08), 실험들 사이에 그다지 변하지 않았다. 주어진 혈청 샘플에 대해, 말단점 역가를 양성도의 한계 미만에서 제1 희석으로서 측정하였다. 말단점 역가는 임의적인 단위이기 때문에, 결과는 동일한 분석내에서 고려되어야 하고, 실험들사이에 직접 비교할 수 없다. 이러한 이유로, 각각의 실험내의 모든 샘플을 동시에 분석하였다.
마우스 혈청에 존재하는 CGG-특이적 항체의 대략적인 농도를 결정하기 위해, ELISA를, 마우스 Ig 표준물과 비교하여 반-정량적인 방법으로 수행하였다. CGG-특이적 항체를 알칼리성 포스페이타제(AP) (모두 Southern Biotechnology Associates Inc로부터 구입, 미국 알라바마주 버밍험 소재)에 접합된 동종형 특이적 다클론성 염소의 항-마우스 항체를 사용하여 드러내는 것을 제외하고, CGG-특이적 항체를 상기한 바와 같이 검출하였다. 표준물을 확립하기 위해, 플레이트를 미표지된 동종형 특이적 다클론성 염소의 항-마우스 항체 (5 ㎍/㎖) (Southern Biotechnology)로 코팅하였다. 플레이트를 상기와 같이 블로킹시킨 다음, 정제된 마우스 항체를 알고있는 농도로 첨가하였다 (Southern Biotechnology으로부터의 마우스 Ig 표준 패널). 세정후, 표준물을 AP에 접합된 동종형 특이적 다클론성 염소의 항-마우스 항체를 사용하여 드러냈다. p-NPP 타블렛 (Sigma)을 AP 기질로 사용하였다. 효소적 반응을 3M NaOH를 첨가하여 중단하였다. OD는 405 nm에서 판독하였다. SoftmaxPro (Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)를 사용하여, 각 동종형에 대해 표준 곡선을 확립하고, CGG-특이적 항체의 양을 계산하였다.
OVA-특이적 항체 수준을 측정하기 위해, 표준의 직접 ELISA 분석을 수행하였다. 간략하게는, 96웰 플레이트 바닥 미세적정 플레이트 (DYNEX Immulon 4MBX)를 1 ㎍/㎖ (총 IgG 검출의 경우) 또는 4 ㎍/㎖ (IgG2a 및 IgG1 검출의 경우)의 난백 알부민 용액 (Sigma Chemical Co, 미국 미조리주 세인트 루이스 소재) (NaHCO3완충액, pH 9.6 (코팅 완충액)으로 희석됨) 100 ㎕로 코팅하였다. 4 ℃에서 밤새 인큐베이션후, 플레이트를 PBS + 0.01% 트윈 20 (세정액)으로 3회 세정하고, 5% 소 혈청 알부민 (BSA) (Sigma Chemical Co, 미국 미조리주 세인트 루이스 소재)를 함유하는 PBS로 실온에서 2시간 동안 블로킹시켰다. 이어서, 미리 희석된 (1:2 비율) 혈청 샘플 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 37 ℃에서 1시간 및 30분 동안 인큐베이트하였다. 세정후, 플레이트를 퍼옥시다제-접합된 제2 항체 100 ㎕와 함께 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이트하였다. 다음 제2 항체: 5% BSA 함유 PBS 중에 1:1000으로 희석된 전체 항-마우스 IgG (Sigma Chemical Co, 미국 미조리주 세인트 루이스 소재); 1:200으로 희석된 항-마우스 IgG2a (Cappel Research Products, 미국 노쓰 캘리포니아주 더험 소재); 1:400로 희석된 항-마우스 IgG1 (Cappel ResearchProducts, 미국 노쓰 캘리포니아주 더험 소재)를 사용하였다. 인큐베이션 말기에, 플레이트를 3회 세정하고, 효소 기질 용액 (0.001% H2O2함유 0.1 M 인산염-시트르산염 완충액 20 ㎖ 중의 오르토-페닐렌디아민 4 ㎎) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고 약 20분 동안 암실에 방치하였다. 효소적 반응을 4 N H2SO450 ㎕로 중단하고, 플레이트를 450 nm에서 마이크로플레이트 자동판독기에서 판독하였다. 결과를 실험 조건 당 3개의 혈청의 종점 희석액의 평균으로 나타내고, 여기서 종점은, 각 분석에 포함된 3개의 음성 대조 샘플의 평균 +2 SD 보다 더 큰 흡광도값을 생성하는 최종 혈청 희석액으로 결정한다.
DC 제조 및 주사
DC를 상기한 방법 (Vremec D 등, "The Surface phenotype of dendritic cells purified from mouse thymus and spleen: investigation of the CD8 expression by a subpopulation of dendritic cells" J Exp Med 176: 47-58, 1992)을 사용하여 비장으로부터 단리하였다. 간략하게는, 129 또는 제I형 IFNR KO 마우스로부터의 비장을 작은 조각으로 절단하고, 교반하면서 5% FCS 함유 RPMI, 콜라게나제 III (1 ㎎/㎖, Lorne Laboratories, Reading, UK) 및 DNase I (0.6 ㎎/㎖ Sigma, St Louis, MO) 중에 37 ℃에서 5분 동안, 이어서 실온에서 15분 동안 분해시켰다. DC-풍부 세포 집단을 니코덴즈 (Nycodenz, Life Technology Paisley, 영국) 구배를 사용하여 얻었다. 이어서, 저밀도 세포 분획을 얼음상에서 20분 동안 PBS-EDTA-FCS 중에 항-CD11c-FITC (Becton Dickinson, 영국 옥스포드 소재)로 표지하였다. 세정후, 세포를 여과하고 (70 ㎛ 세포 스트레이너, Falcon), CD11c+세포를 MoFlow 흐름 세포측정기 (Cytomation, 미국 콜로라도주 포트 콜린스 소재) 상에 분류하여, 98% 초과의 CD11c+인 집단을 얻었다. PBS 중에 2회 세정후, 정제된 DC를 PBS 단독 또는 100 ㎍ CGG 함유 PBS 중에 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이트하였다. 5-7x 105정제된 DC를 CGG와 함께 또는 없이, 제I형 IFNR KO 마우스 ±105U IFN-α/β중으로 sc 주사하였다. CGG + DC + IFN-α/β를 공급받은 마우스를 1 및 2일후에 105U IFN-α/β를 추가로 sc 제공하였다.
T 세포 증식 및 사이토킨 분석
<CGG-특이적 증식 분석>
DrLN을 작은 조각으로 절단하고, 자주 교반하면서 5% FCS 함유 RPMI, 콜라게나제 III (1 ㎎/㎖) 및 DNase I (0.6 ㎎/㎖) 중에 실온에서 20분 동안 분해시켰다. 이어서, 세포 현탁액을 여과하고 (70 ㎛), 세정하여 1500 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 증식 분석을 위해, 미분리된 세포 (웰 당 5 x 105)을 완전 배지 (10% 열-불활성화된 FCS로 보충된 RPMI 1640 (PAA Laboratories), 50 μM 2-ME (Sigma), 10 mM HEPES, 5% NCTC 배지, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 250 ㎍/㎖ 젠타미신 (모두 Life Technologies로부터 구입)) 중에 96웰 플레이트 ±CGG (20 ㎍/ 웰)의 삼중 웰에서 배양하였다. 배양 4일째에, 웰을 1 μCi [3H]-티미딘로8시간 동안 펄스시켰다. 이어서, 플레이트를 수확하고 Microbeta TRILUX 카운터 (Wallac, 핀란드 터쿠 소재)를 사용하여 측정된 [3H]-티미딘를 혼입하였다. 사이토킨 분석을 위해, DrLN 세포를 항-클라스 II (TIB120), 항-CD8 (3155) 및 항-CD11b (M1/70)로 얼음상에서 15분 동안 인큐베이트시켰다. 세정후, CD4+T 세포를 양의 항-래트 TgG 및 항-마우스 IgG 마그네틱 Dynabeads (Dynal, 노르웨이 오슬로 소재)를 사용하여 네거티브 선별에 의해 정제하였다. 2 x 104정제된 CD4+T 세포를 미처리된 동계 마우스로부터의 5 x 105T-결핍된 비장 세포와 함께 96웰 플레이트의 삼중 웰 중에 완전 배지 중에서 배양하였다. T-결핍된 비장 세포는 비장 세포를 래트 항-마우스-Thy-1 항체 (T24) 및 기니아 피그 보체 (VH BIO Ltd, 영국 옥스포드 소재)와 함께 37 ℃에서 45분 동안 인큐베이션시킴으로써 제조하였다. 배양전, T-결핍된 비장 세포를 37 ℃에서 1시간 동안 ±CGG (20 ㎍/웰) 예비 인큐베이트시키고 3000 라드에서 조사하였다. 배향 3일후, 상청액을 수확하고, 사이토킨은 제작자에 의해 지시되는 바와 같이 R & D으로부터의 마우스 IFN-γ및 IL-4를 위한 Quantikine M 키트 (Abingdon, 영국 옥손 소재)를 사용하여 측정하였다.
<OVA-특이적 증식 분석>
항원 유도된 증식 반응을 시험하기 위해, 마우스를 제1 면역 32-35일후 희생시켰다. 각 마우스의 비장으로부터의 단일 비장 세포 현탁액의 세포를 상이한 농도의 OVA (0, 50, 100 및 200 ㎍/㎖)을 함유하는 10% FCS RPMI 배지 0.2 ㎖/웰 중에 5 x 105의 농도로 평면 바닥의 96웰 중에서 배양하였다. 5% CO2습윤된 인큐베이터 중에 37 ℃에서 인큐베이션 4일후, 0.5 μCi [3H]-티미딘 (DuPont-NEN, 미국 매사츄세츠주 보스톤 소재)를 첨가하였다. 추가의 인큐베이션 18시간 후, 세포를 필터메이트 A (Wallac, 핀란드 터쿠 소재) 상에 수확하고, 방사능을 신틸레이터 (Betaplate, Wallac, 핀란드 터쿠 소재) 상에서 판독하였다. 결과를 삼중으로 시험된 3마리 마우스의 평균 cpm ±SD로 나타낸다.
<CGG-특이적 엘리스폿 분석>
멀티-스크린-IP 무균 엘리스폿 플레이트 (밀리포어 (Millipore), 영국 월포드 소재)를 탄산염 완충액 (pH 9.6) 중의 CGG 20 ㎍/ml로 밤새 코팅하였다. PBS로 5회 세척한 후, 플레이트를 37 ℃에서 2 시간 동안 PBS 중 4％ 우유로 차단시키고, PBS로 5회 세척하였다. 세포 현탁액을 상기 기재된 바와 같이 DrLN으로부터 제조하고, 세척하고 1500 rpm에서 10 분 동안 원심분리하고, 15％ FCS로 보충된 완전 배지에 재현탁시켰다. 모든 샘플을 여러 상이한 세포 농도 (2 ×104내지 5 ×105세포/웰)로 3벌식으로 플레이팅하였다. 37 ℃에서 5％ CO2하에 밤새 배양한 후, 플레이트를 PBS-트윈 (0.05％)으로 강력 세척하였다. CGG-특이적 항체는 웰을 AP에 접합된 특이적 폴리클로날 염소 항-마우스 항체 동종형 (써던 바이오테크날러지 (Southern Biotechnology))과 함께 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션시킴으로써 나타났다. 세척한 후, 0.1M 트리스/HCl (pH 9.5); 10％ 디에탄올아민; 0.1M NaCl, 5mM MgCl2에 1 mg/ml으로 희석된 BCIP (시그마 (Sigma))를 AP에 대한 기질로 사용하였다. 플레이트를 수돗물로 세척하여 반응을 중단시켰다. 스폿들을 현미경하에 계수하였다.
실시예 1. CGG+폴리 IC로 면역화시킨 마우스에서 항체 반응: 제I형 IFN의 중요성
아쥬반트로서 작용하는 제I형 IFN의 능력은 먼저 폴리이노신산:폴리시티딜산 (폴리 IC), 합성 이중 가닥 RNA를 이용하여 생체내에서 제I형 IFN의 생산을 유도함으로써 시험하였다. C57BL/6 (B6) 마우스는 PBS 중 닭 감마 글로불린 (CGG)을 피하 주사하여 면역화시키고, 폴리 IC를 공동 주사한 효과를 실험하였다. C57BL/6 (B6) 마우스를 PBS 중 닭 감마 글로불린 (CGG) 100 ㎍ 또는 PBS 중 동량의 CGG 및 폴리 IC 100 ㎍의 혼합물을 피하 주사하여 면역화시켰다. 면역화시킨지 10일 후, CGG-특이적 항체의 다양한 동종형의 존재에 대하여 ELISA를 이용하여 혈청을 분석하였다.
그 결과는 도 1A에 도시되어 있다. CGG 단독은 불량한 면역원성이었고, 반응이 대부분 IgG1 서브클래스의 항체에 국한되었으며, IgM, IgG2b, IgG2a 및 IgG3 항체는 매우 낮은 수준으로 검출되었다. 폴리 IC의 공동 주사는 CGG-특이적 항체 역가에서 뚜렷한 증가를 촉진시켰고, 이는 IgG의 모든 서브클래스에 적용된다 (도 1A). 상기 도면은 IgG1, IgG2b, IgG2a 및 IgG3 항체의 역가가 각각 3배, 4.2배, 9배 및 8.4배 증가된 것을 보여준다.
폴리 IC가 제I형 IFN의 강력한 유도 인자인 것으로 공지되어 있지만, 이는 다른 사이토킨도 유도할 수 있다. 따라서, 폴리 IC의 아쥬반트 활성이 실제로 제I형 IFN에 의존적인지 여부를 측정하는 것이 중요하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 제I형 IFN에 대한 기능적 수용체가 결핍된 마우스 (제I형 IFNR KO 마우스, 129 백그라운드에 대한 것임) 및 대조군 (129) 마우스 (상기 기재된 바와 같이 면역화를 수행하였음)에서 항체 반응을 향상시키는 폴리 IC의 능력을 비교하였다.
B6 마우스에서와 같이, 폴리 IC는 대조군 129 마우스에서 CGG에 대한 항체 반응을 현저히 향상시켰다 (도 1B). 반면에, 제I형 IFNR KO 마우스에서는 폴리 IC의 그러한 능력이 크게 감소되었다. 제I형 IFNR KO 마우스에서는 IgM, IgG1 및 IgG2b 역가가 조금 증가되었으며, 이는 폴리 IC가 독립적으로 제I형 IFN의 이들 동종형의 생산을 향상시킬 수 있음을 나타낸다. 그러나, 폴리 IC의 효과는 대부분 제I형 IFN에 의존적인데, 이는 이들 항체의 역가가 대조군 마우스에 비해 제I형 IFNR KO 마우스에서 훨씬 낮게 유지되었기 때문이다.
또한, 제I형 IFNR KO 마우스에서 IgG2a 및 IgG3 항-CGG 항체의 생산은 폴리 IC에 의해 전혀 자극되지 않았다. 즉, 이들 데이타는 숙주에서 제I형 IFN의 발현 유도가 가용성 단백질 항원에 대한 항체 반응의 현저한 증가를 자극하며, 모든 IgG 서브클래스의 항체에 해당된다는 것을 보여준다.
실시예 2. OVA+아쥬반트로 면역화시킨 마우스에서 항체 반응: 제I형 IFN의 중요성
먼저, 마우스를 OVA, OVA+IFA, OVA+CFA, OVA+CpG 또는 OVA+명반의 피내 주사로 처리하였다. 항원의 경우 50 ㎕ 중 10 ㎍의 투여량으로 사용하였고, IFA 및 CFA를 항원과 1:1 v/v 비율로 혼합하고, 안정한 에멀젼이 수득될 때가지 유화시키고, CpG를 10 ㎍의 양으로 사용하고, 항원과 혼합하고, 명반을 OVA 흡착을 위해 충분한 양으로 사용하였다. 제1 면역화 후, OVA 단독으로 제2 (10일째) 및 제3 (17일째) 처리하였다. 대조군 마우스를 식염수로 처리하였다. 그 결과, OVA 단독은 매우 낮은 항체 반응을 유발하는 불량한 면역원성인 반면, 아쥬반트의 공동 주사는 OVA-특이적 항체 반응의 증가를 유도하는 것으로 나타났다 (도 2). 이러한 향상은 IFA, CFA 또는 CpG의 경우에 특히 현저하였고, 명반의 경우에는 덜 두드러졌다. IgG 서브클래스 특징은, IFA 및 CFA가 IgG1 및 IgG2a 서브클래스 둘다에 대해 효과적인 아쥬반트로서 작용하고 (전형적으로 각각 Th-2 및 Th-1 유형의 항체 반응과 관련) (도 2A), CpG가 IgG2a에 대해 보다 특이적이고 (Th-1 유형), 명반이 IgG1에 대해 보다 특이적인 것으로 (Th-2 유형) 나타났다 (도 2B). 아쥬반트 활성이 제I형 IFN에 의해 매개되는지 여부를 측정하기 위해, 본 발명자들은 제I형 IFN에 대한 기능적 수용체가 결핍된 마우스 (제I형 IFNR KO 마우스 C3H/HeJ)에서 항체 반응을 향상시키는 이들 모든 아쥬반트의 능력을 비교하였다. 그 결과, OVA-특이적 IgG2a 및 IgG1 서브클래스만이 대조군 마우스에 비해 제I형 IFNR KO 마우스에서 약간 증가된 것으로 나타났다 (도 2A 및 2B). 이는 전형적인 Th-1 촉진 아쥬반트에 의해 유발된 항체 반응의 향상에서 제I형 IFN에 의해 발휘되는 기능적 역할을 확인시켜 준다.
실시예 3. CGG+폴리 IC로 면역화시킨 마우스로부터 얻은 T 세포의 시험관내증식 및 IFN 감마 생산: 제I형 IFN의 중요성
T 세포 프라이밍에 대한 제I형 IFN의 효과 또한 평가하였다. 먼저, 시험관내에서 CGG로 재자극시에 증식하는 LN T 세포의 용량을 측정하였다. 면역화시킨지 10일후에 드레이닝 LN (DrLN)을 제거하고 (실시예 1에 기재된 바와 같이), 생성된 세포 현탁액을 CGG의 존재 또는 부재하에 배양시켰다. 폴리 IC와 CGG를 대조군 (129) 마우스에 공동 주사한 경우, CGG 단독으로 면역화시킨 것에 비해 훨씬 높은 CGG-특이적 시험관내 증식 반응이 일어났고 (도 3A), BrdU로 펄싱시켰을 때 시험관내에서 증식된 대부분의 세포가 CD4+인 것으로 나타났다 (데이타는 도시하지 않음). T 세포 프라이밍의 향상은 부분적으로 제I형 IFN에 독립적인데, 이는 제I형 IFNR KO 마우스를 폴리 IC로 처리하면 시험관내 증식 반응 또한 다소 증가되었기 때문이다 (도 3A). 그러나, CGG+폴리 IC를 주사한 제I형 IFNR KO 마우스로부터 얻은 세포는 CGG+폴리 IC를 주사한 대조군 마우스로부터 얻은 세포에 비해 훨씬 낮게 증식되었고, 이는 제I형 IFN이 실제로 T 세포 반응을 생체내에서 향상시킴을 나타내는 것이다. 이는 또한 시험관내에서 재자극된 CD4+T 세포에 의한 사이토킨 생산을 시험한 경우에 명백하였다 (도 3B).
따라서, CGG 단독으로 면역화시킨 마우스로부터 얻은 CD4+DrLN 세포는 시험관내에서 CGG에 의해 자극될 때 IFN-γ를 거의 분비하지 않는 반면, 폴리 IC+CGG를 주사한 마우스로부터 얻은 CD4+세포에서는 IFN-γ가 현저히 많은 양으로 생산되었다. 중요하게는, 폴리 IC가 제I형 IFNR KO 마우스에 비해 대조군 마우스에서 IFN γ를 분비하는 CD4+T 세포의 프라이밍을 매우 높은 정도로 증가시켰다. 반면에, 서로 상당히 상이하지 않은 모든 군에서는 CD4+세포로부터 IL-4가 소량 분비되었다. 따라서, 제I형 IFN의 유도는 생체내에서 T 세포 프라이밍을 향상시켜, IFN γ를 분비하는 CD4+T 세포의 생산을 촉진시킨다.
실시예 4. OVA+아쥬반트로 면역화시킨 마우스에서 T 세포의 시험관내 증식 및 DTH 반응에 있어 내생성 제I형 IFN의 역할
실시예 2에 기재된 면역화의 마지막에, 마우스를 치사시키고, OVA에 대한 증식 분석을 위해 비장을 취하였다. 도 4에는 OVA 100 ㎍을 함유하는 배지에서 배양한 비장 세포의3H 티미딘 흡수에 대한 결과가 도시되어 있다. 이 실험에서, OVA, OVA+CFA (도 4A) 또는 OVA, OVA+CpG, 또는 OVA+명반 (도 4B)으로 면역화시킨 제I형 IFN R 마우스로부터 유래된 모든 비장 세포는 식염수로 처리한 대조군에 비해 현저한 증식을 나타낸 반면 (OVA+명반의 경우는 제외), 어떠한 제I형 IFNR KO 마우스 처리군에서도 증식은 전혀 검출되지 않았다. 평행 실험으로, 아쥬반트를 제2 및 제3 면역화에서도 투여하고, 이어서 DTH 반응 측정을 위해 OVA를 발바닥에 가하는 약간 상이한 프로토콜로 일부 정상 및 제I형 IFNR KO 마우스를 면역화시켰다 (도 4C 및 4D). 대조군에 비해 제I형 IFNR KO 마우스에서 관찰된 불완전한 DTH 반응은, 아쥬반트에 의해 유도된 DTH 반응이 내생성 제I형 IFN에 의해 매개된다는 것을나타낸다. 이와 관련하여, DTH를 유도할 수 있는 모든 아쥬반트는 또한 마우스에서 주사후에 제I형 IFN 생산을 자극한다고 언급할 수 있다.
실시예 5. 제I형 IFN의 처리에 의한 일차 항체 반응의 자극
외인성 제I형 IFN의 항체 반응에 대한 효과를 IFN-α 및 IFN-β 모두를 함유하는 마우스 제I형 IFN의 부분적으로 정제된 고역가 조성물을 사용하여 최초로 연구하였다. B6 마우스를 CGG 100 ㎍ 단독으로 또는 동일한 투여량의 CGG + IFN-α/β 105U로 sc 주사하였다 (IFN 1X). 그리고, CGG + IFN-α/β로 주사된 마우스의 분리된 군을 1일 늦게 IFN-α/β 단독으로 (105U) 이차 sc 주사하거나 (IFN 2X), 1 및 2일 모두 늦게 IFN-α/β (105U) sc 주사하였다 (IFN 3X). 도 5A에 나타난 바와 같이, 마우스를 IFN-α/β로 처리시 CGG-특이적 항체 반응이 강하게 향상되었다; 상기 효과는 제I형 IFN을 3회 주사받은 마우스에서 가장 현저하였고, IgG의 모든 하위군에 대해 명백하였다. CGG-특이적 IgE는 어떠한 마우스의 군에서도 추적되지 않았다 (데이터는 보여지지 않음). IFN-α/β으로 처리시 엔도톡신의 오염 가능성이 줄어들면서 LPS-비-반응성 C3H/HeJ 마우스에서의 항체 반응이 유사하게 향상되었다 (데이터는 보여지지 않음).
친화성-정제 IFN-β를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다 (도 5B). 이 경우에, IFN-β의 단독 주사는 일차 항체 반응을 향상시키기에 충분하였으나, 부분적으로 정제된 IFN-α/β에 대해서 가장 높은 항체 역가는 IFN-β의 3회 주사 후에 달성되었다. IFN-β의 1회, 2회 또는 3회 주사 후에, 항체 역가는 IgM에 대해 각각 5, 6 및 8배; IgG1에 대해 각각 6.4, 8.5 및 12.8배; IgG2b에 대해 각각 13.3, 16 및 26.6배; IgG2a에 대해 각각 25.6, 32 및 153.6배; IgG3에 대해 각각 16.6, 64 및 117.3배 증가되었다. 부분적으로 정제된 IFN-α/β를 사용한 실험과 함께 주어져서, 상기 결과들은 면역 반응 동안에 제I형 IFN을 초기에 투여하면 가용성 단백질 항체에 대한 일차 항체 반응이 현저하게 증가된다는 것을 명백하게 보여준다.
실시예 6. CGG + 알루미늄에 대해 전흡착된 제I형 IFN로 면역된 마우스에서의 항체 반응
제I형 IFN의 반감기의 연장이 그의 아쥬반트로서 작용하는 능력을 가능하게 할 것인지를 결정하기 위해서, sc 주사 이전에 제I형 IFN-α/β(U)를 CGG (100 ㎍) 및 포화량의 알루미늄과 혼합하였다; 이러한 전략은 IL-12의 아쥬반트성을 크게 증대시킴을 보여주었다 (24). 인상적이게도, 알루미늄에 전흡착될 경우, 제I형 IFN의 단독 주사는 가용성 제I형 IFN의 3회 주사보다 CGG-특이적 항체 반응을 유사하거나 보다 큰 정도로 향상시켰다 (도 6).
알루미늄 전흡착의 증대 효과는 IgG2a 생성에 대해서 가장 현저하였다. 이러한 결과는 제I형 IFN의 존재를 연장시키는 것이 정말로 그의 아쥬반트 활성을 증가시키며, 제I형 IFN가 아쥬반트로서 실용적으로 사용될 수 있을 것임을 시사한다.
실시예 7. 제I형 IFN와 다른 아쥬반트간의 비교
제I형 IFN의 아쥬반트로서의 효율성을 추가로 평가하기 위해서, 본 발명자들은 이들의 일차 항체 반응을 향상시키는 능력을 시판되는 아쥬반트의 그것과 비교하였다. 처음의 비교는 두 가지 오일계 아쥬반트인 불완전 프로인트 아쥬반트 (Incomplete Freund's Adjuvant (IFA)) 및 티터맥스 (Titermax)로 수행하였다.
상기 아쥬반트를 CGG 100 ㎍을 함유하는 항체 용액과 1:1 부피/부피 비율로 혼합하고, 안정한 유탁액이 형성될 때까지 유화시켰다. 그런 다음, 마우스를 면역화하고, 항 CGG 항체가 있는지를 혈청 분석하였다. IFA 및 티터맥스가 보다 높은 정도의 IGG1 항체를 자극하였으나, 제I형 IFN는 IgM 및 IgG2b 항체를 유도하는 능력의 면에서 상기 아쥬반트와 동일하였으며, IgG2a 및 IgG3 항체의 생성을 증가시키는 면에서는 보다 우수하였다 (도 7).
보다 엄격한 아쥬반트 활성 시험으로서, 제I형 IFN를 완전 프로인트 아쥬반트 (Complete Freund's Adjuvant (CFA))와 비교하였다. CFA는 오래도록 마우스의 아쥬반트 활성에 대한 "금의 표준 (gold standard)"으로 여겨져왔고, 모든 이소타입 (iostype)의 항체의 생성을 향상시키는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 본 발명자들은 면역화한 후 제10일에, 대조군 (WT 129) 및 CGG 단독, CGG + CFA 또는 CGG + IFN-α/β로 주사된 IFN-IR KO 마우스에서의 CGG-특이적 항체 역가를 비교하였다 (도 8).
대조군의 마우스에서, CGG + IFN-α/β 또는 CGG + CFA로 주사된 마우스에서의 항체 역가는 CGG 단독으로 면역화된 것보다 높았다. 두드러지게, IFN-α/β의 아쥬반트 활성은 CFA의 그것으로 적합하게 비교하였다. 사실, CFA는 보다 높은 역가의 IgM 항체를 유도하였으나 (단지 129 배경 상에서), IFN-α/β는 유사한 역가의 IgG1 및 IgG2b 항체의 생성을 자극하였다. 더욱이, IFN-α/β은 CFA보다 높은수준의 IgG2a, 및 적어도 129sv 배경 상에서 IgG3 항체를 유도하였다. 따라서, 이러한 결과는 IFN-α/β이 정말로 강력한 아쥬반트 활성을 갖고 있음을 보여주었다.
상기 효과는 특히 비교되는 반응이, 급속하게 제거되는 경향이 있는 가용성 단백질 + 가용성 IFN-α/β에 대한 것, 및 오랜 시간 동안의 주사의 부위에 살아남을 수 있는 CFA의 오일성 유탁액에 대한 것일 경우 상당하다.
실시예 8. 내인성 제I형 IFN의 CFA의 아쥬반트 활성에서의, 그리고 단백질 단독에 대한 반응의 자극에서의 역할
CFA와 IFA 또는 티터맥스의 아쥬반트 활성 사이의 두드러진 차이는, 전자는 상당한 역가의 IgG2a 또는 IgG3 항체의 유도할 수 있었다는 것이다. 후자가 제I형 IFN과 성질이 공유된 것이기 때문에, CFA가 그렇게 할 가능성이 상기 아쥬반트에 의한 내인성 제I형 IFN의 유도와 관련된 것인지에 대한 의문이 제기되었다. 제I형 IFN이 유사하게 보이는 CFA에 의해 유도되었고, CFA의 중요한 구성요소가 열-치사 미코박테리아이며, CpG DNA와 같은 박테리아 성분은 제I형 IFN의 생성을 자극하는 것으로 공지되어 있다.
상기 가설을 시험하기 위해서, 본 발명자들은 IFN-α/β 및 CFA의 항체가 제I형 IFNR KO 마우스 대 대조군 마우스에서의 CGG에 대한 항체 반응을 증대시키는 능력을 비교하였다 (도 8). 예상한 대로, IFN-α/β은 완전히 제I형 IFNR KO 마우스에서 CGG에 대한 반응을 향상시킬 수 없었다. 중요하게도, CFA가 항체 반응을 촉진하는 능력은 또한 제I형 IFNR KO 마우스에서 매우 결핍되었다. CFA가 제I형 IFNR KO 마우스에서 여전히 높은 역가의 IgG1 항체를 유도하기는 하지만, CGG 단독으로 면역화된 것과 비교시에는 IgM, IgG2b, IgG2a 또는 IgG3의 어떠한 향상도 더이상 없었다. 이러한 결과는 CFA의 아쥬반트 활성에 있어서 제I형 IFN의 중요한 역할을 증명한다.
실시예 9. 장기 항체 생성의 유도 및 제I형 IFN에 의한 기억
제I형 IFN가 일차 항체 반응을 향상시킴을 보여줌에 따라, 이러한 반응이 장기적으로 지속되는지를 결정하는 것이 관심이 되었다. 최초로, 본 발명자들은 실시예 5에 기재된 것과 같이, CGG의 단독 주사, 또는 CGG + IFN-α/β의 3회 주사 6개월 후의 혈청을 분석함으로써, 장기 항체 생성에 대한 시험을 하였다 (도 9A). CGG 단독으로 주사된 마우스는 6개월 후 극도로 낮은 수준의 CGG-특이적 항체를 가졌다.
반대로, CGG + IFN-α/β가 주사된 마우스는 이들의 혈청에 여전히 상당한 역가의 CGG-특이적 항체의 가졌다. 매우 낮고 CGG 단독으로 주사된 마우스에서의 역가와 상당히 다른 IgG3을 제외하고는, 모든 시험된 이소타입의 항체들이 존재하였다. 따라서, 주사하는 동안 제I형 IFN의 주사는 장기 항체 생성을 가능하게 하였다.
장기 항체 생성이 장기간 사는 플라즈마 세포에 의해 유지되는지 또는 기억 B 세포로부터의 항체-생성 세포의 공급에 의해 유지되는지는 논쟁의 여지가 있다. 따라서, 기억이 또한 제I형 IFN의 존재 하에서의 면역화에 의해 유도되는지를 관찰하는 것이 관심이 되었다. 이렇게 하기 위해서, 본 발명자들은 6개월 일찍 주사된 마우스의 CGG에 대한 이차 반응을 증가시키는 능력을 시험하였다. 따라서, 6개월이전에 CGG 단독으로 또는 CGG + IFN-α/β의 3회 주사로 주사된 마우스를 CGG 단독 (100 ㎍)으로 재주사하였다. CGG에 대한 일차 반응으로부터의 기여를 최소화하기 위해서, 이차 반응을 투여 및 투여하지 않은 이후의 제6일에 연구하였고, 비주사된 마우스를 대조군으로 사용하였다. CGG-특이적 항체 역가를 CGG 재주사 이전과 이후에 동일한 마우스에서 비교하였다 (도 9B).
6개월 일찍 CGG 단독으로 주입된 마우스에서, CGG 투여에 대한 반응은 투여하지 않은 마우스와 구별할 수 없었고, 이는 CGG 단독으로 주사된 후 6개월에 CGG에 대한 기억이 없었음을 나타낸다. 그러나, 현저히 대조적으로, 6개월 이전에 CGG + IFN-α/β로 주사된 마우스는 CGG에 대한 급속한 이차 반응을 증가시켰다. 그러나, 상기 이차 반응은 높은 역가의 IgG1 항체가 상기 마우스에서 살아남았다는 사실에도 불구하고, IgG2b 및 IgG2a 항체에 제한되는 것으로 보인다. 이러한 결과는 제I형 IFN가 가용성 단백질 항원의 단독 투여 후에 장기간 남는 기억의 생성을 촉진하였음을 명백하게 보여주었다.
실시예 10. 항체 반응 및 이소타입 스위칭의 향상은 제I형 IFN에 의한 수상돌기 세포의 자극을 통해 유발된다.
제I형 IFN이 분명히 각종 IgG 아종에 대한 항체 반응 및 스위칭의 크기를 모두 현저하게 증대시킬 수 있었지만, 그들의 생체내 작용 메카니즘은 알려지지 않았다. 본 발명자들은, DC가 IFN-α/β에 반응할 수 있는 유일한 세포인 입양 전달 모델을 설계하였다. 이들 실험에서는 야생형 129 마우스 또는 제I형 IFNR KO 마우스로부터의 고도로 정제된 비장 DC 5-7 X 105을 CGG 100 ㎍과 함께 잠시동안 배양하고, IFN-α/β(105U)와 함께 또는 없이 제I형 IFNR KO 수령자에게 피하로 주사하였다. CGG + DC + IFN-α/β를 투여받은 마우스에게 전과 동일하게 IFN-α/β을 2회 더 주사하였다. 이어서, 면역화 10일 후에 CGG-특이성 항체 역가를 측정하였다 (도 10).
예상한 바대로, CGG + 제I형 IFNR KO DC를 투여 받은 마우스의 IFN-α/β처치는 항체 반응을 향상시키지 못했는데, 이는 이들 마우스에 있는 어떠한 세포도 제I형 IFN에 반응할 수 없었기 때문이다. 반대로, CGG + 야생형 DC를 투여 받은 마우스에게 IFN-α/β을 주사한 결과 CGG + 야생형 DC 단독을 주사한 경우와 비교해서 4가지 IgG 아종 모두에 있어서 항체 역가의 증가를 유도했다. 따라서, 제I형 IFN에 의한 DC의 자극은 동시 주사된 단백질에 대한 항체 반응을 향상시킬 뿐 아니라 이소타입 스위칭을 유도하기에 충분하다.
실시예 11. 제I형 IFN으로 아쥬반트화된 인플루엔자 백신으로 면역화된 마우스의 항체 반응.
본 발명자들은 15 ㎍의 정제된 아단위 인플루엔자 백신을 단독으로 또는 2x105U의 제I형 IFN과 함께 C57BL/6 (B6) 마우스에게 근육내 또는 비내로 주사하였다. 면역화 7일 또는 14일 후 혈청을 인플루엔자-특이성 항체의 존재 여부에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 제I형 IFN 동시-주사는 인플루엔자-특이성 항체 반응에 있어 복용량에 대해 크게 의존적인 아쥬반트 효과를 나타냈다 (도 11A). 도 11B는항원 주사 후 2일간의 연장된 제I형 IFN의 투여가 인플루엔자-특이성 항체 반응을 더 증가시켰음을 보여준다.
특히, IFN-아쥬반트화된 백신은 처치한 모든 마우스에 있어서 균일한 반응을 유도한 반면, 백신 단독은 반복적인 면역화 후에도 제한된 수의 마우스에서 (약 30%) 항체 반응을 유도하였다. 도 11C는 제I형 IFN을 여러 시간에, 즉 백신 투여 전에, 후에 또는 함께 투여하여 아쥬반트로 사용한 경우 차별적인 효과가 나타남을 보여준다. 최적의 아쥬반트 효과는 IFN을 백신과 동시 주사한 경우에 관찰되었다. 도 12a는 제I형 IFN-아쥬반트화된 백신의 비내 면역화가 인플루엔자 백신의 면역성을 높일 수 있음을 보여준다. 흥미롭게도, 인플루엔자 특이성 항체 이소타입의 분석 결과 전형적으로 Th-1형 면역 반응과 함께 IgG2a 항체 아종이 유도됨을 보여주었다. 특히, IFN-아쥬반트화된 백신은 백신 단독에 비해 바이러스 공격에 대해 보다 강한 보호 효과를 나타냈다 (도 12B).
실시예 12. 제I형 IFN은 인플루엔자 백신의 매우 강력한 점막 아쥬반트이다.
실험 제1 세트에서는, C57BL/6 마우스에게 인플루엔자 백신만을 또는 제I형 IFN과 함께 14일의 간격을 두고 비내로 2회 투여하여 면역화하고, 항체 수준을 각 면역 2주 후에 측정하였다 (도 14a). 항체 생성에서의 일반적인 증가 (특히 IgG2a)가 첫번째 면역화 후 IFN-처치된 동물에서 관측되었다. 두번째 면역화 2주 후에는, 백신만을 주사한 동물에 비해 IFN-처치된 마우스에 있어서 항체 역가가 더 증가하였다. 특히, 이 시점에서는 백신만을 주사한 마우스에 비해 IFN과 혼합된 백신으로 면역화한 동물에게서 IgG2A 및 IgA 역가의 상당한 증가 (각각 1,000배 및100배)가 관찰되었다. 아쥬반트로서 IFN으로 면역화된 마우스는 또한 대조용 동물에 비해 분비성인 폐의 IgA의 수준이 더 높게 나타났다. 흥미롭게도, 공격 후의 생존 수치 및 마우스 체중 감소 부족에 의해 드러나듯이, IFN-아쥬반트화된 백신을 비내로 투여받은 모든 마우스는 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 보호된 한편, 백신만으로 면역화된 동물에게 있어서는 부분적인 보호 효과만이 발견되었다 (도 14b). IFN-IR KO 및 대조용 C3H/HeN 마우스에서의 유사한 면역 실험에 있어서, 제I형 IFN이 MF59에 비해 두 시점 모두에서 대조용 동물에게서 IgG2a 및 IgA를 유도시키는데 탁월하다는 것이 증명된 한편, MF59는 2가지 면역화 후 IgG1 항체를 유도하는데 보다 효과적이었다 (도 14c, 하부). 예상한 바대로, 아쥬반트로 IFN을 사용하여 비내로 면역화한 IFN-IR KO 동물에서는 모든 Ig 아종에 대한 상당한 항체 반응이 관찰되지는 않았다. 반대로, MF59는 여전히 IFN-IR KO 마우스에게서 IgG1 항체를 유도할 수 있었지만, IgG2a 및 IgA의 유도는 대조용 동물에서 관측된 반응에 비해 크게 감소되었다 (도 14c).
실시예 13. 바이러스 공격 후의 마우스 생존 및 IgG 역가 증가는 엄밀하게는 관련성이 없다.
C57BL/6 마우스에게 앞서 기재한 바대로 FLU 백신의 근육내 (전신) 또는 비내 (점막) 단일 면역화로 백신을 접종하고, 14일 후 IgG 역가를 측정하였다.
도 15에서 명백한 바와 같이, 아쥬반트화된 백신의 1회 단일 투여가 공격받은 동물을 완전하게 보호하기에 충분하다는 것이 증명되었다.
또한, 바이러스 공격 후의 마우스의 생존은 IgG의 증가와는 엄밀히 관련성이없다. 사실, 아쥬반트가 없는 백신의 사용으로 IgG 역가는 상당히 증가하지만 생존율은 크게 증가하지 않는데, 바이러스 공격 후 약 10%의 마우스가 생존하였다.
한편, 백신과 조합된 제I형 IFN 아쥬반트의 효과는 백신만의 효과와 비교해서 IgG 역가는 적당히 증가시켰더라도 바이러스 공격 후의 마우스 생존율은 단일 면역화 처치 후라도 상당히 증가시켰다 (약 100%).

Claims (30)

  1. 생체내 보호 면역화 치료에서 백신에 대한 Th-1형 체액 면역 반응 향상용 무독성 아쥬반트 조성물의 제조를 위한, 백신 투여량 당 100.000 IU 이상의 투여량으로 사용되는 제I형 IFN의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 향상된 체액 면역 반응이 IgG1 및(또는) IgG2a 및(또는) IgG2b 및(또는) IgG3 및(또는) IgA 및(또는) IgM 생산의 선택적 유도를 수반하는 것인 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보호 면역화 치료가 피하, 근육내 또는 피내 주사, 또는 경구 또는 점막 투여를 통해 수행되는 것인 용도.
  4. 제3항에 있어서, 점막 투여가 비내 또는 경구 투여이고, 국부 및(또는) 전신 보호 면역화를 유발하는 것인 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 및 백신이 상기 아쥬반트 및 백신의 투여 부위에의 동시 전달을 위해 제제화되는 것인 용도.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내 보호가 1회의 단일 면역화 이후에 달성되는 것인 용도.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내 보호가 먼저 백신 및 아쥬반트 조성물을 동시에 투여한 다음, 백신 주사 후 제1일 또는 제1일과 제2일에 아쥬반트 조성물의 추가 투여량을 투여할 때 달성되는 것인 용도.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제I형 IFN이 천연 IFN-α, 합성 재조합 제I형 IFN, 재조합 IFN-α 아형, IFN-β, IFN-ω, 또는 제I형 IFN의 하나 이상의 구성원을 코딩하는 핵산 서열인 용도.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제I형 IFN이 페길화 제I형 IFN 아형인 용도.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제I형 IFN 투여량이 1 ×106내지 6 ×106IU 범위내인 용도.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제I형 IFN이 수상돌기 세포를 표적화할 수 있는 모노클로날 항체와 융합된 재조합 제I형 IFN인 용도.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신이 감염제 또는 다른공급원으로부터의 1종 이상의 항원을 포함하는 것인 용도.
  13. 제12항에 있어서, 상기 백신이 종양으로부터의 1종 이상의 항원을 포함하는 것인 용도.
  14. 제11항 또는 제13항에 있어서, 상기 항원이 1 내지 1000 ㎍의 양으로 존재하는 용도.
  15. 제14항에 있어서, 상기 항원이 10 내지 200 ㎍의 양으로 존재하는 용도.
  16. 항원과 아쥬반트 둘 다를 제어 방출 및 지속 방출시키기 위해 아쥬반트로서 제I형 IFN을 백신 투여량 당 100,000 IU 이상의 투여량으로 포함하는 백신.
  17. 제16항에 있어서, 피하, 근육내 또는 피내 주사, 또는 경구 또는 점막 투여용 백신.
  18. 제17항에 있어서, 점막 투여가 비내 또는 경구 투여인 백신.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제I형 IFN이 천연 IFN-α, 합성 재조합 제I형 IFN, 재조합 IFN-α 아형, IFN-β, IFN-ω, 또는 제I형 IFN의 하나 이상의 구성원을 코딩하는 핵산 서열인 백신.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제I형 IFN이 페길화 제I형 IFN 아형인 백신.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제I형 IFN 투여량이 1 ×106내지 6 ×106IU 범위내인 백신.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제I형 IFN이 수상돌기 세포를 표적화할 수 있는 모노클로날 항체와 융합된 재조합 제I형 IFN인 백신.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신이 감염제 또는 다른 공급원으로부터의 1종 이상의 항원을 포함하는 것인 백신.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신이 종양으로부터의 1종 이상의 항원을 포함하는 것인 백신.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 1 내지 1000 ㎍의 양으로 존재하는 백신.
  26. 제25항에 있어서, 상기 양이 10 내지 200 ㎍인 백신.
  27. 제16항 또는 제26항에 있어서, 제I형 IFN 투여량이 1 ×106내지 6 ×106IU 범위내인 백신.
  28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 알루미늄 염을 추가로 포함하는 백신.
  29. 항원의 존재와 관련된 질환의 예방 또는 치료에 개별적으로, 동시에 또는 연속적으로 사용하기 위한,
    제I형 IFN을 100.000 IU 이상의 투여량으로 포함하는 무독성 아쥬반트 조성물; 및
    1종 이상의 항원, 및 제약상 허용가능한 담체, 비히클 또는 보조제를 포함하는 백신
    을 포함하는 부분들의 키트.
  30. 백신 투여량 당 100.000 IU 이상의 투여량의 제I형 IFN와 함께 항원을 제어 방출 및 지속 방출 조성물로 제제화시키는 단계를 포함하는, 제16항 내지 제28항중 어느 한 항에 따른 백신의 제조 방법.
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