KR20190122717A - 면역 증강제, 면역치료 약학적 조성물 및 이의 제조 및 용도 - Google Patents

면역 증강제, 면역치료 약학적 조성물 및 이의 제조 및 용도 Download PDF

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간 쟈오
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Abstract

본 발명은 적어도 인터페론 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자를 포함하는 면역 증강제, 및 적어도 항원 및 상기 면역 증강제를 포함하는 면역치료 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 면역치료 약학적 조성물의 제조 방법, 면역 증강제 및 면역치료 약학적 조성물의 용도를 추가로 개시한다. 면역 증강제는 바이러스, 박테리아 및 다른 미생물에 의해 야기되는 질환 및 종양 치료에 적용될 수 있다.

Description

면역 증강제, 면역치료 약학적 조성물 및 이의 제조 및 용도
본 발명은 생의약의 분야, 특히 면역 증강제, 면역치료 약학적 조성물 및 이의 제조 및 용도에 관한 것이다.
영양 상태, 건강 상태 및 의료 수준이 크게 개선되면서, 기대 수명은 꾸준히 증가하였다. 그러나, B형 간염, AIDS 및 결핵과 같은 주요 전염병뿐만 아니라 다른 병원성 미생물 및 종양에 의해 유발된 지속적인 전염병은 공중 보건을 위협하는 주요 문제가 되었다. B형 간염, AIDS 및 HPV, 결핵은 세계에서 주요 전염병이다. 2008년 중국 보건부의 통계 보고서에 따르면, 중국에는 B형 간염 바이러스에 감염된 9천3백만 명이 있었고, 이는 전 세계의 3분의 1을 차지한다. 이 환자들 중 일부는 결여된 효과적인 임상 치료가 필요하였다. 중국의 에이즈 사망자 수는 급격히 증가하여 4년 연속 전염병 사망자를 차지하였다. HIV 감염은 고위험 집단에서 일반 집단으로 퍼지는 경향을 나타내었다. 결핵 치료에서 다중 약물 저항 및 광범위한 약물 저항은 더욱 심각한 문제가 되고 있다. 중국의 결핵 저항률은 28%까지 상승하고 있다. HPV 감염은 2000년 이후로 이용 가능한 HPV 백신이 있다는 사실을 무시하고 다른 심각한 공중 보건 문제이다. 또한, 환자에게 반복적으로 발병할 뿐 아니라 또한 내성 염색의 뿌리를 나타내는 만성 요로 감염, 폐 감염과 같은 여러 면역성 만성 박테리아 감염이 존재한다.
미국 국립 암 통계 센터(National Cancer Statistics Center)의 자료에 따르면, 2014년 미국에서 암 사망자 수는 50만 명 이상으로 2위를 차지했으며, 2009년 중국에서는 657만 명이었고 이는 그 해의 전체 사망자 수의 26%를 차지하였다. 암 발병률은 젊은 세대에서 크게 증가하였다. 중국에서 간암 발병률은 27/100000이며, 이 중 90%는 B형 간염 바이러스에 의한 지속적인 감염과 관련이 있다.
따라서, 지속적인 감염과 종양으로 인해 경제적 및 사회적 부담이 급격히 증가하여, 공중 보건에 큰 위협이 되었다.
그중, B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 공중 보건을 심각하게 위협하는 심각한 전염병이다. 전 세계에서 약 20억 명의 사람들이 HBV에 감염되었으며, 그 중 약 2억4천만명이 만성적으로 감염되고 매년 HBV 감염으로 인한 간부전, 간경변 및 간암으로 약 650,000명이 사망한다. 약 9천3백만 명이 중국에서 만성적으로 HBV에 감염되며 그 중 약 2천만 명이 만성 B형 간염(CHB) 환자이다. HBV 복제의 지속 가능하고 효과적인 억제 및 B형 간염 e 항원(HBeAg)의 혈청 전환은 CHB의 임상 치료를 위한 만족스러운 종점으로 간주되었다.
B형 간염 항원(HBsAg) 소실 및 HBsAg 혈청 전환은 B형 간염의 임상 치료 동안 임상 치료로 간주된다. 따라서, HBsAg의 혈청 전환을 갖는 CHB 환자에서 임상 치료를 달성하는 것이 CHB를 치료하는 임의의 접근법의 목표이다. 그러나, HBsAg 혈청 전환률은 자연적으로 연간 1-2%이다. 이중 맹검, 무작위 대조 임상 코호트 연구에서, HBsAg 소실은 1년 동안 테노포비르 다이피복실로 치료된 HBeAg-양성 CHB 환자 중 3%에서만 달성되었다. 다른 무작위 대조 임상 연구에서, HBsAg 소실은 3-4년 동안 PEG화-인터페론-알파로 순차적으로 엔테카비르로 치료된 HBeAg-양성 CHB 환자 8.5%에서 달성되었다. 치료 종료 후 3년 후 후속 조치로, 1년 동안 HBeAg-음성 CHB 환자에 대한 PEG화-인터페론-알파의 또 다른 무작위 조절된 시험은 환자의 8.7%의 HBsAg가 제거된 것으로 밝혀졌다. 이들 데이터는 CHB 환자에서 HBsAg의 제거가 가장 어려운 과제로 남아 있음을 보여 주었다. 따라서, 새로운 약물을 개발하고 B형 간염 만성 감염에 대한 치료를 통해 HBV를 치료할 시급한 필요성이 있다(WHO에서 요청).
B형 간염이 현재 치료될 수 없는 주된 이유는 환자의 HBV-특이적 세포 면역 기능의 상실 또는 실패로 인한 CHB 환자의 면역 내성이다. B형 간염 치료 백신은 B 형 간염 치료를 위한 새로운 접근법이며, HBV 감염 환자의 면역 내성을 깨고, 환자를 리모델링 또는 자극하여 HBV에 대한 중화 항체 및 세포 반응을 생성하는 것을 목표로 한다. 현재, 효능을 평가하기 위한 임상 연구하에 DNA 기반 백신, DC 기반 백신, 유전자 조작 단백질 기반 백신 및 항원-항체 복합체가 있다. 명백히, 상기 치료 백신에는 일부 예측 가능한 문제가 있다. 예를 들어, 나쁜 면역원성은 DNA 백신과 관련이 있다. DN 백신을 제조하는 데 품질 관리 문제 및 높은 비용과 함께 기술적인 어려움이 있는데, 이는 환자 내부로 되돌려 보내지는 생체외 로딩된 항원을 필요로 하기 때문이다. 숙주 세포 반응을 자극하는 낮은 능력은 기존의 임상 결과에 기초하여 재조합 단백질 백신과 관련되었다. 이러한 모든 단점은 CHB 치료에 대한 임상적 이점을 달성하는 데 필요한 면역 내성을 파괴하지 못할 수 있다.
따라서, 면역 내성을 깨고 지속적인 미생물 감염뿐만 아니라 종양에 대해서도 효과적으로 질병을 치료할 수 있는 면역 치료 백신을 개발할 필요가 시급하다.
전통적인 백신은 약독화되고 불활성화 병원성 유기체(박테리아, 바이러스 등) 또는 유전자 조작 항원 구성 요소에 의해 제조된 생물학적 제품을 의미한다. 현대 백신은 유전자 조작 항원 구성 요소와 더 관련이 있다. 예방 접종은 감염성 병원체의 확산으로부터 개인을 보호할 뿐만 아니라 집단 내 감염성 병원체의 확산을 제한한다. 예방 접종의 메커니즘은 숙주 면역계의 활성화 및 궁극적으로 해당 병원체에 대한 반응으로 특정 면역 기억의 생성을 통해 동일한 병원체를 발견한 후 신속하게 병원균을 제거하여 장기 예방을 달성하는 것이다. 치료 백신은 예방 백신과 동일한 장기 효능을 가진다. 건강한 인간 대상에 사용되는 예방 백신과 달리, 치료 백신은 질환을 치료하기 위해 숙주 면역계를 재활성화 또는 복구함으로써 환자의 조직에 이미 감염되어 숨겨져 있는 병원체를 표적으로 한다. 현재, 치료 백신에 대한 연구는 주로 악성 종양뿐만 아니라 지속적인 전염병과 같은 효과적인 치료법이 없는 주요 만성 질환에 중점을 둔다. 위에서 논의한 바와 같이, 이들 질환은 중국에서 환자 수가 매우 많다. 이런 만성 질환 및 악성 종양에 대한 치료 백신의 개발을 개선하면 소분자 약물과 관련된 부작용을 해결할 수 있을 뿐만 아니라 부작용이 현저하게 적고 효능이 길며 특이성이 좋을 수 있다.
치료 백신 개발은 종종 강력한 항원보강제가 필요하기 때문에 치료 백신은 항원보강제의 역할에서 점점 더 분리될 수 없게 된다. 특히, 재조합 단백질 항원에 기초한 치료 백신이 원하는 면역치료 효능을 달성하기 위해서 항원보강제가 필요하다. 항원보강제는 면역 내성을 파괴하고, 보호 기간을 연장하며, 특정 유형의 면역 반응을 유도함으로써 치료 백신이 병원체에 대한 적응성 면역 반응을 향상시키는 것을 돕는 약제이다. 그러나, 이런 목적으로 항원보강제의 사용 또는 개발에 많은 어려움이 있다. 어려움의 일부는 항원보강제의 부작용, 항원보강제의 효과 및 항원보강제 용량에 대한 항원의 면역 반응을 효과적으로 증가시키는 방법에 관한 문제를 포함한다. 따라서, 어려움 중 하나는 원하는 효과를 달성하기 위해 어떻게 "올바른" 항원보강제를 선택하는 방법이다.
본 기술의 단점을 고려하여, 본 발명은 면역 증강제 및 면역치료 약학적 조성물을 제공하고, 면역치료 약학적 조성물을 제조하는 방법, 및 면역 증강제 및 관련 면역치료 약물의 사용을 개시한다. 본 발명의 특정 기술 솔루션은 다음과 같다:
한 양태에서, 본 발명은 적어도 재조합 인터페론-알파(rIFN-α) 및 재조합 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(rGM-CSF)를 포함하는 면역 증강제를 제공한다.
바람직하게는, 상기 면역 증강제에서, rIFN-α의 함량 대 rGM-CSF의 함량의 중량비는 투여량당 (0.1 x 104 IU - 5 x 106 IU):(1μg-200μg)의 범위이다.
더욱 바람직하게는, rIFN-α의 함량 대 rGM-CSF의 함량의 비는 투여량당 (0.5 x 104 IU - 1 x 105 IU):(5μg - 150μg)의 범위이다.
더욱 바람직하게는, rIFN-α의 함량 대 rGM-CSF의 함량의 비는 투여량당 (0.5 x 104 IU - 5 x 104 IU):(5μg - 50μg)의 범위이다.
가장 바람직하게는, rIFN-α 함량 대 rGM-CSF 함량의 비는 투여량당 1 x 104 IU:10μg의 범위이다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 면역 증강제에서 rGM-CSF의 함량은 투여량당 약 1μg 내지 약 100μg의 범위이고, 바람직하게는 투여량당 약 5μg 내지 약 50μg의 범위이고, 보다 바람직하게는 투여량당 약 5μg 내지 약 20μg의 범위이고, 가장 바람직하게는 투여량당 약 10μg이다.
다른 바람직한 실시태양에서, 상기 면역 증강제에서 rIFN-α의 함량은 투여량당 1 x 103 IU - 9 x 106 IU의 범위, 바람직하게는 투여량당 5 x 103 IU - 5 x 105 IU, 보다 바람직하게는 투여량당 8 x 103 IU - 2 x 105 IU 범위, 가장 바람직하게는 투여량당 1 x 104 IU와 같은 약 0.5 x 104 IU - 1 x 105 IU 범위이다.
다른 바람직한 실시태양에서, 상기 면역 증강제는 수산화 알루미늄 및/또는 인산 알루미늄과 같은 알루미늄 항원보강제를 더 포함할 수 있다.
한 실시예에서, 알루미늄 항원보강제의 양은 투여량당 약 0.5mg - 약 10mg의 범위이고; 바람직하게는 투여량당 약 1mg - 약 3mg의 범위이고; 보다 바람직하게는 투여량당 약 1.25mg - 약 2.5mg의 범위이다. 다른 실시예에서, 알루미늄 항원보강제의 양은 투여량당 약 0.1mg - 약 3mg의 범위이고; 바람직하게는 투여량당 약 0.8 mg - 약 2 mg의 범위이고; 가장 바람직하게는 투여량당 약 1.25mg이다. 또 다른 실시예에서, 알루미늄 항원보강제의 양은 투여량당 약 0.01mg - 약 3mg의 범위이고; 바람직하게는 투여량당 약 0.05mg - 약 2mg의 범위이고; 가장 바람직하게는 투여량당 약 0.125mg과 같은 약 0.1mg - 약 0.5mg의 범위이다.
한 실시예에서, 알루미늄 항원보강제 대 rGM-CSF의 중량비는 투여량당 (약 0.01mg 내지 약 1mg):(약 1μg 내지 약 200μg)의 범위이고; 바람직하게는 투여량당 (약 0.05mg 내지 약 0.5mg):(약 5μg 내지 약 150μg)의 범위이고; 더욱 바람직하게는, 비는 투여량당 (약 0.1mg 내지 약 0.25mg):(약 5㎍ 내지 약 50㎍)의 범위이고; 가장 바람직하게는, 중량비는 투여량당 약 0.125 mg:약 10μg이다. 다른 실시예에서, 알루미늄 항원보강제 대 rGM-CSF의 중량비는 투여량당 (약 0.1mg 내지 약 10mg):(약 1μg 내지 약 300μg)의 범위이고; 바람직하게는 투여량당 (약 0.5mg 내지 약 5mg):(약 2μg 내지 약 200μg)의 범위이고; 보다 바람직하게는 중량비는 투여량당 (약 1.5mg 내지 약 3mg):(약 5μg 내지 약 100μg)의 범위이고; 가장 바람직하게는, 중량비는 투여량당 (약 1mg 내지 약 2mg):(약 10μg 내지 약 75μg)의 범위이다.
바람직하게는, 상기 인터페론은 인터페론 알파(IFN-α)이다.
보다 바람직하게는, 상기 인터페론은 rIFN-α-2a이다.
다른 양태에서, 본 발명은 적어도 항원 및 상기 면역 증강제를 포함하는 면역치료 약학적 조성물을 제공한다.
한 실시태양에서, 면역치료 약학적 조성물에서 rIFN-α는 인터페론 알파 -2a이다.
다른 실시태양에서, 면역치료 약학적 조성물에서 항원은 단백질 항원을 포함한다.
바람직하게는, 단백질 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 기생 항원 및 종양 항원 중 적어도 하나이다.
보다 바람직하게는, 상기 바이러스 항원은 HBV 항원, 헤르페스 바이러스 항원, HPV 항원, HIV 항원, 메르켈 세포 바이러스, 인플루엔자 바이러스 항원 및 RSV 항원 중 적어도 하나를 포함한다.
다른 실시태양에서, 상기 단백질 항원은 불활성화 백신 항원, 약독화 백신 항원 또는 서브유닛 백신 항원이다.
다른 실시태양에서, 단백질 항원은 유전자 조작 백신 항원이다. 한 실시태양에서, 상기 면역치료 약학적 조성물은 약학적으로 또는 면역학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제 중 적어도 하나를 더 포함한다.
상기 면역치료 약학적 조성물에서, rIFN-α의 함량 대 rGM-CSF의 함량의 비는 투여량당 (약 0.5 x 104 IU 내지 약 1.5 x 104 IU):(약 5μg 내지 약 20μg)의 범위이고; 바람직하게는 상기 비는 투여량당 약 1 x 104 IU:약 10μg이다.
상기 면역치료 약학적 조성물에서, rGM-CSF의 함량은 투여량당 약 1μg 내지 약 200μg의 범위이고; 바람직하게는 투여량당 약 5μg 내지 약 50μg의 범위이고; 보다 바람직하게는 투여량당 약 5μg 내지 약 20μg의 범위이고; 가장 바람직하게는 투여량당 약 10μg의 범위이다.
상기 면역치료 약학적 조성물에서, rIFN-α의 함량은 투여량당 약 1 x 103 IU 내지 약 9 x 105 IU의 범위이고; 바람직하게는 투여량당 약 5 x 103 IU 내지 약 1 x 105 IU의 범위이고; 보다 바람직하게는 투여량당 약 8 x 103 IU 내지 약 5 x 104 IU의 범위이고; 가장 바람직하게는 투여량당 약 1 x 104 IU과 같은 약 1 x 104 내지 약 2 x 104 IU의 범위이다.
상기 면역치료 약학적 조성물에서, 항원 대 rGM-CSF의 함량비는 투여량당 (약 0.1μg 내지 약 10μg):(약 1μg 내지 약 100μg)의 범위이고; 바람직하게는 투여량당 (약 0.5μg 내지 약 5μg):(약 5μg 내지 약 50μg)의 범위이고; 보다 바람직하게는 투여량당 (약 1μg 내지 약 5μg):(약 5μg 내지 약 25μg)의 범위이고; 가장 바람직하게는 투여량당 약 1μg:약 10μg의 범위이다.
다른 양태에서, 본 발명은 항원을 rIFN-α 및 rGM-CSF와 혼합하여 혼합물을 형성한 후, 혼합물에 약학적으로 또는 면역학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 첨가하여 상기 면역치료 약학적 조성물을 생산하는 단계를 포함하여 면역치료 약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
한 실시태양에서, rGM-CSF, rIFN-α 및 항원은 4-10℃, 바람직하게는 4℃에서 혼합된다.
다른 양태에서, 본 발명은 면역화될 대상에 대한 항원의 투여 또는 항원 및 면역 증강제의 공동 투여 전에 안전하고 유효한 양의 상기 면역 증강제를 투여하는 것을 포함하여 상기 면역 증강제의 용도를 제공한다.
바람직하게는, 상기 투여는 적어도 점막 투여 또는 주사 투여, 보다 바람직하게는 국소 주사 투여를 포함한다.
바람직하게는, 상기한 바와 같이 면역화될 대상은 인간 또는 비인간 포유동물을 포함하는 포유동물이다. 비인간 포유동물은 설치류, 토끼, 고양이, 개, 돼지 및 소와 같은 설치류를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 면역치료 약물의 제조에서의 면역치료 약학적 조성물의 용도를 제공하며, 상기 용도는:
(1) 단핵구 생산을 촉진하는 단계;
(2) 단핵구 CCR2의 발현을 촉진하는 단계;
(3) 표현형 CD11b+ CD11c+ DC를 사용하여 Ly6ChiCCR2+ 단핵구의 DC로의 분화를 촉진하는 단계;
(4) 대상의 세포 면역 및 CTL 세포 용해 기능을 개선하는 단계; 및
(5) 대상의 체액 면역성 및 하나 또는 여러 개의 보호 항체의 생산을 촉진하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 용도는 하나 이상의 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염 및/또는 종양의 예방 또는 치료를 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 바이러스 감염은 HBV 감염, 헤르페스 바이러스 감염, HPV 감염, HIV 감염, 메르켈 세포 바이러스(예를 들어, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(MCV 또는 MCPyV)) 관련 감염, 인플루엔자 바이러스 감염 및 RSV 감염 중 하나 이상을 포함한다.
한 바람직한 실시태양에서, 바이러스 감염은 만성 B형 간염이다.
다른 바람직한 실시태양에서, 항원이 간염 표면 항원인 경우, 면역치료 약학적 조성물은 면역 내성을 파괴하고, 감염된 간세포를 제거하고, HBeAg 및 HBsAg를 모두 제거하고, 항-HBs Ab를 생산할 수 있다.
다른 바람직한 실시태양에서, 항원이 간염 표면 항원을 갖는 preS1인 경우, 면역치료 약학적 조성물은 면역 내성을 파괴하고, 감염된 간세포를 제거하고, HBeAg 및 HBsAg를 모두 제거하고, 항-HBs Ab를 생산할 수 있다.
다른 바람직한 실시태양에서, 항원이 종양 항원인 경우, 면역치료 약학적 조성물은 효과적인 항-종양 면역 반응을 유도한다.
다른 바람직한 실시태양에서, 상기 종양 항원은 전립선암 에피토프 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 유방암 에피토프 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 결장 직장암 에피토프 폴리펩타이드, 자궁 경부암 에피토프 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 간암 에피토프 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 다발성 골수종 에피토프 펩타이드 및 신장 세포 암종 에피토프 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 바람직한 실시태양에서, 항원이 연쇄상 구균 항원인 경우, 면역치료 약학적 조성물은 항균성 감염을 일으키는 면역 반응을 유도한다.
다른 바람직한 실시태양에서, 연쇄상 구균 항원은 연쇄상 구균 타입 A 에피토프 펩타이드 또는 폴리펩타이드 중 하나이다.
다른 바람직한 실시태양에서, 항원이 HIV 항원인 경우, 면역치료 약학적 조성물은 HIV 감염에 대한 면역 반응을 유도한다.
다른 바람직한 실시태양에서, HIV 항원은 HIV 에피토프 펩타이드 또는 폴리펩타이드 중 하나이다.
바람직하게는, 상기 용도는 본 발명에 논의된 바와 같이 안전하고 치료학적 유효량의 면역치료 약학적 조성물을 면역화될 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 면역화될 대상은 인간 또는 비인간 포유동물을 포함하는 포유동물이다. 비인간 포유동물은 설치류, 토끼, 고양이, 개, 돼지 및 소를 포함한다.
현재 존재하는 기술과 비교하여, 면역 증강제의 조성물 및 본 발명의 관련 방법 및 용도는 다음과 같은 장점을 갖는다:
(1) 본 발명은 면역 기능을 현저하게 개선하고, 항원 제시의 효율을 향상시키고, 면역 내성을 효과적으로 차단하고 효과적인 면역 활성화 및 반응을 확립하고 강력한 항체 및 세포 면역 반응을 일으킬 수 있는 면역 증강제로서 최적의 비로 rGM-CSF 및 rIFN-α를 포함하는 혼합물을 사용한다;
(2) 기술된 바와 같이 최적의 비로 rGM-CSF 및 rIFN-α를 포함하는 면역 증강제는 체액성 및 세포성 면역을 효과적으로 활성화시키고 면역 효능을 현저하게 향상시킬 수 있다;
(3) 면역 증강제 및 B형 간염 표면 항원의 혼합물 또는 조합은 B형 감염 동물 모델에서 면역 내성을 성공적으로 파괴하는 데 사용될 수 있고 HBsAg는 이의 항-HB 항체를 동반하여 제거될 수 있다;
(4) 면역 증강제 및 종양 항원의 혼합물 또는 조합은 항-종양 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있다.
(5) 면역 증강제 및 연쇄상 구균 항원의 혼합물 또는 조합은 항균성 감염을 일으키는 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있다;
(6) 면역 증강제 및 HIV 항원의 혼합물 또는 조합은 항-HIV 감염을 일으키는 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있다;
(7) 면역 증강제는 사용하기 쉽고 저렴하고 부 반응이 적으며 부작용이 적다.
본 발명의 범위 내에서, 상기 본 발명의 각각의 기술적 특징 및 이하에서 (실시예로서) 기술된 다양한 기술적 특징이 서로 조합되어 새로운 또는 바람직한 기술적 해결책을 형성할 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명에 개시된 원리를 벗어나지 않는 임의의 균등물 또는 변형은 본 발명의 보호 범위에 속한다.
본 발명은 본 발명의 목적, 기술적 특징 및 기술적 효과를 완전히 설명하기 위해 도면과 함께 추가로 설명될 것이다. 본 발명의 상기 및 다른 양태 및 장점은 다음의 설명으로부터 나타날 것이다. 설명에서, 본 발명의 일부를 형성하고 본 발명의 바람직한 실시예가 예로서 도시된 첨부 도면을 참조한다. 이런 실시태양은 본 발명의 전체 범위를 반드시 나타내는 것은 아니며, 따라서 본 발명의 범위를 해석하기 위해 청구범위 및 명세서를 참조한다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 면역치료 약학적 조성물 치료의 사용에 의한 상이한 비 및 조합의 효과를 나타내는 그래프 및 이미지 세트이다. C57BL/6 마우스는 각각 100IU, 1,000IU, 10,000IU IFN-α 및 1ug HBV 백신과 10μg, 20μg, 30μg GM-CSF 조합으로 면역화시켰다. 도 1a: 면역화 후 3일에 말초 혈액 CD11b+ CD11c+ DC 비. 면역화 후 21일에, 10μg의 HBsAg가 마우스의 왼쪽 풋패드에 주사되었고 PBS는 대조군으로서 오른쪽 풋패드에 주사되었다. 풋패드의 팽창은 주사 후 각각 24시간, 48시간 및 72시간에 측정되었다. 도 1b: 24시간 DTH의 통계 결과. 도 1c: 면역 21일 후 말초 혈액을 수집하고, 혈청을 분리하고, 항-HBsAg 수준을 ELISA로 측정하였다. 결과는 평균±SEM으로 표현되며, *는 P<0.05를 나타내고; **는 P<0.01을 나타내고; ***는 P <0.001을 나타낸다.
도 2는 면역치료 약학적 조성물 치료의 사용에 의한 상이한 비 및 조합의 효과를 나타내는 그래프 및 이미지의 세트이다. C57BL/6 마우스는 각각 1000IU, 10000IU, 100000IU IFN-α 및 1ug HBV 백신과 5μg, 10μg, 20μg GM-CSF 조합으로 면역화되었다. 도 2a: 면역화 후 3일에 말초 혈액 CD11b+ CD11c+ DC 비. 면역화 후 21일에, 10μg의 HBsAg가 마우스의 왼쪽 풋패드에 주사되었고 PBS를 대조군으로서 오른쪽 풋패드에 주사되었다. 풋패드의 팽창은 주사 후 각각 24시간, 48시간 및 72시간에 측정되었다. 도 2b: 24시간 DTH의 통계 결과. 도 2c: 면역화 후 21일에 말초 혈액을 수집하고, 혈청을 분리하고, 항-HBsAg 수준을 ELISA로 측정하였다. 결과는 평균±SEM으로 표현되며, *는 P<0.05를 나타내고; **는 P <0.01을 나타낸다.
도 3은 말초 혈액 및 림프절에서 CD11b+ CD11c+ DC의 변화를 보여주는 그래프 세트이며 두 종류의 사전 혼합 계획에서 항-HBsAg 수준을 비교하였다. 도 3a: 면역화 후 3일에 말초 혈액에서 CD11b+ CD11c+ DC의 비. 도 3b: 면역화 후 3일에 마우스 림프절에서 CD11b+ CD11c+ DC의 비. 도 3c: 21일 동안 혈청 중 항-HBsAg 수준. 결과는 평균±SEM, P> 0.05에 대해 ns로 표현되고; *P <0.05인 경우; **P <0.01의 경우.
도 4는 본 발명의 특정 실시태양에 따라 상이한 면역치료 약학적 조성물로 면역화된 야생형 마우스의 DTH 결과를 나타내는 그래프 및 이미지의 세트이다: 도 4a: 이 실험에서 상이한 실험 그룹에 대한 면역화 전략. 도 4b: 제 2 면역화 후 7일에, 10μg의 HBsAg 항원은 마우스의 왼쪽 풋패드에 주사되었고, PBS는 음성 대조군으로서 오른쪽 풋패드에 주사되었다. 24시간 후, 풋패드의 팽창이 관찰되었다. 도 4c: 마우스 풋패드에 HBsAg 항원 주사 후 24시간, 48시간, 72시간에서의 팽윤도. ns(P> 0.05)는 통계적 차이를 나타내지 않았고, *(P <0.05)는 통계적 차이를 나타내었고 **(P <0.01)는 유의한 통계적 차이를 나타내었다.
도 5는 본 발명의 특정 실시태양에 따라 야생형 마우스에 의해 생성된 HBsAg-특이적 HBsAb, IgG1, IgG2a의 농도를 나타내는 그래프 세트이다: 도 5a: 상이한 면역치료 약학적 조성물에 의한 면역 후 ELISA에 의해 측정된 HBsAb 농도의 결과. 도 5b: 제 2 면역화 후 7일에, 상이한 면역화된 그룹에서의 HBsAg-특이적 IgG1 및 IgG2a 농도가 ELISA에 의해 검출되었다. 도 5c: 제 2 면역화 후 7일에, HBsAg-특이적 IgG2a 대 IgG1의 비가 ELISA에 의해 검출되었다. ns(P> 0.05)는 통계적 차이가 없음을 나타내고 **(P <0.01)은 유의한 통계적 차이를 나타내었다.
도 6은 본 발명의 특정 실시태양에 따라 상이한 면역치료 약학적 조성물로 면역화된 야생형 마우스로부터의 T 림프구의 사이토카인 분비 결과를 나타내는 그래프의 세트이다: 제 2 면역화 후 7일에, 비장 세포를 채취하고 18시간 동안 HBsAg(10μg/L)으로 자극하고 6시간 동안 BFA에 의해 최종적으로 차단되었다. IFN-γ(도 3a), IL4(도 3b), IL17A(도 3c)를 분비하는 CD4+ T 세포 및 IFN-γ(D)를 분비하는 CD8+ T 세포를 검출하기 위해 유동 세포 측정법을 사용하였다. ns(P> 0.05)는 통계적 차이를 나타내지 않았고, *(P <0.05)는 통계적 차이를 나타내었고 **(P <0.01)는 유의한 통계적 차이를 나타내었다.
도 7은 본 발명의 특정 실시태양에 따라 상이한 면역치료 약학적 조성물로 면역화된 야생형 마우스로부터의 T 림프구의 증식을 나타내는 그래프 세트이다: 제 2 면역화 후 7일에, 비장 세포를 1μM CFSE로 염색하고 72시간 동안 HBsAg로 자극 하였다(10μg/mL). CD4+ T 세포(도 4a) 및 CD8+ T 세포(도 4b)의 증식을 검출하기 위해 유세포 분석을 사용하였다. ns(P> 0.05)는 통계적 차이를 나타내지 않았고, *(P <0.05)는 통계적 차이를 나타내었고 **(P <0.01)는 유의한 통계적 차이를 나타내었다.
도 8은 본 발명의 특정 실시태양에 따른 상이한 면역치료 약학적 조성물을 갖는 면역화된 야생형 마우스의 생체외 CTL 결과를 나타내는 그래프 세트이다: 면역화 후, 비장 세포를 단리하고 비 관련 항원 세포로서 HBV CTL 폴리펩타이드 S208-215(10μg/mL)로 3일 동안 배양하였다. OVA CTL 펩타이드 OVA257 -264(10μg/mL)를 무-관련 항원 세포로 사용되었다. 야생형 마우스 비장 세포를 37℃에서 1시간 동안 HBV CTL 펩타이드(10μg/mL)와 배양하고 수집 후 표적 세포로서 CFSE로 염색되었다. 이펙터 세포: 표적 세포 = 20:1을 혼합하고 6시간 동안 배양하고, PI 15분으로 염색하였고, 표적 세포의 CTL 세포 사멸을 유세포 분석법에 의해 검출하였다. 도 8a: 유세포 분석 데이터 분석 전략. 도 8b: 상이한 면역화 그룹에 대한 CTL 유세포 분석 결과. 도 8c: 상이한 HBV-특이적 면역 그룹의 CTL 사멸률 통계 결과. ns(P> 0.05)는 통계적 차이가 없음을 나타내고 **(P <0.01)는 유의한 통계적 차이를 나타내었다.
도 9는 본 발명의 더 나은 실시예에서 야생형 마우스에서 IL-12를 분비하는 DC2.4 세포 및 혈청 IL-12의 농도에 대한 상이한 면역치료 약학적 조성물의 효과를 나타내는 그래프 세트이다: DC2.4 세포는 72시간 동안 GM-CSF(1μg/mL), IFN-α (20IU/mL) 및 LPS로 각각 치료하였다. 도 9a: DC2.4 세포에서 IL-12의 수준. 도 9b: 각각 통계 결과. 혈청 IL-12 농도는 면역화 후 3, 7, 14 및 21일에 ELISA에 의해 측정되었다. 도 9c: 21일째의 혈청 IL-12 농도 결과. ns(P> 0.05)는 통계적 차이를 나타내지 않았고, *(P <0.05)는 통계적 차이를 나타내었고 **(P <0.01)는 유의 한 통계적 차이를 나타내었다.
도 10은 본 발명의 더 나은 실시예에서 야생형 마우스에서 혈액 DC 세포의 수 및 기능에 대한 상이한 면역치료 약학적 조성물의 효과를 나타내는 그래프 세트이다: 도 10a: 상이한 약물 조합-치료 마우스에서 혈액 CD11b+ CD11c+ DC 세포에 대한 유세포 분석 결과. 도 10b 및 도 10c: 각각 마우스 혈액에서 CD11b+ CD11c+ DC의 백분율 및 양. 도 10d: CD11b+ CD11c+ DC 세포에 대한 CD80 발현 수준. 도 10e: CD11b+ CD11c+ DC 세포의 MHC-II 발현 수준. ns(P> 0.05)는 통계적 차이를 나타내지 않았고, *(P <0.05)는 통계적 차이를 나타내었고 **(P <0.01)는 유의한 통계적 차이를 나타내었다.
도 11은 본 발명의 더 나은 실시예에서 야생형 마우스에서 혈액 단핵구의 수 및 기능에 대한 상이한 면역치료 약학적 조성물의 효과를 나타내는 그래프 세트이다: 도 11a 및 도 11b: 상이한 약물 조합-치료 마우스에서 CD11b+Ly6C+ 단핵구의 유세포 분석법 전략 및 결과. 도 11c 및 도 11d: 각각 마우스 혈액에서 CD11b+Ly6C+ 단핵구의 백분율 및 양. 도 11e: CD11b+Ly6C+ 단핵구의 MHC-II의 발현 수준. 도 11f: 21일의 면역화 후 ELISA에 의해 검출된 마우스의 혈청에서 MCP-1의 수준. ns(P> 0.05)는 통계적 차이를 나타내지 않았고, *(P <0.05)는 통계적 차이를 나타내었고, **(P <0.01)는 유의한 통계적 차이를 나타내었다.
도 12는 본 발명의 더 나은 실시예에서 rAAV8-1.3HBV 마우스 모델 검증의 검증을 나타내는 그래프, 도표 및 이미지의 세트이다: 도 12a: 6-8주령의 수컷 C57B/L6 마우스를 선택하고 마우스당 1 x 1010 μg/100μL의 투여량으로 꼬리 정맥을 통해 rAAV-1.3HBV 바이러스로 주사하였다. 도 12d, 도 12e, 도 12c 및 도 12g: 주사 14일 후, 마우스에서 HBeAg, HBsAg, HBV-DNA 및 ALT의 혈청 수준이 각각 검출되었다. 도 12b: 간, 심장 및 신장에서 각각 HBcAg의 면역조직화학적 결과. 화살표로 표시된 세포는 HBcAg 양성 세포이다. 도 12f: 간, 심장 및 신장에서 각각 HBcAg의 헤마톡실린-에오신 염색 결과. ns(P> 0.05)는 유의한 차이를 나타내지 않았고, P <0.0001은 유의한 통계적 차이를 나타내었고, Bar = 200μm.
도 13은 본 발명의 더 나은 실시예에서 rAAV8-1.3HBV 마우스 모델의 모니터링을 나타내는 그래프 세트이다: C57B/L6 마우스는 rAAV-1.3 HBV 바이러스에 감염되었다. 도 13a, 도 13b 및 도 13c: 감염 후 0주 내지 12주에 혈청에서 HBsAg, HBV-DNA 및 ALT의 수준이 관찰되었다.
도 14는 본 발명의 더 나은 실시예에서 B형 간염 모델 마우스에서 면역치료 약학적 조성물로 면역화된 동물에서 HBsAg 및 HBeAg의 혈청 수준의 변화를 나타내는 그래프 세트이다: 바이러스 감염 후 21일에 면역이 시작되었고 2주마다 면역되었다. 혈청 HBsAg 및 HBeAg 농도는 각각의 면역화 전에 측정되었다. 도 14a: 9개의 실험 그룹에서 상이한 시점에서의 혈청 HBsAg 농도. 도 14b: 9개의 실험 그룹에서 상이한 시점에서의 혈청 HBeAg, 점선 S/CO = 1. ns(P> 0.05)는 통계적 차이를 나타내지 않았고, *(P <0.05)는 통계적 차이를 나타내었고, **(P <0.01) 통계적으로 유의 한 차이를 나타내었다.
도 15는 본 발명의 더 나은 실시예에서 rAAV8-1.3 B형 간염 마우스의 혈액에서 CD11b+CD11c+ 수지상 세포에 대한 면역치료 약학적 조성물 치료의 효과를 나타내는 그래프 세트이다: B형 간염 마우스 모델이 면역화된 후 3일에 마우스의 정맥혈을 채취하여 혈액 중 CD11b+ CD11c+ DC의 수준을 측정하였다. 도 15a: 혈액에서 CD11b+ CD11c+ DC에 대한 유세포 분석 전략. 도 15b: 상이한 면역화된 그룹의 혈액에서 CD11b+ CD11c+ DC의 비율. 도 15c: 상이한 면역화된 그룹의 혈액에서 CD11b+ CD11c+ DC의 통계 결과. 도 15d 및 도 15e는 상이한 면역화된 그룹의 혈액에서 CD11b+ CD11c+ DC 상의 CD80, CD86, MHC-I 및 MHC-II의 발현 및 통계적 결과를 보여준다. ns(P> 0.05)는 통계적 차이를 나타내지 않았고, *(P <0.05)는 통계적 차이를 나타내었고 **(P <0.01)는 유의한 통계적 차이를 나타내었다.
도 16은 rAAV8-1.3 B형 간염 마우스의 혈액에서 단핵구에 대한 면역치료 약학적 조성물 치료의 효과를 나타내는 그래프 세트이다: B형 간염 마우스 모델이 면역화된 후 3일에, 마우스의 정맥혈을 채취하였고 혈액 내 단핵구의 수준을 측정하였다. 도 16a: 혈액 내 단핵구에 대한 유세포 분석 전략. 도 16b: 상이한 면역화된 그룹의 혈액에서 CD11b+Ly6G+Ly6C+ 과립구, CD11b+Ly6G-Ly6Chi 단핵구 및 CD11b+Ly6G-Ly6Clo 단핵구의 비. 도 16c: 상이한 면역화된 그룹의 혈액에서 CD11b+Ly6G+Ly6C+ 과립구, CD11b+Ly6G-Ly6Chi 단핵구 및 CD11b+Ly6G-Ly6Clo 단핵구의 통계적 결과. 도 16d: 상이한 면역화된 그룹의 혈액에서 CD11b+Ly6G+Ly6C+ 과립구, CD11b+Ly6G-Ly6Chi 단핵구 및 CD11b+Ly6G-Ly6Clo 단핵구에서의 CCR2 발현의 통계 결과. ns(P> 0.05)는 통계적 차이를 나타내지 않았고, *(P <0.05)는 통계적 차이를 나타내었고 **(P <0.01)는 유의한 통계적 차이를 나타내었다.
도 17은 면역치료 약학적 조성물 치료가 rAAV8-1.3HBV B형 간염 마우스의 세포 면역성을 향상시킨다는 것을 나타내는 그래프 및 이미지의 세트이다: 도 17a: 4번째 면역화 후 7일에, HBsAg(10μg/10μL) 항원이 마우스의 왼쪽 발패드에 주사되었고 오른쪽 발패드는 대조군으로서 PBS로 주사되었다. 24시간 후, 캘리퍼 두께는 버니어 캘리퍼로 측정되었고, 패드 팽창 두께 = 왼쪽 패드 두께 - 오른쪽 패드 두께. 도 17b: 양성 대조군으로서 상이한 면역화된 그룹, CD3(1μg/mL) 및 CD28(100ng/mL)에서 CD8+ T 세포의 증식의 통계적 결과. 도 17c 및 도 17d는 상이한 면역화된 그룹에서 각각 비장 IFN-γ+CD4+ T 세포 및 IL-4+CD4+ T 세포 통계적 결과. 도 17e: 양성 대조군으로서 상이한 면역화된 그룹, 이오노마이신(1μg/mL) 및 PMA(100ng/mL)에서 비장 IFN-γ+CD8+ T 세포의 유세포 분석. 도 17f: 상이한 면역화된 그룹에서 비장 IFN-γ+CD8+ T 세포의 통계적 결과. 도 17g: 면역조직 화학적 방법에 의해 측정된 상이한 면역화된 그룹에서 간에서의 CD8+ T 세포, Bar = 100μm. 생체내 (H) 및 (I)에서 CTL 분석의 유세포 분석 결과(좌) 및 통계 결과(우). ns(P> 0.05)는 통계적 차이를 나타내지 않았고, *(P <0.05)는 통계적 차이를 나타내었고 **(P <0.01)는 유의한 통계적 차이를 나타내었다.
도 18은 면역치료 약학적 조성물 치료가 rAAV8-1.3HBV B형 간염 마우스의 체액성 면역을 향상시키는 것을 나타내는 그래프 및 이미지의 세트이다: 4차 면역화 후 14일에, 말초 혈액을 채취하고 혈청을 분리하였다. 도 18a: 혈청 HBeAg 결과. 도 18b: 혈청 HBsAg 결과. 도 18c: 혈청 HBV-DNA 결과, 키트 검출 한계 30IU/mL에 대한 점선. 도 18d: 혈청 ALT 결과. 도 18e: 간에서의 HBcAg의 면역조직화학적 결과, bar = 50μm. 도 18f: 혈청 항-HBsAg 결과. 도 18g: 혈청 IgG2a/IgG1 결과. ns(P> 0.05)는 통계적 차이를 나타내지 않았고, *(P <0.05)는 통계적 차이를 나타내었고 **(P <0.01)는 유의한 통계적 차이를 나타내었다.
도 19는 면역치료 약학적 조성물 치료의 효능에 대한 CCR2 차단의 효과를 나타내는 그래프 및 이미지의 세트이다: CCR2 차단제 INCB 3344는 GM-CSF의 주사 1시간 전에 30μg/kg의 투여량으로 3회, GM-CSF/INF-α/VACCINE의 주사 1시간 전에, 주사 24시간 및 48시간에 주사되었다. 3일 후 말초 혈액에서 CD11b+Ly6ChiCCR2hi 단핵구의 유세포 분석 및 통계 분석(각각 도 19a) 및 (도 19b). 도 19c: 말초 혈액에서 CD11b+CD11c+ DC의 비의 통계적 결과. 도 19d: 비장에서 IFN-γ+CD8+ T 세포의 비율의 통계적 결과. 도 19e, 도 19f 및 도 19g: 각각 혈청 ALT, HBsAg 및 HBV-DNA의 결과. 도 19h: 간 HBcAg의 면역조직화학적 결과, Bar = 50μm. ns(P> 0.05)는 통계적 차이를 나타내지 않았고, *(P <0.05)는 통계적 차이를 나타내었고 **(P <0.01)는 유의한 통계적 차이를 나타내었다.
도 20은 본 발명의 특정 실시태양에 따른 전립선암 펩타이드 백신의 향상에 대한 면역치료 약학적 조성물 치료의 면역 효과를 나타내는 그래프 세트이다. 동물은 조성물로 면역화되고 이런 면역화 및 세포 면역 반응을 나타내는 항원 면역성 검사 이후 항체 생산(도 20a) 및 풋패드 팽창의 크기 변화(도 20b)가 유도되었다.
도 21은 본 발명의 특정 실시태양에 따른 유방암 펩타이드 백신의 향상에 대한 면역치료 약학적 조성물 치료의 면역 효과를 나타내는 그래프 세트이다. 동물은 조성물로 면역화되고 이런 면역화 및 세포 면역 반응을 나타내는 항원 면역성 검사 이후 항체 생산(도 21a) 및 풋패드 팽창의 크기 변화(도 21b)가 유도되었다.
도 22는 본 발명의 특정 실시태양에 따른 결장 직장암 펩타이드 백신의 향상에 대한 면역치료 약학적 조성물 치료의 면역 효과를 나타내는 그래프 세트이다. 동물은 조성물로 면역화되고 이런 면역화 및 세포 면역 반응을 나타내는 항원 면역성 검사 이후 항체 생산(도 22a) 및 풋패드 팽창의 크기 변화(도 22b)가 유도되었다.
도 23은 본 발명의 특정 실시태양에 따른 자궁 경부암 펩타이드 백신의 향상에 대한 면역치료 약학적 조성물 치료의 면역 효과를 나타내는 그래프 세트이다. 동물은 조성물로 면역화되고 이런 면역화 및 세포 면역 반응을 나타내는 항원 면역성 검사 이후 항체 생산(도 23a) 및 풋패드 팽창의 크기 변화(도 23b)가 유도되었다.
도 24는 본 발명의 특정 실시태양에 따른 간세포 암종 펩타이드 백신의 향상에 대한 면역치료 약학적 조성물 치료의 면역 효과를 나타내는 그래프 세트이다. 동물은 조성물로 면역화되고 이런 면역화 및 세포 면역 반응을 나타내는 항원 면역성 검사 이후 항체 생산(도 24a) 및 풋패드 팽창의 크기 변화(도 24b)가 유도되었다.
도 25는 본 발명의 특정 실시태양에 따른 다발성 골수종 펩타이드 백신 면역의 향상에 대한 면역치료 약학적 조성물 치료의 면역 효과를 나타내는 그래프 세트이다. 동물은 조성물로 면역화되고 이런 면역화 및 세포 면역 반응을 나타내는 항원 면역성 검사 이후 항체 생산(도 25a) 및 풋패드 팽창의 크기 변화(도 25b)가 유도되었다.
도 26은 본 발명의 특정 실시태양에 따른 신장 세포 암종의 펩타이드 백신의 향상에 대한 면역치료 약학적 조성물 치료의 면역 효과를 나타내는 그래프 세트이다. 동물은 조성물로 면역화되고 이런 면역화 및 세포 면역 반응을 나타내는 항원 면역성 검사 이후 항체 생산(도 26a) 및 풋패드 팽창의 크기 변화(도 26b)가 유도되었다.
도 27은 본 발명의 더 나은 실시예에서 연쇄상 구균 타입 A 백신의 향상에 대한 면역치료 약학적 조성물 치료의 면역 효과를 나타내는 그래프 세트이다. 동물은 조성물로 면역화되고 이런 면역화 및 세포 면역 반응을 나타내는 항원 면역성 검사 이후 항체 생산(도 27a) 및 풋패드 팽창의 크기 변화(도 27b)가 유도되었다.
도 28은 본 발명의 더 나은 실시예에서 HIV-1 펩타이드 백신의 향상에 대한 면역치료 약학적 조성물 처리의 면역 효과를 나타내는 그래프 세트이다. 동물은 조성물로 면역화되고 이런 면역화 및 세포 면역 반응을 나타내는 항원 면역성 검사 이후 항체 생산(도 28a) 및 풋패드 팽창의 크기 변화(도 28b)가 유도되었다.
도 29는 본 발명의 더 나은 실시예에서 HBV PreS 및 HBV PreS1의 향상에 대한 면역치료 약학적 조성물 치료의 면역 효과를 나타내는 그래프 세트이다. GM-CSF의 최적 조성물에 대한 투여량은 10μg, 10,000IU의 IFN-α, 1μg의 PreS 또는 1μg의 PreS1이다. 6주령 암컷 Balb/c 마우스는 GM-CSF/IFN-α/PreS 또는 GM-CSF/IFNα/PreS1의 최적 투여량 비로 각각 2주 간격으로 3회 피하 주사되었다. 대조군은 PreS 또는 PreS1로 개별적으로 면역화되었다. 체액 면역을 검출하기 위해 각 면역화 전후에 혈액 샘플이 수집되었다.
본 발명의 임의의 실시태양이 상세하게 설명되기 전에, 본 발명은 이하의 상세한 설명에서 설명되거나 이하의 도면에 예시되는 구성 요소의 구축 및 배열의 세부 사항에 대한 응용분야에 제한되지 않음을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 실시태양이 가능하고 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본 발명에 사용된 어구 및 용어는 설명의 목적을 위한 것이며 제한하는 것으로 간주해서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에서 "포함하는(including)", "포함하는(comprising)" 또는 "갖는(having)" 및 이의 변형의 사용은 이후에 열거된 항목 및 그 등가물뿐만 아니라 추가 항목을 포함하는 것으로 의도된다. 추가로, 본 발명은 기술될 수 있는 특정 방법론, 프로토콜, 물질 및 시약에 제한되지 않는 것으로 이해된다. 또한, 본 발명에서 사용된 용어는 특정 실시태양을 설명하기 위한 목적으로만 사용되며 이후에 출원된 비 잠정적 응용에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다.
본 발명 및 첨부된 특허 청구 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 또한, 용어 "한(a)"(또는 "an"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. "포함하는(comprising)", "포함하는(including)" 및 "갖는(having)"이라는 용어는 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 설명된다. 본 발명에 구체적으로 언급된 모든 간행물 및 특허는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 간행물에 보고된 화학 물질, 기기, 통계 분석 및 방법론을 기술하고 개시하는 것을 포함하여 모든 목적을 위해 참고로 포함된다. 본 명세서에서 인용된 모든 참고 문헌은 당업자의 수준을 나타내는 것으로 간주된다. 본 발명의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 이런 개시보다 앞서는 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에 사용된 하기 용어는 다음의 의미를 갖는다.
본 발명에 사용된 용어 "포함하는(comprising)" 또는 "포함한다(comprises)"는 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하지만 다른 것을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 구성과 방법을 정의하기 위해 사용될 때 "필수적으로 이루어지는"은 언급된 목적을 위한 조합에 본질적으로 중요한 다른 요소를 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명에 정의된 바와 같은 요소로 필수적으로 이루어진 조성물은 청구된 발명의 기본 및 신규 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 재료 또는 단계를 배제하지 않을 것이다. "이루어지는"은 다른 성분의 미량 이상의 원소 및 실질적인 방법 단계를 배제하는 것을 의미한다. 이들 전이 용어 각각에 의해 정의된 실시태양은 본 발명의 범위 내에 있다.
범위를 포함하여 온도, 시간, 양 및 농도와 같은 수치 지정 전에 사용되는 용어 "약"은 (+) 또는 (-) 10%, 5% 또는 1%에 의해 변할 수 있는 근사치를 나타낸다.
본 발명에 사용된 용어 "면역 증강제"는 자연 면역 반응을 강화, 증진 또는 증강시킬 수 있는 임의의 작용제 또는 물질을 의미한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 재조합 인터페론과 같은 적어도 하나의 인터페론, 재조합 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자와 같은 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자를 포함하는 면역 증강제를 개시한다. 한 바람직한 실시태양에서, 면역 증강제는 rIFN-α 및 rGM-CSF를 포함한다.
본 발명에 사용된 용어 "약학적 조성물"은 질환 또는 병리학의 의학적 진단, 치유, 치료 또는 예방에 사용하기 위한 임의의 화학적 또는 생물학적 화합물 또는 물질, 또는 둘 이상의 이러한 화합물 또는 물질의 혼합물 또는 조합을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "치료하다" 및 "예방하다" 및 이로부터 유래된 단어는 반드시 100% 이상의 완전한 치료 또는 예방을 의미하지는 않는다. 오히려, 다양한 치료 또는 예방 정도가 있으며, 이의 당업자는 잠재적 이점 또는 치료 효과를 갖는 것으로 인식한다. 한 실시태양에서, 본 발명의 조성물 또는 방법은 포유동물에서 질환의 임의의 양의 임의의 수준의 치료 또는 예방을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제공되는 치료 또는 예방은 질환, 예를 들어 치료되거나 예방되는 암의 하나 이상의 상태 또는 증상의 치료 또는 예방을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 목적상, "예방"은 질환, 또는 이의 증상 또는 상태의 개시 지연을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법과 관련하여, 암은 본 발명에 기술된 임의의 종양 항원과 관련된 임의의 암을 포함하는 임의의 암일 수 있다.
본 발명은 임의의 포유동물에 적용 가능하다. 본 발명에 사용된 용어 "포유동물"은 인간, 개 또는 고양이 등과 같은 온혈 척추동물을 의미한다. 한 실시태양에서, 포유동물은 설치류, 토끼, 고양이, 개, 돼지 및 소와 같은 설치류를 포함한다.
본 발명에 사용된 용어 "투여하다" 또는 "투여"는 백신 또는 조성물과 같은 물질로 환자를 치료하는 기술에서 통상적이고 통상적인 의미를 의미한다. 본 발명에 사용된 용어 "공-투여" 및 "동시 투여"는 동의어이며 두 물질 또는 두 조성물이 동시에 환자의 신체에 존재하는 방식 및 타이밍으로 환자에게 2개의 물질 또는 2개의 조성물을 동시에 투여하는 것을 의미한다. 공-투여는 동시에 또는 순차적으로 이루어질 수 있고, 공-투여된 물질 또는 조성물은 환자에게 동시에, 또는 개별적으로 그러나 가까운 시간에 또는 같은 날에 투여될 수 있거나 그렇지 않으면 신체에서 각 물질 또는 조성물에 대한 체류 기간의 실질적인 중첩을 초래한다. 투여, 예를 들어, 비경구 투여는 피하 투여, 근육내 투여, 경피 투여, 피내 투여, 복강내 투여, 안내 투여, 비강내 투여 및 정맥내 투여를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 또는 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 개체에게 투여될 수 있다. 이런 방법은, 예를 들어, 피부: 예를 들어, 근육내, 정맥내, 복강내, 피내, 점막, 점막하 또는 피하 속으로 또는 통해 모든 주사 경로를 통한 비경 구적인 투여를 포함한다. 또한, 백신은 눈, 코, 입, 항문 또는 질의 점막 상피에, 또는 신체의 어느 부분에서든 외피의 표피에 점적, 스프레이, 젤 또는 연고로서 국소 도포에 의해 투여될 수 있다. 다른 가능한 투여 경로는 호흡기를 통한 흡입을 통한 스프레이, 에어로졸 또는 분말 도포이다. 이 마지막 경우에, 사용되는 입자 크기는 입자가 호흡기 속에 얼마나 깊이 침투할지를 결정할 것이다. 대안적으로, 도포는, 예를 들어, 분말, 액체 또는 정제로서 식품, 사료 또는 음료수와 결합하거나 액체, 겔, 정제 또는 캡슐로서 입 속에 또는 좌약으로 항문에 직접 투여에 의해 영양 경로를 통할 수 있다.
II. 본 발명의 바람직한 실시태양의 설명
본 발명을 설명하기 전에, 본 발명은 설명된 특정 방법 및 실험 조건으로 제한되지 않으며, 이런 방법 및 조건은 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 발명에서 사용된 용어는 특정 실시태양을 기술하기 위한 것이며 제한하기 위한 것이 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 제한된다는 것을 이해해야 한다.
광범위한 연구 후, 출원인은 면역 증진제로서 rGM-CSF와 rIFN-α의 혼합물의 최적 비율이 신체의 면역력을 크게 향상시키고(예를 들어, 단백질 항원과 혼합된 경우), 항원 제시의 효율을 향상시키고 효과적인 면역 활성화 및 반응을 확립하고; 강력한 항체 및 세포 면역 반응을 유도하여 질환을 예방하고 치료할 수 있음을 처음으로 발견하였다. 면역 증강제를 B형 간염 백신과 혼합하면 B형 간염 동물 모델에서 면역 내성을 성공적으로 차단하고 HBsAg의 제거 및 항-HBs Ab의 유도를 유도한다.
본 발명의 목적은 신규한 면역치료 약학적 조성물 및 특히 지속적인 바이러스 감염 및 종양에 대한 면역치료 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 HBV, 헤르페스 바이러스, HPV, HIV, 메르켈 세포 바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 RSV와 같은 많은 질환 또는 바이러스의 치료를 위한 새로운 면역요법 약물로서 사용될 수 있다.
한 실시태양에서, 면역치료 약학적 조성물은 재조합 인터페론과 같은 적어도 하나의 인터페론, 재조합 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자와 같은 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자를 포함한다. 한 실시태양에서, 재조합 인터페론은 재조합 인터페론-알파(rIFN-α)이다. 한 실시태양에서, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자는 재조합 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(rGM-CSF)이다.
한 실시태양에서, 면역 치료 제약 조성물은 재조합 인터페론과 같은 인터페론, 재조합 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자와 같은 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자를 포함하는 면역 증강제를 포함한다.
면역 증강제의 한 실시태양에서, 재조합 인터페론의 함량 대 재조합 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자의 함량의 비는 투여량당 (약 0.1 x 104 IU - 약 5 x 106 IU) 내지 (약 1μg - 200μg)이다. 다른 실시태양에서, 재조합 인터페론의 함량 대 재조합 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자의 함량의 비는 투여량당 (약 0.5 x 104 IU - 약 1x 105 IU) 내지 (약 5μg -약 50μg)이다.
한 실시태양에서, 면역 증강제의 재조합 인터페론은 인터페론 알파-2a와 같은 인터페론 알파이다.
바람직하게는, rIFN-α의 함량 대 rGM-CSF의 함량에 대한 중량비는 투여량당 (0.1 x 104 IU - 5 x 106 IU):(1μg - 200μg)의 범위이다.
더욱 바람직하게는, rIFN-α의 함량 대 rGM-CSF의 함량의 비는 투여량당 (0.5 x 104 IU - 1 x 105 IU):(5μg - 150μg)의 범위이다.
더욱 바람직하게는, rIFN-α의 함량 대 rGM-CSF의 함량의 비는 투여량당 (0.5 x 104 IU - 5 x 104 IU):(5μg - 50μg)의 범위이다.
가장 바람직하게는, rIFN-α 함량 대 rGM-CSF 함량의 비는 투여량당 1 x 10 4 IU:10μg의 범위이다.
한 바람직한 실시태양에서, rGM-CSF의 함량은 투여량당 약 1μg 내지 약 100μg의 범위이고; 바람직하게는 투여량당 약 5μg 내지 약 50μg의 범위이고; 보다 바람직하게는 투여량당 약 5μg 내지 약 20μg의 범위; 가장 바람직하게는 투여량당 약 10μg이다.
다른 바람직한 실시태양에서, rIFN-α의 함량은 투여량당 1 x 103 IU - 9 x 106 IU의 범위, 바람직하게는 투여량당 5 x 103 IU - 5 x 105 IU의 범위, 보다 바람직하게는 투여량당 8 x 103 IU - 2 x 105 IU의 범위, 가장 바람직하게는 투여량당 1 x 104 IU와 같은 약 0.5 x 104 IU - 1 x 105 IU의 범위이다.
다른 바람직한 실시태양에서, 상기 면역 증강제는 수산화 알루미늄 및/또는 인산 알루미늄과 같은 알루미늄 항원보강제를 더 포함할 수 있다.
한 실시예에서, 알루미늄 항원보강제의 양은 투여량당 약 0.5mg - 약 10mg의 범위이고; 바람직하게는 투여량당 약 1mg - 약 3mg의 범위이고; 보다 바람직하게는 투여량당 약 1.25mg - 약 2.5mg의 범위이다. 다른 실시예에서, 알루미늄 항원보강제의 양은 투여량당 약 0.1mg - 약 3mg의 범위이고; 바람직하게는 투여량당 약 0.8 mg - 약 2 mg의 범위이고; 가장 바람직하게는 투여량당 약 1.25mg이다. 또 다른 실시예에서, 알루미늄 항원보강제의 양은 투여량당 약 0.01mg - 약 3mg의 범위이고; 바람직하게는 투여량당 약 0.05mg - 약 2mg의 범위이고; 가장 바람직하게는 투여량당 약 0.125mg과 같은 약 0.1mg - 약 0.5mg의 범위이다.
한 실시예에서, 알루미늄 항원보강제 대 rGM-CSF의 중량비는 투여량당 (약 0.01mg 내지 약 1mg):(약 1μg 내지 약 200μg)의 범위이고; 바람직하게는 투여량당 (약 0.05mg 내지 약 0.5mg):(약 5μg 내지 약 150μg)의 범위이고; 더욱 바람직하게는, 비는 투여량당 (약 0.1mg 내지 약 0.25mg):(약 5㎍ 내지 약 50㎍)의 범위이고; 가장 바람직하게는, 중량비는 투여량당 약 0.125 mg:약 10μg이다. 다른 실시예에서, 알루미늄 항원보강제 대 rGM-CSF의 중량비는 투여량당 (약 0.1mg 내지 약 10mg):(약 1μg 내지 약 300μg)의 범위이고; 바람직하게는 투여량당 (약 0.5mg 내지 약 5mg):(약 2μg 내지 약 200μg)의 범위이고; 보다 바람직하게는 중량비는 투여량당 (약 1.5mg 내지 약 3mg):(약 5μg 내지 약 100μg)의 범위이고; 가장 바람직하게는, 중량비는 투여량당 (약 1mg 내지 약 2mg):(약 10μg 내지 약 75μg)의 범위이다.
한 실시태양에서, 면역치료 약학적 조성물은 위에서 논의한 바와 같이 단백질 항원(보다 바람직하게는 재조합 단백질 항원)과 같은 적어도 항원 및 면역 증진제를 포함한다. 한 실시태양에서, 재조합 인터페론은 인터페론 알파-2a이다. 한 실시태양에서, 항원은 재조합 단백질 항원을 포함하거나 재조합 단백질 항원이다. 면역치료 약학적 조성물의 한 실시태양에서, 재조합 인터페론의 함량 대 재조합 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자의 함량의 비는 투여량당 (약 0.5 x 104 IU - 약 1 x 105 IU) 내지 (약 5μg - 약 20μg). 다른 실시태양에서, 재조합 인터페론의 함량 대 재조합 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자의 함량의 비는 투여량당 약 1 x 104 IU 내지 약 10μg이다.
한 실시태양에서, 재조합 단백질 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 곰팡이 항원, 기생충 항원 및 종양 항원 중 적어도 하나이다. 한 실시태양에서, 바이러스 항원은 HBV 항원, 헤르페스 바이러스 항원, HPV 항원, HIV 항원, 메르켈 세포 바이러스 항원, 인플루엔자 항원 및 RSV 항원 중 적어도 하나이다. 한 실시태양에서, 재조합 단백질 항원은 불활성화 백신 항원, 약독화 백신 항원 또는 서브유닛 백신 항원이다.
한 실시태양에서, 재조합 단백질 항원은 유전자 조작 재조합 항원이다.
한 실시태양에서, 면역치료 약학적 조성물은 적어도 항원보강제를 더 포함한다. 한 실시태양에서, 항원보강제는 수산화 알루미늄과 같은 알루미늄 항원보강제이다.
한 실시태양에서, 면역치료 약학적 조성물은 약학적으로 또는 면역학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 더 포함한다. 한 실시태양에서, 면역치료 약학적 조성물은 B형 간염 항원을 더 포함한다. 한 실시태양에서, 안전하고 치료학적으로 유효한 양의 면역 증강제는 항원의 투여 이전 또는 대상에 대한 항원(들)의 투여(예를 들어, 동시 투여) 동안 대상에게 투여될 수 있다. 한 실시태양에서, 안전하고 치료학적 유효량의 면역 증강제는 대상에 대한 항원의 투여 이전에 대상에 투여된다. 다른 실시태양에서, 안전하고 치료학적 유효량의 면역 증강제는 대상에 대한 항원(들)의 투여(예를 들어, 동시 투여) 동안 대상에게 투여된다.
한 실시태양에서, B형 간염 항원은 재조합 B형 간염 표면 항원과 같은 재조합 B형 간염 항원이다.
한 실시태양에서, 재조합 단백질 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 곰팡이 항원, 기생충 항원 및 종양 항원 중 적어도 하나이다.
한 실시태양에서, 바이러스 항원은 HBV 항원, 헤르페스 바이러스 항원, HPV 항원, HIV 항원, 메르켈 세포 바이러스 항원, 인플루엔자 항원 및 RSV 항원 중 적어도 하나이다.
다른 실시태양에서, 재조합 단백질 항원은 불활성화 백신 항원, 약독화 백신 항원 또는 서브유닛 백신 항원이다. 한 바람직한 실시태양에서, 재조합 단백질 항원은 유전자 조작 재조합 항원이다.
한 실시태양에서, 본 발명의 면역치료 약학적 조성물은 재조합 인터페론과 같은 적어도 하나의 인터페론, 재조합 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자와 같은 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 알루미나 항원보강제와 같은 항원보강제 및 단백질 항원(보다 바람직하게는 재조합 단백질 항원)과 같은 항원을 포함한다. 한 실시태양에서, 항원보강제는 수산화 알루미늄과 같은 알루미늄 항원보강제이다. 한 실시태양에서, 재조합 인터페론은 인터페론 알파-2a와 같은 인터페론 알파이다.
한 실시태양에서, 재조합 단백질 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 곰팡이 항원, 기생충 항원 및 종양 항원 중 적어도 하나이다. 한 실시태양에서, 바이러스 항원은 HBV 항원, 헤르페스 바이러스 항원, HPV 항원, HIV 항원, 메르켈 세포 바이러스 항원, 인플루엔자 항원 및 RSV 항원 중 적어도 하나이다. 한 실시태양에서, 재조합 단백질 항원은 불활성화 백신 항원, 약독화 백신 항원 또는 서브유닛 백신 항원이다. 한 바람직한 실시태양에서, 재조합 단백질 항원은 재조합 B형 간염 항원, 바람직하게는 재조합 B형 간염 표면 항원과 같은 B형 간염 항원이다.
한 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 면역치료 약학적 조성물은 특정 비율 및 특정 순서로 혼합된 후 rIFN-α, rGM-CSF, 알루미늄 항원보강제 및 재조합 B형 간염 표면 항원을 포함한다.
한 실시태양에서, 본 발명의 면역치료 약학적 조성물은 B형 간염의 치료에 유용하고 면역 증강제가 rIFN-α 및 rGM-CSF를 포함하는 만성 B형 간염의 치료에 특히 적합하며, 항원보강제는 수산화 알루미늄이다. 한 실시태양에서, 최적의 비율로 rIFN-α 및 rGM-CSF와 단백질 항원 또는 백신 조합은 약학적 제제로 제조된다. 한 실시태양에서, rIFN-α의 함량 대 rGM-CSF의 함량의 비는 투여량당 (약 0.1 x 104 IU - 약 5 x 106 IU) 내지 (약 1μg - 약 200μg), 바람직하게는 (0.5 x 104 IU - 약 1 x 105 IU) 내지 (약 5μg - 약 50μg), 보다 바람직하게는 약 1 x 104 IU 내지 약 10μg이다.
한 실시태양에서, rIFN-α의 함량 대 rGM-CSF의 함량의 비는 투여량당 (약 0.5 x 104 IU 내지 약 1.5 x 104 IU):(약 5μg 내지 약 20μg)의 범위이며; 바람직하게는 상기 비는 투여량당 약 1 x 104 IU:약 10μg이다.
상기 면역치료 약학적 조성물에서, rGM-CSF의 함량은 투여량당 약 1μg 내지 약 200μg의 범위이고; 바람직하게는 투여량당 약 5μg 내지 약 50μg; 보다 바람직하게는 투여량당 약 5μg 내지 약 20μg; 가장 바람직하게는 투여량당 약 10μg이다.
상기 면역치료 약학적 조성물에서, rIFN-α의 함량은 투여량당 약 1 x 103 IU 내지 약 9 x 105 IU의 범위이고; 바람직하게는 투여량당 약 5 x 103 IU 내지 약 1 x 105 IU의 범위이고; 보다 바람직하게는 투여량당 약 8 x 103 IU 내지 약 5 x 104 IU의 범위이고; 가장 바람직하게는 투여량당 약 1 x 104 IU과 같은 약 1 x 104 내지 약 2 x 104 IU의 범위이다.
상기 면역치료 약학적 조성물에서, 항원 대 rGM-CSF의 함량비는 투여량당 (약 0.1μg 내지 약 10μg):(약 1μg 내지 약 100μg); 바람직하게는 투여량당 (약 0.5μg 내지 약 5μg):(약 5μg 내지 약 50μg); 보다 바람직하게는 투여량당 (약 1μg 내지 약 5μg):(약 5μg 내지 약 25μg); 가장 바람직하게는 투여량당 약 1μg:약 10μg이다.
한 실시태양에서, 약학적 제제 또는 제형 중의 조성물은 피하, 근육, 점막 및 신체의 다른 부분과 같은 전통적인 주사 방법을 통해 체내로 주입되고, 또한 비강 점적, 점안제 및 피부 전달에 의해 투여될 수 있다. 투여 후, 단핵구는 미성숙 DC로 효과적으로 분화된 후 성숙 DC 세포로 전환되어, 바이러스 유도 면역 내성을 파괴하고 신체에 숨겨진 바이러스를 제거하기 위해 숙주 면역을 효과적으로 유도하도록 항원 제시의 효율을 향상시키고; 바이러스 감염의 재발을 방지하고 심지어 신체에서 바이러스를 제거하고 HBV 재감염을 예방하기 위해 강력한 항체 및 세포 면역 반응을 가진다.
본 발명에서, 항원은 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 등과 같은 미생물로부터 유래될 수 있다.
한 실시태양에서, 면역치료 약학적 조성물에서 항원은 단백질 항원을 포함한다.
바람직하게는, 단백질 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 기생 항원 및 종양 항원 중 하나 이상이다.
보다 바람직하게는, 상기 바이러스 항원은 HBV 항원, 헤르페스 바이러스 항원, HPV 항원, HIV 항원, 메르켈 세포 바이러스, 인플루엔자 바이러스 항원 및 RSV 항원 중 하나 이상을 포함한다.
다른 실시태양에서, 상기 단백질 항원은 불활성화 백신 항원, 약독화 백신 항원 또는 서브유닛 백신 항원이다.
다른 실시태양에서, 단백질 항원은 유전자 조작 백신 항원이다.
한 바람직한 실시태양에서, 단백질 항원은 B형 간염 항원, 바람직하게는 재조합 B형 간염 항원, 보다 바람직하게는 재조합 B형 간염 표면 항원과 같은 재조합 단백질 항원이다.
한 실시태양에서, 바이러스 항원은 혈청 유래 B형 간염 바이러스 표면 항원 또는 유전자 조작 B형 간염 표면 단백질일 수 있고 효모 및 CHO 세포에서 발현될 수 있다. 한 실시태양에서, B형 간염 서브유닛 항원은 효모 시스템 또는 포유동물 세포에서 발현되도록 유전자 조작에 의해 제조되고, 추출, 정제 및 항원보강제와 조합된다.
바이러스 항원은 헤르페스 바이러스, HPV, HIV, 메르켈 세포 바이러스, 인플루엔자 바이러스, RSV 또는 아데노비리대, 아레나비리대, 브라디비리대, 칼리시비리대, 코로나비리대, 필로비리대, 헤파드나비리대, 헤르페스비리대, 오르쏘믹소비리대, 파포비리대, 파라믹소비리대, 파르보비리대, 피코나비리대, 폭스비리대, 레오비리대, 레트로비리대, 리합도비리대 또는 토가비리대를 포함하나 이에 제한되지 않는 각 바이러스과로부터 유도될 수 있다. 이들은 또한 PRRSV, PCV, FMDV, 광견병 바이러스, 파로바이러스, 디스템퍼 바이러스, 아데노바이러스, 코로나바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 보르데텔라 및 렙토스피라 박테리아와 같은 동물 질환을 유발하는 미생물도 포함한다.
종양 항원은 다음 종양: 구강암, 식도암, 위암, 십이지장 암, 소장 암, 결장암, 항문 암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 암, 폐암, 피부암(흑색종), 골암, 골수종, T 및 B 세포 림프종, 백혈병, 호지킨 종양, 비호지킨 종양, 카포시 육종, 두경부 신생물, 뇌 갑상선, 신경아교종, 갑상선, 흉선, 신장, 요도, 방광, 고환, 전립선, 음경, 자궁, 자궁 경부, 난소, 난관, 질로부터 유도될 수 있다.
한 실시태양에서, 동물 바이러스 항원은 주로 불활성화 백신, 약독화 백신 및 서브유닛 백신과 같은 동물 백신으로부터 유도된다.
한 실시태양에서, 항원은 종양 유도 특이적 및 관련 항원일 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 논의된 바와 같은 면역치료 약학적 조성물의 제조 방법을 개시하며, 상기 방법은 항원, 재조합 인터페론, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 및 약학적으로 또는 면역학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 무균 조건하에서 혼합하여 면역치료 약학적 조성물을 생산하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 치료 백신 항원보강제 및 백신 조성물로서 본 발명에 논의된 바와 같은 면역치료 약학적 조성물의 사용 및 제조 방법을 제공한다. 출원인은 증명 목적을 위한 예로서 재조합 B형 간염 표면 항원을 사용한다. 구체적인 구현 공정에서 이 분야의 기술자는 본 발명의 재조합 rHBsAg 항원으로부터 제조 된 B형 간염 서브유닛 백신과 같은 기존 기술의 임의의 백신으로 이를 대체할 수 있다.
한 실시태양에서, 면역치료 약물의 제조에 있어서 제 5 항의 면역치료 약학적 조성물의 용도로서, 용도는 1) 단핵구 생산 촉진하는 단계; 2) 단핵구 CCR2의 발현을 촉진하는 단계; 3) Ly6ChiCCR2+ 단핵구의 표현형 CD11b+CD11c+을 가진 DCs로 의 분화를 촉진하는 단계; 4) 대상의 세포 면역 및 CTL 세포용해 기능을 개선시키는 단계; 5) 대상의 체액 면역성 및 하나 또는 여러 개의 보호 항체의 생산을 촉진하는 단계를 포함한다.
한 실시태양에서, 용도는 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염 및 종양 중 하나 이상을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 바이러스 감염은 인간 간염 바이러스 감염, 헤르페스 바이러스 감염, 인간 유두종 바이러스 감염, 인간 면역 결핍 바이러스 감염, 메르켈 세포 바이러스 감염, 인플루엔자 바이러스 감염 및 호흡기 세포 융합 바이러스 감염 중 하나 이상을 포함한다.
한 실시태양에서, 항원은 B형 간염 백신이고 면역치료 약학적 조성물은 항 -HBs Ab를 생성하면서 면역 내성을 분해하고 감염된 간세포, HBeAg 및 HBsAg를 제거할 수 있다. 한 실시태양에서, 항원은 종양 항원이고 면역치료 약학적 조성물은 항-종양 면역 반응을 유도한다. 다른 실시태양에서, 종양 항원은 전립선암 항원 폴리펩타이드 또는 에피토프 펩타이드, 유방암 항원 폴리펩타이드 또는 에피토프 펩타이드, 결장 직장암 항원 폴리펩타이드 또는 에피토프 펩타이드, 자궁 경부암 폴리펩타이드 또는 에피토프 펩타이드, 간암 폴리펩타이드 또는 에피토프 펩타이드, 다발성 골수종 폴리펩타이드 또는 에피토프 펩타이드 및 신장 세포 암종 폴리펩타이드 또는 에피토프 펩타이드 중 적어도 하나를 포함한다.
한 실시태양에서, 항원은 연쇄상 구균 항원 중 하나이며 면역치료 약학적 조성물은 항균성 감염을 일으키는 면역 반응을 유도한다. 한 실시태양에서, 연쇄상 구균 항원은 변형 연쇄상 구균 타입 A 에피토프 펩타이드이다.
한 실시태양에서, 항원은 HIV 항원 중 하나이고 면역치료 약학적 조성물은 항-HIV 감염을 일으키는 면역 반응을 유도한다. 한 실시태양에서, HIV 항원은 HIV 에피토프 펩타이드이다.
한 실시태양에서, 항원은 메르켈 세포 바이러스 항원 중 하나이고 면역치료 약학적 조성물은 항-메르켈 세포 바이러스 감염을 생성하는 면역 반응을 유도한다. 한 실시태양에서, 메르켈 세포 바이러스 항원은 메르켈 세포 폴리펩타이드 중 하나이다.
한 실시태양에서, 상기 용도는 안전하고 치료학적 유효량의 면역치료 약학적 조성물을 면역화될 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 대상은 포유동물이다.
한 실시태양에서, 출원인은 투여량당 약 1μg 내지 약 200μg의 범위, 바람직하게는 투여량당 약 20μg 내지 약 150μg의 범위, 더욱 바람직하게는 투여량당 약 50μg 내지 약 100μg의 범위인 것을 실험적으로 확인하였다.
한 실시태양에서, 출원인은 약 1000 IU 내지 약 50,000 (IU) 유닛의 범위, 바람직하게는 투여량당 약 2000 IU 내지 약 30,000 (IU)의 범위, 보다 바람직하게는 약 5000 IU 내지 약 20000 (IU)의 범위의 IFN-α의 활성이 효과적이라는 것을 실험적으로 확인하였다.
본 발명은 다음의 기술적 실시태양을 채택하였다. 재조합 인간 인터페론-α는 유전자 조작 기술을 통해 대장균 또는 효모 시스템에서 발현되고, 추출되고, 정제되고 rhIFN-α(I형 인터페론)를 사용할 준비를 하도록 부형제로 결합된다. 재조합 인간 GM-CSF는 유전자 조작 기술을 통해 대장균 또는 효모 시스템에서 발현되고, 추출되고, 정제되고 rhGM-CSF(재조합 인간 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자)를 사용할 준비를 하도록 결합된다. 인간 B형 간염 표면 항원은 유전자 조직 기술에 의해 효모 시스템 또는 CHO 세포에서 발현되고, 추출되고, 정제되고 rHBsAg(재조합 B형 간염 표면 항원)를 사용할 준비를 한다.
본 발명의 조성물에서 rhIFN-α, rhGM-CSF 및 항원은 이 분야의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있거나 상업적으로 이용 가능하다. 본 발명의 조성물의 한 실시태양에서, rHBsAg 대 rhGM-CSF의 질량비는 약 1:(1-100), 바람직하게는 1:(1-80); 보다 바람직하게는 1:(1-30)(예를 들어, 1:7.5)이다. rhGM-CSF 대 rhIFN-α 및/또는 알루미늄 항원보강제의 비는 상기한 바와 같다.
면역 증진제
항원보강제 및 비특이적 면역 증강제로도 알려진 면역 증강제는 항원성이 아니며 항원과 사전 또는 동시에 작용한다. 이들은 항원에 대한 특이적 면역 반응을 비특이적으로 변경 또는 향상시키며, 이는 항원과 함께(예를 들어, 공동-투여) 또는 면역원성을 향상시키거나 면역 반응의 유형을 변경시키기 위해 항원의 투여 전에 미리 주사된다. 전통적인 알루미늄 항원보강제 이외에, 사이토카인과 같은 물질은 또한 중요한 항원보강제가 될 수 있다. 예를 들어, GM-CSF는 조혈 전구 세포의 증식, 분화 및 성숙을 촉진할 뿐만 아니라 APC, 섬유아세포, 각질세포 및 피부 점막 세포와 같은 다른 세포를 자극하는 다능성 조혈 세포 성장 인자이다.
예비 실험에서 본 출원인은 B형 간염 백신과 GM-CSF의 조합이 포유동물의 면역 반응을 향상시킬 수 있지만, 그 향상은 제한적이라는 것을 발견하였다. 또한, 출원인은 하루 한 번 3회 GM-CSF의 사전 주사 후 동일한 부위에서 백신 항원 주사, 면역 반응, 특히 T-세포 반응의 수준이 크게 개선될 것이라는 것을 발견하였다. 이 메커니즘은 또한 깊이 연구되었다. GM-CSF의 사전 주사는 주로 항원 제시 세포(DC)의 수, DC 항원 제시의 능력 및 생존력을 증가시키기 위해 단핵구의 농축 및 형질 전환을 개선한다는 것이 발견되었다. DC는 항원에 노출될 때 효과적으로 T 세포에 항원을 제시하여 세포 면역의 반응을 향상시킬 수 있다. 이 연구는 GM-CSF 및 백신 항원의 상이한 투여 전략이 상이한 면역 효과를 생성할 수 있음을 나타내었다. 그러나, 이 방법은 임상적으로 사용하기에 매우 불편하다. 실제로, 백신 주사 전에 GM-CSF의 3일의 사전 주사 프로토콜은 주사를 취급한 환자 및 간호사에게는 구현하기 쉽지 않았다. 3개의 주요 단점이 존재한다는 것이 발견되었다: 1) 이 방법은 환자에게 예방 접종을 하고 일관된 결과를 얻는 데 큰 불편함을 가져오는데, 이는 실시된 여러 횟수의 주사 및 임상 시험에서 매회 주사된 위치의 비 동일성 때문이다, 2) 위의 사실로 인해, 환자 순응도 불량 및 시험 중단은 불편한 프로토콜과 관련이 있었다, 3) 환자는 한 번의 주사를 완료하기 전에 며칠 동안 병원에 입원할 필요가 있다. 이러한 단점을 고려하여, 3일 전치료는 시급히 개선해야 한다.
고용량 투여시 IFN-α는 경보 인접 세포를 통해 바이러스의 복제를 억제하여 항 바이러스 단백질을 생성하여 바이러스 감염을 제거할 수 있을 뿐만 아니라 면역조절 역할을 하고 항 바이러스 반응을 향상시키는 자연 살해 세포(NK 세포), 단핵구, 대식세포 및 T 림프구 활성을 향상시킬 수 있다.
IFN-α는 수지상 세포를 분화로 유도하고 수지상 세포 교차 제시를 향상시키는 것으로 나타났다(J. Immunol. April 1, 2012 188: 3116-3126; Blood February 9, 2012 119:1407-1417). 함께 투여되는 IFN-α 및 GM-CSF는 특정 농도에의 생체외 시스템에서 말초 혈액 단핵구를 강력한 항원 제시 세포로 분화시킬 수 있다(Journal of Leukocyte Biology 1998, 64:58-367). 그러나, 발명된 최적 용량 비로 함께 단백질 항원을 갖는 IFN-α 및 GM-CSF가 생체 내에서 강화된 면역 반응을 제공할 수 있는지 여부는 이전에 조사되지 않았다. 특히 강화된 면역 반응이 분화하는 Ly6ChiCCR2+ 단핵구의 활성화 및 이들의 CD11b+CD11c+ 수지상 세포로의 강화를 통해 매개될 수 있는지 여부는 알려져 있지 않다. Ly6ChiCCR2+ 단핵구의 CD11b+CD11c+ 수지상 세포로의 분화는 Ly6C- 단핵구와 같은 다른 유형의 단핵구이기 때문에 잠재적인 세포 매개 면역에 매우 중요하다.
이 두 가지 주요 유형의 단핵구는 생쥐와 인간에서 보고되었다(Immunity 2003, 19, 71-82). 가장 주목할만한 차이점은 높은 수준의 Ly6C를 발현하는 염증성 단핵구와 Ly6C가 결여되는 단핵구 사이에 있다. 본 발명에 기술된 최적의 제형의 면역치료 약학적 조성물은 높은 수준의 Ly6ChiCCR2+ 단핵구를 유도할 수 있고 후속적으로 치료 효과를 유발할 수 있다.
조합
본 발명은 면역치료 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 면역치료 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 및 유효량의 활성 성분을 포함한다. 본 발명에 사용된 용어 "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 투여량"은 인간 및/또는 동물에서 기능적 또는 활성이고 인간 및/또는 동물에게 허용 가능한 양을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 독성, 자극 및 알레르기와 같은 과도한 부작용 없이 인간 및/또는 포유동물에 적용 가능한 합리적인 이익/위험 비율을 갖는 물질을 의미한다. 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 치료제의 투여를 돕는 담체를 의미하며 이는 다양한 부형제 및 희석제를 포함한다.
본 발명의 면역치료 약학적 조성물은 안전하고 치료학적으로 유효한 양의 활성 성분 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 이런 담체는 식염수, 완충제, 덱스트로스, 글리세롤, 만니톨, 트레할로스, 사이클로덱스트린, 알루미늄 항원보강제, 요소 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않을 수 있다. 일반적으로, 약학적 제제는 투여 방식과 일치해야 한다. 본 발명의 면역치료 약학적 조성물은 주사제, 경구 제제(정제, 캡슐, 경구 액체), 경피제 및 서방형 제제의 형태일 수 있다. 예를 들어, 통상적인 방법에 의해, 조성물은 생리 식염수 또는 글루코오스 및 다른 보조제를 함유하는 수용액을 포함할 수 있다. 면역치료 약학적 조성물은 바람직하게는 무균 조건하에서 제조된다.
본 발명의 치료적 유효량의 활성 성분은 투여 방식 및 치료될 질환의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 치료적 유효량은 다양한 인자(예를 들어, 임상 시험을 통해)에 기초하여 이 분야의 일반 기술인에 의해 선택될 수 있다. 이런 인자는 생체 이용률, 대사, 반감기와 같은 활성 성분의 약동학적 파라미터; 질환의 심각성, 환자의 체중, 환자의 면역 상태, 투여 등을 포함하나 이에 제한될 수 없다. 일반적으로, 활성 성분이 약 0.00001 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 바람직하게는 약 0.0001 mg 내지 약 10 mg/kg의 투여량으로 매일 투여될 때 만족스러운 효과가 얻어진다. 예를 들어, 치료 조건의 긴급성에 따라, 여러 분할된 투여량이 매주 투여될 수 있거나, 투여량이 비례적으로 감소될 수 있다.
본 발명의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 만니톨, 트레할로스, 사이클로덱스트린, 알루미늄 항원보강제, 요소, 리포좀, 지질, 오일, 단백질, 단백질-항체 접합체, 펩타이드, 셀룰로오스, 나노 입자, 나노 겔 및 다른 조합을 포함하나 이에 제한될 수 있다. 담체는 이 분야의 일반 기술자에게 잘 알려진 대로 투여 모드와 일치해야 한다.
본 발명은 또한 미생물 감염 및 지속적인 감염(바이러스 감염과 같은) 또는 종양을 포함하는 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물의 용도를 제공한다.
백신 구성
본 발명의 백신 조성물은 예방적(감염 방지)일 수 있고 또한 치료적일 수 있다. 백신 조성물은 면역원성 항원(예를 들어 단백질 항원)을 포함하고, 담체-특이적 항체를 유도하지 않는 "약학적으로 허용 가능한 담체(들)"와 조합된다. 적합한 담체는 수산화 알루미늄, 덱스트로스, 만니톨, 트레할로스, 사이클로덱스트린, 담체 단백질, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 아미노산 폴리머, 아미노산 코폴리머와 같은 전형적으로 크고 천천히 대사되는 거대 분자, 오일 방울과 같은 지질 응집체 및/또는 이들의 조합이다. 이 벡터는 이 분야의 일반 기술인에게 잘 알려져 있다. 또한, 이들 벡터는 면역 자극제("항원보강제")로서 기능한다. 항원은 또한 박테리아 독소(디프테리아, 파상풍, 콜레라, 디프테리아 CRM197과 같은 톡소이드) 또는 운반체 단백질(HPV16 또는 HPV18의 L1, 메르켈 세포 바이러스의 VP1, 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌)에 접합될 수 있다.
상기 본 발명의 면역 자극제에 더하여, 면역원성 조성물의 효과를 향상시키는 다른 항원보강제는 또한 백신 조성물에 첨가될 수 있으나, (1) 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 황산 알루미늄 등과 같은 알루미늄; (2) (a) MF59(WO90/14837 참조), (b) SAF 및 (c) RibiTM 항원보강제 시스템(RAS)과 같은 수중유 에멀젼 제형; (3) 프로인트 완전 항원보강제(CFA) 및 프로인트의 불완전 항원보강제(IFA); (4) TLR 작용제, 예를 들어. CpG, MPL, 폴리 I:C, Pam3Cys, 플라겔린, 레시퀴모드; (5) (IL-1, IL-2 및 IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 등과 같은) 인터루킨, 종양 괴사 인자(TNF) 및 등과 같은 사이토카인; (5) 콜레라 독소 CT, 백일해 독소 PT 또는 대장균 열 불안정 독소 LT와 같은 박테리아 ADP-리보실화 독소 해독 변이체, 예를 들어, WO 93/13302 및 WO 92/19265; 및 (6) 조성물의 효과를 향상시키는 다른 물질을 포함하나 이에 제한될 수 없다.
한 실시태양에서, 백신 조성물은 항원, 약학적으로 허용 가능한 담체 및 항원보강제와 같은 면역원성 조성물을 포함하고, 통상적으로 물, 식염수, 글리세롤, 완충제 등과 같은 희석제를 함유한다. 또한, 습윤제, 유화제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 또한 포함될 수 있다.
보다 구체적으로, 면역원성 조성물을 포함하는 백신은 면역학적 유효량의 면역원성 폴리펩타이드뿐만 아니라 상기 다른 원하는 구성 요소를 함유한다. "면역 학적 유효량"은 단일 투여량으로 또는 연속 투여량의 일부로서 대상에게 투여되는 양이 치료 또는 예방에 효과적임을 의미한다. 양은 개인의 건강 및 생리학, 개인의 유형(예를 들어, 인간), 개인의 면역계가 항체를 생산하는 능력, 원하는 보호 정도, 백신의 제형, 의학적 조건의 의사의 평가 및 다른 관련 인자에 따라 변할 수 있다. 이 양은 비교적 넓은 범위 내에 있을 것이며 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있을 것으로 예상된다.
일반적으로, 백신 조성물 또는 면역원성 조성물은 주사, 예를 들어 액체 용액 또는 현탁액으로서 제제화될 수 있다; 또한 주사 전에 용액 또는 현탁액으로 제조하기에 적합한 고체 형태로 생산될 수 있다. 제형은 또한 항원보강제 효과를 향상시키기 위해 리포좀에 유화되거나 캡슐화될 수 있다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 1가 또는 다가일 수 있다.
투여 경로 및 투여량
조성물은 대상에게 직접 투여될 수 있다. 대상은 인간 또는 비인간 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다. 백신으로서 사용될 때, 본 발명의 조성물은 임의의 공지된 방법을 사용하여 개체에게 직접 투여될 수 있다. 이 백신은 일반적으로 통상적인 백신에 의해 사용된 바와 같은 동일한 경로를 사용 및/또는 병원체 감염을 모방하여 투여된다.
본 발명의 약학적 조성물 또는 백신 조성물의 투여 경로는 근육내, 피하, 피내, 폐내, 정맥내, 비강내, 질, 경구 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함하나 이에 제한되지 않을 수 있다. 원하는 경우, 투여 경로는 질환의 상태에 따라 조합되거나 조정될 수 있다. 백신 조성물은 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 투여될 수 있고 면역을 유발 및/또는 유지하기 위해 부스터 투여량의 투여를 포함할 수 있다.
백신은 "치료적 유효량"으로 제공되어야 하며, 즉, 백신의 양은 선택된 투여 경로에서 면역 반응을 유발하기에 충분하고 바이러스 감염에 대한 숙주의 보호를 효과적으로 촉진할 수 있어야 한다.
각 투여량에 대해 선택된 항원의 양은 심각한 부작용 없이 보호 반응을 유발할 수 있는 양을 기준으로 한다. 일반적으로, 숙주 세포의 감염 후, 각각의 투여량은 약 0.1μg 내지 약 10000μg, 바람직하게는 약 1μg 내지 약 100μg, 보다 바람직하게는 약 10μg 내지 약 50μg의 단백질 항원을 함유한다. 대상에서의 항체 역가 및 다른 반응은 특정 백신에 대한 최적의 투여량을 결정하기 위한 표준 방법으로 사용될 수 있다. 면역 수준은 부스터 투여량이 필요한지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. PBMC의 혈청 또는 T 세포 기능에서 항체 역가를 평가한 후, 부스터 투여량이 필요할 수 있다. 항원보강제 및/또는 면역 자극제의 투여는 본 발명의 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 바람직한 방법은 피하 또는 근육내 경로로부터의 주사에 의해 면역원성 조성물을 투여하는 것이다.
본 발명은 특정 실시예를 참조하여 하기에 추가로 설명된다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위해 사용되며 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 다음의 실시예는 일반적으로 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 또는 제조업체의 권장 조건에 기술된 것과 같은 통상적인 조건에 따른 실험 방법의 특정 조건을 나타내지 않았다. 달리 지시되지 않는 한, 백분율 및 부분은 중량으로 지칭된다.
재료 및 방법
1. 실험 동물 및 세포주
6 내지 8주령 C57BL/6 수컷 마우스는 Huafukang Laboratory Animal Co. Ltd (중국 베이징)에서 구입하였다. 모든 마우스를 환경적으로 제어된 조건에 수용하였다. 5개 마우스를 독립적인 환기 장치를 가진 각 케이지에 있었다. 모든 절차는 기관 동물 사용 및 관리위원회의 승인으로 수행하였다.
DC2.4 세포는 C57BL/6 골수 유래 수지상 세포이다.
2. 주요 시약
본 발명의 실시예에서 사용된 주요 시약은 표 1에 도시된다.
명칭 카탈로그 크기 제조사
인간 인터페론 알파-2b S20030030 5억 IU Beijing Kawin Technology Share-Holding Co., Ltd.
인간 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 S19980020 150μg North China Pharmaceutical Gin Tan Biotechnology Co., Ltd.
재조합 B형 간염 백신(CHO) S20113004 10μg North China Pharmaceutical Gin Tan Biotechnology Co., Ltd.
혈액학 HBsAg GK-001 1mg/mL Shanghai Gui Kang Biological Technology Co., Ltd.
HBsAb ELISA 표준 GBW(E)090187 80mIU/mL Beijing Kinghawk Pharmaceutical Co., Ltd.
HBsAg ELISA 표준 GBW(E)090174 2IU/mL Beijing Kinghawk Pharmaceutical Co., Ltd.
마우스 인터페론 알파 50525-M01H 10μg Sino Biological Inc.
마우스 IL-4 111249 10μg Peprotech
마우스 GM-CSF 021455 10μg Peprotech
HRP-표지 염소 항-마우스 lgG1 1071-05 1mL Southern Biotech
HRP-표지 염소 항-마우스 lgG2a 1081-05 1mL Southern Biotech
B형 간염 표면 항원 CTL 에피토프 펩타이드 S208-215 :
ILSPFLPL		 순도 95% Shanghai Gui Kang Biological Technology Co., Ltd.
치킨 난백 알부민 CTL 에피토프 펩타이드 O257-264:
SIINFEKL		 순도 95% Shanghai Gui Kang Biological Technology Co., Ltd.
DMEM 배지 12491-015 500mL Gibco
RPMI1640 배지 11875-093 500mL Gibco
태아 소 혈청 10100-147 500mL Gibco
페니실린 + 스트렙토마이신 BL505A 100mL Nanjing Wo Hong Technology Co., Ltd.
포볼 에스터 P1585 1mg Sigma
로노마이신 10634 10634 Sigma
브레펠딘 A(1000x) 420601 420601 BioLegend
CD8 T 세포 분류 키트 48008 100 테스트 BioLegend
마우스 단핵구 풍부 키트 19761 109 세포 Stemcell
인산염 버퍼 SH30256.01 500mL Hyclone
혈청-제거 세포 동결보존 용액 C40100 100mL Suzhou Saimei Biotechnology Co., Ltd.
4% 파라포름알데하이드 G1101 500mL Wuhan Guge Biotechnology Co., Ltd.
뮤린 MCP-1 ELISA 분석 키트 88-7391-22 2x96 테스트 eBioscience
뮤린 IL12p70 ELISA 분석 키트 BMS6004 96 테스트 eBioscience
정제된 항-마우스 CD3 기능 등급 16-0032-85 500μg eBioscience
정제된 항-마우스 CD28 기능 등급 16-0281-85 500μg eBioscience
투과 버퍼(10x) 00-8333-56 100mL eBioscience
CFSE 65-0850 500μg eBioscience
CCR2 억제제(INCB 3344) HY50674 30mg Medchemexpress
3. 항체
본 발명의 실시예에 사용된 항체는 표 2에 도시된다.
명칭 클론 아이소타이프 제조사
APC/Cy7 항-마우스 CD3 17A2 래트 lgG2b, k BioLegend
PE/Cy7 항-마우스 CD4 RM4-5 래트 lgG2a, k BioLegend
FITC 항-마우스 CD8 53-6.7 래트 lgG2a, k eBioscience
APC 항-마우스 IFN-γ XMG1.2 래트 lgG1, k BioLegend
브릴리언트 바이올렛 421TM
항-마우스 IL-4		 11B11 래트 lgG1, k BioLegend
PE 항-마우스 IL-17A TC11-18H10.1 래트 lgG1, k BioLegend
브릴리언트 바이올렛 421TM
항-마우스 CD11b		 M1/70 래트 lgG2b, k BioLegend
FITC 항-마우스 CD11c HL3 햄스터 lgG BD
PE 항-마우스 Ly6G RB6-8C5 래트 lgG2b, k eBioscience
FITC 항-마우스 Ly6C HK1.4 BioLegend
알렉사 플루오르®647
항-마우스 CCR2		 SA203G11 래트 lgG2b, k BioLegend
FITC 항-마우스 F4/80 BM8 래트 lgG2a, k eBioscience
APC 항-마우스 CD80 16-10A1 햄스터 lgG eBioscience
브릴리언트 바이올렛 510TM
항-마우스 CD86		 GL-1 래트 lgG2b, k BioLegend
PE 항-마우스 MHC-I AF6.88.5.5.3 래트 lgG2b, k eBioscience
eVolveTM 655
항-마우스 MHCII		 M5/114.15.2 래트 lgG2b, k eBioscience
PE 항-마우스 IL-12 C17,8 래트 lgG2a, k eBioscience
PE 항-마우스 PDCA-1 eBio927 래트 lgG2b, k eBioscience
PE 항-마우스 Ki67 SolA15 래트 lgG2a, k eBioscience
4. 동물 그룹 및 면역화 전략은 표 3에 도시된다.
그룹(n=5) 투여량 비율
① PBS -
② GM-CSF 10μg
③ IFN-α 10000IU
④ VACCINE 1μg
⑤ GM-CSF/IFN-α 10μg/10000IU
⑥ GM-CSF/VACCINE 10μg/1μg
⑦ IFN-α/VACCINE 10000IU/1μg
⑧ GM-CSF/IFN-α/VACCINE 10μg/10000IU/1μg
⑨ 3xGM-CSF+VACCINE 10μg(하루 1회, 전체 3회) + 1μg
참고: VACCINE은 표 1의 CHO 재조합 B형 간염 백신 또는 효모 재조합 B형 간염 백신이다. VACCINE의 1회 투여량에서 항원의 양은 1ug이고 알루미늄 항원보강제의 양은 0.125mg이다(VACCINE의 투여량 비율은 총 질량을 기초로 한다). 그룹 ⑤, ⑥, ⑦, ⑧의 구성 요소를 계량하고 특히 혼합하고, 사용할 때까지 적어도 2시간 동안 4℃에 두었다.
5. 마우스 혈액 수집 및 혈청 준비
약 200μL의 혈액을 안와 부비동에서 약 200μL의 혈액을 수집하였다. 수집된 혈액을 37℃에서 40분 동안 배양하고, 4℃에서 30분 동안 3000rpm으로 원심 분리하였다. 혈청을 수집하여 -80℃에서 보관하였다.
6. ELISA에 의한 특이적 항체 역가 검출
항원을 2μg/mL로 희석하여 4℃에서 밤새 플레이트를 코팅하였다. 테스트할 마우스 혈청을 10배 구배 희석으로 희석하고, 100μl의 희석된 혈청을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 2차 항체 배양의 200μl/웰은 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 37℃에서 15분 동안 TMB 반응. 샘플의 OD 값에 따라, 항원-특이적 IgG의 역가를 계산하였다.
7. 지연형 과민증(DTH) 테스트
마우스에 100μL의 상응하는 약물을 피하 주사하였다. 마지막 면역화 후 7일째에, 마우스 풋패드에 마이크로 주사기를 사용하여 HBsAg(10μg/10μL)를 주사하고 대조군으로서 오른쪽 풋패드에 PBS 10μL를 주사하였다. 주사 후, 버니어 캘리퍼를 사용하여 풋패드 두께를 각각 24시간, 48시간 및 72시간에 측정하였다. 동일한 부위를 3회 측정하여 평균화하였다. DTH 공식: DTH 팽윤 두께(mm) = 왼발 풋패드 두께 (mm) - 오른쪽 풋패드 두께(mm).
8. 유세포 분석에 의한 세포내 사이토카인의 검출
마우스 비장을 무균적으로 제거하고 단일 세포 현탁액으로 제조하였다. 세포를 1 x 107 세포/ml로 조절하였다. HBsAg(최종 농도 10μg/ml)를 첨가하여 37℃에서 18시간 동안 비장 세포를 자극하고, 마지막 6시간 동안 브레펠딘 A(BFA)에 의해 차단하였고 포볼 에스테르(PMA) 100ng/ml 및 이오노마이신 1μg/ml을 양성 대조군으로 하였다. 적절한 형광 항체를 50μL 염색 시스템에 첨가하고, 세포 표면 항체를 4℃에서 30분 동안 염색한 후, 세포내 사이토카인 항체를 4℃에서 1.5시간 동안 배양하였다. BD 유세포 분석을 통한 검출에 의해, 결과는 FlowJo7.6 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
9. 카복시플루오레세인 다이아세테이트 숙신이미딜 에스터(CFSE)에 의한 T 세포 증식 분석
마우스 비장을 무균적으로 제거하고 단일 세포 현탁액으로 제조하였다. 세포를 1 x 107 세포/ml로 조절하였다. HBsAg(최종 농도의 10μg/ml)를 첨가하여 37℃에서 72시간 동안 비장 세포를 자극하고, 항-CD3 및 항-CD28(최종 농도 1μg/mL, 최종 농도 100ng/mL)을 양성 대조군으로 하였다. 세포를 항-CD3, 항-CD4 및 항-CD8로 염색하였다. T 세포의 증식은 유세포 분석에 의해 검출되었다. FlowJo 7.6 소프트웨어로 결과를 분석하였다.
10. DC2.4 세포 테스트
DC2.4 세포의 1 x 105 세포/웰을 6-웰 플레이트 상에 플레이팅하였다. 세포를 72시간 동안 37℃에서 5% CO2에서 각각 LPS(1μg/mL), GM-CSF(1μg/mL), IFN-α(100IU/mL), GM-CSF/IFN-α에 의해 자극하고, 브레펠딘 A(BFA)을 마지막 6시간 동안 첨가하였다. DC를 72시간 동안 배양한 후, 표면 분자 CD11b, CD80, CD86, MHC-1, MHC-II 및 세포내 사이토카인 IL12를 염색하고 유세포 분석에 의해 세포를 검출하였다.
11. 생체외 세포 독성 용해 분석
마우스 비장을 무균적으로 제거하고 단일 세포 현탁액으로 제조하였다. 이펙터 세포는 HBsAg(10μg/mL)의 CTL 펩타이드에 의해 37℃에서 72시간 동안 농축하였다. 표적 세포를 HBsAg(10μg/mL)의 CTL 펩타이드에 의해 1시간 동안 자극하였다. 이펙터 세포 대 표적 세포의 비는 50:1이었다. 반응 후, 세포를 프로피듐 아이오다 이드(PI)로 염색하고 유세포 분석에 의해 검출하였다.
12. 생체내 세포 독성 용해 분석
나이브 C57BL/6 공여자 마우스의 비장 세포를 15mM의 CFSE로 표지하고 1mg/mL의 S208-215(CFSEhigh 표적 세포로 정의)로 펄싱하였다. 동일 분율의 비장 세포를 1mM의 CFSE로 표지하고, 비-HBV 표적 대조군으로서 1mg/mL의 OVA257-264 (CFSElow 표적 세포로 정의)로 펄싱하였다. 1:1 비의 CFSEhigh 및 CFSElow 세포의 혼합물을 제 4 백신 접종 후 14일째에 마우스당 2x107 세포로 면역화된 수용자에게 정맥내로 전달시켰다. 8시간 후, 비장 세포를 수용자로부터 단리하고 CFSE 형광 강도를 분석하였다.
13. 면역조직화학(IHC) 분석
4차 면역화 후 14일째에, 해부된 간 샘플을 수집하고 파라핀 왁스에 삽입하기 전 3일 동안 4% 파라포름알데하이드에 고정시키고 5 내지 10mm 두께의 슬라이스로 절단하였다. 간 섹션을 조직학 분석을 위해 헤마톡실린-에오신으로 염색하고 IHC 분석을 위해 다클론 토끼 항체와 함께 배양하였다.
14. 통계 분석
스튜던트 t-테스트를 사용하여 통계 분석을 수행하였고 0.05 미만의 P 값은 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 1
IFN-α/GM-CSF/VACCINE은 야생형 마우스에서 체액성 및 세포성 면역을 유도한다.
1.1 GM-CSF, IFN-α 및 VACCINE의 최적 투여량 비율
3x GM-CSF + VACCINE 요법과 동일한 면역 치료 효과를 달성하도록 GM-CSF, IFN-α 및 VACCINE의 최적 투여량 비율을 결정하기 위해, 다양한 투여량 비율의 GM-CSF, IFN-α, 및 VACCINE을 검사하였다. 본 발명자는 CD11b+CD11c+ 세포의 수가 다른 비율과 비교하여 1μg의 백신과 혼합된 10μg의 GM-CSF 및 10,000IU의 IFN-α 요법에서 투여량 비율에서 유의하게 더 높다는 것을 발견하였다(도 1a). 본 발명자는 1μg의 VACCINE과 혼합된 10μg의 GM-CSF 및 10,000IU의 IFN-α에 의해 유도된 DTH 반응이 동물에서 3xGMCSF+VACCINE과 동일한 수준에 도달하였지만 다른 투여량 비율보다 유의하게 더 높다는 것을 발견하였다(도 1b). 우리는 또한 최고 수준의 항-HBsAg가 3xGM-CSF+VACCINE과 비교하여 이러한 투여량 비율을 갖는 GM-CSF/IFN-α/VACCINE 요법에 의해 달성됨을 발견하였다(도 1c). 이들 결과는 10μg의 GM-CSF, 10,000IU의 IFN-α 및 1μg의 VACCINE을 사용한 요법이 최적의 투여량 비율인 것을 입증한다.
구체적으로, 6-8 주령, 수컷 C57B/L6 마우스FMF 실시태양에서 선택한다. 첫 번째 실험에서는 3가지 투여량의 GM-CSF(10μg, 20μg 및 30μg), 3가지 투여량의 IFN-α(100IU, 1,000IU, 10,000IU) 및 HBV 백신 1μg를 각각 선택하였고, 3가지 성분을 혼합하고 0일 및 14일에 2회 면역화시켰다. 면역화 후 1, 2 및 3일에 말초 혈액 샘플을 수집하고, DC의 변화를 검출하고 분석하였다. DTH 및 HBsAb의 수준은 21일에 검출되었다. 실험 결과는 말초 혈액에서 CD11b+CD11c+DCs의 비율 및 DTH 및 항-HBsAg 반응의 수준이 10μg의 GM-CSF 및 10,000IU의 IFN-α 및 1μg의 HBV 백신의 조합에 의해 유의적으로 증가한 것으로 나타났다(도 1). CTL 반응 및 항-HBsAg 항체 수준은 동일한 현상을 나타내었다(데이터는 도시되지 않음).
10μg의 GM-CSF의 농도는 이전 실험에서 가장 낮았고, 5μg의 GM-CSF를 두 번째 투여량 찾기 실험에 추가하였다. 유사하게, 100,0000IU에서 고용량의 IFN-α를 제 2 투여량-찾기 실험에 첨가하였다. 결과는 도 2에 도시되어 있다. 다양한 용량의 IFN-α와 5μg GM-CSF의 조합에 의한 CD11b+CD11c+ DCs의 비율 및 항-HBsAg의 수준 및 DTH 반응은 다른 용량의 IFN-α와 조합된 10μg의 GM-CSF의 것보다 낮았다. 놀랍게도, 다양한 용량의 GM-CSF와 조합된 100,000IU의 IFN-α는 10,000IU 이하의 IFN-α의 것보다 CD11b+CD11c+ DCs의 비율 및 DTH 및 항-HBsAg의 수준에 대해 상당한 억제 효과를 나타내었다. 이 결과는 마우스 면역화를 위한 GM-CSF에 대한 최적의 투여량 비율은 10ug이고, IFN-α는 10,000IU인 것을 입증한다.
1.2 면역 반응에 대한 성분 처리 효과
실험은 플랜 A 그룹(면역화 직전에 GM-CSF, IFN-α 및 HBV 백신을 혼합)과 플랜 B 그룹(GM-CSF, IFN-α 및 HBV 백신 혼합하고 면역화 전 4℃에서 12시간 동안 보관)을 포함하였다. 각 그룹을 0일 및 14일 동안 2회 면역화하였고, 말초 혈액 및 림프절의 DC는 면역화 후 1일, 2일 및 3일에 테스트하였고, 항-HBsAg 수준은 21일에 검출하였다. 결과는 말초 혈액으로부터의 CD11b+CD11c+DC의 비율이 PBS 대조군의 것과 비교하여 플랜 A 및 B 그룹 모두에서 유의하게 더 높았다(P <0.01)는 것을 나타내었다. 그러나, 플랜 B 그룹은 플랜 A 그룹보다 높았다(도 3a). 플랜 A는 국소 림프절에서 CD11b+CD11c+DCs의 비율을 크게 증가시키지 않았지만, 플랜 B는 국소 림프절에서 CD11b+CD11c+DCs의 비율을 유의하게 증가시켰다(도 3b). 또한, 플랜 A 그룹에 의한 항-HBsAg 항체의 유도는 플랜 B 그룹보다 적었다(2136±165.2 mIU/mL v.s 3094±126.6 mIU/mL, P <0.01, 도 3c). 이들 결과는 GM-CSF, IFN-α 및 백신의 각 성분의 혼합 처리가 면역화 전에 4℃에서 적어도 12시간 동안 보다 유리하게 저장한다는 것을 입증한다.
1.3 면역화 후 마우스 DTH 반응
세포성 면역은 만성 B형 간염 바이러스의 치료에 중요한 역할을 하는데 이는 세포성 면역의 수준은 B형 간염을 제거하는 능력과 양의 상관관계가 있기 때문이다. DTH 테스트는 세포성 면역의 가장 편리하고 직접적인 평가이다. 도 4a에 나타낸 면역화 전략에 기초하여, HBsAg를 마우스 풋패드에 주입하여 표 3에 열거된 상이한 요법으로 면역화된 야생형 마우스의 DTH 반응을 테스트하였다. 결과는 VACCINE 단독, IFN-α/VACCINE, GM-CSF/VACCINE, 3xGM-CSF + VACCINE, IFN-α/GM-CSF/VACCINE은 모두 DTH 반응을 유도할 수 있다는 것을 나타내었다(도 4b). 상이한 요법을 비교하는 통계 분석으로서, (도 4c). DTH 반응은 3xGM-CSF/VACCINE 또는 IFN-α/GM-CSF/VACCINE을 가진 동물에서 24시간째에 가장 강한 것으로 나타났으며, 다른 그룹보다 현저하게 높았다(P <0.01). 그러나, 3xGM-CSF/VACCINE과 IFN-α/GM-CSF/VACCINE 면역화 사이에는 유의한 차이가 없었으며(P> 0.05), 이는 두 요법이 유사한 수준의 세포성 면역을 유도할 수 있음을 시사한다. 사용하기 쉬운 IFN-α/ GM-CSF/VACCINE의 단일 제형을 고려하면, IFN-α/GM-CSF/VACCINE 요법은 백신 전에 GM-CSF로 3일 전처리(3xGM-CSF/VACCINE) 보다 사용하는 데 이점을 가진다.
1.4 체액성 면역에 대한 IFN-α/GM-CSF/VACCINE의 효과
보호성 항체의 생산은 백신 효능을 평가하기 위한 황금 표준으로 간주된다.
각 요법 면역화 후 항-HBsAg 항체(HBsAb)의 역가를 테스트하였다. 결과는 GM-CSF, IFN-α 및 IFN-α/GM-CSF의 나이브 마우스 면역화가 HBsAb를 유도하지 않았음을 보여 주었다. VACCINE, GM-CSF/VACCINE, IFN-α/GM-CSF/VACCINE 및 3xGM-CSF/VACCINE은 다양한 수준의 HBsAb를 유도하였다. IFN-α/GM-CSF/VACCINE 그룹(2749±238.9 IU/L)의 HBsAb 수준은 3xGM-CSF/VACCINE 그룹(3016±196.2 IU/L)의 수준보다 약간 낮았지만 유의한 통계적 차이는 없었다(P> 0.05). 이 두 그룹의 HBsAb 수준은 VACCINE 그룹(918.4±43.28IU/L), GM-CSF/VACCINE 그룹(1665±45.94 IU/L) 및 IFN-α/VACCINE 그룹(1902±76.93IU/L, 도 2a)에 비해 크게 증가하였다. 또한, 데이터는 GM-CS/VACCINE 그룹 및 IFN-α/VACCINE 그룹이 VACCINE 그룹보다 높은 HBsAb를 생성할 수 있음을 보여 주었다(P <0.01). 결과는 3xGM-CSF+VACCINE 그룹과 IFN-α/GM-CSF/VACCINE 두 그룹은 더 높은 수준의 보호 HBsAb를 유도할 수 있음을 증명한다.
IgG2a/IgG1의 비는 Th1 또는 Th2 분극에 대한 숙주 면역 반응을 평가하는 데 사용될 수 있다. 도 5b 및 5c에 도시된 바와 같이, IgG2a:IgG1의 현저하게 더 높은 비는 다른 면역 그룹과 비교된 IFN-α/GM-CSF/VACCINE 및 3xGM-CSF+VACCINE 그룹과 관련이 있었고(P <0.05), 이는 IFN-α/GM-CSF/VACCINE 및 3xGM-CSF+VACCINE이 더 많은 Th1 유형의 반응을 촉진시키는 요법이라는 것을 나타낸다.
1.5 세포성 면역에 대한 IFN-α/GM-CSF/VACCINE의 효과
HBsAg-특이적 DTH 및 IgG1/IgG2a의 이전 결과에서, 본 발명자들은 IFN-α/GM-CSF/VACCINE 그룹 및 3xGM-CSF/VACCINE 그룹이 모두 세포성 면역을 효율적으로 촉진할 수 있는 반면, 세포성 면역의 중요성은 바이러스 감염을 제거하는 것이다.
HBsAg-특이적 세포성 면역의 수준은 다른 요법에서 추가로 조사하였다. 결과는 CD4+ T 세포의 IFN-γ, IL-4 및 IL-17의 유도 수준(도 6c) 및 CD8+ T 세포의 IFN-γ(도 6d)는 다른 그룹에 비해 IFN-α/GM-CSF/VACCINE 그룹 및 3xGM-CSF+VACCINE에서 현저하게 높았다는 것을 보여 주었다(P> 0.05). IFN-α/GM-CSF/VACCINE 그룹 및 3xGM-CSF+VACCINE 그룹 사이의 유의한 차이가 관찰되지 않았는데, 이는 두 요법 모두 T 세포가 유사한 수준의 사이토카인을 생성하도록 유도할 수 있음을 나타낸다.
1.6 면역화 후 T 세포 증식
T 림프구 증식은 세포성 면역 반응의 중요한 부분이다. T 세포 증식의 특정 수준은 특정 항원에 대한 면역을 반영한다. 이 연구에서, CFSE-표지법을 사용하여 HBsAg에 대한 T 세포 증식을 테스트하였다.
데이터는 IFN-α/GM-CSF/VACCINE 그룹에서 CD4+ T 세포 증식의 유도 수준이 3xGM-CSF + VACCINE과 비교하여 차이가 없었지만(P> 0.05; 도 7a), 다른 그룹보다 높았다(P <0.01). CD8+ T 림프구 증식 수준에 대해, IFN-α/GM-CSF/VACCINE 그룹은 GM-CSF/VACCINE 그룹, GM-CSF 그룹 및 VACCINE 그룹에서 보다 현저하게 높았지만(P <0.05) 3xGM-CSF+VACCINE, IFN-α/GM-CSF 및 IFN-α/VACCINE과 차이가 없다(P> 0.05; 도 7b). 이로부터, IFN-α/GM-CSF/VACCINE은 또한 유도된 3xGM-CSF+VACCINE과 유사한 수준에서 T 림프구 증식을 유의하게 촉진시킬 수 있다.
1.7 생체외 CTL 분석
CD8+ 세포질 세포(CTL)는 치료 백신의 기능을 평가하는 핵심 요소이다. HBV 지속성 감염에 있어서, HBV 항원-특이적 CTL은 감염된 세포로부터 HBV를 제거하는 주요 힘으로 간주된다. 이 연구에서, 본 발명자들은 생체외 CTL 분석을 사용하여 상이한 그룹에서 CD8+ T 세포의 세포독성을 조사하였다. 결과는 IFN-α/GM-CSF/VACCINE 및 3xGM-CSF+VACCINE에 의한 CTL의 유도된 수준이 다른 방법보다 20% 더 높다는 것을 보여 주었다(P <0.01, 도 8).
1.8 항원 제시 세포(APC)에 대한 영향
이전 실험에서, 본 발명자들은 IFN-α/GM-CSF/VACCINE 요법이 체액성 및 세포성 면역 반응을 보다 잘 자극하여, 항원 제시 세포(APC)를 효율적으로 활성화할 수 있음을 시사한다. APCs, 특히 수지상 세포(DC)는 선천성 및 적응성 면역 반응 사이를 연결하는 결정적인 역할을 한다. 따라서, 본 발명자들은 IFN-α/GM-CSF/VACCINE 요법이 DC의 기능에 크게 영향을 미칠 수 있다고 가정하였다.
먼저, 본 발명자들은 생체외에서 뮤린 골수 유래 DC2.4 세포를 테스트하였고 IFN-α/GM-CSF의 처리가 IFN-α 또는 GM-CSF 단독의 것과 비교하여 IL-12를 분비하는 데 DC를 상당히 개선시킬 수 있음을 발견하였다(도 9b). 생체내 실험에서, 본 발명자들은 혈청 IL-12p70의 농도가 다른 그룹에 비해 마우스에서 IFN-α/GM-CSF/VACCINE 또는 3xGM-CSF+VACCINE 면역 후 21일에 유의하게 증가함을 발견하였다 (도 9c).
또한, CD11b+CD11c+ DC의 빈도 및 절대 수, IFN-α/GM-CSF/VACCINE 요법에 의해 유도된 CD80 및 MHC-II의 발현은 IFN-α/GM-CSF, IFN-α/VACCINE, GM-CSF/VACCINE 또는 VACCINE 그룹에서 보다 유의하게 더 높다는 것을 관찰하였다(P <0.05). 이런 유도된 변화는 IFN-α/GM-CSF/VACCINE 그룹과 3xGM-CSF+VACCINE 그룹에서 가장 높았지만, 두 요법 사이에 유의한 차이는 없었다(도 10).
1.9 생체내 단핵 세포 분석
이전 결과에서 알 수 있듯이, IFN-α/GM-CSF/VACCINE 및 3xGM-CSF+VACCINE 요법은 DC의 수와 기능을 크게 증가시킬 수 있음을 입증하였다. 일반적으로, DC는 상수이다. CD11b+CD11c+ DC의 수가 증가하는 원인은 상이한 사이토카인 하에서 대 식세포 또는 수지상 세포로 계속 분화될 수 있기 때문에 단핵구의 전환 때문일 수 있다. 생체내 IFN-α/GM-CSF/VACCINE 요법에 의해 단핵구가 DC로 전환되는지를 찾기 위해, 동물을 다양한 요법으로 면역화시키고 면역화 전후에 단핵구를 분석하였다. 데이터는 IFN-α/GM-CSF/VACCINE 또는 3xGM-CSF+VACCINE 요법에 의해 처리된 말초 혈액으로부터의 CD11b+Ly6C+ 단핵구의 수가 다른 요법의 것보다 유의하게 더 높다는 것을 보여준다(P <0.05). 동시에, 이들 단핵구에서의 CD80 및 MHC-II의 발현 또한 유의하게 증가하였다(도 11). 또한, IFN-α/GM-CSF/VACCINE 및 3xGM-CSF+VACCINE 요법의 혈청에서 MCP-1의 농도는 ELISA 분석에 의해 면역화가 검출된 후 21일에 다른 면역화된 그룹의 것보다 유의하게 더 높았다(P <0.05).
1.10 요약
상기 실험 데이터는 IFN-α/GM-CSF/VACCINE이 3xGM-CSF+VACCINE 투여량과 동일한 면역 효과를 달성할 수 있음을 나타낸다. 최적의 투여량 및 제형에서 이 IFN-α/GM-CSF/VACCINE은 요법을 사용하기 쉬워지고, 따라서 3xGM-CSF+VACCINE의 번거로운 프로토콜에 비해 큰 이점을 제공한다. 최적화된 IFN-α/GM-CSF/VACCINE은 임상 응용분야에서 3xGM-CSF+VACCINE을 완전히 대체하여 임상적 이점을 얻을 수 있다.
실시예 2
IFN-α/GM-CSF/VACCINE은 rAAV-1.3HBV 마우스에서 면역 내성을 파괴한다
실시예 1에서, IFN-α/GM-CSF/VACCINE 및 3xGM-CSF+VACCINE은 야생형 마우스에서 체액성 및 세포성 반응을 자극하여 CD8+ T 세포의 HBV-특이적 CTL 활성을 유의하게 증가시킬 수 있다. 이들이 만성 B형 간염에서 면역 내성을 파괴하여 HBV를 제거할 수 있는지 테스트한다. 본 발명자들은 새로운 동물 모델을 채택하였다. 이 모델에서, 본 발명자들은 HBV 게놈의 1.3 복제물(AAV8-1.3HBV)을 보유한 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV)에 감염되어 HBV 유도 면역 내성을 확립하고 이 모델을 사용하여 최적화된 IFN-α/GM-CSF/VACCINE 요법의 효능을 평가하였다.
2.1 rAAV-1.3HBV 마우스 모델의 확립 및 검증
rAAV-1.3HBV 재조합 바이러스가 수컷 C57BL/6 마우스를 감염시킬 수 있는지 검증하기 위해, 꼬리 정맥을 통해 1x106 pfu/ml의 바이러스를 주사함으로써 모델이 확립되었다. 데이터는 혈청 샘플이 감염 후 양의 HBeAg(S/CO> 1), 667.9±80.39IU/mL의 HBsAg 및 205.6±28.92 복제물/mL의 HBV-DNA를 함유하였으며, 이는 PBS 대조군보다 현저하게 높다는 것을 보여 주었다(P <0.0001, 도 12). 감염된 마우스로부터의 알라닌 아미노 트랜스퍼라제(ALT)의 수준은 20.81±1.72U/L이었고, 이는 PBS 대조군(22.01±1.47 U/L)과 통계적으로 상이하지 않았다. 면역조직화학(IHC) 결과는 rAAV-1.3HBV 바이러스에 감염된 간세포에서만 HBcAg 양성이 관찰되었으며, HBcAg 양성 세포는 심장 및 신장에서 발견되지 않았다는 것을 보여주었다. H&E의 결과는 rAAV-1.3HBV에 감염된 간세포의 크기가 커졌지만 심근세포와 신장 세포에서는 뚜렷한 변화가 발견되지 않았다.
2.2 rAAV-1.3HBV 마우스 모델 모니터링
바이러스 지속성을 평가하기 위해, 바이러스 감염(wpi) 후 12주에 걸쳐 마우스를 지속적으로 모니터링하였다. HBsAg 및 바이러스 DNA의 발현은 12 wpi에 비해 현저한 감소 없이 안정적으로 유지되었다(도 13). 또한, 이 기간 동안 ALT의 혈청 수준은 PBS 그룹과 현저한 차이가 없었으며, 이는 rAAV-1.3HBV가 수컷 C57BL/6 마우스에서 지속적 감염일 수 있다는 것을 나타낸다.
2.3 B형 간염 마우스의 GM-CSF/IFN-α/VACCINE 치료
최적화된 요법이 이들 마우스로부터 B형 간염 바이러스 감염을 제거할 수 있는지 테스트하기 위해, 본 발명자들은 rAAV8-1.3HBV 감염 마우스 처리에 GM-CSF/IFN-α/VACCINE에 대한 최적화된 면역화 전략을 적용하였다. 감염된 마우스를 격주 간격으로 4회 동안 다양한 요법으로 면역화시키고, 혈청 샘플을 수집하여 각각의 표시된 시점에서 분석하였다. 본 발명자들은 GM-CSF/IFN-α/VACCINE 또는 3 x GM-CSF+VACCINE 그룹의 HBsAg의 혈청 수준이 다른 그룹과 비교하여 현저하게 감소하고 9 wpi에서 4회의 면역화 후 감소된 것을 관찰하였다(P <0.01, 도 14). HBeAg의 혈청 수준은 다른 그룹과 비교하여 GM-CSF/IFN-α/VACCINE 및 3xGM-CSF+VACCINE 치료 그룹 모두에서 7wpi에서 현저하게 감소되고 제거되었다(P <0.01). GM-CSF/IFN-α/VACCINE과 3xGM-CSF+VACCINE의 면역화는 면역 내성 동물에서 유사하고 강력한 치료 효과를 달성하며, 두 요법은 동물 모델에서 지속적인 HBV 감염을 제거하도록 유도하는 강력한 항-HBV 면역 반응을 유발할 수 있다는 것을 시사한다.
2.4 HBV 감염된 마우스로부터의 DC에 대한 GM-CSF/IFN-α/VACCINE의 영향
DCs 세포 특이적 세포성 면역을 촉진하는 데 결정적인 역할을 하기 때문에, 본 발명자들은 GM-CSF/IFN-α/VACCINE은 야생형 마우스에서 CD11b+CD11c+ DCs의 생산을 현저하게 촉진할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 rAAV8-1.3HBV 감염된 마우스에서 DC 생산에 대한 GM-CSF/IFN-α/VACCINE의 효과를 조사하고자 하였다.
GM-CSF/IFN-α/VACCINE 및 3xGM-CSF+VACCINE의 요법 둘 다는 다른 면역화된 그룹보다 현저하게 높은 CD11b+CD11c+ DCs의 생산을 상당히 촉진할 수 있었다(P <0.01, 도 15a-c). 또한, GM-CSF/IFN-α/VACCINE 및 3xGM-CSF+VACCINE 요법은 다른 면역화된 그룹보다 현저하게 높은 CD11b+CD11c+ DCs에 대한 CD86, MHC-I 및 MHC-II의 발현을 유도하였다(P <0.05 도 15d-e). GM-CSF/IFN-α/VACCINE의 치료는 CD11b+CD11c+ DCs 생산을 유도할뿐만 아니라 이러한 rAAV8-1.3HBV 감염 마우스에서 항원을 처리하는 DCs의 능력을 향상시킬 수 있다.
2.5 HBV 감염 마우스에서 단핵구에 대한 GM-CSF/IFN-α/VACCINE의 효과
GM-CSF/IFN-α/VACCINE은 야생형 마우스에서 CD11b+Ly6C+ 단핵구를 현저하게 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명자들은 HBV 감염 마우스에서 단핵구에 대한 GM-CSF/IFN-α/VACCINE 요법의 효과를 검증하려고 시도하였다.
GM-CSF/IFN-α/VACCINE 및 3xGM-CSF+VACCINE 요법은 GM-CSF, IFN-α, GM-CSF/IFN-α, GM-CSF/VACCINE 및 IFN-α/VACCINE 그룹(P <0.05) 및 PBS 및 VACCINE 그룹의 것(P <0.01, 도 16)과 비교된 CD11b+Ly6G-Ly6Chi 및 CD11b+Ly6G-Ly6Clo의 단핵구의 우수한 수준(P> 0.05)을 유도하였다. GM-CSF/IFN-α/VACCINE 그룹과 3xGM-CSF+VACCINE 그룹의 과립구 수는 다른 그룹보다 유의하게 높았다(P <0.01). CD11b+ Ly6G-Ly6Chi 단핵구는 염증에 대한 지표인 이들 단핵구에 대해 높은 수준의 CCR2hi를 유도하는 것으로 입증되었다; CD11b+Ly6G-Ly6Chi 단핵구는 CCR2lo 순환 단핵구와 관련이 있었다.
2.6 DC 분화를 위한 인간의 단핵구에 대한 GM-CSF/IFN-α의 효과
본 발명자들은 GM-CSF/IFN-α/VACCINE이 DCs와 단핵구의 생산을 촉진할 수 있음을 증명할 수 있기 때문에, DCs와 단핵구 사이에 직접적인 상관관계가 있는지 테스트할 것이다. 이를 위해, 인간 PBMCs로부터의 CD14+ 단핵구를 항-CD14 접합된 자기 비드에 의해 단리하고 각각 GM-CSF, IFN-α, GM-CSF/IFN-α 및 LPS로 자극하였다. 결과는 GM-CSF 및 IFN-α 모두 CD14+ 단핵구를 CD11c+DC 전환으로 촉진할 수 있으며, 조합의 효과는 이들 중 하나보다 더 엄격하다는 것을 보여주었다. GM-CSF 및 IFN-α의 조합은 또한 이들 중 하나보다 DCs에 대한 CD80, CD86, HLA-A2 및 HLA-DR의 발현을 촉진할 수 있다. 따라서, GM-CSF/IFN-α의 조합은 단핵구에서 DC 로의 전환을 촉진할뿐만 아니라 DC 성숙 및 기능성을 촉진시킨다.
2.7 HBV 감염 마우스에서 세포 면역에 대한 GM-CSF/IFN-α/VACCINE의 효과
DTH는 항원 특이적 세포 반응을 나타낸다. GM-CSF/IFN-α/VACCINE 및 3x GM-CSF + VACCINE 요법은 모두 HBV 감염 마우스에서 DTH 반응 및 다른 그룹에 비해 24시간(P <0.01)에서 가장 많은 반응을 유의하게 유발할 수 있다(도 17a).
T 세포 증식은 HBV 감염된 마우스에서 다른 그룹과 비교하여 GM-CSF/IFN-α/VACCINE 그룹 및 3xGM-CSF+VACCINE 그룹에 의해 현저하게 향상되었다(P <0.01, 도 17b).
GM-CSF/IFN-α/VACCINE 및 3xGM-CSF+VACCINE 그룹은 HBV 감염된 마우스에서 다른 그룹에 비해 높은 수준으로 CD4+ T 세포(Th1) 및 CD8+ T 세포(Tc1)를 생산하는 IFN-γ, CD4+ T 세포를 생산하는 IL-4를 촉진할 수 있었다(P <0.01, 도 17c & f).
간 조직에서 CD8 세포의 면역조직화학 분석에 의해, GM-CSF/IFN-α/VACCINE 및 3xGM-CSF+VACCINE 그룹 둘 다는 HBV 감염된 마우스의 다른 그룹보다 간으로 더 많은 CD8+ T 세포 침윤을 유도함을 관찰할 수 있었다(도 17g).
생체내 CTL 분석에서, GM-CSF/IFN-α/VACCINE 및 3xGM-CSF+VACCINE 그룹은 HBV 감염 마우스의 다른 그룹과 비교하여 HBV에 대해 상당히 높은 수준의 CTL을 유도할 수 있었다(45%)(도 17hi).
2.8 HBVHBV 감염 마우스에서 체액성 반응에 대한 GM-CSF/IFN-α/VACCINE 요법의 효과
rAAV8-1.3HBV 감염 마우스에서 체액성 면역 반응에 대한 GM-CSF/IFN-α/VACCINE 요법의 효과를 조사하기 위해, 동물을 격주 간격으로 4회 다양한 요법으로 면역화하고, 항-HBV 항체 반응을 테스트하고, HBeAg(도 18a) 및 HBsAg (도 18b) 및 HBV-DNA(도 18c)의 농도에 대해 분석하였다. 본 발명자들은 HBeAg 및 HBsAg의 두 수준이 모두 제거되고, HBV-DNA의 혈청 수준이 검출 한계 미만이고, 혈청 ALT가 다른 그룹과 비교하여 GM-CSF/IFN-α/VACCINE 또는 3xGM-CSF+VACCINE으로 4회의 면역화 후 약 3배 증가함을 관찰하였다. GM-CSF와 IFN-α의 조합은 더 높은 수준의 ALT를 유도하며, 이러한 조합은 간에서 더 높은 염증을 유도함을 시사한다. 간 면역조직화학의 분석은 간에서 HBcAg-양성 세포가 GM-CSF/IFN-α/VACCINE 및 3xGM-CSF+VACCINE 면역화 후 현저하게 감소한 것을 밝혔다(도 18e). 또한, 항-HBsAg 항체는 GM-CSF/IFN-α/VACCINE 및 3xGM-CSF+VACCINE 면역화된 그룹에서만 유도될 수 있었다. 항체 아형에 대한 추가의 조사는 IgG2a:IgG1> 1임을 나타내었고, 이는 강력한 세포 면역 반응이 유도되었음을 시사한다.
2.9 GM-CSF/IFN-α/VACCINE 요법에 대한 Ly6ChiCCR2hi 단핵구의 차단 효과
GM-CSF/IFN-α/VACCINE은 rAAV8-1.3HBV 감염된 동물의 말초 혈액에서 CD11b+Ly6G-Ly6ChiCCR2hi 단핵구를 촉진할 수 있고, 궁극적으로 HBV 제거인 세포성 및 체액성 반응과 관련이 있다. Ly6C hi CCR2 hi 단핵구가 면역 활성화의 맥락에서 특히 중요하고 면역 내성을 깨뜨리는지를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 동일한 동물 모델에서 CCR2 기능을 차단하기 위해 CCR2 억제제를 사용하였다.
본 발명자들은 먼저 말초 혈액으로부터의 CD11b+Ly6ChiCCR2hi 단핵구 및 CD11b+CD11c+ DC의 비율은 차단되지 않은 그룹의 것보다 CCR2 억제제(INCB3344)로 차단된 생체내에서 현저하게 더 낮다는 것을 발견하였다(도 19a-b). 한편, IFN-γ- 생산 CD8+ T 세포 및 혈청 ALT는 차단되지 않은 그룹보다 CCR2 억제제로 치료된 동물에서 현저하게 더 낮았다. 또한, 본 발명자들은 CCR2 억제제 또는 PBS 대조군으로 치료된 동물에서 HBsAg 및 HBV-DNA의 혈청 수준이 약간 변화됨을 발견하였다. 마지막으로, 간 면역조직화학의 결과는 차단되지 않은 그룹과 비교하여 CCR2 억제제로 치료된 동물에서 HBcAg-양성 세포의 제거가 심각하게 억제됨을 나타내었다.
실시예 3
항종양 면역 반응에 대한 GM-CSF/IFNα-2b/VACCINE의 효과를 입증하기 위해, 본 발명자들은 전립선암 에피토프 펩타이드 서열 중 하나(PAP, 서열 : SEQ ID NO. 1에 나타낸 바와 같은 CMSAMTNLAALFPPEG)를 백신 항원으로 선택하였다. 선택된 전립선암 에피토프 펩타이드(PAP)를 먼저 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 소 혈청 알부민(BSA)과 접합시켰다. 정제 후, 50μg의 접합 항원을 4℃에서 10μg GM-CSF 및 10,000 IU IFNα-2b와 혼합한 후, 수산화 알루미늄 항원보강제로 제제화하였다. 제제화된 백신을 사용하여 BALB/c 마우스를 일주일에 2번씩 2회 피하 면역시켰다. 대조군으로서, 50㎍의 접합된 항원을 알루미늄 항원보강제에서 제제화하고 일주일에 2번씩 2회 피하 BALB/c 마우스를 면역화시켰다. 전립선암 에피토프 펩타이드(PAP)를 BSA와 접합시키고 상기 GM-CSF/IFNα-2b 및 알루미늄 항원보강제와 함께 제제화하였다. 면역화 방식은 위에서 언급한 일정 및 경로와 동일하였다. 면역화 2주 후, 마우스의 혈청 샘플을 ELISA 분석을 위해 항원 특이적 체액성 반응의 수준, 지연형 과민증(DTH) 분석을 위해 10μg 접합 항원이 주사된 풋패드를 조사하였다. 본 발명자들은 전립선 종양 항원에 대한 항체(도 20a) 및 DTH(도 20b)의 수준이 대조군보다 GM-CSF/IFNα-2b/접합된 PAP 백신으로 면역화된 동물에서 현저하게 더 높다는 것을 관찰하였다.
실시예 4
항종양 면역 반응에 대한 GM-CSF/IFNα-2b/VACCINE의 효과를 입증하기 위해, 본 발명자들은 유방암 에피토프 펩타이드 서열 중 하나(WT1, 서열 : SEQ ID NO. 2에 나타낸 바와 같은 CYTWNQMNLSLGEQQYSV)를 백신 항원으로 선택하였다. 선택된 유방암 에피토프 펩타이드(WT1)를 먼저 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 소 혈청 알부민(BSA)과 접합시켰다. 정제 후, 50μg의 접합 항원을 4℃에서 10μg GM-CSF 및 10,000 IU IFNα-2b와 혼합한 후, 수산화 알루미늄 항원보강제로 제제화하였다. 제제화된 백신을 사용하여 BALB/c 마우스를 일주일에 2번씩 2회 피하 면역시켰다. 대조군으로서, 50㎍의 접합된 항원을 알루미늄 항원보강제에서 제제화하고 일주일에 2번씩 2회 피하 BALB/c 마우스를 면역화시켰다. 유방암 에피토프 펩타이드(WT1)를 BSA와 접합시키고 상기 GM-CSF/IFNα-2b 및 알루미늄 항원보강제와 함께 제제화하였다. 면역화 방식은 위에서 언급한 일정 및 경로와 동일하였다. 면역화 2주 후, 마우스의 혈청 샘플을 ELISA 분석을 위해 항원 특이적 체액성 반응의 수준, 지연형 과민증(DTH) 분석을 위해 10μg 접합 항원이 주사된 풋패드를 조사하였다. 본 발명자들은 유방암 항원에 대한 항체(도 21a) 및 DTH(도 21b)의 수준이 대조군보다 GM-CSF/IFNα-2b/접합된 WT1 백신으로 면역화된 동물에서 현저하게 더 높다는 것을 관찰하였다.
실시예 5
항종양 면역 반응에 대한 GM-CSF/IFNα-2b/VACCINE의 효과를 입증하기 위해, 본 발명자들은 결장 직장암 에피토프 펩타이드 서열 중 하나(CEA, 서열 : SEQ ID NO. 3에 나타낸 바와 같은 YLSGADLNLC)를 백신 항원으로 선택하였다. 선택된 결장 직장암 에피토프 펩타이드(CEA)를 먼저 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 소 혈청 알부민(BSA)과 접합시켰다. 정제 후, 50μg의 접합 항원을 4℃에서 10μg GM-CSF 및 10,000 IU IFNα-2b와 혼합한 후, 수산화 알루미늄 항원보강제로 제제화하였다. 제제화된 백신을 사용하여 BALB/c 마우스를 일주일에 2번씩 2회 피하 면역시켰다. 대조군으로서, 50㎍의 접합된 항원을 알루미늄 항원보강제에서 제제화하고 일주일에 2번씩 2회 피하 BALB/c 마우스를 면역화시켰다. 결장 직장암 에피토프 펩타이드(CEA)를 BSA와 접합시키고 상기 GM-CSF/IFNα-2b 및 알루미늄 항원보강제와 함께 제제화하였다. 면역화 방식은 위에서 언급한 일정 및 경로와 동일하였다. 면역화 2주 후, 마우스의 혈청 샘플을 ELISA 분석을 위해 항원 특이적 체액성 반응의 수준, 지연형 과민증(DTH) 분석을 위해 10μg 접합 항원이 주사된 풋패드를 조사하였다. 본 발명자들은 결장 직장암 항원에 대한 항체(도 22a) 및 DTH(도 22b)의 수준이 대조군보다 GM-CSF/IFNα-2b/접합된 CEA 백신으로 면역화된 동물에서 현저하게 더 높다는 것을 관찰하였다.
실시예 6
항종양 면역 반응에 대한 GM-CSF/IFNα-2b/VACCINE의 효과를 입증하기 위해, 본 발명자들은 결장 직장암 에피토프 펩타이드 서열 중 하나(E6, 서열 : SEQ ID NO. 4에 나타낸 바와 같은 DKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQLC)를 백신 항원으로 선택하였다. 선택된 결장 직장암 에피토프 펩타이드(E6)를 먼저 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 소 혈청 알부민(BSA)과 접합시켰다. 정제 후, 50μg의 접합 항원을 4℃에서 10μg GM-CSF 및 10,000 IU IFNα-2b와 혼합한 후, 수산화 알루미늄 항원보강제로 제제화하였다. 제제화된 백신을 사용하여 BALB/c 마우스를 일주일에 2번씩 2회 피하 면역시켰다. 대조군으로서, 50㎍의 접합된 항원을 알루미늄 항원보강제에서 제제화하고 일주일에 2번씩 2회 피하 BALB/c 마우스를 면역화시켰다. 결장 직장암 에피토프 펩타이드(E6)를 BSA와 접합시키고 상기 GM-CSF/IFNα-2b 및 알루미늄 항원보강제와 함께 제제화하였다. 면역화 방식은 위에서 언급한 일정 및 경로와 동일하였다. 면역화 2주 후, 마우스의 혈청 샘플을 ELISA 분석을 위해 항원 특이적 체액성 반응의 수준, 지연형 과민증(DTH) 분석을 위해 10μg 접합 항원이 주사된 풋패드를 조사하였다. 본 발명자들은 결장 직장암 항원에 대한 항체(도 23a) 및 DTH(도 23b)의 수준이 대조군보다 GM-CSF/IFNα-2b/접합된 E6 백신으로 면역화된 동물에서 현저하게 더 높다는 것을 관찰하였다.
실시예 7
항종양 면역 반응에 대한 GM-CSF/IFNα-2b/VACCINE의 효과를 입증하기 위해, 본 발명자들은 간세포 암종(HCC) 에피토프 펩타이드 서열 중 하나(Trp, 서열 : SEQ ID NO. 5에 나타낸 바와 같은 CRPGWRAACNQKIL)를 백신 항원으로 선택하였다. 선택된 간세포 암종 에피토프 펩타이드(Trp)를 먼저 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 소 혈청 알부민(BSA)과 접합시켰다. 정제 후, 50μg의 접합 항원을 4℃에서 10μg GM-CSF 및 10,000 IU IFNα-2b와 혼합한 후, 수산화 알루미늄 항원보강제로 제제화하였다. 제제화된 백신을 사용하여 BALB/c 마우스를 일주일에 2번씩 2회 피하 면역시켰다. 대조군으로서, 50㎍의 접합된 항원을 알루미늄 항원보강제에서 제제화하고 일주일에 2번씩 2회 피하 BALB/c 마우스를 면역화시켰다. 간세포 암종 에피토프 펩타이드(Trp)를 BSA와 접합시키고 상기 GM-CSF/IFNα-2b 및 알루미늄 항원보강제와 함께 제제화하였다. 면역화 방식은 위에서 언급한 일정 및 경로와 동일하였다. 면역화 2주 후, 마우스의 혈청 샘플을 ELISA 분석을 위해 항원 특이적 체액성 반응의 수준, 지연형 과민증(DTH) 분석을 위해 10μg 접합 항원이 주사된 풋패드를 조사하였다. 본 발명자들은 HCC암 항원에 대한 항체(도 24a) 및 DTH(도 24b)의 수준이 대조군보다 GM-CSF/IFNα-2b/접합된 HCC 백신으로 면역화된 동물에서 현저하게 더 높다는 것을 관찰하였다.
실시예 8
항종양 면역 반응에 대한 GM-CSF/IFNα-2b/VACCINE의 효과를 입증하기 위해, 본 발명자들은 다발성 골수종 에피토프 펩타이드 서열 중 하나(MAGE-A3, 서열 : SEQ ID NO. 6에 나타낸 바와 같은 KVAELVHFLFLWGPRALVC)를 백신 항원으로 선택하였다. 선택된 다발성 골수종 에피토프 펩타이드(MAGE-A3)를 먼저 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 소 혈청 알부민(BSA)과 접합시켰다. 정제 후, 50μg의 접합 항원을 4℃에서 10μg GM-CSF 및 10,000 IU IFNα-2b와 혼합한 후, 수산화 알루미늄 항원보강제로 제제화하였다. 제제화된 백신을 사용하여 BALB/c 마우스를 일주일에 2번씩 2회 피하 면역시켰다. 대조군으로서, 50㎍의 접합된 항원을 알루미늄 항원보강제에서 제제화하고 일주일에 2번씩 2회 피하 BALB/c 마우스를 면역화시켰다. 다발성 골수종 에피토프 펩타이드(MAGE-A3)를 BSA와 접합시키고 상기 GM-CSF/IFNα-2b 및 알루미늄 항원보강제와 함께 제제화하였다. 면역화 방식은 위에서 언급한 일정 및 경로와 동일하였다. 면역화 2주 후, 마우스의 혈청 샘플을 ELISA 분석을 위해 항원 특이적 체액성 반응의 수준, 지연형 과민증(DTH) 분석을 위해 10μg 접합 항원이 주사된 풋패드를 조사하였다. 본 발명자들은 다발성 흑색종 암 항원에 대한 항체(도 25a) 및 DTH(도 25b)의 수준이 대조군보다 GM-CSF/IFNα-2b/접합된 MAGE-A3 백신으로 면역화된 동물에서 현저하게 더 높다는 것을 관찰하였다.
실시예 9
항종양 면역 반응에 대한 GM-CSF/IFNα-2b/VACCINE의 효과를 입증하기 위해, 본 발명자들은 신장 세포 암종 에피토프 펩타이드 서열 중 하나(hTERT, 서열 : SEQ ID NO. 7에 나타낸 바와 같은 EARPALLTSRLRFIPKC)를 백신 항원으로 선택하였다. 선택된 신장 세포 암종 에피토프 펩타이드(hTERT)를 먼저 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 소 혈청 알부민(BSA)과 접합시켰다. 정제 후, 50μg의 접합 항원을 4℃에서 10μg GM-CSF 및 10,000 IU IFNα-2b와 혼합한 후, 수산화 알루미늄 항원보강제로 제제화하였다. 제제화된 백신을 사용하여 BALB/c 마우스를 일주일에 2번씩 2회 피하 면역시켰다. 대조군으로서, 50㎍의 접합된 항원을 알루미늄 항원보강제에서 제제화하고 일주일에 2번씩 2회 피하 BALB/c 마우스를 면역화시켰다. 신장 세포 암종 에피토프 펩타이드(hTERT)를 BSA와 접합시키고 상기 GM-CSF/IFNα-2b 및 알루미늄 항원보강제와 함께 제제화하였다. 면역화 방식은 위에서 언급한 일정 및 경로와 동일하였다. 면역화 2주 후, 마우스의 혈청 샘플을 ELISA 분석을 위해 항원 특이적 체액성 반응의 수준, 지연형 과민증(DTH) 분석을 위해 10μg 접합 항원이 주사된 풋패드를 조사하였다. 본 발명자들은 신장 세포 암종 항원에 대한 항체(도 26a) 및 DTH(도 26b)의 수준이 대조군보다 GM-CSF/IFNα-2b/접합된 hTERT 백신으로 면역화된 동물에서 현저하게 더 높다는 것을 관찰하였다.
실시예 10
항종양 면역 반응에 대한 GM-CSF/IFNα-2b/VACCINE의 효과를 입증하기 위해, 본 발명자들은 연쇄상 구균 타입 A 항원 에피토프 펩타이드 서열 중 하나(J8, 서열 : SEQ ID NO. 8에 나타낸 바와 같은 QAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQC)를 백신 항원으로 선택하였다. 선택된 연쇄상 구균 타입 A 항원 에피토프 펩타이드(J8)를 먼저 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 소 혈청 알부민(BSA)과 접합시켰다. 정제 후, 50μg의 접합 항원을 4℃에서 10μg GM-CSF 및 10,000 IU IFNα-2b와 혼합한 후, 수산화 알루미늄 항원보강제로 제제화하였다. 제제화된 백신을 사용하여 BALB/c 마우스를 일주일에 2번씩 2회 피하 면역시켰다. 대조군으로서, 50㎍의 접합된 항원을 알루미늄 항원보강제에서 제제화하고 일주일에 2번씩 2회 피하 BALB/c 마우스를 면역화시켰다. 연쇄상 구균 타입 A 항원 에피토프 펩타이드(J8)를 BSA와 접합시키고 상기 GM-CSF/IFNα-2b 및 알루미늄 항원보강제와 함께 제제화하였다. 면역화 방식은 위에서 언급한 일정 및 경로와 동일하였다. 면역화 2주 후, 마우스의 혈청 샘플을 ELISA 분석을 위해 항원 특이적 체액성 반응의 수준, 지연형 과민증(DTH) 분석을 위해 10μg 접합 항원이 주사된 풋패드를 조사하였다. 본 발명자들은 연쇄상 구균 타입 A 항원에 대한 항체(도 27a) 및 DTH(도 27b)의 수준이 대조군보다 GM-CSF/IFNα-2b/접합된 J8 백신으로 면역화된 동물에서 현저하게 더 높다는 것을 관찰하였다.
실시예 11
항종양 면역 반응에 대한 GM-CSF/IFNα-2b/VACCINE의 효과를 입증하기 위해, 본 발명자들은 HIV 에피토프 펩타이드 서열 중 하나(C4-V3, 서열 : SEQ ID NO. 9에 나타낸 바와 같은 KQIINMWQEVGKAMYARPNCNTRKSIHIGPGRAFYTTGEIIC)를 백신 항원으로 선택하였다. 선택된 HIV 에피토프 펩타이드(C4-V3)를 먼저 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 소 혈청 알부민(BSA)과 접합시켰다. 정제 후, 50μg의 접합 항원을 4℃에서 10μg GM-CSF 및 10,000 IU IFNα-2b와 혼합한 후, 수산화 알루미늄 항원보강제로 제제화하였다. 제제화된 백신을 사용하여 BALB/c 마우스를 일주일에 2번씩 2회 피하 면역시켰다. 대조군으로서, 50㎍의 접합된 항원을 알루미늄 항원보강제에서 제제화하고 일주일에 2번씩 2회 피하 BALB/c 마우스를 면역화시켰다. HIV 에피토프 펩타이드(C4-V3)를 BSA와 접합시키고 상기 GM-CSF/IFNα-2b 및 알루미늄 항원보강제와 함께 제제화하였다. 면역화 방식은 위에서 언급한 일정 및 경로와 동일하였다. 면역화 2주 후, 마우스의 혈청 샘플을 ELISA 분석을 위해 항원 특이적 체액성 반응의 수준, 지연형 과민증(DTH) 분석을 위해 10μg 접합 항원이 주사된 풋패드를 조사하였다. 본 발명자들은 HIV 항원에 대한 항체(도 28a) 및 DTH(도 28b)의 수준이 대조군보다 GM-CSF/IFNα-2b/접합된 C4-V3 백신으로 면역화된 동물에서 현저하게 더 높다는 것을 관찰하였다.
실시예 12
항종양 면역 반응에 대한 GM-CSF/IFNα-2b/VACCINE의 효과를 입증하기 위해, 본 발명자들은 2개의 추가 HBV 폴리펩타이드(SEQ ID NO. 10에 나타낸 바와 같은 코돈 최적화 PreS 및 SEQ ID NO. 11에 나타낸 바와 같은 이의 cDNA 서열 및 SEQ ID NO. 12에 나타낸 바와 같은 코돈 최적화 PreS1)를 백신 항원으로 선택하였다. 50μg의 접합 항원을 4℃에서 10μg GM-CSF 및 10,000 IU IFNα-2b와 혼합한 후, 수산화 알루미늄 항원보강제로 제제화하였다. 제제화된 백신을 사용하여 BALB/c 마우스를 일주일에 2번씩 2회 피하 면역시켰다. 대조군으로서, 50㎍의 접합된 항원을 알루미늄 항원보강제에서 제제화하고 일주일에 2번씩 2회 피하 BALB/c 마우스를 면역화시켰다.
각각 1ug의 PreS 또는 1ug의 PreS1을 4℃에서 10μg GM-CSF 및 10,000IU IFNα-2b와 혼합한 후, 수산화 알루미늄 항원보강제로 제제화하였다. 6-8 주령의 암컷 Balb/c 마우스를 각각 GM-CSF/IFN-α/PreS 또는 GM-CSF/IFN-α/PreS1로 피하로 2주 간격으로 3회 면역화시켰다. 대조군은 PreS 또는 PreS1 단독으로 면역화하였다. 체액성 반응의 수준은 각 면역화 전후에 ELISA에 의해 검출하였다. 항-PreS1 또는 PreS 특이적 항체의 수준은 도 29에 도시된 바와 같이 대조군의 수준보다 상당히 높았다.
본 발명은 바람직한 실시태양과 관련하여 설명되었지만, 당업자는 본 발명이 첨부된 청구 범위의 사상 및 범위 내에서 수정하여 실시될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 전술한 실시태양에 제한되지 않아야 하고, 여기에 제공된 설명의 사상 및 범위 내에서 모든 수정 및 균등물을 더 포함해야 한다.

Claims (33)

  1. 적어도 재조합 인터페론 및 재조합 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자를 포함하는 면역 증강제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    재조합 인터페론의 함량 대 재조합 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자의 함량의 비는 (약 0.1 x 104 IU - 약 5 x 106 IU) 대 (약 1μg - 약 200μg)인 면역 증강제.
  3. 제 1 항에 있어서,
    재조합 인터페론의 함량 대 재조합 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자의 함량의 비는 (약 0.5 x 104 IU - 약 1 x 105 IU) 대 (약 5μg - 약 50μg)인 면역 증강제.
  4. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    재조합 인터페론은 인터페론 알파인 면역 증강제.
  5. 적어도 항원 및 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 면역 증강제를 포함하는 면역치료 약학적 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    재조합 인터페론은 인터페론 알파-2a인 면역치료 약학적 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서,
    항원은 재조합 단백질 항원을 포함하는 면역치료 약학적 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서,
    재조합 인터페론의 함량 대 재조합 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자의 함량의 비는 (약 0.5 x 104 IU - 약 1 x 105 IU) 대 (약 5μg - 약 20μg)인 면역치료 약학적 조성물.
  9. 제 5 항에 있어서,
    재조합 인터페론의 함량 대 재조합 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자의 함량의 비는 약 1 x 104 IU 대 약 10μg인 면역치료 약학적 조성물.
  10. 제 7 항에 있어서,
    재조합 단백질 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 기생 항원 및 종양 항원 중 적어도 하나인 면역치료 약학적 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    바이러스 항원은 HBV 항원, 헤르페스 바이러스 항원, HPV 항원, HIV 항원, 메르켈 세포 바이러스 항원, 인플루엔자 항원 및 RSV 항원 중 적어도 하나인 면역치료 약학적 조성물.
  12. 제 7 항에 있어서,
    재조합 단백질 항원은 불활성화 백신 항원, 약독화 백신 항원 또는 서브유닛 백신 항원인 면역치료 약학적 조성물.
  13. 제 7 항에 있어서,
    재조합 단백질 항원은 유전자 조작 재조합 항원인 면역치료 약학적 조성물.
  14. 제 5 항에 있어서,
    면역치료 약학적 조성물은 약학적으로 또는 면역학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 더 포함하는 면역치료 약학적 조성물.
  15. 제 5 항의 면역치료 약학적 조성물의 제조 방법으로서,
    항원, 재조합 인터페론, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 및 약학적으로 또는 면역학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 무균 조건하에서 혼합하여 면역치료 약학적 조성물을 생산하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 대상에 대한 항원의 투여 이전 또는 항원(들)의 투여 동안 안전하고 치료적으로 유효한 양의 면역 증강제를 투여하는 것을 포함하는 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 면역 증강제의 용도.
  17. 제 16 항에 있어서,
    투여는 적어도 점막 투여 또는 주사 투여를 포함하는 용도.
  18. 제 16 항에 있어서,
    대상은 포유동물인 용도.
  19. 면역치료 약물의 제조에서의 제 5 항의 면역치료 약학적 조성물의 용도로서,
    상기 용도는:
    (1) 단핵구 생산을 촉진하는 단계;
    (2) 단핵구 CCR2의 발현을 촉진하는 단계;
    (3) 표현형 CD11b+ CD11c+를 사용하여 Ly6ChiCCR2+ 단핵구의 DC로의 분화를 촉진하는 단계;
    (4) 대상의 세포 면역 및 CTL 세포 용해 기능을 개선하는 단계; 및
    (5) 대상의 체액 면역성 및 하나 또는 여러 개의 보호 항체의 생산을 촉진하는 단계를 포함하는 용도.
  20. 제 19 항에 있어서,
    용도는 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염 및 종양 중 하나 이상의 예방 또는 치료를 포함하는 용도.
  21. 제 20 항에 있어서,
    바이러스 감염은 인간 간염 바이러스 감염, 헤르페스 바이러스 감염, 인간 파필로마 바이러스 감염, 인간 면역결핍 바이러스 감염, 메르켈 세포 바이러스 감염, 인플루엔자 바이러스 감염 및 호흡기 세포 융합 바이러스 감염 중 하나 이상을 포함하는 용도.
  22. 제 20 항에 있어서,
    바이러스 감염은 만성 B형 간염인 용도.
  23. 제 19 항에 있어서,
    항원이 B형 간염 표면 항원이고 면역치료 약학적 조성물은 면역 내성을 깨뜨리고, 감염된 간세포, HBeAg 및 HBsAg를 제거하고, 항-HBs Ab를 생산하는 용도.
  24. 제 19 항에 있어서,
    항원이 종양 항원이고 면역치료 약학적 조성물은 항-종양 면역 반응을 유도하는 용도.
  25. 제 24 항에 있어서,
    종양 항원은 전립선암 항원 폴리펩타이드 또는 에피토프 펩타이드, 유방암 항원 폴리펩타이드 또는 에피토프 펩타이드, 결장 직장암 항원 폴리펩타이드 또는 에피토프 펩타이드, 자궁 경부암 폴리펩타이드 또는 에피토프 펩타이드, 간암 폴리펩타이드 또는 에피토프 펩타이드, 다발성 골수종 폴리펩타이드 또는 에피토프 펩타이드 및 신장 세포 암종 폴리펩타이드 또는 에피토프 펩타이드 중 적어도 하나를 포함하는 용도.
  26. 제 19 항에 있어서,
    항원이 연쇄상 구균 항원 중 하나이고 면역치료 약학적 조성물은 항균성 감염을 일으키는 면역 반응을 유도하는 용도.
  27. 제 26 항에 있어서,
    연쇄상 구균 항원은 변형 연쇄상 구균 타입 A 에피토프 펩타이드인 용도.
  28. 제 19 항에 있어서,
    항원이 HIV 항원의 하나이고 면역치료 약학적 조성물은 항-HIV 감염을 일으키는 면역 반응을 유도하는 용도.
  29. 제 28 항에 있어서,
    HIV 항원은 HIV 에피토프 펩타이드인 용도.
  30. 제 19 항에 있어서,
    항원이 메르켈 세포 바이러스 항원의 하나이고 면역치료 약학적 조성물은 항-메르켈 세포 바이러스 감염을 일으키는 면역 반응을 유도하는 용도.
  31. 제 30 항에 있어서,
    메르켈 세포 바이러스 항원은 메르켈 세포 폴리펩타이드의 하나인 용도.
  32. 제 19 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    용도는 안전하고 치료학적 유효량의 면역치료 약학적 조성물을 면역화될 대상에게 투여하는 것을 포함하는 용도.
  33. 제 30 항에 있어서,
    대상은 포유류인 용도.
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