具体实施方式
在一个实施方式中,本发明提供了适于对犬给药的单价疫苗,其能防治犬发生由支气管炎博德特氏杆菌引起的疾病。本发明的单价疫苗包括重组产生的支气管炎博德特氏杆菌p68抗原和兽医学可接受的载体,如佐剂。
在另一个实施方式中,本发明提供了防止犬发生由支气管炎博德特氏杆菌引起的疾病的方法,其通过给予犬包括重组产生的支气管炎博德特氏杆菌p68抗原和兽医学可接受的载体(如佐剂)的单价疫苗。
在又一个实施方式中,本发明提供了适于对犬给药的联合疫苗。本发明的联合疫苗包括重组产生的支气管炎博德特氏杆菌p68抗原与至少一种其它抗原,该抗原能在犬中引发保护性免疫反应,防止发生由这些其它抗原引起的疾病。本发明的另一个实施方式包括来自犬科病原体的两种或多种抗原,它们能在犬中引发保护性免疫反应,防止发生由这些病原体引起的疾病。
本发明优选的联合疫苗包括犬瘟热(CD)病毒、2型犬腺病毒(CAV-2)、犬副流感病毒(CPI)及犬细小病毒(CPV)的减毒株;犬冠状病毒(CCV)株的灭活制剂;和四种钩端螺旋体血清型(犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、出血性黄疸型钩端螺旋体及波摩那钩端螺旋体)的制剂。
本发明另一种优选的联合疫苗包括犬瘟热(CD)病毒、2型犬腺病毒(CAV-2)、犬副流感病毒(CPI)及犬细小病毒(CPV)的减毒株;犬冠状病毒(CCV)株的灭活制剂;五种钩端螺旋体血清型(布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、出血性黄疸型钩端螺旋体及波摩那钩端螺旋体)的制剂。
本发明又一种优选的联合疫苗包括CD病毒、CAV-2、CPI病毒、CPV株的减毒株;和四种钩端螺旋体血清型(犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、出血性黄疸型钩端螺旋体及波摩那钩端螺旋体)的制剂。
本发明另一种优选的联合疫苗包括CD病毒、CAV-2、CPI病毒、CPV株的减毒株;及犬钩端螺旋体和出血性黄疸型钩端螺旋体的制剂。
本发明又一种优选的联合疫苗包括CD病毒、CAV-2、CPI病毒、CPV株的减毒株;和五种钩端螺旋体血清型(布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、出血性黄疸型钩端螺旋体及波摩那钩端螺旋体)的制剂。
本发明也提供了通过给予犬本发明的联合疫苗来防止犬发生由犬科病原体所引起的疾病的方法。
为了清晰地公开且不由其所限制,将本发明的详细说明划分成下面的小节来描述或说明本发明的某些特征、实施方式或应用。
定义及缩写
在此使用的术语“防止犬发生由犬科病原体所引起的疾病”是指减低或消除由病原体感染的风险、改善或减轻感染症状、或促进从感染状态的康复。例如,如果病毒或细菌负荷降低、病毒或细菌播散减少、感染发生率或持续时间减少、急性期血清蛋白水平下降、直肠温度降低、和/或食物摄取和/或发育增加时,则实现了保护作用。
术语“p68抗原”是指具由SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳所确定分子量为68kDa的蛋白质,其被p68特异单克隆抗体Bord 2-7(ATCC#)识别,且具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1基本相同的氨基酸序列。
术语“基本相同”是指其序列一致性至少为约90%,优选为至少约95%,或更优选为至少约98%。
在此使用的术语“单价疫苗”是指具有一种主要抗原组分的疫苗。例如,p68单价疫苗包括支气管炎博德特氏杆菌p68抗原作为该疫苗的主要抗原组分,该疫苗能防止施用该疫苗的动物发生由支气管炎博德特氏杆菌引起的疾病。单价疫苗的另一个实例包括布拉迪斯拉发钩端螺旋体的细胞制剂作为疫苗的主要抗原组分,该疫苗能防止施用该疫苗的动物发生由布拉迪斯拉发钩端螺旋体引起的疾病。
术语“联合疫苗”是指能在犬中引发保护性免疫反应的抗原的二价或多价组合。联合疫苗对抗病原体的保护效应通常通过在动物体内诱发免疫反应(细胞介导的或体液的免疫反应或二者组合)而实现。
“免疫原性的”是指组合物刺激犬对特定病原体发生免疫反应的能力。该免疫反应可以是主要由细胞毒素的T细胞和产生细胞因子的T细胞所介导的细胞免疫反应,或是主要由辅助T细胞所介导的体液免疫反应,然后该反应可活化B细胞导致抗体生成。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指足以在施用了该疫苗的犬中引起保护性免疫反应的单价或联合疫苗的用量。该免疫反应可包括但不限于,诱发细胞和/或体液免疫。疫苗的治疗有效量可根据该疫苗中使用的特定抗原、犬的年龄及状况、和/或感染程度而变化,且可由兽医来决定。
p68疫苗
本发明第一次证明了包含支气管炎博德特氏杆菌p68抗原的疫苗组合物,能有效地防止犬发生由支气管炎博德特氏杆菌引起的疾病。本发明的疫苗组合物不会产生明显的接种后反应,可安全用于幼犬,且可在犬中诱导持续较长时间的保护性免疫。
因此,本发明的一个实施方式针对包含支气管炎博德特氏杆菌p68抗原(或“p68疫苗”)的疫苗组合物,其适用于对犬给药,并能防止犬发生由支气管炎博德特氏杆菌引起的疾病,例如,传染性气管支气管炎(“犬舍咳”)。
对本发明的目的而言,术语“p68抗原”是指具有由SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳所确定的68kDa分子量的蛋白质,其被p68特异性单克隆抗体Bord 2-7(ATCC#)识别,且具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1基本相同的氨基酸序列。“基本相同”是指序列一致性为至少约90%,优选为至少约95%,或更优选为至少约98%。具有与SEQ ID NO:1基本相同的氨基酸序列的p68抗原的实例,是在WO 92/17587中说明的p68抗原,其表示为SEQ ID NO:3。本发明的p68特异性单克隆抗体识别,例如,天然的p68蛋白、重组型p68蛋白及在细菌表面上的p68蛋白质。
根据本发明,适合用于本发明的p68抗原包括天然的p68蛋白(即,从支气管炎博德特氏杆菌中纯化出的天然p68蛋白)和重组产生的p68蛋白。
从支气管炎博德特氏杆菌纯化天然p68的描述,例如,见Montaraz等人,
Infection and lmmunity 47:744-751(1985),且在下文提供的实施例中也有说明。p68的重组产生可使用任何一种由本领域技术人员所熟知的分子克隆及重组表达技术来实现。例如,可将编码p68的核酸分子引进适当的宿主细胞,诸如细菌、酵母细胞(例如,毕赤氏酵母(Pichia)细胞)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(例如,CHO细胞)。编码p68的核酸分子可以被置于能影响p68抗原在宿主细胞中表达的启动子的可操作连接中。由宿主细胞表达的p68能很容易使用常规的蛋白纯化技术来进行纯化。
在本发明的优选实施方式中,将编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的p68抗原的、SEQ ID NO:2所示的核酸序列,在表达载体中克隆,且置于温度敏感型启动子的可操作连接中。将该表达载体引进大肠杆菌,且以加热诱导表达该p68抗原。溶解所述细胞,并通过离心分离积聚该p68抗原的包涵体。使用SDS或其它本领域中熟知的增溶剂(诸如尿素、胍盐酸盐、胆酸钠、牛磺胆酸盐及脱氧胆酸钠)溶解该包涵体中的重组型p68。根据本发明,纯化的天然或重组型p68蛋白与兽医学可接受的载体合并在一起形成p68疫苗组合物。
术语“兽医学可接受的载体”包括任何及全部的溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂及抗真菌剂、等渗剂、吸收延缓剂及类似物。稀释剂可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油及类似物。等渗剂尤其可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖等。稳定剂尤其包括白蛋白。
根据本发明,适合使用的佐剂包括但不限于几种类型的佐剂,诸如:无机盐类,例如明矾、氢氧化铝、磷酸铝及磷酸钙;表面活性剂和微粒,例如非离子嵌段聚合物表面活性剂(例如,胆固醇)、病毒颗粒、皂草苷(例如Quil A、QS-21及GPI-0100)、蛋白体、免疫刺激复合物、蜗形体(cochleate)、季胺(溴化二甲基双十八烷基铵(DDA))、阿夫立定(avridine)、维生素A、维生素E;细菌产物,如RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、草分枝杆菌(Mycobacterum phlei)的细胞壁骨架(Detox_)、胞壁酰基二肽类(MDP)及三肽类(MTP)、单磷酰基脂质A、卡介苗(Bacillus Calmete-Guerin)、热不稳定的大肠杆菌肠毒素、霍乱毒素、海藻糖二霉菌酸酯、CpG寡脱氧核苷酸(oligodeoxnucleotide);细胞因子及激素类,例如白介素(IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、脱氢表雄甾酮、1,25-二羟基维生素D3;多聚阴离子类,例如,葡聚糖;聚丙烯酸类(例如,聚甲基丙烯酸甲酯、卡巴浦尔(Carbopol)934P);载体,例如破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱毒素B亚单位、肠毒性大肠杆菌的突变型热不稳定肠毒素(rmLT)、热休克蛋白;水包油乳液,例如AMPHIGEN_(Hydronics,美国);及油包水乳液,诸如例如弗式完全和不完全佐剂。
可用于本发明的疫苗的优选佐剂包括Quil A及胆固醇。
p68抗原与兽医学可接受的载体能够以任何方便和实用的方式结合以形成疫苗组合物,例如通过混合物、溶液、悬液、乳化、胶囊化、吸收等,且可制成如片剂、胶囊、粉末、糖浆、悬液之类的适于注射、植入、吸入、摄入等的剂型。优选将该疫苗配制成可通过注射对犬给药的剂型,其剂量为约0.1至5毫升,或优选约0.5至2.5毫升,或更优选约1毫升。适当时,应该利用公知的方法将本发明的药学组合物灭菌。
在疫苗中,p68的用量应该能是免疫有效的,其范围通常为每剂量0.5-1000微克。优选地,p68用量范围为每剂量1-260微克。更优选地,p68用量范围为每剂量10-100微克。甚至更优选地,p68的用量为每剂量约15至25微克。
适合用于疫苗中的佐剂用量根据所使用的佐剂性质而定。例如,当使用Quil A及胆固醇作为佐剂时,Quil A通常的用量为每剂量约1-1000微克,优选每剂量30-100微克,更优选每剂量约50-75微克;胆固醇通常的用量为每剂量约1-1000微克,优选为每剂量约30-100微克,更优选为每剂量约50-75微克。
在另一个实施方式中,本发明提供了通过给予犬上述的p68疫苗组合物,防止犬发生由支气管炎博德特氏杆菌引起的疾病的方法。根据本发明,该p68疫苗组合物为犬提供了长时间(至少约4个月)的免疫性,优选为至少约6个月,或甚至更优选为约一年。
根据本发明,p68疫苗可通过任何已知的途径对犬给药,包括口服、鼻内、粘膜、局部、经皮及肠胃外(例如,静脉内、腹膜内、皮内、皮下或肌肉内)。也可使用无针递送装置来实现给药。可使用组合途径来实现给药,例如首先使用肠胃外途径给药,随后使用粘膜途径给药。
优选的给药途径包括皮下及肌肉内给药。
本发明的p68疫苗组合物可给予至少6周龄的犬,优选至少7周龄,且更优选至少8或9周龄。可以对犬接种一次剂量或多于一次剂量的p68疫苗。优选地,以约2-4周的间隔对犬给予二次剂量的p68疫苗,优选两次给药的间隔为约3周。若犬在4月龄前接种,则建议在到达4月龄时再用单次剂量接种,因为在小于4月龄的幼犬中,母体抗体可能会干扰足够的免疫反应的发展。犬也可每年用单次剂量再次接种。如果可能接触支气管炎博德特氏杆菌,如生育、膳食,并显示出状况时,可在这些事件发生1年(或优选6个月)内另外辅助免疫一次。
联合疫苗
在另一个实施方式中,本发明提供了联合疫苗和通过给予这种联合免疫来保护犬免受支气管炎博德特氏杆菌和/或一种或多种其它犬科病原体感染的方法。本发明的联合疫苗组合物不会显示出功效干扰,且可安全用于幼犬。
本发明的联合疫苗包括支气管炎博德特氏杆菌p68抗原(其可如上述制得)、与至少一种来自其它犬科病原体的抗原,该抗原能诱发犬对由此其它病原体所引起的疾病的保护性免疫反应。这种联合疫苗也包括两种或多种这些其他犬科病原体的组合,而不包括p68抗原。
这些其它的病原体包括但不限于犬瘟热(CD)病毒、2型犬腺病毒(CAV-2)、犬副流感(CPI)病毒、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬疱疹病毒及狂犬病病毒。在本发明的疫苗组合物中使用的来自这些病原体的抗原,可以是改良的活病毒制剂或灭活病毒制剂的形式。将这些病毒的有毒株减毒的方法及制造灭活病毒制剂的方法在本领域是已知的,且在例如美国专利第4,567,042和4,567,043号中描述。
其它病原体还包括布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、出血性黄疸型钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体、hardjobovis钩端螺旋体、卟啉单胞菌属、拟杆菌属、利什曼原虫属、包柔氏螺旋体属、埃利希氏体属、支原体属及犬小孢子菌。在本发明的疫苗组合物中使用的来自这些病原体的抗原,可以是灭活的全细胞制剂或部分细胞制剂的形式,可使用本领域已知的方法来对它们进行制备。例如,制备灭活的全或部分钩端螺旋体细胞制剂的方法在本领域是已知的,且在例如Yan,K-T,“Aspects of Immunity to Leptospiraborgpetersenii serovar hardjo”PhD论文,Appendix 1,1996.Faculty ofAgriculture and Food Science,The Queen′s University of Belfast;Mackintosh等人,“The use of a hardjo-pomona vaccine to preventleptospiruria in cattle exposed to natural challenge with Leptospiainterrogans serovar hardjo”,
New Zealand Vet.J.28:174-177,1980;Bolin等人,“Effect of vaccination with a pentavalent leptopsiral vaccine onLeptospira interrogans serovar hardjo type hardjo-boivs infection ofpregnant cattle”,
Am.J.Vet.Res.50:161-165,1989中描述。
根据本发明,联合疫苗通常包括兽医学可接受的载体。如上所述,兽医学可接受的载体包括任何及全部的溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂及抗真菌剂、等渗剂、吸收延缓剂及类似物。稀释剂可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油及类似物。等渗剂尤其可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖等。稳定剂尤其包括白蛋白。
根据本发明,适合使用的佐剂包括但不限于几种类型的佐剂,诸如:无机盐类,例如明矾、氢氧化铝、磷酸铝及磷酸钙;表面活性剂和微粒,例如非离子嵌段聚合物表面活性剂(例如,胆固醇)、病毒颗粒、皂草苷(例如Quil A、QS-21及GPI-0100)、蛋白体、免疫刺激复合物、蜗形体、季胺(溴化二甲基双十八烷基铵(DDA))、阿夫立定、维生素A、维生素E;细菌产物,如RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、草分枝杆菌的细胞壁骨架(Detox_)、胞壁酰基二肽类(MDP)及三肽类(MTP)、单磷酰基脂质A、卡介苗(Bacillus Calmete-Guerin)、热不稳定的大肠杆菌肠毒素、霍乱毒素、海藻糖二霉菌酸酯、CpG寡脱氧核苷酸;细胞因子及激素类,例如白介素(IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、脱氢表雄甾酮、1,25-二羟基维生素D3;多聚阴离子类,例如,葡聚糖;聚丙烯酸类(例如,聚甲基丙烯酸甲酯、卡巴浦尔934P);载体,例如破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱毒素B亚单位、肠毒性大肠杆菌的突变型热不稳定肠毒素(rmLT)、热休克蛋白;水包油乳液,例如AMPHIGEN_(Hydronics,美国);及油包水乳液,诸如例如弗式完全和不完全佐剂。
可用于根据本发明的联合疫苗中的优选佐剂包括1)Quil A加胆固醇;和2)氢氧化铝。适合用于疫苗中的佐剂用量根据所使用的佐剂性质而定。例如,当使用Quil A和胆固醇作为佐剂时,Quil A通常的用量为每剂量约1-1000微克,优选每剂量30-100微克,更优选每剂量约50-75微克;胆固醇通常的用量为每剂量约1-1000微克,优选为每剂量约30-100微克,更优选为每剂量约50-75微克。当氢氧化铝用作佐剂时,其通常的用量为大约0.5-20%,优选大约0.5-10%,更优选大约1-2%。
p68抗原、来自其它病原体的一种或多种抗原、和/或兽医学可接受的载体,能够以任何方便和实用的方式结合以形成疫苗组合物,例如通过混合物、溶液、悬液、乳化、胶囊化、吸收等,并可制成如片剂、胶囊、粉末、糖浆、悬液之类的适于注射、植入、吸入、摄入等的剂型。优选将该疫苗配制成可通过注射对犬给药的剂型,其剂量为约0.1至5毫升,或优选约0.5至2.5毫升,或更优选约1毫升。
联合疫苗可通过用液体制剂(该液体制剂由溶解在无菌盐水溶液中的钩端螺旋体抗原组成,并用Quil A和胆固醇佐剂化)将减毒病毒株的冻干制剂(或通过其他方法如喷雾干燥或干燥制成的制剂)和病毒制剂再水化而制备。这种联合疫苗也可通过用无菌溶液将减毒病毒株的冻干制剂和钩端螺旋体病毒制剂(或通过其他方法如喷雾干燥或干燥制成的制剂)再水化,或用CCV加稀释剂将所述的冻干制剂再水化而制备。
根据本发明,联合疫苗可给予至少6周龄的犬,优选至少7周龄,更优选至少8或9周龄。联合疫苗能够以2至4次剂量给药,优选2至3次。每剂量给药的间隔为2-6周,优选2-4周。
给药可通过任何已知的途径来完成,包括口服、鼻内、粘膜、局部、经皮及肠胃外(例如,静脉内、腹膜内、皮内、皮下或肌肉内)。给药也可通过使用无针递送装置来实现。给药也可使用组合途径来实现,例如首先使用肠胄外途径给药,随后使用粘膜途径给药。优选的给药途径包括皮下及肌肉内给药。
优选的联合疫苗和接种方法
本发明优选的联合疫苗包括CD病毒的减毒株、CAV-2的减毒株、CPI病毒的减毒株、CPV的减毒株、CCV株的灭活制剂、和支气管炎博德特氏杆菌p68抗原。
特别优选的联合疫苗包括减毒的CD病毒株,其命名为“SnyderHill”株(National Veterinary Service Laboratory,Ames,IA);减毒的CAV-2株,其命名为“Manhattan”株(National Veterinary ServiceLaboratory,Ames,IA);减毒的CPI病毒株,其命名为“NL-CPI-5”(National Veterinary Service Laboratory,Ames,IA);减毒的CPV株,其命名为“NL-35-D”(National Veterinary Service Laboratory,Ames,IA);CCV株的灭活制剂,其命名为“NL-18”(National Veterinary ServiceLaboratory,Ames,IA);和重组的支气管炎博德特氏杆菌p68抗原,其序列为SEQ ID NO:1。此联合疫苗(本文中也称为“p68/5CV联合疫苗”)可优选地通过用液体制剂将减毒病毒株的冻干制剂和病毒制剂再水化而制备,该液体制剂由溶解在无菌盐水溶液中的p68抗原组成,并用Quil A和胆固醇佐剂化。不含p68抗原的联合疫苗在此称为5CV联合疫苗。这种联合疫苗优选通过用液体制剂将减毒病毒株的冻干制剂和病毒制剂再水化而制备,该液体制剂由无菌盐水溶液组成,并用Quil A和胆固醇佐剂化。
另一种特别优选的联合疫苗包括p68/5CV联合疫苗的抗原组分、以及以下五种钩端螺旋体属的灭活全细胞制剂:布拉迪斯拉发钩端螺旋体(例如,可从National Veterinary Service Laboratory,Ames,IA获得的布拉迪斯拉发钩端螺旋体株)、犬钩端螺旋体(例如,C-5株,National Veterinary Service Laboratory,Ames,IA)、感冒伤寒型钩端螺旋体(例如,MAL 1540株,National Veterinary Service Laboratory,Ames,IA)、出血性黄疸型钩端螺旋体(例如,NADL 11403株,NationalVeterinary Service Laboratory,Ames,IA)及波摩那钩端螺旋体(例如,T262株,National Veterinary Service Laboratory,Ames,IA)。此联合疫苗(本文也称为“p68/5CV-钩端螺旋体联合疫苗”),可优选地通过用液体制剂将减毒病毒株的冻干制剂(或通过其他方法如喷雾冻干或干燥制成的制剂)和病毒制剂再水化而制备,该液体制剂由溶解在无菌盐水溶液中的p68抗原和钩端螺旋体抗原组成,并用Quil A和胆固醇佐剂化。没有p68抗原的联合疫苗在此称为5CV-5钩端螺旋体联合疫苗。没有p68抗原、也没有布拉迪斯拉发钩端螺旋体的联合疫苗在此称为5CV-4钩端螺旋体联合疫苗。没有p68抗原、且具有犬钩端螺旋体和出血性黄疸型钩端螺旋体的5CV联合疫苗,在此称为5CV-2钩端螺旋体联合疫苗。这种联合疫苗优选通过用液体制剂将减毒病毒株的冻干制剂(或通过其他方法如喷雾冻干或干燥制成的制剂)和病毒制剂再水化而制备,该液体制剂由溶解在无菌盐水溶液中的钩端螺旋体抗原组成,并用Quil A和胆固醇佐剂化。这种联合疫苗也可优选地通过用无菌溶液将减毒病毒株和钩端螺旋体病毒制剂的冻干制剂(或通过其他方法如喷雾干燥或干燥制成的制剂)再水化,或用CCV加稀释剂将所述的冻干制剂再水化而制备。
根据本发明,可将该p68/5CV、p68/5CV-钩端螺旋体、5CV、5CV-5钩端螺旋体、5CV-4钩端螺旋体和5CV-2钩端螺旋体联合疫苗给予4周龄或更大(优选6周或更大)的健康犬,优选为3次剂量,每次给药间隔约3周。每年可再对犬接种单次剂量。如果可能接触支气管炎博德特氏杆菌和/或犬科病毒,如生育、膳食,并显示出状况时,可在这些事件发生1年(或优选6个月)内另外辅助免疫一次。
本发明又一种优选的联合疫苗包括CD病毒的减毒株、CAV-2的减毒株、CPI病毒的减毒株、CPV的减毒株、和重组的支气管炎博德特氏杆菌p68抗原。
特别优选的联合疫苗包括减毒的CD病毒株,其命名为“SnyderHill”株(National Veterinary Service Laboratory,Ames,IA);减毒的CAV-2株,其命名为“Manhattan”株(National Veterinary ServiceLaboratory,Ames,IA);减毒的CPI病毒株,其命名为“NL-CPI-5”(National Veterinary Service Laboratory,Ames,IA);减毒的CPV株,其命名为“NL-35-D”(National Veterinary Service Laboratory,Ames,IA);和重组的支气管炎博德特氏杆菌p68抗原,其序列为SEQ ID NO:1。这种联合疫苗(本文中也称为“p68/DA2PP联合疫苗”),可优选地通过用液体制剂将减毒病毒株的冻干制剂(或通过其他方法如喷雾干燥或干燥制成的制剂)再水化而制备,该液体制剂由溶解在无菌盐水溶液中的p68抗原组成,并用Quil A和胆固醇佐剂化。没有p68抗原的联合疫苗在此称为DA2PP联合疫苗。这种联合疫苗优选通过用液体制剂将减毒病毒株的冻干制剂(或通过其他方法如喷雾干燥或干燥制成的制剂)再水化而制备,该液体制剂由无菌盐水溶液组成,并用QuilA和胆固醇佐剂化。
另一个特别优选的联合疫苗包括p68/DA2PP联合疫苗的抗原组分、以及如下两种钩端螺旋体的灭活全细胞制剂:犬钩端螺旋体(例如,C-51株,National Veterinary Service Laboratory,Ames,IA)和出血性黄疸型钩端螺旋体(例如,NADL 11403株,National VeterinaryService Laboratory,Ames,IA)。或者,优选的联合疫苗可包括p68/DA2PP联合疫苗的抗原组分、以及如下五种钩端螺旋体的灭活全细胞制剂:布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、出血性黄疸型钩端螺旋体及波摩那钩端螺旋体。这些联合疫苗在此也称为“p68/DA2PP钩端螺旋体联合疫苗”,其优选通过用液体制剂将减毒病毒株的冻干制剂(或通过其他方法如喷雾干燥或干燥制成的制剂)和病毒制剂再水化而制备,该液体制剂由溶解在无菌盐水溶液中的p68抗原和钩端螺旋体抗原组成,并用Quil A和胆固醇佐剂化。
或者,另一种优选的联合疫苗包括DA2PP联合疫苗的抗原组分、以及如下五种钩端螺旋体的灭活全细胞制剂:布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、出血性黄疸型钩端螺旋体及波摩那钩端螺旋体。又一种优选的联合疫苗包括DA2PP联合疫苗的抗原组分、以及如下四种钩端螺旋体的灭活全细胞制剂:犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、出血性黄疸型钩端螺旋体及波摩那钩端螺旋体。这些联合疫苗在此也称为“DA2PP钩端螺旋体联合疫苗”,其优选通过用液体制剂将减毒病毒株的冻干制剂(或通过其他方法如喷雾干燥或干燥制成的制剂)和病毒制剂再水化而制备,该液体制剂由溶解在无菌盐水溶液中的钩端螺旋体抗原组成,并用Quil A和胆固醇佐剂化。
根据本发明,可将p68/DA2PP、p68/DA2PP-钩端螺旋体、DA2PP、和DA2PP钩端螺旋体联合疫苗给予6周龄或更大(优选8周或更大)的健康犬,优选为2次剂量,每次给药间隔约3周。如果给予至少12周龄的犬,单次剂量可能是足够的。每年可再对犬接种单次剂量。如果可能接触支气管炎博德特氏杆菌和/或犬科病毒,如生育、膳食,并显示出状况时,可在这些事件发生1年(或优选6个月)内另外辅助免疫一次。另一种优选的联合疫苗包括p68抗原(优选具有SEQ ID NO:1的重组p68抗原)以及CPI的减毒株。
又一种优选的联合疫苗包括p68抗原(优选具有SEQ ID NO:1的重组p68抗原)、CPI的减毒株和至少两种钩端螺旋体,如犬钩端螺旋体(例如,C-51株,National Veterinary Service Laboratory,Ames,IA)和出血性黄疸型钩端螺旋体(例如,NADL 11403株,NationalVeterinary Service Laboratory,Ames,IA)。
在本发明的联合疫苗中,p68抗原和来自一种或多种其它病原体的抗原的用量应是免疫有效的。通常在联合疫苗中的p68抗原用量,应该至少为每剂量约0.5微克。减毒的CD病毒用量应该为每剂量至少大约102至大约109TCID50(组织培养感染剂量50%细胞病变效应(tissueculture infectious dose 50%cytopathic effect)),优选的范围为每剂量大约104至大约106 TCID50。减毒的CAV-2用量应该为每剂量至少大约102至大约109 TCID50,优选的范围为每剂量大约104.0至大约106.0TCID50。减毒的CPI病毒用量应该为每剂量至少大约102至大约109TCID50,优选的范围为每剂量大约106至大约108 TCID50。减毒的CPV用量应该为每剂量至少大约102至大约109 TCID50,优选的范围为每剂量大约107至大约109 TCID50。灭活的病毒制剂中CCV的用量应该为每剂量至少大约100个相对单位,优选的范围为每剂量1000-4500个相对单位。在疫苗中每种钩端螺旋体的范围应该为每疫苗剂量大约100-3500NU(浊度单位),优选的范围为每剂量200-2000NU。
联合疫苗可配制成通过注射将疫苗给予犬的剂型,其剂量为0.1至5毫升,优选0.5至2.5毫升,更优选大约1毫升。
本发明通过下列非限制性的实施例来进一步阐明。
实施例1
犬博德特氏杆菌p68重组抗原剂量滴定研究
疫苗:
实验疫苗抗原为大肠杆菌菌株LW68产生的支气管炎博德特氏杆菌重组p68外膜蛋白(SEQ ID NO:1)。该疫苗包含不同程度的经SDS(十二烷基硫酸钠)溶解的p68,用每1毫升剂量50微克的QAC(QuilA/50微克胆固醇)进行佐剂化。
激发物质:
使用支气管炎博德特氏杆菌(犬分离物(dog isolate)#85B,通道(passage)#3,组(lot)#051597)的气溶胶作为激发物质。平均培养板计数为1.59×108 CFU/毫升。
动物:
将六十只雄性及雌性幼犬随机分配为六个处理组(每组10只幼犬)之一。在第一次接种前41天,对幼犬抽血并进行气管拭子(trachealswab),在第一次接种前28天重复一次,并将出现任何血清反应阳性或培养阳性的动物从研究中排除。
根据随机完全区组设计,将动物随机分配至处理组和房间(room)中。指派不了解疫苗分配组别的人完成接种后的观察。
设计:
组别 |
剂量水平 |
途径1 |
动物数目 |
T01T02T03T04T05T06 |
盐水对照(1mL剂量,0.9%盐水)1微克p684微克p6816微克p6864微克p68256微克p68 | SCSCSCSCSCSC | 988999 |
1SC:皮下
步骤:
IVP给药:
在第0天时,以安慰剂或实验疫苗接种动物。在第21天时,进行第二次接种。第一次接种在右颈皮下给药,第二次接种在左颈皮下给药。
激发给药:
在第二次接种后28天,以支气管炎博德特氏杆菌的气溶胶激发全部动物。在激发后的2至14天(第51至63天),每日两次(一次早上,一次下午)监视动物咳嗽情况30分钟。
观察及样品收集:
在每次接种后,触诊全部的注射位置并进行三维测量七天(第0至7天及第21至28天),且在每次接种后的第14天(第14及35天)重复相同的步骤。
在接种当天及在每次接种后三天(第0至3天及第21至24天)记录直肠温度。
在接种当天(第0及21天)和在第42、50及63天收集血液,利用ELISA测定从支气管炎博德特氏杆菌中纯化的p68蛋白的特异抗体。也在第42、49、50、52、54、56及58天时收集血液,分析血清淀粉样蛋白A(SAA)。
对全部动物进行气管拭子分离支气管炎博德特氏杆菌,在接种前(在供应商处,-41天和-28天时进行)及在第49天时收集血液用于测定支气管炎博德特氏杆菌凝集滴度。
博德特氏杆菌p68犬和鼠抗体滴定DAB ELISA
在0.01M硼酸盐缓冲液中将纯化的天然p68稀释成600ng/mL,并以100μl/孔加入至各孔中。平板在4℃下培养过夜。然后以过量PBS-Tween 20冲洗平板一次。将1%脱脂奶/PBS以200μl/孔加入至平板中。然后在37℃下培养平板1小时。然后用过量PBS-Tween 20冲洗平板一次。
将以1∶50稀释的犬或鼠血清加入至ELISA平板的最上排,然后将二倍连续稀释的血清依次加入平板中。平板在37℃下培养1小时。随后,用过量PBS-Tween 20冲洗平板3次。
将1∶2000稀释的过氧化物酶标记的羊抗犬IgG(H+L),以100μl/孔加入至上述用犬血清培养的平板中。然后在37℃下培养平板1小时。将1∶4000稀释的过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(H+L),以100μl/孔加入至上述用鼠血清培养的平板中。然后在37℃下培养平板1小时。随后,用过量PBS-Tween 20冲洗平板3次。
以100μl/孔加入ABTS底物。大约20分钟后,在405-490nm处用Molecular Devices或类似的平板读数仪对这些平板进行读数。
数据分析:
使用Fisher确切概率检验(Fisher’s Exact Test)来测试咳嗽犬数目的处理误差。使用5%的显著性水平。
在使用一般线性混合模型分析前,将ELISA滴度进行对数转换。使用95%的置信度水平来评估处理误差。对激发的观察每天监测两次,每次30分钟。
结果:
气管拭子培养和凝集滴度
评估气管拭子培养和凝集滴度,以监视进入研究中的动物的支气管炎博德特氏杆菌的状况。一些犬在不同的时间点处显示滴度增加,但是在激发前滴度没有增加至128以上。
注射部位观察
第一次接种后的注射部位反应显示于表1。在T05(64微克)接种动物中观察到最大的注射部位反应,测量到的最大平均注射部位反应仅有14.69cm3(接种后2天)。T03(4微克)、T04(16微克)和T06(256微克)接种动物在接种后直至7天才表现不同的注射部位反应。T02(1微克)接种动物仅在接种后第1天表现出反应。接种后第七天,在处理组中,注射部位反应在统计学上没有显著差异。第14天时,全部的注射部位反应都已经消失。
第二次接种后的注射部位反应显示于表2。在第二次接种后,在T06(256微克)中观察到最大的平均注射部位反应,测量到的最大平均注射部位反应为50.03cm3(接种后1天)。在T05(64微克)和T04(16微克)的动物中,于第二次接种后直至7天才表现注射部位反应。在T03(4微克)及T02(1微克)动物中,于接种后直至7天才表现出最小的注射部位反应。在接种后,T02(1微克)和T03(4微克)与安慰剂组相比,注射部位反应在统计学上没有显著差异。第二次接种后14天没有观察到注射部位反应。
第一次接种后的注射部位反应频率显示于表3。在第一次接种后任何时间,T06(256微克)的接种得到最高的总体LSM频率,76%的注射部位显示有反应。下一个最高的频率是T05(64微克)的第一次接种后,72%的注射部位显示有反应,然后是T04(16微克)的第一次接种后为69%,T03(4微克)的第一次接种后为63%。T02(1微克)第一次接种后的频率最低,为38%。
第二次接种后的注射部位反应频率显示于表4。每种疫苗的总体LSM频率与第一次接种后所见一致。
接种后的注射部位反应的发生率及持续时间总结于表5中。在第一和第二次接种后,对T03、T04、T05及T06(分别为4微克、16微克、64微克及256微克)可测量到的注射部位反应的发生率(或在任何时间显示有反应的犬数目)为100%。接收T02(1微克)的动物显示接种后注射部位反应的发生率最小(57.1%)。
对T04、T05及T06(分别为16微克、64微克及256微克)接种动物,在第一及第二次接种后的反应持续时间(以反应的天数的最小均方表示,显示于表5)较长(第一次接种后2.7至5.1天,第二次接种后6.0至6.7天)。T02及T03(分别为1微克及4微克)接种动物在第一及第二次接种后,表现出的注射部位反应天数最小(第一次接种后0.3及1.3天,第二次接种后1.9及4.5天)。
直肠温度
平均直肠温度测量总结于表6。T02(1微克)在第1及24天,T03(4微克)在第1、21及24天、T04(16微克)在第2及24天、T05(64微克)在第23天、T06(256微克)在第0、1及24天的LSM直肠温度与安慰剂有显著差异。在第23天时,所有与安慰剂的比较在统计学上没有显著性(P>0.05)。
p68 ELISA血清学
p68 ELISA数据总结于表7。在所有组中,p68 BLISA特异抗体接种前的病毒滴度几何均数均很低(范围为24.9至28.9),而且安慰剂的滴度在整个研究期间保持很低。在第一次接种后21天,在接种处理过程中,p68 ELISA滴度几何均数已经增加(范围为55.2至4,411.7),但是T02(1微克)滴度在统计学上与安慰剂(T01)没有差异。在第二次接种后42天,在全部接种组中的滴度几何均数进一步增加(范围为674.6至48,382.0),表明对接种有良好的血清学反应。
血清淀粉样蛋白A(SAA)血清学
SAA滴度总结于表8。在激发前,在所有处理组中,SAA滴度几何均数都很低(范围为0.1至0.5)。激发后,T01的GMT滴度范围从1.5至146.0,其中p68处理组的范围从0.3至23.1。在第50、52、54及56天时,全部处理组与安慰剂在统计学上均有差异。p68疫苗之间均没有表现出统计学上的差异,除了T02(1微克)在第52天表现出与所有其他p68处理组的几何均数有显著差异。
激发反应
激发反应数据显示于表9。在激发后通过监测咳嗽来测定反应,使用二种方法来分析观察结果:有咳嗽的天数的最小均方数和连续二天咳嗽(疾病发生率)。
咳嗽平均天数的分析表明p68处理组之间在统计学上没有显著差异;但是以安慰剂接种的犬平均咳嗽8.6天,然而给予p68疫苗的犬咳嗽明显较少,平均范围在2.2至4.7天。
当使用疾病发生率来对犬评价时,全部的T01(安慰剂)都观察到连续二天咳嗽(100%的疾病发生率)。T04(16微克)和T05(64微克)接种犬分别显示55.6%及66.7%的疾病发生率。T02(1微克)接种犬仅有28.6%、T03(4微克)接种犬有50%、T06(256微克)接种犬有33.3%观察到连续咳嗽二天。
讨论:
在此研究中,目标是在犬中建立抗原剂量、免疫反应和保护作用之间的关系。所检验的p68抗原剂量为1微克、4微克、16微克、64微克及256微克。
注射部位反应测定的分析表明,p68处理组中的反应可忽略,除了在第二次接种后第一天的T06(256微克)。所观察到的反应趋于变小,通常在观察期间反应尺寸会减少。这些反应尺寸在临床上不明显且在未剪毛的犬上很有可能被忽略。
接种后的直肠温度在全部组的犬中都不显著,且都在正常限度内。
在T03至T06中,对接种的血清学反应优异。在这些处理组中,从第21天至第63天与安慰剂比较时,全部都显示显著较高的p68ELISA滴度。从第42天至第63天与T01(安慰剂)相比,T02(1微克)表现出明显的p68 ELISA滴度。在T05(64微克)和T06(256微克)中观察到最高的滴度。
在激发后检查全部p68接种犬的SAA反应,与对照组的犬相比,激发后SAA的升高幅度较低。在激发后,p68疫苗剂量水平之间没有表现出差异,除了T02(1微克)在第52天表现出与所有其他p68处理组的几何均数有统计学的差异。
使用咳嗽天数的最小均方(LSM)或连续二天咳嗽(疾病发生率)来分析激发后的咳嗽观察结果。使用咳嗽天数的LSM,尽管不同的p68疫苗剂量水平之间显示没有差异,但在安慰剂与全部p68接种组之间显示有显著差异。使用疾病发生率,T02(1微克)、T03(4微克)和T06(256微克)接种犬的咳嗽明显少于安慰剂组。
结论:
本研究是为了在犬中建立起抗原剂量、免疫反应和保护作用之间的关系。所检验的p68抗原剂量为1微克、4微克、16微克、64微克及256微克。
因为注射部位反应最小、直肠温度正常和对接种没有负面反应,证明所有疫苗都是安全的。在较低抗原处理组中,注射部位反应的尺寸和这些反应的持续时间较少。如由ELISA滴度所测定,较高抗原剂量组对接种的血清学反应优异,显示较高的血清学反应。当使用咳嗽天数的LSM作为比较方法时,与安慰剂相比,所有处理组都显示咳嗽明显减少。注意到在处理组之间没有差异。当使用连续二天咳嗽(或疾病发生率)来比较时,T02(1微克)、T03(4微克)和T06(256微克)接种犬的咳嗽明显少于安慰剂组。
表1.在用p68抗原或安慰剂第一次接种后,犬注射部位反应的体积
|
处理剂(N) |
在第一次接种以下研究天数后,注射部位反应的LS平均体积(cm3)1 |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
14 |
T01T02T03T04T05T06 |
安慰剂(9)p68,1μg(7)p68,4μg(8)p68,16μg(9)p68,64μg(9)p68,256μg(9) |
0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a |
0.00a4.00b0.00ac0.00a10.44d7.00e |
0.00a0.00a,b0.64a,b3.56b14.69c8.53d |
0.00a0.00a4.56b4.28b10.56c7.50b,c |
0.00a0.00a1.14a,b1.32a,b4.01b,c5.62c |
0.00a0.00a0.39a1.79a,b4.40b4.36b |
0.00a0.00a,b0.00a2.36a,b2.82a,b3.56b |
0.00a0.00a0.00a0.38a1.15a1.24a |
0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a |
1不同上标的数值在统计学上有差异(P≤0.05)
表2.在用p68抗原或安慰剂第二次接种后,注射部位反应的体积
|
处理剂(N) |
在第二次接种以下研究天数后,注射部位反应的LS平均体积(cm3)1 |
0(21) |
1(22) |
2(23) |
3(24) |
4(25) |
5(26) |
6(27) |
7(28) |
14(35) |
T01T02T03T04T05T06 |
安慰剂(9)p68,1μg(7)p68,4μg(8)p68,16μg(9)p68,64μg(9)p68,256μg(9) |
0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a |
0.00a0.54a0.00a0.00a2.89a50.03b |
0.00a2.36a,b5.33a,b,c7.58b,c10.99c8.58b,c |
0.00a1.14a4.20a10.67b14.28b13.44b |
0.00a0.45a2.59a,b7.25b,c9.79c11.32c |
0.00a0.61a2.89a,b7.28c9.75c7.42b,c |
0.00a0.50a1.53a7.97b11.14b9.51b |
0.00a0.16a1.23a,b5.14a,b6.50b2.69a,b |
0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a |
1不同上标的数值在统计学上有差异(P≤0.05)
表3.在用p68抗原或安慰剂第一次接种后注射部位反应的频率
处理剂(N) |
在第一次接种以下研究天数后,每圈2有反应的犬的LS平均百分比3 |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
14 |
T01T02T03T04T05T06 |
安慰剂(9)p68,1μg(7)p68,4μg(8)p68,16μg(9)p68,64μg(9)p68,256μg(9) |
0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a |
0.00a100.00b90.00b,c62.50c90.00b,c100.00b,d |
0.00a83.33b80.00b87.50b100.00b100.00b |
0.00a50.00b90.00c100.00c100.00c100.00c |
0.00a25.00a80.00b100.00b90.00b100.00b |
0.00a12.50a63.33b77.50b,c90.00b,c100.00c |
0.00a37.50b80.00c87.50c90.00c87.50c |
0.00a37.50b80.00c100.00c90.00c100.00c |
0.00a0.00a0.00a10.00a0.00a0.00a |
2每处理两圈
3不同上标的数值在统计学上有差异(P≤0.05)
表4.在用p68抗原或安慰剂第二次接种后注射部位反应的频率
| 处理剂(N) |
在第二次接种以下研究天数后,每圈1有反应的犬的LS平均百分比2 |
0(21) |
1(22) |
2(23) |
3(24) |
4(25) |
5(26) |
6(27) |
7(28) |
14(35) |
T01T02T03T04T05T06 |
安慰剂(9)p68,1μg(7)p68,4μg(8)p68,16μg(9)p68,64μg(9)p68,256μg(9) |
0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a |
0.00a58.33b83.33c90.00c,d100.00d100.00d |
20.00a58.33b100.00c100.00c100.00c100.00c |
10.00a58.33b100.00c100.00c100.00c100.00c |
0.00a45.83b90.00c100.00c100.00c100.00c |
0.00a41.67b73.33c100.00d100.00d100.00d |
0.00a41.67b73.33c100.00d100.00d100.00d |
0.00a29.17b73.33c100.00d100.00d87.50c,d |
0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a0.00a |
2每处理两圈
3不同上标的数值在统计学上有差异(P≤0.05)
表5:在用p68抗原或安慰剂接种后,注射部位反应的持续时间
| 处理剂(N) |
可测量的反应(任何时间) |
有反应的LS平均天数4(第一次接种后) |
有反应的LS平均天数1(第二次接种后) |
T01T02T03T04T05T06 |
安慰剂(9)p68,1μg(7)p68,4μg(8)p68,16μg(9)p68,64μg(9)p68,256μg(9) |
0/9(0%)4/7(57.1%)8/8(100%)9/9(100%)9/9(100%)9/9(100%) |
0.0a0.3a1.3a,b2.7b4.9c5.1c |
-0.0a1.9b4.5c6.0d6.3d6.7d |
4不同上标的数值在统计学上有差异(P≤0.05)
表6.在用p68抗原或安慰剂接种后,犬的平均直肠温度
| 处理剂(N) |
以下研究天数时LS平均直肠温度5 |
0 |
1 |
2 |
3 |
21 |
22 |
23 |
24 |
T01T02T03T04T05T06 |
安慰剂(9)p68,1μg(7)p68,4μg(8)p68,16μg(9)p68,64μg(9)p68,256μg(9) |
38.9a,b39.0a,b39.0a39.0a38.9a,b38.7b |
38.9a38.5b38.7a,b39.0a38.9a39.3c |
38.9a,b38.8a38.6a38.9b38.9a,b38.8a,b |
39.0a38.4b39.0a38.7a,b38.8a39.0a |
39.0a38.7a38.6b38.7a38.7a38.8a |
38.8a38.6a38.6a38.8a38.7a38.8a |
38.9a,b38.7a,b38.6a38.7a,b39.0b38.9a,b |
39.0a38.6b,c38.4c38.6b,c38.7a,b38.6b,c |
表7.在用p68抗原或安慰剂接种后,犬的血清学p68 DAB ELISA滴度
6 | 处理剂(N) |
以下研究天数时p68ELISA病毒滴度的几何均数2 |
0 |
21 |
42 |
49 |
63 |
T01T02T03T04T05T06 |
安慰剂(9)p68,1μg(7)p68,4μg(8)p68,16μg(9)p68,64μg(9)p68,256μg(9) |
25.2a25.5a25.3a28.9a25.3a24.9a |
48.3a55.2a310.9b515.4b1699.5c4411.7d |
30.0a674.6b7865.0c12180.4c36460.6d48382.0d |
28.2a294.4b4414.8c5824.4c17593.9d25980.9d |
230.4a1301.7b10580.1c11429.3c22689.3c,d30594.3d |
1在第0和21研究天数时给予疫苗,不同上标的数值在统计学上有差异(P≤0.05)
6在第0和21研究天数时给予疫苗,在第49研究天数时进行激发。
2不同上标的数值在统计学上有差异(P≤0.05)
表8.接种p68抗原或安慰剂的犬在激发后,犬的血清淀粉样蛋白A(SAA)滴度
| 处理剂(N) |
激发后如下研究天数时血清淀粉样蛋白A滴度的几何均数7 |
49 |
50 |
52 |
54 |
56 |
58 |
T01T02T03T04T05T06 |
安慰剂(9)p68,1μg(7)p68,4μg(8)p68,16μg(9)p68,64μg(9)p68,256μg(9) |
0.2a0.2a0.2a0.1a0.5a0.5a |
146.0a8.3b9.9b16.3b11.4b23.1b |
87.2a1.2b6.4c11.6c8.0c16.4c |
153.6a0.7b2.3b3.0b3.4b3.8b |
14.7a0.6b1.2b1.6b1.3b1.1b |
1.5a0.3a1.8a1.4a1.2a0.4a |
1不同上标的数值在统计学上有差异(P≤0.05)
表9.接种p68抗原或安慰剂的犬在激发后,犬的咳嗽发生率和持续时间
|
处理剂(N) |
疾病发生率8,2 |
咳嗽的LS平均天数2 |
T01T02T03T04T05T06 |
安慰剂(9)p68,1μg(7)p68,4μg(8)p68,16μg(9)p68,64μg(9)p68,256μg(9) |
9/9a(100%)2/7b(28.6%)4/8b(50%)5/9a,b(55.6%)6/9a,b(66.7%)3/9b(33.3%) |
8.6a2.2b3.8b3.7b4.7b3.0b |
8以连续两天咳嗽为准。
2不同上标的数值在统计学上有差异(P≤0.05)
实施例2
犬博德特氏杆菌p68免疫原性研究
动物
购买45只雄性及雌性杂种犬。在幼犬到达研究场所那天,对全部的幼犬给予MLV细小病毒疫苗。在研究期间,除了实验产物外,没有其他的疫苗给予幼犬。在第0天(第一次接种当天),犬龄大约为9周龄(±1周)。
在激发前,需要将犬保持在隔离室中,以防止接触博德特氏杆菌和其它犬科病原体。在用博德特氏杆菌气溶胶激发后,继续隔离过程以防止接触其它犬科病原体。
疫苗
在处理组T01及T02中使用无菌盐水作为安慰剂疫苗。在处理组T03及T04中使用犬重组p68支气管炎博德特氏杆菌疫苗。将p68抗原的结构基因克隆在大肠杆菌中,并由温度敏感型启动子调控该基因的表达。将细胞溶解,离心分离包涵体。通过SDS处理来溶解包涵体内的重组p68。将该重组p68(每毫升15微克)与无菌盐水(作为稀释剂)中的50微克/毫升Quil A及50微克/毫升胆固醇结合。每1毫升剂量包含0.28%乙醇及0.01%硫柳汞。
激发接种物
使用Biologics Control Laboratories-Microbiology目前采用的方法,制备支气管炎博德特氏杆菌Bihr Cat株作为激发接种物。将汇合生长的支气管炎博德特氏杆菌-Bihr Cat株接种在Bordet-Genou琼脂板上,并在37.5+/-2.5℃下培养48小时。选择毒性I期(virulent phase I)集落并在Bordet-Genou琼脂上划痕,在37.5+/-2.5℃下培养24小时。在培养后,使用博德特氏杆菌盐水冲洗来自该琼脂的集落,并将抗原稀释至600nm下光密度为0.80。在激发前和激发后进行细胞计数,以确认浊度计读数。激发靶浓度为大约1×109CPU。激发前浓度为2.37×109CFU(100%I期),激发后浓度计数为1.35×109CFU(100%I期)。
研究设计
总结表
处理组 |
处理剂 |
途径 |
动物数目 |
T01 |
盐水对照 |
肌肉内 |
8 |
T02 |
盐水对照 |
皮下 |
7 |
T03 |
p68 15微克/剂量 |
皮下 |
15 |
T04 |
p68 15微克/剂量 |
肌肉内 |
15 |
随机化/设盲(blinding)
从接种至激发日期间,根据广义区组设计(generalized blockdesign)对动物分配处理组。各处理组随机指定房间。在激发日,通过区组将动物随机分配至激发房间。
不了解处理组分组情况的经认证合格的人,进行微生物学和血清学测定,并评价注射部位、测量直肠温度和观察咳嗽。
数据分析
接种后反应变量由注射部位数据、直肠温度和p68 ELISA滴度组成。注射部位数据总结如下:1)处理和研究天数与具有可测量反应的动物数目的关系;2)处理与具有可测量反应的动物时间点数目的关系;3)处理与在任何时间点具有可测量反应的动物数目的关系。
使用一般线性混合模型,单独对第一次和第二次接种分析注射部位体积(cm3)、直肠温度和自然对数转换的p68 ELISA滴度数据。
构建观察时间点最小均方对处理作图的事前(priori)线性对比,以检验处理组在每个观察时间点的差异,并比较每次处理内的时间点。全部比较使用5%的显著性水平。
激发后反应变量由每日咳嗽观察、p68ELISA滴度及血清淀粉样蛋白A滴度组成。使用一般线性混合模型来分析在激发后期间的咳嗽天数。
构建处理最小均方的事前对比,以检验处理组差异。对所有比较使用5%的显著性水平。
分别对第一次及第二次接种使用Fisher确切概率检验比较处理组的连续二天咳嗽的发生率。对所有比较使用5%的显著性水平。
对激发后的血清淀粉样蛋白A(SAA)滴度数据,在使用一般线性混合模型分析前,对滴度值进行自然对数转换。
构建观察时间点最小均方对处理作图的事前线性对比,以检验处理组在每个观察时间点的差异,并比较在每次处理内的时间点。对所有比较使用5%的显著性水平。
研究步骤
详细的动物处理步骤
将四十五(45)只血清反应阴性及培养物阴性的幼犬随机分配至4个处理组之一。分别将八只及七只犬分配至肌肉内(IM)或皮下(SC)对照组中,总共有15只对照犬。将十五只犬分配至p68 SC处理组,15只犬分配至p68 IM处理组。处理组在上述的研究设计一节中详述。
第0天指定为第一次接种当天。在第0天时给予疫苗,21天后重复。第一次接种使用右颈,第二次接种使用左颈。第一次和第二次接种分别在右和左半膜肌肌肉中进行肌肉内注射给药。在每次接种后,对所有注射部位进行七天的三维测量,在接种后14天进行跟踪测量。在接种当天(在接种前)和在每次接种后三天监测直肠温度。
在第35天时,对所有动物进行气管拭子,用于支气管炎博德特氏杆菌培养,并收集血液用于测定凝集滴度。所有动物对气管拭子呈阴性,对博德特氏杆菌呈血清学阴性,认为适合进行激发。
在第45天时,在第二次接种后24天,对所有犬施予支气管炎博德特氏杆菌的气溶胶激发。使用一次性鼻锥(被舒适地安装在经镇静的犬的鼻口上)来对经镇静的犬进行激发。将该鼻锥接上喷雾器,而该喷雾器与设定在5.5至6.0psi的真空压力泵连接。将1毫升的激发物质置于该喷雾器中,并对每只犬给予雾化的激发物质4分钟。观察人员不知道处理组的分配状况。
在激发后,监测动物的咳嗽状况14天(第46-59天)。每天大约在相同的时间点观察2(二)次,每次大约30分钟,一次在早上进行,一次在下午进行,并记录结果。
血液收集
在第一次接种前和激发前收集血液用于检测凝集滴度。在接种前,第0和21天和在第35、45及59天时,收集血液用于抗p68 ELISA评价。在激发当天(第45天)和在第46、48、50、52及54天时,收集血液进行血清淀粉样蛋白A(SAA)测定。
在样品上进行的测试
通过培养来评价气管拭子上支气管炎博德特氏杆菌的存在。将每个气管拭子在博德特氏杆菌选择性琼脂板上划痕。包括阳性和阴性对照。在37.5±2.5℃下培养平板48±4小时。每块平板上得到的集落与阳性对照组进行比较,并进一步检测显示与阳性对照组相同的任何集落,以确定支气管炎博德特氏杆菌的存在。证实性检测包括使用TSI、柠檬酸盐(Citrate)和尿素琼脂(Urea Agar)和硝酸盐红介质(Nitrate Redmedia)。
使用下列方法来评价血清的凝集滴度、p68 ELISA分析或SAA分析:
凝集滴度——使用博德特氏杆菌盐水将血清连续稀释在微量滴定板中。每块板中包含阳性和阴性对照。使用支气管炎博德特氏杆菌株B7(生长在Bordet Genou琼脂上,采集、灭活并稀释至630nm下呈20%T)作为凝集抗原,并加入至每个孔中。摇晃这些平板,并在35±2℃下培养2小时。在室温下第二次培养22小时后,对这些平板读数。终点滴度可使用显示出50%凝集的最后一个孔来决定。
p68 ELISA滴度——在涂布有对博德特氏杆菌p68抗原特异的多克隆抗血清的96孔微量滴定板上,捕获重组p68抗原。将连续二倍级数稀释的犬血清加入至板中并培养。每块板上包含以1∶1000稀释的阳性和阴性对照。使用过氧化物酶标记的亲和纯化的羊抗犬IgG指示剂共轭物,来探测p68抗原的特异抗体。然后加入发色底物ABTS,当阳性对照孔O.D.为1.2+0.2时,对该板读数。以最后稀释液的倒数计算所提供的样品的滴度,其光密度大于阴性对照血清稀释液均数加上五个标准差。
SAA滴度——使用购自Accuplex Co.,University of NebraskaMedical Center,Omaha,NB 68198的试剂盒来评价犬血清淀粉样蛋白A滴度。简单地说,在涂布有抗犬SAA单克隆抗体的微量滴定板上,捕获犬SAA。将犬血清的稀释样品加入至该板中,随后加入生物素标记的抗犬抗体共轭物。培养后,加入过氧化物酶交联的抗生物素蛋白链菌素显色底物。30分钟后对该板进行读数。
结果
直肠温度
直肠温度测定值总结在表10和11中。
表10.在接种盐水或p68博德特氏杆菌后(第一次接种后
a),犬直肠温度(℃)的最小均方
处理剂 |
直肠温度(℃) |
标准误差 |
研究天数 |
0 |
1 |
2 |
3 |
T01盐水IM |
38.2 |
38.2 |
38.2 |
38.2 |
0.08 |
T02盐水SC |
38.0 |
38.3 |
38.2 |
38.2 |
0.09 |
T03 p68 SC |
38.1 |
38.3 |
38.1 |
38.0 |
0.06 |
T04 p68 IM |
38.2 |
38.4 |
38.2 |
38.2 |
0.06 |
a在第0天时进行第一次接种。
表11.在接种盐水或p68博德特氏杆菌后(第二次接种后
a),犬直肠温度(℃)的最小均方
处理剂 |
直肠温度(℃) |
标准误差 |
研究天数 |
21 |
22 |
23 |
24 |
T01盐水IM |
38.1 |
38.3 |
38.2 |
38.2 |
0.10 |
T02盐水SC |
38.5 |
38.5 |
38.2 |
38.2 |
0.10 |
T03 p68 SC |
38.0 |
38.3 |
38.1 |
38.1 |
0.08 |
T04 p68 IM |
38.1 |
38.4 |
38.4 |
38.4 |
0.08 |
a在第21天时进行第二次接种。
在第一次接种后,在任何一天任何组之间均没有出现显著差异。在第21天时,在接种盐水的犬与所有接种p68的犬之间均有显著差异(T01、T02对T03、T04,p=0.0053)。在第24天时,在p68 SC与IM接种之间显示有显著差异(p=0.0124)。
注射部位反应
注射部位反应总结在表12和13中。由于技术上的疏忽,在第二次接种后的第14天(第35天)没有进行注射部位观察。
在T03(p68 SC)中观察到可测量到的部位反应,其体积最小。在第3天T04(p68 IM)的一只犬中注意到有小的注射部位反应,但是此测量值的影响最小,不会反映到该组的总体均数中。
表12.在接种盐水或p68(15微克/剂量)博德特氏杆菌后(第一次接种后
a),犬注射部位反应的最小均方(cm
3)
处理剂b |
注射部位反应的平均体积(cm3) |
研究天数 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
14 |
T01盐水IM |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
T02盐水SC |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
T03 p68 SC |
7.4 |
4.3 |
6.8 |
3.4 |
2.5 |
2.6 |
1.9 |
0.1 |
T04 p68 IM |
0.0 |
0.0 |
0.0c |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
a在第0天时进行第一次接种。
b标准误差,T01=0.80、T02=0.84、T03=0.70、T04=0.70
c一只犬具有很小的部位反应(0.5cm2),但是由于四舍五入,此最小值的影响并不反映在总体均数中。
表13.在接种盐水或p68(15微克/剂量)博德特氏杆菌后(第二次接种后
a),犬注射部位反应的最小均方(cm
3)
处理剂b |
注射部位反应的平均体积(cm3) |
研究天数 |
22 |
23 |
24 |
25 |
26 |
27 |
28 |
T01盐水IM |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
T02盐水SC |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
T03 p68 SC |
8.6 |
9.2 |
9.5 |
7.3 |
5.2 |
4.7 |
5.1 |
T04 p68 IM |
0.0 |
0.0 |
0.0c |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
a在第21天时进行第二次接种。
b标准误差,T01=1.12、T02=1.19、T03=0.92、T06=0.92
在注射部位测量值上的显著差异总结在表14中。在第一次接种后的六天,都注意到在T02(盐水SC)与T03(p68 15微克SC)注射部位测量值之间的显著差异。在第7天和再次在第14天(二周再评价观察)时,任何处理组之间没有注意到有显著差异。
在第二次接种后的七天,在T02组(盐水SC)与T03(p68 15微克SC)注射部位测量值之间注意到有显著差异。
表14.在注射部位反应测量值的最小均方中事前对比的显著性值。
研究天数 |
对比(处理组与处理组) |
p-值 |
1 |
T02 v T03T03 v T04T01T02 v T03T04 |
0.00010.00010.0001 |
2 |
T02 v T03T03 v T04T01T02 v T03T04 |
0.00070.00080.0101 |
3 |
T02 v T03T03 v T04T01T02 V T03T04 |
0.00010.00010.0002 |
4 |
T02 v T03T03 v T04T01T02 v T03T04 |
0.00440.00420.0339 |
5 |
T02 V T03T03 v T04 |
0.03130.0253 |
22 |
T02 v T03T03 v T04T01T02 v T03T04 |
0.00010.00010.0002 |
23 |
T02 v T03T03 v T04T01T02 v T03T04 |
0.00010.00010.0001 |
24 |
T02 v T03T03 v T04T01T02 v T03T04 |
0.00010.00010.0001 |
25 |
T02 v T03T03 v T04T01T02 v T03T04 |
0.00010.00010.0013 |
26 |
T02 v T03T03 v T04T01T02 v T03T04 |
0.00130.00070.0172 |
27 |
T02 v T03T03 v T04T01T02 v T03T04 |
0.00350.00190.0313 |
仅显示有显著性的(P<0.05)对比。
p68 ELISA滴度
p68 ELISA数据总结在表15和图1中。由于在接种犬中对p68有相当大的滴度反应,故在研究中的不同时间点使用不同的滴定最小值。第0及21天的滴定从50开始。对第35、45及59天,以200开始滴定。任何报告为“小于”的数值均在分析前除以2。在研究进程中,由于这些最小的滴定值,在对照组(T01及T02)中观察到p68 ELISA值有增加。凝集滴度保持<4。
当与接种安慰剂的动物比较时,全部接种p68的动物从接种的第一天至激发日(第0与第45天)都显示滴度至少增加四倍。
表15.在接种盐水或p68(15微克/剂量)后和在支气管炎博德特氏杆菌气溶胶激发后,犬p68(15微克/剂量)ELISA终点滴度
a的几何均数和标准误差。
处理剂 |
研究天数b |
0 |
标准误差 | 21 |
标准误差 | 35 |
标准误差 | 45 |
标准误差 | 59 |
标准误差 |
T01盐水IM |
25.0 |
4.78 |
25.0 |
4.78 |
125.4 |
23.96 |
100.0 |
18.14 |
130.0 |
32.24 |
T02盐水SC |
25.0 |
5.06 |
25.0 |
5.06 |
113.5 |
23.00 |
100.0 |
19.39 |
100.0 |
26.50 |
T03 p68 SC |
25.0 |
3.93 |
189.5 |
29.77 |
10688.7 |
1679.20 |
4555.1 |
603.43 |
8796.0 |
1592.43 |
T04 p68 IM |
25.0 |
3.93 |
121.4 |
19.08 |
11023.7 |
1731.85 |
4419.2 |
585.44 |
13718.1 |
2483.54 |
a第0天和21天的滴定以50开始。第35、45和59天的滴定以200开始。任何报告为“小于”的数值均在分析前除以2。
b第0天进行第一次接种;第21天进行第二次接种;并在第45天进行激发。
接种后和激发后的ELISA滴度的最小均方的显著性差异,列在表16中。在接种完成后,在p68 SC和p68 IM接种动物之间没有注意到显著性差异。
表16:接种后和激发后的p68 ELISA终点滴度的最小均方之间,事前对比的显著性值。
研究天数 |
对比 |
p-值 |
21 |
T01 v T04T02 v T03T03 v T04 |
0.00010.00010.0491 |
35 |
T01 v T04T02 v T03 |
0.00010.0001 |
45 |
T01 v T04T02 V T03 |
0.00010.0001 |
59 |
T01 v T04T02 v T03 |
0.00010.0001 |
仅显示有显著性的(P<0.05)对比。
血清淀粉样蛋白A滴度
在激发后的第0、1、3、5、7和9天测定SAA数值。血清淀粉样蛋白A的数值在表17中列出并表示在图2中。
表17.在接种盐水和p68(15微克/剂量)博德特氏杆菌的犬中,用支气管炎博德特氏杆菌气溶胶激发后,血清淀粉状蛋白A滴度的几何均数和标准误差
血清淀粉样蛋白A的几何均数和标准误差 |
研究天数a |
|
45 |
46 |
48 |
50 |
52 |
54 |
TRT |
均数 |
标准误差 |
均数 |
标准误差 |
均数 |
标准误差 |
均数 |
标准误差 |
均数 |
标准误差 |
均数 |
标准误差 |
T01 |
0.1 |
0.02 |
277.3 |
125.30 |
82.4 |
42.17 |
69.8 |
28.60 |
6.0 |
2.24 |
1.2 |
0.33 |
T02 |
0.4 |
0.06 |
384.5 |
185.63 |
128.9 |
70.46 |
215.9 |
94.56 |
28.0 |
11.23 |
3.7 |
1.11 |
T03 |
0.5 |
0.05 |
31.7 |
10.51 |
6.0 |
2.25 |
2.3 |
0.68 |
0.8 |
0.23 |
1.3 |
0.27 |
T04 |
0.3 |
0.04 |
50.0 |
16.58 |
8.6 |
3.22 |
5.0 |
1.50 |
2.4 |
0.65 |
0.7 |
0.14 |
a在第45天激发
SAA滴度的显著性差异总结在表18中。在激发后第1、3和5天,盐水对照的SAA滴度显示比接种的犬高。当与激发后第7和9天的SC接种犬相比,盐水SC对照继续显示明显较高的SAA滴度。
表18.激发后的血清淀粉样蛋白A滴度的最小均方之间,事前对比的显著性值。
研究天数 |
对比(处理组比处理组) |
p-值 |
46 |
T01 v T04T02 v T03 |
0.00250.0001 |
48 |
T01 v T04T02 v T03 |
0.00070.0001 |
50 |
T01 v T04T02 v T03 |
0.00010.0001 |
52 |
T01 v T02T02 v T03 |
0.00930.0001 |
54 |
T02 v T03 |
0.0493 |
仅显示有显著性的(P<0.05)对比。
咳嗽观察
在第二次接种后24天(第45天)对所有处理组进行气溶胶激发。使用两种方法来进行咳嗽观察——以连续两天咳嗽为准的疾病状态(显示在表19中)和咳嗽天数的百分比(显示在表20和21中)。当使用连续两天咳嗽的标准来评价犬时,80%p68接种犬(SC和IM)至少咳嗽连续两天,而盐水SC和盐水IM接种犬分别为100%和87.5%。当用观察到咳嗽天数的百分比来评价犬时,p68 SC和IM接种犬观察到有咳嗽的天数百分比分别为38.72%和41.05%。盐水SC和盐水IM接种犬咳嗽天数的百分比分别为69.04%和62.66%。
表19.在接种盐水和p68(15微克/剂量)博德特氏杆菌的犬中,用支气管炎博德特氏杆菌气溶胶激发后,以连续两天咳嗽为标准的疾病状况的总结
处理组编号 |
犬数量 |
连续两天咳嗽的犬百分比 |
T01盐水IM |
8 |
87.5 |
T02盐水SC |
7 |
100 |
T03 p68 15微克/剂量SC |
15 |
80.0 |
T04 p68 15微克/剂量IM |
15 |
80.0 |
当疾病状况用连续二天咳嗽作为标准时,在接种盐水与接种p68的犬之间没有显著差异。
表20.在接种盐水和p68(15微克/剂量)博德特氏杆菌的犬中,用支气管炎博德特氏杆菌气溶胶激发后的咳嗽天数的平均百分比
处理组 |
犬数量 |
均数 |
标准误差 |
T01盐水IM |
8 |
62.66% |
8.67 |
T02盐水SC |
7 |
69.04% |
8.86 |
T03 p68 15微克SC |
15 |
38.72% |
6.38 |
T04 p68 15微克IM |
15 |
41.05% |
6.44 |
在T02(盐水SC)与T03(p68 15微克SC)之间显示有显著差异(p=0.0112)。在T01(盐水IM)与T04(p68 15微克IM)之间显示没有显著差异。
表21.在接种盐水和p68(15微克/剂量)博德特氏杆菌的犬中,用支气管炎博德特氏杆菌气溶胶激发后,处理后的咳嗽天数平均百分比
参数 |
估计值 |
标准误差 |
盐水均数(T01&T02) |
65.89% |
1.10 |
15微克/剂量均数(T03&T04) |
39.88% |
4.34 |
在盐水对照与p68接种犬之间显示有显著差异(p=0.0022)。
讨论
本研究设计的目的是阐明p68博德特氏杆菌15微克/剂量疫苗在犬中的安全性及功效。
使用注射部位和直肠温度观察来检验安全性。注射部位反应测量值的分析表明,在IM接种组中的反应可忽略,而在SC接种组中的反应最小。所观察到的反应趋向变小,通常在观察期间体积会减小。这些反应体积在未剪毛的犬中很有可能被忽略。虽然在第21天时观察到盐水与接种犬之间、以及在第24天时在IM与SC接种之间有显著的差异,但所有组中所有犬的直肠温度在临床均不显著,且都在正常限度内。
使用p68 ELISA终点滴度的测量值和咳嗽的观察来检验功效。不管是何给药途径,在第35天时p68接种组中均显示有良好的p68抗体反应。在激发后接种者中观察到良好的回忆应答。与SC途径相比,虽然传统上更多血管及较少脂肪的IM途径可获得较高的抗体反应,但在整个研究过程中,p68 SC与IM接种者之间没有显著差异。
在激发后,在接种和未接种p68博德特氏杆菌的犬中SAA反应的检验表明,在接种的动物组中,特别是在激发后第1、3和5天时,SAA值增加的幅度较小。
结论
在此研究中,使用在接种后24天的犬激发模型来检验15微克/剂量的p68犬博德特氏杆菌疫苗的功效。正常的直肠温度、最小的注射部位反应表明疫苗是安全的,在结合的IM和SC组中证明了功效。SAA数值的比较显示在气溶胶激发后第1、3和5天,接种盐水与接种p68的犬之间有显著差异。
实施例3
犬博德特氏杆菌p68疫苗持续6个月的免疫学研究
动物
购买九十只雄性及雌性杂种犬,大多数幼犬在第一次接种当天为9周龄(±1周)。
在犬到达研究场所后给予MLV细小病毒疫苗。为了符合研究条件,通过气管拭子及凝集滴度确定动物对支气管炎博德特氏杆菌的反应呈阴性。在研究期间,不给予除实验产品以外的疫苗。
必须将犬保持在隔离设备中以防止在激发前接触支气管炎博德特氏杆菌和犬科病原体。在用支气管炎博德特氏杆菌气溶胶激发后,继续该隔离措施以防止接触其它犬科病原体。
疫苗
在处理组T01及T02中使用无菌盐水作为安慰剂疫苗。在处理组T03及T04中使用犬重组p68支气管炎博德特氏杆菌疫苗。将p68抗原的结构基因在大肠杆菌中克隆,基因的表达由温度敏感型启动子来调控。将细胞溶解,离心分离包涵体。通过SDS处理来溶解在包涵体中的重组p68。将15微克的p68和60微克的p68分别与在无菌Lepto盐水中(作为稀释剂)50微克/毫升的Quil A及50微克/毫升的胆固醇结合。在4℃下将这些结合组分混合24小时,并通过微流器(microfluidizer)三次。每1毫升剂量包含2.7微升乙醇及0.0001%硫柳汞。在实验疫苗中,p68的浓度由p68 ELISA测量。全部测定重复五(5)次。所有疫苗在组合后6个月内使用。
激发接种物
将支气管炎博德特氏杆菌-Bihr Cat株接种在Bordet-Genou琼脂板中,并在37.5+/-2.5℃下培养48小时。选择毒性I期集落并在Bordet-Genou琼脂上划痕,在37.5+/-2.5℃下培养24小时。在培养后,使用博德特氏杆菌盐水冲洗来自该琼脂的集落,并将细胞稀释至600nm下光密度为0.80。在激发之前和之后进行细胞计数,以确证浊度计读数。激发靶浓度为大约1×109CPU。对于I组,激发前浓度计数为1.94×109CFU,激发后浓度计数为1.43×109。对于II组,激发前浓度计数为2.55×109,激发后浓度计数为2.13×109。
研究设计
总结表
处理组 | 处理剂 | 途径 |
动物数目第一次接种的天数 |
第0天(I组) |
第20天(II组) |
动物的总数目 |
T01 |
盐水对照 |
皮下 |
8 |
7 |
15 |
T02 |
盐水对照 |
肌肉内 |
8 |
7 |
15 |
T03 |
p68 60微克/剂量 |
皮下 |
8 |
7 |
15 |
T04 |
p68 60微克/剂量 |
肌肉内 |
8 |
7 |
15 |
T05 |
p68 15微克/剂量 |
皮下 |
8 |
7 |
15 |
T06 |
p68 15微克/剂量 |
肌肉内 |
8 |
7 |
15 |
以两阶段或组进行本研究,I组由48只犬组成,II组为42只犬。每个组在第0天时进行#1接种。20天后进行#2接种。I组中的事件与在II组中的事件偏差大约15天。在最后一次接种后181天,用支气管炎博德特氏杆菌气溶胶激发犬。
随机化/设盲
根据完全随机化设计对动物随机分配处理组和房间。
在每个研究组中,从#1接种至激发日的期间,使用随机化方案将动物随机分配至处理组和房间中(每个房间3至5只犬)。
在激发当天,使用广义区组设计将以前处理的动物随机分配至激发的房间内。
不了解处理组分组情况的经认证合格的人进行微生物学和血清学测定,并评价咳嗽和注射部位。
数据分析
接种后反应变量由注射部位数据、直肠温度和p68 ELISA滴度组成。注射部位数据总结如下:1)处理和研究天数与具有可测量反应的动物数目的关系,2)处理与具有可测量反应的动物时间点数目的关系,3)处理与在任何时间点具有可测量反应的动物数目的关系,4)每只动物可测量的反应的持续时间。
使用一般线性混合模型单独对第一次和第二次接种分析注射部位体积(cm3)、直肠温度和自然对数转换的p68 ELISA滴度数据。
构建观察时间点最小均方对处理作图的事前线性对比,以检验处理组在每个观察时间点的差异,并比较每次处理内的时间点。有兴趣的特定比较为T01比T03、T01比T05、T03比T05、T02比T04、T02比T06及T04比T06。如果时间点-处理-研究组交互作用项处显著性,P<0.05,在每个时间点的处理组之间、和处理组中的时间点之间的对比都在每个研究组内,否则这些对比将以时间点-处理交互作用效应最小均方为准。对于所有比较,使用5%的显著性水平。
激发后反应变量由p68 ELISA滴度、血清淀粉样蛋白A滴度和每日的咳嗽观察所组成。如前所述来分析激发后的p68 ELISA滴度。对激发后血清淀粉样蛋白A(SAA)滴度数据,在使用一般线性混合模型分析前,对该滴度值进行自然对数转换。
修改咳嗽的分析以反映USDA的要求。对每只犬而言,计算观察到咳嗽的期间的观察周期百分比。在分析前,使用反正弦平方根转换来转换该百分比。使用一般线性混合模型来分析咳嗽。
将来自此分析的最小均方值转换回百分比,并且咳嗽减少的百分比如下计算:
减少百分比=100×(对照组均数-处理组均数)/(对照组均数)
构建处理最小均方的事前线性对比,以检验处理组的差异。有兴趣的特定比较为T01比T03、T01比T05、T03比T05、T02比T04、T02比T06和T04比T06。如果处理-研究组交互作用项有显著性,P<0.05,处理组之间的对比在每个研究组内,否则处理组之间的对比以处理主要效应最小均方为准。对于所有比较,使用5%的显著性水平。
研究步骤
详细的动物处理步骤
在达到研究前提之前和第一次接种前,对幼犬进行气管拭子以进行支气管炎博德特氏杆菌培养,并收集血液用于凝集滴度检测。所有动物对博德特氏杆菌呈气管拭子阴性和血清学阴性,被认为符合研究条件。将48只幼犬随机分配至六个处理组之一中,为I组。重复该步骤,用42只犬做为II组。使动物适应研究场所至少5天。
各组和处理详述在第7.4.A节。由于设备限制和为了提高在激发后咳嗽观察的准确性,接种和各自的激发时间交错15天,以得到二个犬的组。对I组和II组,第0天指#1接种当天。20天后进行#2接种。经皮下途径进行T01、T03和T05的处理。经肌肉内途径进行T02、T04和T06的处理。在颈的背外侧进行皮下注射。对于#1接种,使用右颈;对#2接种,使用左颈。对#1接种和#2接种,分别在右侧和左侧半膜肌肌肉处进行肌肉内注射。在每次接种后对全部注射部位进行三维测量七天,在接种后14天进行跟踪测量。在接种当天(在接种前)和在每次接种后三天监测直肠温度。在每次接种前(在第-1天和第19天)和在第50天时收集血液用于p68 ELISA滴度测定。
每个月,对所有经镇静的犬进行气管拭子用于支气管炎博德特氏杆菌培养,以确认支气管炎博德特氏杆菌的阴性状态。也收集血液用于凝集和ELISA滴度的检测。在激发前对每组重复该步骤7天。阳性气管拭子培养或凝集滴度增加的证据将动物从研究中排除。
在#2接种后181天,对犬进行激发。使用一次性鼻锥对经镇静的犬激发,该鼻锥被舒适地安装在经镇静的犬的口鼻上。将该鼻锥接在喷雾器上,该喷雾器接在设定于5.5至6.0psi的真空压力泵上。将1毫升激发物质置于该喷雾器中,并对每只犬给予雾化的激发物质4分钟。
在激发前,改变激发后的咳嗽观察,以符合USDA的推荐要求。在激发后,观察激发后第三至第十天间的每组犬,总共8天。每日观察动物咳嗽状况两次,每次观察时间大约45分钟。观察期之间的间隔大约为12小时。不了解处理组分配情况的人员记录咳嗽的观察情况。
血液的收集
在每个组第一次接种前、每个月、和激发前收集血液用于凝集滴度的检测。
在#1接种和#2接种前一天、第50天、和之后间隔大约30天后,收集每组的血液用于抗p68 ELISA评价。还收集激发当天和激发后观察期最后一天的血液。
在激发当天(激发前)和在激发后1、3、5、7和9天收集每组的血液用于血清淀粉样蛋白A(SAA)检测。
在样品上进行的检测
通过培养来评价气管拭子上支气管炎博德特氏杆菌的存在。将每个气管拭子在博德特氏杆菌选择性琼脂板上划痕。包括阳性和阴性对照。在37.5±2.5℃下培养平板48±4小时。每块平板上得到的集落与阳性对照组进行比较,并进一步检测显示与阳性对照组相同的任何集落,以确定支气管炎博德特氏杆菌的存在。证实性检测包括使用TSI、柠檬酸盐(Citrate)和尿素琼脂(Urea Agar)和硝酸盐红介质(Nitrate Redmedia)。
使用下列方法来评价血清的凝集滴度、p68 ELISA分析或SAA分析:
凝集滴度——使用博德特氏杆菌盐水将血清连续稀释在微量滴定板中。每块板中包含阳性和阴性对照。使用支气管炎博德特氏杆菌株B7(生长在Bordet Genou琼脂上,采集、灭活并稀释至630nm下呈20%T)作为凝集抗原,并加入至每个孔中。摇晃这些平板,并在35±2℃下培养2小时。在室温下第二次培养22小时后,对这些平板读数。终点滴度可使用显示出50%凝集的最后一个孔来决定。
p68 ELISA滴度——在涂布有对博德特氏杆菌p68抗原特异的多克隆抗血清的96孔微量滴定板上,捕获重组p68抗原。将连续二倍级数稀释的犬血清加入至板中并培养。每块板上包含以1∶1000稀释的阳性和阴性对照。使用过氧化物酶标记的亲和纯化的羊抗犬IgG指示剂共轭物,来探测p68抗原的特异抗体。然后加入发色底物ABTS,当阳性对照孔O.D.为1.2±0.2时,对该板读数。以最后稀释液的倒数计算所提供的样品的滴度,其光密度大于阴性对照血清稀释液均数加上五个标准差。
SAA滴度——在涂布有抗犬SAA单克隆抗体的96孔微量滴定板上捕获犬血清淀粉样蛋白A。将犬血清的稀释样品加入至该板中并培养。加入参考标准品,以获得从0.31纳克/毫升至20纳克/毫升的标准曲线。加入生物素标记的抗犬抗体共轭物。在培养生物素标记的抗犬抗体后,加入交联过氧化物酶的抗生物素蛋白链菌素。加入发色底物TMB,30分钟后对该板进行读数。通过将样品与标准曲线比较,并乘以适当的稀释因子,测定血清淀粉样蛋白A的浓度。
结果
除非另外提到,否则结果均来自I组和II组的综合数据。
气管拭子培养和凝集滴度
在研究进程中,有11只犬显示气管拭子培养物阳性和/或凝集滴度升高。将这些犬和与呈阳性的犬圈养在一起的犬从该研究中排除,这样减少了20只犬。从每组中排除的犬数为:T01-4只犬,T02-2只犬,T03-3只犬,T04-1只犬,T05-5只犬,T06-5只犬。
注射部位观察
注射部位反应总结在表22-25中。由于技术的疏忽,在第21天时没有收集I组81595犬的注射部位信息。修改该试验方案,这样不收集II组犬第22天的注射部位反应数据,来自第22天的数据的概述仅包含来自I组中每个处理组八只犬的信息。接受IM处理的任何犬没有观察到注射部位反应。对于SC接种的两个处理组(T03和T05),注射部位测量值最小。
表22.在接种盐水或p68博德特氏杆菌后(第一次接种后
a),犬注射部位反应的最小均方(cm
3)
处理组 |
平均体积(cm3)b |
研究天数 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
14 |
T01 盐水SC |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
T02 盐水IM |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
T03 60μg SC |
5.8 |
6.4 |
7.3 |
6.3 |
5.0 |
4.9 |
2.7 |
0 |
T04 60μg IM |
0 |
0 |
0 |
0 |
0. |
0 |
0 |
0 |
T05 15μg SC |
4.4 |
4.6 |
3.1 |
2.1 |
1.2 |
0.9 |
0.7 |
0 |
T06 15μg IM
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
a在第0天时进行#1接种。
b所有均数标准误差=0.64
表23.在接种盐水或p68博德特氏杆菌后(第二次接种后
a),犬注射部位反应的最小均方(cm
3)
处理组 |
平均体积(cm3) |
研究天数 |
21b |
22c |
23b |
24b |
25b |
26b |
27b |
34b |
T01盐水SC |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
T02盐水IM |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
T03 60μg SC |
5.0 |
3.2 |
4.2 |
5.8 |
5.9 |
5.8 |
4.3 |
0.1 |
T04 60μg IM |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
T05 15μg SC |
3.7 |
2.4 |
2.2 |
2.6 |
2.1 |
2.0 |
1.6 |
0 |
T06 15μg IM |
0d |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
a在第20天进行#2接种。
b该天的平均标准误差=0.55。
c该天的平均标准误差=0.70。
dT06组第21天的标准误差=0.57。
表24.在接种盐水或p68博德特氏杆菌后(第一次接种后
a),具有可测量到的注射部位反应的犬的百分比
处理组 |
可测量到的反应的百分比 |
n |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
14 |
T01盐水SC |
15 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
T02盐水IM |
15 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
T03 60μg SC |
15 |
66.7 |
73.3 |
73.3 |
73.3 |
73.3 |
73.3 |
66.7 |
0 |
T04 60μg IM |
15 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
T05 15μg SC |
15 |
73.3 |
73.3 |
60.0 |
60.0 |
53.3 |
46.7 |
46.7 |
0 |
T06 15μg IM |
15 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
a在第0天进行#1接种。
表25.在接种盐水或p68博德特氏杆菌后(第二次接种后
a),具有可测量到的注射部位反应的犬的百分比
处理组 |
可测量到的反应的百分比 |
研究天数 |
n |
21 |
22b |
23 |
24 |
25 |
26 |
27 |
34 |
T01盐水SC |
15 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
T02盐水IM |
15 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
T03 60μg SC |
15 |
80.0 |
50.0 |
66.7 |
66.7 |
80.0 |
80.0 |
80.0 |
6.7 |
T04 60μg IM |
15 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
T05 15μg SC |
15 |
73.3 |
50.0 |
73.3 |
73.3 |
73.3 |
73.3 |
66.7 |
0 |
T06 15μg IM |
15 |
0c |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
a在第0天进行#2接种。
b第22天n=8
cT06组第21天n=14
注射部位测量值间的显著性差异总结在表26中。在第一次接种后的七天,T01(盐水SC)与T03(60微克SC)注射部位测量值之间注意到有显著性差异。在第一次接种后,仅有前四天在T01(盐水SC)与T05(15微克SC)之间注意到有显著性差异。在第3至7天,在T03(60微克SC)与T05(15微克SC)之间发现有显著性差异。在第14天(两周再评估观察),在任何组之间没有差异。
在第二次接种后的七天,在T01(盐水SC)与T03(60微克SC)和T05(15微克SC)注射部位测量值之间注意到有显著性差异(p=0.0138)。在第23至27天,在T03(60微克SC)与T05(15微克SC)之间发现有显著性差异。第34天(两周再评估观察),在任何组之间没有注意到有差异。
表26.在注射部位反应测量值的最小均方中事前对比的显著性值
研究天数 |
对比(处理组比处理组) |
p-值 |
1 |
T01 v T03T01 v T05 |
0.00010.0001 |
2 |
T01 v T03T01 v T05 |
0.00010.0001 |
3 |
T01 v T03T01 v T05T03 v T05 |
0.00010.00060.0001 |
4 |
T01 v T03T01 v T05T03 v T05 |
0.00010.02140.0001 |
5 |
T01 v T03T03 v T05 |
0.00010.0001 |
6 |
T01 v T03T03 v T05 |
0.00010.0001 |
7 |
T01 v T03T03 v T05 |
0.00310.0258 |
21 |
T01 v T03T01 v T05 |
0.00010.0001 |
22 |
T01 v T03T01 v T05 |
0.00100.0166 |
23 |
T01 v T03T01 v T05T03 v T05 |
0.00010.00550.0113 |
24 |
T01 v T03T01 v T05T03 v T05 |
0.00010.00080.0001 |
25 |
T01 v T03T01 v T05T03 v T05 |
0.00010.00670.0001 |
26 |
T01 v T03T01 v T05T03 v T05 |
0.00010.01040.0001 |
27 |
T01 v T03T01 v T05T03 v T05 |
0.00010.04750.0004 |
仅显示有显著性(P<0.05)的对比。
直肠温度
直肠温度测量值总结在表27和28中。修改试验方案,这样就不收集II组犬第22天的直肠温度数据,因此,第22天数据的概述仅包含来自I组中每个处理组犬的信息。
表27.在接种盐水或p68博德特氏杆菌后(第一次接种后
a),犬直肠温度(℃)的最小均方
处理组 |
直肠温度(℃)b |
研究天数 |
0 |
1 |
2 |
3 |
T01盐水SC |
38.5 |
38.4 |
38.3 |
38.2 |
T02盐水IM |
38.4 |
38.2 |
38.4 |
38.2 |
T03 60μg SC |
38.4 |
38.5 |
38.2 |
38.3 |
T04 60μg IM |
38.4 |
38.5 |
38.4 |
38.4 |
T05 15μg SC |
38.5 |
38.5 |
38.2 |
38.2 |
T06 15μg IM |
38.5 |
38.4 |
38.3 |
38.4 |
a在第20天进行#1接种。
b标准误差=0.09
表28.在接种盐水或p68博德特氏杆菌后(第二次接种后
a),犬直肠温度(℃)的最小均方
处理组 |
直肠温度(℃) |
研究天数 |
20b |
21b |
22c |
23b |
T01盐水SC |
38.6 |
38.5 |
38.3 |
38.4 |
T02盐水IM |
38.6 |
38.6 |
38.3 |
38.4 |
T03 60μg SC |
38.7 |
38.6 |
38.6 |
38.4 |
T04 60μg IM |
38.8 |
38.7 |
38.5 |
38.5 |
T05 15μg SC |
38.6 |
38.6 |
38.5 |
38.4 |
T06 15μg IM |
38.7 |
38.7 |
38.4 |
38.5 |
a在第20天进行#2接种。
b标准误差=0.08
c标准误差=0.11
在第一次接种后第1天,注意到在T02(盐水IM)与T04(60微克IM)之间的直肠温度有显著性差异。在第二次接种后的任何一天,在任何组的直肠温度之间没有发现显著性差异。
p68 ELISA滴度
激发前的p68 ELISA数据总结在表29中。由于在第19天T06 I组的犬有反应,在p68 ELISA滴度的数据分析中可观察到该组引起的影响。该影响小且不影响其它分析的时间点。因此,I组和II组的数据综合起来用于报告。
在接种的犬中,由于对p68有相当大的滴度反应,在本研究中,在不同的时间点使用不同的滴定最小值。第-1和19天的滴定以50开始。对第50至195天,滴定以200开始。在第201及211天收集的样品的滴定以1000开始。任何报告为“小于”的数值,在分析前都除以2。在研究进程中,在对照组(T01和T02)的p68 ELISA值中所观察到的增值是这些最小滴定值所产生的。除了先前所提到的外,凝集滴度保持<4。
在第50天,全部接种安慰剂的犬的p68滴度<200。在第二次接种后(第0天对第50天),当与接种安慰剂的动物比较时,全部接种p68的动物的滴度显示至少增加四倍。
表29.在接种p68博德特氏杆菌后,在第0天及第20天时,犬p68 ELISA终点滴度的几何均数和标准误差
处理组 |
研究天数 |
-1a |
19a |
50b |
均数 |
标准误差 |
均数 |
标准误差 |
均数 |
标准误差 |
T01盐水SC |
31.4 |
5.06 |
30.5 |
4.92 |
100.0 |
16.14 |
T02盐水IM |
27.7 |
4.47 |
25.0 |
4.03 |
100.0 |
16.14 |
T03 p68 60μg SC |
29.8 |
4.80 |
507.6 |
81.92 |
10633.5 |
1715.94 |
T04 p68 60μg IM |
26.7 |
4.31 |
249.7 |
40.29 |
4722.2 |
762.02 |
T05 p68 15μg SC |
25.0 |
4.03 |
268.7 |
43.36 |
5622.8 |
907.35 |
T06 p68 15μg IM |
33.4 |
5.40 |
91.8 |
14.81 |
3528.9 |
569.46 |
a第-1和19天的滴定以50开始。任何报告为“小于”的数值,在分析前都除以2。
b第50天的滴定以200开始。任何报告为“小于”的数值,在分析前都除以2。
接种后ELISA滴度的最小均方的显著性差异列于表30中。在接种前(第-1天),SC对照和SC接种或IM对照和IM接种之间,在p68ELISA滴度上没有观察到显著的差异。
表30.接种后p68 BLISA终点滴度的最小均方之间,事前对比的显著性值
研究天数 |
对比 |
p-值 |
19 |
T01 v T03T01 v T05T02 v T04T02 v T06T03 v T05T04 v T06 |
0.00010.00010.00010.00010.00610.0001 |
50 |
T01 v T03T01 v T05T02 v T04T02 v T06T03 V T05 |
0.00010.00010.00010.00010.0059 |
仅显示有显著性(P<0.05)的对比。
在研究进程中所测量的p68 ELISA滴度总结于表31并显示于图3。
在研究进程中,尝试每种方法以协调在I组和II组间的活动。对关键的数据采集时间点(即,围绕接种和激发的事件),这种尝试可实现。在本研究过渡期间的三个实例中,各组之间的血液及气管拭子采集会变化1或2天。为了总结及报告此过渡期间的p68 ELISA数据,这些天的数据合并在一起。因此,第79天包括来自第79天(I组)与第81天(II组)的合并数据,第111天与第110天(II组)和第111天(I组)相应,而第169天则与第169天(II组)及第170天(I组)相应。在每个试验方案中,不对超过第50天的p68 ELISA数据进行数据分析。
表31.在接种和用支气管炎博德特氏杆菌气溶胶激发后,在未接种和接种p68博德特氏杆菌的犬中,p68 ELISA终点滴定的几何均数的总结
处理组 |
p68 ELISA终点滴度的几何均数a |
研究天数b,c |
79 |
110 |
140 |
169 |
195 |
201 |
211 |
T01盐水SC |
100.00 |
154.92 |
106.00 |
108.59 |
117.18 |
109.14 |
500.0 |
T02盐水IM |
112.85 |
145.33 |
130.61 |
115.51 |
113.43 |
112.37 |
500.0 |
T03 60μg SC |
3434.24 |
2884.97 |
1861.64 |
1895.56 |
3097.24 |
2408.61 |
81564.79 |
T04 60μg IM |
1508.60 |
1164.81 |
933.12 |
987.64 |
1142.01 |
1547.87 |
59940.47 |
T05 15μg SC |
1699.20 |
1511.80 |
1229.35 |
1312.62 |
2248.63 |
2244.47 |
29869.29 |
T06 15μg IM |
974.18 |
916.21 |
573.51 |
876.15 |
1505.01 |
1458.16 |
11503.28 |
a第50至195天的滴定从200开始。在第201天和211天时所收集的样品的滴定从1000开始。任何报告为“小于”的数值,在分析前都除以2。
b#1和#2接种分别在第0和20天进行。在第201天进行激发。
c在研究进程中,尝试每种方法以协调在I组和II组间的活动。在三个实例中,各组的血液采集会变化1或2天。为了总结数据,这些天的数据合并在一起。不对超过第50天的p68 ELISA滴度进行分析。第79天与第79天和第81天对应,第110天与第110天和第111天对应,第169天与第169天和第170天对应。
咳嗽观察
在第二次接种后,对两组进行181天的气溶胶激发。为了符合USDA的建议,将咳嗽标准改变成大约45分钟的观察,在激发后第三至八天大约间隔十二小时。咳嗽观察总结于表32和33中。
表32.用支气管炎博德特氏杆菌气溶胶激发后,在未接种及接种p68博德特氏杆菌的犬中的咳嗽时间点的平均百分比
|
处理剂 |
犬的数目 |
均数 |
标准误差 |
T01 |
盐水SC |
11 |
75.44% |
7.73 |
T02 |
盐水IM |
13 |
80.50% |
6.64 |
T03 |
p68 60μg SC |
12 |
67.30% |
8.12 |
T04 |
p68 60μg IM |
14 |
71.81% |
7.32 |
T05 |
p68 15μg SC |
10 |
36.30% |
9.19 |
T06 |
p68 15μg IM |
10 |
39.55% |
9.18 |
表33.用支气管炎博德特氏杆菌气溶胶激发后,在未接种及接种p68博德特氏杆菌的犬中,经处理的咳嗽时间点的平均百分比
参数 |
估计值 |
标准误差 |
盐水平均(T01&T02) |
78.26% |
5.28 |
60μg/剂量平均(T03&T04) |
69.58% |
5.68 |
15μg/剂量平均(T05&T06) |
37.92% |
6.70 |
当与盐水对照相比时,15微克/剂量组的咳嗽减少百分比为51.55%,60微克/剂量组为11.09%。统计学的显著性差异总结在表34中。
表34.在咳嗽时间点百分比的最小均方中事前对比的显著性值
对比 |
p-值 |
T01 v T05 |
0.0041 |
T03 v T05 |
0.0199 |
T02 v T06 |
0.0019 |
T04 v T06 |
0.0119 |
T01&T02 v T05&T06 |
0.0001 |
(仅显示有显著性(P<0.05)的对比。)
血清淀粉样蛋白A
在激发后第0、1、3、5、7及9天测定SAA值。血清淀粉样蛋白A值显示在表35并在图4中表示。
表35.用支气管炎博德特氏杆菌气溶胶激发后,在未接种及接种p68博德特氏杆菌的犬中,血清淀粉样蛋白A滴度的几何均数和标准误差
TX |
血清淀粉样蛋白A的几何均数和标准误差a |
研究天数 |
201 |
202 |
204 |
206 |
208 |
210 |
均数 |
标准误差 |
均数 |
标准误差 |
均数 |
标准误差 |
均数 |
标准误差 |
均数 |
标准误差 |
均数 |
标准误差 |
T01 |
1.1 |
0.33 |
257.3 |
84.61 |
371.6 |
116.44 |
548.7 |
171.93 |
68.0 |
21.31 |
9.4 |
2.95 |
T02 |
1.0 |
0.28 |
114.0 |
32.83 |
111.9 |
32.21 |
108.9 |
31.36 |
15.6 |
4.48 |
1.7 |
0.49 |
T03 |
0.8 |
0.25 |
135.7 |
40.55 |
119.7 |
35.75 |
74.5 |
22.25 |
10.9 |
3.38 |
1.0 |
0.30 |
T04 |
0.8 |
0.23 |
134.7 |
39.20 |
156.0 |
43.59 |
174.8 |
48.86 |
34.6 |
9.67 |
1.9 |
0.54 |
T05 |
0.8 |
0.28 |
68.4 |
22.85 |
88.3 |
29.50 |
9.3 |
3.12 |
1.9 |
0.64 |
2.0 |
0.66 |
T06 |
0.8 |
0.27 |
45.7 |
14.94 |
54.0 |
17.67 |
9.4 |
3.07 |
1.9 |
0.63 |
0.8 |
0.27 |
a在第201天进行激发。
SAA滴度的显著性差异总结在表36中。
表36.激发后血清淀粉样蛋白A滴度的最小均方中事前对比的显著性值。
研究天数 |
对比(处理组比处理组) |
p-值 |
202 |
T01 v T05T02 v T06T04 v T06 |
0.00540.03930.0154 |
204 |
T01 v T03T01 v T05T04 v T06 |
0.00970.00200.0154 |
206 |
T01 v T03T01 v T05T02 v T06T03 V T05T04 v T06 |
0.00010.00010.00010.00010.0001 |
208 |
T01 v T03T01 v T05T02 v T06T03 v T05T04 v T06 |
0.00010.00010.00010.00230.0001 |
210 |
T01 v T03T01 v T05 |
0.00020.0068 |
仅显示有显著性(P<0.05)的对比。
讨论
本研究设计用来显示重组p68博德特氏杆菌疫苗在犬中的安全性和六个月的功效,15微克/剂量和60微克/剂量疫苗都显示出安全性。在研究中,15微克/剂量可良好地保持功效和6个月期间的免疫性。
使用注射部位和直肠温度观察来检验安全性。注射部位反应测量的分析显示在IM接种组中没有反应,在接种15微克/剂量与60微克/剂量SC的两组中有最小的反应。在接种15微克/剂量SC的犬中,所观察到的反应趋向于变小。这种反应看上去很短暂,通常在14天或更少的时间内消除。这些反应的区域在注射部位未剪毛的犬中很有可能被忽略。接种后的直肠温度不明显,全部组的所有犬都在正常限度内。
使用咳嗽观察及p68 ELISA终点滴度的测量来检验接种后181天的免疫性功效及持续时间。在盐水对照中的咳嗽百分比(78.26%)表明,给予研究动物的激发是可接受的。当与对照比较时,15微克/剂量组的咳嗽时间点的百分比(37.92%)显示咳嗽减少了51.55%,满足USDA所规定的功效要求。当与对照比较时,60微克/剂量组(69.58%)显示犬咳嗽的减少最小,证明没有保护作用。
虽然在统计学上没有比较,但从表29和31中可看出,当与IM接种比较时,SC接种有较高抗体反应的趋势。为了进行讨论,进一步的评论考虑到了不同的剂量组并结合IM及SC给药途径的结果。
不管是何给药途径,在两个接种组中第50天时皆显示良好的p68抗体反应,并在整个研究进程中在接种者中保持。在激发后,接种者可观察到良好的回忆应答。
比较研究过程中15微克/剂量和60微克/剂量的p68 ELISA滴度,显示60微克/剂量组具有稍高的滴度反应(图3)。该反应虽然优良,但与气溶胶激发后的保护作用没有关联。在从本研究排除的气管拭子阳性或凝集滴度升高的犬中,p68 ELISA滴度反应是可变的。从本研究中排除的阳性气管拭子培养物和/或升高的凝集滴度的六个对照中的三个,其p68 ELISA滴度保持<200。这似乎表明p68 ELISA滴度与从本研究排除的犬的气管拭子或凝集滴度状态没有关联性。
在接种及未接种p68博德特氏杆菌的犬中,在激发后SAA反应的检验表明,SAA值在15微克/剂量组中较少升高,特别是在激发后第5及7天。
结论
在本研究中,在接种后6个月,使用犬激发模型来检验15微克/剂量与60微克/剂量的p68犬博德特氏杆菌疫苗的功效。直肠温度正常和最小的注射部位反应都可说明两种疫苗是安全的。虽然以15微克/剂量与60微克/剂量接种的犬对接种都显示有良好的血清学反应(可由p68 ELISA滴度来测定),在接种60微克/剂量的犬中,该反应与临床保护作用无关联。当接种60微克/剂量的犬与未接种的对照比较时,在咳嗽上没有显示有显著差异。当与对照比较时,15微克/剂量疫苗使咳嗽减少了超过50%,说明其良好的功效。所显示的保护作用方面的差异可能是60微克/剂量疫苗中SDS水平较高导致的。SAA数值的比较说明在接种组与对照组间的差异。
实施例4
VANGUARD_加5/CV-L的安全性和功效
VANGUARD_加5/CV-L是CD病毒、CAV-2、CPI病毒、CPV的减毒株和犬钩端螺旋体及出血性黄疸钩端螺旋体的灭活全培养物的冻干制剂,加上灭活的CCV的液体制剂与佐剂组成。所有病毒都在已建立的细胞系上繁殖。CPV部分可通过在犬细胞系上低传代而减毒,该细胞系赋予其的免疫性能能够以表38所示的水平压倒母体抗体的干扰。所述液体组分可用来再水合冻干组分,该组分已与替代真空的惰性气体封装。
实验室评价证明经VANGUARD_加5/CV-L免疫的犬可对抗CD、ICH、CAV-2及CPI呼吸道疾病、由CCV及CPV引起的肠炎、及由犬钩端螺旋体及出血性黄疸钩端螺旋体引起的钩端螺旋体病,且在这些疫苗部分之间不存在免疫学干扰。广泛的安全性测试显示出其安全性,且在正常使用条件下,在6周龄的幼犬中基本上无反应。
这也说明CAV-2疫苗可交叉保护对抗由CAV-1所引起的ICH。研究表明CAV-2不仅对抗ICH,而且同样对抗CAV-2呼吸道疾病。在所进行的检测中,从接种CAV-2的犬中不能回收2型犬腺病毒激发病毒。
在VANGUARD_加5/CV-L中的CPV部分接受了全面的安全性及功效检测。在实验室检测和一定现场条件的临床检测中显示是安全的,且基本上没有反应。产物安全性可进一步由直肠(backpassage)研究来说明,该研究包括口服给予易感犬多次剂量的疫苗株,其仍然全部正常。
研究说明3剂量含有CPV病毒滴度增加的疫苗,可克服与母体抗体相关的血清中和(SN)滴度。其他人显示低至1∶4的血清中和滴度,会干扰使用传统改良活疫苗的主动免疫作用。以五十只6周龄幼犬进行临床检测[25只接种(SN滴度范围-256),25只未接种的对照(SN滴度范围4-1024)](表37)。接种组接受3次剂量,从6周龄开始间隔3周进行接种。在第1次接种后,13/25只幼犬CPV SN滴度(血清转化)显示增加4倍或更大(表38)。这13只幼犬中的12只在第一次接种时的母体SN滴度≤1∶16,剩余的幼犬SN滴度为1∶64。另外9只初始SN滴度在1∶16至1∶256之间的幼犬在第二次接种后发生血清转化。它们的母体抗体SN滴度在第二次接种时已下降至≤1∶64。同样,最后3次初始SN滴度为1∶128的接种,在第三次接种后,在其母体抗体CPV滴度降至≤1∶64后,发生血清转化。因此,在本研究中,当从6周龄开始提供3剂量疫苗后,全部25只接种犬(甚至具有最高母体抗体水平的那些犬)都会发生主动免疫(GM=1∶1176;SN滴度的范围128-4096)。在第三次以异种CPV激发病毒接种3周后,对全部50只犬进行激发。25只未接种的对照犬有14只死亡或显示出严重的足以授权安乐死的疾病,然而全部25只接种犬基本上保持健康。因此,在VANGUARD_加5/CV-L中高滴度、低传代的疫苗病毒,具有高度的免疫原性并能在母体抗体的存在下刺激主动免疫性。
VANGUARD_加5/CV-L的CCV部分的功效,在大量疫苗激发研究中已被证明。十六只7至8周龄幼犬用VANGUARD_加5/CV-L接种(接种犬),17只用Vanguard_加5/L接种(对照)。全部幼犬以3周的间隔接受三次1毫升的剂量。在第三次接种后三周,用CCV有毒株(CV-6)对幼犬进行激发。监测感染后的临床观察、温度、体重及血液参数21天。当与对照比较时,CCV接种犬表现出腹泻发生率和有毒CCV脱落(shed)量的减少。在激发后21天,对小肠部分切片的有毒CCV进行荧光抗体染色,显示在CCV接种犬与对照之间可检测到CCV抗原显著地减低(P)(表39)。
表37.接种犬及对照组的起始血清中和(SN)滴度
SN滴度 |
包含的接种# |
包含的对照# |
<1∶2 |
3 |
0 |
1∶4 |
4 |
3 |
1∶8 |
1 |
3 |
1∶16 |
4 |
1 |
1∶32 |
2 |
5 |
1∶64 |
3 |
1 |
1∶128 |
6 |
3 |
1∶256 |
2 |
3 |
1∶512 |
0 |
5 |
1∶1024 |
0 |
1 |
表38.接种后血清中和(SN)滴度的几何均数(范围)
a
组别 |
N |
接种前 |
接种后 |
1 |
2 |
3b |
全部接种犬 |
25 |
1∶24(<2-256) |
1∶108(8-1024) |
1∶605(8-4096) |
1∶1176(128->4096) |
第一次接种后的应答者 |
13 |
1∶6(<2-64) |
1∶460(64-1024) |
1∶1745(256-4096) |
1∶1410(256-4096) |
第二次接种后的应答者 |
9 |
1∶87(16-256) |
1∶20(8-64) |
1∶376(256-1024) |
1∶1625(256-4096) |
第三次接种后的应答者 |
3 |
1∶128(128) |
1∶32(16-64) |
1∶25(8-64) |
1∶203(128-256) |
未接种对照犬 |
25 |
1∶64(4-1024) |
1∶9(<2-64) |
1∶3(<2-64) |
<1∶2(<2-4) |
a在6、9及12周龄接种的犬。
b激发前的SN滴度
表39.在激发后21天,小肠部分切片的荧光抗体染色
|
肠切片 |
荧光抗体阳性的犬% |
接种组 |
对照组 |
十二指肠空肠回肠 |
1 |
0 |
89 |
2 |
0 |
100 |
3 |
0 |
100 |
4 |
0 |
89 |
5 |
0 |
100 |
6 |
12.5 |
56 |
7 |
0 |
78 |
8 |
12.5 |
78 |
9 |
0 |
67 |
10 |
12.5 |
56 |
结论
在本研究中,包含CD病毒、CAV-2、CPI病毒、CPV和犬钩端螺旋体和出血性黄疸型钩端螺旋体的灭活全培养物和CCV的佐剂化联合疫苗,当作为疫苗用于幼犬时,证明是安全和有效的。联合疫苗也显示能克服与母体抗体有关的血清中和(SN)滴度。
实施例5
犬博德特氏杆菌天然p68免疫原性研究
动物
本研究包括二窝SPF小猎犬及二窝随机来源的犬。将犬随机分配为接种或不接种组。本研究包括总共10只接种及11只不接种犬。
实验疫苗的制备
从48小时Bordet-Gengou血液琼脂涂布平板中,通过用5至10毫升热萃取缓冲液冲洗该板表面,收获支气管炎博德特氏杆菌(110H株)。或者,离心去掉上清液部分收获两培养物(Charlotte Parker限定成分培养基)中生长的细胞。将所收获的细胞悬浮在25mM Tris-HCl,pH 8.8中,在60℃下培养1小时。以20,000×g在4℃离心30分钟,从热萃取物中分离细胞碎片。将叠氮化钠(0.01%)加入至热萃取液上清液部分,然后通过微孔过滤进一步净化。
使用标准步骤,通过将单克隆抗体(称为Bord 2-7)与CNBr活化的琼脂糖凝胶4B交联,制备单克隆抗体亲和树脂。将大约30.35毫克的单克隆抗体与1克的亲和树脂交联。以大约1升萃取物对20毫升树脂的比例,将净化的热萃取上清液部分(上面)与Bord 2-7亲和树脂混合。
通过在室温下培养混合物,并轻轻摇晃过夜,然后将树脂沉降并吸出上清液部分,促使天然p68与树脂结合。然后将该树脂填入直径2.6cm的柱中,并相继以PBS(pH 7.5)和10mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)以5毫升/分钟的流速冲洗该柱。当在280nm处的吸光度到达基线水平时,使用100mM的三乙胺来洗脱结合物质,并收集280nm处吸收的单一大波峰的馏分,通过ELISA来检测p68的存在。混合包含p68的馏分并对PBS透析以去除三乙胺。
系列配制的实验疫苗被制成包含大约100微克纯化p68和1%氢氧化铝凝胶的制剂。在1毫升的最后疫苗剂量体积中,使用福尔马林(0.01%)作为防腐剂。
激发接种物
基本如以上实施例所述制备激发物质。
研究步骤
将二十一(21)只血清反应阴性和培养呈阴性的幼犬随机分配到两个处理组之一。十一只犬分配至不接种组(对照组),十只犬分配至接种组。第0天表示第一次接种当天。在第0天时,皮下给药一毫升的疫苗,并在21天后重复。在第一及第二次接种前收集血液用于血清学p68 ELISA检测。
在第35天时(在第二次接种后14天),如上所述对全部犬进行支气管炎博德特氏杆菌的气溶胶激发。如先前实施例所述,在激发后监测动物咳嗽14天。
结果
临床观察及对p68的血清学反应总结于表40中。
表40:临床观察及血清学反应的总结
组别 |
N |
连续两天咳嗽的数目 |
正常/总数 |
滴度(GMT)PRE-VAX |
激发前的滴度(GMT) |
激发后的滴度(GMT) |
疫苗 |
10 |
0 |
10/10 |
5.08 |
348.15 |
391.30 |
对照 |
11 |
11 |
0/11 |
6.10 |
6.45 |
18.81 |
讨论
在本研究中,10只对照犬中的10只至少连续两天咳嗽。如果犬连续两天咳嗽则认为其为临床上生病。根据此标准,100%的不接种的对照犬都是生病的。在接种组中,一只犬在激发后第4天咳嗽,一只犬在激发后第4和6天咳嗽。两只犬在第14天咳嗽。没有一只接种犬连续两天咳嗽。因此,判断在天然p68接种组中,100%的犬在激发后保持正常。
结论
本试验证明了天然p68疫苗保护免患支气管炎博德特氏杆菌疾病的能力。
实施例6
多价犬疫苗对抗布拉迪斯拉发钩端螺旋体激发的功效
本研究的目的是在犬中证明含有布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、出血性黄疸型钩端螺旋体和波摩那钩端螺旋体血清型馏分的疫苗,对抗布拉迪斯拉发钩端螺旋体激发的功效。
材料
疫苗:使用的疫苗如下:
1.使用一种冻干疫苗,其包括犬瘟热、2型腺病毒、副流感病毒、和细小病毒抗原(VANGUARD_PLUS 5)。疫苗包含的是释放抗原水平。产品代码13D1.22
2.使用犬冠状病毒疫苗的液体稀释制剂(FIRSTDOSE_CV)。疫苗包含的是释放抗原水平。产品代码14P5.20
3.使用一种冻干的疫苗,其包括犬瘟热、2型腺病毒、副流感病毒、细小病毒、布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、出血性黄疸型钩端螺旋体和波摩那钩端螺旋体抗原。疫苗含有大约600 nephlos的每种钩端螺旋体血清型,和释放抗原水平的改良活病毒馏分(犬腺病毒、瘟热病毒、副流感病毒、细小病毒)。产品代码4637.2A
研究动物:使用大约5-6周龄的小猎犬,雌雄不拘。在接种时,它们对布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、出血性黄疸型钩端螺旋体和波摩那钩端螺旋体血清型是血清反应呈阴性的(<1∶8)。让它们随意进食市售的饲料和饮用城市用水。
激发生物体:每只动物经腹膜内注射给予一次剂量大约2mL(10-1稀释的感染仓鼠肝组织)的布拉迪斯拉发钩端螺旋体。
研究设计
处理组编号 |
疫苗描述* |
途径 |
犬的数量 |
疫苗接种天数 |
钩端螺旋体激发** |
血液样品收集天数 |
天数 |
剂量 |
稀释 |
T1 |
对照 |
SQ |
10 |
0&21 |
49 |
2mL |
10-1 |
0,21,35,48,50,52,55,58,61,64,67,70 |
T2 |
对照 |
IM |
10 |
0&21 |
49 |
2mL |
10-1 |
0,21,35,48,50,52,55,58,61,64,67,70 |
T3 |
钩端螺旋体 |
SQ |
10 |
0&21 |
49 |
2mL |
10-1 |
0,21,35,48,50,52,55,58,61,64,67,70 |
T4 |
钩端螺旋体 |
IM |
10 |
0&21 |
49 |
2mL |
10-1 |
0,21,35,48,50,52,55,58,61,64,67,70 |
方法
接种期:在研究第0和21天,4个接种组中的40只犬(10只动物/组)注射对照或检测疫苗,概括如下:
T1:1mL对照疫苗,含有用犬冠状病毒稀释剂重新组成的犬瘟热、2型腺病毒、副流感病毒、细小病毒,并通过皮下(SQ)注射给药。(产品代码13D1.22,用产品代码14P5.20重新组成)
T2:1mL对照疫苗,含有用犬冠状病毒稀释剂重新组成的犬瘟热、2型腺病毒、副流感病毒、细小病毒,通过肌肉内(IM)注射给药。(产品代码13D1.22,用产品代码14P5.20重新组成)
T3:1mL钩端螺旋体疫苗,含有用犬冠状病毒稀释剂重新组成的犬瘟热、2型腺病毒、副流感病毒、细小病毒、布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、出血性黄疸型钩端螺旋体和波摩那钩端螺旋体疫苗,并通过SQ注射给药。(产品代码46J7.2A;产品代码4637.2A和14P5.20的组合)
T4:1mL钩端螺旋体疫苗,含有用犬冠状病毒稀释剂重新组成的犬瘟热、2型腺病毒、副流感病毒、细小病毒、布拉迪斯拉发钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、出血性黄疸型钩端螺旋体和波摩那钩端螺旋体疫苗,并通过IM注射给药。(产品代码46J7.2A;产品代码4637.2A和14P5.20的组合)
接种后在大约1小时和5小时对不良全身反应进行接种后观察。
钩端螺旋体激发:在第49研究日,通过腹膜内注射大约2mL剂量的布拉迪斯拉发钩端螺旋体,激发检测动物。
血液样品采集:在第0、21、35、48、50、52、55、58、61、64、67和70研究日从可获得的动物中采集血清样品。同样,在第48、50、52、55、58、61、64、67和70研究日采集血浆样品。
细菌血清学:通过微量凝集试验化验第0、21、35、48、58和70研究日时获得的血清样品中,布拉迪斯拉发钩端螺旋体循环抗体。
螺旋体血症:通过暗视野显微镜法检查第48、50、52、55、58、61、64、67和70研究日获得的血浆样品中的螺旋体,并培养用于钩端螺旋体再分离。
全血计数/血清化学检测板:对第48、50、52、55、58、61、64、67和70研究日获得的血浆样品检测,但不限于,血小板计数和沉降率。对相同时间间隔获得的血清样品检测,但不限于,淀粉酶、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和肌酸酐。在第55研究日,2只动物(Nos.QPH3、RVG3),在第58研究日1只动物(No.RBH3),在第61研究日3只动物(Nos.OLH3、OUH3、PTG3),在第70研究日1只动物(No.OWG3),没有完成CBC和沉降率的测定,因为收集的血浆样品在检测前凝固。在第67研究日,2只动物(Nos.OUH3,SAG3)没有完成沉降率的检测,因为血浆样品数量不足以进行检测。这些结果对这些研究参数没有影响。
直肠体温:在第47-70研究日记录直肠体温。激发后(第50研究日),体温升高≥39.2℃被认为是钩端螺旋体病的指标。
尿培养:在第48、55和70研究日获得的尿样培养钩端螺旋体,并进行尿分析。在第48研究日,1只动物(No.CBC3)没有完成尿分析,因为收集时获得的尿量不足以进行检测。在第55研究日,2只动物(No.OPH3、RXG3)没有完成尿分析,因为收集时获得的尿量不足以进行检测。在第70研究日,10只动物(Nos.OYG3、PIG3、PUG3、QHG3、QQH3、QSG3、RDG3、RUG3、RVG3、RYG3)没有完成尿分析,因为收集时获得的尿量不足以进行检测。这些结果对本研究参数没有影响。
尸检和钩端螺旋体分离:在激发后期间或有结果时对动物实施安乐死进行尸检。收集体液和组织(即肝、肾和尿),并提交BCL进行钩端螺旋体再分离。在第55研究日,2只动物(No.OPH3、RXG3)没有完成细菌再分离,因为收集时获得的尿量不足以进行检测。在第70研究日,4只动物(Nos.OYG3、PUG3、QSG3、RUG3)没有完成细菌再分离,因为收集时获得的尿量不足以进行检测。这些结果对本研究参数没有影响。
健康观察:每天监测动物的一般健康状况。
数据总结和分析
数据用混合模型或分类程序(categorical procedure)(SAS/STATSoftware Changes and Enhancements through Release 6.12,SAS Institute,Cary,North Carolina)分析。
使用一般线性重复测量混合模型(固定效应模型项是处理、研究天数、和处理对研究天数)来分析温度、血清抗体滴度、血小板计数、沉降率、淀粉酶、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和肌酸酐。在检测到显著性(P≤0.05)处理或处理对研究天数交互作用效应后,对感兴趣的目标进行对比。为适合用于分析,滴度进行对数转换,且当转换时,最小均方转换回几何均数进行表示。没有进行分析的观察结果(即,尸检结果和接种后的观察结果)没有进入总结数据库。
对每个处理组计算血小板计数<200至少一次的动物和直肠温度大于或等于39.2℃的动物的频率分布。
在研究过程中,激发后的每天将动物归类为正常或生病。存在下列任何征象的归类为生病:结膜炎、抑郁、食欲不振、肌肉震颤、流鼻涕、发热(≥39.2℃)或含泪眼。
使用一般线性混合模型(固定效应模型项是处理)来分析激发后动物归类为生病的天数。已死亡或被安乐死的二项变量用Fisher确切概率检验来进行分析。螺旋体血症以及尿、肾和肝中细菌的再分离使用Fisher确切概率检验来分析,以比较处理组。
给药途径与处理对途径交互作用之间缺少显著性差异(P≤0.05,双侧(two-sided))的情况下,使用对比来比较处理组T1和T2的均数与处理组T3和T4的均数(P≤0.05,单侧(one-sided))。如果分析是重复测量分析,则将每个时间点采集的数据进行比较。否则,使用对比来比较T1对T3和T2对T4(P≤0.05,单侧)。如果分析是重复测量,则在每个时间点进行这些比较。
在接种动物中生病的发生率很低(P≤0.05,单侧),证明钩端螺旋体疫苗对布拉迪斯拉发钩端螺旋体的功效。下列的变量支持钩端螺旋体疫苗的功效:(1)接种组的平均血小板计数显著较高(P≤0.05,单侧);(2)接种组平均沉降率显著较低(P≤0.05,单侧);(3)接种组螺旋体血症的发生率显著降低(P≤0.05,单侧)。
结果
激发后临床征象:检测动物显示钩端螺旋体病临床指标(结膜炎、抑郁、腹泻、血尿、黄疸、食欲不振、濒死、肌肉震颤、发热、呕吐)的平均天数在表1中表示。激发后(第50-70研究日),T1和T2对照组生病的平均天数分别为4.3和3.3。相反,T3和T4接种组的均数分别为0.7和0.5,与T1-T2对照组比较时,这些结果显著改善(P<0.05)。显示激发后临床征象的动物百分比也提供在表1中。75%的T1-T2对照组显示有钩端螺旋体病的征象,而仅有30%的T3-T4接种组观察到相似的征象。在本研究激发期过程中需要安乐死的感染动物的数目也显示在表1中。T1-T2对照组中5只动物(25%)显示有钩端螺旋体病的严重征象,并被安乐死。相反,T3-T4接种组在相同的时间间隔内仍然保持健康,对于接种组,比较结果(T1-T2 vs T3-T4)是显著提高的(P<0.05)。激发后的平均体温显示在表2中。在激发后的最初9天内(第50-58研究日),T1-T2对照组的平均温度范围为37.8至39.4℃。在相同的时间间隔内,T3-T4接种组的平均温度范围为38.2至38.7℃。值得注意的是,当与T1-T2平均温度相比时,在激发后2、3和5天,T3-T4接种组的平均温度明显较低(P<0.05)。至少一次温度≥39.2℃的动物频率也显示在表2中。体温升高≥39.2℃被认为是钩端螺旋体感染的指标。在激发后观察期内,显示60-70%的T1-T2对照组的温度≥39.2℃。相反,T3-T4接种组仅30%显示有临床征象。
激发后螺旋体血症:螺旋体血症的频率显示在表3中。在血液中螺旋体的存在(通过细菌培养检测)是证明钩端螺旋体病的临床结果。激发后一天(第50研究日),在90%的T1对照组、60%的T2对照组、60%的T3接种组和70%的T4接种组具有螺旋体血症。不管接种状态如何,都期望在腹膜内注射后24小时从血液中再分离细菌。之后,T1对照组形成的螺旋体血症如下:激发后第3天(第52研究日)为100%,第6天(第55研究日)为56%,第9天(第58研究日)为33%。同样,T2对照组形成的螺旋体血症如下:激发后第3天为60%,第6天为50%,第9天为29%。相反,在相同的激发后时期和余下的激发后时期(即,第50-70研究日)内,T3-T4接种组中都没有形成螺旋体血症。
总体上,螺旋体血症阳性的动物的百分比包括,在激发后一天(第50-70研究日)T1-T2对照组为60%-100%,T3-T4接种组为60%-70%。相反,除了激发后一天(第50-70研究日)以外,阳性动物的百分比为:T1-T2对照组为60%-100%,T3-T4接种组为0%。
从激发后的体液和组织中再分离钩端螺旋体:从血液、尿、肾和肝样本中钩端螺旋体的再分离显示在表4中。在前面的章节中提供了来自血液的钩端螺旋体再分离结果的总结。从激发后3天开始(即,排除了激发后第1天),在60-100%的T1-T2对照组中建立了螺旋体血症,但在相同时间内T3-T4接种组没有建立螺旋体血症。值得注意的是,对于接种组,比较结果(T1-T2 vs T3-T4)是显著提高的(P<0.05)。
在尸检中采集肾样本。从T1和T2对照组中获得的50%肾样本中再分离钩端螺旋体。从T3-T4接种组的样本中没有再分离出钩端螺旋体。对于接种组,比较结果(T1-T2 vs T3-T4)是显著提高的(P<0.05)。
在尸检中采集肝样本。从T1和T2对照组中获得肝样本分别有10%和20%再分离出钩端螺旋体。从T3-T4接种组的样本中没有再分离出钩端螺旋体。对于接种组,比较结果(T1-T2 vs T3-T4)是显著提高的(P<0.05)。
在激发后两个时间间隔和尸检时采集尿标本。在激发后6天(第55研究日)时从T1对照组的两个样本中再分离出了钩端螺旋体。从T2对照组和T3-T4接种组的任何样本中都没有再分离出钩端螺旋体。
激发后血小板计数:平均血小板计数显示在表5中。血液血小板数目的减少(血小板减少症)是钩端螺旋体病的临床指标。T1-T2对照组的平均浓度范围在61和937之间。在相同的时间间隔内,T3-T4接种组的平均计数范围在400和566之间。值得注意的是,与T1-T2对照组相比,T3-T4接种组的血小板计数在激发后3、6和9天显著提高(P<0.05)。
血小板计数至少一次<200的动物频率也显示在表5中。在激发后期间,90%的T1对照组和60%的T2对照组被确定有血小板减少(血小板计数<200)。相反,在感染后仅有10%的T3接种组发生血小板减少,T4接种组则没有。
激发后的沉降率:平均沉降率显示在表6中。沉降率的增加是钩端螺旋体病的一个临床指标。
T1-T2对照组的平均沉降率在2.4至16.0的范围内。在相同的时间间隔内,T3-T4接种组的平均速率在1.5至6.3的范围内。值得注意的是,与T1-T2对照组比较,在激发后3、6、9、12、15、18和21天,T3-T4接种组的速率显著较低(P<0.05)。
激发后的ALT浓度:平均丙氨酸转氨酶(ALT)浓度显示在表7中。ALT增加是细菌感染的一个临床指标(即,当肝功能下降时,ALT水平升高)。T1-T2对照组的平均浓度范围在22和79之间。在相同的时间间隔内,T3-T4接种组的平均浓度范围在21和61之间。值得注意的是,与T1-T2对照组相比,在激发后3、6、9和12天,T3-T4接种组的浓度显著较低(P<0.05)。
激发后的肌酸酐浓度:平均肌酸酐浓度显示在表8中。肌酐浓度增加是细菌感染的一个临床指标(即,由于钩端螺旋体病引起肾功能下降,肌酸酐水平升高)。T1对照组(即,SQ给药)的平均浓度范围在0.30和0.99之间。在相同的时间间隔内,T3接种组(即,SQ给药)的平均浓度范围在0.26和0.40之间。值得注意的是,与T1对照组相比,在激发后1、6、9、12、15、18和21天,T3接种组的浓度明显较低(P<0.05)。T2对照组(即,IM给药)的平均浓度范围在0.30和1.31之间。在相同的时间间隔内,T4接种组(即,IM给药)的平均浓度范围在0.32至0.46之间。在激发后的T2和T4数值之间没有显著差异。
激发后淀粉酶、AST和尿分析:与T1-T2对照组相比,T3-T4接种组的平均浓度没有显著差异。然而,通常T1-T2对照组激发后的浓度更剧烈地增加。总之,在T1-T4检测动物中没有观察到激发后AST(天冬氨酸转氨酶)和尿分析结果的变化。这3个参数的结果在此没有列出。
血清抗体滴度:平均血清布拉迪斯拉发钩端螺旋体抗体滴度显示在表9中。在研究接种期(第0-48研究日),T1-T2对照组的平均滴度大约为2(即,血清学阴性)。相应地,T3-T4接种组的均数范围在2(接种前)和1181(接种后)之间。值得注意的是,与T1-T2平均滴度相比,在接种后21、35和48天,T3-T4接种组的平均滴度显著较高(P<0.05)。
在研究的激发期(第58&70研究日),T1-T2对照组的平均滴度范围在2135和41160之间。相应地,T3和T4接种组的平均滴度范围在727和10891之间,与T1-T2对照组相比,在接种后第58研究日(即,激发后第9天)和第70研究日(即激发后第21天),是显著较低的(P<0.05)。结果,激发后对照组证明对布拉迪斯拉发钩端螺旋体有强烈的初次应答(即,形成感染),而T3-T4接种组的应答不太强烈(即,典型地回忆应答)。
接种后的全身反应:当在初次接种和加强免疫接种后大约1和5小时评价时,在T1-T4检测动物中没有观察到接种后的全身反应。该结果在此没有列出。
结论
激发后通过SQ或IM注射给予多价钩端螺旋体疫苗对布拉迪斯拉发钩端螺旋体的功效可由下面的结果来证明,其中:当与对照组相比时,(1)钩端螺旋体相关性疾病的发生率显著较低,(2)螺旋体血症的发生率明显较低,(3)显著较高的血小板计数,和(4)明显较低的平均沉降率。
表41:用对照或多价钩端螺旋体疫苗免疫的犬在布拉迪斯拉发钩端螺旋体激发后的临床征象的总结
处理(接种)组 |
激发的动物数 |
钩端螺旋体激发后显示临床征象的天数 |
激发后具有临床征象的动物百分比_ |
需要安乐死的感染动物的百分比_ |
均数_ |
最小 |
最大 |
T1 | 对照(SQ) | 10 | 4.3 | 0 | 9 |
90%N=9/10 |
10%N=1/10 |
T2 | 对照(IM) | 10 | 3.3 | 0 | 10 |
60%N=6/10 |
40%N=4/10 |
T3 | LEPTO疫苗(SQ) | 10 | 0.7 | 0 | 4 |
30%N=3/10 |
0%N=0/10 |
T4 | LEPTO疫苗(IM) | 10 | 0.5 | 0 | 3 |
30%N=3/10 |
0%N=0/10 |
_百分比或处理最小均方。对照组(T1-T2)的均数与接种组(T3-T4)的均数有显著差异(P≤0.05)。
表42:用对照或多价钩端螺旋体疫苗免疫的犬在布拉迪斯拉发钩端螺旋体激发后的平均体温
处理(接种)组 |
研究日的平均温度**(激发后的天数) |
温度≥39.2℃的频率(%) |
49(0) |
50(1) |
51(2)_ |
52(3)_ |
53(4) |
54(5)_ |
55(6) |
56(7) |
57(8) |
58(9) |
T1 |
对照(SQ) |
38.1N=10 |
38.6N=10 |
39.4N=10 |
38.9N=10 |
38.5N=10 |
38.8N=9 |
38.6N=9 |
38.2N=9 |
38.2N=9 |
38.3N=9 |
70N=7/10 |
T2 |
对照(IM) |
38.3N=10 |
38.5N=10 |
39.4N=10 |
38.9N=10 |
38.7N=10 |
38.6N=8 |
38.3N=8 |
37.8N=8 |
38.2N=7 |
38.1N=7 |
60N=6/10 |
T3 |
LEPTO疫苗(SQ) |
38.2N=10 |
38.4N=10 |
38.5N=10 |
38.3N=10 |
38.7N=10 |
38.5N=10 |
38.5N=10 |
38.2N=10 |
38.5N=10 |
38.4N=10 |
30N=3/10 |
T4 |
LEPTO疫苗(IM) |
38.2N=10 |
38.5N=10 |
38.5N=10 |
38.3N=10 |
38.5N=10 |
38.5N=10 |
38.3N=10 |
38.3N=10 |
38.4N=10 |
38.6N=10 |
30N=3/10 |
**处理最小均方。N=动物数、或激发后温度≥39.2℃的数目/动物数。
_对照组(T1-T2)的均数与接种组(T3-T4)的均数有显著差异(P≤0.05)。
表43:用对照或多价钩端螺旋体疫苗免疫的犬在布拉迪斯拉发钩端螺旋体激发后的螺旋体血症的频率
处理(接种)组 |
研究日的螺旋体血症的频率(%)**(激发后的天数) |
48(-1) |
50(1) |
52(3) |
55(6) |
58(9) |
61(12) |
64(15) |
67(18) |
70(21) |
T1 |
对照(SQ) |
0N=0/10 |
90N=9/10 |
100N=10/10 |
56N=5/9 |
33N=3/9 |
0N=0/9 |
0N=0/9 |
0N=0/9 |
0N=0/9 |
T2 |
对照(IM) |
0N=0/10 |
60N=6/10 |
60N=6/10 |
50N=4/8 |
29N=2/7 |
0N=0/6 |
0N=0/6 |
0N=0/6 |
0N=0/6 |
T3 |
LEPTO疫苗(SQ) |
0N=0/10 |
60N=6/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
T4 |
LEPTO疫苗(IM) |
0N=0/10 |
70N=7/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
**N=螺旋体血症阳性的数目/动物数。
表44:用对照或多价钩端螺旋体疫苗免疫的犬在布拉迪斯拉发钩端螺旋体激发后,从体液和组织再分离钩端螺旋体的频率
处理(接种)组 |
从体液和组织再分离钩端螺旋体的频率** |
血液_ | 尿 | 肾__ | 肝__ |
包括激发后+1天 |
排除激发后+1天__ |
T1 |
对照(SQ) |
100N=10/10 |
100N=10/10 |
22N=2/9 |
50N=5/10 |
10N=1/10 |
T2 |
对照(IM) |
60N=6/10 |
60N=6/10 |
0N=0/7 |
50N=5/10 |
20N=2/10 |
T3 |
LEPTO疫苗(SQ) |
60N=6/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
T4 |
LEPTO疫苗(IM) |
70N=7/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
0N=0/10 |
**N=螺旋体血症阳性的数目/动物数。
_不管接种状态,腹膜内注射后24小时血管中暴露的细菌。因此,再分离数据也归纳排除接种后第1天(第50研究日)获得的结果。
__对照组(T1-T2)的均数与接种组(T3-T4)的均数有显著差异(P≤0.05)。
表45:用对照或多价钩端螺旋体疫苗免疫的犬在布拉迪斯拉发钩端螺旋体激发后的平均血小板计数
处理(接种)组 |
研究日的平均血小板计数**(激发后的天数) |
血小板计数<200的频率(%) |
48(-1) |
50(1) |
52(3)_ |
55(6)_ |
58(9)_ |
61(12) |
64(15) |
67(18) |
70(21) |
T1 |
对照(SQ) |
534N=10 |
426N=10 |
61N=10 |
128N=8 |
499N=8 |
937N=9 |
724N=9 |
586N=9 |
490N=8 |
90N=9/10 |
T2 |
对照(IM) |
549N=10 |
451N=10 |
174N=10 |
204N=8 |
480N=7 |
738N=5 |
735N=6 |
604N=6 |
498N=6 |
60N=6/10 |
T3 |
LEPTO疫苗(SQ) |
557N=10 |
450N=10 |
463N=10 |
560N=10 |
538N=10 |
506N=9 |
490N=10 |
458N=10 |
465N=10 |
10N=1/10 |
T4 |
LEPTO疫苗(IM) |
521N=10 |
442N=10 |
400N=10 |
552N=9 |
566N=10 |
483N=9 |
478N=10 |
472N=10 |
472N=10 |
0N=0/10 |
**处理最小均方。N=动物数、或激发后血小板计数<200的数目/动物数。
_对照组(T1-T2)的均数与接种组(T3-T4)的均数有显著差异(P≤0.05)。
表46:用对照或多价钩端螺旋体疫苗免疫的犬在布拉迪斯拉发钩端螺旋体激发后的平均沉降率
处理(接种)组 |
研究日的平均沉降率**(激发后的天数) |
48(-1) |
50(1) |
52(3)_ |
55(6)_ |
58(9)_ |
61(12)_ |
64(15)_ |
67(18)_ |
70(21)_ |
T1 |
对照(SQ) |
1.3N=10 |
6.7N=10 |
10.4N=10 |
9.0N=8 |
6.8N=8 |
4.5N=9 |
4.6N=9 |
3.0N=9 |
2.4N=8 |
T2 |
对照(IM) |
1.2N=10 |
5.7N=10 |
10.2N=10 |
9.7N=8 |
16.0N=7 |
5.9N=5 |
5.1N=6 |
3.6N=6 |
3.3N=6 |
T3 |
LEPTO疫苗(SQ) |
1.1N=10 |
5.3N=10 |
2.9N=10 |
3.0N=10 |
3.3N=10 |
2.3N=9 |
2.1N=10 |
1.9N=9 |
1.5N=10 |
T4 |
LEPTO疫苗(IM) |
1.3N=9 |
6.3N=10 |
3.8N=10 |
4.3N=9 |
3.9N=10 |
2.0N=9 |
2.4N=10 |
2.5N=9 |
2.1N=10 |
**处理最小均方。N=动物数。
_对照组(T1-T2)的均数与接种组(T3-T4)的均数有显著差异(P≤0.05)。
表47:用对照或多价钩端螺旋体疫苗免疫的犬在布拉迪斯拉发钩端螺旋体激发后的平均MLT(丙氨酸转氨酶)浓度
处理(接种)组 |
研究日的ALT浓度**(激发后的天数) |
48(-1) |
50(1) |
52_(3) |
55_(6) |
58_(9) |
61_(12) |
64(15) |
67(18) |
70(21) |
T1 |
对照(SQ) |
33N=10 |
66N=10 |
79N=10 |
32N=9 |
34N=9 |
26N=9 |
24N=9 |
22N=9 |
24N=9 |
T2 |
对照(IM) |
35N=10 |
60N=10 |
63N=10 |
30N=8 |
32N=7 |
34N=6 |
26N=6 |
24N=6 |
24N=6 |
T3 |
LEPTO疫苗(SQ) |
30N=10 |
57N=10 |
27N=10 |
22N=10 |
23N=10 |
22N=10 |
23N=10 |
21N=10 |
22N=10 |
T4 |
LEPTO疫苗(IM) |
32N=10 |
61N=10 |
30N=10 |
22N=10 |
25N=10 |
26N=10 |
26N=10 |
24N=10 |
25N=10 |
**处理最小均方。N=动物数。
_对照组(T1-T2)的均数与接种组(T3-T4)的均数有显著差异(P≤0.05)。
表48:用对照或多价钩端螺旋体疫苗免疫的犬在布拉迪斯拉发钩端螺旋体激发后的平均肌酸酐浓度
处理(接种)组 |
研究日的平均肌酸酐浓度**(激发后的天数) |
48(-1) |
50(1) |
52(3) |
55(6) |
58(9) |
61(12) |
64(15) |
67(18) |
70(21) |
T1 |
对照(SQ) |
0.32aN=10 |
0.33aN=10 |
0.30aN=10 |
0.80aN=9 |
0.99aN=9 |
0.70aN=9 |
0.63aN=9 |
0.52aN=9 |
0.39aN=9 |
T3 |
LEPTO疫苗(SQ) |
0.31aN=10 |
0.26bN=10 |
0.32aN=10 |
0.37bN=10 |
0.39bN=10 |
0.33bN=10 |
0.40bN=10 |
0.36bN=10 |
0.27bN=10 |
T2 |
对照(IM) |
0.31aN=10 |
0.33aN=10 |
0.30aN=10 |
1.31aN=8 |
1.08aN=7 |
0.51aN=6 |
0.51aN=6 |
0.42aN=6 |
0.30aN=6 |
T4 |
LEPTO疫苗(IM) |
0.33aN=10 |
0.32aN=10 |
0.33aN=10 |
0.41aN=10 |
0.43aN=10 |
0.36aN=10 |
0.46aN=10 |
0.39aN=10 |
0.32aN=10 |
**处理最小均方。N=动物数。
a,b不同上标的列(T1 vs T3和T2 vs T4)中的值有显著差异(P≤0.05)。
表49:用对照或多价钩端螺旋体疫苗免疫的犬平均血清布拉迪斯拉发钩端螺旋体抗体滴度
处理(接种)组 |
平均布拉迪斯拉发钩端螺旋体抗体滴度**(激发后的研究日) |
0 |
21_ |
35_ |
48_ |
58_ |
70_ |
T1 |
对照(SQ) |
2N=10 |
3N=10 |
2N=10 |
2N=10 |
41160N=9 |
4770N=9 |
T2 |
对照(IM) |
2N=10 |
2N=10 |
2N=10 |
3N=10 |
22571N=7 |
2135N=6 |
T3 |
LEPTO疫苗(SQ) |
2N=10 |
56N=10 |
1032N=10 |
159N=10 |
10891N=10 |
1106N=10 |
T4 |
LEPTO疫苗(IM) |
2N=10 |
97N=10 |
1181N=10 |
257N=10 |
8819N=10 |
727N=10 |
**处理几何均数。N=动物数。
_对照组(T1-T2)的均数与接种组(T3-T4)的均数有显著差异(P≤0.05)。