CN1455816A - 从cDNA中挽救犬热病病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过犬热病病毒重组生产非节段化的负的单链RNA病毒的方法，以及通过该方法所生产的免疫原性组合物。其他实施方案涉及生产作为减毒和/或传染性病毒的犬热病病毒的方法。所述重组病毒可以用cDNA克隆制备，并且可以相应获得具有特定变化的病毒，这些变化包括核苷酸/多核苷酸缺失、插入、取代和重组。

Description

从cDNA中挽救犬热病病毒
                      发明领域
本发明涉及一种用于重组生产犬热病病毒——一种非节段化的负的单链RNA病毒——的方法，以及通过该方法所生产的免疫原性组合物。其他实施方案涉及生产作为减毒和/或传染性病毒的犬热病病毒的方法。所述重组病毒是用cDNA克隆制备的，并且相应可以获得在其基因组中具有特定变化的病毒。本发明还涉及利用由所述方法生产的重组病毒作载体表达外源遗传信息，例如外源基因，以便用于多种目的，包括用于除了犬热病病毒以外的其他病原体的基因治疗和细胞导向的免疫原性或治疗用组合物。
                      发明背景
有外被的负的单链RNA病毒是单一组构并且能表达的。负的单链病毒的基因组RNA在核壳中起着两种模板的作用：作为mRNA合成的模板，以及作为反基因组(+)链的模板。负的单链RNA病毒能编码并包装它自身的RNA决定型RNA聚合酶。只有当这种病毒进入受感染细胞的细胞质中之后才能合成mRNA。病毒的复制是在mRNA合成之后进行的，并且需要连续合成病毒蛋白。新合成的反基因组(+)链起着产生其他拷贝的(-)链基因组RNA的模板作用。
犬热病病毒(CDV)是麻疹病毒属的一员(30)。与包括麻疹病毒、牛瘟病毒和Peste des petits反刍动物病毒在内的该属的其他成员类似，CDV是一种有外被的RNA病毒，它包括大约为16kb的负的单链基因组(4，18，25)。该基因组包括6个非重叠基因区，排列为3’-N-P-M-F-H-L-5’，它能在受感染的细胞中编码8种已知病毒的肽。所述病毒多肽包括：核壳蛋白(N)，它能将病毒基因组RNA衣壳化；基质蛋白(M)，它是毒粒的结构成分；融合(F)和血凝素(H)外被糖蛋白；催化性聚合酶亚基(L)；和由P基因编码的三种蛋白。所述P基因通过利用从翻译起始密码子下游进入的不同读框(C)或者利用通过mRNA编辑所产生的移码(V)，编码磷蛋白(P)聚合酶亚基和非结构蛋白(C和V)。
CDV最著名的是能导致犬发病(4，28)。所述病毒通常是通过空气传播的，并且最初的感染发生在上呼吸道上皮。随后所述传染传播到淋巴组织，导致免疫抑制，并进一步将所述病毒传播到很多器官和细胞类型。某些动物能从这种病中恢复过来，但是在数天至数周之内，有相当大数量的动物会产生中枢神经系统的主动感染，导致发生渐进性脱髓鞘病，这种病表现出神经病症状。这种病被作为人脱髓鞘病的模型进行研究(52，57)。
尽管传统上是与犬的感染相关，但是用改良的检测技术所做的最新研究业已证实，CDV能感染多种宿主(4，11，18，52)。所有犬科动物都易感这种病，包括家犬和野狗、狐狸、狼和草原狼。CDV还与非洲和美国动物园中的，包括狮子和虎在内的大型猫科动物的死亡相关。业已报导过CDV在海豹中的爆发，并且已知这种病毒会导致诸如水貂、雪貂和浣熊的小型食肉动物发病。CDV甚至被认为与诸如Paget’s病和多发性硬化的某些人类疾病相关(14，19，28)。在麻疹病毒属中，这种相对较宽的宿主范围是相当特殊的，因为该属的其他成员表现出有限的宿主范围。
业已实现将活的减毒CDV疫苗用于在家犬群体中控制这种疾病，但是仍然需要其他的疫苗研究。三种流行疫苗不能用于所有易感动物群体(4，18，52)。雪貂、狐狸、某些大型猫科动物、小熊猫、和非洲野狗易感由疫苗菌株导致的疾病，这给试图防止其动物受到CDV感染的动物园和野生动物园造成了特殊问题。除了CDV的很大的宿主范围之外，还表明可能存在发生抗原变异以及适应其他新宿主的相当大的可能性。因此，能够给多种动物服用的安全疫苗是有价值的，并且，如果这种疫苗能够根据未来的抗原变异而方便地操作的话将是有利的。
研究了新的CDV疫苗。例如，业已用犬和雪貂试验了能表达CDV糖蛋白的基于重组痘苗病毒或金丝雀痘的疫苗(34，51)，并且，这些疫苗成功地诱导了预防性免疫反应。不过，尚有待确定这种免疫反应的持续时间是否与由常规的活的CDV疫苗诱导的免疫反应相同(4)。业已用小鼠试验了基于CDV糖蛋白的DNA疫苗。在用CDV的神经毒性菌株进行大脑内刺激时，所述免疫过的小鼠能存活下来，不过，某些小鼠未能完全避免感染(48)。除了检验上述技术之外，可能还需要改良活的减毒CDV疫苗，以便提高其在多种宿主中的安全性。业已报导过的现有的活的减毒CDV疫苗在家犬群体中控制犬热病方面的成功(4，18，52)表明，修饰过的和改良的活的减毒CDV菌株仍然是疫苗开发的重要选择。
有利于活的减毒CDV疫苗开发的一种重要技术是cDNA挽救技术，该技术能够从克隆的DNA中恢复非节段化的负链RNA病毒(10，31，40，42)。自从该技术被首次披露以来(38，44)，这种技术业已被越来越频繁地用于衍生减毒菌株，实施遗传学分析，以及将外源基因插入多种负链病毒(10，31，40，42)。简单地讲，这种技术能够挽救负链RNA病毒，即使这种病毒的基因组RNA是没有传染性的。挽救是通过将病毒基因组cDNA克隆到一种质粒载体上而实现的，所述载体被设计成在能表达T7RNA聚合酶的转染过的细胞中产生精确拷贝的所述病毒基因组。这种质粒通常包括这样的cDNA：在所述正的基因组链的5’末端以T7RNA聚合酶启动子为旁侧序列，而在其3’末端以核酶序列为旁侧序列。由T7RNA聚合酶启动的转录形成所述病毒基因组的5’末端，而核酶裂解所述一级T7RNA聚合酶衍生的转录物，形成3’末端。除了通过质粒在细胞内合成所述基因组之外，还可以将含有N、P和L基因的T7表达载体导入所述细胞，以便提供启动病毒挽救所必需的反式作用因子的最低互补体。由所述基因组cDNA克隆和N、P和L的表达质粒共转染的小百分比的细胞，能包装一种基因组转录物，由N蛋白形成一种核壳颗粒，该颗粒随后起着由P和L蛋白组成的病毒聚合酶的底物的作用。
在该步骤之后，就可以启动所述病毒的复制循环。
所述聚合酶复合物通过接合位于所述基因组3’末端，特别是位于启动子区的顺式作用信号启动并完成转录和复制。然后由所述基因组模板从3’到5’末端单向转录病毒基因。相对相邻的上游基因(即核蛋白基因(N))而言，通常有较少的来自下游基因(例如，聚合酶基因(L))的mRNA。因此，总是存在根据有关基因相对基因组3’末端的位置的mRNA含量的梯度。
到目前为止，对所述非节段化的RNA病毒进行分子遗传学分析一直都是困难的，因为由转染的质粒在细胞内产生的裸露的基因组RNA或RNA是没有感染力的。目前，有披露可以分离某些重组的非节段化负链RNA病毒的方法的文献(Schnell et al.，1994)。这些方法在本文中被称为“挽救”。用于挽救不同的负链病毒的技术遵循共同的宗旨；不过，每一种病毒具有决定成功挽救的不同的必需成分(41，43，44，63，64，65，66，67，68，70和73)。在由基因组cDNA质粒转染之后，通过噬菌体T7RNA聚合酶和能裂解RNA以便形成3’末端的、由载体编码的核酶序列的组合作用，产生了精确拷贝的基因组RNA。这种RNA通过最初由共转染表达质粒提供的病毒蛋白包装和复制。对于犬热病病毒来说，尚有待建立一种挽救方法，因此，有必要设计一种犬热病挽救方法。挽救犬热病病毒的设计是复杂的，因为与对其他RNA病毒的研究相比，还缺少对犬热病病毒生物学的深入研究。很显然，CDV微型复制子研究尚未公开，而微型复制子系统必然会提供开发病毒挽救方法的起点。因此，尚没有可用于建立一种挽救系统的试剂，如N、P和L蛋白表达克隆或完整长度的基因组cDNA序列。另外，对于CDV来说，有效进行微型复制子表达的细胞培养条件和转染条件尚属未知。充分了解上述变数对于任何重组病毒的成功挽救来说都是重要的。另外，犬热病病毒的某些菌株在组织培养系统中不能有效生长。尽管事实上从1998年起就可以获得一种修饰过的基因组序列(GenBank保藏号AF014953，被收作本文参考)，但尚未报导过微型复制子或病毒挽救系统。
为了成功挽救犬热病病毒的cDNA，在转染之后必须发生多种分子事件，包括：1)通过T7RNA聚合酶精确地、完整地合成基因组或反基因组RNA，并且通过核酶序列进行3’末端加工；2)以接近启动复制的水平合成病毒N、P和L蛋白；3)从头开始，将基因组RNA包装到转录活性的和复制感受态核壳结构中；和4)在足以使复制进行的水平上由新形成的核壳表达病毒基因。
本发明提供了重组生产犬热病病毒的挽救方法。挽救的犬热病病毒具有多种用途，如制备抗体，诊断、预防和治疗用途，细胞导向和制备突变型病毒，以及制备免疫原性组合物和治疗组合物。
                      发明概述
本发明提供了用于生产重组犬热病病毒的方法，包括在至少一个宿主细胞中实施挽救组合物的转染，该组合物包括(i)一种转录载体，该载体包括一种分离的核酸分子，该核酸分子包括编码犬热病病毒的基因组或反基因组的多核苷酸序列，和(ii)至少一种表达载体，它包括编码衣壳化、转录和复制所必需的反式作用蛋白的至少一种分离的核酸分子。所述转染是在足以实现所述载体共表达和产生重组病毒的条件下进行的。然后回收所述重组病毒。
其他实施方案涉及所述核苷酸序列，该序列在进行mRNA转录时，能表达以下犬热病病毒蛋白的一种或多种或其任意组合：N、P、M、F、H、L和P、C和V蛋白(它是由上文所述的犬热病病毒的P基因产生的)。相关的实施方案涉及包括所述核苷酸序列的核酸分子。本发明的一种优选实施方案采用了由GenBank保存的犬热病病毒核苷酸序列(保藏号AF014953-SEQ ID NO：1)。其他实施方案涉及所述核苷酸，上述犬热病病毒蛋白的氨基酸序列及其变体。
本发明的蛋白和核苷酸序列具有用于犬热病病毒的诊断、预防和治疗用途。可将所述序列用于设计筛选系统，用于筛选能够通过衣壳化、复制或扩增干扰或破坏正常病毒发育的化合物。所述核苷酸序列还可用于免疫原性组合物中，在用于表达外源基因时，对犬热病病毒和/或其他病原体进行免疫。
在优选实施方案中，生产了用于免疫原性组合物中的传染性重组病毒，并且提供了治疗或预防犬热病病毒感染和/或其他病原体感染的方法，其中，该方法使用了所述组合物。
在其他实施方案中，本发明提供了用于生产减毒的、传染性的或具有这两种特征的重组犬热病病毒的方法。所述重组病毒是用cDNA克隆制备的，因此，可以获得在其基因组中具有特定变化的病毒。其他实施方案采用本文所使用的基因组序列来表达外源基因。由于我们在本文中报导了犬热病病毒Onderstepoort菌株的完整cDNA克隆的全面克隆和测序，其序列也是本发明的一种实施方案。
本发明还涉及将通过本发明所生产的重组病毒用作表达诸如外源基因的外源遗传信息的载体用于多种目的，包括除了犬热病病毒以外的病原体的免疫原性和治疗组合物，基因治疗，和细胞导向。
对于发展中的技术和潜在的治疗来说，成功挽救犬热病病毒是非常重要的，之所以如此，是因为存在若干种强制性原因。制备重组CDV的能力将有利于改良的免疫原性组合物的开发。制备重组CDV的能力，将有利于开发CDV载体。另外，存在可以利用的用于研究基于CDV的免疫原性和治疗组合物以及基于CDV的病毒载体的途径的动物模型。可以将天然宿主——狗和雪貂用作在天然宿主生物中研究CDV减毒的遗传学基础的实验模型。重组CDV的另一个优点是，由于它是一种神经营养病毒，制备重组CDV的能力将允许对神经营养进行遗传学分析。另外，由于CDV能产生急性和持久性感染，人们可以对持久性感染进行遗传学分析。相应地，可以将重组CDV用于剖析所述病毒产生诸如人中枢神经系统的脱髓鞘病的特征的症状的能力。
某些实施方案采用了犬热病病毒的实验室改良型Onderstepoort菌株(17)。用实验室改良型菌株作为挽救犬热病病毒的起始模型具有若干优点。首先，实验室改良型菌株在培养的细胞中生长良好。这一特征将有助于促进成功挽救重组体。其次，所述实验室改良的菌株能够在诸如Vero细胞的可用于疫苗生产的细胞系中很好地生长。第三，所述实验室改良的菌株与业已在狗体内成功使用的疫苗病毒(Onderstepoort)密切相关，因此，提供了这样一种可能性，那就是这种重组病毒同样会具有减毒的表型。第四，如果所述实验室改良的重组病毒需要进一步减毒，可以对所述Onderstepoort菌株的基因组方便地进行特征分析，以便鉴定减毒突变。第五，所述实验室改良的菌株具有在培养的细胞中生长的能力，这一特征使得人们可以进行必要的体外初步研究，而不是完全依赖于动物模型系统。在这里详细披露的上述实施方案和其他实施方案体现了本发明的目的。
                      附图说明
图1表示为了用于CDV挽救而制备的质粒DNA的组构示意图。图1A是完整长度CDV克隆pBS-rCDV的示意图。CDV基因组中的基因区用黑色方框画出，方框里面是白色字母和基因边界。CDV前导序列和尾随序列在CDV基因组的末端以开放的方框形式画出。在所述质粒载体中对所述基因组进行定向，以便指导由位于该基因组5’末端的旁侧T7RNA聚合酶启动子(灰色方框)合成正的RNA。在所述正的cDNA3’末端旁侧是肝炎Δ病毒核酶序列(在图1A中用加斜线的方框表示；参见Been etal.，1997，5)和两个T7RNA聚合酶终止子(灰色方框)。用于克隆的限制酶消化位点用斜体字母表示。
图1B表示CDV微型复制子(pCDV-CAT)。该微型复制子是在用于制备所述病毒cDNA克隆的同一种载体上制备的。将其旁侧为107个核苷酸CDV前导序列和106个核苷酸的尾随序列(开放的方框)的CAT报导基因插在NotI位点和NarI位点之间(方法)。所述微型复制子cDNA的取向使得能在通过T7RNA聚合酶转录之后，产生一种负的微型复制子RNA。
图1C表示为了指导N、P或L基因在用MVA/T7感染的细胞(61)中表达而制备的T7RNA聚合酶决定型质粒载体(29)。将所述cDNA插入片段克隆在内部核糖体进入位点(IRES)的3’末端，以便有利于T7RNA聚合酶转录物的翻译。在其3’末端有一个由50个腺苷残基组成的片段，其后是一个T7RNA聚合酶终止子。
图2A是表示CAT测定结果的放射性自显影图。进行该测定是为了对CDV-CAT微型复制子表达实验进行定量，正如在例3.1.1中所披露的。在图2-A中，用20微克微型复制子RNA转染细胞，并且通过用CDV感染启动CDV-CAT微型复制子活性。泳道1中的测定来自没有用CDV感染的负对照。泳道2表示由CDV感染启动的专一性微型复制子活性的水平。
图2B是表示CAT测定结果的放射性自显影图，进行该测定是为了对CDV-CAT微型复制子表达实验进行定量，正如在例3.1.2中所披露的。在图2-B中，用CDV微型复制子RNA(20微克)和T7表达质粒pCDV-N(1微克)，pCDV-P蛋白(1微克)和pCDV-L(用量如图所示)转染细胞。负对照如泳道1(无N、P或L表达载体)和泳道2(无L表达载体)所示。泳道3-5来自相同的转染，所不同的是，在这些转染中使用用量逐渐提高的L表达载体。
图3A是表示在转染pCDV-CAT质粒DNA之后，CDV-CAT微型复制子活性的CAT测定结果的荧光图象。如例3.1.3所述。图3A中的结果证实了培养温度对微型复制子活性的影响。图3A中的相对活性是相对泳道8中所提供的值表达的。
图3B是表示在转染pCDV-CAT质粒DNA之后，CDV-CAT微型复制子活性的CAT测定结果的放射性自显影图。如例3.1.4所述。图3B表示热激对微型复制子表达的有利影响。图3B中的CAT活性值是相对泳道2表达的。
图4A表示来自重组rCDV挽救的两个代表性噬斑，如例4.1所述。第一个(左侧)噬斑是从Onderstepoort菌株基因组cDNA中挽救的rCDV(Pbs-rCDV)。被标明为rCDV-P/Luc/M第二个(右侧)噬菌斑是包括图5A所示荧光素酶基因的重组菌株。
图4B表示通过例4.2所披露的实验所获得的挽救菌株的RT/PCR扩增产物的分析的结果。泳道1-7表示来自CDV基因组上的1978和2604之间的部分的RT/PCR扩增反应产物。泳道1中的负对照(-L)是用源于来自在没有pCDV-L载体DNA的情况下进行的挽救实验的培养物的RNA所获得的RT/PCR结果。泳道3、5和7是负对照，其中，省略了RT/PCR的RT步骤。泳道8-10表示用BstBI消化与泳道2、4和6中的DNA相同的样品的结果。消化PCR片段，得到了两个大约315bp的片段，而未消化过的片段为630bp。
图5包括6项说明(A-F)。部分(A)表示存在于完整cDNA克隆上的CDV基因组的结构。在部分(B)中，示出了M/F基因间区的一部分(3320-3380号核苷酸)，用于说明如何改变该区，以便产生存在于质粒prCDV-mcs中的多个克隆位点。改变用粗体表示的核苷酸，以便产生限制位点。部分(C-E)表示如何将外源基因插入prCDV-mcs上的FseI和MluI位点之间。在PCR扩增期间，将合成拷贝的M/F基因-末端/基因/起始信号添加到所述外源基因的5’末端。在(F)中，示出了外源基因(X)在CDV基因组上的基因组定位。术语：rCDV表示重组病毒菌株；prCDV表示含有病毒cDNA序列的质粒(pBS-rCDV)。
图6表示CDV的cDNA克隆的完整的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。
图7表示CDV完整长度基因组克隆的完整序列(CDV基因组+载体；CDVSEQ ID NO：2199-1788；总长度为18826bp)，SEQ ID NO：3。
图8表示按照例5(c)的对存在于来自用rCDV和rCDV-HBsAg菌株感染过的细胞的提取物中的蛋白进行的Western印迹分析。要指出的是，rCDV-HBsAg-1，2，和3是从用质粒prCDV-HBsAg进行的独立的转染中分离的。
图9表示CPV VP2编码区核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。
图10表示CPV VP2的推测的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。
                       发明详述
如上文所述，本发明涉及生产重组犬热病病毒(CDV)的方法。在本领域中，此类方法被称为“挽救”或反向遗传学方法。业已披露了用于不同的非节段化负链病毒的若干种挽救方法(参见40、41、43、44、63、64、65、66、67、68和70)。有关挽救的其他文献包括公开的国际专利申请号WO97/06270，该申请涉及麻疹病毒和幅粘液病毒亚科的其他病毒的挽救；以及公开的国际专利申请号WO97/12032，该申请涉及RSV挽救。
本发明的其他实施方案涉及编码犬热病病毒的基因组或反基因组或其蛋白的多核苷酸序列以及该序列的变体的挽救方法，和采用了该序列的组合物。所述变体序列优选能在高严格条件下，与编码一种或多种犬热病蛋白的多核苷酸，如GenBank保藏号AF014953的多核苷酸序列或SEQ ID NO：1(图6)杂交。有关高严格性Southern杂交条件的定义，可以方便地参考Sambrook et al.(1989)，pp.387-389，该文献被收作本文参考，其中，在第11段上的洗涤步骤被认为是高严格性的。本发明还涉及保守性变体，其中，所述多核苷酸序列通过对核苷酸三联体上的第三个核苷酸的改变而与参考序列不同。所述保守性变体优选起着犬热病病毒参考多核苷酸序列的生物学等同物的作用。
本发明还涉及包括一种或多种所述多核苷酸的核酸分子。如上文所述，特定的核苷酸重组序列可以包括一种或多种犬热病病毒的不同菌株的基因组。具体的实施方案采用了SEQ ID NO：1的核苷酸序列，或在转录时能表达一种或多种犬热病病毒蛋白(N、P-P/C/V、M、F、H和L)的核苷酸序列。
其他实施方案采用了犬热病病毒蛋白(N、P-P/C/V、M、F、H和L)的氨基酸序列，它的翻译的序列在GenBankAF014953中，并且还涉及其片段或变体。所述氨基酸序列的片段和变体以及能表达犬热病病毒蛋白的变体核苷酸序列优选是生物学等同物，即它们基本上保留了与所述蛋白相同的功能，以便获得减毒的、传染性的或同时具有这两种特征的需要的重组犬热病病毒。所述变体氨基酸序列是由本发明的多核苷酸序列编码的。所述变体氨基酸序列与犬热病病毒蛋白的氨基酸序列可以具有大约70％-大约80％，优选大约90％的总体相似性。所述变体核苷酸序列与所述核苷酸序列可以具有大约70％-大约80％，优选大约90％的总体相似性，它在转录以后，能编码犬热病病毒蛋白的氨基酸序列或犬热病病毒蛋白的变体氨基酸序列。提供了犬热病病毒蛋白N、P-P/C/V、M、F、H和L的代表性核苷酸序列，它的翻译的序列如GenBankAF014953所示，该序列被收入本文。
通过制备所述核苷酸序列或蛋白序列的变体，可以获得生物学等同物。所述变体可以是模板序列的插入、取代、缺失或重组。可以通过常规方法制备犬热病多核苷酸序列的变体，如PCR诱变、氨基酸(丙氨酸)筛选、和位点专一性诱变。通过用所述变体进行挽救，评估该变体的表型，即如果要评估其干扰挽救犬热病病毒的能力的能力的话，评估是否获得了需要的重组犬热病病毒，或者获得了需要的生物学效果。如果预期的用途是免疫原性组合物的话，还可以评估所述变体的免疫原性。
可以通过改变所述核苷酸序列的密码子获得氨基酸序列的改变。众所周知的是，所述改变可以根据用其他的氨基酸取代所述氨基酸序列上的某些氨基酸而实现。例如，通过用其他的氨基酸取代，可以使蛋白产生小的构象变化，这种变化会导致与犬热病病毒的其他蛋白结合或相互作用的能力降低。其他的变化可以改变重组犬热病病毒的减毒水平。
正如Kyte和Doolittle(69)所披露的，人们可以利用氨基酸的亲水指数赋予一种多肽相互作用的生物学功能，其中，业已发现某些氨基酸可以取代具有类似亲水指数的其他氨基酸，并且仍然能保持类似的生物学活性。另外，类似氨基酸的取代可以以亲水性为基础进行，特别是当所制备的多肽的预期的生物学功能是用于免疫学实施方案中时尤其如此。例如，参见US4554101(该专利被收作本文参考)，该专利指出，由相邻氨基酸的亲水性决定的“蛋白”的最大局部平均亲水性与其免疫原性相关。因此指出，可以根据每一种氨基酸的亲水性进行取代。
在使用亲水性指数或亲水指数时(为每一种氨基酸规定一个值)，优选引入氨基酸的取代，其中，所述指数值为±2，以±1为特别优选，以±0.5以内为最优选的取代。
由本发明的核苷酸序列所编码的犬热病病毒蛋白的优选特征包括下面特征中的一种或多种：(a)是膜蛋白或者是直接与膜结合的蛋白；(b)能够作为一种蛋白通过SDS丙烯酰胺(10％)凝胶分离；和(c)保持其在有其他合适的犬热病病毒蛋白的情况下，导致挽救生产需要的重组犬热病病毒的生物学功能。
一旦获得了上述核苷酸和氨基酸序列，人们就可以进一步挽救犬热病病毒。犬热病挽救是通过用一种挽救组合物对培养基中的至少一个细胞进行转染、或转化而完成的。所述挽救组合物包括(i)一种转录载体，该载体包括一种分离的核酸分子，该核酸分子包括编码犬热病病毒的基因组或反基因组的多核苷酸序列，和(ii)至少一种表达载体，它包括编码衣壳化、转录和复制所必需的反式作用蛋白的一种或多种分离的核酸分子；所述转染是在足以实现所述载体共表达和产生重组病毒的条件下进行的。反基因组表示作为合成子代基因组模板的分离的正的信使多核苷酸序列。多核苷酸序列优选是一种cDNA，构建这种序列是为了在转录时提供一种相对于复制型中间RNA的正的版本的犬热病基因组或反基因组，以便降低与编码产生转录的、复制的核壳所必需的蛋白的互补序列的正转录物杂交。所述转录载体包括一个可操作地连接的转录单位，该转录单位包括一个由在犬热病病毒表达中具有调控作用的遗传因子组成的组件，例如，启动子、结构基因或被转录成犬热病病毒RNA的编码序列，以及合适的转录起始和终止序列。
所述转录载体是与犬热病病毒蛋白N、P和L共同表达的，所述蛋白是生产能够进行RNA复制的核壳所必须的，并且还使得后代核壳成分能够进行RNA复制和转录。所述N、P和L是由编码所述必需蛋白的一种或多种表达载体(例如，质粒)产生的，不过，所述必需蛋白的一种，或一种或多种可以在特定宿主细胞中生产，对该宿主细胞进行过工程改造，以便作为稳定的转化体含有所述病毒专一性基因并表达基因产物。在一种优选实施方案中，N、P和L蛋白是由一种表达载体表达的，更优选的是，N、P和L分别是由诸如质粒的独立的表达载体表达的。在后一种情况下，人们可以更方便地控制在转染或转化期间所提供的每一种蛋白的相对量。可以用能表达N、P或L的质粒表达其他犬热病病毒蛋白，或者用其他质粒表达所述其他蛋白。
尽管N、P和L的量会根据宿主细胞对其表达的耐受性而变化，需要对表达N、P和L的质粒进行调整，以便在所述细胞内获得有效摩尔比的N、P和L。有效摩尔比是足以提供成功挽救所需犬热病病毒的N、P和L的比例。这种比例可以根据在微型复制子(CAT/报导基因)测定中所观察到的表达质粒的比例获得。在一种实施方案中，转染质粒pCDVN：pCDVP的分子比例低于大约5∶1，而pCDVP：pCDVL的分子比例低于大约15∶1。优选的是pCDVN：pCDVP的分子比例为大约3∶1-大约1∶3，而pCDVP：pCDVL的分子比例为大约10∶1-大约1∶5，更优选的是pCDVN：pCDVP的分子比例为大约2∶1，而pCDVP：pCDVL的分子比例为大约8∶1-大约1∶1，最优选的是pCDVN：pCDVP的分子比例为大约1.2∶1，而pCDVP：pCDVL的分子比例为大约5∶1。
在用基因组cDNA质粒与犬热病病毒表达质粒pCDVN、pCDVP和pCDVL一起进行转染或转化之后，通过噬菌体T7RNA聚合酶和由载体编码的能裂解RNA以便形成其3’末端的核酶序列的共同作用下，产生了精确拷贝的基因组RNA。通过最初由共转染的表达质粒提供的病毒蛋白包装并复制所述RNA。对于犬热病病毒挽救来说，将能表达T7RNA聚合酶的来源连同N、P和L的来源一起添加到所述宿主细胞(或细胞系)中。犬热病病毒的挽救是通过用包括适当定位的T7RNA聚合酶启动子的犬热病病毒基因组cDNA克隆和编码犬热病病毒蛋白N、P和L的表达质粒共转染所述细胞系而实现的。
为了挽救犬热病病毒，将所需病毒基因组的克隆DNA等同物插在被插入合适的转录载体(例如细菌质粒)中的DNA决定型RNA聚合酶启动子(例如，T7RNA聚合酶启动子)和自我裂解的核酶序列(例如肝炎Δ核酶)之间。该转录载体提供了可方便操作的DNA模板，所述RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶)能转录具有精确的或接近精确的5’和3’末端的单链RNA拷贝的病毒反基因组(或基因组)。所述病毒基因组DNA拷贝的取向以及旁侧的启动子和核酶序列决定着是否转录了反基因组或基因组RNA等同物。
因此，在所述挽救方法中采用了一种挽救组合物。该挽救组合物可以根据具体要求或用途加以改变。挽救组合物的一种例子是这样一种组合物，该组合物包括(i)一种转录载体，该载体包括一种分离的核酸分子，该核酸分子包括编码犬热病病毒的基因组或反基因组的多核苷酸序列，和(ii)至少一种表达载体，它包括编码衣壳化、转录和复制所必需的反式作用蛋白的一种或多种分离的核酸分子。对所述转录和表达载体进行选择，以便所述挽救组合物在宿主细胞中的转染会导致所述载体的共表达，并且产生重组的犬热病病毒。
如上文所述，所述分离的核酸分子包括一种编码犬热病病毒的至少一种基因组或反基因组的序列。所述分离的核酸分子可以包括编码一种基因组、反基因组或其修饰形式的多核苷酸序列。在一种实施方案中，所述多核苷酸编码一种可操作的连接的启动子，需要的基因组或反基因组、自我裂解的核酶序列以及转录终止子。
在本发明的一种优选实施方案中，所述多核苷酸编码基因组或反基因组，所述基因组或反基因组是通过核苷酸插入、重组、缺失或取代由野生型犬热病病毒修饰而来的。有人认为，通过挽救获得复制型病毒的能力，会随着对编码天然基因组和反基因组的多核苷酸的修饰的增加而降低。所述基因组或反基因组序列可以来自犬热病病毒的任何菌株的基因组。所述多核苷酸序列还可以编码一种通过一种或多种异源来源的基因组或反基因组或基因的重组结合而形成的嵌合基因组。
由于可以将通过本发明方法生产的重组病毒用作诊断研究的工具或治疗或预防性免疫原和药用组合物，所述多核苷酸还可以编码犬热病的野生型或任何修饰形式。在很多实施方案中，所述多核苷酸编码一种减毒的、传染形式的犬热病病毒。减毒形式的病毒可以通过发生在一个或多个基因的编码区内的，以及发生在一个或多个非编码区，即基因组的基因间区内的突变而产生。若干种减毒突变在上文中作过更详细的说明。例如，正如在公开的国际专利申请号WO98/13501中所披露的，一种减毒形式可以是这样一种多核苷酸：它编码的犬热病病毒的基因组或反基因组在3’基因组启动子区具有至少一个减毒突变，并且在RNA聚合酶基因上具有至少一个减毒突变。
所述多核苷酸的修饰形式还可以编码一种缺陷型病毒。所述缺陷型病毒包括在编码CDV的多核苷酸上的一种改变，使得重组生产的病毒不是复制感受态的。所述突变通常发生在编码该病毒复制所必需的蛋白的一个或多个基因内或基因上。为了实现复制，所述缺陷型病毒必须通过宿主细胞加以补充，该宿主细胞含有所述核苷酸序列的未修饰过的形式(未改变过的形式)，这种核苷酸序列可以改变，以便使得所述病毒成为缺陷型。所述宿主细胞和细胞系，被称为补偿细胞或补偿细胞系。所述缺陷型细胞优选在补偿细胞系中繁殖，以便产生复制感受态的病毒。
本发明还涉及CDV多核苷酸序列的非传染性改变。对于CDV来说，人们可能希望改变与传染性病毒生产相关的基因或核苷酸序列，但是这种改变不会抑制病毒基因组的复制。这种改变以及包括这种改变的CDV多核苷酸，被称为“非传染性改变和非传染性CDV多核苷酸”。适当的改变，复制缺陷型或非传染性，可以根据预期的用途而不同，例如，相对犬或马细胞而言，在人细胞中的复制是缺陷型的。
可以通过互补将所述改变过的序列提供给缺陷型或非传染型重组生产的病毒。还可将所述互补的重组病毒用于药用目的，如用于基因治疗的基因输送或作为免疫原性组合物的一部分。
除了编码上述需要的犬热病基因组和反基因组的修饰形式的多核苷酸序列之外，所述多核苷酸序列还可以编码具有一个或多个异源基因或需要的异源核苷酸序列的需要的基因组或反基因组。异源表示被插入的基因或核苷酸序列不存在于CDV的受体菌株中，或者所述基因或核苷酸序列以不同于正常情况的方式插入所述CDV多核苷酸序列。所述变体是通过将特定的异源核苷酸序列导入编码犬热病病毒的基因组或反基因组的多核苷酸序列中而制备的。可以将需要的异源序列插入犬热病多核苷酸序列的非必需或非编码区内，或者插入非编码区和编码区之间，或者插在该多核苷酸序列的任意一个末端。在其他实施方案中，将所需要的异源序列插入所述非编码区内或者插入非必需基因的编码区。所述插入位置可以利用犬热病病毒的梯度表达特征(25)。通过将所述外源序列插入不同的基因组位置，利用犬热病病毒的天然3’→5’减弱梯度，可以在这种类型的挽救系统中方便地检查外源抗原表达的不同水平。
可以根据需要改变所述外源核苷酸序列(例如基因)。根据所述理想重组病毒的用途，所述异源核苷酸序列可以编码辅助因子(如白介素)、T辅助表位、限制标记、佐剂或不同微生物病原体(例如病毒、细菌、真菌或寄生虫)的蛋白，特别是能够引起预防性免疫反应的蛋白。为了增加挽救所需犬热病病毒或微型复制子病毒载体的可能性，可能需要选择编码辅助因子、细胞因子(如白介素)、T辅助表位、限制标记、佐剂或不同微生物病原体(例如病毒、细菌或真菌)的蛋白的免疫原性部分的异源序列。例如，在某些实施方案中，选择编码诸如白介素-12的细胞因子的异源基因，以便改善所述重组病毒或由该病毒所表达的抗原的预防或治疗特征。
用于本发明的抗原，可以选自可用于所需目的的任何抗原。可以将所述抗原添加到本发明的组合物中，或者作为异源序列由重组产生的犬热病病毒表达，正如上文所述的。人们可以选择可用于针对诸如病毒、细菌或真菌的一种或多种病原体的抗原。在下面列举了潜在的病原体目标的详细清单。
所述病毒的例子包括，但不限于人免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1-3型、单纯疱疹病毒、人巨噬细胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、杯状病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、狂犬病病毒、牛瘟病毒、冠状病毒、细小病毒、传染性鼻气管炎病毒、猫白血病病毒、猫传染性腹膜炎病毒、禽传染性粘液病病毒、新城病病毒、Marek’s病病毒、猪呼吸道和生殖综合症病毒、马动脉炎病毒和各种脑炎病毒。
所述细菌的例子包括，但不限于流感嗜血菌(可分型的和不可分型的)、睡眠嗜血菌、粘膜炎莫拉氏菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、无乳链球菌、粪链球菌、幽门螺杆菌、脑膜炎萘瑟氏球菌、淋病萘瑟氏球菌、沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、百日咳杆菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌属、霍乱弧菌、白喉棒杆菌、结核分支杆菌、鸟分支杆菌-胞内分支杆菌复合体、奇异变形菌、普通变形菌、金色葡萄球菌、破伤风梭菌、问号螺旋体、布氏疏螺旋体、溶血巴斯德氏菌、多杀巴斯德氏菌、大叶肺炎放线杆菌和鸡败血枝原体。
所述真菌的例子包括，但不限于曲霉属、芽酵母属、念珠菌属、球孢子菌属、隐球菌属和组织胞质菌属。
所述寄生虫的例子包括，但不限于利什曼原虫属、major、蛔虫属、鞭虫属、贾第亚原虫属、血吸虫属、隐孢虫属、毛滴虫属、兔弓形虫属和卡氏肺囊虫。
其他类型的异源序列可以编码用于消除或减轻病变细胞的一种或多种肽或多肽，所述肽或多肽包括，但不限于来自癌细胞或肿瘤细胞的肽，过敏原淀粉样肽、蛋白或其他大分子成分。
所述癌细胞或肿瘤细胞的例子包括，但不限于前列腺专一性抗原、癌胚抗原、MUC-1、Her2、CA125和MAGE-3。
所述过敏原的例子包括，但不限于披露于被收作本文参考文献的US5830877和公开的国际专利申请号WO99/51259中的过敏原，并且包括花粉、昆虫毒液、动物皮屑、真菌孢子和药物(如青霉素)。所述成分会干扰IgE抗体的产生，这是一种已知的过敏反应诱因。
淀粉样肽蛋白(APP)与多种疾病有关，如老年性痴呆、淀粉样变性或淀粉样生成疾病。β-淀粉样肽(又被称为Aβ肽)是APP的一种有42个氨基酸的片段，它是通过β和γ分泌酶加工APP而产生的，并且具有以下序列：Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tur Glu Val His His Gln Lys Leu ValPhe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met ValGly Gly Val Val Ile Ala.
在某些患者体内，淀粉样沉积采用凝聚的Aβ肽形式。令人吃惊的是，业已发现服用分离的Aβ肽，可以在脊椎动物宿主体内诱导针对淀粉样沉积物的Aβ肽成分的免疫反应(参见公开的国际专利申请号WO99/27944)。所述Aβ肽还与其他不相关的成分连接。因此，本发明的异源核苷酸序列还包括所述Aβ肽、Aβ肽的片段以及Aβ肽的抗体或其片段的表达。Aβ肽的一种这样的片段是具有以下序列的包括28个氨基酸的肽(披露于US466829中)：
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln LysLeu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys.
通过表达异源序列，能够以与表达载体相同的方式将重组形式的犬热病病毒用于将各种RNA、氨基酸序列、多肽和蛋白形式的各种活性成分输送到动物或人体内。可将所述重组犬热病病毒用于在该病毒转录启动子的控制下表达一种或多种异源基因(甚至是3、4或5种基因)。在其他实施方案中，所述其他外源异源核酸序列可以是最多达7-10kb的单一序列，它是作为单一的额外转录单位表达的。优选遵循rule-of-six(参考文献6)。在某些优选实施方案中，该序列可以长达4-6kb。人们还能以附加单顺反子转录单位和多顺反子转录单位形式插入异源遗传信息。所述附加单顺反子转录单位和多顺反子转录单位的使用，应当可以插入更多的遗传信息。在优选实施方案中，所述异源核苷酸序列是作为至少一个多顺反子转录单位插入犬热病病毒基因组序列中的，它可以包括一个或多个核糖体进入位点。
在其他优选实施方案中，所述异源核苷酸序列编码一种多蛋白和足够数量的蛋白酶，所述蛋白酶能裂解所述多蛋白，以便产生该多蛋白的单一的多肽。
可以对所述异源核苷酸序列进行选择，以便利用犬热病病毒的正常感染途径，所述病毒通过呼吸道进入体内，并且能够感染多种组织和细胞，例如，唾液腺、淋巴组织、乳腺、睾丸、甚至是脑细胞。还可以用所述异源基因提供能被用于基因治疗或用于特殊细胞导向的试剂。作为仅仅利用在犬热病感染的正常途径中接触的正常细胞的替代方案，所述异源基因或片段可以编码来自不同病原体的另一种蛋白或氨基酸序列，该异源基因在被用作重组犬热病病毒的一部分时，能将重组的犬热病病毒导向不在犬热病病毒的正常感染途径上的细胞或组织。这样，重组犬热病病毒就成了一种用于输送多种外源基因，并相应地输送多种类型的抗原的载体。我们的实施例证明，重组犬热病病毒可以用作表达载体。可以将所述重组犬热病病毒表达载体用于输送一种或多种抗原。可以选择来自多种传染剂的抗原(1，7)，以便用于需要的用途。人们可以选择可用于针对下列任意一种病原体的抗原。牛                             马BRSV                            里氏埃里希氏体BVD弯曲菌属                        脑脊髓炎睡眠嗜血菌                             东方IBR                                    西方钩端螺旋体                             委内瑞拉副流感                          流感溶血巴斯德氏菌                  狂犬病多杀巴斯德氏菌                  鼻肺炎PI3                             轮状病毒破伤风抗毒素                    链球菌破伤风类毒素                    破伤风抗毒素毛滴虫属                        破伤风类毒素
                            病毒性动脉炎犬                             猫博德特氏菌                      杯状病毒布氏疏螺旋体                 衣原体CAV-2                        白血病冠状病毒                     犬小孢子菌热病                         猫传染性粒细胞缺乏症钩端螺旋体                   狂犬病副流感                       鼻气管炎细小病毒狂犬病                      猪博德特氏菌布氏疏螺旋体                 A胸膜肺炎CAV-2                        博德特氏菌冠状病毒                     大肠杆菌热病                         丹毒钩端螺旋体                   副猪嗜血菌副流感                       钩端螺旋体细小病毒                     支原体狂犬病                       细小病毒
                         多杀巴斯德氏菌
                         假狂犬病毒
                         破伤风抗毒素
                         破伤风类毒素
在优选实施方案中，选择用于兽用目的的抗原，用于抗狂犬病病毒、犬细小病毒(严重的肠胃道疾病)、犬细小病毒2(严重的肠胃炎)、犬冠状病毒(肠胃炎)、犬腺病毒1型(传染性肝炎)和犬腺病毒2型(犬咳病)、犬幅流感病毒(支气管炎犬咳病)和多种其他动物病原体。
我们的研究结果表明，CDV的分子遗传学操作是可行的，并且可以用cDNA挽救技术实现未来型简单CDV菌株和CDV表达载体的合理化设计。
rCDV的挽救提供了一种寻求开发犬热病病毒的更安全的活的减毒免疫原性组合物的途径。其他的减毒病毒如果保留了对狗进行免疫的效力，并且是安全的，而且还能有效用于诸如大型猫科动物、小型食肉动物和海豹的其他动物的话，这种病毒就是理想的。对于采用减毒的犬热病病毒的实施方案来说，使用传统方法引入减毒突变，以便产生修饰过的病毒，如病毒在细胞细胞培养物生长期间进行的化学诱变，是向培养物中添加化学诱变剂，然后筛选业已在亚最佳温度下进行过传代的病毒，以便筛选温度敏感型和/或低温适应型突变，鉴定能在细胞培养物中产生小的噬斑的突变型病毒，并且通过异源宿主进行传代，以便筛选宿主范围突变。另一种引入减毒突变的方法，包括通过定点诱变产生预定的突变。可以引入一个或多个突变。通常在动物模型体内筛选所述病毒的生物活性的减弱。对减毒的犬热病病毒进行核苷酸测序，以便定位减毒突变的位点。
实现这一目的的另一种方法，是使用合理化疫苗设计方法。有多种研究可能有助于鉴定可以在犬热病病毒上检验的减毒氨基酸取代和顺式作用信号改变。例如，对人副流感病毒3型和呼吸道合胞病毒的重组菌株的研究，业已鉴定了多种减毒突变，这些突变可能与CDV密切相关。所述突变包括发生在L蛋白上的氨基酸取代(49、50、60)，以及发生在前导序列和GE/GS信号上的顺式作用序列上的突变(21、50、59)。另外，业已检查了麻疹病毒疫苗的基因组序列，并且与野生型分离物进行了比较。已经有C或V蛋白表达缺陷型病毒的例子，这种病毒表现出某种程度的减毒作用(12、13、15、22、31、37、53、56)。具体地讲，人们可以将相当于另一种非节段化的、负的单链RNA病毒的编码或非编码区上的减毒突变的一种或多种突变插入CDV基因组，所述病毒是单链负病毒纲的病毒，优选是副粘液病毒科的病毒，如PIV、RSV、腮腺炎和麻疹。其他病毒的各种突变是众所周知的，并且在不断地产生。业已鉴定的可以对单链负病毒纲的病毒进行减毒的突变包括，但不限于以下突变：麻疹病毒3’基因组启动子+RNA聚合酶基因(WO98/13501)、麻疹病毒N、P和C基因、和F基因-末端信号(WO99/49017)、呼吸道合胞病毒3’基因组启动子+RNA聚合酶基因(WO98/13501)、呼吸道合胞病毒M基因-末端信号(WO99/49017)、呼吸道合胞病毒RNA聚合酶基因(US5993824)、呼吸道合胞病毒N和F基因(WO00/61611)、和副流感病毒3型3’基因组启动子+RNA聚合酶基因(WO98/13501)。一旦在CDV基因组上产生了所述突变，人们就可以利用本发明的方法重组生产所述重组病毒。另外，可以使用基因失活方法。最后，可以采用新的基因改组方法(3，58)开发出犬热病病毒的更安全、毒性更低的菌株，以便用于免疫原性和治疗组合物中。
首先通过诸如序列鉴定、序列标记的验证和基于抗体的测定的体外方法，检验挽救的重组犬热病病毒的预期表型(温度敏感性、低温适应性、噬斑形态学、以及转录和复制减弱)。如果挽救的病毒存在减毒表型的话，就可以利用合适的动物模型或靶动物进行刺激实验。首先用所述减毒的、重组生产的病毒对所述动物进行免疫，然后用该病毒的野生型形式进行刺激。通过比较减毒病毒和野生型CDV或其他标准物(例如，CDV的一种可以接受的减毒形式)的毒力，确定重组生产的CDV的减毒水平。通过所述比较，优选能确定减毒的重组病毒与野生型病毒相比在毒力方面具有显著降低。所述减毒重组病毒的毒力水平，应当足以满足将所述重组病毒用于治疗人类或治疗特定类型的非人动物。
表达载体以及编码衣壳化、转录和复制所必需的反式作用蛋白的分离的核酸分子的选择，可以根据所需病毒的选择而改变。制备所述表达载体，是为了能够在特定条件下，在宿主细胞中与所述转录载体共表达，并且产生重组病毒。
犬热病挽救包括合适的细胞环境，其中，存在T7RNA聚合酶，以便启动由含有病毒基因组cDNA的转录载体转录反基因组(或基因组)单链RNA。在转录同时或者在转录之后不久，由核壳蛋白将所述病毒反基因组(或基因组)RNA转录物衣壳化成有功能的模板，并且与由编码所需病毒专一性反式作用蛋白的共转染的表达质粒同时产生的必需聚合酶成分结合。以上事件和过程导致了病毒mRNA的必要转录、新基因组的复制和扩增，并且因此产生了新的病毒后代，即挽救。
在本发明的挽救方法中，T7RNA聚合酶可以由重组痘苗病毒提供。不过，该系统要求挽救的病毒是通过物理或生化方法从痘苗病毒中分离的，或者通过在不是痘病毒的良好宿主的细胞或组织中充分传代而分离的。通过使用不能在哺乳动物细胞中繁殖的痘苗病毒的宿主细胞限制菌株(例如MVA-T7)可以避免这一前提条件。业已报导了能表达噬菌体T7RNA聚合酶的两种重组MVAs。所述MVA/T7重组病毒含有一个受7.5K弱的早期/晚期启动子(Sutter et al.，1995)或11K强的晚期启动子(74)调控的整合拷贝的T7RNA聚合酶。
用于所述挽救组合物转染的宿主细胞或细胞系，可以根据所选择的挽救条件在很大范围内变化。在能够共表达所述挽救组合物的载体的条件下培养所述宿主细胞，以便产生需要的重组犬热病病毒。所述宿主细胞可以从多种细胞中选择，包括真核细胞，优选脊椎动物细胞。可以使用禽类细胞，不过，如果需要的话，宿主细胞可以来自其他细胞，甚至是人细胞，如人胚胎肾细胞。典型的宿主细胞有人293细胞、A549细胞(肺癌)和HEp2细胞(宫颈癌)。还可将Vero细胞(猴肾细胞)以及很多其他类型的细胞用作宿主细胞。合适的宿主细胞的其他例子有：(1)人二倍体原代细胞系：例如，WI-38和MRC5细胞；(2)猴二倍体细胞系，例如，FRhL-胎罗猴肺细胞；(3)准原代连续细胞系：例如，AGMK-非洲绿猴肾细胞；(4)其他潜在的细胞系，如CHO、MDCK(Madin-Darby犬肾)，DK(狗肾)和原代鸡胚胎成纤维细胞(CEF)。某些真核细胞系比其他细胞系更适合繁殖病毒，而某些细胞系对某些病毒来说根本就无法使用。采用能产生可检测的细胞病变效应的细胞系，以便能方便地检测活的病毒的挽救。对于犬热病来说，可以在Vero细胞上共培养转染过的细胞，因为所述病毒能够在Vero细胞上迅速扩散，并因此产生便于检测的噬斑。一般，采用允许特定病毒生长的宿主细胞。
在其他优选实施方案中，可以添加一种能促进转染的试剂，以便增加细胞对DNA的摄取。有多种这样的试剂为本领域所公知。常见的例子有LIPOFECTACE(Life Technologies，Gaithersburg，MD)和EFFECTENE(Qiagen，Valencia，CA)。Lipofectace和Effectene都是阳离子脂类。它们都能对DNA进行包衣，并增强细胞对DNA的摄取。Lipofectace形成包围DNA的脂质体，而Effectene能对DNA进行包衣，但不能形成脂质体。
所述转录载体和表达载体可以是为了在所述宿主细胞中表达而设计的质粒载体。包括至少一个编码衣壳化、转录和复制所必需的反式作用蛋白的分离的核酸分子的表达载体，能够表达来自同一种表达载体或至少两种不同载体的蛋白。所述载体通常是从基础挽救方法中了解到的，并且在用于本发明的改进方法中时没有必要加以改变。
在本发明的方法中，可以采用标准的挽救温度范围(大约32-大约37℃)；不过，业已证实在较高温度下进行的挽救能改善重组RNA病毒的回收。所述较高的温度被称为热激温度(参见国际专利公开号WO99/63064，公开日为1999年12月9日，该专利被收作本文参考)。有效的热激温度是高于推荐用于实施重组病毒挽救的标准温度的温度，在该温度下，重组病毒的回收水平得到提高。典型的温度范围清单如下：从38到大约47℃，以大约42到大约46℃为更优选。另外，业已发现，43、44和45℃的热激温度是特别优选的。
采用多种方法测定所需重组犬热病病毒的回收水平。正如在本文的实施例中所指出的，利用氯霉素乙酰转移酶(CAT)报导基因监测并优化挽救重组病毒的条件。所述报导基因的相应活性建立了重组病毒表达的基准和检测水平。其他方法包括检测所获得的重组病毒的噬斑数量，并通过测序证实所述挽救病毒的产生。
在优选实施方案中，对存在于所述宿主细胞中的转染的挽救组合物实施一个噬斑扩增步骤(即扩增步骤)。将所述转染的挽救组合物转移到至少一层噬斑扩增细胞(PE细胞)上。通过选择一种犬热病病毒或重组犬热病病毒能在其中表现出增强了的生长的噬斑扩增细胞，可以改善从所述转染细胞中回收重组病毒。优选将含有所述挽救组合物的转染过的细胞转移到基础上铺满的PE细胞的单层上。在于1999年12月9日公开的国际专利申请号WO99/63064中还提供了包括噬斑在内的对挽救技术的各种改进。
另外，业已发现在30-35℃的温度下而不是在37℃下能增强微型复制子的(参见图3B)。对于在较低温度下实施犬热病病毒挽救实验来说，这一发现具有实用价值。尽管较低的培养温度提高了微型复制子的活性，但是业已发现在较高温度下进行瞬时培养能提高CDV微型复制子活性。就热激对微型复制子活性产生的正面影响来说，优选将热激步骤整合到本发明的犬热病病毒挽救方法中。
挽救方法优选采用用于转染方法的磷酸钙技术。与脂质体方法相比，磷酸钙方法通常能将转染实验中CDV-阳性孔的数量增加大约2倍(资料未发表)。在分离高度减毒的菌株时，这一点可能是重要的。并不受以下理论的约束，磷酸钙对细胞膜的损伤可能比脂质体试剂的小，并且比较健康的细胞膜能促进相对较少的挽救病毒的芽殖。同样可能现实的是，磷酸钙沉淀在将多种不同质粒导入同一种细胞方面更为有效，并且它确实产生了更多的含有完整的N、P和L表达质粒组以及基因组cDNA的细胞。
优选的病毒挽救方法包括上述技术中的若干种，如噬斑扩增、热激、钙沉淀技术(10、31、40、42)，以及若干种重要改进，如低温培养。
通过不同的技术组合，采用微型复制子可以尝试优化所述挽救方法，这样能够通过瞬时测定快速确定能影响基因表达水平的多种变数。例如，可以快速试验用于挽救的各种因素，包括每一种表达载体(N、P和L)，以及复制子载体上的顺式作用信号，以便评估其在挽救系统中的活性。人们还可以利用所述微型复制子系统确定最高微型复制子表达所需要的表达载体的最佳用量(参见图2和3；资料未发表)。上述每一个优化步骤都能对微型复制子表达产生有利的增强，并且综合在一起之后能够对挽救产生显著作用。通过将两种或两种以上优化的变数和技术组合在一起，人们可以显著提高成功挽救病毒的百分比。可以通过确定每一个平板上阳性孔的数量测定成功的比例。成功比例至少为大约50％，甚至高于60％。在其他实施方案中，成功比例至少为75％，更优选至少为80％。与业已公开的挽救技术相比，这是一种实质性的提高(例如，参见公开的国际专利申请号WO99/63064)。
对于犬热病病毒来说，采用所述改进方案优化的挽救方法都能在转染的6孔平板上产生4-6个CDV-阳性孔。相反，由免疫原性组合物形成的候选菌株，特别是含有理想减毒突变的菌株，复制非常差和/或难于挽救。用于提高挽救效率的特定技术可用于挽救任何非节段化的、负的单链RNA病毒。在下面提供了非节段化的负的单链RNA病毒的现行分类学分类，同时提供了每一种类型的例子。
单链负病毒纲的非节段化负的单链RNA病毒的分类
副粘液病毒科
副粘液病毒亚科
呼吸道病毒属(以前称之为副粘液病毒)
仙台病毒(小鼠副流感病毒1型)
人副流感病毒(PIV)1型和3型
牛副流感病毒(BPV)3型
Rubulavirus属
猴病毒5(SV5)(犬副流感病毒2型)
腮腺炎病毒
新城病病毒(NDV)禽副粘液病毒1
人副流感病毒(PIV-2、4a和4b型)
麻疹病毒属
麻疹病毒(MV)
海豚麻疹病毒
犬热病病毒(CDV)
Peste des petits反刍动物病毒
海豹热病病毒
牛瘟病毒
肺炎病毒亚科
肺炎病毒属
人呼吸道合胞病毒(RSV)
牛呼吸道合胞病毒
小鼠肺炎病毒
火鸡鼻气管炎病毒
棒状病毒科
狂犬病病毒属
狂犬病病毒
水疱病毒属
水疱性口炎病毒(VSV)
短时病病毒属
牛短时热病毒
纤丝病毒科
纤丝病毒属
青猴病病毒
为了提高上述任意一种病毒的病毒挽救效率，人们可以改变N、P和L表达载体的数量以及完整长度cDNA的微型复制子的数量，以便产生使得人们能够挽救所述重组病毒的量。人们可以采用下面的两个或两个以上步骤和/或技术来提高挽救效率：(1)筛选用于转染的细胞类型(优选Vero细胞、HEp2或A549细胞)；(2)选择转染试剂(优选使用磷酸钙试剂)；(3)筛选用于实施噬斑扩增步骤的最佳细胞类型；和(4)筛选用于改善转染的细胞类型。另外，通过采用下面的一个或多个步骤和/或技术，可以进一步提高挽救效率：(1)改变用于特定细胞类型和挽救系统的培养温度；(2)改变所施加的热激时间(优选在转染开始之后大约2-大约4小时开始施加热激)；(3)改变热激温度(优选大约42-大约44℃)和(4)改变热激时间(优选大约2-大约3小时)。通过选择合适数量的T7聚合酶源，如MVA/T7或重组痘苗病毒，和/或通过细胞接触转染试剂和转染中的DNA的时间，还可以获得挽救效率的进一步提高。
用本发明方法制备的重组犬热病病毒被用于诊断、预防和治疗目的。用本发明方法制备的重组病毒优选是减毒的。所述减毒的重组病毒与感染人和动物宿主的野生型病毒相比表现出毒力的明显减弱。减毒的程度是这样的：在大多数个体上不会出现感染症状，不过所述病毒保留了足够的复制能力，以便具有感染性并且产生所需免疫原性组合物的理想免疫反应。可将所述减毒重组病毒单独或者作为免疫原性组合物与药物、抗原、免疫制剂或佐剂结合用于预防或减轻疾病。所述活性制剂可以用常规方法制备和输送，即通过使用稀释剂或可以药用的载体。
本发明的另一种实施方案涉及将未减毒的或减毒的重组生产的犬热病病毒用于免疫原性组合物中，该组合物包括：(i)至少一种重组生产的犬热病病毒，和(ii)至少一种可以药用的缓冲剂或稀释剂、佐剂或载体。所述组合物优选具有治疗和预防用途，作为免疫原性组合物用于预防和/或缓解犬热病感染。在这种用途中，使用免疫学有效量的至少一种本发明的重组犬热病病毒，以便在正常犬热病感染的过程中导致明显的减轻。
对本领域技术人员来说，所述免疫原性组合物的配方是众所周知的。本发明的免疫原性组合物可以含有其他抗原性成分(例如，多肽或其片段，或编码一种抗原或其片段的核酸)，并且优选含有可以药用的载体。合适的可以药用的载体和/或稀释剂包括常规溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、水溶液、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等的任一种和全部。术语“可以药用的载体”表示不会在服用它的患者体内导致过敏反应或其他不希望的效应的载体。例如，合适的可以药用的载体包括以下成分中的一种或多种：水、盐水、磷酸缓冲的盐溶液、葡萄糖、甘油、和乙醇等及其组合。可以药用的载体还可以包括微量辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，这些物质能延长所述抗原的货架寿命或加强其效果。将所述介质和试剂用于具有药理学活性的物质在本领域中是众所周知的。任何常规介质或试剂都可用于本发明的免疫原性组合物中，除非它与所述活性成分不兼容。
所述免疫原性组合物的服用可以通过任何常规有效方式进行，如鼻内、肠胃外、口腔或局部用于粘膜表面，如通过气溶胶喷雾用于鼻腔、口腔、眼睛、肺、阴道或直肠表面。优选的服用方法是肠胃外或鼻内。
口服制剂包括这些正常使用的赋形剂，例如，药用级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁等。
本发明的免疫原性组合物可以包括佐剂，包括，但不限于氢氧化铝；磷酸铝；StimulonTMQS-2 1(Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Framingham，MA)；MPLTM(3-O-脱酰化单磷酸脂A；RIBI ImmunoChem Research，Hamilton，MT)；IL-12(遗传学研究所，剑桥，MA)；N-乙酰-肉桂酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)；N-乙酰-正肉桂酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637，被称为正-MDP)；N-乙酰-正肉桂酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A，被称为MTP-PE)；和霍乱毒素。可以使用的其他成分是霍乱毒素的无毒衍生物，包括它的B甲基(例如，其中位于29号氨基酸位置上的谷氨酸被另一种氨基酸取代，优选被组氨酸取代，参见公开的专利申请号WO00/18434，该专利被收作本文参考)，和/或非犬热病多肽与霍乱毒素或其B亚基、procholeragenoid、真菌多糖的结合物或遗传工程产生的融合体。
本发明的重组生产的减毒犬热病病毒可以作为免疫原性组合物中的唯一活性免疫原服用，不过，所述免疫原性组合物还可以包括其他活性免疫原，包括上文所述的针对其他致病物种的其他免疫活性抗原。所述其他免疫活性抗原可以是复制型抗原或非复制型抗原。其他免疫活性抗原可以是定向针对多种传染剂的抗原(1，7)。所述免疫原性组合物可用于治疗多种动物，包括陪伴动物，如狗(犬)和猫，并且还可以治疗家畜，如牛、猪和马。
本发明的一个重要方面涉及一种在哺乳动物体内诱导免疫反应的方法，该方法包括给所述哺乳动物提供本发明的免疫原性组合物的步骤。所述免疫原性组合物是一种在接受治疗的动物或人体内具有免疫原性的组合物，以便该组合物中所含的免疫有效量的多肽能产生针对犬热病感染的理想反应。优选实施方案涉及一种用于治疗(包括缓解)或预防动物感染犬热病的方法，该方法包括给动物服用免疫有效量的所述抗原性组合物，有关剂量可以根据个体的具体情况而改变。该剂量可以通过本领域技术人员所公知的常规实验来确定。可以用本发明的免疫原性组合物治疗动物甚至是人。当然，可以治疗多种动物。可以治疗的动物包括陪伴动物，如宠物狗，以及野生动物，如狐狸、狼和草原狼。由于业已报导了甚至是小熊猫也易感犬热病病毒，人们可以治疗生活在圈养区或环境中的任何动物，如在动物园或野生动物园中的动物。业已报导过犬热病病毒在海豹和诸如水貂、雪貂和浣熊的食肉动物中爆发，其中任意一种动物都可以成为本发明所述治疗的目标动物。
提供下面的实施例是为了说明本发明的某些实施方案。不过，本领域技术人员在阅读本说明书之后可以理解的是，在不超出本发明构思或范围的前提下，可以对所披露的具体实施方案进行多种改变，而仍然能获得类似或相似结果。
                       实施例
例1
材料和方法
细胞和病毒
在补充了10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s改进的Eagle培养基(DMEM)中维持HEp2、A549、Vero、B95-8和鸡胚胎成纤维(CEF)细胞。在补充了5％FBS的改进的基本必需培养基(SMEM)中生长HeLa悬浮细胞。按以前披露的方法(46)在HeLa细胞中繁殖实验室改良的Onderstepoort CDV菌株(17)。第二种实验室改良的Onderstepoort菌株是由苏黎士大学的Martin Billeter博士提供的，并且在B95-8细胞中繁殖。在CEF细胞中繁殖为了表达T7RNA聚合酶基因而设计的重组减毒痘苗病毒菌株MVA/T7(从B.Moss博士处获得，国家健康研究所，Bethesda，MD；参见Wyatt等，1995；参考文献61)。在CEFs上滴定MVA/T7母液。在HeLa悬浮细胞中生长麻疹病毒(MV)的实验室改良的Edmonston菌株(55)。
重组DNA
分子克隆方法是按照标准方案进行的(2，26，71)。
1A-完整长度的CDV cDNA克隆
完整长度的CDV cDNA克隆是利用出现在有关基因组中的常见限制位点，由6个RT-PCR片段组装而成的(图1A)。克隆所述病毒cDNA，使T7RNA聚合酶启动子与正的基因组链的5’末端融合，而3’末端的旁侧是肝炎Δ病毒核酶和两个T7转录终止子。通过去掉3个G残基，在3’末端将T7RNA聚合酶启动子截短。这3个残基通常提供了优选的T7聚合酶转录起始位点，这样，转录物的大部分将始于所述正的基因组链上的第一个A残基。
制备含有单一的NotI和NarI位点的质粒载体，以便克隆CDV完整长度的基因组克隆。在CDV基因组中缺乏NotI和NarI限制位点，这使得它们成为用于载体主链中的方便位点。这种修饰过的载体DNA是通过PCR制备的。设计引物，以便由以前披露的麻疹病毒微型复制子质粒扩增所述载体主链(图1，p802参考文献45)。所述引物能指导所述载体主链扩增，并且排除了麻疹病毒微型复制子序列。扩增的DNA保留了位于核酶序列上的NarI位点，并且产生了一个NotI位点(参见图1A中的NotI和NarI位点)。该引物还包括为了在NotI和NarI位点产生一个多接头而设计的5’延伸部分，一旦连接所述扩增的DNA，就使所述扩增的载体主链环化，以便用于细菌转化。所述多接头所包括SalI、NdeI、DraIII、BsiWI和SgrAI位点有利于克隆由所述病毒基因组扩增的片段(图1A)。
将完整长度的基因组cDNA扩增到上述载体上(图1A)。完整的CDV cDNA序列有15690个碱基，这是一个可以用6除尽的数字，符合rule-of-six(6，23)。所述病毒cDNA在质粒pPS-rCDV(图1A)中的取向允许通过T7RNA聚合酶合成正拷贝的CDV基因组。为了制备基因组cDNA质粒，在逆转录和PCR扩增(RT/PCR)之后，由纯化的病毒RNA依次克隆所述CDV基因组的6个片段(CDV)(46)。所扩增的第一个基因组cDNA片段与图1A中的NarI/SgrAI片段相同(CDV，SEQID NO：2的13089-15690号核苷酸)。用于扩增CDV cDNA的3’末端的引物互补于CDV的末端，并且包括一个延伸部分，该部分包括跨越NarI位点的核酶序列(cagccggcgccagcgaggaggctgggaccatgccggccACCAGACAAAGCTGGGT，SEQ ID NO：6，其中CDV序列用大写字母表示)。第二种引物跨越所述病毒基因组上的SgrAI位点(ATACTCAAGTCAAATACTCAGGGAC，SEQ ID NO：7)。用NarI和SgrAI消化扩增的片段，并且克隆到所述载体主链上。然后将该质粒用于克隆在跨越SgrAI和BsiWI位点的下一个片段(10136-13088；引物CAGGGGTGCTTTTCTGAGTCACTGC，SEQ ID NO：8和ACGACCTTTCTGAGCCCTGGGACTC，SEQ ID NO：9)。类似地，依次扩增BsiWI-DraIII片段(8666-13015号核苷酸；引物AGAGGAGACCAGTTCACTGTACTCC，SEQ ID NO：10和TGATTCCCTCCCCTGAGGCATGAGC，SEQ ID NO：11)、NdeI/DraIII片段(5845-8665号核苷酸；引物GCAATCCAATCTCTTAGAACCAGCC，SEQ ID NO：12和TCGAATCTGTAAAATTGGTGACACC，SEQ ID NO：13)和SalI和NdeI片段(2962-5844号核苷酸；引物GCCATTACTAAACTAACTG，SEQID NO：14和CTCTTATGAATTTCTCCTCC，SEQ ID NO：15)，并添加到生长的cDNA克隆中。最后扩增含有T7启动子和CDV1-296号核苷酸的NtoI/SalI(引物ATGGGTTTCAGCTGGAGGTCTCTC，SEQ ID NO：16和 cggcgccgcgtaatacgactcactata ACCAGACAAAGTTGGCT，SEQ IDNO：17，其中，CDV核苷酸用大写字母表示，并且添加到基因组cDNA克隆中。
对完整的基因组cDNA质粒进行测序，并且与CDV基因组保守序列进行比较。由此发现了多个核苷酸改变，这些改变很有可能是通过RT/PCR扩增导入的。由于氨基酸密码子的专一性，蛋白编码区上的某些碱基变化是沉默的。不修复这些碱基取代；将其用作有用的“标记”，以便鉴定重组病毒。另外，还在位于M和F基因之间的基因间区(M/F基因间区)的6837号核苷酸上发现了一个非编码区碱基的改变，该碱基取代没有被修复。影响密码子专一性的碱基取代，可以通过寡核苷酸诱变或通过用独立RT-PCR扩增的DNA片段取代突变区而修复。寡核苷酸诱变是这样进行的：首先亚克隆需要碱基校正的片段，然后使用QuickChange(Stratagene)或Morph(5prime-3prime，Inc)诱变试剂盒进行校正。然后将校正的片段送回所述完整长度的克隆中。对修复的完整长度克隆进行测序，以便证实诱变的校正。
1B-CDV微型复制子
同样用用于完整长度cDNA克隆的质粒载体制备含有CDV微型复制子(CDV-CAT)序列的pCDV-CAT。构成CDV微型复制子的序列包括CAT基因，在报导基因的5’末端是以CDV前导序列为旁侧序列，而在其3’末端是CDV尾随序列(图1B)。将CDV微型复制子以与完整长度克隆相反的方向插入T7聚合酶启动子和核酶之间。因此，T7RNA聚合酶转录产生了负链微型基因组RNA的等同物。
将所述CDV微型复制子克隆到上述载体主链上。用于克隆的微型复制子DNA是通过PCR制备的。CAT基因的5’末端以CDV前导序列和核酶序列为旁侧序列(包括NarI位点)，而CDV尾随序列和T7启动子位于3’末端(图1B)。它是通过4个嵌套PCR反应产生的。简单地讲，用4套不同的引物CAT基因进行4次不同的扩增。第一套引物定向扩增CAT基因，同时通过整合在CAT基因专一性引物5’末端的序列在PCR产物上添加前导和尾随序列部分。下一轮PCR使用的引物与第一套引物重叠，同时添加来自CDV前导和尾随序列的其他序列。将这种使用重叠引物进行5’延伸的方案重复4次，使用选自下面列举的引物：质粒微型复制子5’末端引物A65 CDV                     107 CDV  CAT基因5’末端|                                |GATCCTACCTTAAAGAACAAGGCTAGGGTTCAGACCTACCAAT ATGGAGAAAAAAATCACSEQ ID NO.18B26 CDV                                              CDV 85|                                                       |TTAAATTATTGAATATTTTATTAAAAACTTAGGGTCAATGATCCTACCTTAAAGAACAAGSEQ ID NO.19C1 CDV                                            CDV 57|                                                    |ACCAGACAAAGTTGGCTAAGGATAGTTAAATTATTGAATATTTTATTAAAAACTTAGSEQ ID NO.20D核酶序列                   CDV 1                 CDV 24NarI                          |                     |GGCGCCAGCGAGGAGGCTGGGACCATGCCGGCCACCAGACAAAGTTGGCTAAGGATASEQ ID NO.21E核酶序列                       CDV 1                 CDV 24
 NarI                          |                     |ATTGGCGCCAGCGAGGAGGCTGGGACCCATGCCGGCCACCAGACAAAGTTGGCTAAGGATASEQ ID NO.22质粒微型复制子3′末端引物F15624 CDV                        CDV 15584  CAT基因3’末端|                                       |TAGCAATGAATGGAAGGGGGCTAGGAGCCAGACTAACCTGTCATT ACGCCCCGCCCTGC
                来自CDV L基团的终止密码子******来自CAT的终止密码子SEQ ID NO.23G15666 CDV                                        CDV 15608|                                                       |ACTTATTAATAACCGTTGTTTTTTTTCGTATAACTAAGTTCAATAGCAATGAATGGAAGGSEQ ID NO.24H        15690 CDV                               CDV 15640
     |                                              |CTCACTATAACCAGACAAAGCTGGGTATGATAACTTATTAATAACCGTTGTTTTTTTTCGSEQ ID NO.25I                        15690 CDV              CDV 15662HindIII       T7启动子        |                         |ATTGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGACCAGACAAAGCTGGGTATGATAACTTATSEQ ID NO.26J                     15690 CDV                 CDV 15661
 NotI   T7启动子          |                         |ATTGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGACCAGACAAAGCTGGGTATGATAACTTATSEQ ID NO.27
4轮嵌套PCR扩增产生的微型复制子片段包括：5’-NarI位点-33bp的核酶序列-CDV前导序列-CAT基因-CDV尾随序列-T7启动子-HindIII位点。以上4轮嵌套PCR扩增是用以下引物对进行的：第一轮：引物A+F；第二轮：引物B+G；第三轮：引物C+H；第四轮：引物D+I。
人们可以发现，引物F在CT基因的3’末端决定两种终止密码子。一种是CAT基因终止密码子，而另一种则来自CDV基因组的L基因。这两种终止密码子进行简单地整合，以便引入3个额外的核苷酸(第二种终止密码子)，使得该微型基因组遵循rule-of-six(6，23)。
此时，最初的计划是使用在图1B中的NtoI位点上含有HindIII位点的载体。因此，上面所列举的引物I含有HindIII位点。在所述载体上使用NtoI位点的决定，导致了进行第五轮PCR，以便制备含有NtoI位点的微型复制子片段。为了引入NtoI位点，用引物E和J(J包括NtoI位点)扩增所述微型复制子DNA。
最后，上面使用的引物在CDV微型复制子上整合了一个野生型T7启动子序列(TAATACGACTCACTATAGGG，SEQ ID NO：28，参见引物H、I和J)。由于在转染实验中具有较差的微型复制子活性，因而导致了对微型复制子进行进一步的修饰，以便消除T7启动子3’末端的3个G残基(斜体)。T7启动子上的这些残基由所述聚合酶精确拷贝，并且整合到微型复制子转录物上。由此产生了不遵循rule-of-six的微型复制子RNA(6，23)。T7启动子的截短，降低了启动子活性，不过产生了一种遵循rule-of-six的微型复制子转录物。使用类似于E和J的引物，通过PCR扩增制备修饰过的微型复制子，修饰过的引物J缺少以上3个G残基。
1C-用于表达异源核酸或基因序列的CDV结构。
对基因组cDNA克隆的P和M基因之间的部分进行修饰，以便能够插入外源基因。对修饰进行选择，以便能够导入若干独特的限制位点，同时又能对CDV序列产生最小的改变。引入8种核苷酸取代，产生3种独特的限制位点(3330G→A，3331G→A，3335T→C，3348A→G，3349A→G，3355G→C，3373T→A和3377T→G)。这些修饰在CDV的3329-3377号核苷酸位置之间产生了三种独特的限制位点(AatII，FseI和MluI，图5A)。在紧靠AatII位点的3’末端增加第九种碱基改变(3337A→T)，以便剔除为了产生AatII位点而进行的核苷酸改变时所产生的SalI位点。
首先在包括P和M基因间区的质粒亚克隆上进行核苷酸取代(2961号位置上的SalI改变成5843号位置上的NdeI)。将来自所述亚克隆的修饰过的片段交换送回到完整长度的基因组克隆上，将所述新的限制酶位点定位在P基因开放读框的3’末端和P/M基因-末端/基因-启动信号的5’末端。该片段(pBS-rCDV+)的成功挽救，表明了所述碱基取代没有对所述病毒产生显著的破坏作用。
然后将克隆pBS-rCDV+用作载体，用于插入外源基因。用引物(5’末                     端                    ，TACTGGCCGGCCATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGCCTAAGTCCGCTGCCACCATGGAAGACGCCAAAAACAT，SEQ ID NO：29；3’末端，ACGCGTTTTACAATTTGGACTTTACGC，SEQ ID NO：30)扩增来自pGL2-luc(Promega)的荧光素酶基因，在荧光素酶基因上整合了一个5’FseI位点和3’MluI位点。对荧光素酶编码区的氨基末端专一的5’末端引物还包括一个5’延伸部分，该部分除了FseI位点之外，还包括一个拷贝的来自P/M基因间区的GE/GS信号(图5A)。对用于扩增荧光素基因的引物进行设计，以便在最终将它插入pBS-rCDV+内产生pBS-rCDV-P/luc/M时产生一种遵循rule-of-six的片段(23)(图5A)。
1D-表达载体pCDV-N、pCDV-P和pCDV-L
如图1C所示，通过将N(108-1679号核苷酸)、P(801-3324)或L(9029-15584)编码序列插入基于pTM-1(29，41)的载体，制备表达载体pCDV-N、pCDV-P和pCDV-L。该载体含有脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点(IRES)上游的T7RNA聚合酶启动子。将位于IRES3’末端的NcoI位点用于克隆，并且还包括ATG起始密码子。一个合成的聚腺苷酸片段位于所述克隆片段的3’末端，随后是一个T7RNA聚合酶终止子。所述N、P和L基因插入片段是通过PCR扩增制备的。所述N和P基因是通过RT/PCR由感染的细胞RNA扩增的。所述L基因是由完整长度的CDV cDNA克隆通过PCR扩增的。在PCR期间引入的错误，通过用由独立的PCR扩增所产生的片段取代突变的序列或者通过寡核苷酸定向诱变而修复。在由感染的细胞RNA进行RT/PCR扩增之后，将来自实验室改良的Edmonston菌株的MV N、P和L基因(55)克隆到T7载体上。
1E-DNA测序和序列验证
使用染料终止子/Taq DNA聚合酶试剂盒(ABI)通过循环测序(16，24)测定克隆在表达载体上的基因的序列、pCDV-CAT的序列、和完整长度基因组克隆的序列。在microspin G50柱(Amersham-PharmaciaBiotech)纯化测序反应物，并且在ABI377自动测序仪(ABI)上分析。用MacVector(牛津分子)通过计算机分析分析序列数据。
通过直接由扩增的RT/PCR产物制备共有序列，验证CDVOnderstepoort菌株的基因组序列(36)。简单地讲，使用Trizol试剂(LifeTechnologies)通过胍-苯酚-氯仿提取方法(9)，从感染的细胞中提取RNA。使用基因专一性引物和SuperscriptII逆转录酶(Life Technologies)对纯化的RNA进行逆转录。然后用基因专一性引物和Taq DNA聚合酶(ABI)扩增基因组片段，然后进行凝胶纯化。按上述方法对纯化的PCR片段进行循环测序和分析。
验证挽救的CDV
通过DNA测序分析重组CDV(rCDV)分离物基因组上的序列标记或分析限制酶位点标记的存在。利用14个核苷酸位点区分在实验室中使用的rCDV和CDV菌株。通过上述胍-苯酚-氯仿提取分离感染细胞的RNA。使用Titan one tube PCR试剂盒(Roche分子生物学)通过RT-PCR扩增含有合适的序列标记的基因组区。用于验证污染质粒DNA存在的负对照(-RT)是通过在RT步骤之后添加RNA进行的，它是在单一试管反应系统中完成的。按上述方法对PCR片段进行测序，或者用合适的限制酶消化扩增的片段(图4B)。
通过序列分析分析含有荧光素酶基因的rCDV基因组(rCDV-P/luc/M)，以便验证荧光素酶基因是正确插入的。还要分析用rCDV-P/luc/M分离物感染的细胞对荧光素酶的表达。用Reporter裂解缓冲液(Promega：Madison，Wisc.)制备感染细胞提取物，并用购自Pharmingen的试剂和分析荧光素实验室发光计(Pharmingen，San Diego，CA)分析荧光素酶活性。
例2
通过CAT测定进行的瞬时表达分析和病毒挽救的一般方法
通过若干种方法进行微型复制子转染。对于用CDV微型复制子作为RNA进行转染的实验来说，用Lipofectace(Life Technologies)转染293细胞。微型复制子RNA是用pCDV-CAT DNA(图1B)作转录模板，通过T7RNA聚合酶在体外制备的(2)。使用Megascript试剂盒(Ambion)中的试剂和方法合成并纯化RNA。在由CDV感染提供的补偿的微型复制子实验中(图2A)，RNA转染混合物的成分是用两只试管制备的。一只试管装有20微克纯化的微型复制子RNA和100微升无血清OptiMEM(Life Technologies)。第二只试管是用100微升无血清OptiMEM和9-12微升Lipofectace(Life Technologies)制备的。然后混合两只试管中的内含物，并且在室温下培养30-40分钟。在转染之前，从293细胞单层中除去培养基(在60毫米的培养皿上达到大约80％的铺满度)，并且用无血清OptiMEM洗涤细胞1次。然后将RNA转染混合物与含有足够CDV(Onderstepoort)的0.8毫升无血清OptiMEM混合，以便以每个细胞大约2个噬斑形成单位(pfu)的感染复数(moi)感染所述单层。然后将1毫升该转染混合物添加到细胞单层上，并且在37℃下培养5小时。在经过5小时培养之后，将1毫升补充了20％SBS的TMEM添加到所述细胞中，并且继续培养过夜。在转染之后大约24小时制备细胞提取物，此时有超过70％的细胞单层表现出细胞融合。基本上按以前披露的方法进行CAT测定(35)。在某些实验中(图3)，用荧光底物取代C14-标记氯霉素底物(20，62)，并且按照底物生产商的方法对测定方法进行改进(Fast CAT Yellow或Fast CAT Green；Molecular Probes)。在FlourImager(Molecular Dynamics)上分析荧光CAT测定的产物，并且用ImageQunt软件(Molecular Dynamics)进行定量。
另外用N、P和L表达质粒对RNA微型基因组进行共转染。该转染基本是按上述方法进行的，所不同的是，将RNA与合适的质粒DNA(1微克pCDV-N和pCDV-P，2纳克pCDV-L)、100微升无血清OptiMEM和20微升Lipofectace(Life Technologies)混合。在转染之前1小时，用MVA/T7以每个细胞5个pfu的感染复数感染293细胞单层，以便提供用于转录表达质粒的T7RNA聚合酶。
对上述转染方法进行改进，以便用于DNA微型复制子转染，并且按照类似于Whitehead等所披露的方法(59)。在这些实验中，我们将293细胞换成HEp2或A594细胞，因为我们发现这些细胞明显更能抗MVA/T7感染。用于转染的细胞通常为大约70-90％的铺满度。在添加15微升Lipofectace(Life Technologies)之前，通过在200微升无血清OptiMEM中混合微型复制子DNA(10纳克pCDV-CAT)和表达质粒(400纳克pCDV-N、300纳克pCDV-P、50-100纳克pCDV-L)制备转染混合物。在室温下将该混合物培养20-30分钟。制备足够量的独立的MVA/T7混合物，以便提供0.8微升含有足够MVA/T7无血清OptiMEM，以每个细胞大约2-5pfu的感染复数感染6孔平板的每一个孔。在开始转染之前，除去单层中的培养基，并将转染混合物添加到800微升MVA/T7混合物中，将合并后的1微升混合物添加到细胞中。在培养一夜之后，用补充了10％FBS的DMEM取代所述转染培养基，并且再培养一天。在开始转染之后大约48小时，按上述方法收获细胞，并制备提取物用于CAT活性分析。正如在图例中所标明的，大体上按下文所述的磷酸钙转染方法进行某些微型复制子实验(图3B)，进行病毒挽救。
用于病毒挽救的细胞转染主要是通过磷酸钙方法进行的。我们还采用了上述Lipofectace方法，但是发现，与一个热激步骤组合的磷酸钙方法(35)更为有效。在转染之前，在6孔平板中的A549细胞或HEp2单层的铺满度为75-90％。在转染之前1-2小时，用4.5毫升含有10％FBS的DMEM饲养所述细胞，并且转移到设定为3％二氧化碳的培养箱中。正常情况下，该培养箱的温度也被设定为32℃而不是37℃，因为微型复制子实验表明，这种较低的温度有可能获得较高水平的挽救(图3A)。通过首先在5毫升的聚丙烯试管中混合完整长度的CDV质粒(5微克)和400纳克pCDV-N、300纳克pCDV-P和100纳克pCDV-L，并用水将最终体积调整到225微升制备磷酸钙-DNA沉淀物。然后将25微升的2.5M氯化钙添加到所述DNA溶液中。最后，将250微升的2×BES缓冲的盐溶液(50mM BES[pH6.95-6.98]，1.5mM磷酸氢二钠，280mM氯化钠)滴加到所述试管中，同时轻轻涡搅拌该混合物。在室温下让沉淀物形成20-30分钟。然后将所述沉淀物滴加到培养基中，接着添加足够量的MVA/T7，以便提供1-3的MOI。在将所述细胞送回到设定为3％二氧化碳的培养箱中之前，轻轻摇晃所述平板，以便确保培养基、磷酸钙-DNA沉淀物和MVA/T7均匀混合。在开始转染3小时之后，将所述6孔平板密封在拉链封口的塑料袋中，并且在设定为43-44℃的水浴中浸泡2小时。在热激之后，将细胞送回到设定为3％二氧化碳的32℃的培养箱中。次日，除去转染培养基，并且用hepes-缓冲的盐溶液(10mMhepes[pH7.0]，150mM氯化钠，1mM氯化镁)洗涤细胞，并且用2-3毫升补充了10％FBS的DMEM饲养。在32℃下将所述细胞再培养24-48小时。在转染开始之后48-72小时，将所述细胞刮入所述培养基中，并且转移到装有Vero细胞的70-80％铺满单层和10毫升培养基的10厘米的平板上，以便开始培养(35)。在开始培养之后3-5小时，用10毫升含有10％FBS的DMEM取代所述培养基。在4-6天之后，出现了噬斑。通过将细胞刮入所述培养基并且在-80℃下冷冻回收挽救的病毒用于随后的分析。
例3
CDV微型复制子表达。对于开发病毒挽救系统来说，用微型复制子报导系统进行瞬时表达研究是重要的，通过微型复制子报导基因分析瞬时表达，可以比较迅速地评估转染参数，以便确定最佳条件，并且它还是用于确定N、P和L表达载体是否能指导合成有功能的蛋白的有价值的工具。
3.1通过病毒挽救CDV微型复制子
3.1.1该微型复制子实验检验了CDV-CAT微型复制子是否能发挥其通过病毒补偿挽救的能力。将体外合成的CDV-CAT微型复制子RNA(20微克)转移到293细胞的60毫米的培养皿中，在转染开始时，同样用相近的CDV以大约2的感染复数感染所述细胞。在转染之后大约24小时，当大约70％的细胞已经整合成合胞体时，制备细胞提取物，并且分析CAT活性(图2A)。在图2A中示出了表示CAT测定结果的放射性自显影图。在用微型复制子RNA转染的CDV感染的细胞中很容易检测到CAT活性，这表明该微型复制子是有功能的(图2A，泳道2)。用RNA转染但没有用CDV感染的对照细胞不能产生可检测的CAT活性(图2A，泳道1)，这表明CAT活性明显是由于所述微型复制子的复制和表达所导致的。
3.1.2在确定了当提供由互补的病毒表达的反式作用蛋白时CDV微型复制子RNA是有功能的之后，我们随后检验了N、P和L蛋白表达载体提供补偿作用的能力(图1A)，用微型复制子RNA(20微克)和pCDV-N(1微克)、pCDV-P(1微克)和pCDV-L(用量如图2B所示)进行共转染。在转染之前1小时，用MVA-T7以5的感染复数感染用于本实验中的293细胞，以便提供由所述质粒载体表达N、P和L蛋白所必需的T7RNA聚合酶。分析来自转染细胞提取物的CAT活性表明，所述表达质粒能有效提供补充作用(图2B)。在使用50和100纳克的pCDV-L表达质粒时就能检测到指示微型复制子复制和表达的CAT活性(图2B)，并且在100纳克的用量下活性最大。超过100纳克的L表达质粒具有抑制作用(图2B，泳道5)。正如所预料的，在仅接受微型复制子RNA(图2B，泳道1)或不接受L蛋白表达载体(图2B，泳道2)的负对照转染中，检测到很少CAT活性或没有该活性。
3.1.3CDV微型复制子DNA的挽救
用于最终的微型复制子实验中的条件更接近于用于挽救完整长度病毒的条件，因为是将微型复制子质粒DNA而不是RNA与N、P和L的表达载体一起转染到细胞中。因此，复制子RNA的合成取决于T7RNA聚合酶的细胞内转录。图3A中的结果表明，在微型复制子DNA转染之后可以获得微型复制子活性。另外，为了验证微型复制子的活性可能具有某种温度敏感性的可能性，我们在不同温度下培养转染的细胞(图3A)。在6孔平板中转染A549细胞，并且在32℃或37℃下培养。使用脂质体转染试剂将质粒微型复制子pCDV-CAT(50纳克)与表达质粒(400纳克pCDV-N、300纳克pCDV-P，50-100纳克pCDV-L)共转染到A549细胞中。类似地，用麻疹病毒微型复制子(100纳克pMV107-CAT)和麻疹病毒蛋白表达载体(400纳克pMV-N、300纳克pMV-P，100纳克pMV-L)进行共转染。在转染的同时，用MVA/T7以大约2的感染复数感染所述细胞。在转染之后大约48小时制备细胞提取物，并且分析CAT活性。在该附图所示实验中，CAT测定是用荧光氯霉素底物进行的，并通过荧光图象仪对反应产物进行定量。图3A中所示的相对CAT活性是相对在泳道8中给出的值表达的。
图3所示结果清楚地表明CDV-CAT微型复制子活性水平(参见图3A，泳道2和3)显著高于省略了pCDV-L DNA的负对照转染的水平(参见图3A，泳道1)。在缺少pCDV-L载体的情况下出现了弱的但是可检测的背景信号，这可能是由于CDV前导序列中隐蔽的痘苗病毒启动子或细胞RNA聚合酶II启动子所造成的。除了存在MV前导序列和尾随序列之外的相同的微型复制子载体在使用明显更大量的MV微型复制子时产生几乎无法检测的背景(参见图3A，泳道5)(35，41)。上述结果还表明，在32℃下而不是在37℃下培养，通常能产生高出2-3倍水平的CDV-CAT活性。因此，将32℃的温度用于病毒挽救。
另外，上述实验(图3)是用A549或HEp2细胞进行的(在图3中是A549；HEp2，资料未发表)，因为我们发现这些细胞似乎比293细胞更能耐受MVA/T7感染(图2B)。对上述某些实验来说，还用脂质体转染方法(图3A)取代了磷酸钙方法(图3B)。还检验了其他变数，并且在下文中披露。
对CDV微型复制子进行的热激
使用在方法部分所披露的磷酸钙方法，用pCDV-CAT微型复制子(10纳克)和N(400纳克)、P(300纳克)和L(50-100纳克)的表达载体对6孔平板上的A549细胞进行共转染。在开始转染之后3小时，将所述细胞转移到43℃下培养2小时，然后再送回到32℃下培养一夜。在图3B中示出了热激对CDV微型复制子表达的影响。热激处理能将CDV-CAT活性提高大约4-16倍，这表明该处理可能对挽救CDV有利。
例4
4.1rCDV的挽救
将上述产生了最高微型复制子活性水平的转染和培养条件应用于挽救CDV，即通过磷酸钙方法(方法部分)用完整长度的cDNA质粒和pCDV-N、pCDV-P和pCDV-L表达载体转染A549或Hep2细胞。在开始转染之后3小时，在43-44℃下对所述细胞进行2小时的热激，然后送回到32℃的培养箱中。次日，更换培养基，并将转染的细胞再培养1天。为了鉴定能产生病毒并扩增少量rCDV的转染的细胞培养物，用新的Vero细胞单层培养转染过的细胞(方法部分；参考文献35)。在32℃下培养4-6天之后出现了合胞体(参见图4A)。
在大多数实验中，我们的挽救条件在转染的6孔平板中产生了4-6个rCDV阳性孔，这些阳性孔在用Vero细胞培养后可以检测到。我们还使用磷酸钙或脂质体转染试剂对挽救效率进行了有限的比较。在方法部分所披露的磷酸钙方法所导致的CDV阳性感染通常比脂质体试剂导致的阳性感染高大约2倍(资料未发表)。
4.2挽救病毒的特征分析
将来自用两种rCDV分离物(rCDV1和rCDV2)或从Martin Billeter获得的Onderstepoort菌株(Ond)感染过的细胞中获得的RNA用于扩增来自P基因的DNA片段。来自重组菌株的RT/PCR扩增的片段含有一个BstBI的限制酶消化位点“标记”。非重组(Ond)菌株缺乏该位点。对来自若干种实验的CDV分离物进行特征分析，以便证实挽救了重组的病毒。重组CDV应当包括在cDNA克隆期间引入的核苷酸改变(序列“标记”)，该改变没有修复。例如，在P基因具有两个位置很近的碱基改变(2295和2298号核苷酸)，它在氨基酸密码子专一性方面是沉默的，但产生了BstBI限制酶消化位点。在实验室中使用的两种CDV菌株上缺乏重组cDNA上的这种BstBI标记(我们的实验室改良的Onderstepoort菌株和由苏黎士大学的Martin Billeter提供的实验室改良的Onderstepoort菌株)，这两种菌株有可能成为污染病毒源。例如，通过RT/PCR由感染的细胞扩增了P基因的一部分(从1978-2804号位置)，然后用BstBI进行消化。结果清楚地表明，重组病毒含有BstBI标记，而非重组菌株没有(参见图4B，比较泳道2，3，6和泳道8，9，10)。通过BstBI裂解来自重组病毒的PCR产物，产生了比抗消化的DNA移动更快的双链体(参见图4B)。还通过对PCR扩增的DNA片段进行直接测序验证了上述结果。对11种其他序列标记进行类似分析，并且结果明确表明，CDV的重组菌株是通过挽救产生的。通过两个负对照可以排除序列标记的分析是由转染的细胞细胞携带的污染的基因组cDNA引起的可能性。用源于接受了除了pCDV-L表达载体之外的所有质粒DNA的负对照转染的细胞制备的RNA不能产生可检测数量的PC R产物(参见图4B，泳道1)。另外，如果省略逆转录步骤的话，就不会出现逆转录PCR产物(参见图4B，泳道3，5，7)。
例5
用上述挽救方法由挽救的CDV表达异源基因
a)荧光素酶基因的表达
为了进一步评估CDV作为潜在载体的可能性，对CDV基因组cDNA进行修饰，以便接收外源基因。首先，向3330和3373号位置之间的部分引入9个核苷酸取代(图5A、5B)。由此在P和M基因之间的基因间区(P/M基因间区)引入了3个限制酶位点(AatII、FseI和MluI)。这些位点在基因组cDNA克隆在pBS-rCDV+中是独特的(图5B)。挽救了含有这些碱基取代的病毒(rCDV+)，这表明所述修饰对病毒的生活力没有明显影响(资料未发表)。然后利用FseI和MluI位点插入荧光素酶报导基因。诸如B对原始rCDV质粒载体(pBS-rCDV)进行的核苷酸取代，以便制备质粒pBS-rCDV+。对荧光素酶基因进行修饰，并插入质粒prCDV-mcs(图5B)。制备用于克隆的荧光素酶基因，首先进行PCR，以便扩增编码序列，在扩增时使用质粒pGL2-对照(Promega of Madison，WS)作模板。PCR引物(参见下面的PCR引物表，引物1和2)包括末端限制酶裂解位点，以便能将扩增的报导基因插在prCDV-mcs的FseI和MluI位点之间(图5B)。5’PCR引物(引物1)还包括等同于CDV/P/M基因间转录控制序列的合成拷贝的额外序列。用所述引物对荧光素酶编码序列进行的PCR扩增产生了一种包括P/M基因间转录控制序列和与5’末端融合的FseI位点和与3’末端融合的MluI位点的荧光素酶基因。将扩增的序列克隆到pBS-rCDV-mcs上，随后进行的DNA序列分析证实荧光素酶基因精确地克隆了荧光素酶基因，从而产生了pBS-rCDV-P/Luc/M(图5C)。
在将含有荧光素酶基因的cDNA用于挽救实验之后，检测病毒噬斑(参见图4A，rCDV-P/Luc/M)。通过对跨越连接CDV序列和荧光素酶基因之间的结合部分的RT/PCR扩增的片段进行测序，鉴定回收病毒(rCDV-P/Luc/M)的分离物，由此发现所述基因正如所预料的被插入重组病毒中(资料未发表)。
用由5种不同的rCDV-P/Luc/M病毒的分离物(编号1-5)感染的细胞制备的提取物进行荧光素酶测定。用不同的rCDV菌株感染装有Vero细胞的6孔平板的每一个孔，并且在感染之后大约48小时当75％或更多的单层表现出细胞融合时制备细胞提取物。将提取物稀释104倍，并对其中的50微升进行分析，以便产生在下面的荧光素酶表中所示出的结果。在不进行稀释的情况下对负对照样品进行分析。所述对照样品包括一种模拟感染和用rCDV和rCDV-mcs病毒进行的感染。在挽救rCDV-P/Luc/M病毒时，同时用缺乏L表达质粒(无pCDV-L)进行负对照转染。将来自该平行模拟挽救的细胞裂解物用于进行模拟感染，这种感染同样只能产生背景水平的荧光素酶活性。正如在下面的荧光素酶表中所示出的，在从独立感染中回收的用rCDV-P/Luc/M的不同分离物感染的细胞中观察到了较高水平的荧光素酶活性(参见表，编号1-5)。负对照产生非常低的背景水平荧光素酶(rCDV，rCDV+，无L质粒)。
荧光素酶表
样品 感染 荧光素酶活性(相对光单位)
1 Mock 0
2 无pCDV-L 85
3 RCDV-P/Luc/M-1 160,909
4 RCDV-P/Luc/M-2 183,096
5 RCDV-P/Luc/M-3 170,532
6 RCDV-P/Luc/M-4 132,221
7 RCDV-P/Luc/M-5 287,520
8 RCDV-mcs 0
9 RCDV 0
b)犬细小病毒(CPV)VP2基因的表达
制备含有CPV VP2基因的CPV基因组质粒(参见图5D和下面的流程图)。用于克隆VP2基因的CPV基因组DNA是通过用蛋白酶K消化和有机提取方法用CPV疫苗菌株FD99制备的(该菌株是从Fort Dodge实验室的犬疫苗DURAMUNEMAX中分离的CPV菌株，Ft.Dodge，Iowa)。用5’引物(引物4)通过PCR扩增VP2编码序列，该引物含有与VP2编码序列的5’末端同源的序列，此外还含有与CDV P/V基因间转录控制序列(引物3)等同的序列。5’和3’引物(引物3和4)还含有如上文所述的用于将扩增的VP2编码序列插入质粒prCDV-mcs的末端限制位点。在克隆扩增的VP2 DNA之前，将该DNA的一部分直接用于DNA序列分析。由此提供了有关VP2基因的DNA序列，该序列不含在随后的克隆步骤中引入的任何潜在的核苷酸改变。然后，将VP2 PCR产物的其余部分用于将所述基因克隆到标准克隆载体(pBSK(+))上。然后使用染料终止子循环测序(购自应用生物系统的循环测序试剂，FosterCity，CA)和自动测序仪(应用生物系统377，Foster City，CA)，通过DNA测序测定克隆的VP2基因和连接的CDV P/M基因间转录控制序列的核苷酸序列(有关核苷酸序列参见图9，SEQ ID NO：39，有关氨基酸序列参见图10，SEQ ID NO：40)，然后将其转入CDV基因组DNA克隆(prCDV-mcs)上的P和M基因之间，以便制备质粒pBS-rCDV-VP2(图8E)。用质粒pBS-rCDV-VP2从独立转染中挽救若干种病毒分离物。用引物7和8(见下文)通过逆转录和PCR扩增(RT/PCR)分析病毒基因组RNA，发现上述菌株不含有VP2基因。
为了证实rCDV-VP2病毒能表达VP2蛋白，人们可以使用一种能够通过传统方法制备的多克隆抗体。通过Western印迹(2)根据对VP2的反应性测定VP2表达。简单地讲，通过在Laemmli缓冲液(Bio-Rad实验室，Hercules，CA)中煮沸，裂解被用作正对照的用CPV感染的狗肾细胞。在12％的聚丙烯酰胺凝胶上对粗制细胞提取物中的蛋白进行电泳，然后将蛋白电泳转移到硝酸纤维素膜上。用封闭缓冲液(磷酸缓冲的盐溶液+5％干奶粉(Bio-Rad实验室，Hercules，CA))处理所述膜，然后与用封闭缓冲液稀释的含有抗CPV抗体的狗血清起反应。用过氧化物酶标记过的抗狗二级抗体(Sigma，St.Louis，MO)和化学发光底物(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate，Pierce，Rockford，IL)检测抗原-抗体结合。Western印迹分析发现所述狗抗血清能与来自用CPV感染的细胞的65kDa的蛋白专一性反应；这种65kDa多肽的相对迁移率与预期的VP2大小吻合。可以用该方法证实同一种多肽在用rCDV-VP2菌株感染的细胞中的存在。
c)乙型肝炎病毒表面抗原基因HBsAg的表达
用质粒prcDV-HBsAg挽救含有来自乙型肝炎病毒(HBV)的表面抗原基因的rCDV分离物(图8E)。通过将HBsAg编码序列插在prCDV-mcs的FseI和MluI位点之间制备质粒pBS-rCDV-HBsAg，如在上面的例子(a)和(b)中所述。使用引物5和6(见下文)，通过PCR由克隆的HBV基因组(菌株ayw；GenBank保藏号V01460；(75))扩增HBsAg基因。
使用质粒pBS-rCDV-HBsAg分离若干种独立挽救的含有HBsAg基因的CDV的重组菌株。通过用基因专一性引物(引物7和8)进行引物RT-PCR分析来自rCDV-HBsAg分离物的病毒基因组RNA(rCDV-HBsAg1，2和3)，以便证实该重组分离物含有HBsAg基因。在证实所述重组病毒含有HBsAg基因之后，进行Western印迹分析，以确保HBsAg基因被表达。如图8所示，Western印迹分析发现了24和27kDa的蛋白。27kDa形式的HBsAg菌株是该蛋白的糖基化形式(76)。用缺乏HBV基因的重组CDV感染的细胞提取物不能与所述抗体起反应(FitgeraldIndustries International Inc.，Concord，MA)。作为对照，剥离所述印迹，并且用抗CDV N蛋白抗体(VMRD，Inc.，Pullman，WA)检测，证实所有提取物都是由用CDV感染的细胞制备的。
PCR引物表
1.荧光素酶5’末端
5’-TACTGGCCGGCC ATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGCC TAAGTCCGCTGCCACCATGGAAGACGCCAAAAACAT-3’(SEQ ID NO.31)
在CDV基因-末端/基因起始信号下面划线，FseI位点用斜体表示。在荧光素酶ATG起始密码子(粗体)之前添加Kozak(77)翻译控制共有序列(GCCACC)。2.荧光素酶3’末端
5’-TTTTACGCGTTTACAATTTGGACTTTCCGC-3’(SEQ ID NO 32)MluI位点用斜体表示。3.CPV VP2 5’末端
TACTGGCCGGCC ATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGCCTAA GTCCGCTGCCACCATGAGTGATGGAGCAGTTCAAC(SEQ ID NO.33)参见引物1的说明。4.CPV VP23’末端TTTTACGCGTTTAATATAATTTTCTAGGTGC(SEQ ID NO.34)MluI位点用斜体表示。5.HbsAg 5’末端
TACTGGCCGGCC ATTATAAAAAACTTAGGACAAAGAGCCTAA GTCCGCTGCCACCATGGAGAACATCACATCAGGAT(SEQ ID NO 35)参见引物1的说明。6.HbsAg 3’末端
TTTTACGCGTTTATCAGCTGGCATAGTCAGGCACGTCATAAGGATAGCTAATGTATACCCAAAGACA(SEQ ID NO.36)MluI位点用斜体表示。
7.FseI位点5’
ATAACATGCTGGCTCTGCTC(SEQ ID NO.37)
用于PCR分析插入重组CDV菌株基因组中的基因的5’引物。对所述外源基因5’末端旁侧的CDV序列有专一性。
8.MluI位点的3’末端
GCTAGTCAGGAGAACCATGT(SEQ ID NO.38)
用于PCR分析插入重组CDV菌株基因组中的基因的3’引物。对所述外源基因3’末端旁侧的CDV序列有专一性。
开发含有CPV VP2基因的CDV表达载体的流程图·通过蛋白酶K消化和苯酚氯仿提取从疫苗病毒制剂中纯化CPV基因
                     组DNA
                      ↓
             ·PCR扩增VP2编码序列。(5’PCR引物含有对CDV P/M基因间转录控制序列专一的结合序列，5’
       和3’引物都含有用于克隆的末端限制位点)
                      ↓
·用扩增的DNA作模板测定确切的CPV VP2序列(图9)
                      ↓
       将VP2基因克隆到质粒载体pBSK(+)上
                      ↓·对克隆的VP2基因进行测序，以便确定该序列是否与以前确定的序列
                       吻合
                        ↓·将克隆的VP2基因转入CDV基因组克隆(将VP2基因插在CDVP和
                     M基因之间
                        ↓·挽救重组病毒并分析基因组结构。对出现在重组病毒菌株中的所述基
                     因进行测序
                        ↓·通过用狗多克隆抗血清进行免疫吸印检查感染细胞的提取物，验证VP2
                        表达。
下面提供了被收作本文的参考文献清单。
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   C.L.帕克斯(Parks，Christopher)
   M.S.西胡(Sidhu，Mohinderjit)
   P.瓦尔皮塔(Walpita，Tramila)
   G.R.科瓦克斯(Kovacs，Gerald)
   S.A.乌德姆(Udem，Stephen)<120>  从cDNA中挽救犬热病病毒<130>  AM100308PCT<140>  PCT/US 01/20157<141>  2001-06-22<150>  US 60/213,698<151>  2000-06-23<160>  38<170>  PatentIn version 3.0<210>  1<211>  15690<212>  DNA<213>  犬热病病毒<400>  1accagacaaa gttggctaag gatagttaaa ttattgaata ttttattaaa aacttagggt    60caatgatcct accttaaaga acaaggctag ggttcagacc taccaatatg gctagccttc    120ttaaaagcct cacactgttc aagaggactc gggaccaacc ccctcttgcc tctggctccg    180ggggagcaat aagaggaata aagcatgtca ttatagtcct aatcccgggt gattcaagca    240ttgttacaag atctcgacta ttggatagac ttgttaggtt ggttggtgat ccaaaaatca    300acggccctaa attaactggg atcttaatca gtatcctctc cttgtttgtg gaatcccctg    360gacagttgat ccagaggatc atagacgacc ctgatgtaag catcaagtta gtagaggtaa    420taccaagcat caactctgct tgcggtctta catttgcatc cagaggagca agtctggatt    480ctgaggcaga tgagttcttc aaaattgtag acgaagggtc gaaagctcaa gggcaattag   540gctggttaga gaataaggat atagtagaca tagaagttga taatgctgag caattcaata   600tattgctagc ttccatcttg gctcaaattt ggatcctgct agctaaagcg gtgactgctc   660ctgatactgc agccgactcg gagatgagaa ggtggattaa gtatacccag caaagacgtg   720tggtcggaga atttagaatg aacaaaatct ggcttgatat tgttagaaac aggattgctg   780aggacctatc tttgaggcga ttcatggtgg cgctcatctt ggacatcaaa cgatccccag   840ggaacaagcc tagaattgct gaaatgattt gtgatataga taactacatt gtggaagctg   900ggttagctag tttcatccta actatcaagt ttggcattga aactatgtat ccggctcttg   960ggttgcatga gttttccgga gaattaacaa ctattgaatc cctcatgatg ctatatcaac   1020agatgggtga aacagcaccg tacatggtta tcttggaaaa ctctgttcaa aacaaattta   1080gtgcagggtc ctacccattg ctctggagtt atgctatggg ggttggtgtt gaacttgaaa   1140actccatggg agggttaaat ttcggtcgat cttactttga cccagcttac ttcagactcg   1200ggcaagaaat ggttaggaga tctgccggca aagtaagctc tgcacttgcc gccgagcttg   1260gcatcaccaa ggaggaagct cagctagtgt cagaaatagc atccaagaca acagaggacc   1320ggacaattcg agctactggt cctaagcaat cccaaatcac ttttctgcac tcggaaagat   1380ccgaagtcgc caatcaacaa cccccaacca tcaacaagag gtccgaaaac cagggaggag   1440acaaataccc cattcacttc agtgacgaaa ggcttccagg gtatacccca gatgtcaaca   1500gttctgaatg gagtgagtca cgctatgaca cccaaattat ccaagatgat ggaaatgacg   1560atgatcggaa atcgatggaa gcaatcgcca agatgaggat gcttactaag atgctcagtc   1620aacctgggac cagtgaagat aattctcctg tttatagtga taaagagcta ctcaattaaa   1680tattcaagac cagtcttgca tcagtcaaca attatcattc taaactcatt ataaaaaact   1740taggacccag gtccaacaaa cccgatcaat cattcatccg accacccgtt ctatccctaa   1800atggcagagg aacaggccta ccatgtcagc aaagggctgg aatgcctcaa agccctcaga   1860gagaatcctc ctgacattga ggagattcaa gaggtcagca gcctcagaga ccaaacctgc   1920aacccaggcc aagagaatgg aaccacaggc atgcaggaag aggaggactc tcagaatctc   1980gatgaatcac acgagccaac aaaaggatca aactatgtcg gccatgtacc tcaaaataat   2040ccgggatgtg gagaacgcaa tactgcgctt gtggaggcgg agcggccccc tagagaggac   2100atccaaccag gacctggaat acgatgtgat catgtttatg atcacagcgg tgaagaggtt   2160aagggaatcg aagatgctga cagtctcgtg gtacctgcag gcactgtcgg taatcgagga   2220ttcgagagag gagaaggaag ccttgatgat agcactgagg attctggcga agattattcc   2280gaaggaaatg cttcatctaa ctggggatat tctttcggcc ttaaaccgga cagagcagct   2340gatgtgagca tgctgatgga agaggaatta agtgctctac tcaggacaag cagaaatgta   2400gggattcaga aaagggatgg gaagactctg cagttcccac ataatcccga aggtaagaca   2460agggatccgg agtgtggatc cattaaaaag ggcacagaag agaggtcagt ctcacatgga   2520atggggatag ttgctggatc gacaagtggt gcaacccaat ctgcactcaa gtcaactggg   2580ggatcatcag agccaagtgt ttctgcgggg aatgtccgcc aacctgcaat gaatgcaaag   2640atgacccaga aatgcaaact cgagtctggc acgcaactcc ctcccaggac ctcaaatgag   2700gctgagtctg acagtgagta cgatgatgag cttttctctg agatacaaga aattcgatct   2760gccattacta aactaactga agataatcaa gcaatactta ctaaactgga taccttatta   2820ctgcttaaag gagagactga ttcaattaag aaacaaatca gcaaacaaaa tattgctatt   2880tccacgattg aggggcatct atcaagcatt atgatagcta tacctggttt tggaaaggac   2940acgggagatc ctacggcaaa tgtcgacatt aacccagagc tccgccctat catagggaga   3000gattcaggaa gagcactagc agaagttctc aagcagcccg catcatcccg cggtaatcgg   3060aaggacagtg gtattactct gggctcaaaa ggtcaactat tgagagacct ccagctgaaa   3120cccattgaca aagagtctag ctcggcaatc ggatacaaac cgaaggatac cgcaccttcc   3180aaagctgtac ttgcatcatt gattagatca agcagagttg atcaaagtca caaacataac   3240atgctggctc tgctcaaaaa tatcaagggg gatgacaacc taaacgagtt ctaccaaatg   3300gtcaaaagta ttactcatgc ttaatctgta gcgttgacta atctactaac cggcgcaaaa   3360ctgctttcac tatcgcttaa aagcaattat aaaaaactta ggacacaaga gcctaagtcc   3420gctcctaaaa aatgactgag gtgtacgact tcgatcagtc ctcttggtac accaaaggct   3480cattggcccc tattttgcct accacttatc ccgatggtag gctcataccc caagtcagag   3540taatagatcc aggactcggc gatcggaaag atgaatgctt catgtatatt ttcttaatgg   3600gtataataga agacaatgat ggcctcggac ctccaattgg aagaacattt ggatcgctgc   3660ctttaggagt tgggcgtact acagccagac ctgaggagtt attgaaagaa gccaccctgt   3720tggatattat ggtaaggcga actgcaggtg tcaaggaaca actggtattt tataataaca   3780ccccattgca catcttaact ccgtggaaaa aggtccttac gagtggaagt gtgttcagtg   3840caaatcaagt ctgtaacaca gtcaatctaa taccattaga catagcacaa agattcaggg   3900tggtatatat gagcatcact cgactatcag acgatggaag ttacagaatt ccccgcggga   3960tgtttgaatt ccgctccagg aatgctttag 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        20                  25                  30Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln
    35                  40                  45Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn
50                  55                  60Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg65                  70                  75                  80Arg Val Val Val Asn Asn Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met
            85                  90                  95Ala Leu Asp Asp Thr His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val
        100                 105                 110Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu
    115                 120                 125Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu
130                 135                 140Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro145                 150                 155                 160Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala
            165                 170                 175Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser
        180                 185                 190Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp
    195                 200                 205Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly
210                 215                 220Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp225                 230                 235                 240Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg
            245                 250             255Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro
        260                 265                 270Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro
    275                 280                 285Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly
290                 295                 300Tyr Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly ValThr Gln Met Gly305                 310                 315                320Lys Thr Asn Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val
            325                 330                 335Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro
        340                 345                 350Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu
    355                 360                 365Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His
370                 375                 380Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr385                 390                 395                 400Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln
            405                 410                 415Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Asp Asp Asn Val Leu Leu Pro
        420                 425                 430Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe
    435                 440             445Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro ValTyr
450                 455                 460Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro465                 470                 475                 480Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly
            485                 490                 495Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro
        500                 505                 510Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp
    515                 520                 525Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr
530                 535                 540Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn545                 550                 555                 560Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Glu Ile Val Tyr Glu Arg Ser
            565                 570                 575Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr
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Claims (48)

1.一种用于生产重组犬热病病毒的方法，包括：
在培养基中，在至少一个宿主细胞中实施挽救组合物的转染或转化，该组合物包括(i)一种转录载体，该载体包括一种分离的核酸分子，该核酸分子包括编码犬热病病毒的基因组或反基因组的多核苷酸序列，和(ii)至少一种表达载体，它包括编码衣壳化、转录和复制所必需的反式作用蛋白(N、P和L)的多核苷酸序列的一种或多种分离的核酸分子，所述转染是在足以实现所述载体共表达和产生重组病毒的条件下进行的。
2.如权利要求1的方法，还包括回收所述重组病毒。
3.如权利要求1的方法，其中所述编码犬热病病毒的基因组或反基因组的分离核酸分子是一个以上基因组或反基因组源的嵌合体。
4.如权利要求1的方法，其中所述编码犬热病病毒的基因组或反基因组的分离核酸分子包括SEQ ID NO：1、2或3的多核苷酸序列。
5.如权利要求1的方法，其中所述编码犬热病病毒的基因组或反基因组的分离核酸分子编码减毒的病毒或传染形式的病毒。
6.如权利要求1的方法，其中所述编码犬热病病毒的基因组或反基因组的分离核酸分子编码传染形式的病毒。
7.如权利要求1的方法，其中所述编码犬热病病毒的基因组或反基因组的分离核酸分子编码减毒的病毒。
8.如权利要求1的方法，其中所述编码犬热病病毒的基因组或反基因组的分离核酸分子编码传染形式的减毒病毒。
9.如权利要求1的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。
10.如权利要求1的方法，其中所述宿主细胞是脊椎动物细胞。
11.如权利要求1的方法，其中所述宿主细胞是禽细胞。
12.如权利要求1的方法，其中所述宿主细胞源于人细胞。
13.如权利要求9的方法，其中所述宿主细胞源于人胚胎细胞。
14.如权利要求12的方法，其中所述宿主细胞源于人胚胎肾细胞、人肺癌、和人宫颈癌或动物肾细胞。
15.用权利要求1的方法制备的重组犬热病病毒。
16.一种组合物，包括(i)用权利要求1的方法制备的重组犬热病病毒和(ii)可以药用的载体。
17.如权利要求1的方法，其中所述转录载体还包括T7 RNA聚合酶基因。
18.一种免疫原性组合物，包括一种分离的重组生产的犬热病病毒和可以药用的载体。
19.一种对动物或人进行免疫，以便诱导对犬热病病毒的保护作用的方法，包括给所述动物或人服用权利要求18的免疫原性组合物。
20.一种核酸分子，包括编码犬热病病毒的基因组或反基因组的多核苷酸序列。
21.如权利要求20的核酸分子，包括SEQ ID NO：1的正链反基因组信使犬热病病毒序列。
22.一种核酸分子，包括编码犬热病病毒的一种或多种蛋白的多核苷酸序列。
23.如权利要求20、21或22的核酸分子，其中多核苷酸序列还包括一种或多种异源核苷酸序列或一种或多种异源基因。
24.一种质粒，包括编码犬热病病毒的基因组或反基因组的多核苷酸序列。
25.一种质粒，包括编码犬热病病毒的一种或多种蛋白的多核苷酸序列。
26.如权利要求24的质粒，其中所述多核苷酸序列还包括一种或多种异源核苷酸序列或一种或多种异源基因。
27.如权利要求25的质粒，其中所述多核苷酸序列还包括一种或多种异源核苷酸序列或一种或多种异源基因。
28.一种用权利要求24-27的至少一种质粒转化过的宿主细胞。
29.一种组合物，包括分离的重组生产的犬热病病毒和可以药用的载体；其中所述犬热病病毒能表达至少一种异源多核苷酸。
30.如权利要求18的免疫原性组合物，其中所述犬热病病毒能表达至少一种编码一种抗原的异源多核苷酸。
31.如权利要求18的免疫原性组合物，还包括针对除了犬热病病毒之外的病原体的至少一种抗原。
32.如权利要求31的免疫原性组合物，其中至少一种抗原是减毒的RNA病毒。
33.如权利要求18的免疫原性组合物，还包括针对能感染犬的病原体的至少一种抗原。
34.如权利要求31的免疫原性组合物，其中至少一种抗原是针对选自下列一组的一种或多种病毒的抗原：狂犬病病毒、犬细小病毒、犬细小病毒2、犬冠状病毒、犬腺病毒1型、犬腺病毒2型、和犬副流感病毒。
35.如权利要求18的免疫原性组合物，还包括针对能感染人的病原体的至少一种抗原。
36.如权利要求31的免疫原性组合物，其中除了犬病毒之外的病原体的至少一种抗原是由重组生产的犬热病病毒表达的。
37.如权利要求31的免疫原性组合物，其中至少一种抗原是一种或多种犬细小病毒的抗原。
38.一种核苷酸序列，包括重组犬热病病毒的cDNA克隆的序列。
39.如权利要求26的质粒，其中所述异源核苷酸序列是作为单一的转录单位插入犬热病病毒基因组序列内。
40.如权利要求26的质粒，其中所述异源核苷酸序列是作为一个或多个单顺反子转录单位插入犬热病病毒基因组序列内。
41.如权利要求26的质粒，其中所述异源核苷酸序列是作为至少一个可能包括一个或多个核糖体进入位点的多顺反子转录单位插入犬热病病毒基因组内。
42.一种组合物，包括用权利要求28的宿主细胞生产的分离的重组生产的犬热病病毒，和可以药用的载体。
43.一种核苷酸序列，包括图6(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ ID NO：3)的重组犬热病病毒cDNA克隆的多核苷酸序列。
44.如权利要求19的方法，其中所述动物选自犬、猫、牛、猪和马。
45.一种对动物或人进行免疫，以便诱导对犬热病病毒的保护作用的方法，包括给所述动物或人服用权利要求18，30-37的免疫原性组合物。
46.如权利要求1的方法，其中所述编码犬热病病毒的基因组或反基因组的多核苷酸序列或其变体多核苷酸序列，包括犬热病病毒野生型核苷酸的至少一个突变，以便该突变相当于单负病毒纲(OrderMononegavirales)的其他非节段化的、负的单链RNA病毒的编码或非编码区上的已知减毒突变。
47.如权利要求1的方法，其中所述编码犬热病病毒的基因组或反基因组的多核苷酸序列或其变体多核苷酸序列，包括使重组生产的病毒复制失效的至少一个突变。
48.如权利要求46的方法，其中所述RNA病毒选自PIV、RSV、腮腺炎和麻疹。
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