CN100335131C - 重组火鸡疱疹病毒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组火鸡疱疹病毒，其通过存在在启动子控制下的编码新城疫病毒F蛋白的cDNA而被修饰。由本发明的重组火鸡疱疹病毒组成的禽类疫苗可以在鸡中诱导抗新城疫病毒的保护性免疫。

Description

重组火鸡疱疹病毒及其应用
发明领域
本发明提供了一种重组火鸡疱疹病毒(rHVT)，其包含由修饰的鸡β-肌动蛋白(β-actin)启动子控制下的新城疫病毒(NDV)F蛋白(F基因)的cDNA。
相关技术描述
新城疫是在家禽饲养业中最可怕的传染性疾病之一。新城疫的发生存在包括从高死亡率至无症状等许多形式。因而将该毒株分类为(1)强毒株(高毒性)，(2)中等毒力株(中等毒性)，(3)轻型毒株(低毒性)及(4)无症状毒株(Alexander，D.J.In Diseases of Poultry，1997)。强毒株形式NDV感染的鸡在几天后就变得抑郁和昏睡，其死亡率范围从12％至50％以上。幸存的禽类通常产生神经系统症状，如斜颈或头回旋痉挛。这种疾病如此可怕的原因之一是鸡不管年岁如何均易感NDV，而且感染强毒株NDV的鸡在所有年龄均表现出爆发性症状。由于NDV是高度传染性的，任何一只鸡在疾病爆发时均必须处理。养鸡场应该彻底消毒以预防进一步感染。中等毒力病原株(中等毒性)特征在于使幼鸡死亡。轻型毒力病原株(低毒性)特征在于引起轻度呼吸道感染，这些毒株多用于制备接种于幼鸡的疫苗。无症状肠道毒株通常在无疾病表现的鸡的胃肠道中分离得到(Alexander，1997)。新城疫既能感染鸡也能感染火鸡，但是在火鸡中的临床症状没有在鸡中那样严重(Alexander，1997)。
目前，可利用活的及灭活疫苗预防新城疫的发生。这些疫苗是有效的但并非没有缺陷。灭活疫苗必须重复接种于下蛋的育种母鸡。活疫苗主要用于幼鸡。然而，它不能保证这些具有高母体抗体水平的幼鸡产生长期持久的免疫。重复施用活疫苗有时对幼鸡健康生长不利，因为疫苗反应会导致轻度的呼吸道疾病。因此针对家禽业需要一种有效的无副作用的，而且不需要重复接种的新型疫苗。
为符合工业需要，Sakaguchi等人(J.Virol.74：3217-3226，2000；Vaccine 16：472-479，1998)揭示了一种重组Mark’s病病毒血清1型，其病毒基因组的US10区域具有NDV的F基因。由此获得的重组病毒在SPF鸡以及母体抗体阳性的商业禽类中均能诱导抗新城疫的持续保护性免疫。
Marek’s病是家禽业的另一种严重疾病。针对此种疾病，火鸡疱疹病毒(HVT)(Writter R.L.et al.Am.J.Vet.Res.1970，31，525-538)已经最广泛用作安全疫苗。
迄今为止，已经有一些关于基于HVT的新城疫一Marek’s病二价疫苗的报道。例如，Morgan等(Avian Dis.37：1032-1040，1993；Vaccine11：349-358，1993；Avian Dis.36：858-870，1992)构建了具有NDVF基因的重组HVT并测试了这些重组体作为新城疫疫苗的效力。Macmillan等(Vaccine14：469-477，1996)构建了表达NDV的HN和F蛋白的重组的HVTs，并测试了这些重组体的效力。在这两种情况中，接种的SPF鸡对NDV有抵抗力，但对具有高母体抗体水平的商业鸡类不能产生令人满意的效力。
Saitoh等将编码NDV的F和HN蛋白的cDNA插入HVT基因组(WO99/18215)。插入的基因在CMV或RSV启动子的控制下。外源基因的插入位点是UL44和45之间或者UL45和46之间的一种最新鉴别的基因间区域。这些重组体赋予SPF鸡类以及具有NDV母体抗体的鸡类良好的抗NDV攻击的保护作用。然而，这些重组体表达HN和F两个插入基因。由于HN蛋白诱导血细胞凝集抑制(HI)抗体以使鸡类免疫，因此难以区分疫苗免疫的鸡与NDV感染的鸡。因此，能够诱导抗新城疫的足够保护性免疫且能够表达F蛋白基因的的重组病毒是一种更希望的疫苗。如Morgan等所述，这个目的并不易于达到，因为只具有NDV的F基因的rHVT在鸡类中不诱导所期望的免疫。
发明概述
本发明提供了一种重组火鸡疱疹病毒，其通过插入由修饰的鸡β肌动蛋白启动子(Pec启动子)的控制下的NDV的F蛋白的cDNA而得到修饰。rHVT在SPF鸡类以及在具有高NDV母体抗体水平的商业鸡类中诱导抗NDV的持久保护性免疫。
具体地，本发明提供了一种重组火鸡疱疹病毒，其通过插入由一种启动子控制下的NDV F基因而得到修饰，这一启动子的序列为SEQID NO.1。本发明进一步提供了一种新城疫-Marek’s病的二价疫苗，其主要由上述的重组火鸡疱疹病毒所组成。
下文将详细描述本发明。
SEQ ID NO.1
5’-AGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATTGGCCCGCCGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCATTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGATGCAGTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCACCCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTCTAGAGG-3’
(NDV F基因)
只要编码NDVF蛋白，则来自任何NDV毒株的任何基因均符合本发明的目的。例如Sato、Miyadera、D26、Atami、D26、Atami或Fuji以及Texas GB、B1或LaSota毒株的F基因。野毒株或任何已知DNA序列的F基因也是合适的。在这些基因当中，来自D26的基因是一个良好实例。本发明不希望将一个额外的抗原基因掺入病毒主链。
(启动子)
在本发明中，NDV F基因通过SEQ IDNO.1所述启动子(称为Pec启动子)或其类似物控制。所述Pec启动子(日本未经审查的专利出版物No.2001-188)通过缺失鸡β肌动蛋白启动子的一个不必要区域而产生。与Pec同源的启动子是指一种启动子，其活性与Pec几乎相同，长度为120-850碱基对(bp)或者更适宜的150-600bp。一种同源启动子可以通过在β肌动蛋白启动子中取代、缺失或添加核苷酸而产生。本发明使用的启动子可包括天然存在的或修饰的增强子序列。这种启动子例如是COA启动子，如SEQ IDNO.2所示。
(禽类疱疹病毒)
只要对鸡类无病原性，任何火鸡疱疹病毒均可以用于本发明中。例如，FC126(ATCC VR-584B)、PB-THV1、H-2、YT-7、WTHV-1或HPRS-26毒株适于所述病毒主链。而在这些之中，FC126由于其在鸡类中的安全应用而适宜用于本发明。
(基因插入区域)
已知HVT的一些非必需区域，其对病毒生长是不必要的，因此适合NDV F基因插入。例如，UL43(WO 89/01040)、US2(WO93/25665)或者UL44与UL46之间的ORF间区域(inter-ORF region)(WO 99/18215)适合插入F基因。在这些当中，UL44与UL46之间的ORF间区域是最合适的。
就本发明而言，可最新通过以下的常用方法鉴别一个非必需区域。首先，将合适长度的禽类疱疹病毒DNA片段克隆入大肠杆菌质粒中并通过限制酶分析作物理图谱。然后，将由一个启动子和一个标记基因组成的一个基因盒插入克隆DNA片段中的一个合适的限制位点，产生一个同源质粒。如后文所述，如果与获得的同源质粒进行同源重组，产生一种表达所插入的标记基因的重组病毒，而且其在体内和体外是稳定的，那么原始选择的DNA片段应是适于NDV F cDNA插入的一个非必需区域。
(构建rHVT)
就本发明而言，任何已知的产生重组禽类疱疹病毒的方法均是适合的。一个典型实例如下所述。(1)首先，如上所述，构建一个重组质粒，其包括禽类疱疹病毒的一个非必需区域。然后将5’末端的一个启动子及3’末端的一个聚腺苷酸化信号正确的接在一起，并将NDV-FcDNA插入所述非必需区域以产生一个同源质粒。(2)将所得质粒移至用亲代HVT感染的鸡胚成纤维(CEF)细胞中，或者共同转染入具有感染性HVT基因组DNA的CEF细胞中。转染可以通过任何已知的方法进行。(3)将转染的CEF细胞接种入培养平板中并孵育至出现病毒噬斑。(4)可鉴别的噬斑包括重组病毒以及亲代野生型病毒。将重组病毒通过任何已知方法从野生型病毒中纯化，以筛选插入的外源基因的表达。
(新城疫-Marek’s病二价疫苗)
由于F蛋白是NDV的一种保护性抗原，而主链HVT是Marek’s病的一种活疫苗，因此含有本发明的F基因的rHVT可用作新城疫和Marek’s病的二价疫苗，或者作为新城疫的单价疫苗。
主要由本发明rHVT组成的疫苗可包括鸡细胞和/或培养基的配料。只要无药理学不利作用，所述疫苗可还有任何配料如防腐剂。另外，本发明的疫苗可用作与任何重组或非重组病毒如MDV血清1型或血清2型疫苗株的混合物。
任何已知方法均适于制备本发明的重组二价疫苗。例如，将rHVT接种于允许培养细胞如CEF细胞中并生长至合适效价。然后，将细胞用刮刀从培养平板或者培养瓶中刮除，或者经胰蛋白酶处理并进行离心。然后将分离自上清的细胞悬浮于含有二甲基亚砜的培养基中并贮存于液氮中。当rHVT在上清中时，将被收集并冻干。
将二价重组HVT疫苗通过任何已知的接种Marek’s病疫苗的方法施用于鸡类。例如，将本发明的疫苗稀释为10-105，或者更合适的102-104噬斑形成单位(PFU)/剂，皮下接种于一日龄的雏鸡颈后部，或者使用注射器及其他任何注射设备注入胚卵中。
本发明的禽类二价疫苗给予SPF鸡90％或更多的抗NDV攻击的保护作用，而且给予具有高水平抗NDV母体抗体的商业鸡类至少70％或更多的保护作用。
在本发明中，如实施例所述，抗NDV攻击的保护作用以在攻击测试中保护的禽类与总测试禽类的比率而确定。首先，通过攻击未接种的禽类确定NDV攻击病毒的合适剂量。90％或更多这些禽类(阴性对照组)必须显示临床信号。接下来将接种的禽类通过肌内途径注射至股部或者通过气管内、眼内或眶下途径用相同剂量的攻击病毒攻击。观测受攻击的禽类的新城疫发病情况，特别是神经系统症状。
优选实施方案描述
实施例1：构建同源载体
通过标准分子生物学技术构建质粒(Molecular Cloning：ALaboratory Manual.2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.1989)。将DNA限制片段在琼脂糖凝胶上电泳并用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化(QIAGEN，Cat#28704)。
1-1：构建用于测定启动子活性的质粒
质粒pGIMICSpolyASfi(2773bp，WO 99/18215)通过将一个聚腺苷酸化信号和一个SfiI位点导入pUC18的多克隆位点而构得。然后将pGIMICSpolyASfi用NheI消化并与通过NheI和XbaI消化从Pica基因增强子2(5064bp，TOYO INK MFG CO.，LTD)切下的1721bp的片段连接，获得的质粒称为pLUC-Pro(4494bp)。
接下来使用鸡细胞基因组DNA库作为模板通过PCR制备包含β肌动蛋白启动子的一个DNA片段(大约1.5kb)。所述引物为PrBac1(SEQ ID NO.2，5’-CAGTGTCGCTGCAGCTCAGTGCATGCACGCTCATTGCCC-3’)及PrBac2(SEQ ID NO.3，5’-GCTCTAGAGTCGACAAGCTTCATGGCTGGCTGCGGAGGAACAGAGAAGGG-3’)。
获得的片段用PstI和XbaI消化及与通过PstI和XbaI消化而产生的4482bp片段连接。所得质粒称为pLUC-bac，其长度为5986bp，并包含所述β肌动蛋白启动子区域。
pLUC-bac用BamHI和BglII消化，将所得5958bp片段自身连接产生pLUC-bac-Sma。由于pLUC-bac-Sma在β肌动蛋白启动子上游具有PstI和SmaI位点，因此用PstI和SmaI限制pLUC-bac-Sma随后自身连接产生第一个质粒以获得β肌动蛋白启动子缩短的5’区域。相似地，用SacI和XbaI限制pLUC-bac随后通过自身连接产生第二个质粒以获得β肌动蛋白启动子缩短的3’区域。然后将所得两个质粒线性化及使用Kilo序列检测试剂盒(TAKARA SYUZO CO.，LTD)进行ExoIII处理。在1、2和3分钟取样以从第一个质粒获得7个样品及从第二个质粒中获得22个样品。所有29个样品均包含大约200-1500bp的启动子区域。通过标准步骤将所得样品平端化并自身连接以产生环形质粒。
使用PicaGene(TOYO INK MFG.CO.，LTD)测定萤光素酶活性。简而言之，将1μg所述29个质粒的每一个质粒借助基因脉冲发生器(Gene Pulser，Bio-Rad Laboratories)通过电穿孔导入CEF细胞中。然后将所述细胞培养24小时及加入细胞裂解缓冲液(PicaGene试剂盒中的)。将所述细胞在-80℃冷冻1小时，并在室温解冻以完成细胞裂解。离心后，将10μl回收的上清加入100μl的PicaGene底物溶液中，1分钟之后用Lumino-Meter(Model 11253，Bio-Rad Laboratories)测定荧光素酶强度。Lumino-Meter用于计算产生的萤光素酶的数量，可以用来指征启动子的活性(见图1)。
如图1所示，在含有5’末端缺失的样品中，TATAAA上游缺失120bp以上的样品，其启动子的活性明显降低。相反，在3’末端，启动子活性与缺失长度之间没有相关性。例如，与全长β肌动蛋白启动子相比，大约100bp的缺失导致启动子的活性降低1/5。朝向3’末端的进一步缺失(超过100bp)不会恢复原始活性。
1-2：核心序列启动子
文献(参考文献12-19)表明β肌动蛋白启动子的所有区域均不是不可缺少的。基于这种信息，通过PCR使用pLUC-bac的β肌动蛋白启动子作为模板获得273、211、175和163bp片段。引物是SEQ IDNO.4(5’-TATTTTGTGCAGCGAT-3’)及SEQ ID NO.5(5’-ACGTCTAGAAGGCAACGCAGCGACT-3’)或者SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6(5’-CTGTCTAGATAACGCGGTCAGTCAGA-3’)。所得片段coa273、coa211、coa175和coa163称为核心序列启动子(COA)。
接着，将这四个COA用PstI和XbaI消化，同时用PstI和XbaI从pLUC-pro中切下的一个4482bp片段，并将这些片段进行连接。四个质粒的启动子活性如实施例1-1所述测定。结果是，pLUC-COA273、pLUC-COA211、pLUC-COA175和pLUC-COA163的活性分别是全长β肌动蛋白启动子活性的97％、76％、96％和34％。pLUC-COA273中包含的启动子称为COA启动子，因为其表现出最高的启动子活性。
1-3：构建p45/46Sfi(图2和3)
基于MDV血清1型的gC同源(gCh)基因(Coussers et al.，J.Virol.62：2373-2379，1988)及其邻近BamHI-B片段(Japanese UnexaminedPatent Publication No.H6-292583)的信息，通过PCR制备在两个ORFUL45h和UL46h之间具有一个SfiI位点的DNA片段并克隆入pUC18。首先，根据Lee等所述方法从感染HVT FC126毒株的CEF细胞中制备HVT DNA(J.Gen.Virol，51：245-253，1980)。用获得的HVT DNA作为模板，使用两对引物进行PCR。第一对引物是SEQ ID NO.7(5’-CCCCGAATTCATGGAAGAAATTTCC-3’)和SEQ ID NO.8(5’-CGCGGGCCTTATTGGCCAAAACACACCTCTAACGGTTACT-3’)。第二对引物是SEQ ID NO.9(GCGCGGCCAATAAGGCCAAAACACAGTAACCGTTAGAGGT-3’)和SEQ ID NO.10(5’-CCCCAAGCTTTCAAGTGATACTGCGTGA-3’)。使用所得两个PCR产物的混合物作为模板，用SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8进行另一次PCR以产生在两个QRF UL45h和UL46h之间具有一个SfiI位点的片段。
所得片段然后用EcoRI和HindIII消化并与已经用EcoRI和HindIII消化的pUC18连接。所得质粒称为p45/46Sfi。
1-4构建pUC18polyAsfi
通过退火两个合成的寡核苷酸(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)随后与已经用EcoRI和HindIII消化的pUC18连接而构建pUC18polyASfi。
SEQ ID NO.11：138bp
5’-AGCTTGCCAATAGGCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGCGAGCTCGTAGCGGGCCCGCATGCGGTACCGTCGACAATAAAGAACCGCTTTAAGAATAGTGTTTATTTTTGTGTTTATGGCCAATAAGGCCG-3’
SEQ ID NO.12：138bp
5’-AATTCGGCCTTATTGGCCATAAACACAAAAATAAACACTATTCTTAAAGCGGTTCTTTATTGTCGACGGTACCGCATGCGGGCCCGCTAGCGAGCTCGCCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGCCTTATTGGC-3’
将插入的片段用BglI切除并设计粘端以插入p45/46Sfi的SfiI位点中。另外，将多克隆位点加入所述片段的5’末端以便可以插入一个启动子-外源基因盒。SalI位点下游的43bp序列是聚腺苷酸化信号，它是衍生于位于MDV GA毒株UL46h下游的序列。
1-5：构建pBac
将包含实施例1-1所述β肌动蛋白启动子的一个大约1.5kb的DNA片段用PstI和SalI消化，及与已经用PstI和SalI消化的pUC18polyASfi连接。所得质粒称为pBac。
1-6：构建pGICOA
使用pBac作为模板，用引物PrBac3和PrBac4进行PCR。
PrBac3(SEQ ID NO.13)：
5’-TTTCTGCAGTATTTTGTGCAGCGAT-3’
PrBac4(SEQ ID NO.14)：
5’-CTGTCTAGATAACGCGGTCAGTCAGA-3’
PrBac3具有一个PstI位点，PrBac4具有一个XbaI位点。将PCR扩增的片段用PstI和XbaI切除以产生一个大约300bp的片段。然后将该片段与已经用PstI和XbaI消化的pUC18polyASfi连接。所得质粒称为pGICOA。
1-7：构建Pec启动子
将CMV增强子加入COA启动子中以增强其启动子的活性。
由于CMV增强子有两个BglI位点，因此来自CMV增强子的BglI盒不易被插入于pGICOA的SfiI位点中。为缺失BglI位点，使用pBK-CMV(Stratagene)作为模板，用3对引物进行PCR而构建体外诱变。所述引物是PrCMV1(SEQ ID NO.15)和PrCMV3(SEQ ID NO.17)、PrCMV4(SEQ ID NO.18)和PrCMV5(SEQ ID NO.19)及PrCMV6(SEQ ID NO.20)和PrCMV2(SEQ ID NO.16)。使用获得的三个扩增片段作为模板，用引物PrCMV1和PrCMV2进行第二次PCR。由于PrCMV1有一个PstI位点，PrCMV2有一个EcoT22I位点，因此将扩增的片段用PstI和EcoT22I消化以产生一个大约300bp的片段，然后将其克隆入pGICOA的PstI位点中以产生pGIPec。pGIPec中包含的启动子称为Pec启动子，由来自CMV增强子的大约275bp片段以及来自β肌动蛋白启动子的一个273bp片段组成。
所述Pec启动子表现出增强的启动子活性，当用实施例1-1所述的方法在体外评估时，比COA启动子的活性高6.5倍。
PrCMV1(SEQ NO.15)：
5’-GGG CTG CAG AGT TAT TAA TAG TAA TCA ATT-3’
PrCMV2(SEQ NO.16)：
5’-GGG ATG CAT CCA TTT ACC GTC ATT GAC GTC-3’
PrCMV3(SEQ NO.17)：
5’-GGG TCG TTG GGC GGT CAG CCG GCG G-3’
PrCMV4(SEQ NO.18)：
5’-CTT ACG GTA AAT GGC CCG CCG GCT G-3’
PrCMV5(SEQ NO.19)：
5’-TAC ACT TGA TGT ACT GCC AAT GGG C-3’
PrCMV6(SEQ NO.20)：
5’-TAT TTA CGG TAA ACT GCC CAT TGG C-3’
1-8：构建NDV-F载体
使用XLIII10H(Sato，H.et al.，Virus Research，7241-7255，1987)作为模板，用引物PrF1和PrF2进行PCR。
PrF1(SEQ NO.21)
5’-GCTCTAGAGGATCCGCATGGGCTCCAGATCTTCTACCAGGATCCC-3’
PrF2(SEQ NO.22)
5’-GCGAGCTCGGTCCATGACTGAAGACTGCTATTGG-3’
PrF1有XbaI和BamHI位点，PrF2有一个SacI位点。
扩增的长度为大约1.9kb的片段编码F基因的553个氨基酸，其与病毒研究7241-7255，1987中所报道的内容相一致。将该片段用XbaI和KpnI消化并克隆到已用XbaI和KpnI消化的pGIPec中。所得质粒称为pGIPecF。
1-9：构建同源载体p45/46PecF
为构建同源质粒p45/46PecF，将Pec启动子、NDV F基因和SV40聚腺苷酸化信号序列插入p45/46Sfi中。首先，将Pec启动子和NDV F基因用BglI和KpnI从pGIPecF中切除。其次，从pBR-CMV(Stratagene)中通过PCR使SV40聚腺苷酸化信号序列扩增，并用BglI和KpnI切割。将这两个片段克隆入SfiI位点，同时破坏一个SfiI位点，并产生所述同源质粒p45/46pecF。
实施例2：构建并纯化rHVT/NDV
如Morgan等所述制备HVT野生型FC126毒株(wt-HVT)的病毒DNA(Avian Disease，34：345-351，1990)。将CEF细胞用制备的wt-HVT DNA和p45/46PecF转染(见实施例3-3)。所得重组病毒引起噬斑并得到纯化，这一过程采用抗NDV-F抗体对噬斑进行染色的方法实现。
简而言之，将5μg同源载体p45/46PecF和25μg wt-HVT DNA溶解于100μl的生理盐水G(0.14M NaCl，0.5mM KCl，1.1mM Na2HPO4，1.5mM NaH2PO4，0.5mM MgCl2，0.011％葡萄糖)中。然后，将CEF细胞悬浮于0.7ml的生理盐水G中并进行电穿孔。将转染的细胞在室温孵育10分钟并移至一个60mm培养皿中，所述培养皿中含有由Leibovitz’s L-15(GIBCO BRL，Cat.#41300-39)和McCoy’s 5A培养基(GIBCO BRL，Cat.#21500-061)(1∶1)，以及4％小牛血清组成的5ml培养基(LM(+)培养基)。在37℃在5％CO2中孵育后，重组体从wt-HVT中通过一系列有限稀释法得以纯化。在每次纯化循环时，使用抗原-抗体反应证实F基因的表达，抗体采用抗NDV-F单克隆抗体3-1G/5(Morrison，T.G. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：1020-1024，1987)作为一级抗体。重复纯化操作直至每个获得的噬斑均由抗NDV-F抗体染色呈现阳性。纯化的重组体HVT称为rHVT/NDV。
实施例3：确证rHVT/NDV的稳定性
3-1：Southern杂交
将纯化的rHVT/NDV在两个150mm培养皿中CEF细胞上增殖以获得铺满的噬斑。将细胞从培养皿中刮下，转移至Falcon试管中，在1500转/分钟(rpm)离心5分钟。收获的细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，再悬浮于1.2ml PBS和0.8ml裂解缓冲液(1.25％TritonX-100，250mM 2-ME以及50mM EDTA(溶于PBS中))，涡旋30秒使之裂解。然后将裂解物在室温在3000rpm离心5分钟，将上清移至一个Eppendorf试管中。在22℃，15000rpm离心20分钟收集病毒。然后将回收的沉淀再悬浮1ml的12.5mM Tris-Cl(pH7.5)中，并补加4μl核酸酶溶液(0.25mg/ml DNase I，0.25mg/ml RNase A，150mM NaCl)，在37℃孵育30分钟，及通过用SDS-蛋白酶溶液(500mM EDTA，25μl；10％SDS，125μl；H2O，87μl；10mg/ml蛋白酶K，12.5μl；2-巯基乙醇，0.5μl)在55℃孵育30分钟而破坏。所得混合物用苯酚-氯仿处理两次，并将16μl 5M NaCl加入水相中。病毒DNA通过加入2.5体积的-20℃的乙醇而沉淀，用70％乙醇洗涤及沉淀。在风干后，将回收的沉淀溶解于50μl的TE缓冲液(10mM Tris-Cl(pH8.0)，1mM EDTA)中。
然后将TE缓冲液中回收的病毒DNA用XhoI、XbaI和SfuI消化并进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。将单个凝胶上电泳的DNA片段同时移至两个尼龙膜上(Molecular Cloning：A Laboratory Mannual，thirdedition，6.35，Sambrook，J.，and Russell，D.W.，Cold Spring HarborLaboratory)。在烘焙固定DNA后，将固定的DNA与DIG-标记的探针杂交，所用探针为“F探针”或“IS45/46探针”，是用PCR DIG探针合成试剂盒(ROCHE DIAGNOSTICS，Cat.#1636090)制备。F探针用NDV-F-F(SEQ ID NO.23)和NDV-F-R(SEQ ID NO.24)作为引物，p45/46PecF作为模板，通过PCR制备。IS45/46探针用45/46-F(SEQ ID NO.25)和45/46-R(SEQ ID NO.26)及p45/46Sfi制备。
NDV-F-F(SEQ ID NO.23)：
5’-CTAGCAGTGGCAGTTGGGAAGAT-3’
NDV-F-R(SEQ ID NO.24)：
5’-GTTAAGGCAGGGGAAGTGATTTGT-3’
45/46-F(SEQ ID NO.25)：
5’-GGGGAAGTCTTCCGGTTAAGGGAC-3’
45/46-R(SEQ ID NO.26)：
5’-GGTGCAATTCGTAAGACCGATGGG-3’
Southern印迹结果显示，一个3.6kb片段与F探针杂交，3.6kb和1.2kb片段与IS45/46探针杂交，表明所制得的rHVT/NDV含有期望的基因组结构。
3-2：rHVT/NDV的体外稳定性
将rHVT/NDV在CEF细胞中传代10次，并进行Southern印迹分析。结果与实施例3-1所得结果相同，表明所发明的rHVT/NDV甚至在10代后仍保持稳定。
3-3：rHVT/NDV的体内稳定性
将3000PFU的rHVT/NDV皮下接种于SPF鸡，以及具有抗NDV母体抗体的商业鸡的背部。在接种3、4、5及6周后，从接种的禽类中收集外周血并从外周血淋巴细胞中回收病毒。收集淋巴细胞的过程如下所示。
使用含有0.5ml肝素溶液(100u/ml)的2.5ml注射器，从鸡中收集2ml血液并置于15ml Falcon离心管中的5ml Ficoll-Paque(Amersham-Pharmacia)上。在1800rpm离心20分钟后，在Ficoll-Paque和血清层界面处形成外周血淋巴细胞带。用Pasteur移液管收集界面层，接种于9cm培养皿中的CEF细胞中，培养7天。当在第一次培养及随后的传代培养期间观测到噬斑时，认为病毒从淋巴细胞中成功分离。结果归纳于表1中。
          表1：从接种的禽类外周血淋巴细胞中分离rHVT
  rHVT/NDV   HVT FC 126   未接种
  MA+***   SPF****   MA+   SPF   MA+
 3周**   2/2*   ND*****   2/2   1/1   ND
 4周   3/3   2/2   1/3   2/2   0/2
 5周   3/3   2/2   1/3   ND   0/2
 6周   3/3   2/2   1/3   2/2   0/2
*：从中回收病毒的禽类数/测试的禽类数
**：周龄
***：母体抗体阳性鸡
****：无特异性病原的鸡
*****：未做
如表1所示，rHVT/NDV以及亲代HVT FC126毒株自接种3-6周后接种的鸡的外周血淋巴细胞回收。当用实施例2所述的方法，用抗F抗体染色时，所有重组噬斑均表现为表达F基因，表明rHVT/NDV在体内传代后是稳定的。
实施例4：确证rHVT/NDV表达插入的基因
4-1：免疫荧光技术
rHVT/NDV感染的细胞在37℃与组织培养室玻片中新鲜的CEF细胞一起孵育，并将获得的噬斑用冷却的丙酮固定。为检测表达的抗原基因产物，使用鸡抗NDV抗血清或兔抗F抗血清的500倍PBS稀释液作为一级抗体。固定的细胞与一级抗体在室温和100％湿度下孵育大约1小时，用PBS洗涤3次，然后与二级抗体在室温反应大约1小时。二级抗体是用荧光底物(FITC)标记的抗鸡免疫球蛋白或抗兔IgG抗体。在用PBS洗涤3次后，通过荧光显微镜检测处理的玻片。用感染亲代HVT FC-126的细胞作为对照。结果归纳于表2。
        表2：通过rHVT/NDV表达所插入的F基因(荧光检测)
  病毒  初级抗体
 兔抗F抗血清  鸡抗NDV抗血清  抗VP2单克隆抗体(R63)   PBS
  rHVT/NDV  +  +   -   -
  FC126  -  -   -   -
  None  -  -   -   -
+：检测到，-：未检测到
如表2所示，rHVT/NDV表达插入的NDV-F基因。
4-2：Western印迹
将CEF细胞用rHVT/NDV感染，m.o.i.＝0.1，孵育72小时，溶解于SDS-GEL上样缓冲液中。类似地，将被亲代HVT FC126感染或未感染的细胞孵育及溶解。所得样品还原、变性并进行SDS-PAGE。将电泳的蛋白质从SDS-GEL中转移至PVDF膜(Immobilon-P，Millipore)，该膜用1％w/v脱脂奶粉PBS溶液封闭1小时。然后将处理的膜与稀释500倍的抗F兔抗血清在室温下反应，用PBS洗涤3次，及与生物素酰化的山羊抗兔抗血清孵育1小时。PBS洗涤3次后，将该膜与抗生物素蛋白-碱性磷酸酶复合物孵育1小时，用PBS洗涤3次，TBS洗涤1次，然后与BCIP-NBT(一种碱性磷酸酶底物)反应。如图4所示，60kDa的一个蛋白条带仅在rHVT/NDV感染细胞的泳道中观测到，这就是所期望大小的F蛋白。
实施例5：rHVT/NDV在SPF鸡中的效力
将在实施例2中获得的rHVT/NDV作为新城疫疫苗进行效力测试。
使用20Gauge注射器，以1950PFU/100μl/禽的剂量将rHVT/NDV皮下接种于15只1天龄的SPF鸡的背部(LineM，日本生物学实验室)。从接种后3周开始，从接种的禽类中收集血清，通过商用ELISA试剂盒(IDEXX，ELISA kit to diagnose Newcastle Disease)测定抗NDV抗体的滴度。阳性对照组的鸡在14天龄根据销售者推荐接种商用NDV活疫苗。阴性对照组的鸡不予施用任何疫苗。在43天龄(接种后42天)，将3个组的所有鸡均用103EID50的NDV-TexasGB通过股部肌内注射而加以攻击，NDV-TexasGB是美国的标准攻击毒株。对所攻击的鸡每天检测死亡率或者检测新城疫任何的发作迹象。
                    表3：用毒性NDV对rHVT/NDV接种的SPF鸡的攻击实验
  接种   剂量(PFU/鸡)   鸡数   出现症状鸡数/总数(％)  孵化HI(ELISA)滴度   攻击时ELISA滴度
  rHVT/NDV   1950   20   0/20(0) 0   0.207±0.03
  商业NDV活疫苗   见标签   10   0/10(0)   1.089±0.29
  阳性对照   N/A   10   11/12(92)   0.089±0.01
  阴性对照   N/A   5   0/5(0)   N/A
如表3所示，用rHVT/NDV接种的鸡未表现出任何临床迹象，在攻击后ELISA滴度明显提高。
实施例6：rHVT/NDV在NDV母体抗体阳性鸡中的效力
为检测rHVT/NDV作为疫苗对具有抗NDV母体抗体阳性鸡的效力，购买商业鸡的受精卵(Hyline，Kanagawa Youkei Rengoukai)并孵化。使用20Gauge 1.5英寸注射器将1950 PFU/μl的rHVT/NDV接种于18天龄鸡胚。将阳性对照组的鸡在14天龄时用商业NDV活疫苗根据销售者推荐进行接种。阴性对照组的鸡不予施用任何疫苗。在43天龄，将所有组的鸡均用103EID50的NDV-TexasGB通过在股部肌内注射而加以攻击，所述NDV-TexasGB是美国的标准攻击毒株。对受攻击的禽类每天检测死亡率或者检测新城疫的任何发作情况。
                        表4：用毒性NDV对rHVT接种的商业鸡的攻击实验
  接种   剂量(PFU/鸡)   鸡数   出现症状鸡数/总数(％)  孵化时HI(ELISA)滴度   攻击时ELISA滴度
  rHVT/NDV   1950   10   0/12(0)   N/A   0.471±0.108
  商业NDV活疫苗   见标签   10   1/10(0)   N/A   1.386±0.287
  阳性对照组   N/A   10   10/10(100)   N/A   0.047±0.003
  阴性对照组   N/A   5   0/5(0)   N/A   N/A
如表4所示，用rHVT接种的鸡未表现出任何临床迹象，在攻击后ELISA滴度明显提高。
实施例7：ELISA滴度与疫苗效力之间的关系
ELISA滴度与保护作用之间的关系通过测定在攻击后从鸡中收集的血清的中抗NDV滴度而进行评估，待测鸡用如实施例5和6所述方法接种。抗体滴度通过实施例5所用商业ELISA试剂盒测定。图5和6分别表示存活或未存活的SPF以其商业禽类的ELISA滴度。正如图中所示，所有具有0.15或更高抗体滴度(S/P值)的鸡在受到毒性NDV攻击时均存活。
实施例8：免疫持续时间
按照实施例6所用的方法用rHVT/NDV接种5只鸡，保持不受攻击，每两周收集血清并测定其中的NDV-ELISA滴度。作为对照，未接种的鸡以相同的程序处理。以实施例7中获得的S/P值0.15作为标准来确定保护作用。结果如表5所示。
                             表5：rHVT/NDV给予的保护性免疫的持续时间
  组   周龄
  2   3   4   5   7   11   15   20   24   30   45   50
  rHVT/NDV   抗体滴度   0.85   0.50   0.31   0.21   0.36   0.84   0.91   0.88   1.21   0.90   1.04   1.12
  保护作用   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  未接种对照组   抗体滴度   0.74   0.46   0.10   0.03   0.01   0.02   0.05   0.02   0.02   0.00   0.01   0.02
  保护作用   +   +   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
如表5所示，在4周龄，未接种鸡的ELISA滴度降低至标准值以下，表示无保护作用。在50周龄，滴度降低至几乎为0。相反，接种的鸡示在5周龄时表现出最低的滴度值，而这足以赋予完全保护作用。之后，在24周龄时，该数值持续逐渐提高至1.21，并将其保持至50周龄。这些数据表明本发明的rHVT/NDV在接种的母体抗体阳性的商业鸡中能够诱导长期的保护性免疫。
实施例9：从rHVT/NDV接种鸡的外周血淋巴细胞中分离rHVT/NDV
将3000PFU的rHVT/NDV皮下接种于1天龄抗NDV母体抗体阳性商业鸡的背部。该接种鸡保持30周，每两周从其翅脉收集外周血。如实施例3所用方法，从外周血淋巴细胞中回收病毒。从rHVT/NDV接种的所有鸡中回收的病毒，均表现能表达F基因。
                               序列表
<110>日本瑞翁株式会这社
<120>重组火鸡疱疹病毒及其应用
<130>新城疫病毒
<140>
<141>
<160>26
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>555
<212>DNA
<213>Gallus gallus
<220>
<221>promoter
<222>(1)..(555)
<400>1
gagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg  60
cgttacataa cttacggtaa attggcccgc cggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt  120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca  180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca  240
agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggatgc agtattttgt gcagcgatgg  300
gggcgggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc  360
gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat  420
ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc  480
tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct  540
ctgactgacc gcgtc                                                   555
<210>2
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：synthetic
     primer DNA for PCR
<400>2
cagtgtcgct gcagctcagt gcatgcacgc tcattgccc                         39
<210>3
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：synthetic
     primer DNA for PCR
<400>3
gctctagagt cgacaagctt catggctggc tgcggaggaa cagagaaggg              50
<210>4
<211>16
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：synthetic
     primer DNA for PCR
<400>4
tattttgtgc  agcgat                                                  16
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：synthetic
     primer DNA for PCR
<400>5
acgtctagaa ggcaacgcag cgact                                         25
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：synthetic
     primer DNA for PCR
<400>6
ctgtctagat aacgcggtca gtcaga                                        26
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：synthetic
     primer DNA for PCR
<400>7
ccccgaattc atggaagaaa tttcc                                         25
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：synthetic
     primer DNA for PCR
<400>8
cgcgggcctt attggccaaa acacacctct aacggttact                         40
<210>9
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：synthetic
     primer DNA for PCR
<400>9
gcgcggccaa taaggccaaa acacagtaac cgttagaggt                         40
<210>10
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：synthetic
     primer DNA for PCR
<400>10
ccccaagctt tcaagtgata ctgcgtga                                      28
<210>11
<211>138
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Modified
     synthetic oligonucleotide from pUC18
<400>11
agcttgccaa taaggctgca ggtcgactct agaggatccc cgggcgagct cgctagcggg  60
cccgcatgcg gtaccgtcga caataaagaa ccgctttaag aatagtgttt atttttgtgt  120
ttatggccaa taaggccg                                                138
<210>12
<211>137
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Modified
     synthetic oligonucleotide from pUC18 plasmid
<400>12
aattcggcct tattggccat aaacacaaaa ataaacacta ttcttaaagc ggttctttat  60
tgtcgacggt accgcatgcg ggcccgctag cgagctcgcc cggggatcct ctagagtcga  120
cctgcagcct tattggc                                                 137
<210>13
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     primer DNA for PCR
<400>13
tttctgcagt attttgtgca gcgat                                         25
<210>14
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     primer DNA for PCR
<400>14
ctgtctagat aacgcggtca gtcaga                                        26
<210>15
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     primer DNA for PCR
<400>15
gggctgcaga gttattaata gtaatcaatt                                    30
<210>16
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     primer DNA for PCR
<400>16
gggatgcatc catttaccgt cattgacgtc                                    30
<210>17
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     primer DNA for PCR
<400>17
gggtcgttgg gcggtcagcc ggcgg                                         25
<210>18
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     primer DNA for PCR
<400>18
cttacggtaa atggcccgcc ggctg                                         25
<210>19
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     primer DNA for PCR
<400>19
tacacttgat gtactgccaa gggc                                          24
<210>20
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     primer DNA for PCR
<400>20
tatttacggt aaactgccca ttggc                                         25
<210>21
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     primer DNA for PCR
<400>21
gctctagagg atccgcatgg gctccagatc ttctaccagg atccc                   45
<210>22
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     primer DNA for PCR
<400>22
gcgagctcgg tccatgactg aagactgcta ttgg                               34
<210>23
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     prirmer DNA for PCR
<400>23
ctagcagtgg cagttgggaa gat                                           23
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     primer DNA for PCR
<400>24
gttaaggcag gggaagtgat ttgt                                          24
<210>25
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     primer DNA for PCR
<400>25
ggggaagtct tccggttaag ggac                                          24
<210>26
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     primer DNA for PCR
<400>26
ggtgcaattc gtaagaccga tggg                                          24

Claims (4)

1.一种重组火鸡疱疹病毒，其携带在如SEQ ID NO：1所示序列的启动子控制下的新城疫病毒的F蛋白基因。
2.如权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒，其中所述启动子和F蛋白基因被插入病毒基因组主链的非编码的ORF间区域。
3.如权利要求2所述的重组火鸡疱疹病毒，其中所述非编码区位于疱疹病毒基因组的UL45和UL46之间。
4.一种禽类疫苗，其包含权利要求1、2或3所述的重组火鸡疱疹病毒。
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