CN1247785C - 巨细胞病毒内含子a片段 - Google Patents

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Abstract

公开了用于表达基因产物的巨细胞病毒(CMV)内含子A片段。还描述了含有这些片段的表达载体以及使用这些载体的方法。

Description

巨细胞病毒内含子A片段
                              技术领域
本发明总的涉及重组基因表达系统。更具体而言，本发明涉及在表达构建物中用于表达基因产物的新颖的巨细胞病毒(CMV)内含子A片段，及其使用方法。
                              发明背景
在各种原核和真核重组表达系统中方便地生产蛋白质。例如，大肠杆菌来源的质粒DNA载体被广泛用于蛋白质的体外和体内表达。在体外，这种载体用于如蛋白质表达的性质的初步评估到重组蛋白质的大规模生产范围中的目的。在体内，DNA载体用于如基因治疗和核酸接种。
通常，有效的载体是那些由于使用有效的启动子和其它控制元件的缘故而表达高水平的蛋白质的载体。可能影响细胞的有效转染的其它因素包括：(1)细胞对质粒的摄取；(2)质粒在胞吞后从内吞噬囊中的逃逸；(3)质粒从胞质到核的移位；和(4)质粒在核中的转录。
几个实验室的工作表明，有效转染的一个主要障碍，是质粒向核的移位，尤其是在不进行有丝分裂的细胞(如肌细胞)中。可能影响此步骤的一个参数是质粒的大小，因为大分子被摄取到核中所涉及的核孔复合体的大小有限。因此，需要设计保留了高水平表达蛋白质的能力的小质粒。这种小质粒与较大质粒相比，具有促进DNA传送，并插入较大的基因插入子的潜力。后一点对于将质粒包装的能力有限的某些重组病毒载体来说是特别重要的，如α病毒和腺相关病毒。
一个生产重组蛋白质的特别有效的系统使用含有人巨细胞病毒(hCMV)立即早期(IE1)增强子/启动子区域的载体，该增强子/启动子区域控制分子量为72000的hCMV立即早期蛋白质的转录。参见，例如Chapman等，Nuc.Acids Res.，(1991)，19：3979-3986；和美国专利5688688。该hCMV IE1增强子/启动子是已知的增强子/启动子中最强的一种，并且在大范围的细胞类型中活跃。
hCMV IE1增强子/启动子区域(图2)包括组织特异性调节子、用于几种不同的转录因子的多个潜在的结合位点，以及复合增强子。该基因的转录区域含有4个外显子和3个内含子。最大的内含子(称为内含子A)在该基因的5′-未翻译区域内发现。关于hCMV的Towne株中这个区域的序列和结构，可参见例如Chapman等，Nuc.Acids Res.(1991)， 19：3979-3986；关于hCMV的AD169株中的相应区域的描述，可参见Akrigg等，Virus Res.(1985)，2：107-121。hCMVIE1增强子/启动子的内含子A区域已显示出含有能增强异源蛋白质在哺乳动物细胞中表达的元件。参见，如Chapman等，Nuc.Acids Res.，(1991)，19：3979-3986。
内含子是哺乳动物细胞核中产生的大多数前mRNA转录子中存在的非编码区域。当内含子序列包含在异源表达载体中时，它可有力地增强基因表达。参见，如Buchman等，Molec.Cell.Biol.，(1988)，8：4395-4405；Chapman等，Nuc.AcidsRes.(1991)，19：3979-3986。最近的研究证明，前mRNA剪接与成熟的mRNA从核输出到胞质有关。Cullen，B.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97：4-6；Luo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)，96：14937-17942。因此，表达水平的增加，如由hCMV IE1增强子/启动子的内含子A区域所见到的，可能是由于胞质中可翻译的mRNA的水平增加的缘故。
                              发明概要
因此，本发明提供用于表达构建物的CMV内含子A片段。这些片段在这种表达构建物中保留了增强表达水平的能力。内含子A片段的使用是需要的，尤其是当用于为包装质粒而存在大小限制的重组病毒载体时，如α病毒和腺相关病毒。因此，本发明提供一种以治疗有用量在体外和体内生产重组蛋白质的高度有效的表达系统。
因此，在一个实施例中，本发明涉及hCMV内含子A片段，其中该片段缺乏内含子A的全长序列，它含有：(a)与图1A的1-25位(含)上的邻接的核苷酸序列有至少约75％序列同一性的核苷酸序列；(b)与图1A的775-820位(含)上的邻接的核苷酸序列有至少约75％的序列同一性的核苷酸序列。此外，当该片段存在于表达构建物中时，该构建物所产生的表达水平大于相应的完全缺乏内含子A序列的构建物所产生的表达水平。在某些实施例中，所获得的表达水平至少大于相应的完全缺乏内含子A序列的构建物所获得的表达水平的2倍，或至少10倍，或至少50倍。
在另一实施例中，本发明涉及含有以下序列的内含子A片段：(a)与图1A的1-51位(含)上的邻接的核苷酸序列有至少约75％序列同一性的核苷酸序列；和(b)与图1A的741-820位(含)上的邻接的核苷酸序列有至少约75％序列同一性的核苷酸序列；其中，当该片段存在于表达构建物中时，该构建物所产生的表达水平大于相应的完全缺乏内含子A序列的构建物所产生的表达水平。在某些实施例中，所获得的表达水平至少大于相应的完全缺乏内含子A序列的构建物所获得的表达水平的2倍，或至少10倍，或至少50倍。
在另一实施例中，该内含子A片段含有图1A的1-51位(含)核苷酸序列，此序列与图1A的741-820位(含)核苷酸连接。
在又一实施例中，该内含子A片段含有图1C所述的内含子A核苷酸序列，或者是与该序列具有至少约75％的序列同一性的核苷酸序列。
在另一实施例中，该内含子A片段由图1C所述的内含子核苷酸序列组成。
在又一实施例中，本发明涉及一种hCMV内含子A片段，其中，该片段缺乏全长的内含子A序列，它含有：(a)与图1A的1-25位(含)上的邻接的核苷酸序列有至少约75％序列同一性的核苷酸序列；(b)与图1A的775-820位(含)上的邻接的核苷酸序列有至少约75％的序列同一性的核苷酸序列；其中，当该片段存在于表达构建物中时，该表达构建物将产生等于或者大于含有相应的完整的全长内含子A序列的表达构建物所产生的表达水平。
在另一实施例中，本发明涉及一种hCMV内含子A片段，其中，该片段缺乏全长的内含子A片段，它含有：(a)与图1A的1-51位(含)上的邻接的核苷酸序列有至少约75％序列同一性的核苷酸序列；和(b)与图1A的741-820位(含)上的邻接的核苷酸序列有至少约75％序列同一性的核苷酸序列；其中，当该片段存在于表达构建物中时，该表达构建物将产生等于或者大于含有相应的完整的全长内含子A序列的表达构建物所产生的表达水平。
在另一实施例中，本发明涉及重组表达构建物，该构建物含有(a)编码序列；(b)可操作性连接于该编码序列的控制元件；其中，所述控制元件含有本文所述的内含子A片段，从而该编码序列可在宿主细胞中转录和翻译。在某些实施例中，所述控制元件还含有选自SV40早期启动子、CMV启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子、RSV启动子、SRα启动子和单纯疱疹病毒启动子的启动子。具体而言，该控制元件可含有图2中460/1264核苷酸位上的hCMV立即早期(IE1)增强子/启动子区域，和含有图1A所述的821-834位(含)上的核苷酸序列的5′-UTR的外显子2。本发明还提供含有表达构建物的宿主细胞和生产重组多肽的方法。
在另一实施例中，本发明涉及含有图5B所述的序列的多核苷酸。
在结合下述详细的描述和附图之后，将更容易理解本发明的这些和其它方面。
                          附图的简要描述
图1A(SEQ ID NO：1)显示从hCMV的Towne株得到的代表性CMV IE1内含子A的序列。图1A所示的是从缺失突变体pCON3中删除掉的序列部分。剪接供体序列为黑体字，如箭头所示。剪接受体序列用下划线标记，如箭头所示。图中也指明了可能的支点。
图1B(SEQ ID NO：2)显示与野生型内含子A的3′-部分相比，对应于pCON3的删除的内含子A构建物所保留的3′-部分的寡核苷酸。
图1C(SEQ ID NO：3)显示缺失突变体pCON3的内含子A序列。
图2(SEQ ID NO：4)〔Genbank登记号M60321，Chapman等，Nuc.AcidsRes.(1991)，19：3979-3986〕显示hCMV的主要立即早期基因的5′区域的核苷酸序列，包括增强子/启动子区域。图中显示了增强子区域(～600到～1081位核苷酸)、Pol II启动子(1081-1143位核苷酸)、5′UTR的外显子1(1144-1264位核苷酸)、内含子A(1265-2088位核苷酸)和5′UTR的外显子2(2089-2096位核苷酸)。TATAA和CAAT盒以及起始启动子用方框框起来。
图3显示实施例中所述的各种内含子A缺失突变体。
图4描述由图1C和图3所示的各种缺失突变体进行的归一化的荧光素酶表达。
图5A(SEQ ID NO：5)显示实施例中使用的野生型兔β-珠蛋白基因序列。
图5B(SEQ ID NO：6)显示实施例中使用的优化的兔β-珠蛋白基因序列。
图6显示与RβG-IVSI(含有图4A所示的野生型兔β-珠蛋白基因序列)和RβG-OPTI(含有图4B所示的优化的兔β-珠蛋白基因序列)相比，由测量亲本载体pCMVkm-荧光素酶进行的p55gag表达而获得的荧光素酶表达。
图7描述实施例中所述的免疫了含有内含子A片段的各种构建物的小鼠的抗-p55gag滴度。
                          发明的详细描述
除非另有说明，否则本发明的实施将使用本领域熟练的技术人员已知的化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的方法。这些技术在文献中已经充分阐述。例如，可参见Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(第2版)；《酶学方法》(S.Colowick和N.Haplan编辑，Academic Press，Inc.)；《DNA克隆》，第I和II卷(D.N.Glover编辑)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑)；《核酸杂交》(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑)；《动物细胞培养》(P.K.Freshney编辑)；Perbal，B.，《分子克隆实践指南》。
须注意的是，除非文中有清楚的说明，否则在本说明书和所附带的权利要求书中使用的单数形式“一个”和“该”包括其复数形式。因此，例如，“一种抗原”包括两种或多种抗原的混合物，等等。
整篇文章中使用以下氨基酸缩写：
  丙氨酸：Ala(A)   精氨酸：Arg(R)
  天冬酰胺：Asn(N)   天冬氨酸：Asp(D)
  半胱氨酸：Cys(C)   谷氨酰胺：Gln(Q)
  谷氨酸：Glu(E)   甘氨酸：Gly(G)
  组氨酸：His(H)   异亮氨酸：Ile(I)
  亮氨酸：Leu(L)   赖氨酸：Lys(K)
  甲硫氨酸：Met(M)   苯丙氨酸：Phe(F)
  脯氨酸：Pro(P)   丝氨酸：Ser(S)
  苏氨酸：Thr(T)   色氨酸：Trp(W)
  酪氨酸：Tyr(Y)   缬氨酸：Val(V)
I.定义
在描述本发明时，将使用下述术语，其定义如下。
“内含子A片段”指从CMV立即早期增强子/启动子区域的内含子A片段衍生得到的片段，该片段不包括整条内含子A序列。图2显示代表性的nCMV增强子/启动子区域。完整的内含子A序列由图2的跨越1265-2088位置的小写的核苷酸和图1A的1-820位核苷酸代表。本发明的内含子A片段是全长序列有缺失的片段，该缺失可以是内部的，或者出现在该内含子A区域的5′和/或3′端，只要该区域仍起到使包括该内含子A片段的初级转录子在核中进行可靠的剪接的作用。较佳的是，“内含子A片段”包括获得高于相应的完全缺乏内含子A序列的构建物所获得的表达水平的碱基或元件的最小数目。更佳的是，由包含本发明内含子A片段的构建物产生的表达水平是没有内含子A区域的构建物的至少两倍，较佳至少大于10倍，最佳至少大于20-50倍。较佳的是，表达水平至少等于或大于(如至少两倍以上)含有完整的全长内含子A序列的相应表达构建物所产生的表达水平。通常通过制备包含测试构建物的所有元件、但要么完全缺乏内含子A序列、要么包括该全长内含子A序列的表达构建物，从而进行这种比较(参见本文的实施例)。
因此，本发明的“内含子A片段”一般包括至少5′剪接连接序列(图1A所示的1-7位核苷酸)，通常是内含子A区域的至少前25个5′核苷酸(图1A的1-25位核苷酸)，更佳是内含子A区域的至少前30个核苷酸(图1A的1-30位核苷酸)，还更佳是内含子A区域的至少前40个核苷酸(图1A的1-40位核苷酸)，更佳是内含子A区域的至少前51个核苷酸(图1A的1-51位核苷酸)，甚至是内含子A区域的前75个或更多的核苷酸，也可以是这些值之间的整数，乃至内含子A的5′区域的更多核苷酸。
此外，除了上述5′序列外，“内含子A片段”还任选地包含至少3′剪接连接序列(图1A的812-820位核苷酸)。通常，该内含子A片段将包括图1A所示的内含子A序列的至少25个3′核苷酸(图1A的796-820位核苷酸)，较佳达到图1A所示的序列的50个3′核苷酸(图1A的771-820位核苷酸)，更一般是达到70个3′核苷酸(图1A的751-820位核苷酸)，较佳至少达到80个3′核苷酸(图1A的741-820位核苷酸)，乃至3′区域的更多个核苷酸，如100-150个3′核苷酸，也可以是这些数值之间的任何整数，或者该内含子A的3′区域的更多个核苷酸。
因此，很明显的是，本发明的内含子A片段可包含各种内部缺失，如该内含子A序列的约10-750个或更多的核苷酸，较佳是约25-700或更多个核苷酸，更佳是约50-700个核苷酸，最佳是约500-680到690或更多个核苷酸缺失，或者是上述范围之间的任何整数的缺失，只要包括该内含子A片段的表达构建物如上所述相对于完全缺乏内含子A序列的相应构建物其表达增强，或者提供相对于包括完整的所述内含子A序列的相应构建物的等价的或增强的表达。
所保留的本发明内含子A片段的5′和3′区域可直接相互连接，如图1A所示，或者该内含子A片段的5′和3′区域可通过一接头序列连接。该接头序列可含有1到约400个或更多个核苷酸，或者是这些数值之间的任何整数，且可含有用于特殊的转录因子的区域，如NF1结合位点、组织特异性增强子序列(如肌肉特异性增强子)等。
一个代表性的内含子A片段序列含有图1A中1-51位上的核苷酸序列，此序列与该图中741-820位上的核苷酸连接，从而如图1所示，它们之间的52-740位核苷酸缺失。此构建物中还包含hCMV增强子/启动子区域的5′UTR的外显子2，即图1A的821-834位核苷酸。
本文所使用的“内含子A片段”包括与从任何一种hCMV株(如hCMV Towne株和hCMV AD169株)分离得到的内含子A片段具有同一性的序列，以及与参比分子(如下面所定义)基本上同源并仍如上述起作用的多核苷酸。因此，例如，图1C中所示的片段在支点上和多嘧啶系统中包含核苷酸取代基，以使这些序列与共有序列一致，如图1B和1C所示。较佳的是(但不一定)，所述支点上仍保留终止密码子，即TAA、TAG或TGA。此外，该分子剪接供体和剪接受体区域外的部分更易于改变。鉴于此，较佳是保留5′剪接连接处的5′GT，且较佳是该5′剪接连接处的前6对碱基对。还较佳的是保留3′剪接连接处的3′AG，较佳是该3′剪接连接处的三对碱基对，即CAG。这些区域中的核苷酸较佳至少有80％与图1A所示的天然序列中存在的核苷酸序列同源，但是，只要该内含子A片段保留了功能，其同源性可少些，如上所述。此外，多嘧啶系统区域较佳是所有的碱基基本上全部是T或C的区域。
术语“多肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物，这两个术语并不限于产物的最小长度。因而，肽、寡肽、二聚体、多聚体等都包括在这个定义内。全长的蛋白质及其片段都包括在这个定义内。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。
为了本发明的目的，由编码序列表达的多肽可以是用于疫苗、治疗或诊断的多肽，且可从任何几种已知的病毒、细菌、寄生虫和真菌获得，以及是任何各种肿瘤抗原。或者，表达的多肽可以是治疗用激素、转录介体或翻译介体、酶、代谢途径的中间物、免疫调节子等等。
此外，为了本发明的目的，“多肽”指包含对天然序列进行修饰如删除、添加和取代(一般仍保留其性质)，只要仍维持蛋白质的所需活性。这些修饰可以是人为的，如定点诱变，或者是偶发的，如产生该蛋白质的宿主的突变作用或PCR扩增中产生的错误。
“编码序列”或“编码”选择的多肽的序列是当其处于适当的调节序列的控制之下体外或体内被转录(对于DNA而言)和翻译(对于mRNA而言)成多肽的核酸分子。编码序列的界限由5′(氨基)末端的起始密码子和3′(羧基)末端的翻译终止密码子限定。编码序列可包括但不限于从病毒得到的cDNA、原核或真核mRNA、从病毒(如DNA病毒和逆转录病毒)得到的基因组DNA序列、或者原核DNA，以及合成的DNA序列。转录终止序列可位于该编码序列的3′端。
“核酸”分子可包括双链和单链序列，指(但不限于)从病毒得到的cDNA、原核或真核mRNA、从病毒(如DNA病毒和逆转录病毒)得到的基因组DNA序列、或者原核DNA，以及尤其是合成的DNA序列。该术语还包括任何已知的DNA和RNA的碱基类似物的序列。
“可操作性连接”指元件的排列，其中，所述成分被排成一定的形状，以便执行它们的所需功能。因而，可操作性连接于编码序列的一种给定的启动子，当存在正确的转录因子等时，能使该编码序列有效表达。该启动子不需要与该编码序列邻接，只要它起到指导该序列表达的功能即可。因而，例如，不参与翻译但转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之间，与可转录的内含子一样；并且仍可认为该启动子序列“可操作性连接”于该编码序列。
“重组子”在文中用于描述一种核酸分子，指其起源和操作与其在性质上有关的多核苷酸的全部或部分无关的基因组、cDNA、病毒、半合成或合成的多核苷酸。用来描述蛋白质或多肽的“重组子”指由重组子多核苷酸的表达产生的多肽。通常，如下文的进一步描述，感兴趣的基因被克隆，然后在转化的生物体中表达。宿主生物体在表达条件下表达该外来基因，以产生蛋白质。
“控制元件”指帮助与其连接的编码序列表达的多核苷酸序列。该术语包括启动子、转录终止序列、上游调节结构域、多腺苷酸化信号、不翻译区域〔包括5′-UTR(如hCMV增强子/启动子区域5′UTR的外显子2)和3′UTR〕、适当时还有前导序列和增强子，这些序列共同使宿主细胞中的编码序列转录和翻译。
“启动子”在本文中指能结合宿主细胞中的RNA聚合酶并启动与之可操作性连接的下游(3′方向)编码序列的转录的DNA调节区域。用于本发明的启动子序列包括以高于背景值的可检测的水平启动感兴趣的基因的转录所需的最小数量的碱基或元件。在该启动子序列中有转录启动位点以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。真核细胞启动子常常(但不总是)含有“TATAA”框和“CAAT”框。
控制序列在RNA聚合酶结合启动子序列时“指导转录”了细胞中的编码序列，并将该编码序列转录成mRNA，然后该mRNA被翻译成由该编码序列编码的多肽。
“宿主细胞”是已被转化的细胞，或者能被外源DNA序列转化的细胞。
DNA构建物的“异源”区域是与自然界中其它分子无关联的另一DNA分子中或与其连接的DNA的可鉴别片段。例如，编码除分子量为72000的hCMV立即早期分子的蛋白质以外的人的蛋白质的序列，当与hCMV IE1增强子/启动子连接时，被认为它是一条异源的序列。异源编码序列的另一例子是编码序列本身在自然界中未发现的构建物(如具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。等位变体或者天然的突变事件并不产生异源的DNA区域，如本文所述。
“可选择的标记物”指能赋予表达该标记物的细胞上一种表型，这样在适当的条件下可鉴别出该细胞。通常，可选择的标记物使转染细胞的选择以存在或缺乏抑制主要的细胞功能的化学剂或其它制剂的情况下旺盛生长的能力为基础而进行。因此，合适的标记物包括编码赋予抗药性或对药物敏感、产生颜色、或者改变经含有该可选择的标记物的核酸元件转染的那些细胞在适当的选择培养基中生长时的抗原特性的蛋白质的基因。例如，可选择的标记物包括：细胞毒性标记物和抗药性标记物，从而根据细胞在含有一种或多种细胞毒素或药物的培养基中生长的能力选择细胞；营养缺陷型标记物，通过这种标记物，可根据细胞在含有或缺乏营养成分或补充物(如胸苷和次黄嘌呤)的合成培养基上生长的能力选择细胞；代谢标记物，通过这种标记物，可根据如细胞在含有作为唯一碳源的适当的糖的合成培养基上生长的能力来选择细胞；或者是赋予细胞在生色底物上形成有色集落的能力的标记物，或者是使细胞发出荧光的标记物。代表性的可选择的标记物在下文将有更详细的描述。
“表达盒”或“表达构建物”指能指导感兴趣的序列或基因的表达的装配。该表达盒包括上述控制元件，如可操作性连接于感兴趣的序列或基因(以指导其转录)的启动子或启动子/增强子(如hCMV IE1增强子/启动子)，该表达盒还常常包括多腺苷酸化序列。表达盒还将含有上述内含子A片段以及任选的hCMV IE1增强子/启动子区域的外显子2。在本发明的某些实施例中，在此所述的表达盒可被包含在质粒构建物中。除了该表达盒的组分外，该质粒构建物还含有一种或多种选择性标记物、使该质粒构建物以单链DNA(如M13复制源)存在的信号、至少一个多克隆位点和“哺乳动物”复制源(如SV40或腺病毒复制源性)。
“转化”在本文中指将外源多核苷酸插入宿主细胞中，而不考虑插入的方法：例如，通过直接摄取、转染、感染等的转化。下文进一步描述具体的转染方法。该外源多核苷酸可维持为一种未整合的载体，例如，附加体，或者可以被整合到宿主基因组中。
“分离的”概念用于多肽时，指其所修饰的分子与该分子天然存在的整个生物体是分离且分散的，或者基本上不存在相同类型的其它生物大分子的分子。“分离的”多核苷酸指全部或部分没有通常在天然条件下与其结合的序列的核酸分子；或者指一种以其天然形式存在但与异源序列结合的序列；或者指与染色体脱离的分子。
“同源性”指两条多核苷酸或两条多肽分子部分之间的同一性百分数。当两条DNA或两条多肽序列在定义的长度内有至少约50％的序列同一性时称它们“基本同源”，该序列同一性较佳至少约为75％、更佳至少约为80-85％(80、81、82、83、84、85％)、尤其佳至少约为90％、最佳至少约为95-98％(95、96、97、98％)或者更高，或者是50-100％范围中的任一整数。在本文中，基本同源也指与特定的DNA或多肽序列完全相同的序列。
通常，“同一性”指两条多核苷酸或多肽序列上准确的核苷酸对核苷酸或者氨基酸对氨基酸对应。通过排列两个分子的序列直接比较它们的序列信息，计算两条排列的序列间匹配的准确数量，将其除以最短序列的长度，然后乘以100，从而可得到同一性百分数。在此分析中可辅助使用易于获得的计算机程序，如ALIGH、Dayhoff、M.O.，《蛋白质序列和结构图谱集》〔Atlas of Protein Sequenceand Structure、M.O.Dayhoff编辑，5 Suppl.，3：353-358，National Biomedical ResearchFoundation，Washington，DC〕，它适用于Smith和Waterman分析肽用的局部同源性算法(Advances in Appl.Math.， 2：482-489，1981)。可从Wisconsin SequenceAnalysis Package(第8版，从Genetics Computer Group，Madison，WI获得)获得测定核苷酸序列同一性的程序，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也依赖于Smith和Waterman算法。使用制造者推荐的和上述Wisconsin SequenceAnalysis Package所述的默认参数可容易地使用这些程序。例如，可使用Smith和Warerman的同源性算法的默认计分表和6个核苷酸位置的间隔罚分(gap penalty)测定具体的核苷酸序列与参比序列的同一性百分数。
本发明建立同一性百分数的另一方法是使用版权属于爱丁堡大学、由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发、由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)发行的MPSRCH程序包。Smith-Waterman算法可在这套程序包中使用，其中，在计分表中使用默认参数(例如，gap open penalty＝12，gap extension penalty＝1，gap＝6)。从数据产生的“匹配”值反映出“序列同一性”。计算序列间的同一性百分数或相似性百分数的其它合适的程序在本领域中一般都是已知的，例如，另一种排列程序是BLAST，可使用默认参数。例如，可使用下述默认参数的BLASTN和BLASTP：genetic code＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50 sequences；sort by＝HIGH SCORE；Databases＝non-redundant，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDStranslations+Swiss Protein+Spupdate+PIR。在http：//www.ncbi.nim.gov/cgi-bin/BLAST网址上可查到这些程序的详细描述。
或者，在各同源区域之间形成稳定的复式结构的条件下进行多核苷酸杂交，接着用单链特异性核酸酶消化，然后测定消化的片段的大小，从而测出同源性。在如(对具体的体系所定义的)严格条件下进行的Southern杂交试验中，可鉴别基本同源的DNA序列。确定适当的杂交条件在本领域熟练技术人员所掌握的知识之内。例如，参见Sambrook等人，同上；《DNA克隆》，同上；《核酸杂交》，同上。
II.实施本发明的方式
在详细描述本发明之前，应理解，本发明并不限于所述的特殊制剂或方法参数，它们当然是可以改变的。还应理解，本文所使用的术语仅仅是为了描述具体的实施例，不应认为它们限定了本发明。
虽然可使用与本发明所述的组合物和方法类似或等价的大量组合物和方法，但是，本文所述是优选的材料和方法。
如上所述，本发明是以以下发现为基础：具有新颖的hCMV内含子A片段的情况相对于缺乏内含子A序列的情况能增强下游(3′)序列的表达水平，或者至少提供与使用完整的全长内含子A序列所获得的表达相当的水平。如上所述，获得内含子A序列的hCMV IE1增强子/启动子是已知最强的增强子/启动子之一，且在大范围的细胞类型中活跃。参见，例如Chapman等，Nuc.Acids Res.，(1991)，19：3979-3986；和美国专利5688688。使用从此区域获得的活性片段可有效减少表达特殊的编码序列的整个质粒大小。当使用大编码序列和/或其包装大基因的能力有限的病毒载体时，这是特别有用的。此外，构建物整体大小的减少可有效地增强表达效率。因此，本发明的内含子A片段令人惊讶地保留了使蛋白质在体外和体内高水平表达的能力，而且，在一些例子中，还提供了比使用完整的hCMV IE1内含子A序列的载体更高的表达。如实施例中所示，这些高水平的表达已提供了与亲本载体诱导的免疫反应是可比的甚或更好的免疫反应。
如上所述，用于本文的内含子A片段将保留该内含子A区域的至少最初7个核苷酸，较佳该内含子A区域的至少最初25个核苷酸(参见，显示代表性内含子A序列的图1A)。通常，本发明的内含子A片段将保留该内含子A区域的至少前30个核苷酸(图1A的1-30个核苷酸)，通常是内含子A区域的至少前40个核苷酸(图1A的1-40位核苷酸)，更佳是该内含子A区域的至少前51个核苷酸(图1A的1-51个核苷酸)，甚至是该内含子A区域的前75个或更多个核苷酸。因此，其5′区域可包括25、26、27、28、29、30……50、51、52、53、54、55……70、71、72、73、74、75……85、86、87或更多个5′核苷酸，等。明显的是，上述任何数量的核苷酸，以及在所具体指出的数量范围之内的核苷酸都包括在本文之中，只要含有该内含子A片段的表达构建物如上述起作用即可。
该内含子A片段将任选地包含足量的内含子A的3′区域，以起到本文所述的作用。通常，该内含子A片段将包含至少3′剪接连接序列(图1A的815-820位核苷酸)，较佳的是图1A所示的内含子A序列的至少25个3′核苷酸(图1A的796-820位核苷酸)，较佳达到图1A所示的序列的50个3′核苷酸(图1A的771-820位核苷酸)，更一般是达到70个3′核苷酸(图1A的751-820位核苷酸)，较佳至少达到80个3′核苷酸(图1A的741-820位核苷酸)，甚或是3′区域的更多个核苷酸，如100-150个3′核苷酸，也可以是这些数值之间的任何整数，或者该内含子A的3′区域的更多个核苷酸。因此，该内含子A片段的3′区域可包含50、51、52、53、54、55……70、71、72、73、74、75……85、86、87……90、92、93、94、95、96……110、111、112等等或更多个该内含子A区域的3′核苷酸。明显的是，上述任何数量的核苷酸，以及在所具体指出的数量范围之内的核苷酸都包括在本文之中。
本发明内含子A片段的5′和3′保留区域可直接相互连接，像该内含子A序列内部可有缺失那样。这种缺失可包括如完整的内含子A区域中有10-750个或更多个碱基对、较佳约300-700个碱基对、最佳约500-700个碱基对缺失。如图1A所示，一个优选的片段包含有内部约688个碱基对缺失。因此，此片段包含图1A的1-51位上的核苷酸序列，此序列直接与该图中的741-834位上的核苷酸连接，因而包含该内含子A的52-740位核苷酸缺失，如图1A所示。图1A的821-834位核苷酸代表5′UTR的外显子2。图3显示内含子A有55-661个碱基对缺失的各种内含子A片段构建物。
或者，内含子A片段的5′和3′区域可通过接头序列连接。该接头序列可含有1到约400个或更多个核苷酸，较佳是10-100个核苷酸，或者这些数值之间的任何整数，它可含有增强子区域、特殊的转录因子区域，如NF1结合位点等等。
可使用适当的探针，从CMV基因组库以及含有该内含子A区域的质粒分离得到本发明的内含子A片段，并将其克隆，以今后使用。类似地，在已知的内含子A序列的基础上，可采用多核苷酸合成的已知的方法合成产生该序列〔参见，如Edge，M.D.，Nature，(1981)，292：756；Nambair等，Science，(1984)，223：1299；Jay，Ernest，J.Biol.Chem.，(1984)，259：6311〕。关于hCMV Towne株中的内含子A区域的序列和结构，可参见如Chapman等，Nuc.Acids Res.，(1991)，19：3979-3986；关于hCMV AD169株的相应区域的描述，可参见Akfigg等，VirusRes.，(1985)，2：107-121；还可参见本文的图1A和1C。
用于获得本发明的内含子A片段的一种特别简便的方法是，使用本领域已知的技术，以及本文实施例中所述的方法，从已知含有该内含子A的任何各种质粒中分离出该内含子A(单独的，或者与其余的hCMV增强子/启动子区域结合)。具体而言，可从质粒pCMV6中获得hCMV内含子A，如Chapman等，Nuc.Acids Res.，(1991)，19：3979-3986和美国专利5688688所述。一旦获得，可对该内含子A序列进行操作，以获得其缺失突变体，如使用限制酶将该内含子A序列的一部分切除。在本领域通常所理解的条件下，通过用合适的限制酶(或多种酶)(在其制造商所提供的具体指导下)进行位点特异性DNA切割。例如，参见New EnglandBiolabs，Product Catalog。例如，已从各种各样的原核生物中分离得到具有各种特性的限制性内切核酸酶，这些酶在本领域中也是周知的。例如，可参见Sambrook等，同上。适当的限制性内切核酸酶的选择依赖于具体的目标序列。本领域熟练的技术人员将容易地认识到用于所需序列的正确的限制酶。如果需要，可采用标准的技术，通过聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳将切割的片段进行大小分离。关于大小分离的一般描述，可参见Sambrook等，同上。然后可采用已知的技术，将内含子A序列连接到其它控制序列上，如适当的启动子(如果分离出的该内含子A没有剩余的hCMV IE1增强子/启动子区域)，以及所需的编码序列。
可采用本领域已知的技术优化该内含子A片段的序列，以用于特殊的表达系统中。此外，该片段序列的一部分可以发生改变，如删除或取代可能的支点，以及分子的其它区域。代表性的内含子A的这些区域显示在图1A中。内含子A片段的一个特别优选的序列显示在图1C中。如实施例中所述，通过首先将该内含子A区域的大部分3′序列删除，然后采用合成寡核苷酸的方式，用优选的序列取代该内含子A区域的最后80个核苷酸，然后加入5′-UTR区域的外显子2，从而获得这种片段。
该优选的序列是以出版的支点和多嘧啶系统共有序列为基础。或者，可采用本领域已知的技术获得诱变的序列，如定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。参见，如Sambrook，同上。
一旦获得，可使用该片段来指导所需蛋白质在各种细胞类型中的转录。可方便地使顺式作用控制元件与该内含子A片段结合，以优化与它们相关的编码序列的表达。如果在该系统中产生的蛋白质是自然分泌的，或者被工程加工成的，则转化的细胞可长时间产生蛋白质产物，从而进一步增加产量。该系统使所需的蛋白质以可靠的翻译后修饰、较纯的形式和经济实用的量以可靠的构型进行生产。
因此，本发明的内含子A片段将可用于表达构建物中，以表达各种物质，包括作为抗生素和抗病毒剂的肽，如用于疫苗和诊断剂的免疫原性肽；重组抗体；抗肿瘤剂；免疫调节剂，如任何各种细胞因子，包括白介素-1、白介素-2、白介素-3、白介素-4和γ-干扰素；肽激素，如胰岛素、胰岛素原、生长激素、GHRH、LHRH、EGF、促生长素抑制素、SNX-111、BNP、促胰岛素、ANP、FSH、LH、PSH和hCG、性腺甾体激素(雄激素、雌激素和黄体酮)、促甲状腺素、抑制素、缩胆囊素、ACTH、CRF、强啡肽、内啡肽、内皮缩血管肽、纤连蛋白片段、神经节肽、胃泌素、促胰岛素、胰高血糖素、GTP-结合蛋白片段、鸟苷蛋白、白细胞激肽(leukokinin)、爪蟾抗菌肽、肥大脱粒肽、皮抑菌肽、系统素、神经调节肽、神经降压肽、胰抑制素、胰多肽、P物质、分泌素、胸腺素等；和生长因子，如PDGF、EGF、KGF、IGF-1和IGF-2、FGF等。
更具体而言，用于疫苗和诊断剂的蛋白质可以是病毒、细菌、真菌或寄生虫来源的蛋白质，包括但不限于由人和动物病毒编码并可对应于结构或非结构蛋白质的蛋白质。例如，本发明将可用于从疱疹病毒家族重组生产各种蛋白质，包括从单纯疱疹病毒(HSV)1型和2型衍生得到的蛋白质，如HSV-1和HSV-2糖蛋白gB、gD和gH；从水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)得到的蛋白质，包括CMV gB和gH；和从其它人的疱疹病毒得到的蛋白质，如HHV6和HHV7。〔参见，如Chee等，《巨细胞病毒》(J.K.McDougall编辑，Spfinger-Verlag 1990)，第125-169页，关于巨细胞病毒的蛋白质编码内容的综述；McGeoch等，J.Gen.Virol.，(1998)，69：1531-1574，关于各种HSV-1编码的蛋白质的讨论；美国专利5171568，关于HSV-1和HSV-2 gB和gD蛋白质和编码这些蛋白质的基因的讨论；Baer等，Nature，(1984)，310：207-211，关于EBV基因组中蛋白质编码序列的鉴别；和Davison和Scott，J.Gen.Virol.，(1986)，67：1759-1816，关于VZV的综述〕。
还可方便地将编码肝炎病毒家族的蛋白质的多核苷酸序列用于本文所述的技术，所述病毒包括A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、δ肝炎病毒(HDV)、E型肝炎病毒(HEV)和G型肝炎病毒(HGV)。以实施例的方式，HCV的病毒基因组序列是已知的，还已知获得该序列的方法。参见，如国际出版物WO 89/04669；WO 90/11089和WO 90/14436。该HCV基因组编码几种病毒蛋白质，包括E1(也称为E)和E2(也称为E2/NSI)。〔参见，Houghton等，Hepatology，(1991)，14：381-388，关于HCV蛋白(包括E1和E2)的讨论〕。编码这些蛋白质及其抗原片段的序列可用于本系统。类似地，HDV的δ-抗原的编码序列也是已知的(参见，如美国专利5378814)，此序列也可方便地用于本系统。此外，从HBV衍生得到的抗原，如核心抗原、表面抗原(sAg)、以及前表面(presurface)序列)preS1和preS2，以前称为preS)，以及这些抗原的组合，如sAg/preS1、sAg/preS2、sAg/preS1/preS2和preS1/preS2也可用于本文。参见，如“HBV疫苗——从实验室到临床：一个案例研究”，Mackett，M.和Williamson，J.D.，《人疫苗和接种》，Human Vaccines and Vaccination，第159-176页，关于HBV结构的讨论；Beames等，J.Virol.，(1995)，69：6833-6838，Birnbaum等，J.Virol.，(1990)，64：3319-3330；和Zhou等，J.Virol.，(1991)，65：5457-5464。
编码从其它病毒得到的蛋白质的多核苷酸序列也可用于本表达系统中，所述蛋白质如(无限制)从小RNA病毒科的成员得到的蛋白质(如脊髓灰质炎病毒等)；杯状病毒科；批膜病毒科(如风疹病毒、登革病毒等)；黄病毒科；冠状病毒科；呼肠病毒科；双RNA病毒科；弹状病毒科(如狂犬病病毒等)；线状病毒科(Filoviridae)；副粘病毒科(如腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等等)；正粘病毒科(如A。B和C型流感病毒等)；本雅病毒科；沙粒病毒科；逆转录病毒科〔如HTLV-I、HTLV-II；HIV-1，也称为HTLV-III、LAV、ARV、hTLR等，包括但不限于从分离物HIVIIIb、HIVSF2、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN得到的抗原；HIV-1CM235、HIV-1US4；HIV-2；尤其是猿免疫缺陷病毒(SIV)。参见，如《病毒学》第三版(W.K.Joklik编辑，1988)；《基础病毒学)》，第2版(B.N.Fields和D.M.Knipe编辑，1991)，关于这些和其它病毒的描述。
例如，本发明可用于表达构建物，以表达编码从上述任一HIV分离物获得的gpl20包膜蛋白的基因。已知并报道了用于多种HIV-1和HIV-2(包括HIV的各种遗传亚型的成员)分离物的gpl20序列〔参见，如Myers等，Los Alamos Database，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，New Mexico(1992)；Myers等，《人逆转录病毒和AIDS》1990，Los Alamos，New Mexico：Los Alamos NationalLaboratory；和Modrow等，J.Virol.，(1987)，61：570-578，关于各种HIV分离物的包膜基因序列的比较〕，并且，从任一这种序列衍生得到的序列可用在本发明方法中。此外，本发明同样可适用于从任何各种HIV分离物衍生得到的其它免疫原性蛋白质，包括任何各种包膜蛋白如gpl60和gp41、gag抗原如p24gag和p55gag，以及从pol区域衍生得到的蛋白质。本发明还可用于表达流感病毒蛋白质的表达构建物。具体而言，A型流感的包膜糖蛋白HA和NA是用于产生免疫反应的特别感兴趣的蛋白。A型流感的各种HA亚型已被鉴定〔Kawaoka等，Virology，(1990)，179：759-767；Webster等，“A型流感病毒中的抗原性变化”，第127-168页，P.Palese和D.W.Kingsbury(编辑)，《流感病毒的遗传学》，Springer-Verlag，纽约〕。因此，编码从任何这些分离物中衍生得到的蛋白质的基因序列也可用于本文所述的重组生产技术。
此外，本文所述的片段提供了一种生产用于治疗各种恶性癌症的蛋白质的手段。例如，本发明的系统可用于生产各种肿瘤抗原，这些抗原反过来可用于引起针对该癌症特异的具体蛋白质的体液和细胞介导的免疫反应，如激活的致癌基因、胎儿抗原或者激活标记物。这些肿瘤抗原包括各种MAGE(黑素瘤相关的E抗原)中的任一种，包括MAGE1、2、3、4等〔Boon，T.，Scientific American(1993年3月)：82-89〕；各种酪氨酸酶中的任一种；MART 1(由T细胞识别的黑素瘤抗原)、突变体ras；突变体p53；p97黑素瘤抗原；CEA(癌胚抗原)，以及其它。
很容易理解，本发明可用于生产各种用于预防、治疗和/或诊断各种疾病的蛋白质。
可采用重组方法获得编码上述分子的多核苷酸序列，如通过从表达该基因的细胞筛选cDNA和基因组文库，或者通过从已知含有该基因的载体中获得该基因。此外，可采用标准的技术，如cDNA或基因组DNA的酚抽提和PCR，直接从含有所需基因的细胞或组织中分离出所需基因。参见，如Sambrook等，同上，关于用于获得和分离DNA的技术的描述。也可采用合成而非克隆的方法生产感兴趣的基因。可将核苷酸序列设计成具有所需的具体氨基酸序列的适当的密码子的序列。通常，人们根据要表达序列的宿主选择优选的密码子。可将采用标准方法制得的重叠的寡核苷酸装配成完整的序列，然后将其装配到完整的编码序列中。参见，如Edge，Nature，(1981)，292：756；Nambair等，Science，(1984)，223：1299；Jay等，J.Biol.Chem.，(1984)，259：6311。
还可在本发明表达系统中使用标记物和扩增子。已知各种标记物，这些标记物用于选择转化的细胞系，通常包括其表达在适当的选择培养基中培养细胞时，在转化的细胞上赋予可选择的表型的基因。用于哺乳动物细胞系的这类标记物包括，例如细菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因，可在含有霉酚酸和黄嘌呤的培养基中使用此基因进行选择〔Mulligan等(1981)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：2072-2076〕；和氨基糖苷磷酸转移酶基因(确定了一种使新霉素/卡那霉素衍生物的抗细菌作用失活的蛋白质)，这种基因可在含有新霉素衍生物如G418的培养基中进行选择，这类衍生物通常对哺乳动物细胞是毒性的〔Colbere-Garapin等(1981)，J.Mol.Biol.，150：1-14〕。用于其它表达系统的有用的标记物对于本领域熟练的技术人员来说也是已知的。可采用本领域已知的技术，从市售的质粒获得这些和其它的可选择的标记物。参见，如Sambrook等，同上。
也可通过在编码序列附近安插可扩增的基因，如小鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)基因，从而增强表达。然后可根据dhfr缺陷型细胞中的氨甲蝶呤抗性选择细胞。参见，如Urlaub等(1980)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216-4220；Ringold等(1981)，J.Mol.and Appl.Genet.，1：165-175。包含了标记物和扩增子的构建物也可用于本发明的表达载体中，如美国专利6096505中各种EMCV-DHFR/Neo构建物中的任一种。
还可存在转录终止序列和多腺苷酸化序列，这些序列位于编码序列的翻译终止密码子的3′端。转录终止子/多腺苷酸化信号包括但不限于从SV40中获得的序列，如Sambrook等(同上)所述，以及牛生长激素终止子序列。
在本发明的表达构建物中还存在的将是启动子区域。启动子可以是同源的hCMV IE1启动子，此启动子通常与获得本发明的片段的完整、全长内含子A序列连接；启动子也可以是异源的CMV IE1启动子(如从不同的CMV株得到)，或者甚至是非CMV-IE1启动子。启动子的选择将依赖于用于表达的细胞类型，对于本领域熟练的技术人员来说也是易于确定的。例如，用于哺乳动物细胞表达的典型的启动子包括SV40早期启动子、上述CMV启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)、RSV启动子、SRα启动子、单纯疱疹病毒启动子、组织特异性启动子等。用于本文所述的构建物的一个特殊的启动子是从图2所述的hCMV IE1增强子/启动子区域衍生得到的启动子，如图2中大约460-1264位的核苷酸，或者是此区域的功能部分。其它非病毒启动子，如从鼠金属硫蛋白基因衍生得到的启动子，也可用于哺乳动物表达。昆虫细胞表达系统(典型的是杆状病毒)通常包括多角体蛋白启动子。用于细菌系统的启动子包括从糖〔如半乳糖、乳糖(lac)，Chang等，Nature，(1977)，198：1056；以及麦芽糖〕代谢酶衍生得到的启动子序列；从生物合成酶如色氨酸(trp)衍生得到的启动子序列〔Goeddel等，Nuc.Acids Res.，(1980)，8：4057；Yelverton等，Nucl.Acids Res.，(1981)，9：731；美国专利4738921；EPO出版物036776和121775〕；b-内酰胺酶(bla)启动子系统〔Weissmann(1981)，“干扰素的克隆和其它失策”，Interferon 3(I.Gresser编辑)〕；λ噬菌体PL〔Shimatake等，Nature，(1981)，292：128〕；T5启动子(美国专利4689406号)；杂交启动子如tac、杂交trp-lac启动子〔Amann等，Gene，(1983)，25：167；de Boer等，Proc.Natl.Acad.Sci.，(1983)，80：21〕。用于酵母表达系统的启动子包括，如从编码代谢途径中的酶的序列得到的启动子，如乙醇脱氢酶(ADH)(EPO出版物284044)、烯醇化酶、葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸变位酶和丙酮酸激酶(PyK)(EPO出版物329203)启动子。用于这类系统的其它启动子包括从编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因衍生得到的启动子〔Myanohara等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1983)，80：13〕，以及合成的启动子，如通过将一种酵母启动子的UAS序列与另一种酵母启动子的转录激活区域融合，产生合成的杂交启动子。这些杂交启动子的例子包括与GAP转录激活区域连接的ADH调节序列(美国专利4876197和4880734)，以及由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调节序列与糖酵解酶基因如GAP或PyK的转录激活区域结合而组成的启动子(EPO出版物164556)。可采用本领域已知的技术，从市售的质粒获得这些和其它启动子。参见，如Sambrook等，同上。
构建表达载体，以使特殊的编码序列与该内含子A片段以及适当的调节序列位于该载体中，该编码序列相对于该控制序列的位置和取向为使该编码序列在该控制序列的“控制”之下进行转录的位置和取向(即，在该启动子上结合DNA分子的RNA聚合酶转录该编码序列)。对编码感兴趣的分子的序列进行修饰可有利于获得这种末端。例如，在一些例子中，可能需要修饰该序列，以使它以适当的取向连接于启动子和其它控制序列，即维持阅读框。可在将启动子序列和其它调节序列插入载体中之前，先使它们与编码序列连接。或者，可直接将编码序列克隆到已含有内含子A片段和适当的限制位点的表达载体中。
还可能需要生产感兴趣的基因的突变体或类似物。通过将编码感兴趣多肽的序列的一部分删除、通过插入一条序列、和/或通过将该序列中的一个或多个核苷酸取代，可制备感兴趣的多肽的突变体或类似物。修饰核苷酸序列的技术，如定点诱变等对于本领域熟练的技术人员来说是已知的。参见，如Sambrook等，同上；Kunkel，T.A.，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1985)，82：448；Geisselsoder等，(1987)，BioTechniques，5：786；Zoller和Smith(1983)，Methods Enzymol.，100：468；Dalbie-McFarland等(1982)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：6409。
一旦装配好这些表达构建物，可将它们用于各种系统中，包括昆虫、哺乳动物、细菌、病毒和酵母表达系统，所有这些系统都是本领域已知的。采用本领域已知的各种基因传送技术，使含有感兴趣的核苷酸序列的核酸分子可稳定地整合到宿主基因组中，或者使它们在适当的宿主细胞中维持在稳定的附加型元件上。参见，如美国专利5399346。
例如，昆虫细胞表达系统，如杆状病毒系统，对于本领域熟练的技术人员来说是已知的，并在Summers和Smith，Texas Agriculture Experiment Station BulletinNo.1555(1987)中有描述。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法是以试剂盒形式市售获得的，尤其是从Invitrogen，San Diego CA(“MaxBac”试剂盒)购得的。类似地，细菌和哺乳动物细胞表达系统也是本领域已知的，在如Sambrook等(同上)中有描述。酵母表达系统在本领域中也是已知的，在如《酵母遗传工程》(Barr等编辑，1989，Butterworths，伦敦)中有描述。
使用上述系统的许多适当的宿主细胞也是已知的。例如，哺乳动物细胞系在本领域中是已知的，包括从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的无限增殖的细胞系，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Hela细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)。人胚胎肾细胞、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)、Madin-Darby牛肾(“MDBK”)细胞，以及其它。类似地，细菌宿主如大肠杆菌、枯草芽胞杆菌和链球菌属也可用于本发明的表达构建物。用于本发明的酵母宿主包括(尤其是)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)。用于杆状病毒表达载体的昆虫细胞尤其包括埃及伊蚊(Aedesaegypti)、苜蓿丫纹夜蛾(Autographa califomica)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichophtsia ni)。
可采用各种方法将表达构建物传送给细胞。这些方法包括DEAE葡聚糖-介导的转染、磷酸钙沉淀、聚赖氨酸-或聚鸟氨酸介导的转染、或者使用其它不溶的有机盐(如磷酸锶、硅酸铝包括皂土和高岭土、氧化铬、硅酸镁、滑石粉等)进行的沉淀。其它有用的转染方法包括电穿孔、超声穿孔(sonoporation)、原生质体融合、脂质体、类肽传送或微注射。参见，如Sambrook等，同上，关于转化感兴趣的细胞的技术的讨论。
例如，表达构建物可在传送给细胞之前先被包装在脂质体中。通常，使用能稳定地结合或俘获和维持核酸的脂质体形完成脂质包囊。浓缩的DNA与脂质制品的比值可以变化，但是通常大约为1∶1(mg DNA：微摩尔脂质)，或者脂质可多一些。关于脂质体作为传送核酸的载体的综述，可参见Hug和Sleight，Biochim.Biophys.Acta.，(1991)，1097：1-17；Straubinger等，《酶学方法》(1983)，第10卷，第512-527页。
本发明使用的脂质体制品含有阳离子(正电荷)、阴离子(负电荷)和中性制品，特别优选阳离子脂质体。阳离子脂质体易于获得。例如，从GIBCO BRL，GrandIsland，NY〔还可参见Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)，84：7413-7416〕获得商标为Lipofectin的N〔1-2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三乙基铵(DOTMA)脂质体。可从商业上得到的其它脂质体包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。可使用本领域周知的技术，由易于获得的材料制备其它阳离子脂质体。例如，可参见Szoka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)，75：4194-4198；描述DOTAP〔1，2-二(油酰氧基)-3-(三甲基铵基)丙烷〕脂质体的合成的PCT出版物第WO 90/11092号。可采用本领域已知的方法制备各种脂质体-核酸复合体。例如，可参见Straubinger等人，METHODS OF IMMUNOLOGY(1983)，第101卷，第512-527页；Szoka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)， 75：4194-4198；Papahadjopoulos等人，Biochim.Biophys.Acta(1975)， 394：483；Wilson等人，Cell(1979)， 17：17；Deamer和Bangham，Biochim.Biophys.Acta(1976)， 443：629；Ostro等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1977)， 76：836；Fraley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)， 76：3348；Enoch和Strittmatter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)， 76：145；Fraley等人，J.Biol.Chem.(1980)， 225：10431；Szoka和Papahadjopoulos，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)， 75：145；和Schaefer-Ridder等人，Science(1982)， 215：166。
也可将DNA传送到与Papahadjopoulos等人〔Biochim.Biophys.Acta(1975)，394：483-491〕以及美国专利第4663161号和第4871488号中所述的类似的蜗状脂质组合物中。
根据所选择的表达系统和宿主，通过用上述表达载体转化的宿主细胞在使该蛋白质表达的条件下生长而生产这些分子。然后从宿主细胞中分离出表达的蛋白质，并纯化。如果表达系统将该蛋白质分泌到生长培养基中，可直接从该培养基中纯化该产物。如果不分泌，可从细胞裂解物中分离。适当的生长条件和回收方法的选择是本领域熟练的技术人员已知的。例如，一旦表达，可采用本领域已知的任何技术分离和纯化该产品，这些技术包括色谱法，如HPLC、亲和层析、离子交换层析、尺寸排阻等；电泳；密度梯度离心；溶剂抽提等等。参见，如《蛋白质纯化原理和实践》第2版(Robert K.Scopes编辑，1987)；和《蛋白质纯化方法，一种实用方法》(E.L.V.Harris和S.Angal编辑，1990)。
还可采用标准的基因传送方案，将本发明的表达构建物用于核酸免疫和基因治疗。基因传送方法在本领域中是已知的。参见，如美国专利5399346、5580859、5589466。可直接将基因传送给脊椎动物对象，或者体外传送给从该对象得到的细胞，然后将该细胞再移植到该对象中。
已开发了大量的基于病毒的系统，用它们将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒可给基因传送系统提供一个适宜的平台。可使用本领域已知的技术将经选择的基因插入载体中，然后将所得载体包装到逆转录病毒粒子中。然后分离出该重组病毒，将其在活体内或离体条件下传送到受检对象的细胞中。已描述了大量的逆转录病毒系统〔美国专利第5219740号，Miller和Rosman，BioTechniques(1989)， 7：980-990；Miller，A.D.，Human Gene Therapy(1990)， 1：5-14；Scarpa等人，Virology(1991)， 180：849-852；Burns等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)， 90：8033-8037；和Boris-Lawrie和Temin，Cur.Opin.Genet.Develop.(1993)， 3：102-109。简言之，可容易地从多种多样的逆转录病毒中构建本发明的逆转录病毒基因传送载体，包括如B、C和D型逆转录病毒以及泡沫病毒和慢病毒如FIV、HIV、HIV-1、HIV-2和SIV〔见《RNA肿瘤病毒》，第二版，Cold Spnng Harbor Laboratory，1985)。可从保管单位或收藏单位如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”，10801 University Blvd，Manassas，VA 20110-2209)容易地获得这些逆转录病毒，或者可采用通常可获得的技术，从已知的来源分离得到。
也已经描述了大量的腺病毒载体。与整合到宿主基因组中的逆转录病毒不同，腺病毒始终存在于染色体外，这样使得它产生插入性突变有关的风险最小化〔Haj-Ahmad和Graham，J.Virol.(1986)， 57：267-274；Bett等人，J.Virol.(1993)，67：5911-5921；Mittereder等人，Human Gene Therapy(1994)，5：717-729；Seth等人，J.Virol.(1994)， 68：933-940；Barr等人，Gene Therapy(1994)， 1：51-58；Berkner，K.L.，BioTechniques(1988)， 6：616-629；和Rich等人，Human GeneTherapy(1993)， 4：461-476〕。
此外，已开发出各种腺相关病毒(AAV)载体系统用于基因传送。可采用本领域已知的技术容易地构建AAV载体。参见，如美国专利5173414和5139941；国际出版物WO 92/01070(1992年1月23日出版)和WO 93/03769(1993年3月4日出版)；Lebkowski等，Molec.Cell.Biol.(1998)，8：3988-3996；Vincent等，Vaccines90(1990)(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter，B.J.，Current Opinion inBiotechnology(1992)，3：533-539；Muzyczka，N.，Current Topics in Microbiol.andImmunol.，(1992)，158：97-129；Kotin，R.M.，Human Gene Therapy(1994)，5：793-801；Shelling和Smith，Gene Therapy(1994)，1：165-169；和Zhou等，J.Exp.Med.(1994)，179：1867-1875。
也可实用分子共轭载体用于基因传送，如Michael等，J.Biol.Chem.，(1993)，268：6866-6869和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)，89：6099-6103中所述的腺病毒嵌合载体。
α病毒属的成员也可用于传送感兴趣基因的病毒载体，如但不限于从新德比斯病毒、塞姆利基森林病毒和VEE衍生得到的载体。关于用于实施本方法的新德比斯病毒衍生的载体的描述，可参见Dubensky等，J.Virol.，(1996)，70：508-519，和国际出版物WO 95/07995和WO 96/17072。
还可以不使用病毒载体而传送本发明的表达构建物。例如，可直接传送构建物，或者在传送给对象或其衍生的细胞之前，先将构建物包装在脂质体中，如上文所述。
也可将表达构建物与颗粒载体包囊，或者使其吸附在颗粒载体上，或者使其与颗粒载体结合。这类载体存在针对免疫系统的多个拷贝的选择分子，能促进这些分子在局部淋巴结的俘获和滞留。这些颗粒可被噬菌体吞噬，并且可通过细胞因子释放而增强抗原递呈。颗粒载体的例子包括从聚甲基甲基丙烯酸酯聚合物衍生得到的载体，以及从聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)衍生得到的微粒，已称为PLG。参见，如Jeffery等，Pharm.Res.，(1993)，10：362-368；和MeGee等，J.Microencap.(1996)。
此外，其它微粒系统和聚合物也可用于体内或体外传送表达构建物。例如，诸如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺之类的聚合物以及这些分子的结合物可用于转移感兴趣的核酸。类似地，DEAE葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀或使用其它不溶的无机盐(如磷酸锶、硅酸铝包括皂土和高岭土、氧化铬、硅酸镁、滑石粉等等)进行的沉淀作用也可用于本发明系统。参见，如Felgner，P.L.，Advanced Drug Delivery Reviews，(1990)，5：163-187，关于用于基因转移的传送系统的综述。
此外，使用颗粒载体如金和钨的生物弹道(biolistic)传送系统尤其可用于传送本发明的表达构建物。用颗粒包涂要传送的构建物，通常在减压下使用从“基因枪”卸下的枪粉末加速到高速率。关于这种技术的描述和所使用的装置，可参见如美国专利4945050、5036006、5100792、5179022、5371015和5478744。
用于实施本发明的菌株的保藏
从美国典型培养物保藏中心(10801 University Boulevard，Manassas，VA)获得下列菌株的生物纯培养物的保藏物。所表示的保藏号是根据《布达佩斯条约》成功地进行生存测试后所给予的，并且已经付了所需的费用。这确保了存活的培养物在保藏日起30年内维持存活。根据《布达佩斯条约》的条款从ATCC获得这些生物体，ATCC确保根据35U.S.C.§122和根据此条款的委员会规章(包括特别是与886 OG 638有关的37C.F.R.§1.12)所授权的美国专利和商标委员会测定的微生物的后代的永久和无限制的可获得性。在授予专利权后，关于公众获得所保藏的该培养物的所有限制最终都被取消。
这些保藏物仅仅是为了给本领域熟练的技术人员提供方便，而并不是承认根据35U.S.C.§122条款的规定保藏是必需的。这些基因的核酸序列以及它们所编码的分子的氨基酸序列在与本文所述任何冲突的事件中都得到控制。要制备、使用或销售该保藏材料的话，需要获得许可，现在并未授予许可。
质粒                保藏日               ATCC号
pCON3               2000年9月27号        PTA-2504
III.试验
下面是实施本发明特殊实施例的例子。这些实施例仅仅是阐述性的，无论如何都不能认为它们限定了本发明的范围。
已尽力确保所使用的数值(如量、温度等)的正确性，但是当然应当考虑到一些实验误差和偏差。
从市场上购得限制酶和修饰酶以及其它用于DNA操作的试剂，并根据制造商的建议使用。在克隆DNA片段时，除非另有说明，否则所有的DNA操作都根据标准的方法进行。参见，如Sambrook等，同上。
                            实施例1
               含有内含子A片段的表达构建物的生产
制备一组13个表达构建物，它们在内含子A核心区域中的第54-688位的核苷酸被删除，通过剪接供体和分支位点结合。这些表达构建物与荧火虫(Photinuspyralis)荧光素酶基因连接，或者与密码子优化的HIV p55gag基因连接〔Zur Megede等，J.Virol.，(2000)，74：2628-2635〕。
通过用重建内含子A的最后80个核苷酸(具有优化的支点和聚嘧啶系统序列，如图1B所示)的合成寡核苷酸(图1B)与5′-UTR的外显子2(图1A的821-834位核苷酸)一起替换从质粒pCMVkmLuc获得的778碱基对的NsiI-SalI片段(国际出版物WO 98/06437)，进行内含子A的原始缺失。所得构建物是缺失了688bp的内含子A，如图1A所示。所得的表达质粒pCON3含有hCMV增强子/启动子区域和130bp的内含子A片段。pCON3中的内含子的最终序列如图1C所示。
通过在质粒pCMVII(美国专利6096505)中，按照5′→3′方向从独特的NsiI位点向独特的HpaI位点，或者按照3′→5′方向从HpaI位点向NsiI位点进行渐进性的缺失，从而制备12个额外的内含子A缺失构建物(参见，图3和表1)。在限制酶消化后，用T4DNA聚合酶和过量的dNTP处理质粒。对所产生的粘性末端载体进行凝胶纯化和自连接。如图3所示，这些构建物包括在内含子中有长度4-663对碱基对缺失。为了产生携带所得的内含子修饰的表达载体，将从截短的质粒获得的NdeI-SalI片段取代到用NdeI和SalI消化的pCMVkmLuc质粒中。在这些构建物中，用SalI-XbaI消化所选择的构建物，以产生用于插入经消化质粒pCMVkm2.GACmod.SF2获得的密码子优化的HIV p55gag基因的受体载体片段〔Zur Megede等，J.Virol.，(2000)，74：2628-2635〕。
                                       表1
  消化   缺失长度(bp)  从内含子A中删掉的核苷酸(在消化、钝化、重连接后)
  NsiI-CelII   70   47-116
  NsiI-XcmI   113   47-159
  NsiI-PflmI   150   47-196
  NsiI-MroI   345   47-391
  NsiI-BfrI   578   47-624
  NsiI-PvuII   609   47-655
  NsiI-HpaI   663   47-709
  HpaI-PvuII   54   656-709
  HpaI-BrfI   80   630-709
  HpaI-MroII   314   395-709
  HpaI-PflmI   516   193-709
  HpaI-CelII   590   119-709
                          实施例2
             使用内含子A片段的异源编码序列的表达
使293(ATCC保藏号CRL-1573)和RD(ATCC保藏号CCL-136)细胞在补充了胎牛血清(10％v/v)的DMEM培养基中生长。在转染前14小时，以2×105个细胞/孔接种在6孔平板中。使用2μg的上述载体DNA进行瞬时转染，根据供应者的建议，每孔使用12μg的Fugene 6(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)，每种构建物进行6组重复实验。转染后48小时，分析细胞裂解物的报道基因表达。采用p24抗原ELISA评估HIV p55gag表达(Coulter，Miami，FL)。计算各平板(构建物)的几何平均滴度。
293细胞的瞬时转染和荧光素酶表达的评估表明，几乎所有这些表达的衍生物都与含有全长内含子A序列的pCMVkm-荧光素酶亲本载体一样，甚至更好。含有两个最大的内含子缺失(pCon3，ΔHpaI-CelI)的构建物显示出最大的增强，大约大于亲本载体的两倍(图4)。
为了进一步评估对较小的内含子的表达的影响，用从兔β-珠蛋白基因获得的长126对碱基对的内含子I(RβG-IVSI)取代内含子A的整条序列。图5A显示所使用的野生型兔β-珠蛋白基因序列。对p55gag进行的体外分析表明，野生型构建物的表达约高亲本载体pCMVkm-荧光素酶的1.8倍(图6)。相对于剪接供体、支点和RβG-IVSI的多Y系统的共有序列而言，它们的野生型序列是次优的。因此，含有RβG-IVSI的构建物被修饰，以使这些序列元件被优化。图5B显示所使用的优化的兔β-珠蛋白基因序列，称为RβG-OPTI。对这种构建物的分析显示，其体外p55gag表达大约高于亲本载体的4倍(图6)。
分析所有14种修饰的内含子构建物由RT-PCR剪接的RNA转录子的效率。对于RNA转录子分析，将293细胞瞬时转染，然后用RNAstat 60(Tel-Test B，Inc.，Friendswood，TX)裂解，得到总细胞RNA。用RQ1-DNA酶(Promega公司，Madison，WI)消化抽提的RNA，然后使用GeneAmp RNA PCR试剂盒(Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)进行RT-PCR。使用5′-UTR的外显子1的上游引物〔引物“KBT-162”，序列为CGCTGTTTTGACCTCCATA(SEQ ID NO：7)〕和从荧光素酶报道基因获得的下游引物〔引物“KBT-163”，序列为GTTGAGCAATTCACGTTCAT(SEQ ID NO：8)〕进行跨越该内含子的区域的PCR，还对各RNA制品进行肌动蛋白转录子的对照PCR。所有的突变体都在试验的灵敏度内有效地剪接，因为并没有检测到显示未剪接信息的预计长度的产物。
                          实施例3
               使用该内含子A片段进行核酸免疫
为了测试内含子A片段指导体内转录的能力，以每注射位点5μg裸载体DNA〔无内毒素(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)，在生理盐水中配制〕免疫Balb/C小鼠一次，每组6只，免疫位点为两侧胫骨前肌肉。免疫后3到6周，如Zur Megede等，J.Virol.(2000)，74：2628-2635所述，采用ELISA分析抗-HIV p55gag抗体。
所评估的构建物如图7所示。在单一的免疫后可以看到易变的免疫原性(参见图7)。明显地，删除了大约85％的内含子A的pCON3载体比亲本pCMVkm2.GAGmod.SF2载体产生较高的几何平均滴度(图7)。在免疫后三周，该滴度大约是亲本载体的滴度的2倍，注射后6周，滴度有所减少。
因此，公开了新颖的hCMV内含子A片段和使用此片段的方法。根据前文所述，应认识到，虽然为了阐述本发明而对本发明的特殊实施例方式进行了描述，但是在不偏离附带的权利要求的精神和范围的情况下，可对本发明作出各种修改。
                                   序列表
<110>希龙公司
<120>巨细胞病毒内含子A片段
<130>2302-16095.40/PP16095.003
<140>
<141>
<150>60/240,502
<151>2000-10-13
<160>8
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>838
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：全长的内含子A
<400>1
gtaagtaccg cctatagact ctataggcac acccctttgg ctcttatgca tgctatactg 60
tttttggctt ggggcctata cacccccgct ccttatgcta taggtgatgg tatagcttag 120
cctataggtg tgggttattg accattattg accactcccc tattggtgac gatactttcc 180
attactaatc cataacatgg ctctttgcca caactatctc tattggctat atgccaatac 240
tctgtccttc agagactgac acggactctg tatttttaca ggatggggtc ccatttatta 300
tttacaaatt cacatataca acaacgccgt cccccgtgcc cgcagttttt attaaacata 360
gcgtgggatc tccacgcgaa tctcgggtac gtgttccgga catgggctct tctccggtag 420
cggcggagct tccacatccg agccctggtc ccatgcctcc agcggctcat ggtcgctcgg 480
cagctccttg ctcctaacag tggaggccag acttaggcac agcacaatgc ccaccaccac 540
cagtgtgccg cacaaggccg tggcggtagg gtatgtgtct gaaaatgagc tcggagattg 600
ggctcgcacc gtgacgcaga tggaagactt aaggcagcgg cagaagaaga tgcaggcagc 660
tgagttgttg tattctgata agagtcagag gtaactcccg ttgcggtgct gttaacggtg 720
gagggcagtg tagtctgagc agtactcgtt gctgccgcgc gcgccaccag acataatagc 780
tgacagacta acagactgtt cctttccatg ggtcttttct gcagtcaccg tcgtcgac   838
<210>2
<211>100
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：用于取代内含子A的52-740位
     核苷酸的合成的寡聚物
<400>2
atgcatctcg ttgctgccgc gcgcgccacc agacataatc gctgacacac tgacagactg 60
ttcctttcct tttttttttt ttgcagtcac cgtcgtcgac                       100
<210>3
<211>145
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：缺失突变体pCON3内含子
<400>3
gtaagtaccg cctatagact ctataggcac acccctttgg ctcttatgca tctcgttgct 60
gccgcgcgcg ccaccagaca taatcgctga cacactgaca gactgttcct ttcctttttt 120
tttttttgca gtcaccgtcg tcgac                                       145
<210>4
<211>2170
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：hCMV的主要立即早期基因
<400>4
ctgcagtgaa taataaaatg tgtgtttgtc cgaaatacgc gttttgagat ttctgtcgcc 60
gactaaattc atgtcgcgcg atagtggtgt ttatcgccga tagagatggc gatattggaa 120
aaatcgatat ttgaaaatat ggcatattga aaatgtcgcc gatgtgagtt tctgtgtaac 180
tgatatcgcc atttttccaa aagtgatttt tgggcatacg cgatatctgg cgatacggct 240
tatatcgttt acgggggatg gcgatagacg actttggcga cttgggcgat tctgtgtgtc 300
gcaaatatcg cagtttcgat ataggtgaca gacgatatga ggctatatcg ccgatagagg 360
cgacatcaag ctggcacatg gccaatgcat atcgatctat acattgaatc aatattggca 420
attagccata ttagtcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca 480
tacgttgtat ctatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa tatgaccgcc 540
atgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca 600
tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctcgtgaccg 660
cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata 720
gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta 780
catcaagtgt atcatatgcc aagtccggcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc 840
cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta 900
cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg 960
atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt 1020
gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aataaccccg ccccgttgac 1080
gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa 1140
ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga 1200
ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg cggattcccc gtgccaagag 1260
tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct ttggctctta tgcatgctat 1320
actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgctccttat gctataggtg atggtatagc 1380
ttagcctata ggtgtgggtt attgaccatt attgaccact cccctattgg tgacgatact 1440
ttccattact aatccataac atggctcttt gccacaacta tctctattgg ctatatgcca 1500
atactctgtc cttcagagac tgacacggac tctgtatttt tacaggatgg ggtcccattt 1560
attatttaca aattcacata tacaacaacg ccgtcccccg tgcccgcagt ttttattaaa 1620
catagcgtgg gatctccacg cgaatctcgg gtacgtgttc cggacatggg ctcttctccg 1680
gtagcggcgg agcttccaca tccgagccct ggtcccatgc ctccagcggc tcatggtcgc 1740
tcggcagctc cttgctccta acagtggagg ccagacttag gcacagcaca atgcccacca 1800
ccaccagtgt gccgcacaag gccgtggcgg tagggtatgt gtctgaaaat gagctcggag 1860
attgggctcg caccgtgacg cagatggaag acttaaggca gcggcagaag aagatgcagg 1920
cagctgagtt gttgtattct gataagagtc agaggtaact cccgttgcgg tgctgttaac 1980
ggtggagggc agtgtagtct gagcagtact cgttgctgcc gcgcgcgcca ccagacataa 2040
tagctgacag actaacagac tgttcctttc catgggtctt ttctgcagtc accgtccttg 2100
acacgatgga gtcctctgcc aagagaaaga tggaccctga taatcctgac gagggccctt 2160
cctccaaggt                                                        2170
<210>5
<211>126
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：野生型兔β-珠蛋白
<400>5
gttggtatcc tttttacagc acaacttaat gagacagata gaaactggtc ttgtagaaac 60
agagtagtcg cctgcttttc tgccaggtgc tgacttctct cccctgggct gttttcattt 120
tctcag                                                            126
<210>6
<211>127
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：优化的兔β-珠蛋白
<400>6
gtaagtatcc tttttacagc acaacttaat gagacagata gaaactggtc ttgtagaaac 60
agagtagtcg cctgcttttc tgccaggtac taacttctct cccctctcct cttttctttt 120
tctgcag                                                           127
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物KBT-162
<400>7
cgctgttttg acctccata                                              19
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物KBT-163
<400>8
gttgagcaat tcacgttcat                                             20

Claims (19)

1.一种人巨细胞病毒(hCMV)内含子A片段，其特征在于，所述片段缺乏全长的内含子A序列，它含有：(a)与hCMV内含子A序列前25个邻接的5’核苷酸序列有至少75％序列同一性的核苷酸序列；(b)与hCMV内含子A序列的最后25个3’核苷酸有至少75％的序列同一性的核苷酸序列；其中，当所述片段存在于表达构建物中时，该表达构建物所产生的表达水平大于相应的完全缺乏内含子A序列的构建物所产生的表达水平。
2.如权利要求1所述的内含子A片段，其特征在于，所述片段含有：(a)所述hCMV内含子A序列的前25个5’核苷酸为SEQ ID NO：4的第1265-1289位核苷酸，和(b)所述的hCMV内含子A序列的最后25个3’核苷酸为SEQ ID NO：4的第2064-2088位核苷酸。
3.如权利要求1所述的内含子A片段，其特征在于，(a)所述hCMV内含子A序列的前25个5’核苷酸为SEQ ID NO：1的第1-25位核苷酸，和(b)所述的hCMV内含子A序列的最后25个3’核苷酸为SEQ ID NO：1的第800-824位核苷酸。
4.如前述任一项权利要求所述的内含子A片段，其特征在于，所述片段含有(a)与hCMV内含子A序列前51个邻接的5’核苷酸序列有至少75％序列同一性的核苷酸序列；和(b)与hCMV内含子A序列最后80个邻接的3’核苷酸序列有至少75％序列同一性的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的内含子A片段，其特征在于，(a)所述hCMV内含子A序列的前51个5’核苷酸为SEQ ID NO：4的第1265-1315位核苷酸，和(b)所述的hCMV内含子A序列的最后80个3’核苷酸为SEQ ID NO：4的第2009-2088位核苷酸。
6.如权利要求4所述的内含子A片段，其特征在于，(a)所述hCMV内含子A序列的前51个5’核苷酸是SEQ ID NO：1的第1-51位核苷酸，和(b)所述的hCMV内含子A序列的最后80个3’核苷酸为SEQ ID NO：1的第745-824位核苷酸。
7.如前述任一项权利要求所述的内含子A片段，其特征在于，当所述片段存在于表达构建物中时，该表达构建物产生的表达水平大于相应的完全缺乏内含子A序列的构建物所产生的水平的至少两倍。
8.如前述任一项权利要求所述的内含子A片段，其特征在于，当所述片段存在于表达构建物中时，该表达构建物产生的表达水平大于相应的完全缺乏内含子A序列的构建物所产生的水平的至少十倍。
9.如前述任一项权利要求所述的内含子A片段，其特征在于，当所述片段存在于表达构建物中时，该表达构建物产生的表达水平大于相应的完全缺乏内含子A序列的构建物所产生的水平的至少五十倍。
10.如前述任一项权利要求所述的内含子A片段，其特征在于，所述片段由SEQ ID NO：3的内含子A核苷酸序列或与此序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列组成。
11.如权利要求10所述的内含子A片段，其特征在于，所述片段由SEQ IDNO：3的内含子A核苷酸序列组成。
12.一种人巨细胞病毒(hCMV)内含子A片段，其特征在于，所述片段缺乏全长的内含子A序列，它含有：(a)与hCMV内含子A序列前25个邻接的5’核苷酸序列有至少75％序列同一性的核苷酸序列；(b)与hCMV内含子A序列最后25个3’核苷酸序列有至少75％的序列同一性的核苷酸序列；其中，当所述片段存在于表达构建物中时，该表达构建物产生的表达水平将等于或者大于含有相应的完整的全长内含子A序列的表达构建物所产生的表达水平。
13.如权利要求12所述的内含子A片段，其特征在于，所述片段含有(a)与hCMV内含子A序列前51个邻接的5’核苷酸序列有至少75％序列同一性的核苷酸序列；和(b)与hCMV内含子A序列最后80个邻接的3’核苷酸序列有至少75％序列同一性的核苷酸序列。
14.一种有效指导选择的编码序列进行转录的重组表达构建物，其特征在于，所述表达构建物含有：
(a)编码序列；
(b)控制元件，所述控制元件可操作性连接于所述编码序列，其中，所述控制元件含有权利要求1-13中任一项所述的内含子A片段，从而使所述编码序列可在宿主细胞中转录和翻译。
15.如权利要求14所述的重组表达构建物，其特征在于，所述控制元件还含有选自SV40早期启动子、CMV启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要早期启动子、RSV启动子、SRα启动子和单纯疱疹病毒启动子的启动子。
16.如权利要求14或15所述的重组表达构建物，其特征在于，所述控制元件还含有在SEQ ID NO：4中460-1264位核苷酸发现的hCMV立即早期(IE1)增强子/启动子区域，且所述控制元件还含有5′-UTR的外显子2，该外显子2含有SEQID NO：4的第2089-2096位核苷酸。
17.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求14-16中任一项所述的重组表达构建物。
18.一种生产重组多肽的方法，其特征在于，该方法包括：
(a)提供权利要求17所述的宿主细胞种群；和
(b)在使所述重组表达构建物中的所述编码序列表达的条件下培养所述细胞种群，从而产生所述重组多肽。
19.一种生产重组多肽的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)将权利要求14-16中任一项所述的表达构建物引入宿主细胞中；和
(b)使所述表达构建物的编码序列表达，以生产所述重组多肽。
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