ES2261489T3 - Fragmentos de intron a de citomegalovirus. - Google Patents

Abstract

Un fragmento de Intrón A de citomegalovirus humano (hCMV), en el que dicho fragmento carece de la secuencia de Intrón A completa y comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos contigua de los primeros 25 nucleótidos 5¿ de la secuencia de Intrón A de hCMV, y (b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con los últimos 25 nucleótidos 3¿ de una secuencia de Intrón A de hCMV, en el que dicho fragmento está presente en una construcción de expresión, la construcción de expresión que alcanza niveles de expresión mayores que aquellos niveles alcanzados por una construcción correspondiente que carece por completo de la secuencia de Intrón A.

Description

Fragmentos de Intrón A de citomegalovirus.

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a sistemas de expresión de genes recombinantes. Más particularmente, la invención se refiere a fragmentos de Intrón A de citomegalovirus (CMV) para uso en construcciones de expresión para expresar productos genéticos y procedimientos para usar los mismos.

Antecedentes de la invención

Las proteínas son producidas convenientemente en una diversidad de sistemas de expresión recombinantes procariotas y eucariotas. Por ejemplo, los vectores plasmídicos de ADN derivados de Escherichia coli son ampliamente usados para expresar proteínas tanto in vitro como in vivo. In vitro, tales vectores se usan para fines desde, por ejemplo, la evaluación preliminar de la naturaleza de la expresión proteica hasta para la fabricación a gran escala de proteínas recombinantes. In vivo, los vectores de ADN se usan, por ejemplo, para terapia génica y vacunación con ácidos nucleicos.

En general, los vectores eficaces son aquellos que expresan altos niveles de proteína gracias al uso de promotores eficientes y otros elementos de control. Otros factores que pueden contribuir con la transfección eficaz de células incluyen: (1) incorporación de plásmidos por parte de las células; (2) liberación de plásmidos desde vesículas endocíticas tras la endocitosis; (3) translocación del plásmido desde el citoplasma al núcleo; y (4) transcripción del plásmido en el núcleo.

El trabajo de diversos laboratorios sugiere que una barrera de importancia para la transfección eficaz es la translocación del plásmido dentro del núcleo, particularmente en células que no sufren mitosis (por ej. miocitos). Un parámetro que puede afectar esta etapa es el tamaño del plásmido, ya que el complejo de poros nucleares involucrado en la incorporación de macromoléculas dentro del núcleo tiene un tamaño finito. Por ello, resulta deseable construir plásmidos pequeños que conserven la capacidad de expresar proteínas a niveles altos. Esto tiene el potencial de administrar ADN y permite la inserción de insertos genéticos mayores que los que son posibles en plásmidos mayores. El último punto es particularmente importante para la preparación de ciertos vectores virales recombinantes que tienen capacidad limitada de encapsidar plásmidos, tales como los vectores asociados con alfavirus y adenovirus.

Un sistema particularmente eficaz para la producción de proteínas recombinantes usa vectores que contienen la región potenciadora/promotora inmediata temprana (IE1) del citomegalovirus humano (hCMV) que controla la transcripción de la proteína inmediata temprana con peso molecular 72.000 del hCMV. Ver, por ej., Chapman y col., Nuc. Acids Res. (1991) 19:3979-3986; y la Patente de EEUU Nº 5.688.688. El potenciador/promotor IE1 de hCMV es uno de los potenciadores/promotores conocidos más fuerte y es activo en un amplio espectro de tipos celulares.

La región potenciadora/promotora IE1 de hCMV (Figura 2) incluye un modulador específico de tejido, múltiples sitios potenciales de unión para diversos factores de transcripción diferentes, y un potenciador complejo. La región transcrita del gen contiene cuatro exones y tres intrones. El mayor de los intrones, llamado "Intrón A", se encuentra dentro de la región no traducida 5' del gen. Ver, por ej., Chapman y col., Nuc. Acids Res. (1991) 19:3979-3986 para la secuencia y estructura de esta región en la cepa Towne del hCMV, y Akrigg y col., Virus Res. (1985) 2:107-121, para una descripción de la región correspondiente en la cepa AD169 de gCMV. La región Intrón A del potenciador/promotor IE1 de hCMV demostró contener elementos que potencian la expresión de proteínas heterólogas en células de mamíferos. Ver, por ej., Chapman y col., Nuc. Acids Res. (1991) 19:3979-3986.

Los intrones son regiones no codificadoras presentes en la mayoría de los transcritos pre ARNm producidos en el núcleo de células de mamíferos. Las secuencias de intrones pueden potenciar profundamente la expresión genética cuando están incluidos en vectores de expresión heterólogos. Ver, por ej., Buchman y col., Molec. Cell. Biol. (1988) 8:4395-4405; Chapman y col., Nuc. Acids Res. (1991) 19:3979-3986. Estudios recientes demostraron una conexión entre empalme y exportación de pre ARNm, desde el núcleo hacia el citoplasma, de ARNms maduros. Cullen, B. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:4-6; y Luo y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96:14937-14942. De acuerdo con esto, los niveles incrementados de expresión, tales como aquellos observados con la región Intrón A del potenciador/promotor IE1 de hCMV, pueden deberse a niveles incrementados de ARNms traducibles en el
citoplasma.

Resumen de la invención

Por consiguiente, la presente invención provee fragmentos de Intrón A de CMV para uso en construcciones de expresión. Los fragmentos mantienen la capacidad de potenciar los niveles de expresión cuando están presentes en tales construcciones de expresión. El uso de fragmentos de Intrón A es deseable, especialmente cuando se usan en vectores virales recombinantes con limitación de tamaño para encapsidar plásmidos, tales como vectores asociados con alfavirus y adenovirus. Por ello, la presente invención provee un sistema de expresión altamente eficaz para la producción de proteínas recombinantes en cantidades terapéuticamente útiles, tanto in vitro como in vivo.

Por consiguiente, en una forma de realización, esta invención está dirigida a un fragmento de Intrón A de hCMV, en el que el fragmento carece de la secuencia completa de Intrón A y comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos contigua presente en las posiciones 1-25, inclusive, de la Figura 1A, y (b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos contigua presente en las posiciones 775-820, inclusive, de la Figura 1A. Además, cuando el fragmento está presente en una construcción de expresión, ésta alcanza niveles de expresión mayores que aquellos alcanzados por una construcción correspondiente que carece de la secuencia de Intrón A. En ciertas formas de realización, los niveles de expresión alcanzados son al menos dos veces, o al menos diez veces, o al menos cincuenta veces mayores que aquellos alcanzados con una construcción correspondiente que carece de la secuencia de Intrón A.

En otra forma de realización, la invención está dirigida a un fragmento de Intrón A que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos contigua presente en las posiciones 1-51, inclusive, de la Figura 1A, y (b) una secuencia de nucleótidos que tienen al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos contigua presente en las posiciones 741-820, inclusive, de la Figura 1A, en el que cuando el fragmento está presente en una construcción de expresión, ésta alcanza niveles de expresión mayores que aquellos alcanzados por una construcción correspondiente que carece por completo de la secuencia de Intrón A. En ciertas formas de realización, los niveles de expresión alcanzados son al menos dos veces, o al menos diez veces, o al menos cincuenta veces mayores que aquellos alcanzados con una construcción correspondiente que carece por completo de la secuencia de Intrón A.

En otra forma de realización, el fragmento de Intrón A comprende la secuencia de nucleótidos 1-51, inclusive, de la Figura 1A, unida a los nucleótidos 741-820, inclusive, de la Figura 1A.

En aún otra forma de realización, el fragmento de Intrón A comprende la secuencia de nucleótidos de Intrón A que se muestra en la Figura C, o una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75% de identidad de secuencia con la misma.

En otra forma de realización, el fragmento de Intrón A está constituido por la secuencia de nucleótidos de Intrón A que se muestra en la Figura 1C.

En aún otra forma de realización, la invención está dirigida a un fragmento de Intrón A de hCMV, en el que el fragmento carece de la secuencia completa de Intrón A y comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos contigua presente en las posiciones 1-25, inclusive, de la Figura 1A, y (b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos contigua presente en las posiciones 775-820, inclusive, de la Figura 1A, en el que cuando el fragmento está presente en una construcción de expresión, ésta alcanza niveles de expresión iguales o mayores que aquellos alcanzados por una construcción de expresión que incluye una secuencia correspondiente de Intrón A completa, intacta.

En otra forma de realización, la invención está dirigida a un fragmento de Intrón A de hCMV, en el que el fragmento carece de la secuencia completa de Intrón A y comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos contigua presente en las posiciones 1-51, inclusive, de la Figura 1A, y (b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos contigua presente en las posiciones 741-820, inclusive, de la Figura 1A, en el que cuando el fragmento está presente en una construcción de expresión, ésta alcanza los niveles de expresión iguales o mayores que aquellos alcanzados por una construcción de expresión que incluye una secuencia correspondiente de Intrón A completa, intacta.

En otras formas de realización, la invención está dirigida a construcciones de expresión recombinantes que comprenden (a) una secuencia codificadora; y (b) elementos de control unidos de manera operativa a la secuencia codificadora, en las que los elementos de control comprenden el fragmento de Intrón A descrito en este documento, por lo que la secuencia codificadora puede transcribirse o traducirse en una célula huésped. En ciertas formas de realización, los elementos de control además comprenden un promotor seleccionado del grupo constituido por un promotor temprano de SV40, un promotor de CMV, un promotor LTR de virus de tumor mamario de ratón, un promotor tardío mayor de adenovirus, un promotor de RSV, un promotor de SR\alpha y un promotor de virus herpes simplex. Particularmente, los elementos de control pueden comprender la región potenciadora/promotora inmediata temprana (IE1) de hCMV que se encuentra en las posiciones de nucleótidos 460 a 1264 de la Figura 2, y Exon 2 del 5'-UTR que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en las posiciones 821-834, inclusive, de la Figura 1A. Se proveen también las células huésped que comprenden construcciones de expresión y los procedimientos para producir un polipéptido recombinante.

En otra forma de realización, la invención está dirigida a un polinucleótido que comprende la secuencia que se muestra en la Figura 5B.

Estos y otros aspectos de la presente invención resultarán evidentes en referencia a la descripción detallada y los dibujos que se incorporan a continuación. Además, en este documento se establecen varias referencias que describen en más detalle ciertos procedimientos o composiciones y por lo tanto se incorporan por referencia en su totalidad.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A (SEQ ID Nº 1) muestra la secuencia de un Intrón A IE1 de CMV de la cepa Towne de hCMV. También se muestra en la Figura 1A la porción de la secuencia delecionada del mutante de deleción pCON3. La secuencia dadora de empalme está en negrita y se muestra con una flecha. La secuencia aceptora de empalme está subrayada y señalada con una flecha. Se indican los posibles puntos de ramificación.

La Figura 1B (SEQ ID Nº 2) muestra el oligonucleótido correspondiente con la porción 3' conservada de la construcción de Intrón A delecionada de pCON3 comparada con la porción 3' del Intrón A de tipo salvaje.

La Figura 1C (SEQ ID Nº 3) muestra la secuencia de Intrón A del mutante de deleción pCON3.

La Figura 2 (SEQ ID Nº 4) (número de acceso de GenBank M60321 y Chapman y col., Nuc. Acids Res. (1991) 19:3979-3986) muestra la secuencia de nucleótidos de la región 5' del gen inmediato temprano mayor de hCMV, incluyendo la región potenciadora/promotora. Se muestran: la región potenciadora (nucleótidos \sim600 a \sim1081), el promotor de Pol II (nucleótidos 1081-1143), Exon 1 del 5'UTR (nucleótidos 1144-1264), Intrón A (nucleótidos 1265-2088) y Exon 2 del 5'UTR (nucleótidos 2089-2096). Las secuencias TATAA y CAAT así como el codón de inicio están en cajas.

La Figura 3 muestra diversos mutantes de deleción de Intrón A como se describen en los ejemplos.

La Figura 4 representa la expresión de luciferasa normalizada por los diversos mutantes de deleción mostrados en las Figuras 1C y Figura 3.

La Figura 5A (SEQ ID Nº 5) muestra la secuencia del gen de \beta-globina de conejo de tipo salvaje usada en los ejemplos.

La Figura 5B (SEQ ID Nº 6) muestra la secuencia del gen de \beta-globina de conejo optimizada usada en los ejemplos.

La Figura 6 muestra la expresión de luciferasa como medida de la expresión de p55gag por parte del vector principal, pCMVkm-Luciferasa, comparado con R\betaG-IVSI (conteniendo la secuencia del gen de \beta-globina de conejo de tipo salvaje mostrada en Figura 4A) y R\betaG-OPTI (conteniendo la secuencia del gen de \beta-globina de conejo optimizada mostrada en la Figura 4B).

La Figura 7 representa los títulos de anti-p55gag de ratones inmunizados con diversas construcciones incluyendo el fragmento de Intrón A, como se describe en los ejemplos.

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, procedimientos convencionales de química, bioquímica, técnicas de ADN recombinante e inmunología, dentro de los usados en la técnica. Tales técnicas se explican en profundidad en la bibliografía. Ver, por ej. Sambrook, y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2º Edición); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); DNA Cloning, Vols. I y II (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds.); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed.); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning.

Debe tenerse en cuenta que, como se usan en esta memoria y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una" y "el", "la"incluyen las referencias en plural a menos que el contenido lo exprese claramente de otra manera. Así, por ejemplo, al referirse a "un antígeno" se incluye una mezcla de dos o más antígenos, y similar.

Las siguientes abreviaturas de aminoácidos se usan a lo largo de todo el texto:

Alanina: Ala (A)

Arginina: Arg (R)

Asparagina: Asn (N)

Ácido Aspártico: Asp (D)

Cisteína: Cys (C)

Glutamina: Gln (Q)

Ácido Glutámico: Glu (E)

Glicina: Gly (G)

Histidina: His (H)

Isoleucina: Ile (I)

Leucina: Leu (L)

Lisina: Lys (K)

Metionina: Met (M)

Fenilalanina: Phe (F)

Prolina: Pro (P)

Serina: Ser (S)

Treonina: Thr (T)

Triptofano: Trp (W)

Tirosina: Tyr (Y)

Valina: Val (V)

I. Definiciones

Al describir la presente invención, se usarán los siguientes términos, los que se definen como se indica a continuación.

Por "fragmento de Intrón A" se entiende un fragmento derivado de una secuencia de Intrón A de una región del potenciador/promotor inmediato temprano de CMV, que no incluye la secuencia del Intrón A completa. En la Figura 2 se muestra una región representativa del potenciador/promotor de CMV. La secuencia de Intrón A intacta está representada por los nucleótidos en minúsculas que se extienden desde la posición 1265 hasta 2088 de la Figura 2 y los nucleótidos 1-820 de la Figura 1A. El fragmento de Intrón A de la presente invención comprende una deleción de la secuencia completa, que puede ser interna o puede producirse en los extremos 5' y/o 3' de la región de Intrón A, a condición de que la región continúe funcionando para permitir empalme auténtico en el núcleo de trascritos primarios que incluyen el fragmento de Intrón A. De preferencia, un "fragmento de Intrón A" incluye el mínimo número de bases o elementos necesarios para alcanzar los niveles de expresión por encima de los alcanzados con las construcciones correspondientes que carecen por completo de la secuencia de Intrón A. De más preferencia, los niveles de expresión alcanzados por las construcciones que incluyen el fragmento de Intrón A de la invención son al menos dos veces superiores a aquellos alcanzados sin la presencia de la región de Intrón A, de preferencia al menos diez veces superiores, y de mayor preferencia al menos de veinte a cincuenta, o más, veces superiores a aquellos alcanzados sin la región de Intrón A. De preferencia, los niveles de expresión son al menos iguales a, o mayores que, por ejemplo al menos dos veces superiores a aquellos niveles alcanzados cuando está presente la secuencia de Intrón A completa, intacta, en una construcción de expresión correspondiente. Tales comparaciones se realizan típicamente fabricando construcciones de expresión que incluyen todos los elementos de la construcción de prueba, pero sin la secuencia de Intrón A, o incluyendo la secuencia de Intrón A completa (ver los Ejemplos en el presente
documento).

Por lo tanto, un "fragmento de Intrón A" de la presente invención generalmente incluirá al menos la secuencia de empalme 5' (nucleótidos 1-7 como se muestra en la Figura 1A), usualmente al menos hasta los primeros 25 nucleótidos 5' de la región del Intrón A (nucleótidos 1-25 de la Figura 1A), de más preferencia al menos hasta los primeros 30 nucleótidos de la región del Intrón A (nucleótidos 1-30 de la Figura 1A), de más preferencia aún al menos hasta los primeros 40 nucleótidos de la región del Intrón A (nucleótidos 1-40 de la Figura 1A), de mayor preferencia al menos hasta los primeros 51 nucleótidos de la región del Intrón A (nucleótidos 1-51 de la Figura 1A) y aún hasta los primeros 75 o más nucleótidos de la región del Intrón A, y cualquier número entero entre estos valores, o aún más de la región 5' del Intrón A.

Más aún, además de la secuencia 5' descrita anteriormente, un "fragmento de Intrón A" opcionalmente incluirá al menos la secuencia de empalme 3' (nucleótidos 815-820 de la Figura 1A). Generalmente, el fragmento de Intrón A incluirá al menos hasta los 25 nucleótidos 3' de la secuencia de Intrón A mostrada en la Figura 1A (nucleótidos 796-820 de la Figura 1A), de preferencia hasta 50 de los nucleótidos 3' mostrados en la Figura 1A (nucleótidos 771-820 de la Figura 1A), más generalmente hasta los 70 nucleótidos 3' (nucleótidos 751-820 de la Figura 1A), de preferencia al menos hasta los 80 nucleótidos 3' (nucleótidos 741-820 de la Figura 1A), o aún más de la región 3', tales como los 100-150 nucleótidos 3', y cualquier número entero entre estos valores, o más de la región 3' del Intrón A.

Por lo tanto, resulta evidente que un fragmento de Intrón A de acuerdo con la presente invención puede incluir una diversidad de deleciones internas, tales como aproximadamente 10 hasta aproximadamente 750 o más nucleótidos de la secuencia del Intrón A, de preferencia aproximadamente 25 hasta aproximadamente 700 o más nucleótidos, de más preferencia aproximadamente 50 hasta aproximadamente 700 nucleótidos, y de mayor preferencia aproximadamente 500 hasta aproximadamente 680-690 o más nucleótidos, o cualquier número entero dentro de los anteriores intervalos, a condición de que una construcción correspondiente incluyendo el fragmento de Intrón A potencie la expresión con relación a una construcción correspondiente que carece completamente de la secuencia del Intrón A, o provea una expresión potenciada o equivalente en relación con una construcción que incluye la secuencia completa del Intrón A, como se describió anteriormente.

Las regiones 5' y 3' conservadas del fragmento de Intrón A de la presente invención pueden estar unidas directamente una a la otra, por ej. como se muestra en la Figura 1A, o las regiones 5' y 3' del fragmento de Intrón A pueden estar unidas por medio de una secuencia conectora. La secuencia conectora puede comprender desde 1 hasta aproximadamente 400 o más nucleótidos, o cualquier número entero dentro de estos valores, y puede comprender regiones para factores de transcripción particulares, tales como sitios de unión NF1, secuencias potenciadoras específicas de tejido, tales como potenciadores específicos de músculo y similares.

Una secuencia representativa del fragmento de Intrón A comprende la secuencia de nucleótidos en las posiciones 1-51 unidos a los nucleótidos 741-820, de la Figura A, comprendiendo por lo tanto una deleción interna de nucleótidos 52-740, como se muestra en la Figura 1A. En esta construcción también está incluido Exon 2 del 5'UTR de la región potenciadora/promotora de hCMV, nucleótidos 821-834 de la Figura 1A.

Un "fragmento de Intrón A" como se usa en este documento, abarca secuencias con identidad con un fragmento aislado de Intrón A de cualquiera de las diversas cepas de hCMV, tales como por ejemplo la cepa Towne de hCMV y la cepa AD169 de hCMV, así como polinucleótidos que son sustancialmente homólogos a la molécula de referencia (como se define a continuación) y que aún funciona como se describió anteriormente. Por ello, por ejemplo, el fragmento mostrado en la Figura 1C incluye sustituciones de nucleótidos en los puntos de ramificación y la extensión polipirimidina para conformar estas secuencias como secuencias de consenso, como se muestra en las Figuras 1B y 1C. De preferencia, pero no necesariamente, los puntos de ramificación conservan los codones de terminación, es decir, TAA, TAG o TGA. Más aún, partes de la molécula fuera de la región dadora de empalme y aceptora de empalme son más factibles de cambio. Al respecto, resulta de preferencia mantener el 5'GT que se encuentra en la unión de empalme 5', y de preferencia los seis primeros pares de bases que se encuentran en la unión de empalme 5'. Resulta también de preferencia mantener el 3'AG que se encuentra en la unión de empalme 3', de preferencia los tres pares de bases, CAG, que se encuentran en la unión de empalme 3'. Los nucleótidos que se encuentran en estas regiones son de preferencia al menos 80% homólogos a la secuencia de nucleótidos presente en la secuencia nativa mostrada en la Figura 1A, pero pueden ser menos homólogos a condición de que el fragmento de Intrón A mantenga la función, como se definió anteriormente. Además, la región de extensión polipirimidina es de preferencia una en la que sustancialmente todas las bases son Ts o Cs.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero de residuos de aminoácidos y no se limitan a una longitud mínima del producto. Por lo tanto, péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros, y similares, están incluidos dentro de la definición. Tanto las proteínas completas como los fragmentos de las mismas están incluidos por la definición. Los términos también incluyen modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación y similar.

Para los objetivos de la presente invención, el polipéptido expresado por la secuencia codificadora puede ser útil en una vacuna, en terapéutica o diagnóstico y puede derivar de cualquiera de diversos virus, bacterias, parásitos y hongos conocidos, así como también de diversos antígenos tumorales. Alternativamente, el polipéptido expresado puede ser una hormona terapéutica, un mediador de transcripción o traducción, una enzima, un producto intermedio en una vía metabólica, un inmunomodulador y similar.

Además, para los objetivos de la presente invención, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservativas en la naturaleza), en la secuencia nativa, a condición de que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como por ejemplo a través de mutagénesis dirigida a un sitio, o pueden ser aleatorias, tales como por ejemplo a través de mutaciones de huéspedes que producen las proteínas por errores debidos a la amplificación por PCR.

Una "secuencia codificadora" o una secuencia que "codifica" un polipéptido seleccionado, es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso de ADN) y traducida (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se la coloca bajo el control de secuencias regulatorias adecuadas. Los límites de la secuencia codificadora están determinados por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) terminal y por un codón para detener la traducción en el extremo 3' (carboxi) terminal. Una secuencia codificadora puede incluir, pero no se limita a, ADNc de ARNm viral, procariota o eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN viral (por ej. ADN de virus y retrovirus) o ADN procariota, y secuencias sintéticas de ADN. Una secuencia de terminación de la transcripción puede estar ubicada en posición 3' hacia la secuencia codificadora.

Una molécula de "ácido nucleico" puede incluir secuencias de cadena simple o de cadena doble y se refiere a, pero no se limita a, ADNc de ARNm viral, procariota o eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN viral (por ej. ADN de virus y retrovirus) o ADN procariota, y especialmente secuencias sintéticas de ADN. El término también abarca secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases de ADN y ARN.

"Unido de manera operativa" se refiere a un arreglo de elementos en el que los componentes allí descritos están configurados de manera de llevar a cabo la función deseada. Por ello, un promotor dado unido de manera operativa a una secuencia codificadora es capaz de efectuar la expresión de la secuencia codificadora cuando están presentes los factores de transcripción adecuados, etc. El promotor necesita no estar contiguo con la secuencia codificadora, a condición de que funcione para dirigir la expresión de la misma. Por lo tanto, por ejemplo, secuencias ya trascritas no traducidas pueden estar presentes entre la secuencia promotora y la secuencia codificadora, como también pueden estar intrones transcritos, y la secuencia promotora puede aún ser considerada "unida de manera operativa" a la secuencia codificadora.

"Recombinante" como se usa en este documento para describir una molécula de ácido nucleico, se refiere a un polinucleótido de origen genómico, ADNc, viral, semisintético o sintético que, debido a su origen o manipulación no está asociado en su totalidad o en parte con el polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza. El término "recombinante" como se usa con respecto a una proteína o polipéptido significa un polipéptido producido por la expresión de un polinucleótido recombinante. En general, el gen de interés se clona y posteriormente se expresa en organismos transformados, como se describe a continuación. El organismo huésped expresa el gen extraño para producir la proteína bajo condiciones de expresión.

Un "elemento de control" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que ayuda en la expresión de una secuencia codificadora a la que está unido. El término incluye promotores, secuencias de terminación de transcripción, dominios regulatorios secuencia arriba, señales de poliadenilación, regiones sin traducir, incluyendo 5'-UTRs (tal como Exon 2 de la región potenciadora/promotora de hCMV 5'-UTR) y 3'-UTRs y cuando es adecuado, secuencias líder y promotores, que proveen colectivamente para la transcripción y traducción de una secuencia codificadora en una célula huésped.

Un "promotor" como se usa en este documento es un región regulatoria de ADN capaz de unirse a polimerasa de ARN en una célula huésped e iniciar la transcripción de una secuencia codificadora secuencia abajo (en dirección 3') unida de modo operativo a la misma. Para los objetivos de la presente invención, una secuencia promotora incluye el mínimo número de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción de un gen de interés a niveles detectables por encima de los niveles de base. Dentro de la secuencia promotora se encuentra un sitio de iniciación de la transcripción, así como dominios de unión a proteínas (secuencias de consenso) responsables de la unión a la polimerasa de ARN. Los promotores eucarióticos tendrán a menudo, pero no siempre, cajas "TATAA" y cajas
"CAAT".

Una secuencia de controlo "dirige la transcripción" de una secuencia codificadora en una célula cuando la polimerasa de ARN se una a la secuencia promotora para transcribir la secuencia codificadora en un ARNm, que se traducirá posteriormente en un polipéptido codificado por la secuencia codificadora.

Una "célula huésped" es una célula que ha sido transformada, o es capaz de una transformación, por una secuencia de ADN exógena.

Una región "heteróloga" de una construcción de ADN es un segmento identificable de ADN dentro de o unido a otra molécula de ADN que no se encuentra asociado con la otra molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia codificadora de una proteína humana diferente de la proteína inmediata temprana de peso molecular 72.000 de hCMV se considera una secuencia heteróloga cuando está unida a un potenciador/promotor IE1 de hCMV.

De manera similar, una secuencia que codifica la proteína inmediata temprana de peso molecular 72.000 de hCMV se considera una secuencia heteróloga cuando está unida a un promotor de hCMV con el que no está normalmente asociada. Otro ejemplo de una secuencia codificadora heteróloga es una construcción en la que la secuencia codificadora en sí no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, secuencias sintéticas que tienen codones diferentes a los del gen nativo). La variación alélica o los acontecimientos mutacionales que ocurren naturalmente no dan lugar a una región heteróloga de ADN, como se usa en este documento.

Se entiende por "marcador seleccionable" a un gen que confiere un fenotipo en una célula expresando el marcador, de manera que la célula puede identificarse bajo condiciones adecuadas. Generalmente, un marcador seleccionable permite la selección de células transfectadas con en base a su capacidad para crecer en presencia o en ausencia de un agente químico u otro agente que inhibe una función celular esencial. Los marcadores adecuados, por lo tanto, incluyen genes que codifican proteínas que confieren resistencia o sensibilidad a fármacos, imparten color o cambian las características antigénicas de aquellas células transfectadas con un elemento de ácido nucleico que contiene un marcador seleccionable cuando las células se cultivan en un medio selectivo adecuado. Por ejemplo, los marcadores seleccionables incluyen: marcadores citotóxicos y marcadores de resistencia a fármacos, por los que las células se seleccionan por su capacidad para crecer en un medio que contienen una o más citotoxinas o fármacos; marcadores auxotróficos por los que las células se seleccionan por su capacidad para crecer en medios definidos con o sin nutrientes o suplementos particulares, tales como timidina e hipoxantina; marcadores metabólicos por los que las células se seleccionan por, por ejemplo, su capacidad para crecer en medios definidos que contienen el azúcar adecuado como única fuente de carbono, o marcadores que confieren la capacidad de las células para formar colonias coloreadas en sustratos cromogénicos o que provocan la fluorescencia de las células. Los marcadores seleccionables representativos se describen con más detalle a continuación.

"Casete de expresión" o "construcción de expresión" se refiere a un arreglo que es capaz de dirigir la expresión de la(s) secuencia(s) o gen(es) de interés. El casete de expresión incluye elementos de control, como se describen anteriormente, tales como un promotor o potenciador/promotor (tal como el potenciador/promotor IE1 de hCMV) que está unido de modo operativo (de manera tal que dirige la transcripción de) la(s) secuencia(s) o gen(es) de interés, y a menudo incluye también una secuencia de poliadenilación. Un casete de expresión también incluirá un fragmento de Intrón A como se definió anteriormente y, opcionalmente, Exon 2 de la región potenciadora/promotora IE1 de hCMV. Dentro de ciertas formas de realización de la invención, el casete de expresión descrito en este documento puede estar contenido dentro de una construcción de plásmido. Además de los componentes del casete de expresión, la construcción de plásmido puede también incluir, uno o más marcadores seleccionables, una señal que permite a la construcción de plásmido existir como un ADN de cadena única (por ejemplo, un origen M13 de replicación), al menos un sitio de clonación múltiple y un origen "mamífero" de replicación (por ejemplo, un origen de replicación de SV40 o de adenovirus).

"Transformación", como se usa en este documento se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno dentro de una célula huésped, sin tener en cuenta el procedimiento usado para la inserción: por ejemplo, transformación mediante incorporación directa, transfección, infección y similares. Para procedimientos particulares de transfección, ver a continuación. Los polinucleótidos exógenos pueden mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un episoma, o alternativamente, pueden estar integrados en el genoma del huésped.

Por "aislado" se entiende, cuando se refiere a un polipéptido, que la molécula indicada está separada y diferenciada del organismo completo con el que la molécula se encuentra en la naturaleza o está presente en la ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "aislado" con respecto a un polinucleótido es una molécula de ácido nucleico desprovista, en su totalidad o en parte, de secuencias normalmente asociadas con ella en la naturaleza; o una secuencia, como se presenta en la naturaleza, pero consecuencias heterólogas asociada al mismo; o una molécula no asociada del cromosoma.

"Homología" se refiere al porcentaje de identidad entre dos polinucleótidos o dos fracciones de polipéptidos. Dos ADNs o dos secuencias de polipéptidos son "sustancialmente homólogas" entre sí cuando las secuencias exhiben al menos aproximadamente 50%, de preferencia al menos aproximadamente 75%, de más preferencia al menos aproximadamente 80%-85% (80, 81, 82, 83, 84, 85%), de preferencia al menos aproximadamente 90%, y de mayor preferencia al menos aproximadamente 95%-98% (95, 96, 97, 98%), o más, o cualquier número entero dentro del intervalo desde 50% hasta 100%, de identidad de secuencia sobre una longitud definida de las moléculas. Como se usa en este documento, sustancialmente homólogo también se refiere a secuencias que muestran identidad completa con el ADN o secuencia de polipéptidos especificados.

En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias de polipéptidos, respectivamente. El porcentaje de identidad puede determinarse mediante una comparación directa de la información de la secuencia entre dos moléculas alineando dichas secuencias, contando el número exacto de coincidencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo por la longitud de la secuencia más corta y multiplicando el resultado por 100. Pueden usarse programas informáticos fácilmente disponibles para ayudar en el análisis, tal como ALIGN, Dayhoff, M. O. en Atlas of Protein Sequence and Structure M. O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, D.C., que adapta el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981 para el análisis de péptidos. Los programas para determinar la identidad de secuencia de nucleótidos están disponibles en Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (disponible en Genetics Computer Group, Madison, WI) por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que también se basan en el algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas se utilizan fácilmente con parámetros predeterminados que son recomendados por el fabricante y descritos en Wisconsin Sequence Analysis Package nombrado anteriormente. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de una secuencia de nucleótidos particulados con una secuencia de referencia puede determinarse utilizando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de puntuación predeterminada y un intervalo de penalización de seis posiciones de nucleótidos.

Otro procedimiento para establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención es usar el paquete de programas MPSRCH con derechos de autor de la Universidad de Edimburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA.). El algoritmo de Smith-Waterman puede usarse con este juego de paquetes en los que se usan parámetros predeterminados para la tabla de puntuación (por ejemplo, penalización abierta de intervalo de 12, penalización de extensión de intervalo de uno e intervalo de seis). A partir de los datos generados el valor "Match" refleja la "identidad de secuencia". Otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similaridad entre secuencias son conocidos en la técnica, por ejemplo, otro programa de alineamiento es BLAST, usado con parámetros predeterminados. Por ejemplo, pueden usarse BLASTN y BLASTP con los siguientes parámetros predeterminados: genetic code = standard; filter = none; strand = both; cutoff = 60; expect = 10; Matrix = BLOSUM62; Descriptions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; Databases = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas pueden encontrarse en internet en:

http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Alternativamente, la homología puede determinarse por medio de hibridación de polinucleótidos bajo condiciones en las que se forman dúplex estables entre regiones homólogas, seguido de digestión con nucleasa(s) específicas de hebra única y determinación de tamaño de los fragmentos digeridos. Secuencias de ADN que son "sustancialmente homólogas" pueden identificarse en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo, condiciones de rigurosidad, definidas para ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación adecuadas se encuentra dentro del conocimiento de la técnica. Ver, por ej., Sambrook y col., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

II. Modos de llevar a cabo la invención

Previo a la descripción en detalle de la presente invención, debe entenderse que esta invención no está limitada a formulaciones particulares o parámetros de procesos los que pueden, por supuesto, variar. Debe entenderse también que la terminología usada en este documento tiene el objetivo de describir solamente formas de realización particulares, y no tiene la intención de limitarlas.

A pesar de que en la práctica de la presente invención pueden usarse un número de composiciones y procedimientos similares o equivalentes a aquellos descritos en este documento, en el mismo se describen los materiales y procedimientos de preferencia.

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Como se expuso anteriormente, la presente invención está basada en el descubrimiento de fragmentos de Intrón A de hCMV nuevos que son capaces de potenciar la expresión secuencia arriba (3') en relación con los niveles de expresión alcanzados en ausencia de una secuencia de Intrón A, o al menos proveer niveles de expresión equivalentes a aquellos obtenidos usando la secuencia de Intrón A completa, intacta. Como se explicó anteriormente, el potenciador/promotor IE1 de hCMV del que deriva la secuencia de Intrón A, es uno de los potenciadores/promotores más potentes conocidos y tiene actividad en un amplio espectro de tipo celulares. Ver, por ejemplo, Chapman y col., Nuc. Acids Res. (1991) 19:3979-3986; y la Patente de EEUU Nº 5.688.688. El uso de fragmentos activos de esta región reduce eficazmente el tamaño total del plásmido para la expresión de una secuencia codificadora particular. Esto es particularmente deseable cuando se usan secuencias codificadoras largas, y/o vectores virales con capacidad limitada para empaquetar genes grandes. Más aún, la disminución en el tamaño total de las construcciones potencia eficazmente la eficacia de la expresión. Por ello, los fragmentos de Intrón A de la presente invención sorprendentemente mantienen la capacidad de dar como resultado la expresión de proteína a niveles altos in vitro e in vivo y, en algunos casos, proveer una expresión mayor que la de vectores que usan la secuencia de Intrón A IE1 de hCMV entera. Como se muestra en los ejemplos, estos altos niveles de expresión proveyeron respuestas inmunes comparables con, o aún mejores que, las inducidas por el vector principal.

Como se explicó anteriormente, los fragmentos de Intrón A para uso en este documento conservarán al menos hasta los 7 nucleótidos iniciales de la región de Intrón A, de preferencia al menos hasta los 25 nucleótidos iniciales de la región de Intrón A (ver, Figura 1 A para una secuencia representativa de Intrón A). En general, el fragmento de Intrón A de la presente invención mantendrá al menos hasta los 30 primeros nucleótidos de la región de Intrón A (nucleótidos 1-30 de la Figura 1 A), generalmente al menos hasta 40 primeros nucleótidos de la región de Intrón A (nucleótidos 1-40 de la Figura 1 A), de más preferencia al menos hasta los 51 primeros nucleótidos de la región de Intrón A (nucleótidos 1-51 de la Figura 1 A) y aún hasta los 75 primeros nucleótidos o más de la región de Intrón A. Por ello, la región 5' puede incluir 25, 26, 27, 28, 29, 30 . . . 50, 51, 52, 53, 54, 55 . . . 70, 71, 72, 73, 74, 75 . . . 85, 86, 87 o más de los nucleótidos 5', y así sucesivamente. Resulta evidente que cualquier número de nucleótidos especificados anteriormente, así como la cantidad de nucleótidos dentro de los números especificados, intentan abarcarse en este documentos, a condición de que una construcción de expresión que contiene el fragmento de Intrón A funcione como se definió anteriormente.

El fragmento de Intrón A también incluirá opcionalmente una cantidad suficiente de la región 3' de Intrón A para funcionar como se describió anteriormente. En general, posteriormente, el fragmento de Intrón A incluirá al menos la secuencia de empalme 3' (nucleótidos 815-820 de la Figura 1A), de preferencia, al menos hasta los 25 nucleótidos 3' de la secuencia de Intrón A mostrada en la Figura 1A (nucleótidos 796-820 de la Figura 1A), de preferencia hasta los 50 nucleótidos 3' de la secuencia mostrada en la Figura 1A (nucleótidos 771-820 de la Figura 1A), más generalmente hasta los 70 nucleótidos 3' (nucleótidos 751-820 de la Figura 1A), de preferencia hasta los 80 nucleótidos 3' (nucleótidos 741-820 de la Figura 1A), o aún más de la región 3', tales como los 100-150 nucleótidos 3', y cualquier número entero entre estos valores, o más de la región de Intrón A. Por ello, la parte 3' del fragmento de Intrón A puede incluir 50, 51, 52, 53, 54, 55 . . . 70, 71, 72, 73, 74, 75 . . . 85, 86, 87 . . . 90, 92, 93, 94, 95, 96 . . . 110, 111, 112, y así sucesivamente, o más de los nucleótidos 3' de la región de Intrón A. Resulta evidente que en este documento se intenta abarcar cualquier número de nucleótidos especificado anteriormente, así como una cantidad de nucleótidos dentro de los números especificados.

Las regiones 5' y 3' conservadas del fragmento de Intrón A de la presente invención pueden estar unidas directamente una a la otra, por ejemplo, pueden ser una deleción interna de la secuencia de Intrón A. Esta deleción puede comprender, por ejemplo, 10-750 o más pares de bases de la región de Intrón A intacta, de preferencia aproximadamente 300-700 pares de bases, y de mayor preferencia aproximadamente 500-700 pares de bases. Como se muestra en la Figura 1A, un fragmento de preferencia incluye una deleción interna amplia de aproximadamente 688 pares de bases. Este fragmento por lo tanto incluye la secuencia de nucleótidos en las posiciones 1-51 directamente unidos a los nucleótidos 741-834, de la Figura 1A, comprendiendo así una deleción interna de nucleótidos 52-740 de Intrón A, como se muestra en la Figura 1A. Los nucleótidos 821-834 de la Figura 1A representan el Exon 2 de 5'-UTR. La Figura 3 muestra diversas construcciones de fragmentos de Intrón A con deleciones de Intrón A de entre 55 y 661 pares de bases.

Alternativamente, las regiones 5' y 3' del fragmento de Intrón A pueden estar unidas juntas por medio de una secuencia conectora. La secuencia conectora puede comprender desde 1 hasta aproximadamente 400 o más nucleótidos, de preferencia desde 10 hasta 100 nucleótidos, o cualquier número entero entre esos valores, y pueden comprender regiones para potenciadores, factores de transcripción particulares, tales como sitios de unión NF1, y
similares.

El fragmento de Intrón A de la presente invención pueden aislarse de una biblioteca genómica de CMV, así como de plásmidos conteniendo la región de Intrón A, usando una sonda adecuada y clonados para uso futuro. De manera similar, la secuencia puede producirse sintéticamente, usando procedimientos conocidos de síntesis de polinucleótidos (ver, por ejemplo, Edge, M. D., Nature (1981) 292:756; Nambair, y col. Science (1984) 223:1299; Jay, Ernest, J. Biol. Chem. (1984) 259:6311), basados en la secuencia de Intrón A conocida. Ver, por ejemplo, Chapman y col., Nuc. Acids Res. (1991) 19:3979-3986 para la secuencia y estructura de la región de Intrón A en la cepa Towne de hCMV, y Akrigg y col., Virus Res. (1985) 2:107-121, para una descripción de la región correspondiente en la cepa AD169 de CMV; y las Figuras 1A y 1C en este documento.

Un procedimiento particularmente conveniente para obtener el fragmento de Intrón A de la presente invención es asilar Intrón A (sólo o asociado con el resto de la región potenciadora/promotora de hCMV) de cualquiera de los diversos plásmidos conocidos que lo contienen, usando procedimientos conocidos en la técnica, así como también descritos en los ejemplos en este documento. En particular, el Intrón A de hCMV puede obtenerse a partir del plásmido pCMV6, como se describió en Chapman y col., Nuc. Acids Res. (1991) 19:3979-3986 y Patente de EEUU Nº 5.688.688. Una vez obtenida, la secuencia de Intrón A puede manipularse para obtener mutantes de deleción de la misma, tal como extirpando porciones de la secuencia de Intrón A usando enzimas de restricción. El clivaje de ADN específico se lleva a cabo por medio del tratamiento con una enzima (o enzimas) de restricción adecuada, bajo condiciones que son generalmente conocidas en la técnica, las que son especificadas por el fabricante de estas enzimas disponibles comercialmente. Ver, como por ejemplo, New England Biolabs, Product Catalog. Por ejemplo, se aislaron endonucleasas de restricción con diversas especificidades de un amplio espectro de procariotas y son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook y col., supra. La elección de una endonucleasa de restricción adecuada depende de la secuencia blanco particular. Un experto en la técnica reconocerá fácilmente la enzima de restricción adecuada a usar para una secuencia deseada. Si se desea, puede llevarse a cabo la separación por tamaño de los fragmentos clivados por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida o en gel de agarosa, usando técnicas estándar. Se puede encontrar una descripción general de las separaciones por tamaño en, por ejemplo, Sambrook y col., supra. La secuencia de Intrón A puede posteriormente unirse a otras secuencias de control tal como un promotor adecuado (si el Intrón A se aisla sin la región potenciadora/promotora IE1 hCMV restante), y a la secuencia codificadora deseada, usando técnicas conocidas.

La secuencia del fragmento de Intrón A puede optimizarse para uso en sistemas de expresión particulares usando técnicas bien conocidas. Adicionalmente, pueden cambiarse porciones de la secuencia del fragmento, por ejemplo, mediante deleción o sustitución de posibles puntos de ramificación, así como otras regiones de la molécula. Estas regiones de un Intrón A representativo se muestran en la Figura 1 A. Una secuencia optimizada particular del fragmento de Intrón A se muestra en la Figura 1 C. Como se explica en los ejemplos, este fragmento se obtuvo mediante la deleción en primer lugar de mayor parte de la secuencia 3' de la región de Intrón A y la posterior sustitución, por medio de un oligonucleótido sintético, de los últimos 80 nucleótidos de la región de Intrón A con una secuencia optimizada, y la inclusión de Exon 2 de la región 5'-UTR. La secuencia optimizada se basó en el punto de ramificación publicado y las secuencias de consenso de la extensión polipirimidina. Alternativamente, las secuencias mutagenizadas pueden obtenerse por medio de técnicas bien conocidas, tales como las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio y reacción en cadena de polimerasa (PCR) donde resultan adecuadas. Ver, por ejemplo, Sambrook, supra.

Una vez obtenido, el fragmento puede usarse para dirigir la transcripción de una proteína deseada en una amplia variedad de tipo celulares. Los elementos de control con actuación cis pueden asociarse convenientemente con el fragmento de Intrón A con el fin de optimizar la expresión de la secuencia codificadora asociada al mismo. Si las proteínas producidas en el sistema son también secretadas naturalmente o fabricadas para hacerlo, las células transformadas pueden producir el producto proteico durante períodos de tiempo prolongados, aumentando además los rendimientos. El sistema permite la producción de una proteína deseada en una configuración auténtica, con modificaciones auténticas posteriores a la traducción, en una forma relativamente pura y en cantidades económicamente
útiles.

Por lo tanto, los fragmentos de Intrón A de la presente invención encontrarán uso en construcciones de expresión para expresar una amplia variedad de sustancias, incluyendo péptidos que actúan como agentes antibióticos y antivirales, por ejemplo, péptidos inmunogénicos para uso en vacunas y diagnóstico; anticuerpos recombinantes; antineoplásicos; inmunomoduladores, tales como cualquiera de las diversas citoquinas incluyendo interleuquina-1, interleuquina-2, interleuquina-3, interleuquina-4 e interferón gamma; hormonas peptídicas tales como insulina, proinsulina, hormona del crecimiento, GHRH, LHRH, EGF, somatostatina, SNX-111, BNP, insulinotropina, ANP, FSH, LH, PSH y hCG, hormona esteroide gonadal (andrógenos, estrógenos y progesterona), hormona estimulante de tiroides, inhibina, colecistoquinina, ACTH, CRF, dinorfinas, endorfinas, endotelina, fragmentos de fibronectina, galanina, gastrina, insulinotropina, glucagon, fragmentos de proteína ligadora de GTP, guanilina, las leucoquininas, magainina, mastoparanos, dermaseptina, sistemina, neuromedinas, neurotensina, pancreastatina, polipéptido pancreático, sustancia P, secretina, timosina y similares; y factores de crecimiento, tales como PDGF, EGF, KGF, IGF-1 e IGF-2, FGF, y similares.

Más particularmente, las proteínas para uso en vacunas y diagnóstico pueden ser de origen viral, bacteriano, fúngico o parasitario, incluyendo pero no limitándose a, aquellos codificados por virus humanos y animales y pueden corresponder tanto a proteínas estructurales como no estructurales. Por ejemplo, el presente sistema encontrará uso en la producción recombinante de una amplia variedad de proteínas de la familia de herpesvirus, incluyendo proteínas derivadas de virus de herpes simplex (HSV) de tipo 1 y 2, tales como las glicoproteínas gB, gD y gH de HSV-1 y HSV-2; proteínas derivadas del virus varicella zoster (VZV), virus Epstein-Barr (EBV) y citomegalovirus (CMV) incluyendo CMV gB y gH; y proteínas derivadas de otros herpesvirus humanos tales como HHV6 y HHV7. (Ver, por ejemplo Chee y col., Cytomegaloviruses (J. K. McDougall, ed., Springer-Verlag 1990) pág. 125-169, para una revisión del contenido codificador de proteína de citomegalovirus; McGeoch y col., J. Gen. Virol. (1988) 69:1531-1574, para una discusión de las diversas proteínas codificadas de HSV-1; la Patente de EEUU Nº 5.171.568 para una discusión de proteínas gB y gD de HSV-1 y HSV-2 y los genes que codifican las mismas; Baer y col., Nature (1984) 310:207-211, para la identificación de secuencias de proteínas en un genoma de EBV; y Davison y Scott, J. Gen. Virol. (1986) 67:1759-1816, para una revisión de VZV).

Pueden también usarse convenientemente en las técnicas descritas en este documento las secuencias de polinucleótidos que codifican proteínas de los virus de la familia hepatitis, incluyendo el virus de hepatitis A (HAV), virus de hepatitis B (HBH), virus de hepatitis C (HCV), virus de hepatitis delta (HDV), virus de hepatitis E (HEV) y virus de hepatitis G (HGV). A modo de ejemplo, la secuencia genómica viral de HCV es conocida, ya que existen procedimientos para obtener la secuencia. Ver, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Nº WO 89/04669; WO 90/11089; y WO 90/14436. El genoma de HCV codifica diversas proteínas virales, incluyendo E1 (también conocida como E) y E2 (también conocida como E2/NSI). (Ver, Houghton y col., Hepatology (1991) 14:381-388, para una discusión de las proteínas de HCV, incluyendo E1 y E2). Las secuencias que codifican cada una de esas proteínas, así como fragmentos antigénicos de las mismas, encontrarán utilidad en el presente sistema. De manera similar, la secuencia codificadora para el antígeno \delta de HDV es conocida (ver, por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 5.378.814) y esta secuencia también puede usarse convenientemente en el presente sistema. Adicionalmente, encontrarán utilidad en este documento los antígenos derivados de HBV, tales como el antígeno core, el antígeno de superficie, sAg, así como las secuencias de presuperficie, preS1 y preS2 (anteriormente llamadas preS), así como combinaciones de las anteriores, tales como sAg/preS1, sAg/preS2, sAg/preS1/preS2, y preS1/preS2. Ver, por ejemplo, "HBV Vaccines - from the laboratory to license: a case study" en Mackett, M. y Williamson, J. D., Human Vaccines and Vaccination, pág. 159-176, para una discusión de la estructura de HBV; Beames y col., J. Virol. (1995) 69:6833-6838, Birnbaum y col., J. Virol. (1990) 64:3319-3330; y Zhou y col., J. Virol. (1991) 65:5457-5464.

Pueden también ser de utilidad en los sistemas de expresión las secuencias de polinucleótidos que codifican proteínas derivadas de otros virus, tales como pero no limitándose a, proteínas de miembros de las familias Picornaviridae (por ejemplo, poliovirus, etc.); Caliciviridae; Togaviridae (por ejemplo, virus de rubeola, virus de dengue, etc.); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae; Birnaviridae; Rhabodoviridae (por ejemplo, virus de la rabia, etc.); Filoviridae; Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de paperas, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial, etc.); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de influenza tipos A, B y C, etc.); Bunyaviridae; Arenaviridae; Retroviradae (por ejemplo, HTLV-I; HTLV-II; HIV-1 (también conocidos como HTLV-III, LAV, ARV, hTLR, etc.)), incluyendo pero no limitándose a antígenos de HIV_{IIIb}, HIV_{SF2}, HIV_{LAV}, HIV_{LAI}, HIV_{MN} aislados); HIV-1_{CM235}, HIV-1_{US4}; HIV-2; de inmunodeficiencia en simios (SIV) entre otros. Ver, por ejemplo, Virology, 3rd Edition (W. K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2nd Edition (B. N. Fields y D. M. Knipe, eds. 1991), para una descripción de estos y otros virus.

Por ejemplo, la invención puede usarse en construcciones de expresión para expresar genes que codifican la proteína de envoltura gp120 de cualquiera de los HIV aislados anteriores. Las secuencias de gp120 para muchos de los HIV-1 y HIV-2 aislados, incluyendo miembros de diversos subtipos genéticos de HIV, son conocidas y están descritas (ver, por ejemplo, Myers y col., Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico (1992); Myers y col., Human Retroviruses and Aids, 1990, Los Alamos, New Mexico: Los Alamos National Laboratory; y Modrow y col., J. Virol. (1987) 61:570-578, para una comparación de las secuencias del gen de envoltura de una variedad de HIV aislados) y secuencias derivadas de cualquiera de estos aislados encontrarán utilidad en el procedimiento presente. Además, la invención es igualmente aplicable a otras proteínas inmunogénicas derivadas de cualquiera de los diversos HIV aislados, incluyendo cualquiera de las diversas proteínas de envoltura tales como gp160 y gp41, antígenos gag tales como p24gag y p55gag, así como proteínas derivadas de la región pol. La presente invención también encontrará uso en construcciones de expresión para la expresión de proteínas del virus e influenza. Específicamente, las glicoproteínas de envoltura HA y NA de influenza A son de particular interés para generar una respuesta inmune. Se identificaron numerosos subtipos HA de influenza A (Kawaoka y col., Virology (1990) 179:759-767; Webster y col., "Antigenic variation among type A influenza viruses," pág. 127-168. En: P. Palese y D. W. Kingsbury (ed.), Genetics of influenza viruses. Springer-Verlag, New York). Por lo tanto, las secuencias genéticas que codifican proteínas derivadas de cualquiera de estos aislados pueden también usarse en las técnicas de producción recombinante descritas en este documento.

Además los fragmentos descritos en este documento proveen un medio para producir proteínas útiles para tratar una variedad de cánceres. Por ejemplo, el sistema de la presente invención puede usarse para producir una variedad de antígenos tumorales que pueden usarse para generar tanto respuesta inmune humoral como mediada por células, frente a proteínas específicas particulares del cáncer en cuestión tales como un oncogen activado, un antígeno fetal o un marcador de activación. Dichos antígenos tumorales incluyen cualquiera de los diversos MAGEs (antígenos E asociados al melanoma), incluyendo MAGE 1, 2, 3, 4, etc. (Boon, T. Scientific American (Marzo, 1993): 82-89); cualquiera de las diversas tirosinasas; MART 1 (antígeno de melanoma reconocido por células T), ras mutante; p53 mutante; antígeno p97 de melanoma; CEA (antígeno carcinoembrionario), entre otros.

Resulta fácilmente evidente que la presente invención puede usarse para producir una variedad de proteínas útiles para la prevención, tratamiento y/o diagnóstico de una amplia variedad de enfermedades.

Las secuencias de polinucleótidos que codifican las moléculas descritas anteriormente pueden obtenerse usando procedimientos recombinantes, tales como selección de ADNc y bibliotecas genómicas a partir de células que expresan el gen, o derivando el gen a partir de un vector conocido para incluirlo. Además, el gen deseado puede aislarse directamente de células y tejidos que lo contienen usando técnicas estándar, tales como extracción con fenol y PCR de ADNc o ADN genómico. Ver, por ejemplo, Sambrook y col., supra, para una descripción de las técnicas usadas para obtener y aislar ADN. El gen de interés puede también producirse sintéticamente además de clonarse. La secuencia de nucleótidos puede diseñarse con los codones adecuados para la secuencia de aminoácidos particular deseada. En general, se seleccionarán los codones de preferencia para el huésped en el que se expresará la secuencia. La secuencia completa puede montarse superponiendo oligonucleótidos preparados mediante procedimientos estándar y montarse en una secuencia codificadora completa. Ver, por ejemplo, Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair y col., Science (1984) 223:1299; Jay y col., J. Biol. Chem. (1984) 259:6311.

Pueden también usarse marcadores y amplificadores en los sistemas de expresión de invención. Se conoce una variedad de marcadores útiles para la selección de líneas celulares transformadas y generalmente comprenden un gen cuya expresión confiere un genotipo seleccionable en células transformadas cuando las células se cultivan en un medio selectivo adecuado. Tales marcadores para líneas celulares de mamíferos incluyen, por ejemplo, el gen de fosforribosiltransferasa de xantina-guanina bacteriana, que puede seleccionarse en un medio que contiene ácido micofenólico y xantina (Mulligan y col. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072-2076), y el gen de fosfotransferasa de aminoglicósido (especificando una proteína que inactiva la acción antibacteriana de los derivados de neomicina y kanamicina), que pueden seleccionarse por usar medios que contienen derivados de neomicina tales como G418 los que normalmente son tóxicos para las células de mamíferos (Colbere-Garapin y col. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14). Los marcadores útiles para otros sistemas de expresión son bien conocidos por los expertos en la técnica. Estos y otros marcadores seleccionables pueden obtenerse a partir de plásmidos disponibles comercialmente, usando técnicas bien conocidas. Ver, por ejemplo Sambrook y col., supra.

La expresión puede también amplificarse colocando un gen amplificable, tal como el gen de dihidrofolato reductasa de ratón (dhfr) adyacente a la secuencia codificadora. Las células pueden posteriormente seleccionarse por su resistencia al metotrexato en las células deficientes en dhfr. Ver, por ejemplo, Urlaub y col. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220; Ringold y col. (1981) J. Mol. and Appl. Genet. 1:165-175. Las construcciones que incluyen tanto marcadores como amplificadores también encontrarán utilidad en los vectores de la expresión de la invención, tales como cualquiera de las diversas construcciones EMCV-DHFR/Neo descritas en, por ejemplo, Patente de EEUU Nº 6.096.505.

Las secuencias de terminación de la transcripción y poliadenilación pueden también estar presentes, ubicadas posición 3' hacia el codón de finalización de traducción para la secuencia codificadora. Los ejemplos de señales de terminación de la transcripción/poliadenilación incluyen, pero no se limitan a, aquellas derivadas de SV40, como se describe en Sambrook y col., supra, así como una secuencia de terminación de la hormona de crecimiento bovina.

También puede estar presente una región promotora en las construcciones de expresión de la invención. El promotor puede ser le promotor IE1 de hCMV homólogo normalmente asociado con la secuencia de Intrón A completa, intacta del fragmento del que deriva, un promotor IE1 de CMV heterólogo (por ejemplo de una cepa de CMV diferente), o un promotor IE1 no CMV. La elección del promotor dependerá del tipo celular usado para la expresión y un experto en la técnica puede determinarlo fácilmente. Por ejemplo, los promotores típicos para expresión en células de mamíferos incluyen el promotor temprano SV40, un promotor de CMV como el descrito anteriormente, el promotor LTR del virus tumoral mamario del ratón, el promotor principal tardío de adenovirus (Ad MLP), el promotor RSV, el promotor SR\alpha, el promotor del virus herpes simplex, promotores específicos de tejidos, entre otros. Un promotor en particular usado en las construcciones descritas en este documento es un promotor derivado de la región potenciadora/promotora IE1 de hCMV descrito en la Figura 2, tal como aproximadamente las posiciones de nucleótidos 460 a 1264 de la Figura 2, o porciones funcionales de esta región. Otros promotores no virales, tal como el promotor derivado del gen de metalotioneina murina, también encontrarán uso en la expresión en mamíferos. Los sistemas de expresión en células de insecto, típicamente sistemas de Baculovirus, generalmente incluirán un promotor de polihedrina. Los promotores para uso en sistemas bacterianos incluyen secuencias de promotores derivadas de enzimas de metabolización de azúcares, tales como galactosa, lactosa (lac), (Chang y col., Nature (1977) 198:1056), y maltosa, secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tal como triptofano (trp) (Goeddel y col., Nuc. Acids Res. (1980) 8:4057; Yelverton y col., Nucl. Acids Res. (1981) 9:731; la Patente de EEUU Nº 4.738.921; las Publicaciones EPO Nº 036.776 y 121.775), el sistema promotor de b-lactamasa (bla) (Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes" en Interferon 3 (ed. I. Gresser)), bacteriofago lambda PL (Shimatake y col., Nature (1981) 292:128), el promotor T5 (Patente de EEUU Nº 4.689.406), promotores híbridos tales como tac, un promotor híbrido trp-lac (Amann y col., Gene (1983) 25:167; de Boer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (1983) 80:21). Los promotores útiles en sistemas de expresión en levaduras incluyen, por ejemplo, promotores de secuencias que codifican enzimas en vías metabólicas tales como promotores de alcohol deshidrogenasa (ADH) (Publicación EPO Nº 284.044), enolasa, glucoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAP o GAPDH), hexoquinasa, fosfofructoquinasa, 3-fosfoglicerato mutasa, y piruvato quinasa (PyK) (Publicación EPO Nº 329.203). Otros promotores para uso en tales sistemas incluyen un promotor derivado del gen PHO5 de levadura, que codifica fosfatasa ácida (Myanohara y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:1), así como sintéticos tales como un promotor formado por la fusión de secuencias UAS de un promotor de levadura con la región de activación de transcripción del promotor de otra levadura, creando un promotor híbrido sintético. Los ejemplos de tales promotores híbridos incluyen la secuencia regulatoria de ADH unida a la región de activación de la transcripción GAP (Patentes de EEUU Nº 4.876.197 y 4.88734), así como promotores que están constituidos por las secuencias regulatorias de algunos de los genes ADH2, GAL4, GAL10 o PHO5, combinados con la región de activación de la transcripción de un gen de enzima glicolítica tales como GAP o PyK (Publicación EPO Nº 164.556). Estos y otros promotores pueden obtenerse a partir de plásmidos disponibles comercialmente, usando técnicas conocidas. Ver, por ejemplo, Sambrook y col., supra.

Un vector de expresión se construye de manera tal que la secuencia codificadora está ubicada en el vector con el fragmento de Intrón A y las secuencias regulatorias adecuadas, siendo el posicionamiento y la orientación de la secuencia codificadora con respecto a las secuencias de control tal que la secuencia codificadora es trasncrita bajo el "control" de las secuencias de control (es decir, la ARN polimerasa que se une a la molécula de ADN en el promotor trasncribe la secuencia codificadora). La modificación de las secuencias que codifican la molécula de interés puede resultar deseable para alcanzar este fin. Por ejemplo, en algunos casos podrá ser necesario modificar la secuencia de tal manera que pueda ser unida al promotor y otras secuencias de control en una orientación adecuada; es decir, para mantener el marco de lectura. La secuencia promotora y otras secuencias regulatorias pueden unirse a la secuencia codificadora previamente a la inserción dentro del vector. Alternativamente, la secuencia codificadora puede clonarse directamente en un vector de expresión que ya contiene el fragmento de Intrón A en un sitio de restricción
adecuado.

También puede resultar deseable producir mutantes o análogos del gen de interés. Los mutantes o análogos del polipéptidos de interés pueden prepararse mediante la deleción de una porción de la secuencia que codifica el polipéptido de interés, por inserción de una secuencia, y/o por sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Las técnicas para modificar las secuencias de nucleótidos, tal como la mutagénesis dirigida a un sitio o similares, son bien conocidas por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook y col., supra; Kunkel, T. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448; Geisselsoder y col. (1987) BioTechniques 5:786; Zoller y Smith (1983) Methods Enzymol. 100:468; Dalbie-McFarland y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 79:6409.

Una vez que las construcciones de expresión están montadas, pueden usarse en una amplia variedad de sistemas, incluyendo sistemas de expresión en insectos, mamíferos, bacterianos, virales y en levaduras, todos bien conocidos en la técnica. Las molécula de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos de interés pueden integrarse de manera estable dentro del genoma de la célula huésped o mantenerse en un elemento episomal estable en una célula huésped adecuada usando diversas técnicas de administración de genes bien conocidas en la técnica. Ver como por ejemplo la Patente de EEUU Nº 5.399.346.

Por ejemplo, los sistemas de expresión en célula de insecto, tales como los sistemas de baculovirus, son conocidos por los expertos en la técnica y están descritos en, por ejemplo, Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nº 1555 (1987). Los materiales y procedimientos para sistemas de expresión de baculovirus/célula de insecto están disponibles comercialmente en forma de equipos de, inter alia, Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac" kit). De manera similar, los sistemas de expresión en células bacterianas y de mamíferos son bien conocidos en la técnica y están descritos en, por ejemplo, Sambrook y col., supra. Los sistemas de expresión en levaduras son bien conocidos en la técnica y están descritos en, por ejemplo, Yeast Genetic Engineering (Barr y col., eds., 1989) Butterworths, London.

También se conocen una cantidad adecuada de células huésped para usar con los sistemas anteriores. Por ejemplo, las líneas celulares de mamíferos son conocidas en la técnica e incluyen líneas de células inmortalizadas disponibles en American Type Culture Collection (ATCC), tales como, pero no limitadas a, células de ovario de hámster Chino (CHO), células HeLa, células de riñón de de crías de hámster (BHK), células de riñón de monos (COS), células embrionarias de riñón humanas, células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células de riñón bovinas Madin-Darby ("MDBK"), así como otras. De manera similar, los huéspedes bacterianos tales como E. coli, Bacillus subtilis, y Streptococcus spp., encontrarán utilidad con las construcciones de expresión de la invención. Las levaduras huésped útiles en la presente invención incluyen inter alia, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Las células de insecto para uso con vectores de expresión de baculovirus incluyen, inter alia, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni.

Puede usarse una amplia variedad de procedimientos para administrar las construcciones de expresión a las células. Tales procedimientos incluyen transfección mediada por dextran DEAE, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polilisina o poliornitina o precipitación usando otras sales inorgánicas insolubles, tales como fosfato de estroncio, silicatos de aluminio incluyendo bentonita y caolín, óxido crómico, silicato de magnesio, talco y similares. Otros procedimientos útiles de transfección incluyen la electroporación, sonoporación, fusión de protoplastos, liposomas, administración peptoide o microinyección. Ver, por ejemplo, Sambrook y col., supra, para una discusión de técnicas para transformar células de interés.

Por ejemplo, las construcciones de expresión pueden empaquetarse en liposomas previo a la administración a las células. La encapsulación de lípidos generalmente se realiza usando liposomas capaces de unirse de manera estable o atrapar y retener ácido nucleico. La cantidad de ADN condensado con relación a la preparación de lípidos puede variar pero generalmente es de alrededor de 1:1 (mg de ADN: micromoles de lípidos), o más de lípidos. Para una revisión acerca del uso de liposomas como vehículos para la administración de ácidos nucleicos, ver, Hug y Sleight, Biochem. Biophys. Acta. (1991) 1097:1-17; Straubinger y col., en Methods of Enzymology (1983), Vol. 101, pág. 512-527.

Las preparaciones de liposomas para uso con la presente invención incluyen preparaciones catiónicas (cargadas positivamente), aniónicas (cargadas negativamente) y neutras, siendo particularmente de preferencia los liposomas catiónicos. Los liposomas catiónicas están fácilmente disponibles, por ejemplo, los liposomas N[1-2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamonio (DOTMA) están disponibles bajo la marca registrada Lipofectin, en GIBCO BRL, Grand Island, N.Y.. (Ver, también, Felgner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84:7413-7416). Otros lípidos disponibles comercialmente incluyen transfectasa (DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (Boerhinger). Otros liposomas catiónicos pueden prepararse a partir de materiales fácilmente disponibles usando técnicas bien conocidas. Ver, por ejemplo, Szoka y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75:4194-4198; Publicación PCT Nº WO 90/11092 para una descripción de la síntesis de liposomas DOTAP (1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano). Los diversos complejos liposoma-ácido nucleico se preparan usando procedimientos bien conocidos. Ver, por ejemplo, Straubinger y col., en METHODS OF IMMUNOLOGY (1983), Vol. 101, pág. 512-527; Szoka y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75:4194-4198; Papahadjopoulos y col., Biochim. Biophys. Acta (1975) 394:483; Wilson y col., Cell (1979) 17:77); Deamer y Bangham, Biochim. Biophys. Acta (1976) 443:629; Ostro y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1977) 76:836; Fraley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:3348); Enoch y Strittmatter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:145); Fraley y col., J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka y Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75:145; y Schaefer-Ridder y col., Science (1982) 215:166.

El ADN también puede administrarse en composiciones de lípido de cocleato similares a aquellas descritas por Papahadjopoulos y col., Biochem. Biophys. Acta. (1975) 394:483-491. Ver, también, la Patente de EEUU Nº 4.663.161 y 4.871.488.

Dependiendo del sistema de expresión y del huésped seleccionado, las moléculas se producen cultivando células huésped transformadas por un vector de expresión descrito anteriormente bajo condiciones en las que se expresa la proteína. Posteriormente se aisla la proteína expresada de las células huésped y se purifica. Si el sistema de expresión secreta la proteína en el medio de cultivo, el producto puede purificarse directamente desde el medio. Si no se secreta, puede aislarse de lisados celulares. La selección de las condiciones adecuadas de cultivo y los procedimientos de recuperación se encuentran dentro de la experiencia de la técnica. Por ejemplo, una vez expresado, el producto puede aislarse y purificarse por una cantidad de técnicas, bien conocidas, que incluyen: cromatografía, por ej. HPLC, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, exclusión por tamaño, etc.; electroforesis; centrifugación en gradiente de densidad; extracción con solventes, y similares. Ver, por ejemplo, Protein Purification Principles and Practice, 2nd edition (Robert K. Scopes ed. 1987); y Protein Purification Methods, a Practical Approach (E. L. V. Harris y S. Angal, eds. 1990).

Las construcciones de expresión de la presente invención pueden también usarse para inmunización con ácidos nucleicos y terapia génica, usando protocolos estándar de administración de genes. Los procedimientos para administración de genes son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 5.399.346, 5.580.859, 5.589.466, incorporadas en este documento por referencia en su totalidad. Los genes pueden administrarse al sujeto vertebrado ya sea directamente o, alternativamente, ex vivo, a células derivadas del sujeto y reimplantando dichas células en el sujeto.

Se han desarrollado una cantidad de sistemas basados en virus para transferir genes dentro de células de mamíferos. Por ejemplo, los retrovirus proveen una plataforma conveniente para sistemas de administración de genes. Un gen seleccionado puede insertarse dentro de un vector y empaquetarse en partículas retrovirales usando procedimientos conocidos en la técnica. Posteriormente, puede aislarse el virus recombinante y administrarse a células del sujeto ya sea in vivo o ex vivo. Se describió una cantidad de sistemas retrovirales (Patente de EEUU Nº 5.219.740; Miller y Rosman, BioTechniques (1989) 7:980-990; Miller, A. D., Human Gene Therapy (1990) 1:5-14; Scarpa y col., Virology (1991) 180:849-852; Burns y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:8033-8037; y Boris-Lawrie y Temin, Cur. Opin. Genet. Develop. (1993) 3:102-109. Concretamente, los vehículos retrovirales para administración de genes de la presente invención pueden construirse fácilmente a partir de una amplia variedad de retrovirus, incluyendo por ejemplo, retrovirus de tipo B, C y D así como spumavirus y lentivirus tales como FIV, HIV, HIV-1, HIV-2 y SIV (ver RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985). Tales retrovirus pueden obtenerse fácilmente de depósitos o colecciones tales como American Type Culture Collection ("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209), o aislarse de fuentes conocidas usando técnicas comúnmente disponibles.

Se ha descrito también una cantidad de vectores adenovirus. A diferencia de los retrovirus que se integran dentro del genoma del huésped, los adenovirus persisten extracromosómicamente minimizando así el riesgo asociado con la mutagénesis producida por la inserción (Haj-Ahmad y Graham, J. Virol. (1986) 57:267-274; Bett y col., J. Virol. (1993) 67:5911-5921; Mittereder y col., Human Gene Therapy (1994) 5:717-729; Seth y col., J. Virol. (1994) 68:933-940; Barr y col., Gene Therapy (1994) 1:51-58; Berkner, K. L. BioTechniques (1988) 6:616-629; y Rich y col., Human Gene Therapy (1993) 4:461-476).

Adicionalmente, se desarrollaron diversos sistemas con vectores virus adenoasociados (AAV) para administrar genes. Los vectores AAV pueden construirse fácilmente usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo las Patentes de EEUU Nº 5.173.414 y 5.139.941; las Publicaciones Internacionales Nº WO 92/01070 (publicada el 23 de Enero, 1992) y WO 93/03769 (publicada el 4 de Marzo, 1993); Lebkowski y col., Molec. Cell. Biol. (1988) 8:3988-3996; Vincent y col., Vaccines 90 (1990) (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. Current Opinion in Biotechnology (1992) 3:533-539; Muzyczka, N. Current Topics in Microbiol. and Immunol. (1992) 158:97-129; Kotin, R. M. Human Gene Therapy (1994) 5:793-801; Shelling y Smith, Gene Therapy (1994) 1:165-169; y Zhou y col., J. Exp. Med. (1994) 179:1867-1875.

Pueden también usarse para administración de genes los vectores de conjugados moleculares, tales como los vectores quiméricos de adenovirus descritos por Michael y col. en J. Biol. Chem. (1993) 268:6866-6869 y por Wagner y col. en Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:6099-6103.

También encontrarán uso como vectores virales para la administración de genes de interés los miembros del género Alphavirus, tales como pero no limitados a vectores derivados de los virus Sindbis, Semliki Forest y VEE. Para una descripción acerca de vectores derivados de virus Sinbus para la práctica de los presentes procedimientos, ver, Dubensky y col., J. Virol. (1996) 70:508-519; y las Publicaciones Internacionales Nº WO 95/07995 y WO 96/17072.

Las construcciones de expresión de la presente invención pueden administrarse también sin un vector viral. Por ejemplo, la construcción puede administrarse directamente, o empaquetada en liposomas previamente a la administración al sujeto o a células derivadas del mismo, como se describió anteriormente.

Las construcciones de expresión pueden también encapsularse en, adsorberse a, o asociarse con vehículos particulados. Tales vehículos presentan múltiples copias de una molécula seleccionada al sistema inmunológico y promueven el atrapamiento y la retención de las moléculas en los ganglios linfáticos locales. Las partículas pueden ser fagocitadas por macrófagos y pueden potenciar la presentación de antígenos a través de la liberación de citoquinas. Los ejemplos de vehículos particulados incluyen aquellos derivados de polímeros de polimetilmetacrilato, así como micropartículas derivadas de poli(láctidos) y poli(láctido-co-glicólidos), conocidos como PLG, ver, por ejemplo, Jeffery y col., Pharm. Res. (1993) 10:362-368; y McGee y col., J. Microencap. (1996).

Además, pueden usarse otros sistemas particulados y polímeros para la administración in vivo o ex vivo de construcciones de expresión. Por ejemplo, son útiles para transferir un ácido nucleico de interés, polímeros tal como polilisina, poliarginina, poliomitina, espermina, espermidina, así como conjugados de estas moléculas. De manera similar, encontrarán uso en el presente sistema, la transfección mediada por DEAE, precipitación con fosfato de calcio o precipitación usando otras sales inorgánicas insolubles, tales como fosfato de estroncio, silicatos de aluminio incluyendo bentonita y caolín, óxido crómico, silicato de magnesio, talco, y similares. Ver, por ejemplo, Felgner, P. L., Advanced Drug Delivery Reviews (1990) 5:163-187, para una revisión acerca de sistemas de administración útiles para transferir genes.

Adicionalmente, resultan especialmente útiles los sistemas de administración biolísticos que usan vehículos particulados tales como oro y tungsteno, para la administración de construcciones de expresión de la presente invención. Las partículas están recubiertas con la construcción que se quiere administrar y se aceleran a alta velocidad, generalmente bajo atmósfera reducida, usando una pistola de descarga de polvo de una "pistola de genes". Para una descripción de tales técnicas y aparatos útiles, ver, por ejemplo las Patentes de EEUU Nº 4.945.050; 5.036.006; 5.100.792; 5.179.022; 5.371.015; y 5.478.744.

Depósitos de Cepas Útiles en la Práctica de la Invención

Se realizó un depósito de cultivos biológicamente puros de las siguientes cepas en The American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. El número de acceso indicado se asignó tras probar con éxito la viabilidad y pagar los derechos necesarios, bajo la provisión de Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de cultivos viables durante un período de treinta (30) años desde la fecha de depósito. Los organismos quedaron disponibles por la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapesr, que asegura disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie a quien determina el U.S. Commissioner of Patents and Trademarks con derecho para el mismo de acuerdo con 35 USC \NAK 122 y las reglas del Commissioner de acuerdo con el mismo (incluyendo 37 CFR \NAK 1,12 con particular referencia a 886 OG 638). Sobre la cesión de una patente, todas las restricciones acerca de la disponibilidad al público de los cultivos depositados se eliminarán irrevocablemente.

Estos depósitos se proveen solamente como conveniencia para aquellos expertos en la técnica, y no es una reconocimiento que el depósito se exija bajo 35 USC \NAK 112. Las secuencias de los ácidos nucleicos de estos genes, así como las secuencias de aminoácidos de las moléculas codificadas por los mismos, se incorporan en este documento por referencia y sirven como control en el caso de cualquier conflicto con la descripción de este documento. Se exigirá una licencia para fabricar, usar, o vender los materiales depositados, y tal licencia no es cedida por la presente.

	Plásmido	Fecha de Depósito	Nº ATCC
	pCON3	27 de Septiembre, 2000	PTA-2504

III. Desarrollo experimental

A continuación se presentan ejemplos de formas de realización específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen sólo con finalidad ilustrativa, y no intentan limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.

Se realizaron esfuerzos para asegurar la precisión en relación a los números usados (por ej. cantidades, temperaturas, etc.), pero deberían tenerse en cuenta, por supuesto, algunos errores y desviaciones experimentales.

Las enzimas de restricción y de modificación, así como otros reactivos para las manipulaciones de ADN se adquirieron en proveedores comerciales, y se usaron de acuerdo con las directivas de los fabricantes. En la clonación de fragmentos de ADN, excepto donde se indica, todas las manipulaciones de ADN se realizaron de acuerdo con procedimientos estándar, Ver, por ejemplo, Sambrook y col., supra.

Ejemplo 1 Producción de Construcciones de Expresión que Incluyen Fragmentos de Intrón A

Se realizó una serie de 13 construcciones de expresión que delecionaron desde entre 54 y 688 nucleótidos de la región core de Intrón A, unidas por el dador de empalme y sitios puntuales de ramificación. Las construcciones de expresión se unieron a un gen de luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis) o a un gen p55gag de HIV optimizado con codón (Zur Megede y col., J. Virol. (2000) 74:2628-2635).

La deleción inicial de Intrón A se preparó por medio de la sustitución de un fragmento Nsil-Sall de 778 pares de bases del plásmido pCMVkmLuc (Publicación Internacional Nº WO 98/06437) con un oligonucleótido sintético (Figura 1B) que restauró los últimos 80 nucleótidos del Intrón A (con punto de ramificación optimizado y secuencias de extensión de polipirimidina como se muestran en la Figura 1B), junto con Exon 2 de 5'-UTR (nucleótidos 821-834 de la Figura 1A). La construcción resultante contuvo una deleción de 688 pb del Intrón A y se muestra en la Figura 1A. El plásmido de expresión resultante, pCON3, contiene la región potenciadora/promotora de hCMV con un fragmento de Intrón A de 130 pb. La secuencia final del intrón en pCON3 se muestra en la Figura 1C.

Se realizaron doce construcciones de deleción de Intrón A adicionales por medio de deleciones progresivas dentro del plásmido pCMVII (Patente de EEUU Nº 6.096.505) en dirección 5' \rightarrow 3' desde el sitio único NsiI hacia el sitio único HpaI, o en dirección 3' \rightarrow 5' desde el sitio HpaI hacia el sitio NsiI (ver, Figura 3 y Tabla 1). Tras la digestión con enzimas de restricción, se trató los plásmidos con T4 ADN polimerasa y dNTPs en exceso. Los fragmentos de vectores con extremos romos se purificaron en gel y se autounieron. Como se muestra en la Figura 3, estas construcciones incluyeron deleciones dentro del intrón de longitudes en un intervalo desde 54 hasta 663 pares de bases. Para generar vectores de expresión con las modificaciones resultantes en el intrón, se sustituyó el fragmento NdeI-SaII de los plásmidos truncados en plásmidos pCMVkmLuc digeridos con NdeI y SaII. De estas construcciones, las seleccionadas se sometieron a digestión con SaII-XbaI para generar fragmentos de vectores receptores para la inserción del gen p55gag de HIV optimizado con codón obtenido por digestión del plásmido pCMVkm2.GAGmod.SF2 (Zur Megede y col., J. Virol (2000) 74:2628-2635).

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TABLA 1

Digerido	Longitud de Deleción	NT. Delecionados de Intrón A (tras la digestión,
	(pb)	formación de extremos romos y reunión)
NsiI-CelII	70	47-116
NsiI-XcmI	113	47-159
NsiI-PflmI	150	47-196
NsiI-MroI	345	47-391
NsiI-BfrI	578	47-624
NsiI-PvuII	609	47-655
NsiI-HpaI	663	47-709
HpaI-PvuII	54	656-709
HpaI-BrfI	80	630-709
HpaI-MroII	314	395-709
HpaI-PflmI	516	193-709
HpaI-CelII	590	119-709

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Ejemplo 2 Expresión de una Secuencia Codificadora Heteróloga Usando Fragmentos de Intrón A

Se cultivaron células 293 (ATTC Nº de Acceso CRL-1573) y RD (ATTC Nº de Acceso CCL-136) en medio DMEM suplementado con suero fetal de ternero 10% v/v). Catorce horas previo a la transfección, se sembraron 2 x 10^{5} células/pocillo en 6 placas de pocillos. La transfección transitoria se realizó usando 2 \mug del ADN del vector descrito anteriormente, por pocillo usando 12 \mug de Fugene (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) por instrucción del proveedor en 6 pocillos por duplicado por construcción. Cuarenta y ocho horas tras la transfección, se analizaron los lisados celulares buscando la expresión del gen. Se evaluó la expresión de p55gag de HIV por medio de un ELISA de antígeno p24 (Coulter, Miami, FL). Se calculó la media geométrica de los títulos en cada placa (construcción).

La transfección transitoria de 293 células y la evaluación de la expresión de luciferasa indicó que casi todos estos derivados expresaron de igual manera o mejor que el vector principal, pCMVkm-Luciferasa conteniendo la secuencia de Intrón A completa. Las construcciones con las mayores deleciones del intrón (pCon3, \DeltaHpaI-CelII) mostraron la mayor potenciación, aproximadamente dos veces mayor que la del vector principal (Figura 4).

Para evaluar además el efecto en la expresión de un intrón más pequeño, se sustituyó la secuencia completa de Intrón A con el Intrón I de 126 pares de bases del gen de \beta globina de conejo (R\betaG-IVSI). La Figura 5A muestra la secuencia del gen de \beta globina de conejo que se usó. El análisis in vitro de la expresión de p55gag indicó que la construcción de tipo salvaje tuvo una expresión hasta 1,8 veces superior a la del vector principal, pCMVkm-Luciferasa (Figura 6). Las secuencias de tipo salvaje son subóptimas para el dador de empalme, punto de ramificación y extensión poliY en relación con las secuencias de consenso para estos elementos. Por lo tanto, la construcción conteniendo R\betaG-IVSI se modificó de tal manera de optimizar estos elementos de la secuencia. La Figura 5B muestra la secuencia del gen de \beta globina de conejo optimizada que se usó, llamada R\betaG-OPTI. El análisis de esta construcción mostró una expresión de p55gag aproximadamente 4 veces mayor comparada con la del vector principal en vitro (Figura 6).

Se analizaron las 14 construcciones de intrón modificadas en su eficacia para empalmar el transcrito de ARN por RT-PCR. Para el análisis de transcriptos de ARN, se transfectaron transitoriamente 293 células y posteriormente se lisaron usando RNAstat 60 ((Tel-Test B, Inc., Friendswood, TX) para dar ARN celular total. Se sometió el ARN extraído a digestión con RQ1-Dnasa (Promega Corp, Madison, WI) y se realizó el análisis RT-PCR usando el equipo GeneAmp RNA PCR (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). La PCR abarcando la región del intrón se realizó usando un cebador secuencia arriba en exon 1 de 5' UTR [cebador "KBT-162"; secuencia CGCTGTTTT
GACCTCCATA (SEQ ID Nº 7)] y un cebador secuencia abajo del gen de luciferasa [cebador "KBT-163"; secuencia GTTGAGCAATTCACGTTCAT (SEQ ID Nº 8)]; también se realizó una PCR de control de transcriptos de actina para cada preparación de ARN. Todos los mutantes empalmaron eficazmente, dentro de la sensibilidad del ensayo, ya que no se detectaron productos de las longitudes previstas para mensajes no empalmados.

Ejemplo 3 Inmunización con Ácido Nucleico Usando el Fragmento de Intrón A

Con el fin de probar la capacidad de los fragmentos de Intrón A para dirigir la transcripción in vivo, se inmunizaron ratones Balb/C en grupos de 6 animales (Charles River Co., Willmington, MA) una vez bilateralmente en el músculo tibial anterior con 5 \mug de ADN del vector desnudo en el sitio de inyección (preparado libre de endotoxinas [Qiagen, Inc., Valencia, CA] y formulado en solución salina normal). En la tercera y la sexta semanas posteriores a la inmunización, se analizó sangre mediante ELISA para anticuerpo anti p55gag de HIV como se describe en Zur Megede y col., J. Virol. (2000) 74:2628-2635.

Las construcciones evaluadas se muestran en la Figura 7. Se observaron inmunogenicidades variables tras una única inmunización (ver, Figura 7). De manera significativa, el vector pCON3 con deleción de aproximadamente 85% de Intrón A rindió títulos medios geométricos mayores que el vector principal pCMVkm2.GAGmod.SF2 (Figura 7). Tres semanas posteriores a la inmunización, el título fue aproximadamente el doble de aquel con el vector principal aunque disminuyó 6 semanas tras la inyección.

De acuerdo con esto, se han descrito los fragmentos de Intrón A de hCMV nuevos y los procedimientos para usarlos. De lo precedente, se apreciará que, aunque en este documento se describieron formas de realización específicas con fines ilustrativos, pueden realizarse modificaciones sin desviarse del espíritu y el alcance de las reivindicaciones

<110> CHIRON CORPORATION

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<120> FRAGMENTOS DE INTRÓN A DE CITOMEGALOVIRUS

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<130> 2302-16095,40 / PP16095,003

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<140>

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<141>

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<150> 60/240.502

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<151> 2000-10-13

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<160> 8

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 838

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Intrón A longitud total

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 100

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligo sintético para sustitución de nucleótidos 52-740 de Intrón A

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<400> 2

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2

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<210> 3

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<211> 145

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Intrón de mutante de deleción pCON3

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<400> 3

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3

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<210> 4

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<211> 2170

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: gen inmediato temprano principal de hCMV

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<400> 4

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4

5

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<210> 5

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<211> 126

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: beta globina de conejo tipo salvaje

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<400> 5

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6

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<210> 6

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<211> 127

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: beta globina de conejo optimizada

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<400> 6

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7

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<210> 7

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador KBT-162

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgctgttttg acctccata

\hfill

19

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<210> 8

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador KBT-163

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

gttgagcaat tcacgttcat

\hfill

20

Claims (20)

1. Un fragmento de Intrón A de citomegalovirus humano (hCMV), en el que dicho fragmento carece de la secuencia de Intrón A completa y comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos contigua de los primeros 25 nucleótidos 5' de la secuencia de Intrón A de hCMV, y (b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con los últimos 25 nucleótidos 3' de una secuencia de Intrón A de hCMV, en el que dicho fragmento está presente en una construcción de expresión, la construcción de expresión que alcanza niveles de expresión mayores que aquellos niveles alcanzados por una construcción correspondiente que carece por completo de la secuencia de
Intrón A.

2. El fragmento de Intrón A de la reivindicación 1, en el que (a) dichos 25 primeros nucleótidos 5' de una secuencia de Intrón A de hCMV son los nucleótidos 1265-1289 de SEQ ID Nº 4, y (b) dichos 25 últimos nucleótidos 3' de una secuencia de Intrón A de hCMV son los nucleótidos 2064-2088 de SEQ ID Nº 4.

3. El fragmento de Intrón A de la reivindicación 1, en el que (a) dichos 25 primeros nucleótidos 5' de una secuencia de Intrón A de hCMV son los nucleótidos 1-25 de SEQ ID Nº 1, y (b) dichos 25 últimos nucleótidos 3' de una secuencia de Intrón A de hCMV son los nucleótidos 800-824 de SEQ ID Nº 1.

4. El fragmento de Intrón A de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho fragmento comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de los primeros 51 nucleótidos 5' de una secuencia de Intrón A de hCMV, y (b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de los últimos 80 nucleótidos 3' de una secuencia de Intrón A de hCMV.

5. El fragmento de Intrón A de la reivindicación 4, en el que (a) dichos 51 primeros nucleótidos 5' de una secuencia de Intrón A de hCMV son los nucleótidos 1265-1315 de SEQ ID Nº 4, y (b) dichos 80 últimos nucleótidos 3' de una secuencia de Intrón A de hCMV son los nucleótidos 2009-2088 de SEQ ID Nº 4.

6. El fragmento de Intrón A de la reivindicación 4, en el que (a) dichos 51 primeros nucleótidos 5' de una secuencia de Intrón A de hCMV son los nucleótidos 1-51 de SEQ ID Nº 1, y (b) dichos 80 últimos nucleótidos 3' de una secuencia de Intrón A de hCMV son los nucleótidos 745-824 de SEQ ID Nº 1.

7. El fragmento de Intrón A de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho fragmento está presente en una construcción de expresión, la construcción de expresión alcanza niveles de expresión al menos dos veces mayores que aquellos niveles alcanzados por una construcción correspondiente que carece por completo de la secuencia de Intrón A.

8. El fragmento de Intrón A de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho fragmento está presente en una construcción de expresión, la construcción de expresión alcanza niveles de expresión al menos diez veces mayores que aquellos niveles alcanzados por una construcción correspondiente que carece por completo de la secuencia de Intrón A.

9. El fragmento de Intrón A de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho fragmento está presente en una construcción de expresión, la construcción de expresión alcanza niveles de expresión al menos cincuenta veces mayores que aquellos niveles alcanzados por una construcción correspondiente que carece por completo de la secuencia de Intrón A.

10. El fragmento de Intrón A de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho fragmento está constituido por la secuencia de nucleótidos de Intrón A descrita en SEQ ID Nº 3, o una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con la misma.

11. El fragmento de Intrón A de la reivindicación 10, en el que dicho fragmento está constituido por la secuencia de nucleótidos de Intrón A descrita en SEQ ID Nº 3.

12. Un fragmento de Intrón A de citomegalovirus humano (hCMV), en el que dicho fragmento carece de la secuencia completa de Intrón A y comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos contigua de los primeros 25 nucleótidos 5' de la secuencia de Intrón A de hCMV, y (b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con los últimos 25 nucleótidos 3' de una secuencia de Intrón A de hCMV, en el que dicho fragmento está presente en una construcción de expresión, la construcción de expresión alcanza niveles de expresión iguales a, o mayores que, aquellos niveles alcanzados por una construcción de expresión que incluye una secuencia de Intrón A completa, intacta.

13. El fragmento de Intrón A de la reivindicación 12, en el que dicho fragmento comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de los primeros 51 nucleótidos 5' de una secuencia de Intrón A de hCMV, y (b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con los últimos 80 nucleótidos 3' de una secuencia de Intrón A de hCMV.

14. Una construcción de expresión recombinante eficaz para dirigir la transcripción de una secuencia codificadora seleccionada, dicha construcción de expresión comprendiendo: (a) una secuencia codificadora; (b) elementos de control unidos de manera operativa a dicha secuencia codificadora, en la que dichos elementos de control comprenden el fragmento de Intrón A de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, por lo que dicha secuencia codificadora puede transcribirse y traducirse en una célula huésped.

15. La construcción de expresión recombinante de la reivindicación 14, en la que dichos elementos de control además comprenden un promotor seleccionado del grupo constituido por un promotor temprano SV40, un promotor de CMV, un promotor LTR de virus de tumor mamario de ratón, un promotor tardío mayor de adenovirus, un promotor de RSV, un promotor de SR\alpha y un promotor de virus herpes simplex.

16. La construcción de expresión recombinante de la reivindicación 14 ó 15, en la que dichos elementos de control además comprenden la región potenciadora/promotora inmediata temprana (IE1) de hCMV que se encuentra en las posiciones de nucleótidos 460 a 1264 de la SEQ ID Nº 4, y dichos elementos de control además comprenden Exon 2 del 5'-UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de las posiciones 2089-2096 de SEQ ID Nº 4.

17. Una célula huésped que comprende la construcción de expresión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 14-16.

18. Un procedimiento para producir un polipéptido recombinante que comprende: (a) proveer una población de células huésped de acuerdo con la reivindicación 17; y (b) cultivar dicha población de células bajo condiciones en las que dicha secuencia codificadora de dicha construcción de expresión recombinante se expresa, por lo tanto produciendo dicho polipéptido recombinante.

19. Un procedimiento para producir un polipéptido recombinante que comprende: (a) introducir una construcción de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 14-17 en una célula huésped; y (b) provocar la expresión de la secuencia codificadora de dicha construcción de expresión para producir el polipéptido recombinante.

20. Un polinucleótido que comprende la secuencia descrita en SEQ ID Nº 6.