CN1764474A

CN1764474A - 免疫原性组合物及方法

Info

Publication number: CN1764474A
Application number: CNA2004800078180A
Authority: CN
Inventors: J·H·埃尔德里奇; Z·R·伊斯拉埃尔; M·A·伊根; S·A·乌德姆
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2003-03-26
Filing date: 2004-03-23
Publication date: 2006-04-26
Anticipated expiration: 2024-03-23
Also published as: WO2004093906A1; AU2004231464A1; MXPA05008526A; EP1605971B1; CA2517010A1; BRPI0408779A; EP1605971A1; ATE468859T1; CN1764474B; DK1605971T3; NZ542652A; PL1605971T3; US20070134200A1; US20120244113A1; CA2517010C; AU2004231464B2; JP2006523224A

Abstract

一种在哺乳动物受试者中诱导抗原特异性免疫应答的方法，包括步骤：对所述受试者施用有效量的第一组合物，所述第一组合物包括含有编码所述抗原的DNA序列的DNA质粒，所述编码序列受指导其在哺乳动物或脊椎动物细胞中表达的调控序列所调控。该方法也包括对所述受试者施用有效量的第二组合物，所述第二组合物包括含有编码抗原核酸序列的重组水泡性口膜炎病毒(rVSV)，所述编码序列受指导其在哺乳动物或脊椎动物细胞中表达的调控序列所调控。在一个实施方案中rVSV具有复制能力。用于免疫接种和疾病治疗的试剂盒，包括用于实施该方法的组分和说明书。

Description

免疫原性组合物及方法

本发明部分由来自美国政府的基金所资助(国立卫生研究院，资助号NIH NO1-AI 05397和NIH NO1-AI 25458)。因此美国政府对本发明享有某些权利。

发明背景

为了增强免疫原性组合物的有效性，业已报道了多种免疫原性组合物及方法，使用了蛋白质组合物、基于质粒的组合物以及重组病毒构建体作为免疫原性组合物。之前研究已表明基于质粒的免疫原性组合物，在全身应用上，使全身免疫系统对使用诸如蛋白质或重组病毒的常规抗原的二次全身免疫接种更具易感性(参见，如，Xiang等，1997Springer Semin.Iiiimunopathol.，19：257-268；Schneider，J.等，1998Nature Med.，4：397；以及Sedeguh，M.等，1998 Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，95：7648；Rogers，W.O.等，2001 Infec.& Immun.，69(9)：5565-72；Eo，S.K.，等，2001 J.Immunol.，166(9)：5473-9；Ramshaw I.A.和Ramsay，A.J.，2000 Immunol.Today，21(4)：163-5)。

一种经常使用DNA初免/活载体的加强疗法，其包括使用痘苗病毒来加强免疫。最近文献中的例子包括了对人类免疫缺陷病毒(HIV)进行的上述免疫接种(Hanke T.等，2002 Vaccine.20(15)：1995-8；AmaraR.R.等，2002 Vaccine.20(15)：1949-55；Wee E.G.等，2002 J.Gen.Virol.，83(Pt 1)：75-80；Amara R.R.等，2001 Science.292(5514)：69-74)。初免-加强(prime-boost)免疫接种使用DNA和修饰的痘苗病毒载体表达抗原，诸如单纯疱疹病毒-2糖蛋白D、婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum)P36/LACK抗原、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)TRAP抗原、HIV/SIV抗原、鼠结核病抗原和流行性感冒抗原，业已报道了该免疫接种能诱发特异性抗体和细胞因子应答(参见，例如Meseda C.A.等，2002 J.Infect.Dis.，186(8)：1065-73；Amara R.R.等，2002 J.Virol.，76(15)：7625-31；Gonzalo R.M.等，2002 Vaccine，20(7-8)：1226-31；Schneider J.等，2001 Vaccine，19(32)：4595-602；HelZ.等，2001 J.Immunol.，167(12)：7180-91；McShane H.等，2001 Infec.& Immun.，69(2)：681-6和Degano P.等1999 Vaccine，18(7-8)：623-32流行性感冒和疟疾模型)。

最近，业已报道了质粒腺病毒初免加强的基因免疫接种疗法能诱导α-胎蛋白特异性肿瘤免疫并保护猪不患猪霍乱(参见，例如，MengW.S.2001 Cancer Res.，61(24)：8782-6；Hammond，J.M.等，2001 Vet.Microbio.，80(2)：101-19及美国专利号6,210,663)。

业已报道了其它DNA质粒病毒初免加强的疗法。参见，例如，Matano T.等，2001 J.Virol.，75(23)：11891-6(DNA初免/仙台病毒载体加强免疫)。已报道用重组痘病毒初免加强的DNA可用于HIV-1治疗(参见，例如，Kent，S.J.等，1998 J.Virol.，72：10180-8；Robinson，H.L.等，1999 Nat.Med.，5：526-34；和Tartaglia，J.等，1998 AIDSRes.Human Retrovirus.，14：S291-8)。

尽管评价了许多DNA初免/病毒加强疗法，但目前所述的免疫接种疗法仍具有一些缺点。例如，在受试者中一些上述提及的病毒会产生疾病症状；另有一些可能会导致体内重组。一些病毒难以制备和/或接纳外源基因的能力有限。还有一些病毒不利之处在于会引发人体中大量预先存在的载体免疫性，以及其它的安全考虑。

这些需要本领域新的和有用的免疫接种疗法，对所讨论的抗原产生增强的细胞和体液免疫应答水平并符合安全、容易制备及在加强免疫接种时克服哺乳动物宿主对载体的天然免疫应答的要求。

发明概述

本发明提供了一种新的方法、组合物和试剂盒，通过初免/加强疗法用于在哺乳动物受试者中诱导抗病原抗原或其它抗原的免疫应答，与单独施用DNA质粒组分或重组病毒组分所获得的结果相比，针对所述抗原显示了令人惊奇的细胞免疫应答协同刺激作用。

在一个实施方案中，本发明提供了一种在哺乳动物受试者中诱导抗原特异性免疫应答的新方法。该方法包括施用于受试者有效量的第一组合物，所述第一组合物包括含有编码抗原的DNA序列的DNA质粒，所述编码序列受指导其通过DNA质粒在哺乳动物细胞中进行表达的调控序列调控。该方法还包括施用于受试者有效量的第二组合物，所述第二组合物包括含有编码抗原核酸序列的重组水泡性口膜炎病毒(rVSV)，所述编码序列受下述调控序列的调控，该调控序列调控上述编码序列在哺乳动物细胞中通过rVSV进行表达。在一个实施方案中，所述重组VSVA是减毒、可复制的病毒。在另一个实施方案中，所述重组VSV是不复制的病毒。可以按任何顺序施用所述第一和第二组合物。此外，本发明考虑在多次施用其中一种组合物后再多次施用另外一种组合物。在一个实施方案中，优选共施用细胞因子。

在本发明另一个实施方案中，提供了一种用于在哺乳动物受试者中诱导对抗原产生抗原特异性免疫应答的免疫原性组合物。所述免疫原性组合物包括含有编码所述抗原的DNA序列的DNA质粒的第一组合物，所述编码序列受下述调控序列的调控，该调控序列调控上述编码序列通过DNA质粒表达。该组合物也包括至少一种可复制组分，重组水泡性口膜炎病毒(VSV)，其包含编码相同抗原的核酸序列，所述编码序列受指导其通过重组VSV表达的调控序列所调控。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种在哺乳动物受试者中诱导增强水平的抗原特异性免疫反应的治疗或预防方法中所使用的试剂盒。该试剂盒包括，其中，至少一种第一组合物，其包括含有编码所述抗原的DNA序列的DNA质粒，所述编码序列受调控其在哺乳动物中表达的调控序列的调控；至少一种第二组合物，其包括一种可复制组分，其包含编码所述抗原的核酸序列的重组水泡性口膜炎病毒(rVSV)，所述编码序列受调控其在哺乳动物中表达的调控序列的调控；和实施上述方法的说明书。

在另一个实施方案中，本发明提供了上述免疫原性组合物或其组分在制备诱导动物对该组合物中所使用的抗原产生免疫反应的药物中的用途。

本发明的其它方面和实施方案公开于下列的详细描述中。

附图简述

图1A是编码猴免疫缺陷病毒(SIV)gag p37蛋白的示例性质粒DNA示意图。该图显示了该质粒含有操纵gag蛋白表达的人巨细胞病毒(HCMV)启动子/增强子，牛生长激素多腺苷酸化位点(BGH polyA)，复制起点序列(ori)和卡那霉素抗性(kan^R)标记基因。

图1B是编码恒河猴白介素12的p35和p40亚基的示例性双顺反子质粒DNA示意图。p35亚基受HCMV启动子所调控并具有SV40polyA位点。p40亚基受猿猴巨细胞病毒(SCMV)启动子所调控、具有BGH polyA位点并反向转录。该质粒也含有ori序列和kan^R基因。

图2是显示在通过本发明初免/加强疗法所免疫动物未分级外周血单核细胞(PBMC)中VSV N特异性γ干扰素(IFN-γ)ELISpot应答的柱状图。最左边的黑条代表用编码SIV gag蛋白DNA质粒免疫接种，并用表达流行性感冒红血球凝聚素(flu HA)蛋白的VSV载体加强的方案。浅灰条代表涉及用DNA gag质粒初始免疫接种后再用表达HIV gag和env蛋白的VSV加强的本发明方案。白条代表涉及用空或对照的DNA质粒(con DNA)初始免疫接种后再用表达HIV gag和env蛋白的VSV免疫接种的方案。最右边的黑条代表涉及con DNA质粒初始免疫接种后再用表达flu HA蛋白的VSV免疫接种的方案。每组所代表的结果来自5只动物。

图3是显示通过本发明初免/加强疗法所免疫动物未分级PBMC中HIV env 6101特异性γ干扰素(IFN-γ)ELISpot应答的柱状图。最左边的浅灰条代表用编码SIV gag蛋白的DNA质粒免疫接种并用表达fluHA蛋白的VSV载体加强的方案。斑纹条代表涉及用DNA gag质粒初始免疫接种后再用表达HIV gag和env蛋白的VSV加强的本发明方案。方格条代表涉及用空的对照DNA质粒初始免疫接种后再用表达HIV gag和env蛋白的VSV免疫接种的方案。打点的条代表涉及用conDNA质粒初始免疫接种后再用表达flu HA蛋白的VSV加强免疫接种的方案。每组所代表的结果来自5只动物。星号表示产生统计学上显著差异，p＝0.0001。

图4是显示通过酶联免疫吸附测定(ELISA)本发明初免/加强疗法免疫动物血清抗SIV gag p27抗体效价的图。在第0天、第4周和第8周施用质粒DNA并在第15和第23周分别施用VSV(Indiana G血清型)和VSV(Chandipura G血清型)加强。用编码SIV gag蛋白的DNA质粒免疫接种并用表达flu HA蛋白的VSV载体加强的方案表示为(◆)。涉及用DNA gag质粒初免免疫接种后再用表达HIV gag和env蛋白的VSV加强的本发明方案表示为(■)。涉及用空的对照DNA质粒初始免疫接种后再用表达HIV gag和env蛋白的VSV免疫接种的方案表示为(▲)。涉及用对照DNA质粒初始免疫接种后再用表达fluHA蛋白的VSV免疫接种的方案表示为(●)。每组所代表的结果来自5只动物。各组间统计学上显著差异表示为p＝0.0073(^*)；p＝0.5941(#)或p＝0.0027(￥)。

图5是显示通过ELISpot测定法评价用本发明初免/加强疗法免疫接种的动物每百万细胞中SIV gag特异性斑点形成细胞的图。在第0天、第4周和第8周施用质粒DNA并在第15和第23周分别施用VSV(Indiana G血清型)和VSV(Chandipura G血清型)加强。用编码SIV gag蛋白的DNA质粒免疫接种并用表达flu HA蛋白的VSV载体加强的方案表示为(◆)。涉及用DNA gag质粒初始免疫接种后再用表达HIV gag和env蛋白的VSV加强的本发明方案表示为(■)。涉及用空的对照DNA质粒初始免疫接种后再用表达HIV gag和env蛋白的VSV免疫接种的方案表示为(▲)。涉及用对照DNA质粒初始免疫接种后再用表达flu HA蛋白的VSV免疫接种的方案表示为(●)。每组所代表的结果来自5只动物。各组间统计学上显著差异通过方括号表示为p＝0.0001和p＝0.0002。

图6是显示通过初免/加强结合引发的加强的免疫应答的图，所示符号如图5，导致增加的AIDS保护作用，通过在激发后几天内测定CD4T细胞损耗减少来确定。

图7是显示通过初免/加强结合引发的加强的免疫应答的图，所示符号如图5，导致增加的AIDS保护作用，通过在激发后几天内测定血浆内循环病毒(病毒拷贝数/ml)减少来确定。

发明详述

本发明提供了一种在哺乳动物受试者或脊椎动物受试者中诱导抗原特异性免疫应答的新方法，通过结合使用现有技术中所描述的免疫原性组合物的某些组分，并优化组分以产生令人惊奇和协同的效果。一般而言，该方法包括施用于受试者有效量的组合物，所述组合物包括含有编码所述抗原的DNA序列的DNA质粒，所述编码序列受指导其在哺乳动物或脊椎动物细胞中通过DNA质粒表达的调控序列的调控。该方法也包括施用于受试者有效量的组合物的步骤，所述组合物包括一种可复制组分，重组水泡性口膜炎病毒(rVSV)。该rVSV包括编码抗原核酸序列，所述编码序列受指导其在哺乳动物和脊椎动物细胞中通过rVSV表达的调控序列的调控。

这两种免疫原性组合物中先施用的组合物称为初免组合物(primecompositon)。再施用的免疫原性组合物称为加强组合物(boostingcomposition)。即可以DNA组合物作为初免组合物施用，将VSV载体组合物作为加强组合物施用，反之亦然。在一个实施方案中，在VSV载体作为加强组合物施用之前施用于受试者至少一次或多次初免组合物。其后，施用于受试者至少一次或多次加强组合物。此外，本发明考虑在多次施用其中一种组合物后多次施用另一种组合物。该方法进一步考虑施用有效量的细胞因子作为该方法的一步骤。

业已惊奇地发现与单独施用DNA质粒或重组VSV相比，实施该方法能诱导哺乳动物受试者产生增强的免疫应答，包括在CD8+T细胞中对抗原的应答。事实上，正如下面的实施例所示，免疫应答较这两种免疫原性组合物相加组合所预期的还要强。因此，该新方法所诱导的免疫应答在细胞和/或抗体抗抗原反应中具有惊人和协同性增强。参见，如，下表1和图4和5，其中对HIV-1 gag的抗原特异性细胞应答的峰值是单独施用DNA质粒免疫原性组合物应答的3倍多，或几乎是单独施用rVSV免疫原性组合物应答的9倍。

尽管所述哺乳动物受试者是灵长类的，优选是人，但本发明并不仅限于鉴定为哺乳动物的受试者。该方法的组分详述如下，关于所引证的文献在此并入作为参考，以供本领域技术人员详细了解。

A.DNA质粒免疫原性组合物

本发明的免疫原性组合物包括DNA质粒，所述DNA质粒包含编码有待针对其产生免疫应答的选定抗原的DNA序列。在该质粒中，选定抗原受指导其在哺乳动物或脊椎动物细胞中表达的调控序列所调控。该质粒自身组分是常规的。

可用于本发明中的非病毒质粒载体含有分离的和纯化的DNA序列，所述的DNA序列含有编码所述选定免疫原性抗原的DNA序列。该DNA分子可源自病毒或非病毒，如业已设计用于编码外源或异源核酸序列的细菌。这样的质粒或载体包括来源于病毒或噬菌体的序列。许多非病毒载体为本领域所知并可包括但不仅限于，质粒、细菌载体、噬菌体载体，“裸”DNA和用阳离子脂质或聚合物凝聚的DNA。

细菌载体的例子包括，但并不限于，源自卡介苗(bacille CalrnetteGuérin)(BCG)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺菌(Shigella)、大肠杆菌(E.coli)和李斯特菌(Listeria)等的序列。合适质粒载体包括，例如，pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pK37、pKC101、pAC105、pVA51、pKH47、pUB110、pMB9、pBR325、ColE1、pSC101、pBR313、pML21、RSF2124、pCRl、RP4、pBAD18和pBR328。

合适的可诱导的大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc(Amann等，1988 Gene，69：301-315)、阿拉伯糖表达载体(如，pBAD18，Guzman等，1995 J.Bacteriol.，177：4121-4130)和pETIId(Studier等，1990Methods in Enzymology，185：60-89)。pTrc载体靶基因的表达依赖于从杂合的trp-lac融合启动子开始的宿主RNA聚合酶转录。pETIId载体靶基因的表达依赖于从T7 gn10-lac融合启动子开始的转录，其为共表达的病毒RNA聚合酶T7 gn1所介导。该病毒聚合酶提供自宿主菌BL21(DE3)或HMS I 74(DE3)，来源于在lacUV5启动子转录调控下的居民(resident)原噬菌体所含有的T7 gn1基因。PBAD系统依赖于为araC基因所调控的可诱导的阿拉伯糖启动子。该启动子在阿拉伯糖存在条件下被诱导。

所述启动子和其它调控序列操纵抗原在所需哺乳动物或脊椎动物宿主中表达，可类似地选自一系列已知可用于该目的的启动子。许多这样的启动子描述如下。在一个实施方案中，免疫原性DNA质粒组合物描述如下，可用的启动子是人巨细胞病毒(HCMV)启动子/增强子(描述于，如美国专利号5,168,062和5,385,839中，于此并入作为参考)和SCMV启动子/增强子。

本发明核酸序列，分子或载体中所包含的附加调控序列包括，并不限于，增强子序列、聚腺苷酸化序列、剪切供体序列和剪切受体序列、分别位于要被翻译的多肽开始和末端的转录起始和终止位点、用于转录区翻译的核糖体结合位点、表位标记、核定位序列、IRES元件、Goldberg-Hogness“TATA”元件、限制性酶切位点、选择性标记物等。增强子序列包括，如，SV40 DNA的72bp串联重复序列或逆转录病毒长末端重复或LTRs等，用于增加转录效率。

在DNA质粒中可用其它元件，包括，如复制起点、聚腺苷酸化序列(如BGH polyA、SV40polyA)、药物抗性标记(如卡那霉素抗性)等可也选自许多已知序列，包括那些实施例中所描述的和如下所特别提及的。

启动子和其它常用载体元件的选择是常规的，其可获得许多这样的序列，以用于设计本发明的质粒。参见，如Sambrook等，MolecularCloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，(1989)及其所引证的参考资料，例如，3.18-3.26页和16.17-16.27页及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，New York(1989)。本领域技术人员可容易地从本领域已知原料中选择所有在本发明中可使用的质粒组分，并可获得自制药工业。质粒组分和调控序列的选择无需考虑对本发明的限制。

在下面公开的专利中详细描述了用于免疫原性组合物的合适的DNA质粒构建体的例子，所公开的内容在此并入作为参考，如，国际专利公开号WO98/17799、WO99/43839和WO98/17799；以及美国专利号5,593,972、5,817,637、5,830,876和5,891,505等。

类似地，所选定抗原可以是如下讨论中所鉴定的抗原。在本文免疫原性组合物的一个实施方案中，所述选定抗原是HIV-1抗原，诸如通过gag、pol、env、nef、vpr、vpu、vif和tat其中之一所表达的。优选所述抗原序列和DNA质粒的其它组分得到优化，例如通过选择合适于目的宿主的密码子并通过去除任一抑制性序列，如下也讨论了关于抗原的制备。

因此这种免疫原性组合物包括编码用于在宿主中表达单一选定抗原的一种质粒。根据本发明的方法，所述质粒组合物也包括一种DNA质粒，所述DNA质粒含有编码多于一拷贝的所述相同选定抗原的DNA序列。或者，所述组合物可包含表达多个选定抗原的一种质粒。每种抗原受各自的调控元件或组分所调控。或者，每种抗原可受相同的调控元件所调控。在另一个实施方案中，所述DNA质粒组合物可含有多个质粒，其中每个DNA质粒编码相同或不同的抗原。

在另一个实施方案中，所述DNA质粒免疫原性组合物可进一步包含，作为单个DNA质粒的组分或作为含有抗原的DNA质粒的一部分，编码所需细胞因子、淋巴因子或其它基因佐剂的核苷酸序列。核酸序列可获得自的上述合适佐剂的宿主确定如下。在本发明所例证的一个实施方案中，与本发明DNA质粒组合物一起施用的所需细胞因子是白介素-12。

所述DNA质粒组合物期望在药学上可接受的稀释液、赋形剂或载体中施用，例如那些如下所讨论的。尽管所述组合物可以任何可选择的给药途径施用，但在一个实施方案中期望的给药方法是包含所述质粒和作为促进剂的布比卡因肌内注射共施用，描述如下。

在本发明方法的一个实施方案中，其中所述DNA组合物是初免组合物，该方法包括在施用rVSV之前施用至少一次DNA质粒，所述质粒包含编码以诱导所需免疫应答的抗原的序列。在另外一个实施方案中，所述DNA初免组合物还含有第二质粒，所述质粒编码所选择的细胞因子。还在另外一个实施方案中，如下所例证，所述DNA初免组合物包括三种质粒，一种质粒表达第一抗原，第二种质粒表达第二种不同的抗原以及第三种质粒表达所选择的细胞因子佐剂。正如实施例中所详述的，DNA初免组合物的一个实施方案包括三种优化的质粒，(1)编码RNA优化的SIV gag p37基因的质粒(见图1A)；(2)编码两种恒河猴IL-12亚基p35和p40的质粒，分别在两种启动子的调控下(见图1B)和(3)编码HIV-1 gp160 env基因的质粒。

当作为初免组合物时，所述DNA质粒组合物在rVSV加强组合物之前施用一次或优选地，多于一次。当用作为加强组合物时，该DNA质粒组合物在rVSV初免组合物之后施用一次或优选地，多于一次。

B.rVSV免疫原性组合物

用于本发明方法和组合物的另一种免疫原性组合物是能复制的、活的、减毒的水泡性口膜炎病毒(VSV)递送载体。该重组VSV包括编码选定抗原的核酸序列，所述编码序列受指导其在哺乳动物或脊椎动物细胞中表达的调控序列所调控。在本发明的方法中，用于DNA质粒组合物的抗原与用于rVSV免疫原性组合物的抗原相同。

VSV是一种牛病毒，其是分类学上称为单分子负链RNA病毒目的一员，包含11kb非节段的，负链RNA基因组，编码四个内部结构蛋白和一个外部跨膜蛋白。从3′-5′顺序，基因编码的蛋白称为核壳体(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、跨膜糖蛋白(G)和聚合酶(L)。使用本领域已知技术可分离并“拯救”活的VSV。参见，如美国专利号6,044,886、6,168,943和5,789,299；国际公开专利号WO99/02657；Conzelmann，1998，Ann.Rev.Genet.，32：123-162；Roberts和Rose，1998，Virol.，247：1-6；Lawson等，1995 Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 92：4477-4481。另外，例如，VSV(Indiana)的基因组序列在NCBI数据库的登记号为NC001560。其它VSV序列，包括VSV(Chandipura)序列，可在该数据库中获得，例如，参见登记号Ay382603、Af128868、V01208、V01207、V01206、M16608、M14715、M14720和J04350等。VSV毒株，例如New Jersey和Indiana等都可从保藏中心获得，例如美国典型培养物保藏中心、Rockville、Maryland(参见，如登记号VR-1238和VR-1239。在该说明书全文中所引证的文件中描述或参考了其它序列。在该说明书中所引证的所有文献在此并入作为参考。)。

业已显示VSV基因组能容纳多于一个的外源基因，至少达三千个碱基。这些病毒的基因组非常稳定，不会发生重组，几乎很少发生显著的突变。此外，因为它们的复制是细胞质复制，所以它们的基因组含有RNA，它们不会整合到受感染宿主细胞的基因组。同样，这些负链RNA病毒具有相对简单的转录调控序列，可以容易地操纵用于插入有效的外源基因。最后，可以通过改变外源基因相对于病毒转录起始子的位置以调节外源基因表达的水平。3′-5′基因表达梯度反映了转录病毒聚合酶沿着基因组模板前进时可成功越过所遇到的每个基因内基因终止/基因起始信号的可能性减少了。因此，位于接近3′端转录起始启动子的外源基因可充分表达，而那些插入在基因组更远侧位置的外源基因则表达较少。

VSV可在许多不同的细胞型中复制达高效价，并大量表达病毒蛋白。这不但意味着VSV可作为一种有效的功能性外源基因的递送载体，而且在批准用于生产人类生物制品的细胞系中相应的rVSV可达到的生产水平。

rVSV具有出色的将编码关键的保护性免疫原的外源基因从病毒病原体递送至许多不同的细胞型的能力，随后引起真正成形的免疫原性蛋白大量表达(Haglund，K.，等，2000 Virol.，268：112-21；Kahn，J.S.等，1999 Virol.，254：81-91；Roberts，A.等，1999 J.Virol.，73：3723-32；Rose，N.F.等，2000 J.Virol.，74：10903-10和Schlereth，B.等2000 J.Virol.，74：4652-7)。如此表达的该免疫原可同时引起高持久的病毒中和抗体反应和保护性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(Roberts，A.等，1998 J.Virol.，72：4704-11)。

除了rVSV的功效，该活的病毒基因递送载体是安全的，因为在健康人中野生型VSV基本上不会引起的疾病症状或病理，甚至在大量病毒复制时亦然(Tesh，R.B.等，1969 Am.J.Epidemiol.，90：255-61)。此外，人类受其感染并因此预先存在对VSV的免疫性是罕见的。假如进一步减毒，这些rVSV组合物适用于免疫受损的或并亚健康的受试者。在该方法中使用VSV载体的显著优点是存在着许多VSV血清型，这是由于VSV病毒附着蛋白G的交换或修饰所致。因此，携带相同异源抗原的不同血清型VSV载体可重复施用以避免宿主免疫系统产生任何针对VSV G蛋白的中和抗体反应的干扰。

使用本领域之前描述的技术可设计重组VSV，其携带所选定抗原及插入到在病毒转录启动子调控下的VSV任何位置的调控序列。在一个实施方案中，所述编码选定抗原的异源基因插入到VSV的G和L编码区之间。在另外一个实施方案中，异源基因可融合至G蛋白位点。在另一个实施方案中，异源基因融合或邻接至任一其它VSV基因位点。

在另一个实施方案中，基因在基因组不同位置‘改组’。具体而言，将基因组中N基因‘改组’至不同位置。克隆产生所述改组的重组cDNA序列包括修饰起始VSV质粒主链(pVSV-XN1)。该起始载体的三个变体包括偏离正常基因顺序(3′-N-P-M-G-L-5′)的质粒，如下所示：i)3′-P-N-M-G-L-5′；ii)3′-P-M-N-G-L-5′；和iii)3′-P-M-G-N-L-5′。用于产生这些质粒的克隆策略所采用的方法描述于Ball，L.A.等1999 J.Virol.，73：4705-12中。该技术利用了这一事实，即发现在每一编码序列之间的基因末端/基因起始信号几乎是一样的，因此允许基因重排构建而无需导入任何核苷酸取代。或者，可将一些关键点突变导入非编码序列以在附近产生有助于基因组重排的限制性酶切位点。

还在这些载体的另一个实施方案中，G基因细胞质区29个氨基酸的羧基末端编码序列通过缺失G基因5′C末端的氨基酸而被截短。或者，完全缺失G基因。在一个实施方案中，除去G基因完整的细胞质区。在另一个实施方案中，除去细胞质区至少28个氨基酸。在另一个实施方案中，缺失细胞质区的约20个氨基酸。在另一个实施方案中，缺失细胞质区的约10个或更少的氨基酸。

据报道，改组基因组方法和G蛋白修饰方法都会产生部分生长缺陷(Flanagan，E.B.，等2001 J.Virol.75：6107-14；Schnell，M.J.等，1998 EMBO J.，17：1289-96)。可以预计VSV这样的修饰可产生更多的减毒表型或甚至产生非复制型VSV，可用于本发明各种实施方案中。参见，如Johnson，J.E.等，1998 Virol.，251：244-52.37；Johnson，J.E.，等.，1997 J.Virol.，71：5060-8。

类似地，所选定抗原可以是如下讨论所确定的抗原。在本文所述的免疫原性组合物的一个实施方案，所选定抗原是一种进化枝B病毒隔离群的HIV-1 gag和/或env(gp160)基因。还在一个实施方案中，所述抗原是一种HIV-1 pol、nef、vpr、vpu、vif或tat基因。优选地所述抗原序列得到优化，例如通过选择合适于目的宿主的密码子和/或通过去除任一抑制性序列，如下也讨论了关于抗原的制备。

为了克服在连续施用中任何潜在的载体复制效率降低的问题，设计了类似的一组载体，各自携带不同VSV血清型的G基因，可进行成功的加强免疫接种。来自VSV Indiana、New Jersey和Chandipura的G蛋白的一级氨基酸序列基本上趋异，使得对某种预先存在的免疫性并不排除其它种的感染和复制。因此，通过rVSV(Indiana)产生的中和抗体反应应当无法干扰rVSV(New Jersey)或rVSV(Chandipura)的复制。可通过用来自VSV Chandipura或VSV New Jersey的趋异同系物取代VSV Indiana G基因形成三种截然不同的免疫活性载体，以制备可允许成功进行连续免疫接种的载体组。

因此，该rVSV免疫原性组合物可包括一种编码单一选定抗原的rVSV，用于在宿主中表达。根据本发明的方法，所述rVSV免疫原性组合物包括一种rVSV，其含有编码多于一个拷贝的相同选定抗原的核酸序列。或者，该组合物可包括表达多种选定抗原的一种rVSV。每种抗原可受各自的调控元件或组分所调控。或者，每种抗原可受相同的调控元件所调控。在另一个实施方案中，所述rVSV组合物可包括多种rVSV，其中每种rVSV编码相同或不同的抗原。

在另一个实施方案中，所述rVSV免疫原性组合物可进一步包含或与细胞因子、淋巴因子或基因佐剂施用。细胞因子可以蛋白形式施用，或在上述质粒中施用或在重组VSV中通过插入细胞因子编码序列的插入物所编码。例如，所述细胞因子编码序列可以插入到VSV基因组任何位置并从病毒转录起始子处开始表达。可获得核酸序列的合适佐剂的宿主确定如下。在本发明所例证的一个实施方案中，与本发明rVSV组合物一起施用的所需细胞因子是白介素-12。

所述rVSV组合物期望在药学上可接受的稀释液、赋形剂或载体中施用，例如那些如下所讨论的。尽管所述组合物可以任何可选择的给药途径施用，在一个实施方案中期望的施用方法为鼻内注射。

在本发明方法的一个实施方案中，其中所述rVSV组合物是加强组合物，该方法包括在施用DNA免疫原性初免组合物后施用至少一次rVSV。该rVSV组合物表达与初免组合物相同的抗原。在一个实施方案中，rVSV组合物包括附加的编码所选细胞因子的重组病毒。在另一个实施方案中，rVSV包括表达细胞因子的序列，如IL-12存在于表达所述抗原的相同的rVSV中。在另一个实施方案中，多种rVSV组合物作为后期加强物施用。在一个实施方案中，至少两种rVSV组合物在初免组合物之后施用。在另一个实施方案中，至少三种rVSV组合物在初免组合物之后施用。

理想地，如上所讨论，每一后继的rVSV组合物具有不同的血清型，但具有相同的抗原编码序列。所述不同的血清型选自已知天然存在的血清型和通过操纵VSV G蛋白提供的任一合成血清型。在已知方法中，用于改变rVSV G蛋白的技术描述于国际公开号WO99/32648和Rose，N.F.等，2000 J.Virol.，74：10903-10中。

在另一个实施方案中，每种rVSV具有不同的抗原编码序列，但具有相同的VSV G蛋白。在另一个实施方案中，每种rVSV具有不同的抗原编码序列及不同的VSV G蛋白。正如实施例中所详述，一系列rVSV加强组合物的一个实施方案中包括两种优化的rVSV，其含有HIV-1 gp160 env基因，其中一种rVSV是Indiana血清型，另一种是Chandipura血清型。

根据本发明内容，该rVSV免疫原性组合物在施用具有相同抗原的初免DNA免疫原性组合物之后，可作为加强组合物施用于宿主。在本发明方法的任一实施方案中，在第一rVSV组合物施用之后，第二和任一附加的rVSV可作为加强物施用。在一个实施方案中，所述附加的rVSV加强物是具有相同抗原的相同血清型。或者，所述附加的rVSV加强物具有不同的血清型，在施用加强的DNA免疫原性组合物之前连续施用。业已表明施用至少三种加强物是有用的。当作为加强组合物时，所述rVSV组合物在初免DNA免疫原性组合物之后连续施用。当作为初免组合物时，所述rVSV组合物施用一次或优选地施用多次。在一个实施方案中，所述附加的rVSV加强物是具有相同抗原的相同血清型。或者，所述附加的rVSV加强物具有不同的血清型，在施用加强的DNA免疫原性组合物之前连续施用。

能在体内表达HIV-1蛋白的合适的rVSV构建体的例子详述于如下实施例和公开出版物中，如，Rose等，2000 Virol.，268：112-121；Rose等，2000 J.Virol.，74：10903-10910；Rose等2001 Cell，106：539-549；Rose等，2002 J.Virol.，76：2730-2738；Rose等，2002 J.Virol.，76：7506-7517，于此并入作为参考。附加的rVSV载体可进一步减毒，可通过渐进地截短VSV G蛋白或如上所述改组的VSV结构基因来进行。根据本发明的内容，非复制型VSV也可得到使用。rVSVs显示了减毒和免疫活性之间所期望的平衡，预计能用于本发明中。

如下实施例中所例示的几种示例性rVSV构建体例子具有重组基因组：

(1)3′N-P-M-G-HIV env-L-5′

(2)3′N-P-M-G-HIV gag-L-5′

(3)3′N-P-M-G-SIV gag-L-5′

在一个实施方案中，本发明的方法和免疫原性组合物采用了这些rVSV构建体中的一种。在另一个实施方案中，本发明的方法和免疫原性组合物采用了rVSV-HIV env和rVSV-HIV gag。后者的免疫原性组合物同时诱发对真正成形的gp160有效的体液免疫应答，及能杀死HIV-1病毒感染的细胞的CTL(对于Env和Gag)。在该方式中所表达的HIV-1 gp160与CD4/共同受体结合并经历与受体结合相关的构像改变。正确的gp160/受体相互作用暴露了存在于gp160上的隐藏的病毒中和决定子，其是诱导抗体介导的免受感染的保护作用所必需的(参见，如LaCasse，R.A.等，1999 Science.283：357-62)。

C.本发明免疫原性组合物中所使用的抗原

在本发明方法和组合物中，抗原性或免疫原性组合物可用于增强脊椎动物宿主对所选定抗原的免疫应答。所选定抗原，当通过质粒DNA或VSV表达时，可以是源自致病病毒、细菌、真菌或寄生虫的蛋白、多肽、肽、其片段或融合物。或者，所选定抗原可以是源自癌细胞或肿瘤细胞的蛋白、多肽、肽、其片段或融合物。在另一个实施方案中，所选定抗原可以是源自过敏原的蛋白、多肽、肽、其片段或融合物，使得干扰IgE的产生以便调节对过敏原的变态性应答。在另一个实施方案中，所选定抗原可以是源自宿主(自身分子)以一种非期望方式、数量或位置所产生的那些分子或其片段的蛋白、多肽、肽、其片段或融合物，例如那些来自淀粉状前蛋白的，以便预防或治疗脊椎动物宿主中具有淀粉状沉积特征的疾病。在本发明一个实施方案中，所选定抗原可以是源自HIV-1的蛋白、多肽、肽或片段。

本发明也涉及用于增强免疫原性组合物能力的方法，所述免疫原性组合物包括所选定抗原，其源自(1)诱发脊椎动物宿主免疫应答的致病病毒、细菌、真菌或寄生虫，或(2)癌细胞或肿瘤细胞的癌抗原或肿瘤相关抗原，其可在脊椎动物宿主中诱发治疗性或预防性的抗癌作用，或(3)过敏原，使得干扰IgE的产生以便调节对过敏原的变态性应答，或(4)宿主(自身分子)以一种非期望方式、数量或位置所产生的那些分子或其部分，以便减少上述非期望作用。

在另一个实施方案中，使用本发明初免/加强疗法的所需的病毒免疫原性组合物包括涉及预防和/或治疗由如下病毒所引发的疾病的那些，所述病毒为：不限于，人类免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、1-3型副流感病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、嵌杯样病毒，麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、德国麻疹病毒、腺病毒、狂犬病毒、犬瘟热病毒、牛瘟麻疹病毒、人偏肺病毒、禽肺病毒(以前称为土耳其鼻气管炎病毒)、Hendra病毒，Nipah病毒，冠形病毒、细小病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、猫白血病病毒、猫传染性腹膜炎病毒、鸟传染性粘液囊病病毒、新城鸡瘟病毒、马莱克(氏)病毒、猪呼吸和生殖综合病症病毒、马传染性动脉炎病毒和各种脑炎病毒。

在另一个实施方案中，使用本发明初免/加强疗法的所需的细菌免疫原性组合物包括涉及预防和/或治疗由如下细菌所引发的疾病的那些，所述细菌为：不限于，流感(嗜血)杆菌(Haemophilus influenzae)(分型和不可分型的)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、脑膜炎奈瑟(氏)菌(Neisseriameningitidis)、淋病奈瑟(氏)菌(Neisseria gonorrhoeae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、百日咳杆菌(Bordetellapertussis)、Alloiococcus otiditis、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、沙门氏菌(Salmonella typhiumrium)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、志贺氏杆菌(Shigella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)-胞内分枝杆菌复合物(Mycobacteriumintracellulare complex)、奇异变形菌(Proteus mirabilis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、破伤风杆菌(Clostridiumtetani)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、溶血性巴斯德(氏)菌(Pasteurellahaemolytica)、出血败血性巴斯德(氏)菌(Pasteurella multocida)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)和鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)。

在另一个实施方案中，使用本发明初免/加强疗法的所需的抗真菌致病原免疫原性组合物包括涉及预防和/或治疗由如下真菌致病原所引发的疾病的那些，所述真菌致病原为：不限于，曲霉菌属(Aspergillis)、芽生菌属(Blastomyces)、念珠菌属(Candida)、球孢子菌属(Coccidiodes)、隐球菌属(Cryptococcus)和组织胞浆菌属(Histoplasma)。

在另一个实施方案中，使用本发明初免/加强疗法的所需的抗寄生虫免疫原性组合物包括涉及预防和/或治疗由如下寄生虫所引发的疾病的那些，所述寄生虫为：不限于，硕大利什曼原虫(Leishmania major)、蛔虫(Ascaris)、鞭虫属(Trichuris)、贾第虫属(Giardia)、血吸虫属(Schistosoma)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、毛滴虫属(Trichomonas)、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)和卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)。

在另一个实施方案中，使用本发明初免/加强疗法所需的免疫原性组合物包括使用癌抗原或肿瘤相关抗原的那些，所述组合物在脊椎动物中诱发预防性或治疗性抗癌作用，所述抗原包括，不限于，前列腺特异抗原、癌胚抗原、MUC-1、Her2、CA-125和MAGE-3。

上述所列已知抗原的核苷酸和蛋白序列可很容易地为公众通过诸如NCBI的数据库所获得，也可获得自其它来源，如美国典型培养物保藏中心或大学。

在脊椎动物宿主中用于调节对过敏原应答的所需免疫原性组合物，其使用了本发明的初免/加强疗法，包括那些含有过敏原或其片段的。上述过敏原的例子描述于美国专利号5,830,877和国际专利公开号WO99/51259中，在此并入作为参考。上述过敏原包括，不限于，花粉、昆虫毒液、动物毛发、真菌孢子和药物(如盘尼西林)。这些免疫原性组合物干扰IGE抗体的产生，是过敏原反应的已知原因。

在脊椎动物宿主中用于调节对自身分子反应的所需免疫原性组合物，其使用了本发明的初免/加强疗法的，包括那些含有自身分子或其片段的。上述自身分子的例子包括糖尿病所涉及的β-链胰岛素、胃食管返流疾病中所涉及的G17分子和在疾病中下调节自体免疫反应的抗原，所述疾病如多发性硬化症、狼疮和类风湿性关节炎。也包括β淀粉状肽(也称为Aβ肽)，其是淀粉状前蛋白(APP)内的39-43个氨基酸片段，是通过β或γ分泌酶处理APP产生的。Aβ1-42肽具有如下序列SEQ ID NO：1：Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr GluVal His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn LysGly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala。

在选择和使用抗原序列用于设计本发明的DNA质粒和rVSV构建体中，也需要改变所选定抗原编码基因序列以及DNA质粒所要插入的位置所采用的密码子，和/或除去其中的抑制序列，可通过使用如下所详述的技术除去抑制序列：美国专利号5,965,726、5,972,596、6,174,666、6,291,664和6,414,132及国际专利公开号WO01/46408，于此并入作为参考。简单地描述，该技术包括在所选定基因中突变所确定的抑制子/不稳定序列，优选进行多重点突变。

在如下所例证的一个具体实施方案中，本发明免疫原性质粒和rVSV组合物期望使用一种或多种优化序列来编码HIV-1抗原，如gag，、pol和nef抗原，或其免疫原性片段或融合物。嵌合的猴-人免疫缺陷病毒(SHIV)(89.6P)的gag和env基因可用于制备rVSVs，以便保护其免受病毒感染并减轻病毒负荷以及可在猕猴疾病模型中所证实的疾病。如下例子证明了使用SHIV类似物，即SIV gag和HIV 89.6Penv。

D.免疫原性DNA质粒或rVSV构建体中使用的启动子

用于本发明任何组分的合适的启动子，可容易地选自于构成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子等之中。编码本发明抗原的核酸分子所采用的以及具有非特异性活性的构成型启动子的例子包括，不限于，逆转录劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子、逆转录LTR启动子(任选地带有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地带有CMV增强子)(参见，如Boshart等，1985 Cell，41：521-530)、SV40启动子、二氢叶酸盐还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子(Invitrogen)。为外源性补充化合物所调控的诱导型启动子包括，不限于，阿拉伯糖启动子、锌诱导羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导的小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO98/10088)、蜕皮激素昆虫启动子(No等，1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：3346-3351)、四环素阻遏系统(Gossen等，1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551)、四环素诱导系统(Gossen等，1995 Science，268：1766-1769，也参见Harvey等，1998 Curr.Opira.Chern.Biol.，2：512-518)、RU486诱导系统(Wang等，1997 Nat.Biotech.，15：239-243和Wang等，1997 Gene Ther.，4：432-441)以及雷帕霉素诱导系统(Magari等，1997 J.Cliva.Invest.，100：2865-2872)。

可用于本文中的其它类型的诱导型启动子是那些为特异性生理状态所调控的，如，温度或急性期或仅在复制细胞中。有用的组织特异性启动子包括源自编码骨骼β肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、抗肌萎缩蛋白、肌肉肌酸激酶的基因启动子，以及较天然存在的启动子具更高活性的合成的肌型启动子(参见Li等.，1999 Nat.Biotech.，17：241-245)。已知的组织特异性启动子的例子有：对肝而言(白蛋白，Miyatake等.1997 J.Virol.，71：5124-32；肝炎B病毒核心启动子，Sandig等.，1996 Gene Ther.，3：1002-9；α胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等，1996 Hum.Gene Ther.，7：1503-14)；对骨而言(骨钙蛋白，Stein等，1997 Mol.Biol.Rep.，24：185-96；骨唾液蛋白，Chen等.，1996 J.Bone Miner.Res.，11：654-64)；对淋巴细胞而言(CD2，Hansal等，1988 J.Immunol.，161：1063-8；免疫球蛋白重链；T细胞受体α链)；对神经元而言(神经元-特异性烯醇化酶(NSE)启动子，Andersen等，1993 Cell.Mol.Neurobiol.，13：503-15；神经丝轻链基因，Piccioli等，1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：5611-5；神经元特异性ngf基因，Piccioli等，1995Neuron，15：373-84)等。参见，如国际专利公开号WO00/55335所另外列出的已知启动子可用于本文中。

E.本发明免疫原性组合物所使用的载体、赋形剂、佐剂和配方

可用于本发明中的免疫原性组合物，无论是DNA质粒还是rVSV组合物，还包括免疫学上可接受的稀释剂或药学上可接受的载体，例如无菌水或无菌等渗盐水。所述抗原组合物也可与上述稀释剂或载体以常规方式混合。本文中所用的术语“药学上可接受的载体”意在包括任何和所有的溶剂、分散介质、包被物、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗的和吸收延迟剂等等，适用于对人或其它脊椎动物宿主所进行的给药。所述合适的载体对于本领域技术人员而言是显而易见的，主要取决于给药途径。

仍可在本发明免疫原性组合物中存在的附加组分有：佐剂、防腐剂、表面活性剂以及化学稳定剂、悬浮剂或分散剂。通常而言，对稳定剂、佐剂和防腐剂优化以确定在目标人或动物中有效的最佳配方。

1.佐剂

当与免疫原或抗原共同施用时，佐剂是一种能增强免疫应答的物质。业已证实了许多细胞因子或淋巴因子具免疫调节活性，因此可作为佐剂，包括，但不限于，白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(参见，如美国专利号5,723,127)、13、14、15、16、17和18(及其突变型)，干扰素α、β和γ，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(参见，如美国专利号5,078,996和ATCC登记号39900)，巨噬细胞集落刺激因子，粒细胞集落刺激因子，GSF，以及肿瘤坏死因子α和β。还可用于本发明的其它佐剂包括趋化因子，包括但不限于，MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES。黏附分子，如选择蛋白，例如，L-选择蛋白、P-选择蛋白和E-选择蛋白也可用作为佐剂。其它还可用的佐剂包括，不限于，粘蛋白类分子，如CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1，整联蛋白家族成员，例如LFA-1、VLA-1、Mac-1和pl50.95，免疫球蛋白超家族成员，如PECAM、ICAMs，例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3，CD2和LFA-3，共刺激分子，如CD40和CD40L，生长因子，包括血管生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、上皮细胞生长因子、B7.2、PDGF、BL-1和血管内皮生长因子，受体分子，包括Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6。其它佐剂分子还包括半胱天冬酶(ICE)。也参见国际专利公开号WO98/17799和WO99/43839，于此并入作为参考。

用于增强免疫应答的合适佐剂包括，不限于，MPL^TM(3-O-脱酰单磷酰脂质A；Corixa，Hamilton，MT)，其描述于美国专利号4,912,094中，于此并入作为参考。也适合用作为佐剂的是合成的脂质A类似物或氨烷基葡糖胺磷酸化合物(AGP)，或其衍生物或类似物，可获得自Corixa(Hamilton，MT)，其描述于美国专利号6,113,918中，于此并入作为参考。一种上述的AGP是2-[(R)-3-是十四酰基氧基是十四酰基氨基]乙基2-去氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基-氨基]-b-D-吡喃型葡萄糖苷，也称为529(以前称为RC529)。该529佐剂以水溶液形式或稳定的乳剂形式配制。

其它佐剂还包括矿物油和水乳剂，铝盐(明矾)，如氯化铝、磷酸铝等，Amphigen，Avridine，L121/角鲨烯，D-交酯-聚交酯/糖苷，聚醚型多元醇(pluronic polyols)，胞壁酰二肽，灭活的博德特氏菌属(Bordetella)，皂苷类，如Stimulon^TMQS-21(Antigenics，Framingham，MA.)，描述于美国专利号5,057,540中，于此并入作为参考，以及其中产生颗粒的如ISCOMS(免疫刺激复合物)，结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，细菌脂多糖，合成的聚核苷酸，如含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646，于此并入作为参考)，百日咳毒素(PT)，或大肠杆菌热不稳定毒素(LT)，特别是LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129；参见，如国际专利公开号WO93/13302和WO92/19265，于此并入作为参考。

也可用作为佐剂的是：霍乱毒素及其突变体，包括在国际专利公开号WO00/18434中所描述的(其中在氨基酸第29位的甘氨酸为其它氨基酸(除天冬氨酸外)所取代，优选为组氨酸)。相似的CT毒素或突变体，描述于国际专利公开号WO02/098368中(其中在氨基酸第16位的异亮氨酸为其它氨基酸所取代，单独取代或同时在氨基酸第68位的丝氨酸为其它氨基酸所取代，和/或其中在氨基酸第72位的缬氨酸为其它氨基酸所取代)。其它的CT毒素描述于国际专利公开号WO02/098369中(其中在氨基酸第25位的精氨酸为其它氨基酸所取代，和/或在氨基酸第49位插入一个氨基酸，和/或在氨基酸第35和36位插入两个氨基酸)。

在如下所例证的一个实施方案中，所需的佐剂是IL-12，其表达自质粒。参见，如美国专利号5,457,038、5,648,467、5,723,127和6,168,923，于此并入作为参考。将该IL-12表达质粒掺入包含免疫原性DNA质粒的实施例的初免组合物。然而，应当注意在初免和加强组合物之间，该质粒可单独或与rVSV组合物(或通过rVSV表达的)一起施用于哺乳动物或脊椎动物宿主。在一个实施方案中，细胞因子可作为蛋白质来施用。在一个优选的实施方案中，细胞因子可作为包含编码细胞因子的DNA序列的核酸组合物施用，所述编码受指导其在哺乳动物细胞中表达的调控序列所调控。在一个有用的实施方案中，细胞因子表达质粒与DNA组合物一起施用。在另一个实施方案中，可在施用初免物和加强组合物之间施用细胞因子。还在另一个步骤中，细胞因子在加强步骤施用。在另一个实施方案中，细胞因子可与初免组合物和加强组合物一起施用。

其中所述初免组合物是DNA质粒组合物，如下列实施例，质粒组合物可包括编码细胞因子的DNA序列，所述编码序列受调控其在哺乳动物中表达的调控序列的调控。在某些实施方案中，细胞因子编码序列所存在的DNA质粒与抗原编码序列所存在的DNA质粒相同。在另一个实施方案中，细胞因子编码序列所存在的DNA质粒与编码抗原的DNA质粒不同。

2.促进剂或辅剂

除上述载体外，免疫原性组合物包括所需的多聚核苷酸分子，其含有任选的多聚核苷酸促进剂或辅剂，如局部麻醉剂，肽，脂质，包括阳离子脂质、脂质体或油脂颗粒，聚阳离子，如多聚赖氨酸，分支的三维聚阳离子，如树枝状聚合物(dendrimer)，碳水化合物，阳离子两亲物，去污剂，苄铵基表面活性剂，或其它有助于多聚核苷酸转移至细胞的化合物。上述促进剂包括局部麻醉剂布比卡因或丁卡因(参见美国专利号5,593,972、5,817,637、5,380,876、5,981,505和6,383,512和国际专利公开号WO98/17799，于此并入作为参考)。上述用于本发明的促进剂或辅剂的其它非专有例子描述于美国专利号5,703,055；5,739,118；5,837,533；和国际专利公开号WO96/10038，公开于1996年4月4日；以及国际专利公开号WO94/16727，公开于1994年8月8日，于此并入作为参考。

最优选地，所述局部麻醉剂以能与所述核酸分子形成一种或多种复合物的量存在。当所述局部麻醉剂与本发明的核酸分子或质粒混合时，可形成多种包裹着DNA的小复合物或颗粒，并且是均一的。因此，在本发明免疫原性组合物的一个实施方案中，通过将局部麻醉剂与本发明至少一种质粒混合以形成所述复合物。该混合所形成的任何单一复合物可包含多种不同的质粒组合。或者，在本发明组合物的另一个实施方案中，局部麻醉剂可与每种质粒分别预先混合。如果所有质粒要以单个大丸药给药方式施用，则接着将不同的混合物与单一组合物结合以确保在单一免疫原性组合物中存在所需比率的质粒。或者，所述局部麻醉剂可与每种质粒独立混合并独立施用以获得所需比率。

其中，在下文中，术语“复合物(complex)”或“一种或多种复合物”或“复合物(complexes)”用于定义免疫原性组合物的实施方案，应当理解为该术语包含一种或多种复合物。每种复合物含有质粒混合物，或分离形成复合物的化合物。每种复合物可仅含有一种类型的质粒或复合物，或质粒或复合物的混合物，其中每种复合物含有多顺反子DNA。优选地，所述复合物直径在约50至约150nm。当局部麻醉剂用作为促进剂时，优选布比卡因，优选的量约为多聚核苷酸组合物总重量的约0.1重量百分比至约1.0重量百分比。参见，国际专利公开号WO99/21591，于此并入作为参考，其教导可将苄铵基表面活性剂作为辅剂掺入，优选以约0.001-0.03重量％的量施用。根据本发明的内容，局部麻醉剂的量以对所述核酸分子的一定比率存在，为1-10μg/ml核酸的0.01-2.5％w/v量的局部麻醉剂。另一上述范围为100μg/ml-1mg/ml核酸的0.05-1.25％w/v量的局部麻醉剂。

3.免疫原性组合物的其它添加剂

在本发明免疫原性组合物中可包括其它添加剂，包括防腐剂、稳定成分，表面活性剂等。

适合的防腐剂例子包括三氯叔丁醇、梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟苯甲酸酯、乙基香草醛、丙三醇、苯酚和对氯酚。

可使用的适合的稳定成分包括，例如，酪蛋白氨基酸、蔗糖、明胶、酚红、N-Z胺、磷酸二氢钾(monopotassium diphosphate)、乳糖、乳清蛋白水解产物和奶粉。

适合的表面活性剂包括，不限于，福氏不完全佐剂、醌类似物、十六胺、十八胺、十八烷氨基酸酯类、溶血卵磷脂、溴化二甲基双十八烷基铵、甲氧基十六烷基甘油和聚醚型多元醇；多胺，例如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC(poly IC)、聚羧乙烯；肽，例如胞壁酰肽和二肽、二甲基甘氨酸、促吞噬肽；油乳胶；和矿物凝胶，例如磷酸铝等以及免疫刺激复合物(ISCOMS)。质粒和rVSVs也可掺入脂质体用作为免疫原性组合物。所述免疫原性组合物也可包含其它适用于所选择组合物给药方式的添加剂。本发明的组合物也可包括冻干的多核苷酸，可与其它药学上可接受的赋形剂一起制成粉末、液体或悬浮液剂型。参见，如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第2卷，第19版(1995)，如第95章Aerosols以及国际专利公开号WO99/45966，其教导于此并入作为参考。

这些免疫原性组合物可含有适合通过任何常规给药途径施用的添加剂。在某些优选的实施方案中，本发明的免疫原性组合物可以如下形式制备用于施用人，例如，液体、粉末、气溶胶、片剂、胶囊、包有肠溶衣的片剂或胶囊，或栓剂。因此，所述免疫原性组合物也可包括，但不限于，悬浮液、溶液、在油性或水性溶剂中的乳剂、糊剂、以及可植入的持续释放或生物可降解形式。在一个用于肠胃外给药配方的实施方案中，活性成分以固体形式(即粉末或颗粒)提供，在肠胃外施用重建组合物之前用于与合适的载体(如灭菌注射用水)重建。其它可用于肠胃外给药的配方包括那些以微晶形式、以脂质体制备物或作为生物可降解聚合物系统组分来包含活性成分的。用于持续释放或植入的组合物可包含药学上可接受的聚合物的疏水物质，例如乳剂、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。

本发明的免疫原性组合物并不仅限于上述常规选择的，生理可接受的载体、佐剂或其它可用于药物制备物的成分。这些药学上可接受的组合物的制备物，来自上述组分，具有合适的pH等渗性、稳定性和其它本领域公知的常规特性。

F.本发明免疫原性组合物的给药剂量和途径

一般来说，对于本发明免疫原性组合物组分而言，合适的“有效量”或剂量选择取决于免疫原性组合物中所使用抗原的特性，以及受试者身体条件，特别是包括被免疫受试者的常规健康、年龄和体重。给药方法和途径以及在免疫原性组合物中附加组分的存在也影响着剂量以及质粒和rVSV组合物的量。上述选择以及对有效量的上调或下调亦为本领域公知常识。诱导免疫应答，优选保护性应答，或在患者中产生外源效果而无明显的副作用所需要的质粒和rVSV的量可随着这些因素的变化而变化。合适的剂量易于为本领域技术人员所确定。

施用人或非人的脊椎动物的本发明抗原或免疫原性组合物可通过许多种途径施用，包括但不仅限于，鼻内、口、阴道、直肠、肠胃外、皮内、经皮(参见，如国际专利公开号WO98/20734，于此并入作为参考)、肌内、腹膜内、皮下、静脉内和动脉内。合适途径的选择取决于所使用的免疫原性组合物特性，以及主治医师对患者年龄、体重、性别和常规健康的评估，以及免疫原性组合物中所存在的抗原和类似因素。

在下列提供的实施例中，所述免疫原性DNA组合物通过肌内注射(i.m.)施用。在一个实施方案中，需要的是鼻内施用rVSV组合物，而非肌内注射。然而，剂量和给药途径的选择并不为本发明所限制。

类似地，免疫原性组合物给药顺序和在每次给药之间的时间间隔的选择可由主治医师或本领域技术人员根据健康状况和宿主对该方法应用的明确反应而确定。上述优化对于本领域技术人员而言是公知常识。

G.试剂盒组分

还在另外一个实施方案中，本发明提供了一种药用试剂盒，用于准备施用产生免疫性、预防性或治疗性疗法，所述疗法可用于治疗任一上述疾病或病症，是对抗原免疫应答所需的。该试剂盒被设计用于在哺乳动物或脊椎动物受试者中诱导高水平抗原特异性反应的方法中。所述试剂盒包含至少一种免疫原性组合物，所述组合物包括编码抗原的DNA序列的DNA质粒，所述编码序列受指导其在哺乳动物或脊椎动物细胞中表达的调控序列所调控。优选地，在试剂盒中提供了用于多次给药的DNA免疫原性组合物的多次预包装剂量。该试剂盒也包含至少一种免疫原性组合物，所述组合物含有可复制的重组水泡性口膜炎病毒(rVSV)，其包含编码相同抗原的核酸序列，所述编码序列受指导其在哺乳动物或脊椎动物细胞中表达的调控序列所调控。优选地，在试剂盒中提供了用于多次给药的rVSV免疫原性组合物的多次预包装剂量。

其中上述免疫原性组合物并不包含表达诸如IL-12的细胞因子的DNA质粒和/或rVSV，该试剂盒也任选地包含单独的细胞因子组合物或用于多次给药的细胞因子组合物的多次预包装剂量。这些细胞因子组合物通常是核酸组合物，其包含编码所选定细胞因子的DNA序列，所述编码序列受指导其在哺乳动物或脊椎动物细胞中表达的调控序列所调控。

所述试剂盒也包含本文中所描述的初免/加强方法中指导免疫原性组合物使用的说明书。该试剂盒也包括用于实施某些分析的说明书、多种载体、赋形剂、稀释剂、佐剂和上述的等等，以及用于施用所述组合物的装置，例如注射器、喷雾装置等。其它组分可包括一次性手套、消毒的说明书、敷药棒或容器以及其它组合物。

为了更好地理解本发明，提供了下列实施例。所述实施例目的仅在于例证而不限定本发明的范围。在下列实施例中所引用的所有文献、公开出版物和专利于此并入作为参考。

正如下列实施例所证明的，在免疫受试者中本发明初免/加强方案对抗原特异性细胞和体液免疫应答的诱导具有令人惊奇的协同作用。事实上，当通过本发明初免/加强方案诱导这些反应时，与仅施用多次初免组合物或施用多次加强组合物的结果相比，本发明组合物对应答的协同作用是非常明显的。在施用表达所需抗原的DNA质粒后再施用rVSV加强剂的结合，在免疫受试者中产生了增加的抗原特异性T细胞，即相当于超过任一的加成反应。类似地，在使用DNA质粒和rVSV免疫原性组合物的免疫接种方案中，在所需抗原的体液应答中所证实的T细胞增加出乎意料的高。参见，如下表1和图4和5。

实施例1：DNA质粒的制备

该实施例描述了用于本发明一个实施方案中的示例性质粒，如实施例2和3所述。这些质粒并不受本发明所限，但业已被优化用于下列试验中。使用标准重组DNA技术设计下列DNA免疫原性组合物。表达HIV或SIV gag基因的DNA主链载体使用了HCMV启动子、BGHpoly A终止序列、ColE1细菌复制起点(ori)和用于选择的卡那霉素抗性基因。

A.SIV gag p37 DNA质粒

质粒WLV102是一种细菌质粒，其表达免疫应答所需的选定抗原SIV gag p37。质粒WLV102(4383bp)由源自SIV的RNA优化截短的gag基因(p37)(Qiu等，1999J.Virol.，73：9145-9152)插入DNA质粒表达载体WLV001中所组成。gag基因通过失活抑制序列以优化RNA，因此容许gag基因高水平的Rev不依赖型表达，使用了在下述专利所详细讨论的技术：美国专利5,965,726、5,972,596、6,174,666、6,291,664和6,414,132以及国际专利公开号WO01/46408，于此并入作为参考。

所述WLV102质粒主链由三个遗传单位组成。第一组分是真核基因表达单位，其含有来自HCMV立即早期启动子/增强子(Boshart等.1985，上述的)和BGH聚腺苷酸化信号(Goodwin EC和Rottman FM，1982 J.Biol.Claefn.267：16330-16334)的遗传元件。该gag基因克隆在SalI和EcoRI位点之间。第二组分是嵌合卡那霉素抗性(kmr)基因、磷酸腺苷4′-核苷酸转移酶1a型(参见美国专利号5,851,804)。该基因业已被设计赋予有限量的氨基糖甙类抗性，直至其能选择包含该质粒的细菌。第三个组分是ColE1细菌复制起点，其对于质粒在细菌发酵时的增殖是必需的。该质粒如图1A所示。

B.编码细胞因子-rIL-12DNA质粒

恒河猴IL-12WLV104质粒是一种双重启动子构建体，其表达异源二聚体形式的恒河猴IL-12。质粒WLV103是一种双重启动子表达质粒，由编码人IL12蛋白p35和40的两个基因组成。该质粒总共具有6259个核苷酸。WLV103中的每个顺反子含有两个白介素12亚基中的一个，p35或p40，其受独立的调控元件所调控。p35亚基受HCMV启动子/增强子和SV40聚腺苷酸化信号所调控(克隆在SalI和MluI位点之间)。p40亚基受SCMV启动子和BGH聚腺苷酸化信号所调控(克隆在XhoI位点)。

该质粒主链由几个组分组成。第一组分是真核基因表达单位，其含有源自HCMV立即早期启动子/增强子和SV40聚腺苷酸化信号(Fitzgerald M和Shenk T.，1981 Cell，24：251-260)遗传元件。第二组分是真核基因表达单位，用SCMV启动子(Jeang等，1987 J.Virol.，61：1559-1570)和BGH聚腺苷酸化信号组成。第三组分是嵌合卡那霉素抗性(km^r)基因，磷酸腺苷4′-核苷酸转移酶1a型。第四组分是ColE1细菌复制起点，其对于质粒在细菌中的增殖是必需的。

通过限制性酶切消化分析所产生的质粒载体SIV gag/HIV gag和IL-12DNA。将质粒瞬间转染入横纹肌肉瘤细胞，在添加10％小牛血清(FCS)和抗菌素的DMEM培养基中培养。接着使用HIV gag特异性单克隆抗体(ABI)和SIV gag恒河猴多克隆血清(源自SIV感染的动物)进行蛋白质印迹来分析这些细胞适当表达的病毒蛋白。在上清液中用检测p70蛋白的ELISA试剂盒(R&D Systems)检测到了IL-12。

在转化的DH10B细胞中扩增所述质粒载体，在添加卡那霉素的LB培养基中培养，根据制造商说明书，使用Qiagen试剂盒纯化。接着在琼脂糖凝胶上进行电泳，依据已知标准分析DNA。

在0.25％布比卡因配制用于下列试验的每种质粒，浓度为2.5mg/mL，总体积为4.0cc。

实施例2：重组VSV载体的制备

A.VSV基因组cDNA克隆

用于VSV基因组cDNA操作的遗传背景是pVSV-XN1(Schnell，M.J.，等1996 J.Virol.，70：2318-23)。该克隆包含一种VSV Indiana株(VSV_I)cDNA序列的修饰型。所述修饰包括添加两种独特的限制性内切酶识别位点(XhoI和NheI)，并添加VSV基因起始和VSV基因终止信号的拷贝。当诸如HIV-1_89.6p env gp160或SIV gag p55或HIV-1 gag的外源基因合适地插入XhoI和NheI位点之间时，其所处位置适合于在VSV转录调控信号调控下表达。VSV cDNA序列通过顺式作用的DNA序列侧接，所述序列是活病毒复制拯救所必需的。T7 RNA聚合酶启动子指导整个病毒cDNA的初级转录物的转录。在T7 RNA聚合酶中止转录后，核酶剪切所述初级转录物以形成RNA基因组末端。

最初，通过在G和L基因之间插入gag基因(HIV进化枝B)修饰rVSV_i基因组克隆(pVSV-XN1)，产生了质粒prVSVi-gag。类似地，制备含有HIV env基因(基因组克隆prVSVi-env)的分离的rVSV_icDNA克隆。通过扩增来自含有HIV HXBc2 gag基因或HIV 6101株env基因的质粒模板的编码区序列，将制备的gag和env cDNA序列插入pVSV-XN1。用于PCR扩增的引物含有适于进行下一步克隆的限制性酶切位点；5′引物含有XhoI位点，3′引物含有NheI位点。所扩增的编码区序列被分别插入到pVSV-XN1中以产生含有gag的克隆和含有env的克隆。

所述插入pVSV-XN1中的env基因是编码HIV Env/VSV G融合蛋白的修饰型。如果使用拼接PCR(overlap PCR)方法将Env细胞质尾部用更短的VSV G蛋白细胞质尾部来取代，则在用rVSV-HIV Env载体感染之后，显示了细胞表面增强的Env表达(参见，如Johnson，等，1998上述的；Johnson等，1997，上述的)。根据公开的技术，通过将Indiana G基因改变为Chandipura或New Jersey血清型，改变了这两种质粒的载体主链。通过利用M基因中独特的MluI位点和改造入VSVcDNA克隆中的XhoI位点来完成G基因的交换。

PCR扩增来自Chandipura或New Jersey株的VSV G基因编码序列，使用5′引物在M基因中延伸过MluI位点。所用3′引物含有与G基因3′末端同源的序列以及相应于基因-终止/基因-起始信号和XhoI位点的附加末端序列。在其业已用MluI和XhoI从质粒主链酶切后，这些引物所扩增的G基因编码序列可用于取代最初的Indiana G基因。

B.拯救来自cDNA克隆的rVSV

在被导入细胞后，基因组cDNA质粒或转录自基因组cDNA质粒的RNA并不足以启动病毒复制循环。病毒基因组RNA其自身并不是可用于翻译或复制的有效模板。因此，重组病毒必须从各种VSV基因组cDNA构建体中得到拯救。本领域公知的拯救方法有可能用于拯救来自克隆的DNA的病毒。成功的病毒拯救需要细胞中存在VSV基因组RNA和包覆病毒基因组RNA的VSV N蛋白，以及P和L蛋白，其形成病毒mRNA合成和基因组复制所需的病毒RNA-依赖型RNA聚合酶。通过共转染VSV基因组cDNA的质粒和编码VSV N，、P和L蛋白的表达质粒，在培养细胞中产生所有这些病毒组分。

所有这些质粒被设计用于通过噬菌体T7 RNA聚合酶的转录；相应地也用表达噬菌体聚合酶(MVA/T7或VTF7-3)的重组痘苗病毒感染转染的细胞。用于VSV拯救的标准方法描述于Lawson等，1995，上述的；和Schnell等，1996 J.Virol.，70：2318-23中。对该方法进行改良以更有效地用于拯救高度减毒的病毒，也可使该方法与管理机构的准则相一致。简言之，该方法如下所述。

利用磷酸钙转染方法用rVSV基因组克隆和编码VSV N、P和L基因的辅助质粒转染在12.5cm²烧瓶中合格的Vero细胞。在染开始时，加入足够量检定的MVA/T7以提供每一细胞有2个空斑形成单位的多次感染。在转染开始3小时后，对细胞进行3小时热休克步骤以提高几种负链RNA病毒的拯救效率(Parks，C.L等，1999 J.Virol.，73：3560-6)。在转染48-72小时后，将细胞和培养基转移到更大的烧瓶中，该烧瓶含有移植生长的单层Vero细胞，随后温育一天或多天以容许拯救的病毒扩增。在该扩增步骤后收获的病毒进行过滤以除去大多数污染的MVA/T7，并用于rVSV菌株的克隆分离。

通过共有测序(consensus sequencing)方法分析RNA病毒基因组，以测定病毒基因组RNA的核苷酸序列。简言之，纯化的病毒RNA逆转录产生cDNA，接着使用基因特异性引物通过PCR扩增基因组的重叠区。使用凝胶纯化PCR产物，接着使用荧光染色终止剂进行循环测序。纯化测序反应产物并在自动测序仪上进行分析。

C.实施例中所使用的特异性构建体

为了生产用于下列实验的特异性重组VSV载体，将表达HIV-189.6P gp160的重组VSVs融合至VSV G蛋白跨膜区(rVSV HIV-1envG)，并与SIVmac239 gag p55(rVSV SIVgag)混合用作为实验免疫原性组合物。表达流行性感冒血球凝集素蛋白(rVSV fluHA)的rVSV用作为对照组合物。如前所述，使用编码插入至VSV G和L转录单位之间的所需抗原的基因来制备重组VSV载体(Rose等，2000 J.Virol.74：10903-10)。下述构建参见Rose等，同上。

1.质粒构建体

Cleveland Clinic的Amiya Banerjee博士友好地提供了含有Chandipura糖蛋白[G(Ch)]基因的质粒(Masters，P.S.，1989 Virol.，171：285-290)。为了构建含有G(Ch)基因取代Indiana糖蛋白[G(I)]基因的VSV载体，首先使用寡核苷酸指导的诱变从G(Ch)基因中除去XhoI位点，使用了互补引物：5′-CCCCTAGTGGGATCTCCAGTGATATTTGGAC(SEQ ID NO：2)和5′-GTCCAAATATCACTGGAGATCCCACTAGGGG(SEQ ID NO：3)以及Stratagene QuikChange诱变试剂盒。CTCGAG(SEQ ID NO：4)突变为CTC CAG(SEQ ID NO：5)除去了XhoI位点，但不影响G(Ch)蛋白的氨基酸序列。接着使用Vent DNA聚合酶(New EnglandBiolabs)通过PCR扩增该基因。正向引物是：5′-GATCGATCGAATTC ACGCGTAACATGACTTCTTCAG(SEQ IDNO：6)，对于G(Ch)蛋白而言，ATG起始密码子上游含有MluI位点(下划线)。反向引物是：5′-GAACGGTCGACGCGCCTCGAGCG TGATATCTGTTAG TTTTTTT CATATCATGTTGTTGGGCTTGAAGATC(SEQ ID NO：7)，含有SalI和XhoI位点(粗体)，然后是VSV转录起始和终止信号(下划线)，接着是G(Ch)3′编码序列的互补序列。

PCR产物用MluI和SalI消化并克隆到pVSVXN-1载体中(Schnell，等1996 J.Viral.70：2318-2323)，该载体事先用MluI和XhoI消化以去除VSV G(I)编码序列(SalI和XhoI留下可相容的末端用于连接)。该方法所制备的质粒称为pVSV(GCh)XN-1并含有外源基因表达位点，通过独特的XhoI和NheI位点侧接在G(Ch)基因和L基因之间。

使用一种与上述方法相同的方法产生包含来自质粒pNJG(Gallione，C.J.，和J.K.Rose.1983 J.Tirol：162-169)的G(NJ)蛋白基因的载体。正向引物是：5′-GATCGATCGAATTCACGCGTAATATGTTGTCTTATCTAATCTTTGC(SEQ NO：8)，反向引物是：5′-GGAACGGTCGACGCGCCTCGAGCG TGATATCTGTTAG TTTT TTTCATATTAACGGAAATGAGCCATTTCCACG(SEQ NO：9)。用于上述Chandipura构建的位点表示为粗体字母和下划线序列，随后的克隆步骤也如上所述。最终得到的载体称为pVSV(GNJ)XN-1，其含有外源基因表达位点，通过独特的XhoI和NheI位点侧接在G(NJ)基因和VSV L基因之间。

为了制备含有HIV Env 89.6G基因的载体，用XhoI和NheI酶切pVSV-89.6gp160G获得编码带有VSV G细胞质尾部的89.6包膜蛋白的基因(Johnson等1997，上述的)，并克隆入载体pVSV(GNJ)XN-1或pVSV(GCh)XN-1的XhoI和NheI位点之间。该gp160G基因编码所有的gp120和gp41胞外区和跨膜区，并具有融合至VSV G胞质区的26C-末端氨基酸的89.6 Env胞质区的4个氨基酸(N-R-V-R)(SEQ ID NO：10)，以序列I-H-L-C(SEQ ID NO：11)为起点。

2.重组病毒的恢复

使用已建立的方法(Lawson等1995上述的)恢复重组VSVs。简言之，在10-cm培养板上，培养幼仑鼠肾(BHK)细胞至约60％融合。然后用vTF7-3，一种表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒，多次感染细胞，感染(MOI)为10，(Fuerst等1987 Mol.Cell.Biol.7：2538-2544)。1小时后，用3μg pBS-N、5μg pBS-P、1μg pBS-L和10μg编码上述三种全长重组体之一的质粒转染每一培养板的细胞。转染使用了含有二甲基三十六烷基溴化铵和磷脂酰乙醇胺二油醇酯的阳离子脂质体试剂(Rose等，1991 Biotechniques 10：520-525)。细胞在37℃温育48小时。将细胞上清液通过0.2μm滤膜除去大多数的痘苗病毒，然后将其应用于新鲜的BHK细胞，在37℃下再温育48小时。对于某些恢复而言，包含有4微克/平板的编码VSV G的附加质粒(pBS-G)以及N、P和L辅助质粒。通过扫描BHK细胞单层以获得VSV细胞病理结果来证实感染病毒的恢复。接着在BHK细胞上分离病毒空斑，通过将来自单个空斑的病毒添加至10cm直径的BHK细胞培养板上，进行来自单个空斑的病毒母液的培养。然后将这些母液保存在80℃。冻融后，获得自VSV(GI)-89.6G、VSV(GCh)-89.6G和VSV(GNJ)-89.6G的效价都在10⁷-10⁸PFU/ml范围内，该过程减少了大约3倍的VSV效价。

为了在下列实验中使用，每一rVSV构建体都用无菌DME稀释至终体积为0.8cc。

实施例3：初免/加强免疫接种疗法

A.免疫接种方案

通过肌内注射5mg编码恒河猴IL-12p35和IL-12p40的双顺反子DNA质粒、5mg表达SIV gag p37多肽的DNA质粒(1和2组)或10mg空的DNA质粒(3和4组)来免疫恒河猴(每组5只)。所有这些DNA质粒及其配方详述于实施例1中。DNA免疫接种时间表规定在第0天进行初始免疫接种，在第4周和第8周进行第一次和第二次的加强免疫接种。使用针头和注射器在三角肌和四头肌的4个部位进行注射，每个部位1cc。

接着在第15周加强恒河猴，通过鼻内注射(0.4cc/鼻孔，使用手提式吸量管)Indiana(I)血清型的重组水泡性口膜炎病毒(rVSV)，其基于实施例2中含有HIV-1 gp160 env基因的载体(5×10⁶pfu)，以及含有SIV gag p55基因的第二种rVSV(I)(5×10⁶pfu)(2和3组)，或含有流行性感冒血凝素基因的rVSV(I)(1×10⁷pfu)(1和4组)。在第23周再次加强恒河猴，通过鼻内注射(0.4cc/鼻孔，使用手提式吸量管)rVSV(Chandipuri血清型，Ch)，其基于实施例2中含有HIV-1gp160 env基因的载体(5×10⁶pfu)，以及含有SIV gag p55基因的第二种rVSV(Ch)(5×10⁶pfu)(2和3组)，或含有流行性感冒血凝素基因的rVSV(Ch)(1×10⁷pfu)(1和4组)。

密切监测恒河猴外周血中细胞和体液免疫应答的诱导，以及在各种粘膜表面的抗体反应。该监测包括对γ干扰素和SIV gag p55肽库进行酶联免疫点测定(ELISpot)、对γ干扰素和HIV-1 env 6101肽库进行ELISpot测定以及对γ干扰素和VSV N肽库进行ELISpot测定。该ELISpot测定检测PBL中的细胞免疫应答。

可通过ELISA评估血清(图4)、鼻洗液、直肠分泌物和唾液(数据未显示)抗-SIV gag p27 IgG效价及抗-HIV-1 gp160 env效价(数据未显示)以检查体液免疫应答。对于血清来说，ELISA中所使用的抗体是嵌合病毒SHIV89.6和SHIV89的天然抗体。

B.ELISpot测定法检测分泌细胞因子的鼠和人细胞

滤膜免疫空斑测定也称为酶联免疫点测定(ELISpot)，最初开发是用于检测和定量单个分泌抗体的B细胞。最初，该技术是为常规空斑形成细胞测定法提供一种快速和通用的补充方法。近来，对ELISpot测定法的改进已提高了其的灵敏度，使得少到细胞每秒产生100个特定蛋白分子都能得到检测。这些测定法利用了在分泌蛋白细胞周围环境中相对高浓度的已知蛋白(如细胞因子)。使用高亲和力抗体可捕获并检测这些细胞产物。

ELISpot测定法利用了抗同一细胞因子分子上不同表位的两种高亲和力细胞因子特异性抗体；或两种单克隆抗体或一种单克隆抗体和一种多价抗血清的组合。在比色反应基础上，ELISpot产生斑点，检测单个细胞分泌的细胞因子。该斑点代表最初的细胞因子所产生细胞的“足迹”。斑点(即斑点形成细胞或SFC)是永久的，可通过目视、显微镜或用电子仪器定量。

ELISpot测定法进行如下：用1μg/ml浓度的鼠抗人γ干扰素(hIFN-γ)单克隆抗体(clone 27，BD-Pharmingen，San Diego CA)包被96孔平底ELISpot板(Millipore，Bedford，MA)过夜，用添加有0.25％Tween-20的1x PBS洗涤10次，并用含5％小牛血清(FBS)的PBS封闭2小时。通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心，从新鲜提取的肝素化全血中分离恒河猴外周血淋巴细胞(PBLs)，并重悬于含50μg/ml PHA-M(Sigma)或跨越了整个SIV gag开放阅读框的重叠了11个氨基酸的15氨基酸肽库(最终肽浓度为1μM)的完全培养基(RPMI 1640培养基，添加有5％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100单位/mL盘尼西林、100μg/ml硫酸链霉素、1mM丙酮酸钠、1mM HEPES、100μM非必需氨基酸)中，或仅在培养基中重悬。

在10μL/孔中放入细胞的数目为2×10⁵ PBLs并在两个孔中分析。在37℃温育细胞16小时，然后通过首先用去离子水洗涤，再用添加0.25％Tween-20的1x PBS洗涤10次将细胞从培养板上洗下。其后，用兔多抗抗-hIFN-γ生物素化检测抗体(0.2μg/孔，Biosource，Camarillo，CA)处理培养板，该抗体用含1％BSA的1xPBS稀释并在室温下温育2小时。接着用添加0.25％Tween-20的1xPBS洗涤培养板10次，并用100μl/孔的抗生物素蛋白链菌素碱性磷酸酶缀合物(Southern Biotech，Birmingham AL)处理，该缀合物用含5％FBS和0.005％Tween-20的1x PBS稀释至1∶500并在室温下再温育2.5小时。通过使用添加0.25％Tween-20的1x PBS洗涤培养板10次除去未结合的缀合物。然后，添加显色底物(100μL/孔，1-step NBT/BCIP，Pierce，Rockford，IL)，3到5分钟后用水冲洗，风干培养板，用倒置解剖显微镜对产生的斑点目视计数。

本发明ELISpot测定的进行是为了测定在本发明初免/加强免疫接种方法应答中所诱导产生的CD8+T细胞(CTLs)和CD4+T细胞数目，其是通过γ干扰素的生成来测定的。该评估直至对上述恒河猴进行处理后的第25周(在3次DNA初免和2次VSV加强后)。

C.结果

在DNA初始免疫接种后，在10只SIV gag/rIL-12DNA免疫的恒河猴(平均254SFC/10⁶细胞)中有8只可容易检测到SIVgag-特异性IFN-γELISpot应答。在第二次SIV gag/IL-12DNA免疫后，10只免疫的恒河猴(平均1133SFC/10⁶细胞)都显示了高水平的ELISpot应答，并用1/3剂量的gag/IL-12DNA加强了大多数动物中的gag-特异性ELISpot应答(平均1506SFC/10⁶细胞)。在第一次rVSV HIVenv/rVSVSIVgag加强后，与仅接受单次rVSV HIVenv/rVSV SIVgag免疫接种相比(平均386SFC/10⁶细胞)，平均SIV gag ELISpot应答明显提高(3772 SFC/10⁶细胞)。这些结果支持了细胞因子可用于增强DNA初免以增加rVSV免疫接种的免疫原性。

这些结果记录于下表1和图2、3、4和5中。图2显示了在来自这些免疫25周后动物的未分级外周血单核细胞(PBMC)中rVSV N-特异性IFN-γELISpot应答。图3显示了相同样品中HIV env 6101特异性IFN-γELISpot应答。星号表示产生统计学上显著差异，p＝0.0001。图4显示了通过ELISA测定的血清抗体抗-SIV gag p27IgG和抗-HIVgp160 env的效价。用编码SIV gag蛋白的DNA质粒免疫接种并用表达flu HA蛋白的VSV载体加强的方案表示为(◆)。涉及用DNA gag质粒初免免疫接种后再用表达HIV gag和env蛋白的VSV加强的本发明方案表示为(■)。涉及用空的对照DNA质粒初始免疫接种后再用表达HIV gag和env蛋白的VSV免疫接种的方案表示为(▲)。涉及用对照DNA质粒初始免疫接种后再用表达flu HA蛋白的VSV免疫接种的方案表示为(●)。每组所代表的结果来自5只动物。各组间统计学上显著差异表示为p＝0.0073(^*)；p＝0.5941(#)或p＝0.0027(￥)。

图5显示了相同样品中的SIV gag特异性IFN-γELISpot应答的平均数。用编码SIV gag蛋白的DNA质粒免疫接种并用表达flu HA蛋白的VSV载体加强的方案表示为(◆)。涉及用DNA gag质粒初始免疫接种后再用表达HIV gag和env蛋白的VSV加强的本发明方案表示为(■)。涉及用空的对照DNA质粒初始免疫接种后再用表达HIV gag和env蛋白的VSV免疫接种的方案表示为(▲)。涉及用对照DNA质粒初始免疫接种后再用表达flu HA蛋白的VSV免疫接种的方案表示为(●)。每组所代表的结果来自5只动物。各组间统计学上显著差异通过方括号表示为p＝0.0001和p＝0.0002。

表1以列表形式记录了相同的结果。

表1：SIV gag/恒河猴IL-12DNA初免和rVSV-SIV gag/rVSV-HIVenv加强免疫接种后的SIVgag-特异性IFN-γELISpot应答平均数

组#/方案/动物数量	初免	加强	SIVgag-特异性IFNγELISpot应答平均数(#SFC/10⁶PBLs)^a
组#/方案/动物数量	初免	加强	SIVgag-特异性IFNγELISpot应答平均数(#SFC/10⁶PBLs)^a	1，仅进行初免(n＝5)	SIV gag/IL-12DNA	VSV FluHA	471
2，初免/加强(n＝5)	SIV gag/IL-12DNA	VSV-SIVgag/HIV env	2,338	1，仅进行初免(n＝5)	SIV gag/IL-12DNA	VSV FluHA	471
2，初免/加强(n＝5)	SIV gag/IL-12DNA	VSV-SIVgag/HIV env	2,338	3，仅进行加强(n＝5)	空DNA	VSV-SIVgag/HIV env	420
4，对照(n＝5)	空DNA	VSV FluHA	55	3，仅进行加强(n＝5)	空DNA	VSV-SIVgag/HIV env	420

^a在最初DNA免疫接种25周后记录的SIVgag-特异性ELISpot应答平均数。

这些测定结果证明了与仅施用多次初免组合物及多次加强组合物的结果相比，本发明的初免/加强疗法具有令人惊奇协同作用。在施用表达所需抗原的DNA质粒后再施用rVSV加强剂的结合，在免疫受试者中产生了增加的抗原特异性T细胞，即相当于超过任一的加成反应。类似地，在使用DNA质粒和rVSV免疫原性组合物的免疫接种方案中，在所需抗原的体液应答中所证实的T细胞增加出乎意料的高。

实施例4：用于抗HIV免疫接种的恒河猴模型

使用实施例3中的初免/加强策略以及根据相同方案所描述的质粒和VSV载体来免疫恒河猴(Rh)。在首次施用初免组合物后约32周，用330 50％猴感染剂量(MID₅₀)的病原性SIV/HIV重组病毒SHIV89.6P激发恒河猴(Reimann等，1996 J.Virol.，70：3198-3206；Reimann等1996 J.Virol.，70：6922-6928)。

激发后约50-70天，检测动物疾病。在每次免疫接种前、一周和两周后立即监测动物细胞介导的诱导和抗体反应。在激发前和激发后2、4、6、8和12周收集的血清用于测试对HIV-189.6、89.6P、6101和其它的进化枝B初始分离物的中和抗体反应。在试验的免疫接种阶段，激发前和激发后每两周立即监测CD4/CD8计数。激发前和激发后每一周，通过分支DNA分析立即测定血清中病毒负荷。也检查动物的其它体液(阴道、直肠、鼻分泌物及唾液)的细胞和体液免疫应答。

使用几种最合适的基于细胞的测定法分析对所需抗原的细胞介导的免疫应答，包括⁵¹Cr-释放CTL测定法、可溶性MHC I型四聚体染色、ELISpot测定法和细胞内细胞因子分析。通过ELISA技术评估粘膜抗体反应，优化用于粘膜样品。通过标准的ELISA技术亦可评估血清抗体反应。另外，测定来自所有免疫动物的血清，以确定对HIV Env6101和其它初始进化枝B分离物的中和抗体反应。图6阐明了通过本发明初免/加强结合引发了加强的免疫应答，导致增加的AIDS保护作用，通过在激发后至少250天内测定CD4T细胞损耗减少来确定。

除监测免疫原性组合物引发的免疫应答外，还通过检测其释放水平和持续时间来评估活病毒载体的传播潜能。在每次免疫接种后开始三周内按一定间隔频繁获取鼻洗液以测定活病毒存在。也检测质粒病毒负荷用于确定存在的活病毒拷贝。图7显示了通过初免/加强结合引发的加强的免疫应答，通过在激发后至少250天内测定血浆内循环病毒的减少来确定。

与对照动物相比，上述检测的结果很有可能表明根据本发明免疫的动物中具有非常高的抗原特异性CD8+和CD+T细胞。应当预料到根据本发明初免/加强疗法免疫的动物在HIV暴露后仍保持健康，而未免疫的动物则患AIDS。

与其它已知初免/加强疗法方案的结果相比，即与仅一次或多次DNA初免组合物免疫接种或仅一次或多次rVSV载体免疫接种所提供的结果相比，可预计本发明方法具有对免疫动物安全和能印发较高水平的抗-HIV CTLs和抗体。根据本发明的重复的初免/加强可能具协同作用，并因此对预暴露受试者具预防作用，对已感染HIV的受试者具有治疗作用。

所有上述本说明书中的引用文献于此并入作为参考。本发明方法和组分的各种变体及较小变化对于本领域技术人员而言是显而易见的。

序列表

<110>Wyeth

Eldridge，John H.

Israel，Zimra R.

Egan，Michael A.

Udem，Stephen A.

<120>免疫原性组合物及方法

<130>AM-101319PCT

<150>US 60/457,876

<151>2003-03-26

<150>US 60/546,733

<151>2004-02-23

<160>11

<170>PatentIn 3.2版

<210>1

<211>42

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>β-淀粉状1-42肽

<400>1

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Aal His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

35 40

<210>2

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>互补引物

<400>2

cccctagtgg gatctccagt gatatttgga c 31

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>互补引物

<400>3

gtccaaatat cactggagat cccactaggg g 31

<210>4

<211>6

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>互补引物

<400>4

ctcgag 6

<210>5

<211>6

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>互补引物

<400>5

ctccag 6

<210>6

<211>36

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>正向引物

<400>6

gatcgatcga attcacgcgt aacatgactt cttcag 36

<210>7

<211>70

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反向引物

<400>7

gaacggtcga cgcgcctcga gcgtgatatc tgttagtttt tttcatatca tgttgttggg 60

cttgaagatc 70

<210>8

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>正向引物

<400>8

gatcgatcga attcacgcgt aatatgttgt cttatctaat ctttgc 46

<210>9

<211>73

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>反向引物

<400>9

ggaacggtcg acgcgcctcg agcgtgatat ctgttagttt ttttcatatt aacggaaatg 60

agccatttcc acg 73

<210>10

<211>4

<212>PRT

<213>HIV Env 89.6G基因

<400>10

Asn Arg Val Arg

1

<210>11

<211>4

<212>PRT

<213>VSV G细胞质尾部

<400>11

Ile His Leu Cys

1

Claims

1.一种在哺乳动物受试者中诱导抗原特异性免疫应答的方法，所述方法包括入如下步骤：

(a)对所述受试者施用有效量的第一组合物，所述第一组合物包括含有编码所述抗原DNA序列的DNA质粒，所述编码序列受指导其通过所述DNA质粒表达的调控序列所调控；和

(b)对所述受试者施用有效量的第二组合物，所述第二组合物包括含有编码所述抗原的核酸序列的重组水泡性口膜炎病毒(VSV)，所述编码序列受指导其通过所述重组VSV表达的调控序列所调控。

2.根据权利要求1的方法，其中所述VSV具有复制能力。

3.根据权利要求1的方法，其中所述VSV不复制。

4.根据权利要求1的方法，其中在所述第二组合物施用前对所述受试者施用至少一次所述第一组合物。

5.根据权利要求4的方法，其中对所述受试者施用至少一次所述第二组合物。

6.根据权利要求1的方法，其中在所述第一组合物施用前对所述受试者施用至少一次所述第二组合物。

7.根据权利要求6的方法，其中对所述受试者施用至少一次所述第一组合物。

8.根据权利要求1的方法，步骤(a)还包括：施用所述哺乳动物有效量的细胞因子。

9.根据权利要求8的方法，其中所述细胞因子作为核酸组合物施用，所述核酸组合物包括含有编码所述细胞因子的DNA序列的DNA质粒，所述编码序列受指导其通过所述DNA质粒表达的调控序列所调控。

10.根据权利要求9的方法，其中所述细胞因子选自：IL-12、IL-15、GM-CSF及其组合。

11.根据权利要求9的方法，其中所述细胞因子编码序列与所述抗原编码序列存在于相同质粒上。

12.根据权利要求9的方法，其中所述细胞因子编码序列与所述抗原编码序列存在于不同质粒上。

13.根据权利要求1的方法，步骤(b)还包括：施用所述哺乳动物有效量的细胞因子。

14.根据权利要求13的方法，其中所述细胞因子以蛋白形式施用。

15.根据权利要求14的方法，其中所述细胞因子选自：IL-12、IL-15、GM-CSF及其组合。

16.根据权利要求1的方法，其中所述抗原是蛋白、多肽、肽、其片段或融合物，其中所述蛋白来源于选自下述的成分：细菌、病毒、真菌、寄生虫、癌细胞、肿瘤细胞、过敏原和自身分子。

17.根据权利要求16的方法，其中所述病毒是人或猴免疫缺陷病毒。

18.根据权利要求17的方法，其中所述抗原选自：gag、pol、env、nef、vpr、vpu、vif和tat，以及其免疫原性片段或融合物。

19.根据权利要求1的方法，其中所述第一组合物包括含有编码多于一个拷贝的相同或不同的所述抗原DNA序列的DNA质粒。

20.根据权利要求1的方法，其中所述第一组合物包括多于一个DNA质粒，其中每个DNA质粒编码相同或不同的抗原。

21.根据权利要求1的方法，其中所述免疫应答包括较仅施用所述DNA质粒或重组VSV，对所述抗原的CD8+T细胞应答增强。

22.根据权利要求1的方法，其中所述免疫应答包括较仅施用所述第一或第二组合物，在对所述抗原的抗体应答中具有协同增强作用。

23.根据权利要求1的方法，其中所述哺乳动物受试者是灵长类。

24.根据权利要求23的方法，其中所述哺乳动物受试者是人。

25.根据权利要求1的方法，步骤(a)还包括：在施用所述重组VSV前施用至少两种所述DNA质粒，每种质粒包含编码不同抗原的序列。

26.根据权利要求1的方法，步骤(b)还包括：施用至少两种所述重组VSV。

27.根据权利要求26的方法，其中每种所述重组VSV具有不同的VSV G蛋白和不同的VSV血清型，但具有相同的抗原编码序列。

28.根据权利要求26的方法，其中每种所述重组VSV具有不同的抗原编码序列，但具有相同的VSV G蛋白。

29.根据权利要求26的方法，其中每种所述重组VSV具有不同的抗原编码序列，和不同的VSV G蛋白。

30.根据权利要求26的方法，其中第二和任一附加的重组VSV在所述第一重组VSV施用后作为加强剂施用。

31.根据权利要求30的方法，还包括施用至少三次所述加强剂。

32.根据权利要求1的方法，其中所述DNA质粒组合物在药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体中施用。

33.根据权利要求32的方法，其中所述赋形剂包括布比卡因。

34.根据权利要求1的方法，其中所述rVSV组合物在药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体中施用。

35.一种用于在哺乳动物受试者中诱导针对抗原的抗原特异性免疫应答的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括：

(a)一种第一组合物，包括含有编码所述抗原DNA序列的DNA质粒，所述编码序列受指导其通过所述DNA质粒表达的调控序列所调控；和

(b)至少一种重组水泡性口膜炎病毒(VSV)，包括编码所述抗原的核酸序列，所述编码序列受指导其通过所述重组VSV表达的调控序列所调控。

36.根据权利要求35的组合物，其中所述VSV具有复制能力。

37.根据权利要求35的组合物，其中所述VSV不复制。

38.根据权利要求35的免疫原性组合物，还包括细胞因子组合物。

39.根据权利要求38的免疫原性组合物，其中所述细胞因子组合物包括含有DNA质粒的核酸组合物，所述DNA质粒包括编码所述细胞因子的DNA序列，所述编码序列受指导其通过所述DNA质粒表达的调控序列所调控。

40.一种用于在哺乳动物受试者中诱导抗原特异性免疫应答的方法中的试剂盒，所述试剂盒包括：

至少一种第一组合物，包括含有编码所述抗原的DNA序列的DNA质粒，所述编码序列受指导其通过所述DNA质粒表达的调控序列所调控；

至少一种第二组合物，包括含有编码所述抗原的核酸序列的重组水泡性口膜炎病毒(VSV)，所述编码序列受指导其通过所述重组VSV表达的调控序列所调控；和

用于实施权利要求1方法的说明书。

41.根据权利要求40的试剂盒，其中所述VSV具有复制能力。

42.根据权利要求40的试剂盒，其中所述VSV不复制。

43.根据权利要求40的试剂盒，还包括细胞因子组合物。

44.根据权利要求43的试剂盒，其中所述细胞因子组合物包括含有DNA质粒的核酸组合物，所述DNA质粒包括编码所述细胞因子的DNA序列，所述编码序列受指导其通过所述DNA质粒表达的调控序列所调控。

45.下述组合物在制备在动物中诱导对所述抗原免疫应答的药物中的应用，所述组合物是(a)一种第一组合物，包括含有编码所述抗原DNA序列的DNA质粒，所述编码序列受指导其通过所述DNA质粒表达的调控序列所调控；和(b)至少一种重组水泡性口膜炎病毒(VSV)，包括编码所述抗原的核酸序列，所述编码序列受指导其通过所述受重组VSV表达的调控序列所调控。