KR20180036765A - 돼지 종에서의 강화된 면역 응답성 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 돼지 종들 대상체에서의 면역 응답성의 유도 방법에 관한 것이다. 특별하게는, 면역조절자 조성물이 감염원과 싸울 대상체의 능력을 강화하도록 면역 응답성을 유도하기 위해 이용된다.

Description

돼지 종에서의 강화된 면역 응답성

상호-참고문헌

본 출원은 35 U.S.C §119(e) 하에 본원에 그의 내용이 전부 참고문헌으로 포함되는, 발명의 명칭이 [ENHANCED IMMUNE RESPONSE IN PORCINE SPECIES] 인 2015 년 7 월 31 일에 출원된 미국 임시 특허출원 번호 제 62/199,848 호의 권익을 청구한다.

기술분야

본 출원은 개괄적으로는 선천성 면역의 활성화에 의한 대상체에서의 면역 응답성 유발 방법에 관한 것이다. 특별하게는, 면역조절자 조성물이 돼지 종 구성원에서 선천성 면역의 자극에 이용된다.

본 발명은 돼지 종들 대상체에서 선천성 면역 조절을 위한 면역자극성 플라스미드의 사용 방법에 관한 것이다. 상기 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 의 서열과 80% 이상 서열 동일성을 가진 핵산 서열, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 4 의 서열과 84% 이상의 서열 동일성을 가진 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 1 의 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 4 의 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 2 의 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 3 의 서열을 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 상기 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 의 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 가진 핵산 서열 또는 이들의 조합으로 이루어질 수 있다. 일부 측면에서, 상기 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 4 의 서열과 84% 이상의 서열 동일성을 가진 핵산 분자로 이루어질 수 있다. 일부 측면에서, 상기 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 1 의 서열로 이루어질 수 있다. 일부 측면에서, 상기 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 4 의 서열로 이루어질 수 있다. 일부 측면에서, 상기 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 2 의 서열로 이루어질 수 있다. 일부 측면에서, 상기 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 3 의 서열로 이루어질 수 있다.

일부 측면에서, 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 전장 또는 기능성의 선택가능하거나 또는 선별가능한 마커를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 다른 측면에서, 면역자극성 플라스미드는 항생제 내성 유전자가 아닌 선택가능하거나 또는 선별가능한 마커를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약제학적 제형물에 관한 것이다.

본 발명은 나아가 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 본원에 기재된 임의의 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열을 함유하는 면역조절자 조성물에 관한 것이다.

일부 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열의 사용 방법에 관한 것이다. 적합한 사용 방법은 돼지 종들의 대상체에 대한 치료용 투여를 포함한다. 그러한 치료용 투여는 대상체 또는 대상체들의 예방적 치료, 집단감염에 앞선 대량의약 치료 (metaphylactic treatment), 및 감염 후 치료를 포함한다.

본 발명은 대상체에서의 면역 응답성 자극 또는 유발 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 상기 방법은 대상체에 대한 본원에 기재된 면역조절자 조성물의 투여에 의한 대상체에서의 면역 응답성 자극을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 대상체에 대한 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열의 투여에 의한 대상체에서의 면역 응답성 자극을 포함한다. 일부 측면에서, 면역조절자는 또한 생물작용제, 예를 들어 백신과 조합하여 포함하거나 또는 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 돼지에게 유효량의 면역조절자 조성물을 투여하는 것을 포함하는 돼지에서의 설사 감소 방법을 제공하는데, 여기서 상기 면역조절자는 양이온성 지질 전달 비히클 및 면역원을 코드하지 않는 핵산 분자를 함유하며, 여기서 상기 투여는 대장균 (Escherichia coli) 으로의 챌린지 후 상기 돼지에서 설사를 감소시킨다.

본 발명은 또한 돼지에게 면역조절자 조성물을 투여하는 것을 포함하는 돼지에서의 증체 증가 방법에 관한 것으로, 상기 면역조절자는 양이온성 지질 전달 비히클 및 면역원을 코드하지 않는 핵산 분자를 함유하며, 여기서 상기 투여는 돼지 생식기 호흡 증후군 (PRRSV) 으로 챌린지 제공 후 상기 돼지에서 증체를 증가시킨다.

여타 목적 및 특징은 이후 일부 명백하게 되며 일부 지적될 것이다.

하기 도면은 본 명세서의 일부를 구성하며, 본 발명의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시되는 구체적 구현예의 상세한 설명과 조합하여 이들 도면들을 하나 이상 참고함으로써 더욱 잘 이해될 것이다.
도 1 은 pMB75.6 플라스미드 (SEQ ID NO: 2) 의 맵을 보여준다;
도 2 는 pGCMB75.6 플라스미드 (SEQ ID NO: 1) 의 맵을 보여준다;
도 3 은 pLacZ75.6 플라스미드 (SEQ ID NO: 4) 의 맵을 보여준다;
도 4 는 제 0 일 (민무늬, 연회색), 제 3 일 (민무늬, 진회색), 제 7 일 (사선무늬), 제 10 일 (흑색 마름모), 제 14 일 (민무늬, 진적색), 제 18 일 (민무늬, 핑크색), 제 21 일 (민무늬, 청색), 제 24 일 (민무늬, 연청색), 및 제 28 일 (민무늬, 진청색) 에 대해 각 치료 군 (Txt 1: 백신만 제공; Txt 2: 백신 및 200 ㎍ 면역조절자 조성물; Txt 3: 백신 및 50 ㎍ 면역조절자 조성물; Txt 4: 백신 및 10 ㎍ 면역조절자 조성물; 및, Txt 5: 희석제 (5% 덱스트로스 및 물) 의 H1N1 에 대한 적혈구응집반응 억제의 기하 평균을 그래프로 도시한다;
도 5 는 제 0 일 (민무늬, 연회색), 제 3 일 (민무늬, 진회색), 제 7 일 (사선무늬), 및 제 21 일 (민무늬, 청색) 에 대해 각 치료군 (Txt 1: 백신만 제공; Txt 2: 백신 및 200 ㎍ 면역조절자 조성물; Txt 3: 백신 및 50 ㎍ 면역조절자 조성물; Txt 4: 백신 및 10 ㎍ 면역조절자 조성물; 및, Txt 5: 희석제 (5% 덱스트로스 및 물) 의 H3N2 에 대한 적혈구응집반응 억제의 기하 평균을 그래프로 도시한다;
도 6 은 제 0 일 (민무늬, 연회색), 제 3 일 (민무늬, 진회색), 제 7 일 (사선무늬), 제 10 일 (흑색 마름모), 제 14 일 (민무늬, 진적색), 제 18 일 (민무늬, 핑크색), 제 21 일 (민무늬, 청색), 제 24 일 (민무늬, 연청색), 및 제 28 일 (민무늬, 진청색) 에 대해 각 치료 군 (Txt 1: 백신만 제공; Txt 2: 백신 및 200 ㎍ 면역조절자 조성물; Txt 3: 백신 및 50 ㎍ 면역조절자 조성물; Txt 4: 백신 및 10 ㎍ 면역조절자 조성물; 및, Txt 5: 희석제 (5% 덱스트로스 및 물) 의 H1N1 에 대한 적혈구응집반응 억제의 실제 평균을 그래프로 도시한다;
도 7 은 제 0 일 (민무늬, 연회색), 제 3 일 (민무늬, 진회색), 제 7 일 (사선무늬), 및 제 21 일 (민무늬, 청색) 에 대해 각 치료 군 (Txt 1: 백신만 제공; Txt 2: 백신 및 200 ㎍ 면역조절자 조성물; Txt 3: 백신 및 50 ㎍ 면역조절자 조성물; Txt 4: 백신 및 10 ㎍ 면역조절자 조성물; 및, Txt 5: 희석제 (5% 덱스트로스 및 물) 의 H3N2 에 대한 적혈구응집반응 억제의 실제 평균을 그래프로 도시한다;
도 8 은 각 치료 군 (Txt 1: 백신만 제공; Txt 2: 백신 및 200 ㎍ 면역조절자 조성물; Txt 3: 백신 및 50 ㎍ 면역조절자 조성물; Txt 4: 백신 및 10 ㎍ 면역조절자 조성물; 및, Txt 5: 희석제 (5% 덱스트로스 및 물) 에 대해 제 21 일째에 H1N1 및 H3N2 단리물에 대해 혈청전환된 돼지의 백분율을 그래프로 도시한다;
도 9 는 백신 비제공/챌린지 비제공 (속빈 마름모), 예방접종 비제공/챌린지 제공 (색칠된 사각형), Rx I 백신 + 10 ㎍ 면역조절자 + 챌린지 (속빈 삼각형), Rx II 백신 + 50 ㎍ 면역조절자 + 챌린지 (속빈 사각형), Rx III 백신 + 챌린지 (별무늬) 를 포함하는, 각 치료 군에 대한 챌린지에 후속하는 돼지의 매일 평균 태도 스코어를 그래프로 도시한다;
도 10 은 예방접종 비제공/챌린지 비제공 (속빈 마름모), 예방접종 비제공/챌린지 제공 (속빈 사각형), Rx I 백신 + 10 ㎍ 면역조절자 + 챌린지 (색칠된 삼각형), Rx II 백신 + 50 ㎍ 면역조절자 + 챌린지 (색칠된 사각형), Rx III 백신 + 챌린지 (별무늬) 를 포함하는, 각 치료 군에 대한 챌린지 이전부터 챌린지 후 제 10 일까지의 돼지들의 평균 체온을 그래프로 도시한다;
도 11 은 예방접종 비제공/챌린지 비제공 (색칠된 마름모), 예방접종 비제공/챌린지 제공 (색칠된 사각형), Rx I 백신 + 10 ㎍ 면역조절자 + 챌린지 (속빈 삼각형), Rx II 백신 + 50 ㎍ 면역조절자 + 챌린지 (가위무늬), Rx III 백신 + 챌린지 (별무늬) 를 포함하는 치료군에 대한 치명적인 PRRS 바이러스 챌린지 제공 전후 군마다 평균 체중을 그래프로 도시한다;
도 12 는 제 -39 일 내지 제 0 일 (흑색), 제 -39 일 내지 제 6 일 (회색), 및 제 -39 일 내지 제 10 일 (점무늬) 의 체중 증가를 포함하는, 제 -39 일부터 제 10 일까지의 군별 평균 체중 증가를 그래프로 도시한다;
도 13 은 제 0 일 (흑색), 제 6 일 (회색), 및 제 10 일 (점무늬) 째의 군별 챌린지 후 평균 체중을 그래프로 도시한다;
도 14 는 제 0 일부터 제 6 일까지 (흑색), 제 0 일부터 제 10 일까지 (회색), 및 제 6 일부터 제 10 일까지 (점무늬) 에 대한 챌린지 후 체중 증가를 그래프로 도시한다;
도 15 는 제 0 일부터 제 6 일까지 (흑색), 제 0 일부터 제 10 일까지 (회색), 및 제 6 일부터 제 10 일까지 (점무늬) 에 대한 챌린지 후 체중 증가 백분율을 그래프로 도시한다.
도 16 은 챌린비 비제공 (색칠된 사각형), 챌린지 제공 (속빈 마름모), Rx 1 백신 + 10 ㎍ 면역조절자 + 챌린지 (색칠 및 속빈 사각형), Rx 2 백신 + 50 ㎍ 면역조절자 + 챌린지 (속빈 사각형), 및 Rx 3 (색칠 및 속빈 마름모) 를 포함하는 군별 폐 중량을 그래프로 도시한다;
도 17 은 예방접종 비제공/챌린지 비제공, 예방접종 비제공/챌린지 제공, Rx I 백신 + 10 ㎍ 면역조절자 제공/챌린지 제공, Rx II 백신 + 50 ㎍ 면역조절자 제공/챌린지 제공, 및 Rx III 예방접종 제공/챌린지 제공을 포함하는 군마다의 체중 백분율로서의 폐 중량을 그래프로 도시한다;
도 18 은 챌린지 비제공 (속빈 원), 예방접종 비제공/챌린지 제공 (색칠된 사각형), Rx I 백신 + 10 ㎍ 면역조절자 제공/챌린지 제공 (색칠된 삼각형), Rx II 백신 + 50 ㎍ 면역조절자 제공/챌린지 제공 (색칠된 원), 및 Rx III 예방접종 제공/챌린지 제공 (색칠된 마름모) 을 포함하는 치료군으로부터 단리된 PRRS 바이러스를 그래프로 도시한다;
도 19 는 군마다 단리된 폐 바이러스 역가를 그래프로 도시한다;
도 20 은 폐포 격벽 비대 및 비대화의 분포를 기준으로 하는 대조군, 챌린지, Rx I 백신 + 10 ㎍ 면역조절자 제공/챌린지 제공, Rx II 백신 + 50 ㎍ 면역조절자 제공/챌린지 제공, 및 Rx III 예방접종 제공/챌린지 제공을 포함하는 치료군에 대한 폐 병리학 스코어를 그래프로 도시한다;
도 21 은 예방접종 비제공/챌린지 비제공, 예방접종 비제공/챌린지 제공, Rx I 백신 + 10 ㎍ 면역조절자 제공/챌린지 제공, Rx II 백신 + 50 ㎍ 면역조절자 제공/챌린지 제공, 및 Rx III 예방접종 제공/챌린지 제공을 포함하는 각 치료군에서의 개별 동물들의 인터페론 역가를 그래프로 도시한다;
도 22 는 현미경으로 병소를 평가하기 위해 조직 시료가 취해진 폐의 영역들을 도시한다;
도 23 은 위약 치료 돼지에 대한 치료군에서의 PRRSV 의 바이러스 폐 하중을 그래프로 도시한다;
도 24 는 대조군 및 각각의 면역조절자 치료군 사이의 각 동물에서의 총합 전체 엽 스코어 (lobe score) 로 나타내는 전체 폐 병리를 보여준다 (제 -1 일, 제 0 일, 및 제 2 일);
도 25 는 대조군 및 각각의 면역조절자 치료군 (제 -1 일, 제 0 일, 및 제 2 일) 에 대한 IFN-α 혈청 수준을 보여준다;
도 26 은 위약, 25 ㎍ 면역조절자, 50 ㎍ 면역조절자, 75 ㎍ 면역조절자, 및 음성 대조군을 포함하는 치료군에 대한 제 -2 일, 제 4 일, 제 7 일, 제 10 일 및 제 14 일에서의 혈청 바이러스혈증 평균을 그래프로 도시한다;
도 27 은 위약, 25 ㎍ 면역조절자, 50 ㎍ 면역조절자, 75 ㎍ 면역조절자 및 음성 대조군을 포함하는 치료군들 사이의 평균 PRRSV 바이러스 폐 하중을 보여준다;
도 28 은 위약, 25 ㎍ 면역조절자, 50 ㎍ 면역조절자, 75 ㎍ 면역조절자, 및 음성 대조군을 포함하는 치료군들 사이의 현미경 수준의 폐 병소 스코어를 보여준다;
도 29 는 치료군을 통틀어 이유 돼지에서의 독소원성 대장균 (F18 선모, EAST1, STa, 및 STb 독소 및 AIDA 부착소 유전자) 과 관련된 설사 유병률을 보여준다;
도 30 은 자석 세포 분리법을 이용해 단리된 구분되는 혈구 유형을 도시한다.
도 31 은 생리학적으로 관련된 농도의 IC-Ex.1 가 CD172a+ 세포에서 IFN-α 의 발현을 자극한다는 점을 보여준다.
도 32 는 CD172a- 세포가 IC-Ex.1 또는 공지된 면역-자극제로 자극 후 IFN-α 를 생산하지 않음을 그래프로 보여준다.
도 33 는 TNFα 가 CD172a- 세포에서는 생산되지 않음을 그래프로 보여준다.
도 34A 내지 D 는 CD14+, 두가지 유형의 통상적 수상 세포, 및 형질세포형 수상 세포에서 각각 세포 배지 대조군으로 자극 후 IFN-α생산을 도시한다.
도 35 A 내지 D 는 CD14+, 두가지 유형의 통상적 수상 세포, 및 형질세포형 수상 세포에서 각각 CpG ODN 로 자극 후 IFN-α생산을 도시한다.
도 36 A 내지 D 는 CD14+, 두가지 유형의 통상적 수상 세포, 및 형질세포형 수상 세포에서 각각 IC-Ex.1 (100 ng/mL) 로 자극 후 IFN-α 생산을 도시한다.
도 37 A 내지 D 는 CD14+, 두가지 유형의 통상적 수상 세포, 및 형질세포형 수상 세포에서 각각 IC-Ex.1 (10 ng/mL) 로 자극 후 IFN-α 생산을 도시한다.
도 38 A 내지 D 는 CD14+, 두가지 유형의 통상적 수상 세포, 및 형질세포형 수상 세포에서 각각 IC-Ex.1 (100 ng/mL) 로 자극 후 IFN-α 생산을 도시한다.
도 39 A 내지 D 는 CD14+, 두가지 유형의 통상적 수상 세포, 및 형질세포형 수상 세포에서 각각 리포좀 (100 ng/mL) 으로 자극 후 IFN-α 생산을 도시한다.
도 40 A 내지 D 는 CD14+, 두가지 유형의 통상적 수상 세포, 및 형질세포형 수상 세포에서 각각 IC-Ex.1 (10 ng/mL) 로 자극 후 IFN-α 생산을 도시한다.
도 41 A 내지 D 는 CD14+, 두가지 유형의 통상적 수상 세포, 및 형질세포형 수상 세포에서 각각 리포좀 (10 ng/mL) 으로 자극 후 IFN-α 생산을 도시한다.
도 42 는 IFN-α 를 생산하는 세포의 백분율을 그래프로 도시한다.
도 43 은 IFN-α 를 생산하는 세포에 의해 생성되는 평균 형광 강도를 그래프로 보여준다.
도 44 는 상이한 면역자극제들 또는 면역자극제 농도로 자극 후 비교하는 IFN-γ 생산을 그래프로 도시한다.
도 45 는 IC-Ex.1 및 공지된 면역자극제로 자극 후 CD172a+ 세포에서의 IL-4 생산을 도시한다.
도 46 은 IC-Ex.1 및 공지된 면역자극제로 자극 후 CD172a+ 세포에서의 IL-1β 생산을 도시한다.
도 47 은 IC-Ex.1 및 공지된 면역자극제로 자극 후 CD172a+ 세포에서의 IL-6 생산을 도시한다.
도 48 은 IC-Ex.1 및 공지된 면역자극제로 자극 후 CD172a+ 세포에서의 IL-8 생산을 도시한다.
도 49 는 대조군 또는 IC-Ex.1 로 치료 후 돼지 생식기호흡증후군 바이러스로 감염된 대식 세포의 백분율을 비교한다.

발명의 상세한 설명

본 발명에 따르면, 수용자 대상체에서 면역 응답성을 유도할 수 있는 조성물 뿐 아니라 사용 방법이 발견되었다. 특별하게는, 본 발명은 핵산 조성물, 또는 면역조절자 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다. 그러한 면역조절자 조성물은 돼지 종들의 구성원들의 면역계를 변화시키기 위해 이용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 본 발명은, 예를 들어 제한 없이, 바이러스, 박테리아, 세균, 진균, 효모, 선충류 및 당업계에 공지된 여타 미생물과 같은 미생물에 의해 유발되는 감염성 질환의 치료 및 예방에 특히 유용하다. 상기 조성물 및 상기 면역조절자 조성물을 사용하는 방법은 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.

I. 조성물

본 발명에서 유용한 조성물, 예컨대 본원에 기재된 것은 일반적으로 전염병의 예방 요법, 집단예방 요법, 또는 치료 요법으로서 이용될 수 있다. 이러한 조성물은 본원에서 면역조절자 조성물로 지칭된다. 면역조절자 조성물은 수용자 대상체에 면역 응답성을 유발할 수 있는, 하나 이상의 면역자극성 플라스미드 또는 면역자극성 DNA 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 면역 응답은 선천적 면역 응답이다. 일부 측면에서, 면역 응답은 선천적 면역 응답 및 후천적 면역 응답의 조합이다. 일부 측면에서, 면역조절자 조성물은 또한 리포좀 전달 비히클을 포함할 수도 있다.

A. 핵산

일부 측면에서, 본 발명은 전염병 유발물의 치료 또는 예방에 유용한 핵산 분자에 관한 것이다. 본원에 기재된 핵산 분자는 면역자극성 플라스미드 내에 선형의 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA, 아미노산 서열, 리보핵산 (RNA) 또는 그 조합물로서 포함될 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명은 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포 (시험관 내, 생체 내, 또는 생체 외) 에 관한 것으로서, 이는 면역자극성 플라스미드 또는 면역자극성 DNA 서열을 함유한다.

본원에 기재된 핵산 분자는 CpG 모티프에 있어 매우 풍부화되어 있다. 일부 측면에서, 핵산 분자가 척추동물 핵산 서열에서 발견되는 CpG 모티프의 빈도보다 20% 를 초과하는 CpG 모티프를 포함한다. 그러한 CpG 모티프는 면역 자극성 및 비-자극성 CpG 모티프를 포함한다.

일부 측면에서, 본 발명은 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는, 면역자극성 플라스미드 또는 DNA 서열에 관한 것이다. 플라스미드는 임의의 선택가능 또는 선별가능 마커 유전자가 없을 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 pGCMB75.6 플라스미드는 임의의 전장 또는 작용적 선택가능 또는 선별가능 마커 유전자를 포함하지 않는다. pGCMB75.6 의 서열을 SEQ ID NO: 1 에 제시한다.

일부 측면에서, 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드는 전장 또는 작용적 선택가능 또는 선별가능 마커를 코딩하는 핵산 서열을 바람직하게도 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 면역자극성 플라스미드는 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는다. 예를 들어, 플라스미드는 카나마이신 내성 유전자를 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 플라스미드는 바람직하게 면역원을 인코딩하지 않는다.

일부 측면에서, 면역자극성 플라스미드는 항생제 내성 유전자가 아닌 선택가능 또는 선별가능 마커 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 pLacZMB75.6 플라스미드는 선별가능 마커로서 LacZ 유전자를 포함한다. pLacZMB75.6 의 맵은 도 3 에 제공하고, pLacZMB75.6 의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4 로서 제공한다. 도 3 에 나타내는 바와 같이, pLacZMB75.6 은 pGCMB75.6 과 유사하나, LacZ 선별가능 마커를 함유한다.

pMB75.6, pGCMB75.6 또는 pLacZMB75.6 플라스미드의 뉴클레오티드 서열은 유의미하게 그의 면역자극성 특성에 유의하게 악영향을 끼치지 않으면서 어느 정도까지 변형될 수 있다는 점이 이해될 것이다. 일부 측면에서, 본 발명은 pGCMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 1) 과 89% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게 pGCMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 1) 과 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게 pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 1) 의 서열을 포함한다.

일부 측면에서, 본 발명은 pLacZMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 4) 과 84% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게 pLacZMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 4) 과 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게 pLacZMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 4) 을 포함한다.

일부 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2 의 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 의 서열과 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 의 서열을 포함한다.

일부 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 3 의 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 서열과 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 서열을 포함한다.

일부 측면에서, 본 발명은 pGCMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 1) 과 89% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게 pGCMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 1) 과 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다. 일부 측면에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게 pGCMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 1) 로 이루어진다.

일부 측면에서, 본 발명은 pLacZMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 4) 과 84% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게 pLacZMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 4) 과 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다. 일부 측면에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게 pLacZMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 4) 로 이루어진다.

일부 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2 의 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 의 서열과 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다. 일부 측면에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 의 서열로 이루어진다.

일부 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 3 의 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 서열과 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다. 일부 측면에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 서열로 이루어진다.

본 발명의 또다른 중요한 측면은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 또는 SEQ ID NO: 4 에 대해 매우 엄격한 조건 하에 하이브리다이즈하는 핵산 서열을 포함하는 면역 응답을 자극할 수 있는 면역자극성 DNA 서열 또는 면역자극성 플라스미드를 제공한다. 적합한 핵산 서열에는, 본 발명의 핵산과 상동이거나, 실질적으로 유사하거나 또는 동일한 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상동 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 각 상보적 서열에 대해 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 100% 의 서열 유사성을 갖는다. 다른 측면에서, 상동 핵산 서열은 SEQ ID NO: 4 또는 각 상보적 서열에 대해 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 100% 의 서열 유사성을 갖는다. 다른 측면에서, 상동 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2 또는 각 상보적 서열에 대해 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 100% 의 서열 유사성을 갖는다. 다른 측면에서, 상동 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3 또는 각 상보적 서열에 대해 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 100% 의 서열 유사성을 갖는다. 서열 유사성은 문헌 [Altschul, S. F., 등, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990] 에 기재된, BLAST 와 같은 당업계에 공지된 수많은 알고리즘을 이용해 산출될 수 있다. 핵산은 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 상기 기재된 핵산과 서열에 있어서 상이할 수 있다. 일반적으로, 기준 서열은 18 개의 뉴클레오티드, 더욱 일반적으로는 30 개 이상의 뉴클레오티드로 존재할 것이며, 비교 목적으로 조성물의 전체 핵산 서열을 포함할 수 있다.

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열이 본원에 고려된다. 엄격한 하이브리드화 조건은 50℃ 이상 및 0.1X SSC (15 mM 염화나트륨/1.5 mM 나트륨 시트레이트) 에서의 하이브리드화와 같은 조건을 포함한다. 또 다른 예는 42℃ 에서, 50% 포름아미드, 5X SSC (150 mM NaCl, 15 mM 트리나트륨 시트레이트), 50 mM 나트륨 포스페이트 (pH 7.6), 5X Denhardt 용액, 10% 덱스트란 술페이트, 및 20 ㎍/ml 변성, 전단된 연어 정자 DNA 의 용액 중 하룻밤 인큐베이션 후, 약 65℃ 에서 0.1X SSC 중 세정이다. 예의 엄격한 하이브리드화 조건은, 상기 특이적 조건 만큼 적어도 약 80%, 85%, 90%, 또는 95% 정도 엄격한 하이브리드화 조건이다. 기타 엄격한 하이브리드화 조건은 당업계에 공지되어 있고 또한 본 발명의 핵산의 상동체 동정에 이용될 수 있다 (Current Protocols in Molecular Biology, Unit 6, pub. John Wiley & Sons, N.Y. 1989).

본원에 기재된 DNA 분자의 돌연변이 뉴클레오티드는, 돌연변이가 본원에 기재된 바와 같은 면역 응답성을 자극할 능력을 유지하는 핵산 서열을 포함하는 한, 이용될 수 있다. 이러한 돌연변이의 DNA 서열은 통상 하나 이상의 뉴클레오티드가 상이할 것이다. 서열 변경은 치환, 삽입, 결실 또는 그의 조합일 수 있다. 클로닝된 유전자의 돌연변이유발 기술은 당업계에 공지되어 있다. 부위 특이적 돌연변이유발 방법은 문헌 [Gustin 등, Biotechniques 14:22, 1993; Barany, Gene 37:111-23, 1985; Colicelli 등, Mol. Gen. Genet. 199:537-9, 1985; 및 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp. 15.3-15.108] 에서 찾을 수 있으며 모두 본원에 참고문헌으로 포함되어 있다. 요약하면, 본 발명은 대상체에서 면역 응답성을 자극할 수 있는 핵산 서열 및 그의 변이체 또는 돌연변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 기재된 핵산 서열에 의해 인코딩된 중재 RNA 뿐 아니라 임의의 본원에 기재된 핵산에 의해 인코딩된 그에 따른 아미노산 서열을 포함한다.

일부 측면에서, 면역자극성 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOs. 1, 2, 3 및 4 에 제공된 서열과 다른 경우, 플라스미드 내 CpG 디뉴클레오티드가 온전히 잔존되는 것이 바람직하다. 대안적으로, 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 CpG 디뉴클레오티드가 제거되도록 변경되면, 플라스미드의 서열은 플라스미드 내 CpG 디뉴클레오티드의 총 개수가 동일하게 남도록 또 다른 위치에서 변경될 수 있다. pGCMB75.6 또는 pLacZMB75.6 의 뉴클레오티드 서열에 이미 존재하는 것에 부가적으로 추가의 CpG 디뉴클레오티드가 또한 플라스미드에 도입될 수 있다. 따라서, 예를 들어 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드는 바람직하게 약 200 개 이상, 약 220 개 이상, 약 240 개 이상, 약 260 개 이상, 약 270 개 이상, 약 275 개 이상, 약 280 개 이상, 약 283 개 이상, 약 285 개 이상, 또는 약 288 개 이상의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어 면역자극성 플라스미드는 283 개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

일부 측면에서, 면역자극성 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 본원에 제공되는 서열에서 벗어날 경우, 플라스미드 중의 CpG 모티프 타입은 결과로 제공되는 세포질 DNA 감시 분자 (surveillance molecules) 의 활성화를 조절하기 위해 변경된다. 예를 들어, 면역 자극성 CpG 모티프의 갯수는 면역자극성 플라스미드/DNA 의 특이적 역가에 응답하는 특이적 세포질 DNA 감시 분자의 활성화를 증가시키기 위해 증가시킬 수 있다. 추가 예시로서, 비-면역 자극성 CpG 모티프의 갯수는 특이적 세포질 DNA 감시 분자의 활성화 감소 및/또는 타 DNA 감시 분자의 활성화 증가를 위해 증가될 수 있다.

특별하게는, 본 발명은 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드 또는 DNA 서열 중 임의의 것 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약제학적 제형물에 관한 것이다.

B. 면역조절자

본원에 기재된 면역자극성 플라스미드를 사용하기에 적합한 면역조절자 조성물은, 그 전문 내용이 참조로 본원에 인용되는 U.S. 특허 출원 공보 제 2012/0064151 호 A1 및 제 2013/0295167 호 A1 에 기재되어 있다.

면역조절자 조성물은 리포좀 전달 비히클, 및 본원에 기재된, 면역자극성 플라스미드 또는 DNA 서열 중 하나 이상을 포함한다.

적합한 리포좀 전달 비히클은 치료된 대상체의 조직에 핵산 분자를 전달할 수 있는 지질 조성물을 포함한다. 리포좀 전달 비히클은 바람직하게 충분한 시간 동안 대상체에서 안정적으로 잔존할 수 있어 핵산 분자 및/또는 생물작용제를 전달할 수 있다. 예를 들어, 리포좀 전달 비히클은 약 5 분 이상, 약 1 시간 이상 또는 약 24 시간 이상 동안 수용자 대상체에서 안정적이다.

본 발명의 리포좀 전달 비히클은 세포의 형질막과 융합해 세포 내로 핵산 분자를 전달할 수 있는 지질 조성물을 포함한다. 핵산 분자가 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 경우, 핵산:리포좀 복합체는 바람직하게 전달된 핵산 마이크로그램 (㎍) 당 전체 조직 단백질 밀리그램 (mg) 당 발현된 단백질 약 1 피코그램 (pg) 이상의 트랜스펙션 효율을 가진다. 예를 들어, 핵산:리포좀 복합체의 트랜스펙션 효율은 전달된 핵산 ㎍ 당 전체 조직 단백질 mg 당 발현된 약 10 pg 이상의 단백질; 또는 전달된 핵산 ㎍ 당 전체 조직 단백질 mg 당 발현된 약 50 pg 이상의 단백질일 수 있다. 복합체의 트랜스펙션 효율은 전달된 핵산 ㎍ 당 전체 조직 단백질 mg 당 발현된 단백질 1 펨토그램 (fg) 만큼 낮을 수 있으며, 이때 상기 양은 보다 바람직하다.

본 발명의 바람직한 리포좀 전달 비히클은 직경 약 100 내지 500 나노미터 (nm) 이다. 예를 들어, 리포좀 전달 비히클은 직경 약 150 내지 450 nm, 또는 약 200 내지 400 nm 일 수 있다.

적합한 리포좀은 임의의 리포좀, 예컨대 예를 들어 당업자에게 공지된 유전자 전달 방법에서 통상 사용되는 것을 포함한다. 바람직한 리포좀 전달 비히클은 다층 소포 (multilamellar vesicle; MLV) 지질 및 압출 지질을 포함한다. MLV 의 제조 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 더욱 바람직한 리포좀 전달 비히클은 다중양이온성 지질 조성을 갖는 리포좀 (즉, 양이온성 리포좀) 및/또는 폴리에틸렌 글리콜에 컨쥬게이션된 콜레스테롤 백본을 갖는 리포좀을 포함한다. 예의 양이온성 리포좀 조성물은 제한 없이 하기를 포함한다: N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 콜레스테롤, N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP) 및 콜레스테롤, 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-히드록시에틸)-이미다졸리늄 클로라이드 (DOTIM) 및 콜레스테롤, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 콜레스테롤, 및 그 조합물. 전달 비히클로서 사용하기 위한 가장 바람직한 리포좀 조성물은 DOTIM 및 콜레스테롤을 포함한다.

적합한 핵산 분자는 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드 중 임의의 것을 포함한다. 코딩 핵산 서열은 적어도 단백질 또는 펩티드의 일부를 인코딩하나, 비(非)코딩 서열은 단백질 또는 펩티드의 임의의 일부를 인코딩하지 않는다. 본 발명에 따르면, "비코딩" 핵산은 전사 단위의 조절 영역, 예컨대 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 용어 "빈 (empty) 벡터" 는 용어 "비코딩" 과 상호교환적으로 사용될 수 있고, 특히 유전자 삽입 없는 플라스미드 벡터와 같이 단백질 코딩 부분의 부재 하 핵산 서열을 지칭한다. 본원에 기재된 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현은 면역 응답성의 유발에 요구되지 않는다; 그러므로, 플라스미드는 전사 제어 서열에 작동적으로 연결된 임의의 코딩 서열을 포함할 필요는 없다. 그러나, 추가적인 장점이 면역원 및/또는 싸이토카인을 인코딩하는 핵산 서열 (DNA 또는 RNA) 을 조성물에 포함시킴으로써 수득될 수 있다 (즉, 항원-특이적 및 증강된 면역성). 면역원 및/또는 싸이토카인을 인코딩하는 이러한 핵산 서열은 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드에 포함될 수 있거나, 또는 조성물 내 별도의 핵산에 (예, 별도의 플라스미드) 포함될 수 있다.

본원에 기재된 면역자극성 플라스미드 또는 면역자극성 DNA 서열로 리포좀을 복합화하는 것 (complexing) 은 당업계의 표준 방법을 이용하거나 또는 U.S. 특허 제 6,693,086 호 (본원에 이들의 내용은 참조로서 그 전문이 통합되어 있음) 에 기재된 대로 달성될 수 있다. 리포좀에 부가되는 플라스미드의 적당한 농도는 전신 면역 응답이 유발되도록 대상체에 충분량의 플라스미드를 전달하기에 유효한 농도를 포함한다. 예를 들어, 약 0.1 ㎍ 내지 약 10 ㎍ 의 플라스미드가 약 8 nmol 리포좀과 조합될 수 있거나, 약 0.5 ㎍ 내지 약 5 ㎍ 의 플라스미드가 약 8 nmol 리포좀과 조합될 수 있거나, 또는 약 1.0 ㎍ 의 플라스미드가 약 8 nmol 리포좀과 조합될 수 있다. 조성물 내 플라스미드 대 지질 비 (㎍ 플라스미드:nmol 지질) 는 중량에 대해 적어도 약 1:1 플라스미드:지질일 수 있다 (예, 1 ㎍ 플라스미드:1 nmol 지질). 예를 들어, 플라스미드 대 지질의 비는 적어도 약 1:5, 적어도 약 1:10, 또는 적어도 약 1:20 일 수 있다. 본원에서 표시된 비는 조성물 내 양이온성 지질의 양을 기반으로 하고, 조성물 내 지질의 총량을 기반으로 하지 않는다. 본 발명의 조성물 내 플라스미드 대 지질의 비는 적합하게 약 1:1 내지 약 1:80 플라스미드:지질 (중량 기준); 약 1:2 내지 약 1:40 플라스미드:지질 (중량 기준); 약 1:3 내지 약 1:30 플라스미드: 지질 (중량 기준); 또는 약 1:6 내지 약 1:15 플라스미드:지질 (중량 기준) 이다.

C. 생물작용제

본원에 기재된 면역조절자 조성물 중 임의의 것은 본원에 기재된 플라스미드 중 하나 이상 및 리포좀 전달 비히클에 부가적으로 하나 이상의 생물작용제를 추가로 포함할 수 있다.

적합한 생물작용제는 질병의 예방 또는 치료에 유효한 작용제이다. 이러한 생물작용제는 면역 증강자 단백질, 면역원, 백신, 항균제 또는 이의 임의 조합물을 포함한다. 적합한 면역 증강자 단백질은 면역성을 증강시키는 것으로 공지된 단백질이다. 비제한적인 예로, 싸이토카인 (단백질 패밀리 포함) 이 공지된 면역성 증강 단백질 패밀리이다. 적합한 면역원은 체액 및/또는 세포성 면역 응답성을 유발하는 단백질로, 이 면역원을 대상체에 투여하면 대상체의 조직 내 맞닥뜨리는 동일 또는 유사 단백질에 대항하는 면역원-특이적 면역 응답성이 증가된다. 면역원은 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균에 의해 발현된 병원성 항원을 포함할 수 있다. 바람직한 항원은 대상체에 전염병을 야기하는 유기체로부터 유래된 항원을 포함한다. 본 발명에 따르면, 면역원은 체액 및/또는 세포 면역 응답성을 유발하는 천연 발생 또는 합성적으로 유래된 임의의 단백질 일부일 수 있다. 이와 같이, 항원 또는 면역원의 크기는 그 사이의 임의의 크기를 비롯해, 전장 단백질과 같이 크고 약 5-12 아미노산과 같이 작을 수 있다. 항원은 멀티머 단백질 또는 융합 단백질일 수 있다. 항원은 정제된 항원일 수 있다. 대안적으로, 면역 증강자 단백질 또는 면역원은 면역자극성 플라스미드 또는 면역조절자 조성물에 포함된 또 다른 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 면역 증강자 단백질 또는 면역원이 면역조절자 조성물 내 핵산 분자에 의해 인코딩되는 경우, 면역 증강자 단백질 또는 면역원을 인코딩하는 핵산 서열은, 면역원이 대상체의 조직 내에서 발현되어 대상체에게 비특이적 면역 응답성에 더해 면역원-특이적 면역 응답성을 유발하도록 전사 제어 서열에 작동적으로 연결된다. 면역원성에 대한 선별 기술, 예컨대 병원체 항원 면역원성 또는 싸이토카인 활성은 당업자에게 공지되어 있으며, 이는 각종 시험관 내 및 생체 내 어세이를 포함한다.

생물작용제가 백신인 경우, 백신은 살아 있는, 감염성, 바이러스, 박테리아 또는 기생충 백신, 또는 사멸된, 비활성화, 바이러스, 박테리아 또는 기생충 백신을 포함할 수 있다. 하나 이상의 백신, 살아있거나 사멸된 바이러스 백신이 본 발명의 면역조절자 조성물과 조합되어 사용될 수 있다. 적합한 백신은 돼지 종에 대해 당업계에 공지된 것을 포함한다.

생물작용제는 항균제일 수 있다. 적합한 항균제에는 하기가 포함된다: 퀴놀론, 바람직하게 플루오로퀴놀론, β-락탐, 및 마크로라이드-린코사마이드-스트렙토그라민 (MLS) 항생제.

적합한 퀴놀론에는 베노플록사신 (benofloxacin), 빈플록사신 (binfloxacin), 시녹사신 (cinoxacin), 시프로플록사신 (ciprofloxacin), 클리나플록사신 (clinafloxacin), 다노플록사신 (danofloxacin), 디플록사신 (difloxacin), 에녹사신 (enoxacin), 엔로플록사신 (enrofloxacin), 플레록사신 (fleroxacin), 게미플록사신 (gemifloxacin), 이바플록사신 (ibafloxacin), 레보플록사신 (levofloxacin), 로메플록사신 (lomefloxacin), 마르보플록사신 (marbofloxacin), 목시플록사신 (moxifloxacin), 노르플록사신 (norfloxacin), 오플록사신 (ofloxacin), 오르비플록사신 (orbifloxacin), 파주플록사신 (pazufloxacin), 프라도플록사신 (pradofloxacin), 퍼플록사신 (perfloxacin), 사라플록사신 (sarafloxacin), 스파르플록사신 (sparfloxacin), 테마플록사신 (temafloxacin), 및 토수플록사신 (tosufloxacin) 이 포함된다. 바람직한 플루오로퀴놀론에는 시프로플록사신, 다노플사신, 엔로플록사신, 목시플록사신, 및 프라도플록사신이 포함된다. 적합한 나프티리돈에는 날리딕스산이 포함된다.

적합한 β-락탐에는 페니실린 (예, 아목시실린, 암피실린, 아즈로실린, 벤자틴 페니실린, 벤질페니실린, 카르베니실린, 클록사실린, 코-아목시클라브 [즉 아목시실린/클라불란산], 디클록사실린, 플루클록사실린, 메티실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 페녹시메틸페니실린, 피페라실린, 프로카인 페니실린, 테모실린, 및 티카르실린); 세팔로스포린 (예, 세파클로르, 세파로늄, 세파만돌, 세파프리린, 세파졸린, 세페핌, 세픽심, 세포탁심, 세폭시틴, 세프피롬, 세프포독심, 세프퀴놈, 세프타지딤, 세프티오푸르, 세프트리아족손, 세푸록심, 세팔렉신, 세팔로틴, 및 데포테탄); 카르바페넴 및 페넴 (예, 도리페넴, 에르타페넴, 파로페넴, 이미페넴 및 메로페넴); 모노박탐 (예, 아즈트레오남, 노카르디신 A. 타브톡시닌-β-락탐 및 티게모남); 및 β-락타마아제 저해제 (예, 클라불란산, 술박탐 및 타조박탐) 이 포함된다. 바람직한 β-락탐에는 세팔로스포린, 특히 세파졸린이 포함된다.

적합한 MLS 항생제에는 클린다마이신, 린코마이신, 피르리마이신 및 임의의 마크로라이드 항생제가 포함된다. 바람직한 린코사마이드 항생제는 피르리마이신이다.

기타 항균제에는 아미노글리코시드, 클로피돌, 디메트리다졸, 에리트로마이신, 프라미세틴, 푸라졸리돈, 할로푸기논, 2-피리돈, 로베니딘, 술포나미드, 테트라사이클린, 트리메토프림, 각종 플레우로뮤틸린 (예, 티아뮬린 및 발네뮬린) 및 각종 스트렙토마이신 (예, 모넨신, 나라신 및 살리노마이신) 이 포함된다.

II. 방법

본 발명의 주제는 면역조절자 조성물, 면역자극성 플라스미드 (또는 DNA 서열), 및 면역성을 자극시키고 미감염된 대상체에 방어 면역성을, 감염된 대상체에 방어 면역성을, 미감염된 대상체에 증강된 면역성을, 감염된 대상체에 증강된 면역성을, 감염된 대상체에 치료적 면역성을 또는 이들의 조합을 제공하는 방법을 제공하는 것이다. 이와 같이, 본 발명의 조성물은 대상체를 예방적으로 면역화하는데 사용될 수 있거나, 또는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 방법은 본원에 기재된, 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열을 대상체에 투여하고, 대상체에서 면역계를 자극하는 것을 포함한다.

A. 대상체의 면역계 자극 방법

본 발명은 수용자 대상체에서 면역계를 자극 또는 강화하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 대상체에 유효량의 본원에 기재된 면역조절자 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 면역조절자 조성물은 수용자 대상체에서 면역 응답성을 자극하고, 상기 면역 응답성은 감염과 싸우는 것을 돕는다. 일부 측면에서, 면역조절자 조성물은 세포질 DNA 감시 분자들을 활성화시킨다. 일부 측면에서, 면역조절자 조성물은 백신과 같은 하나 이상의 생물작용제의 작동을, 이러한 백신에 앞서 투여시, 백신과 동시에 투여시, 예방접종 후 투여시 또는 백신과 혼합시 증강시킨다. 일부 측면에서, 이 방법은 전염병으로부터 수용자 대상체를 보호하고, 전염병이 있는 집단을 치료하기 위한 새로운 치료 전략을 제공한다. 일부 측면에서 이 방법은 면역조절자 조성물 부재 하에 백신을 이용하는 것과 비교시, 면역조절자를 백신과 병용하는 경우에 질병에 대항해 보다 빠르고, 오래 양호하게 보호한다.

면역 응답성은 본원에 기재된 임의의 리포좀 전달 비히클, 본원에 기재된 임의의 면역자극성 플라스미드 (또는 DNA 서열) 를 임의로는 본원에 기재된 임의의 생물작용제와 조합하여 면역조절자 조성물을 유효량으로 투여함으로써 수용자 대상체에서 활성화될 수 있다. 본원에 사용된, "조합하여" 는 생물작용제가 면역조절자와 혼합되거나 또는 그와 함께 투여되거나 또는 그와 독립적으로 투여될 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다. 그러한 독립적인 투여는 면역조절자 투여 이전 또는 이후일 수 있다. 또한, 1 회 초과의 면역조절자 또는 생물작용제 투여를 포함할 수 있는 조합 투여가 이용될 수 있다는 점도 또한 고려된다. 나아가, 하나 초과의 생물작용제는 면역조절자와 함께 투여될 수 있거나, 면역조절자에 앞서 투여될 수 있거나, 면역조절자 투여 이후에 투여될 수 있거나, 또는 면역조절자와 동시에 투여될 수 있다.

B. 대상체의 생존능 개선 방법

본 발명은 돼지 종들의 구성원의 생존능 개선 방법에 관한 것이다. 생존능 개선 방법은 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 면역조절자 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 면역조절자 조성물을 제공받지 않은 대상체에 비해 개선된 수용자 대상체의 생존능을 제공한다.

C. 생산 개선 방법

본 발명은 돼지 종들의 구성원의 생산 개선 방법에 관한 것이다. 생산 개선 방법은 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 면역조절자 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 면역조절자 조성물을 제공받지 않은 대상체에 비해 개선된 수요자 대상체의 생산을 제공한다. 생산 개선의 평가 방법은 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 생산 개선이 면역조절자 조성물을 제공받은 대상체와 면역조절자 조성물을 제공받지 않은 대상체 사이에서 건강상태, 체중, 크기, 육질 및 여타 파라미터를 비교하여 측정될 수 있음을 인식할 것이다.

유효량의 본원에 기재된 임의의 면역조절자 조성물이 대상체에 투여될 수 있다. 유효량은 수용자 대상체에서 면역 응답성의 활성화에 충분한 것이다. 그러한 활성화 측정 방법은 당업계에 공지되어 있다. 또한, 당업자는 유효량이 연령, 체중, 대상체의 종 및 감염 단계 뿐 아니라 당업계에 공지된 여타 요인들에 좌우될 것임을 알 것이다. 적합한 유효량은 대상체 당 약 0.1 ㎍ 내지 1,000 ㎍ 의 범위일 수 있다. 일부 측면에서, 유효량은 약 0.1 ㎍ 내지 약 10 ㎍, 약 0.1 ㎍ 내지 약 5 ㎍, 약 0.5 ㎍ 내지 약 5 ㎍, 약 0.25 ㎍ 내지 약 5 ㎍, 약 0.05 ㎍ 내지 약 10 ㎍, 약 5 ㎍ 내지 약 15 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 15 ㎍, 약 10㎍ 내지 약 20 ㎍, 약 20 ㎍ 내지 약 30 ㎍, 약 30 ㎍ 내지 약 40 ㎍, 약 40 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 70 ㎍, 약 70 ㎍ 내지 약 90 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 150 ㎍, 약 150 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 200 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 약 250 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 300 ㎍ 내지 약 350 ㎍, 약 350 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 400 ㎍ 내지 약 450 ㎍, 약 450 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 500 ㎍ 내지 약 550 ㎍, 약 550 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 600 ㎍ 내지 약 650 ㎍, 약 650 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 700 ㎍ 내지 약 750 ㎍, 약 750 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 800 ㎍ 내지 약 850 ㎍, 약 850 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 900 ㎍ 내지 약 950 ㎍, 약 950 ㎍ 내지 약 1000 ㎍ 의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 일부 측면에서, 유효량이 약 0.5 ㎍ 내지 약 10 ㎍ 의 범위일 수 있다. 더욱이, 다른 측면에서 바람직하게는 유효량이 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍ 의 범위이다. 또한, 다른 측면에서 바람직하게는 유효량이 약 40 ㎍ 내지 약 70 ㎍ 의 범위이다.

D. 사용 조건

본 발명의 방법은 면역 응답성을 쉽게 유발시키는 질병으로부터 대상체를 보호하도록 대상체에서 면역 응답성을 활성화시킨다. 본원에서 이용되는 바와 같이, 문구 "질병으로부터 보호"란, 질병의 증상을 감소시키는 것; 질병 발병을 감소시키는 것; 질병의 임상적 또는 병적 중증도를 감소시키는 것; 또는 질병을 야기하는 병원체의 발산 (shedding) 을 감소시키는 것을 지칭한다. 대상체를 보호하는 것은 본 발명의 치료적 조성물이 대상체에 투여시, 질병의 발병을 막고, 질병 증상, 임상적 징후, 병리 또는 유발원을 치유 및/또는 완화 또는 감소시키는 이의 능력을 지칭할 수 있다. 이와 같이, 대상체를 질병으로부터 보호하는 것은, 질병 발병을 예방하고 (예방적 치료) 질병이 있는 대상체를 치료하는 것 (치료적 치료) 모두를 포함한다. 용어 "질병"은 정상적인 건강 상태에서 벗어난 대상체의 임의의 건강 상태를 지칭하며, 질병 증상이 존재하는 상태뿐 아니라 이탈 (예, 감염, 유전자 돌연변이, 유전적 결점, 등) 이 발생되었으나 증상이 아직 드러나지 않은 병태도 포함한다.

본 발명의 방법은 질병 방지, 질병에 대항하는 효과기 세포 면역성의 자극, 질병 제거, 질병 완화 및 1 차 질병의 발병으로부터 야기된 2 차 질병의 방지에 사용될 수 있다.

일부 측면에서, 본원에 기재된 방법은 백신이 공동 투여될 때 대 백신이 단독 투여될 때 대상체의 선천적 면역 응답성의 개선에 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 방법은 백신만을 투여하는 것에 비해 백신과 함께 공동투여되는 경우 대상체의 후천적 면역 응답성을 개선시키기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, 백신이 일단 투여되면 후천적 면역성 자극에 시간이 소요되므로 대상체를 즉시 보호하지는 않는다. 용어 "개선"이란, 본 발명에서, 백신이 백신에 의해 주어진 획득 면역성을 통해 대상체를 보호하고/하거나 보호 기간을 연장하기 시작할 때까지 대상체에서 선천적 면역 응답성을 유발하는 것을 지칭한다.

일부 측면에서, 본 발명의 방법은 각종 병원체의 감염에 대항해 보호하도록 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 투여된 조성물은 특정 응답성을 유발하도록 특이적 항원을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 발명의 방법은 비제한적으로 바이러스, 박테리아, 진균, 및 기생충을 비롯한 감염성 미생물 물질로부터 야기된 질병으로부터 수용자 대상체를 보호할 것으로 고려된다. 일부 양상에서, 본 발명의 방법은 감염원으로 인한 감염의 중증도 및 증상을 경감 또는 감소시키기 위해 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 당업자는 본원에 기재된 바와 같은 면역조절자 조성물이 열거하기에 너무 많은 수많은 감염원에 대항해 효과적이라고 인지 및 이해할 것이다. 본원에서 제공된 감염원은 예의 목적을 위해 제공되고 사용 범위의 제한 없이 제공된다.

본원에 기재된 면역조절자 조성물이 유용할 예시 병태에는 대상체에서 감염원에 의해 유발되는 것들이 포함된다. 그러한 병태에는, 제한 없이, 유방선균증 (Actinobacillosis), 아프리카 돼지 열병, 탄저병, 위축성 비염, 오제스키병 (Aujeszky's disease), 보툴리눔 중독증, 브루셀라병, 괴저성 비염, 돼지 콜레라 열병, 클로스트리듐세균 장독혈증 (clostridial enterotoxaemia), 대장균감염증, 젖먹이 돼지의 감염성 농피증, 뇌척수 심근염, 엔테로바이러스 감염증, 돼지 삼출성 표피염, 구제역, 부제증, 돼지 글래서 병, 그리스 돼지병, 돼지 콜레라, 봉입체성 비염, 장선종증, 감염성 관절염, 렙토스피라증, 선회병 (패혈증/내장), 간 병변, 유선염-자궁근층염-무유증 증후군 (mastitis-metritis-agalactia syndrome), 악성 부종, 마이코플라즈마 폐렴, 마이코플라즈마 다발성 관절염, 마이코플라즈마 다발성장막염, 돼지의 괴사성 귀 증후군, 괴저성 비염, 괴사성 위염, 부종증, 골수염, 외이도염, 파보바이러스 감염증, 파스투렐라병, 장미색 비강진, 늑막폐렴, 다발관절염, 돼지 유행성 설사병, 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PPRS), 증식성 출혈 장염, 가성결핵증, 신우신염, 광견병, 백선증, 로타바이러스 감염증, 살모넬라증, 연쇄상구균성 수막염, 연쇄상구균성 수막염 및 관절염, 돼지 적리, 돼지 단독, 돼지 콜레라, 돼지 인플루엔자, 돈두, 돼지 수포병, 탈판 (talfan), 테센병 (teschen), 파상풍, 감염성 위장염, 수포성 질병, 돼지의 수포성 발진, 수포성 구내염, 구토 및 소모성 질환, 백반신, 및 당업계에 공지된 여타 병태들이 포함된다.

본원에 기재된 면역조절자 조성물이 치료 또는 예방에 유용할 예시 감염원에는 대상체의 선천적 면역 응답성에 의해 영향을 받는 감염원들이 포함된다. 그러한 감염원에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 악티노바실러스 속 (Actinobacillus sp.), 악티노바실러스 플레로뉴모니애 (Actinobacillus pleuropneumoniae), 악티노바실러스 수이스 (Actinobacillus suis), 악티노마이세스 피오게네스 (Actinomyces pyogenes), 알파헤르페르스비리내 (Alphaherpersvirinae), 아프토바이러스 (Aphthovirus), 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 베타헤르페스비리내 (Betaherpesvirinae), 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica), 브루셀라 아보르투스 (Brucella abortus), 브루셀라 수이스 (Brucella suis), 칼리시비루스 (Calicivirus), 캄필로박터 속 (Campylobacter sp.), 캄필로박터 효인테스티날리스 (Campylobacter hyointestinalis), 캄필로박터 뮤코살리스 (Campylobacter mucosalis), 카르디오바이러스 (Cardiovirus), 클로스트리디알 페르프린겐스 (Clostridial perfringens), 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 클로스트리디움 셉티쿰 (Clostridium septicum), 클로스트리디움 테타니 (Clostridium tetani), 코로나바이러스 (Coronavirus), 싸이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus), 엔테로바이러스 (Enterovirus), 에리시펠로트릭스 루시오파티애 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 대장균 (Escherichia coli), 유박테리움 수이스 (Eubacterium suis), 에리시펠로트릭스 루시오파티애 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 플라비비리대 (Flaviviridae), 푸소박테리움 네크로포룸 (Fusobacterium necrophorum), 돼지혈구응집성 뇌척수염바이러스 (Haemagglutinating encephalomyelitis virus), 해모필러스 파라수이스 (Haemophilus parasuis), 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans), 렐리스타드 바이러스 (Lelystad virus), 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 리사비루스 (Lyssavirus), 미크로스포룸 나눔 (Microsporum nanum), 미코플라스마 속 (Mycoplasma sp.), 미코플라스마 효프뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae), 미코플라스마 효리니스 (Mycoplasma hyorhinis), 미코플라스마 효시노비애 (Mycoplasma hyosynoviae), 파스퇴렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida), 페스티바이러스 (Pestivirus), 피코르나비리대 (Picornaviridae), 돼지 아테리바이러스 (arterivirus), 돼지 써코바이러스 (circovirus) (PCV), 돼지 엔테로바이러스 (enterovirus), 돼지 유행성 설사병 바이러스 (Procine epidemic diarrhea virus) (PEDv), 돼지 헤르페스바이러스 1, 돼지 헤르페스바이러스 2, 돼지 파르보바이러스 (parvovirus), 페스티바이러스 (Pestivirus), 랍도비리대 (Rhabdoviridae), 로타바이러스 (Rotavirus), 살모넬라 속 (Salmonella sp.), 살모넬라 콜레라에수이스 (Salmonella choleraesuis), 세르풀리나 효디센테리애 (Serpulina hyodysenteriae), 스피로캐테스 (Spirochaetes), 스타필로코시 (Staphylococci), 스타필로코커스 히쿠스 (Staphylococcus hyicus), 스트렙토코시 (Streptococci), 스트렙코코커스 수이스 (Streptococcus suis), 수이폭스바이러스 (Suipoxvirus), 돼지 인플루엔자바이러스 (Swine influenzavirus), 토가비리대 (Togaviridae), 미분류 DNA 바이러스, 베시쿨로바이러스 (Vesiculovirus), 예르시니아 슈도튜베르쿨로시스 (Yersinia pseudotuberculosis), 및 당업계에 공지된 여타의 것이 포함된다.

본원에 기재된 면역조절자 조성물은 감염원에 의해 유발되는 장 병태의 치료 또는 예방에 특히 유용할 수 있다. 그러한 병태에는 대상체의 소화관/장 시스템에 영향을 주는 장의 병태가 포함된다. 그러한 장의 병태에는, 이에 제한되지 않으나, 아프리카 돼지 열병, 돼지 콜레라 열병, 클로스트리듐세균 장독혈증, 대장균감염증, 구제역, 돼지 콜레라, 장 선종증, 괴사성 위염, 부종증, 돼지 유행성 설사병, 증식성 출혈 장염, 로타바이러스 감염증, 살모넬라증, 돼지 적리, 돼지 수포병, 감염성 위장염, 돼지의 수포성 발진증, 수포성 구내염, 및 당업계에 공지된 여타 병태들이 포함된다.

본원에 기재된 면역조절자 조성물이 유용할 예시 감염원에는 대상체의 선천적 면역 응답성에 의해 영향을 받는 감염원들이 포함된다. 그러한 감염원에는, 이에 제한되지 않으나, 악티노바실러스 속 (Actinobacillus sp.), 악티노바실러스 플레로뉴모니애 (Actinobacillus pleuropneumoniae), 악티노바실러스 수이스 (Actinobacillus suis), 악티노마이세스 피오게네스 (Actinomyces pyogenes), 아프리카 돼지 열병 바이러스 (African swine fever virus), 알파 코로나바이러스 (Alphacoronavirus), 알파헤르페르스비리내 (Alphaherpersvirinae), 아프토바이러스 (Aphthovirus), 아스피바이러스 (Asfivirus), 아르테리바이러스 (Arterivirus), 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 베타코로나바이러스 (Betacoronavirus), 베타헤르페스비리내 (Betaherpesvirinae), 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica), 브라키스피라 효디센테리애 (Brachyspira hyodysenteriae), 브루셀라 아보르투스 (Brucella abortus), 브루셀라 수이스 (Brucella suis), 칼리시비루스 (Calicivirus), 캄필로박터 속 (Campylobacter sp.), 캄필로박터 효인테스티날리스 (Campylobacter hyointestinalis), 캄필로박터 뮤코살리스 (Campylobacter mucosalis), 카르디오바이러스 (Cardiovirus), 써코바이러스 (Circovirus), 돼지 콜레라 열병 바이러스 (Classical swine fever virus), 클로스트리디알 페르프린겐스 (Clostridial perfringens), 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 클로스트리디움 셉티쿰 (Clostridium septicum), 클로스트리디움 테타니 (Clostridium tetani), 코로나바이러스 (Coronavirus), 싸이토메갈로바이러스 (Cytomegalovirus), 엔케팔로미오카르디티스 바이러스 (Encephalomyocarditis virus), 엔테로바이러스 (Enterovirus), 에리시펠로트릭스 루시오파티애 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 대장균 (Escherichia coli), 유박테리움 수이스 (Eubacterium suis), 에리시펠로트릭스 루시오파티애 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 대장균, 플라비비리대 (Flaviviridae), 푸소박테리움 네크로포룸 (Fusobacterium necrophorum), 돼지혈구응집성 뇌척수염바이러스 (Haemagglutinating encephalomyelitis virus), 해모필러스 파라수이스 (Haemophilus parasuis), 로소니아 민트라셀룰라리스 (Lawsonia intracellularis), 렙토스피라 인테로간스 세로바르스 (Leptospira interrogans serovars), 렐리스타드 바이러스 (Lelystad virus), 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 리사비루스 (Lyssavirus), 미크로스포룸 나눔 (Microsporum nanum), 미코플라스마 속 (Mycoplasma sp.), 미코플라스마 효프뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae), 미코플라스마 효리니스 (Mycoplasma hyorhinis), 미코플라스마 효시노비애 (Mycoplasma hyosynoviae), 파스퇴렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida), 페스티바이러스 (Pestivirus), 피코르나비리대 (Picornaviridae), 돼지 아테리바이러스 (arterivirus), 돼지 엔테로바이러스 (enterovirus), 돼지 유행성 설사병 바이러스 (Procine epidemic diarrhea virus), 돼지 헤르페스바이러스 1, 돼지 헤르페스바이러스 2, 돼지 파르보바이러스 (parvovirus), 돼지 생식기 호흡 증후군 바이러스, 돼지 사페로바이러스 (Porcine sapelovirus), 돼지 테스코바이러스 (Porcine teschovirus), 페스티바이러스 (Pestivirus), 공수병 바이러스, 랍도비리대 (Rhabdoviridae), 로타바이러스 (Rotavirus), 살모넬라 속 (Salmonella sp.), 살모넬라 콜레라에수이스 (Salmonella choleraesuis), 세르풀리나 효디센테리애 (Serpulina hyodysenteriae), 스피로캐테스 (Spirochaetes), 스타필로코시 (Staphylococci), 스타필로코커스 히쿠스 (Staphylococcus hyicus), 스트렙토코시 (Streptococci), 스트렙코코커스 수이스 (Streptococcus suis), 돈두바이러스 (Swinepox virus), 돼지 인플루엔자바이러스 (Swine influenzavirus), 토가비리대 (Togaviridae), 미분류 DNA 바이러스, 베시쿨로바이러스 (Vesiculovirus), 예르시니아 슈도튜베르쿨로시스 (Yersinia pseudotuberculosis), 및 당업계에 공지된 여타의 것이 포함된다.

본원에 기재된 면역조절자 조성물은 감염원에 의해 유발되는 병태 또는 암의 치료 또는 예방에 특히 유용할 수 있다. 그러한 병태에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 유방선균증, 아프리카 돼지 열병, 탄저병, 위축성 비염, 오제스키병, 보툴리눔 중독증, 브루셀라병, 괴저성 비염, 돼지 콜레라 열병, 클로스트리듐세균 장독혈증, 대장균감염증, 선천적 CNS 징후, 젖먹이 돼지의 감염성 농피증, 뇌척수 심근염, 엔테로바이러스 감염증, 돼지 삼출성 표피염, 구제역, 부제증, 돼지 글래서 병, 그리스 돼지병, 돼지 콜레라, 봉입체성 비염, 장선종증, 감염성 관절염, 렙토스피라증, 선회병 (패혈증/내장), 간 병변, 유선염-자궁근층염-무유증 증후군, 악성 부종, 마이코플라즈마 폐렴, 마이코플라즈마 다발성 관절염, 마이코플라즈마 다발성장막염, 돼지의 괴사성 귀 증후군, 괴저성 비염, 괴사성 위염, 부종증, 골수염, 외이도염, 파보바이러스 감염증, 파스투렐라병, 장미색 비강진, 늑막폐렴, 다발관절염, 돼지 유행성 설사병, 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PPRS), 증식성 출혈 장염, 가성결핵증, 신우신염, 공수병, 백선증, 로타바이러스 감염증, 살모넬라증, 연쇄상구균성 수막염, 연쇄상구균성 수막염 및 관절염, 돼지 적리, 돼지 단독, 돼지 콜레라, 돼지 인플루엔자, 돈두, 돼지 수포병, 탈판, 테센병, 파상풍, 감염성 위장염, 수포성 질병, 돼지의 수포성 발진, 수포성 구내염, 구토 및 소모성 질환, 백반신, 및 당업계에 공지된 여타의 것이 포함된다.

E. 투여

각종 투여 경로가 이용가능하다. 선택된 특정 양태는 물론 특정의 선택된 생물작용제, 대상체의 연령 및 일반적인 건강 상태, 치료될 특정 병태 및 치료학적 효능에 요구되는 투여량에 따라 좌우될 것이다. 본 발명의 방법은 임상적으로 허용불가한 부작용을 야기하지 않으면서 유효 수준의 면역 응답성의 활성화를 초래하는 임의의 투여 양태를 이용하여 실시될 수 있다. 조성물은 단위 투약 형태로 편리하게 제시될 수 있고 당업계에 익히 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

면역조절자 조성물은 정맥내, 근육내, 진피내, 복강내, 유선내, 경피내, 직장내, 점막내, 피하, 스프레이로서, 경구, 안구내, 기관내, 비강내, 국소, 안내 또는 당업계에 공지된 기타 방법으로써 투여될 수 있다. 한 측면에서, 면역조절자는 피하 투여된다. 또 다른 측면에서, 면역조절자는 근육내 투여될 수 있다. 또 다른 측면에서, 면역조절자는 스프레이로서 투여된다. 또 다른 측면에서, 면역조절자는 경구 투여된다. 또 다른 측면에서, 면역조절자는 피하 투여될 수 있다.

한 관점에서, 면역조절자는 챌린지 (또는 감염) 전에 대상체에 단독으로 투여될 수 있다. 또 다른 측면에서, 면역조절자는 챌린지 (또는 감염) 후 대상체에 단독으로 투여될 수 있다. 또 다른 측면에서, 면역조절자는 챌린지 (또는 감염) 과 동시에 대상체에 단독으로 투여될 수 있다.

일부 측면에서, 면역조절자 조성물은 챌린지 이전 예방접종과 동시에 공동-투여될 수 있다. 일부 측면에서, 면역조절자 조성물은 챌린지 (또는 감염) 과 동시에 예방 접종과 동시에 공동-투여될 수 있다. 일부 측면에서, 공동-투여는 백신 및 면역조절자를, 대상체의 동일한 일반적인 위치에서 서로 옆의 두 상이한 부위에 (즉, 대상체의 목에서 나란히 주사), 동일한 일반적인 위치에서 대상체의 반대편에 (즉, 목의 각 측면 위에 하나씩) 또는 동일 대상체의 상이한 위치에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 면역조절자 조성물은 예방접종 및 챌린지 이전에 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 면역조절자 조성물은 예방접종 후, 그러나 챌린지 이전에 투여될 수 있다. 면역조절자 조성물은 챌린지 (또는 감염) 전 예방접종된 대상체에 챌린지 후에 투여될 수 있다.

당업자는 투여 경로가 대상체 및 대상체의 건강 또는 상태에 따라 달라질 수 있음을 인지할 것이다. 제공된 투여 경로는 예의 목적을 위한 것으로 비제한적으로 제공된다.

예방접종은 임의의 연령에서 수행될 수 있다. 백신은 피하로, 스프레이하여, 경구적으로, 근육내로, 유선내로, 진피내로, 경피로, 직장내로, 점막내로, 안구내로, 기관내로, 비강내로, 국소적으로, 안구로 또는 당업계에 공지된 여타 방법으로 투여될 수 있다. 경구 백신은 사료 또는 물에 투여될 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법은 일상적인 예방접종 스케쥴에 기초하여 이용될 수 있음이 고려된다.

면역조절자 조성물은 또한 피하로, 스프레이하여, 경구적으로, 근육내로, 유선내로, 진피내로, 경피로, 직장내로, 점막내로, 안구내로, 기관내로, 비강내로, 국소적으로, 안구로, 또는 당업계에 공지된 여타 방법으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 면역조절자 조성물은 근육내로 투여될 수 있다. 대안적으로, 면역조절자 조성물이 피하로 투여될 수 있다.

면역조절자는 대상체에, 챌린지 전 약 1 내지 약 14 일 전, 또는 챌린지 후 약 1 내지 약 14 일 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, 면역조절자는 챌린지 전 약 1 내지 약 7 일 전에 투여될 수 있거나, 또는 챌린지 후 약 1 내지 약 7 일 후에 투여될 수 있다. 면역조절자는 적합하게 챌린지 전 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 일 전, 또는 챌린지 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 일 후에 투여된다.

다른 전달 시스템은 서방형 (time-release), 지연형 (delayed release) 또는 지속형 (sustained release) 전달 시스템을 포함할 수 있다. 이러한 시스템은 반복적인 조성물 투여를 피해 편의를 증가시킬 수 있다. 많은 종류의 방출 전달 시스템이 이용가능하고 당업자에게 공지되어 있다. 이에는 중합체 기반 시스템, 예컨대 폴리(락티드-글리콜리드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리히드록시부티르산 및 폴리안히드리드가 포함된다. 앞서의 중합체 함유 약물의 마이크로캡슐은 예를 들어 미국 특허 제 5,075,109 호에 기재되어 있다.

전달 시스템은 또한 스테롤 포함 지질, 예컨대 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 지방산 또는 중성 지방, 예컨대 모노-, 디- 및 트리-글리세리드; 히드로겔 방출 시스템; 실라스틱 시스템; 펩티드 기반 시스템; 왁스 코팅; 통상의 결합제 및 부형제를 이용한 압축된 정제; 부분 융합된 임플란트; 등인 비(非)중합체 시스템을 포함한다. 구체예에는 이에 제한되지 않지만, 본 발명의 제제가 U.S. 특허 제 4,452,775 호, 제 4,675,189 호, 및 제 5,736,152 호에 기재된 것과 같은 매트릭스 내 형태로 함유된 침식 시스템, 및 활성 성분이 제어된 속도로 U.S. 특허 제 3,854,480 호, 제 5,133,974 호, 및 제 5,407,686 호에 기재된 바와 같은 중합체로부터 침투하는 확산 시스템이 포함된다. 추가적으로, 펌프-기반 하드웨어 전달 시스템이 이용될 수 있고, 이들 중 일부는 이식에 적합된다.

본 발명의 영역에서 벗어나지 않으면서 상기 조성물, 생성물 및 방법에 각종 변경이 가해질 수 있는 바, 상기 기술 및 하기에 주어진 실시예에 포함된 모든 사항은 예시적인 것이며 제한되는 의미로서 해석되어서는 안된다는 것이 의도된다.

정의

용어 "유효량" 은 원하는 생물학적 효과를 실현하는데 필수적이거나 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 전염병 치료 또는 예방을 위한 면역조절자의 유효량은 미생물에 노출시 면역 응답성의 발달을 야기하여, 대상체 내 미생물의 양 감소를 도모하고, 바람직하게는 미생물의 박멸을 도모하는 데 필수적인 양이다. 임의의 특정 적용을 위한 유효량은 치료되는 질병 또는 병태, 대상체의 크기 또는 질병 또는 병태의 중증도와 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 당업자는 과도한 실험을 필요하게 만들지 않으면서 면역조절자 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다.

용어 "싸이토카인" 은 면역 증강 단백질 패밀리를 지칭한다. 싸이토카인 패밀리에는 조혈 성장 인자, 인터류킨, 인터페론, 면역글로불린 슈퍼패밀리 분자, 종양 괴사 인자 (TNF) 패밀리 분자 및 케모카인 (즉, 세포, 특히 포식 세포의 이동 및 활성화를 조절하는 단백질) 이 포함된다. 예의 싸이토카인에는 제한 없이 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-12 (IL-12), 인터류킨-15 (IL-15), 인터류킨-18 (IL-18), 인터페론-α (IFN-α), 및 인터페론-γ (IFN-γ) 이 포함된다.

용어 "유발하다" 는, 활성화하다, 자극시키다, 생성하다 또는 상향조절하다라는 용어와 상호교환해서 사용될 수 있다.

대상체에서 용어 "면역 응답성을 유발하다" 란 면역 응답성의 활성을 특이적으로 제어하거나 이에 영향을 끼치는 것을 지칭하고, 이에는 면역 응답성 활성화, 면역 응답성 상향조절, 면역 응답성 증강 및/또는 면역 응답성 변경 (예컨대, 해가 되거나 효과적이지 못한 것으로부터 유익하거나 보호적인 것으로 대상체 내 우세한 유형의 면역 응답성을 결국 변경시키는 면역 응답성의 유형을 유발시킴으로써) 을 포함할 수 있다.

용어 "작동적으로 연결된" 이란, 트랜스펙션 될 때 (즉, 형질전환, 형질도입, 또는 트랜스펙션시), 분자가 숙주 세포 내로 발현될 수 있도록 하는 방식으로 전사 제어 서열에 핵산 분자를 연결하는 것을 지칭한다. 전사 제어 서열은 전사의 개시, 신장 및 종료를 제어하는 서열이다. 특히 중요한 전사 제어 서열은 프로모터, 인핸서, 작동자 및 억제자 서열과 같이 전사 개시를 제어하는 것이다. 각종 이러한 전사 제어 서열이 당업자에게 공지되어 있다. 바람직한 전사 제어 서열에는 조류, 어류, 포유류, 박테리아, 바이러스, 식물 및 곤충 세포에서 기능하는 것이 포함된다. 임의의 전사 제어 서열이 본 발명에 이용되지만, 이 서열은 면역원 또는 면역 자극 단백질을 인코딩하는 서열과 자연적으로 연합된 천연 발생 전사 제어 서열을 포함할 수 있다.

용어 "핵산 분자" 및 "핵산 서열" 은 상호 교환해서 사용될 수 있으며, 이에는 DNA, RNA, 또는 DNA 또는 RNA 의 유도체가 포함될 수 있다. 이 용어는 또한 올리고뉴클레오티드 및 더 큰 서열, 예컨대 플라스미드, 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드를 포함하고, 단백질 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산 분자와 조절 영역, 인트론 또는 기타 비코딩 DNA 또는 RNA 를 포함하는 핵산 분자 양자 모두를 포함한다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드는 약 1 내지 약 500 뉴클레오티드의 핵산 서열을 갖고, 더욱 전형적으로는 길이가 약 5 뉴클레오티드 이상이다. 핵산 분자는 포유류, 어류, 박테리아, 곤충, 박테리아, 식물, 합성 공급원 또는 그 조합물을 비롯해 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 핵산 분자는 재조합 DNA 기술 (예, 폴리머라아제 사슬 반응 (PCR), 증폭, 클로닝) 또는 화학적 합성과 같은 당업계에 통상 공지되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 핵산 분자는 천연 핵산 분자 및 그의 상동체를 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 방법에서 유용한 면역 응답성을 유발하는 핵산 분자의 능력을 개질이 실질적으로 방해하지 않도록 하는 방식으로 뉴클레오티드가 삽입, 결실, 치환 또는 도치되어져 개질된 핵산 분자 및 천연 대립유전자 변이체를 포함한다. 핵산 상동체는 당업계에 공지된 다수의 방법을 이용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 본원에 참고문헌으로 포함되어 있는 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989)] 참조).

용어 "선택가능 마커" 및 "선택가능 마커 유전자"는 유기체를 보호하는 생성물을 인코딩하는 유전자를 지칭하며, 여기서 상기 유전자는 유기체를 통상적으로 사멸하거나 그의 성장을 저해하는 조건 또는 선택적 제제 (예, 항생제) 로부터 발현된다. 선택적 마커 유전자는 가장 흔한 항생제 내성 유전자 (예, 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 등) 이다. 따라서, 예를 들어 대장균 세포를, 카나마이신 내성 유전자를 인코딩하는 플라스미드를 도입하는 형질전환 절차에 적용시킨 다음, 카나마이신 함유 배지상 또는 그 안에서 성장시키는 경우, 성공적으로 플라스미드를 취해 카나마이신 내성 유전자를 발현시킨 대장균만이 살아남을 것이다. 용어 "선택적 마커" 및 "선택적 마커 유전자"는 또한 유기체의 성장에 필수적인 화합물 합성에 관여된 효소를 코딩하는 유전자를 포함한다. 필수 화합물을 합성할 수 없는 영양요구성 유기체에 도입되는 경우, 이러한 유전자는 그 유기체를 필수 화합물이 보충된 배지에서 성장 가능하게 허용한다. 예를 들어, 리신 생합성에 관여된 효소 내 돌연변이 또는 이의 부재로 인해 아미노산 리신에 대해 영양요구성인 박테리아 세포는 통상적으로 리신이 보충되어지지 않은 배지 상에서 성장할 수 없다. 이러한 박테리아가 리신 생합성에 관여된 효소를 인코딩하는 플라스미드를 도입하는 형질전환 절차에 적용되는 경우, 성공적으로 플라스미드를 취해 효소를 발현시킨 박테리아는 리신이 보충되지 않은 배지에서 성장시 생존할 것이다. 용어 "선택가능 마커" 및 "선택가능 마커 유전자"는 독/해독제 선택을 허용하는 유전자를 추가로 포함한다. 예를 들어, ccdB 유전자는 세포 분할에 필수 효소인 DNA 자이라아제에 결합하는 단백질을 인코딩한다. DNA 자이라아제에 결합되자마자, ccdB 유전자 생성물은 유전자 복제를 손상시키고 세포사를 유도한다. 즉, ccdB 유전자 생성물을 발현하는 박테리아는 살아남을 수 없다. ccdA 유전자는 ccdB 유전자 생성물의 천연 저해제로서 작용하는 단백질 ("해독제") 를 인코딩한다. 따라서, 박테리아 게놈에서 ccdB 유전자를 갖는 박테리아를 ccdA 유전자 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 도입하는 형질전환 절차에 적용시키는 경우, 성공적으로 플라스미드를 취해 ccdA 유전자를 발현하는 세포만이 살아 남을 것이다.

용어 "선별가능 마커" 및 "선별가능 마커 유전자"는 선별가능 마커 유전자를 발현하는 세포와 선별가능 마커 유전자를 발현하지 않는 세포를 관찰자가 구별 가능하게 하는 생성물을 인코딩하는 유전자를 지칭한다. 선별가능 마커 유전자 시스템은 당업계에 익히 공지되어 있고, 이는 예를 들어 lacZ 유전자 및 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 청색 형광 단백질 (BFP) 또는 시안색 형광 단백질 (CFP) 과 같은 형광 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다.

본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 는 멧돼지과 (Suidae) 의 구성원 또는 돼지 종들인 가축 또는 야생동물을 지칭한다. 특히, 용어 "대상체" 는 번식 또는 식육 제품의 의도로 시판되는 것들을 지칭한다. 적합한 돼지 대상체에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 돼지, 성체 돼지, 어린 돼지, 어린 암퇘지, 젖먹이 돼지, 이유한 돼지, 피더 돼지, 수퇘지 및 당업계에 동지된 여타 돼지 종들의 구성원들이 포함된다. 일부 측면에서, 대상체는 전염병이 있다고 진단되어질 수 있거나, 전염병의 위험에 처할 수 있거나 또는 전염병을 경험할 수 있다. 대상체는 태내, 신생아, 청소년기, 성년기, 중년기 또는 노년기를 비롯한 임의 연령대일 수 있다.

본 발명의 구성요소 또는 그의 바람직한 구현예(들)의 소개 시, 대표단수 및 "상기" 는 구성요소들 중 하나 이상이 존재함을 의미한다. 용어 "함유", "포함" 또및 "갖고 있는" 은 포괄성을 의도하며, 열거한 구성요소들 이외에도 추가 구성요소가 존재할 수도 있음을 의미한다.

실시예

하기의 비제한적인 실시예는 본 발명을 추가로 설명하도록 제공된다.

실시예 1: 면역조절자 복합체는 시판 돼지 인플루엔자 사백신과 함께 공동투여시 적혈구응집반응 억제 항체 유도를 강화한다.

본 실시예의 목적은 시판 돼지 인플루엔자 사백신과 함께 공동투여시 적혈구응집반응 억제 (HI) 항체의 유도에 있어서 면역조절자의 유효성을 평가하는 것이다.

방법

35 마리의 돼지를 현장에서 수령해 5 개의 우리에 넣었다 (치료군 T1, T2, T3, T4, 및 T5). 돼지를 각 치료군에서 비슷한 중량을 수득하도록 무작위로 넣었다. 제 0 일 및 제 14 일째에, T2 내지 T4 에는 다양한 양의 SIV 시판 백신의 권장 투여량으로 면역조절자를 제공했다. 면역조절자 및 시판 백신을 견갑골 아래 부위의 림프절 부근 가까이 피하 접종으로 투여했다. T1 에는 시판 백신만을 제공하고, T5 에는 희석제만을 제공했다. 제 18 일째 돼지 ID 114 을 제외하고, 각각의 남아있는 돼지로부터 0, 3, 7, 10, 14, 18, 21, 24 및 28 일째에 혈청용으로 혈액을 수집했다. 혈액을 혈청용으로 가공하고, 최종 가공 및 적혈구응집반응 억제 (HAI) 시험을 위해 실험실로 옮겼다.

모든 실험실 과정들은 표준 방법에 따라 수행되었다. 혈청 시료는 수용체 파괴 효소를 이용해 예비처리하고, HAI 검정 개시 전 닭 적혈구 세포에 흡수시켜 cRBC 에 대한 비특이적 결합을 감소시켰다. 비특이적 상호작용은 적혈구응집반응 억제가 존재함을 시사하는 허위 양성반응을 유도할 수 있다. 예비처리는 최초 1:5 희석을 제공하게 되어, HAI 검정에서 시험한 첫번째 희석은 1:10 였다. 예비처리된 혈청은 2 배씩 차례대로 희석되었다. 이어서, 일정한 양의 바이러스 (4 내지 8 혈구응집 단위) 를 각 희석물과 인큐베이션했다. 약 45 분의 인큐베이션 기간 후, 1% 배양 적혈구 (cRBC) 용액을 첨가했다. 플레이트를 적혈구응집반응 억제에 대해 관찰했다. 역가는 모든 반복실험에 대해 4 내지 8 바이러스 적혈구응집반응 단위를 완전히 억제하는 혈청의 최종 희석배수로 산출했다.

제 0, 3, 7, 10, 14, 18, 21, 24, 및 28 일째의 혈청 시료를 돼지 인플루엔자 바이러스 (SIV) H1N1 에 대한 항-적혈구응집반응 항체에 대해 시험했다. 추가로, 제 0, 3, 7, 및 21 일째의 혈청 시료를 SIV H3N2 에 대한 항-적혈구응집반응 항체에 대해 시험했다. H1N1 를 이용한 최초 시험 동안 수득되는 결과 때문에 이들 특정일에 시험했다.

면역조절자

본원에 기재된 면역조절자 조성물을 본 연구에 이용했다. 특별하게는, SEQ ID NO: 2, DOTIM 및 약제학적 담체를 포함하는 본원에 기재된 조성물 ("IC-Ex.1") 이 사용되었다.

표 1: 면역조절자의 희석

동물

돼지들은 순종 또는 잡종이고, 시험 현장으로 이동할 때까지 초유를 떼었다. 성별이 섞인 총 35 마리의 동물을 돼지 인플루엔자 음성 농장으로부터 구매해, 35 마리를 연구에 포함시켰다. 돼지의 최초 연령은 도착시 약 8 주령이었고, 접종시에는 9 내지 10 주령이었다. 최초 체중은 접종시 돼지 연령에 적당했다.

아기돼지들은 생후 예방접종하지 않았으며, 예방접종과 상충되는 것으로 공지된 임의의 치료도 제공하지 않았다. 임상 현장 도착 시, 모든 아기돼지들은 일반적인 건강상태에 대해 관찰했다. 연구 개시 전 7 일 동안 동물들을 순응시켰다. 동물들은 임상적 징후에 대해 1 일 1 회 관찰했다. 체온은 1 일 1 회 쟀다.

아기돼지들은 돼지 인플루엔자에 대한 현재 병력이 없는 무리로부터 선택했고, 친(親) 암퇘지/어린 암퇘지는 SIV 에 대해 예방접종하지 않았다. 각 개체는 양호한 건강상태에 있는지 평가해 결정했다. 아기돼지들은 돼지 인플루엔자 바이러스에 대해 혈청학 (적혈구응집반응 억제 (HAI)) 적으로 음성이었다. 제 -1 일 또는 제 0 일에, 모든 아기돼지들을 임상적으로 관찰하여, 치료군으로 배치하거나 또는 치료군마다 최대 7 마리까지의 아기돼지들로 하고 제외했다. 돼지들은 치료 투여 전 21 일 이내에 예방접종과 상충될 치료를 받은 경우에는 제외했다.

연구 디자인

표 2: 연구 디자인.

동물들은 전체 연구 기간 및 순응 동안 임상적 징후에 대해 관찰했다. 챌린지 투여 개시 및 각 연구 동물 개시까지 매 오전 비정상적 호흡, 비정상적 태도 및 발열에 대해 평가했다.

후속하는 표는 비정상적 호흡 및 태도의 임상적 징후에 대한 임상 스코어 분류 지정에 대한 안내자료로 이용되었다. 임상 스코어는 현장에서 유사한 정상적인 건강한 동물과 비교해 정했다.

표 3: 임상 스코어 제공 안내.

동물들은 식욕부진, 기침, 발열, 눈 및 코에서의 액체 배출, 운동실조, 혼수상태, 경련, 홍반, 과민성, 과다타액분비, 파행 (lameness), 드러누움 (recumbence), 이급후증 (tenesmus) 및 떨림 (tremors) 을 포함한 비정상적 임상적 징후에 대해 관찰했다.

연구 제 0 일은 모든 동물에서 동일했으며, 그룹 T2, T3 및 T4 에서는 동물들에게 면역조절자 치료 투여일이다. 면역조절자를 제공받은 모든 동물들은 피하주사했다. 예방접종을 제공받는 모든 동물들은 표지 지시사항에 따라 투여했다. 면역조절자를 제공받은 모든 동물들은 견갑골 아래 부위의 림프절 근처에 주사했다. 백신 및 면역조절자는 서로 가까이 근접한 곳에 따로 투여했다.

이유 및 수송 전에 본래의 농장에서 연구 편입에 대한 적합성 결정을 목적으로 동물들에서 혈청용으로 채혈했다. 한 배에 최소 3 마리의 돼지에서 시료채취했다.

SIV 혈청반응 테스트용의 혈액 시료 (집단 당 동물마다 약 5 내지 7 mL) 를 제 0 일 (예방접종 전), 및 제 3 일, 제 7 일, 제 10 일, 제 14 일, 제 18 일, 제 21 일, 제 24 일, 및 제 28 일에 수집했다.

BBL 표준 조작 과정 (SOP) 을 이용하여 혈청용 혈액 시료를 가공하고, 각 시료는 2 개의 별도 용량으로 분취했다. 혈청 시료는 8 유닛의 혈구응집 (HA) 바이러스를 이용한 BBL SOP 를 이용하는 HAI 검정으로 시험했다. 동종 및 이종 바이러스를 이용해 혈청 시료를 시험했다.

제 -7 일, 제 0 일, 제 7 일, 제 14 일 및 제 21 일, 및 제 28 일 또는 검시 전에 동물을 칭량했다. 폐사하거나 또는 인도적 이유로 안락사된 동물들만 부검하여 수의사가 병의 원인을 결정하도록 했다. 돼지에게 상주 수의사가 바르비투르를 과다량 투여하여 안락사시켰다. 부검은 시험 기관 해당 장소에서 SOP 에 따라 취급했다. 제 28 일째에 모든 남은 동물들은 기관 SOP 에 따라 상주 수의사가 바르비투르를 과다량 투여하여 인도적 방법으로 안락사되었다.

결과

면역조절자 시험 물품으로부터 초래된 뚜렷한 임상적 소견은 없었다. 연구 동안 두마리의 돼지가 폐사했다. 폐사 원인은 두 경우 모두 탈항이었다. 추가로 두마리의 돼지가 파행 및 스트레스 발생으로 연구에서 제외되었다. 제 28 일째에, 모든 남아있는 돼지들을 칭량하고, 채혈 후 안락사시켰다.

표 4 는 SIV H1N1 단리체에 대한 항-적혈구응집반응 항체에 대해 시험한 제 0, 3, 7, 10, 14, 18, 21, 24, 및 28 일째의 혈청 시료로부터의 데이터를 제공한다. Sly H3N2 단리체에 대한 항-적혈구응집반응 항체에 대해 시험한 제 0, 3, 7, 및 21 일째의 혈청 시료에 대한 데이터에 대해서는 표 5 참조. H1N1 에 대한 20 의 HI 역가 및 H3N2 에 대한 10 의 HI 역가를 가진 시험 혈청 시료를 양성으로 보고했다. 이는 각 바이러스 유형에 대한 혈청의 비특이적 배경으로 인한 것이다.

표 4: SIV H1N1 에 대한 적혈구응집반응 억제 역가

NS - 시료 없음

5 - 10 미만의 역가를 나타낸다

10 - 비특이적 배경

챌린지 바이러스 - H1N1 SIV Lot VS24Nov09lowa73-SIVp1

예방접종일 = 제 0 일 및 제 14 일

표 5: SIV H3N2 에 대한 적혈구응집반응 억제 역가

NS - 시료 없음

5 - 10 미만의 역가를 나타낸다

10 - 비특이적 배경

챌린지 바이러스 - H1N1 SIV Lot VS24Nov09lowa73-SIVp1

예방접종일 = 제 0 일 및 제 14 일

논의

본 연구의 목적은 시판 돼지 인플루엔자 사백신과 병용투여시 적혈구응집반응 억제 (HI) 항체의 유도에 대한 면역조절자 조성물의 영향을 평가하기 위한 것이었다. 이러한 목적으로, 총 35 마리의 초유를 뗀 돼지들을 5 개의 치료 군으로 나누고, 각 치료 군은 최초 접종 및 시판 SIV 백신과 함께 다양한 양의 면역조절자의 부스트를 14 일 후에 제공했다. 28 일간의 연구 동안 면역조절자 시험 물품으로 인한 뚜렷한 임상적 소견은 없었다. 그러나, 폐사 또는 인도적 이유의 안락사로 인해 연구에서 총 4 마리의 돼지가 제외되었다.

수집한 모든 혈청 시료들을 H1N1 에 대한 적혈구응집반응 억제에 대해 검정했다. H3N2 에 대한 적혈구응집반응 억제에 대해 연구일 중 선택하여 시험했다. 도 4 및 5 는 각각의 검정일에 대해 산출된 기하 평균을 제시한다. H1N1 단리물로만 백신접종된 군에 비해 시판 백신과 조합하여 200ug 및 10ug 의 면역조절자를 제공받은 치료군에서는 기하 평균에서 두드러진 증가가 있다. 특히 제 21 일째에, 백신만을 접종한 군에 비해 시판 백신과 함께 50ug 의 면역조절자를 제공받은 치료 군에서도 기하 평균 증가가 있었다. 면역조절자 접종시 H3N2 에 대한 혈청전환이 또한 더 일찍 나타났다.

HAI 의 실질적 평균이 또한 도 6 및 7 에 제시되었다. 그들 그래프는 각 치료군에서 개별 역가를 초과하여 나타낸다. 이는 제 14 일 부스트 후 치료군 3 에서 가장 두드러졌다. 2 마리만이 H1N1 에 대해 혈청전환되었지만, 1 마리는 높은 HAI 역가를 가졌다 (표 5 참조).

양측 SIV 단리물에 대해 혈청전환이 있었다. 상기 방법을 이용하여 각 치료군에서 총 개체수와 비교하여 혈청전환이 검출된 돼지의 개체수를 제시하는 표 6A 및 6B 및 도 8 (제 21 일 결과) 참조.

표 6A: 혈청전환의 개요

H1N1 에 대해 혈청전환된 돼지의 개체수*/총 개체수

표 6B: 혈청전환의 개요

H3N2 에 대해 혈청전환된 돼지의 개체수*/총 개체수

결론적으로, 면역조절자 복합체는 시판 돼지 인플루엔자 사백신과 병용투여시 적혈구응집반응 억제 항체의 유도를 강화했다.

실시예 2: 돼지 생식기 호흡 증후군 (PRRS) 백신이 있는 면역조절자는 돼지의 폐에서 조기 바이러스 정화에 도움을 준다.

연구 수행으로 50 ㎍(RxII) 또는 10 ㎍ (RxI) 투여량의 면역조절자와 동시에 제공하는 PRRS 개질 생백신 (MLV) 백신에 의해 돼지에서 유발되는 면역 응답성의 강도 및 품질 뿐 아니라 방어 면역의 수준도 평가했다. 동일한 MLV 백신을 이용했으나, 면역조절자는 투여하지 않은 면역화에 대한 동일한 숙주 응답에 대해 파라미터를 비교했다. 방어 면역의 수준은, 예방접종하지 않은 챌린지 제공된 대조군과 비교하여 예방접종되고 병원성 PRRS 바이러스로 챌린지 제공된 동물에서 관찰된 임상적 징후의 감소를 측정하여 결정했다.

통제된 PRRS 챌린지에서, RxII (PRRS 백신 + 50 마이크로그램의 면역조절자) 군은 PRRS 백신만을 제공받은 군 (RxIII) 의 동물들에 비해 모든 동물에서 더 높은 체중 증체, 폐에서의 더 낮은 바이러스 하중을 가졌으며, 검출가능한 인터페론을 가졌다. 본 연구는 면역조절자가 PRRS 백신과 함께 존재하면, PRRS 예방접종된 (RxIII) 동물들에서는 관찰되지 않는 폐에서의 조기 바이러스 정화에 도움이 됨을 시사한다.

연구 디자인

군 Rx I (T5) 은 PRRS MLV PrimePac 백신 + 10 ㎍ 의 면역조절자를 제공받았다. 군 Rx II (T4) 은 PRRS MLV PrimePac 백신 + 50 ㎍ 의 면역조절자를 제공받았다. 군 Rx III (T5) 은 PRRS MLV PrimePac 백신만을 제공받았다.

표 7: 연구 디자인.

면역조절자

본 연구에 사용된 면역조절자는 실시예 1 에서 상기 기재된 면역조절자이다.

동물

면역조절자 양이온성 리포좀-플라스미드 복합체는 5 mL (1.25 mL 필) 바이알에 포함되어 있는 동결건조 분말로서 제공되었다. 시험 물품을 운반해 2 내지 8℃에서 저장했으며, 냉동시키지 않았다. 면역조절자는 Tris-HCl 락토오스 완충액, pH 6.8 중에 제형화했다. 면역조절자는 주사용 멸균수 (SWFI) USP 첨가로 사용 직전에 재건했다. 용기 및 재건 체적은 하기와 같았다:

5 mL 바이알 용기 425 ㎍ (CoA 로 지칭): 1.25 mL 의 SWFI 를 이용해 재건

10 mL 물, 멸균, 보존제 없음 (주사용/USP), Abbott No.: 488710100 (Fisher Scientific AB4887-10-1)

무균 기법을 이용해 층류 후드 하에 면역조절자를 주사용 멸균수로 재건했다. 동결건조된 면역조절자를 냉장 저장소 (2 내지 8℃) 로부터 꺼내, 재건 전 약 5 분 동안 바이알이 실온이 되도록 했다. 주사기 및 18-게이지 바늘을 이용하여 0.5 mL (2 mL 바이알) 또는 1.25 mL (5 mL 바이알) 의 멸균수 측정에 이용했으며, 점진적으로 1 개의 2 mL 또는 5 mL 동결건조된 면역조절자의 바이알에 각각 주입했다. 재건 시간을 라벨 및 연구 약물 준비 워크시트 상에 기록했다. 바이알을 30 초 이상 약하게 빙빙돌리고 (와류시키지 않음), 5 분 이상 두었다. 바이알을 다시 30 초 이상 약하게 빙빙돌렸다 (와류시키지 않음). 재건된 면역조절자 물질은 백색 반투명 외관을 가졌다. 재건된 바이알을 사용할 때까지 아이스팩과 함께 저장했다. 재건된 면역조절자 물질은 4 내지 6 시간 내에 사용할 때까지 안정했다. 재건된 면역조절자를 표 8 에 제시된 바와 같이 멸균수 중 5% 덱스트로스 중에 희석시켰다.

표 8: 면역조절자 희석.

PRRS 바이러스, 마이코플라즈마 및 서코바이러스를 포함하는 모든 주요 돼지 병원체가 없는 유사한 체중의 총 39 마리 SPF 돼지 (표 9 내지 13) 를 본 연구에 이용했다. 동물들은 혈청학적으로 PRRS 항체에 대해 음성이었다. 돼지의 최초 연령은 적응시 7 내지 9 주령이었다. 모든 아기돼지들은 생후 예방접종하지 않았으며, PRRS 예방접종과 상호작용하는 것으로 공지된 임의의 치료를 처치하지 않았다. 동물들은 연구 개시 전 7 일 동안 적응시켰다. 동물들을 임상적 징후에 대해 1 일 1 회 관찰했다. 체온은 1 일 1 회 쟀다.

동물들은 전체 연구 기간 동안 및 적응기간 동안 임상적 징후에 대해 관찰했다. 챌린지 투여 개시부터 검시할 때까지 각 연구 동물은 비정상적 호흡, 비정상적 태도 및 발열에 대해 매일 아침 평가했다. 후생의 이유로 일부 동물들은 1 일 1 회 초과하여 관찰했다. 호흡 또는 태도 스코어가 3 인 동물은 없었으며, 따라서 의약이 필요 없었고, 인도적 이유로 연구원이 안락사시킨 일이 없었다.

하기는 비정상적 호흡 및 태도의 임상적 징후에 대한 임상 스코어 분류를 정한 안내자료로 이용되었다. 임상 스코어는 현장에서 유사하며 정상적인 건강한 동물과 비교해 정했다. 동물들 사이의 정상적인 차이를 고려하여, 병리적 응답으로부터 정상적인 생리적 응답을 구분하도록 주의를 기울였다.

호흡 스코어 지정:

0= 정상. 약간의 복부 동작이 있는 흉식 호흡

1= 경미한 호흡 곤란. 약간의 복식 호흡

2= 경증 호흡 곤란. 지나친 복식의 고통스러운 호흡

3= 중증 호흡 곤란. 매우 고통스러운 호흡, 복부 호흡. 입을 열고, 코 및 귀의 청색증

활기/우울증 스코어 지정:

0 = 정상. 돼지들이 문열림에 대해 활발하게/꿀꿀거리며 반응한다. 돼지들이 활기있고, 활발하며 호기심이 있다. 문쪽을 바라보고, 입구에 다가가 킁킁거린다. 사료 및 물에 대해 흥미를 보인다. 흥분하면, 배뇨 및 배변할 수 있다.

1= 경미함. 자극하면 일어나지만, 느리거나 또는 흥미 또는 호기심을 많이 보이진 않는다. 물러서서 빨리 누우려고 한다. 사료에 대해 약간 흥미를 보인다.

2= 경증. 두드러지게 활기가 없고, 기립/활동을 싫어한다. 탈진, 비틀거림, 조화운동불능.

3= 중증. 반응이 없고, 기립하지 않으려 함.

치료 방법

7 일의 적응 기간 후, 군 T3 내지 T5 (Rx III 내지 Rx I) 중의 동물들에게 예방접종했다. 면역조절자 (T4 및 T5) 를 제공받은 모든 동물들은 피하로 주사했다. PRRS 백신 T3 내지 T5 를 제공받은 모든 동물들은 2 ml 부피의 PRRS MLV 균주 PrimePac 중의 약 5 x 10⁴ 조직 배양 감염 투여량 50 (TCID50) 투여량으로 근육내 투여했다. 본원에 사용된 바와 같은 "TCID50" 은 접종한 세포의 50% 에서 병리학적 변화를 제공하기 위해 필요한 병원체의 양을 지칭한다. 면역조절자를 제공받은 모든 동물들은 견갑골 아래 부위에서 림프절 부근에 주사했다. 백신 및 면역조절자는 서로 가까이 근접한 곳에 따로 투여했다. 군 T1 및 T2 중의 동물들에게는 바이러스 생장에 사용되는 미감염 세포 (MARC-145 세포) 유래의 폐배지 상청액 2 ml 를 주사했다.

예방접종 4 주 후, 군 T2 내지 T5 의 동물들을 2 ml 부피 중의 2 × 10⁴ TCID50 의 PRRS 바이러스 균주 NADC-20 로, 투여량의 절반은 근육내로, 나머지 절반은 비강내로 투여하여 챌린지했다. 군 T2 로 정한 예방접종 비제공 및 챌린지 제공 동물들은 병원성 NADC-20 PRRS 바이러스 감염으로 인한 임상 증후군의 중증도를 확립하기 위해 제공되었으며, 군 T1 로 배정한 동물들은 생장 및 건강의 정상적 파라미터를 제공하기 위해 이용되었다.

예방접종으로 유도된 방어 면역의 정도는 혈청 및 폐 중의 바이러스 하중을 근거로 결정되었으며, 체중 (BW) 변화 비교 및 우울증의 소견 및 호흡 징후에 의해서도 결정되었다. 임상 파라미터는 챌린지 후 10 일째부터 매일 모니터링되었다. 바이러스혈증 (혈액) 의 정도는 ZMAC 세포에서의 혈청 중 감염성 바이러스 역가를 측정하여 챌린지 후 0, 4, 7 및 10 일에 결정되었다. 폐 조직 중의 바이러스 하중은 바이러스학적 방법으로 결정되었다.

챌린지 후 10 일째에, 모든 연구 동물들은 안락사시키고, 바이러스 하중에 대한 폐 시료를 수집했다. 경력 병리학자들이 육안으로 및 현미경 수준으로 폐에서의 병리학적 변화를 평가했다.

바이러스-특이적 면역성 측정을 위해, 말초혈 시료를 제 -7, 0, 4, 7, 14 및 28 일 (챌린지 제공 전) 및 면역화 후 및 제 38 일 (안락사 전) 에 각 동물로부터 수집했다. 상기 시료들로부터 혈청 및 PBMC 를 수득했으며, 각 동물의 체액 및 세포-매개 면역성의 강도를 측정했다. 항체 역가는 혈청 바이러스-중화 시험을 이용해 결정되었으며, PRRS 바이러스-특이적 인터페론 (IFN)-분비 세포 (IFN-SC) 의 빈도는 백신 바이러스 (PrimePac) 및 챌린지 바이러스 (NADC-20) 에 대해 별도로 수행되었다.

동물들은 연구 제 -7, 0, 7, 14 및 21 및, 제 28 일 및 안락사 직전 (제 38 일) 에 칭량했다. 어떤 동물들도 연구 중 폐사, 또는 인도적 이유로 안락사되지 않았으며, 따라서 중간 검시는 수행되지 않았다.

통계적 분석

제공받아 분석한 데이터는 혈청 (제 4, 7 및 10 일에 측정) 및 폐 및 IFN 역가, 체중 (제 0, 6 및 10 일에 측정), 임상 스코어 및 체온 (치료 후 10 일 동안 매일 측정), 및 검시시 세가지 유형의 스코어로 이루어졌다. 폐포 격벽 비대, 비대화 분포 및 기도 중 염증 세포에 대한 스코어는 0 내지 3 의 범위로 기록되었다.

모든 폐 역가는 각 역가에 1 을 더하고 (+1), 분석 전에 자연 로그로 변환시켜 변형시켰다. 최소 자승 평균을 산출하여 역변환시켜, 임의의 시기에 대한 각 군의 중심 경향 (즉, 기하 평균) 을 나타내어 표로 작성했다. IFN 역가는 변형시키기 않았다.

여러 측정값이 기록되어, 변량의 반복 측정 분석이 이용가능했다 (기준선 - 연구 제 0 일에 최근접 - 이 이용가능한 경우, 공동변수 분석이 이용되었다). 파라미터가 오직 1 회 측정된 경우, 변량 분석이 이용되었다. 모든 모델에서, TRT 의 고정 효과를 5 개 치료군 사이의 차이에 대해 시험했다. 여러 치료군이기 때문에 p-값에 대한 본페로니 조정 (Bonferroni adjustment) 을 이용했다.

검시 스코어 및 임상 스코어에 대해서는, 카이-분석을 이용했다. 0.05 의 알파 수준은 통계적으로 유의한 것으로 간주했다. 모든 분석은 SAS 9.2 소프트웨어를 이용해 수행했다.

결과 및 논의

치료 관련 부작용이 제보되지 않았다. 군마다의 챌린지 제공 후 매일 평균 태도 스코어가 도 9 에 포함되어 있다 (평균 매일 태도 스코어). 챌린지 제공 후 군별 개별 동물 태도 스코어는 표 9 내지 13 에 포함되어 있다. 예방 접종 미제공 및 챌린지 미제공 군은 연구 내내 태도 스코어가 0 이었다 (표 9: 평균 매일 태도 스코어 - Rx). 예방접종 비제공 및 챌린지 제공 군은 평균 태도 스코어가 연구 제 2 내지 10 일 동안 0.3 내지 1 의 범위였다 (표 10: 매일 태도 스코어 예방접종 비제공/챌린지 제공). PPRS 예방접종 + 면역조절자 10 ㎍ 제공 및 챌린지 제공 군 (RxI) 에서는 평균 태도 스코어가 연구 제 2 내지 10 일 동안 0.1 내지 0.7 의 범위였다 (표 11: 매일 태도 스코어 - RxI). PPRS 예방접종 + 면역조절자 50 ㎍ 제공 및 챌린지 제공 군 (RxII) 에서는 평균 태도 스코어가 연구 제 4 내지 8 일 동안은 0.1 내지 0.2 의 범위였고, 연구 제 7, 9 및 10 일에는 태도 스코어가 없었다 (표 12: 매일 태도 스코어 - RxII). PPRS 예방접종 제공 및 챌린지 제공 군 (RxIII) 에서 평균 태도 스코어는 연구 제 2 일 및 제 4 내지 10 일 동안 0.1 내지 0.8 의 범위였다 (표 13: 매일 태도 스코어 - III).

표 9: 매일 태도 스코어 - Rx .

표 10: 매일 태도 스코어 예방접종 비제공 / 챌린지 제공

표 11: 매일 태도 스코어 - RxI .

표 12: 매일 태도 스코어 - RxII .

표 13: 매일 태도 스코어 - RxIII .

군별 연구 제 -1 일의 평균 체온은 103.7℉ 내지 104.3℉ 의 범위였다. 챌린지 제공 동물들에서 연구 제 5 일에 최고 체온이 나타났고, 도 10 에 제시된 바와 같이 군마다 104.0℉ 내지 107.1℉ 의 범위였다. 일별 개별 동물 체온은 표 14 내지 18 에 포함되어 있다.

표 14: 체온 - Rx .

표 15: 체온 - 예방접종 비제공 챌린지 제공.

표 16: 체온 - RxI .

표 17: 체온 - RxII .

표 18: 체온 - RxIII .

병원성 PPRS 바이러스를 이용한 챌린지 전후의 군별 평균 체중은 표 11 에 포함되어 있다. 제 -39 일부터 제 10 일까지의 군별 평균 체중 증가 (제 10 일 중량 - 제 -39 일 중량) 는 제 -39 일부터 도 12 에 포함되어 있다. PRRS 바이러스 챌린지 제공 군들 중에서도 특히, IC-Ex.1 면역조절자 투여 군 (RxI 및 RxII) 에서는 예방접종 비제공 또는 PRRS 예방접종 (RxIII) 군들과 비교했을 때 제 10 일째에 더 높은 체중 증체가 있었다. 개별 동물 체중들이 표 19 내지 23 에 포함되어 있다. 연구 종료 (제 10 일) 시, PRRS 바이러스 챌린지 제공 군들 중에서도 특히, IC-Ex.1 면역조절자 군들 (RxI 및 RxII) 이 각각 더 높은 체중, 125.5 및 125.7 파운드를 나타냈는데; 이에 비해 예방접종 비제공 또는 PRRS 예방접종 (RxIII) 군에서는 각각 116.9 및 117.7 파운드였다 (도 13). 챌린지 제공 후, PRRS 바이러스 챌린지 제공 군들 중에서도 특히, IC-Ex.1 면역조절자 + PRRS 예방접종 제공 군들 (RxI 및 RxII) 은 각각 더 높은 체중 증가인 14.2 (12.7%) 및 13.9 (12.5%) 파운드를 나타냈고 (도 14 및 15); 이에 비해 예방접종 비제공 또는 PRRS 예방접종 (RxIII) 군들은 각각 7.5 (6.8%) 및 11.4 (10.8%) 파운드였다. 챌린지 제공 후 개별 동물 체중은 표 19 내지 23 에 포함되어 있다.

표 19: 체중 (파운드) Rx 예방접종 비제공 및 챌린지 비제공 .

표 20: 체중 (파운드) 예방접종 비제공 챌린지 제공.

표 21: 체중 (파운드) Rx I 예방접종 제공 챌린지 제공.

표 22: 체중 (파운드) Rx II 예방접종 제공 챌린지 제공.

표 23: 체중 (파운드) Rx III 예방접종 제공 챌린지 제공.

표 24: 챌린지 제공 후 체중 - 예방접종 비제공 챌린지 비제공된 Rx.

표 25: 챌린지 제공 후 체중 -(파운드) 예방접종 비제공 챌린지 제공.

표 26: 챌린지 제공 후 체중 -(파운드) 예방접종 제공 챌린지 제공 Rx I.

표 27: 챌린지 제공 후 체중 - (파운드) 예방접종 제공 챌린지 제공 Rx II.

표 28: 챌린지 제공 후 체중 - (파운드) 예방접종 제공 챌린지 제공 Rx II.

군별 평균 폐 중량은 도 16 에 포함되어 있다. 군별 체중 백분율로서의 평균 폐 중량이 도 17 에 포함되어 있다. 챌린지 제공 군들에서의 모든 동물들은 폐 대 체중 비율이 더 높았으며, 챌린지 비제공 대조군에서 0.77 인 것에 비해 1.06 (RxI) 내지 1.19 (예방접종 비제공 대조군) 의 범위었다.

PRRS 바이러스는 챌린지 제공 후 제 4, 7 및 10 일째에 혈청 시료로부터 단리했다. 챌린지 비제공 대조군 동물들은 바이러스 단리에 대해 음성으로 남아있어, 본 연구에서 실시된 생물보안의 통합성을 뒷받침했다. 연구 제 10 일째에, 예방접종 비제공 동물들의 모든 동물들은 바이러스 단리에 대해 양성이었으며, ml 당 0.06×10⁴ 내지 3.16×10⁴ TCID50 의 범위였다. PRRS 백신으로 예방접종한 동물들은 제 10 일째에 혈청에서 낮은 바이러스 역가를 가졌다. RxI 군에서, 9 마리 동물 중 7 마리가 제 10 일째에 바이러스 단리에 대해 음성이었다. RxII 군에서, 9 마리의 동물 중 5 마리가 제 10 일째에 바이러스 단리에 대해 음성이었다. 표 29 에 제시된 바와 같이 RxIII 군에서, 9 마리의 동물 중 7 마리가 바이러스 단리에 대해 음성이었다.

표 29: 챌린지 제공 후 혈청에서의 PRRSV 역가.

PRRS 바이러스는 개별 동물 폐 시료로부터 단리했다. 챌린지 비제공 대조군 동물의 폐 시료는 바이러스 단리물에 대해 음성이어서 본 연구에서 실시되는 생물보안의 통합성을 뒷받침했다. 군 RxII 에서 9 마리 동물 중 2 마리가 바이러스 단리에 대해 음성이었고, 그들의 폐 시료에서는 10² 미만의 바이러스가 있었다. 챌린지 제공 군들에서 모든 타 동물들에서는 폐 시료가 1.78×10² 내지 1.0×10⁵ 의 범위의 역가를 가졌다 (도 18 및 19). 각 동물에 대한 현미경 수준의 폐 병소는 표 30 내지 34 에 기재되어 있다. 챌린지 제공 동물들 중에서 특히 군 RxII 에서의 동물들의 폐에서는 최저 평균 폐포 격벽 비대 및 상기 군에서 더 낮은 바이러스 회복에 해당하는 비대화 분포가 있었다 (도 20).

표 30: 폐 병리학 - 예방접종 비제공 및 챌린지 비제공 ( Rx ).

병리학 스코어 기준 폐포 격벽 비대의 분포

폐포 격벽 비대 0 - 병변 없음 (정상)

0 - 비대화 없음 (정상) 1 - 초점 격벽 비대

1 - 약함 (상대적) 2- 다초점 격벽 비대

2 - 경증 (상대적) 3-격벽 비대 확산

3 - 중증 (상대적)

표 31: 폐 병리학 - 예방접종 비제공 및 챌린지 제공.

병리학 스코어 기준 폐포 격벽 비대의 분포

폐포 격벽 비대 0 - 병변 없음 (정상)

0 - 비대화 없음 (정상) 1 - 초점 격벽 비대

1 - 약함 (상대적) 2- 다초점 격벽 비대

2 - 경증 (상대적) 3 -격벽 비대 확산

3 - 중증 (상대적)

표 32: 폐 병리학 - 예방접종 제공 및 챌린지 제공 Rx I.

병리학 스코어 기준 폐포 격벽 비대의 분포

폐포 격벽 비대 0 - 병변 없음 (정상)

0 - 비대화 없음 (정상) 1 - 초점 격벽 비대

1 - 약함 (상대적) 2- 다초점 격벽 비대

2 - 경증 (상대적) 3 -격벽 비대 확산

3 - 중증 (상대적)

표 33: 폐 병리학 - 예방접종 제공 및 챌린지 제공 Rx II.

병리학 스코어 기준 폐포 격벽 비대의 분포

폐포 격벽 비대 0 - 병변 없음 (정상)

0 - 비대화 없음 (정상) 1 - 초점 격벽 비대

1 - 약함 (상대적) 2- 다초점 격벽 비대

2 - 경증 (상대적) 3 -격벽 비대 확산

3 - 중증 (상대적)

표 34: 폐 병리학 - 예방접종 제공 및 챌린지 제공 Rx III.

병리학 스코어 기준 폐포 격벽 비대의 분포

폐포 격벽 비대 0 - 병변 없음 (정상)

0 - 비대화 없음 (정상) 1 - 초점 격벽 비대

1 - 약함 (상대적) 2- 다초점 격벽 비대

2 - 경증 (상대적) 3 -격벽 비대 확산

3 - 중증 (상대적)

개별 동물들의 인터페론 역가는 도 21 및 표 35 에 포함되어 있다. RxIII (PRRS 백신) 군에서는 9 마리 동물 중 4 마리인 것과 대비되어, RxII (PRRS 백신 + 50 ㎍ 의 면역조절자) 군에서의 9 마리 동물 모두, 및 9 마리인 RxI (PRRS 백신 + 10 ㎍ 의 면역조절자) 군에서 7 마리에서 검출가능한 인터페론 역가를 가졌다.

표 35: Prime Pac - IFN 역가 - 챌린지 제공일.

요약하면, 통제된 PRRS 챌린지에서 RxII (PRRS 백신 + 50 ㎍ 의 면역조절자) 군은 PRRS 백신만을 제공받은 군 (RxIII) 의 동물들에 비해 모든 동물에서 더 높은 체중 증가, 폐에서의 더 낮은 바이러스 하중 및 검출가능한 인터페론을 가졌다. 상기 연구는 PRRS 백신이 있는 면역조절자는 PRRS 예방접종 (RxIII) 동물들에서는 관찰되지 않던 폐에서의 조기 바이러스 정화에 있어 도움이 된다는 점을 시사한다.

실시예 3: PRRS 바이러스를 이용한 실험실에서의 챌린지 전후 돼지에게 투여된 면역조절자의 단일 근육내 주사는 폐 병소를 감소시킨다.

PRRS 챌린지 제공 및 최근 이유한 돼지에서의 폐 병소를 감소시키는 면역조절자의 유효성을 결정하기 위한 연구를 수행했다. 돼지들은 연구 제 0 일에 PRRS 바이러스로 인공적으로 챌린지했다. 이 연구는 5 개의 치료군인, 4x10⁶ PRRSV (균주 NADC-20) 의 1-회 비강내 접종을 한 4 개의 챌린지 제공 군들 (군 B [연구 제 2 일에 면역조절자 투여], C [연구 제 -1 일에 면역조절자 투여], D [연구 제 0 일에 면역조절자 투여] 및 E [위약 대조군으로 5% 덱스트로스 투여]) 및 연구 제 0 일의 1 개의 허위 챌린지 제공 (군 A) 군을 평가했다. 돼지들은 연구 제 0 일에 대략 9 내지 10 주령이었다. 각 우리에서 각각의 4 개 PRRSV 챌린지 제공 군들을 나타냈다. 임상 스코어는 연구 제 -2 일부터 제 16 일까지 매일 기록했다. 돼지들은 폐 병소 평가 및 폐 세척 바이러스 단리에 의한 PRRSV 의 회복 평가를 위해 이틀의 기간 (연구 제 15 및 16 일) 에 걸친 검시를 위해 보냈다. 군 E 위약 대조군 돼지들에서의 전체 폐 엽 관여도가 평균 32.9% 인 것에 비해 군 C 및 D 에서의 면역조절자 치료 돼지들은 (각각) 통계적으로 더 낮은 (p-값이 각각 0.0095 및 0.0247) 폐 병소 스코어 (각각 9.7% 및 13.9%) 를 가졌다. 연구 기간 동안 한가지 부작용 이벤트가 보고되었으나, 조사중인 수의학 제품과는 무관한 것으로 밝혀졌다.

연구 디자인

표 36: 치료군.

표 37: 시험 시스템 요약표

차단은 기능의 분리를 통해 달성했다. 매일 관찰, 임상 스코어 제공, 총체적 및 현미경 수준의 폐 병리학 평가, 시료의 가공 또는 실험 결과의 해석에 관여된 모든 연구 인력들에게 치료군 번호 및 투여한 시험 물질 사이의 연관성에 대해 차단했다. 배정 목록 및 치료 코드 키는 연구 현장에서는 제거했으며, 연구 유효 기간 동안 후원자에 의해 유지되었다.

동물들

돼지들은 요크셔×래드레이스 ×햄프셔 잡종이었다. 돼지들은 시험 물질 투여시 9 내지 10 주령이었다. 연구 모집단의 통계자료를 하기 표 38 에 제공한다.

표 38: 연구 모집단 통계자료.

연구 제 -14 일 (2011 년 4 월 27 일) 에 n=46 의 모든 후보자 돼지들로부터 채혈한 혈청을 유효기간이 2011 년 11 월 1 일인 EXX Laboratories Herdchek PRRS 바이러스 항체 시험 키트 일련번호: 09418-LF113 을 이용하여 PRRSV 항체에 대해 분석했다. 모든 후보자 돼지들은 PRRSV 에 대해 음성으로 결정되었다.

본 연구에 포함되기 위해서는, 돼지들이 임의의 시기에 PRRS 예방접종을 제공받아서는 안되며; 생년월일, 출생지 및 PRRS 및 마이코플라스마에 대한 SPF 상태 인증을 검증할 추적가능한 기록을 갖고 있어야 하며; 연구 제 -1 일에 직장 체온이 104℉ 이고; 연구 제 -1 및 0 일에 호흡 스코어 및 우울증 스코어가 0 이어야 하며; 연구 제 -1 일에 일반적 건강 관찰에 의해 결정된 바 신체적으로 건강해야 한다.

시험 물질 투여 또는 챌린지 감염의 각 해당일에 돼지들이 하기 속성을 갖는 경우 시험 물질 투여 및 챌린지 감염에서 제외되었다: 연구 결과를 혼란스럽게 하거나 또는 연구 완료를 방해할 복잡한 손상 또는 비-표적 전신 질환에 걸림; 또는 연구 제 -1 일 및 제 0 일에 0 이 아닌 호흡 스코어.

면역조절자

본 연구에 사용된 면역조절자는 상기 실시예 1 에서 기재된 것이다.

면역조절자 치료군으로 배정한 돼지들에 2 mL 면역조절자 현탁액 및 5% 덱스트로스 물을 단일한 1 회 근육내 주사로 제공하여, 50 ㎍ 의 면역조절자 플라스미드 DNA 가 전달되도록 했다. 돼지들은 일반적 건강 관찰을 위해 매일 2 회 관찰했다.

연구 과정

모든 돼지에서 연구 제 -2, -1, 0, 2, 4, 7, 10, 14 일 및 검시일에 직장 체온을 기록했다. 직장 체온은 Welch Allyn SureTemp-plus®디지털 체온계를 이용해 수집했다.

연구 제 -14 일 (치료군 배정), 제 -7, 0, 7, 10 및 14 일에 모든 돼지에서 체중을 수득했다. 연구 제 10 일에 기록된 중량은 잃어버린 데이터 양식으로 인해 분석에서 부적합하여, 그 결과 연구 제 10 일에 대해서는 불완전한 데이터셋트를 제공하게 되었다.

본 연구를 위한 접종물은 ZMAC 세포 (돼지 폐포 거대 대식 세포) 에서 단일 패시지로부터 회수된 NADC-20 PRRSV 의 두가지 별도 원액 (Stock#31411 및 #41911) 의 모듬(pool)으로부터 제조했다. Stock # 31411 은 역가가 5X10⁶ 였으며, 후속하여 1:25 로 희석하여 2×10⁶ TCID50/ml 를 수득했다. 희석된 원액은 후속하여 본래 역가가 2×10⁶ TCID50/ml 인 Stock 41911 와 조합했다. 모은 접종물을 적가해, 1.8×10⁶ TCID50/ml 의 역가를 가진 것으로 결정되었다. 역가 결정의 위해, 접종물의 10 배씩의 일련의 희석물을 제조했으며, 웰 당 100 ㎕ 의 각 희석액을 4 배수로 플레이팅했다. 바이러스의 존재여부는 각 웰에서 관찰되는 ZMAC 세포의 아폽토시스 및/또는 세포 사멸을 근거로 하여 스코어로 제공했다. 역가는 Reed 및 Muench방법을 이용하여 산출했다.

후속하여 각각의 돼지에게 2 mL 의 1.8X10⁶ TCID50/mL PRRS 바이러스를 최종 접종물이 약 4×10⁶ TCID50/mL 의 PRRSV 가 되도록 비강내로 (콧구멍마다 1 mL 씩) 투여했다. 과정 실행을 용이하게 하고, 돼지에게 스트레스를 최소화하기 위해, 각각의 돼지는 Lomir Biomedical Inc.(Malone, NY) 사에서 판매하는 Panepinto 슬링에 두었다.

감염 성공율을 높이기 위해, 일회용 3 mL 주사기 말단에 부착되는 소아과용 점막 분무기 (Wolfe Tory Medical, Inc.사, Salt Lake City, UT 소재) 를 이용해 PPRSV 현탁액을 투여했다. 접종물은 흡입 동안 점차 증가하여 투여되었다.

혈청 바이러스혈증 수준은 연구 제 0 일 PRRSV 와 비교하여 연구 제 -2, 4, 7, 10 및 14 일에 결정되었다. 돼지 말초혈내 감염성 PRRS 바이러스의 존재여부는 혈병을 형성하는 정맥혈 시료로부터 수득된 혈청으로부터 결정되었다. 정맥혈 (5 내지 10 cc) 을 레드 탑 Vacutainer 관에 채혈하여, 혈병을 형성하도록 했다. 채혈 2 시간 이내에 혈청 (1 내지 2 cc) 을 이들로부터 수합하고, 분취하여 추가 분석시까지 -80℃ 에서 저장했다. 바이러스혈증의 결정은 RPMI-1640 중 혈청의 10 배씩의 일련의 희석물 제조로 수행했다. 희석된 혈청 시료 0.1 ml 부피를 0.1 ml 부피 중에 약 3 x 10⁴ 의 ZMAC 세포 (돼지 폐포 대식 세포) 의 현탁액을 포함하는 96-웰 조직 배양 플레이트에 3 배수로 옮겼다. 37℃ 에서 5% CO₂ 분위기 중에 3 일 배양 후, 바이러스-유도성 세포변성 유효성 여부를 스코어로 제공했다. 조직 배양 감염 투여량 50 (TCID50) 의 수치는 Reed 및 Muench의 방법을 이용해 결정했다.

폐 조직 중의 바이러스 하중은 검시시 수집된 폐 조직 시료에서 결정했다. 폐에서의 바이러스 하중은 우측 중간엽으로부터 수집된 기관지 폐포 (BAL) 액으로부터 결정했다. BAL 시료는 우측 중간엽으로 유도하도록 기관지로 위치된 카테터에 연결되어 있는 20 mL 주사기를 이용하여, 우측 중간엽으로 10 ml 의 멸균 식염수를 주입하여 수득했다. 해당 엽을 약하게 마사지한 후, 주입에 사용한 것과 동일한 주사기로 액체를 흡입해 주입된 액체를 제거했다. 약 5 ml 의 기관지액을 회수했다. 폐 조직 내 바이러스 하중의 결정은 RPMI-1640 중 BAL 액의 10 배씩의 일련의 희석물 제조로 달성되었다. 0.1 ml 부피의 희석된 혈청 시료를 0.1 ml 부피 중의 3 x 10⁴ 의 돼지 폐포 대식 세포의 현탁액을 포함하는 96-웰 조직 배양 플레이트에 3 배수로 옮겼다. 37℃ 에서 5% CO₂ 분위기 중 3 일 배양 후, 바이러스-유도성 세포변성 유효성 여부를 스코어로 제공했다. TCID50 는 Reed 및 Muench의 방법을 이용해 결정했다.

검시 시, 폐를 흉강으로부터 떼어냈고, 촬영했으며 (각 사진에서 돼지 귀 태그가 있는 등쪽 및 배쪽 측면 제공), 상주하는 수의학 병리학자가 Halbur 등의 문헌 (1995) 에 기재되어 있는 스코어 제공 시스템을 바탕으로 총체적 병소를 스코어로 제공했다. 간략하게, 5 점 (5.0) 인 잠재적 지점이 전엽, 중간엽 및 부속엽의 등쪽 및 배쪽 측면 각각에 지정되었다. 15 점 (15.0) 은 등쪽 하부엽 (dorsal caudal lobe) 에 지정되었고, 12 반 점 (12.5) 은 하부엽의 배쪽 측면에 지정되었다. 각 폐 엽 (폐의 등쪽 및 배쪽 측면) 을 관찰하고, 전체 병소로 영향을 받은 폐의 추산되는 백분율은 후원사 제공 데이터 캡쳐 형태로 문서화되었다. 최종 병소 스코어는 해당 엽에 대한 최대 스코어에 영향받는 엽의 백분율을 곱해 각 엽에 지정되었다. 예를 들어, 20% 의 등쪽 하부 엽에서 병소가 관찰된 경우, 해당 엽에 대한 병소 스코어는 하기와 같이 산출되었다: (20*15)/100 = 병소 스코어가 3 임.

폐 조직 단편에서 현미경 수준으로 병소를 평가하기 위해, 약 1 cm 두께 x 5 cm 길이 x 5 cm 너비 시료를 각각의 폐로부터 취했다 (도 22 참조):

a) 좌측 앞쪽 엽의 앞부분,

b) 좌측 앞쪽 엽의 뒷부분, 및

c) 좌측 뒤쪽 엽의 앞부분.

시료를 10% 중성 완충 포르말린 중에 48 시간 이상 동안 고정시킨 후, 자동화된 조직 가공기에서 파라핀 내에 가공하여 포매했다. 3 내지 5 ㎛ 두께 단편을 절단해, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색했다. 조직 가공 (파라핀 포매, 단편화 및 염색) 은 Histology laboratory of the University of Illinois Veterinary Diagnostic Laboratory 에서 실시했다.

폐 단편을 시험하여, 하기의 4 가지 기준으로 바탕으로 간질성 폐렴의 중증도를 추산하는 스코어를 제공했다:

A. 폐포 격벽 비대: 0 - 비대화 없음 (정상); 1 - 약함 (상대적); 2 - 경증 (상대적); 3 - 중증 (상대적)

B. 폐포 격벽 비대의 분포: 0 - 병변 없음 (정상); 1 - 초점 격벽 비대; 2- 다초점 격벽 비대; 3 -격벽 비대 확산

C. 기관지 관련 림프 조직 (BALT) 발생: 0 - 정상적 BALT 에서 최소 세포; 1 - 갯수 약간 증가; 2 - 갯수 보통 증가; 3-갯수 심히 증가.

D. 기도에서 염증의 증거: 0 - 없음; 1 - 약함; 2 - 보통; 3 - 심함.

정맥혈 (8-10 mL) 을 실험 제 -2, 4, 7 및 14 일에 Vacutainer 관 (소듐 헤파린) 을 이용하는 혈관천공 (venipuncture) 으로 연구 동물들로부터 수득했다. 말초혈 단핵 세포들은 Ficoll-Hypaqe1077 을 이용한 밀도 원심분리로 채혈 후 4 시간 이내에 상기 시료로부터 단리했다. 단리된 세포들은 10% 우태아 혈청을 보충한 RPMI-1640 배지에 현탁시켰다. 세포들은 임의의 외인성 자극제 없이 (싸이토카인의 자발적 생산을 측정하기 위함) 또는 CpG-포함하여 존재하는, 타입 A 올리고뉴클레오티드 (ODN) 인, 2 ㎍/mL 의 톨형 (toll-like) 수용체 9 (TLR9) 아고니스트 ODN D19 (Qiagen 사, Valencia, CA) 의 존재 하에 인큐베이션했다. 후속하여, 추가 사용시까지 배양 및 냉동의 16 시간 후 세포 배양 상청액을 수집했다. 결과로서 수득한 배양 상청액 중의 IFN-α 의 양은 선행기술 (Calzada-Nova 등, 2010) 에서 기재한 특별한 ELISA 를 이용해 결정했다.

통계적 방법

질환 모델의 평가는 두 대조군 사이의 총체적 폐 및 마이크로 폐 데이터를 분석하는 것으로 이루어진다. 통계적으로 유의한 차이는 챌린지 비제공 엄격 대조군과 비교해 챌린지 제공 대조군은 적합한 질환을 나타냄을 보여주기 위해 필요했다. 총체적 폐 스코어 (각 엽의 총합) 는 군 유효성에 대한 변량 분석을 이용해 비교되었다. 각각의 세 (3) 마이크로 폐 스코어 (폐포 격벽 비대, 기도 염증 및 BALT 발생) 를 무-파라미터 Wilcoxon Ranked Sum 시험을 이용해 비교했다. 상기 모델 검증이 충족되는 한, 나머지 분석들은 군 2 내지 5 (챌린지 제공 대조군 및 면역조절자 군) 을 포함했다.

반복적 측정값 (즉, IFN-α) 이 있는 데이터는 변수의 반복적 측정 분석을 이용해 분석했으며, 이용가능한 곳에 기준선 공변량을 포함했다. 최소 AIC 결과가 있는 공변량 구조를 이용했다. 필요에 따라 더욱 근접한 근사값 정규 데이터 분포에 대한 아크 싸인 변환을 적용했다.

단일 종결점이 있는 데이터 (총체적 폐 스코어) 는 변량 분석으로 분석했다. 상기 모든 모델들은 모델의 인자로서 우리를 포함했다. 마이크로 폐 (격벽, 기도 및 BALT) 스코어는 무-파라미터 Wilcoxin Ranked Sum 시험을 이용해 분석했다. 모든 분석은 SAS 9.2 를 이용해 수행했으며, 유의한 유효성을 구분하기 위해서는 0.1 의 알파를 이용했다.

결과

총체적 및 마이크로 폐 스코어는 모두, 엄격한 대조군 대 챌린지 제공 대조군 비교시 유의한 치료 유효성을 나타냈다 (전체, 격벽, 기도 및 BALT 각각에 대해 p-값이 0.0015, 0.0037, 0.0249 및 0.0010). 따라서, 질환 모델 검증에 충족되었다.

각 동물에 대한 총합 전체 엽 스코어로 나타내는 총체적 폐 병리학은 도 24 에 제시된 바와 같이 대조군 및 각각의 면역조절자 군 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타냈다 (면역조절자 제 -1 일, 면역조절자 제 0 일 및 면역조절자 제 2 일 각각에 대해 p-값이 0.0095, 0.0247 및 0.0736). 마이크로 폐 전체 병리학 스코어는 치료군 사이의 임의의 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다 (격벽, 기도 및 BALT 조직에 대해 0.8786, 0.5788 및 0.5865).

도 25 에 제시된 IFN-α 결과는 임의의 연구일에서 임의의 통계적으로 유의한 차이를 제공하지 않았다(전체 치료 유효성은 0.1653 였다).

토의 및 결론

총체적 폐 병소 스코어는 본 연구에서 위약 대조군 동물들에 비해 각각의 치료군에서 유의하게 감소되었다. 그러한 데이터를 근거로, 면역조절자는 여타 바이러스 또는 박테리아 병원체에 대한 노출이 제한된 최근 이유한 건강한 돼지들에서 폐 병소 스코어를 감소시킬 수 있다: 달리 말하면, PRRSV-만의 호흡 챌린지 제공.

인터페론 수준은 PRRSV 챌린지의 측면에서 예측되는 바와 같이 동요되었다. IFN-α 수준의 억제는 PRRSV 감염의 전형적인 후유증이며, IFN-α 수준이 연구 제 -2 일에 비해 연구 제 4 및 7 일째에 수집된 시료에서 현격히 감소된 본 연구에서 분명했다. 면역조절자는 임의의 수집 기간에서 IFN-α 수준에서의 유의한 차이를 제공하지 않았다. 그러나, 아주 흥미로운 점은 연구 제 -1 일에 면역조절자로 치료된 돼지들 (군 C) 및 제 0 일에 치료된 돼지들 (군 D) 로부터 연구 제 14 일에 수집된 대식 세포의 IFN-α 생산에 있어 거의 2 배 증가한 것이다. 그러한 데이터는, 아마도 TLR9 신호전달 이벤트의 후속 활성화에 이은 더 높은 수준의 IFN-α 를 생산하는 상주 대식 세포의 능력 강화에 의해, 면역조절자가 폐에서 점화 효과를 제공할 수 있다는 점을 시사한다. 그러한 관찰사실은 돼지를 면역조절자로 제 -14 일에 치료한 후, 아마도 다시 챌린지 제공 전 제 -1 일에 치료하는 2 회 치료 PRRSV 모델에서 추가적인 탐구를 보장할 수 있을 것이다.

PRRS 바이러스혈증에서의 통계적으로 유의한 감소는 면역조절자 치료 군에서는 관찰되지 않았다. 그러나, 제 7 일에, 제 -1 일 치료군에서, 혈청 바이러스혈증에서 두드러지나 유의하지는 않은 감소가 있었다. 도 23 에 제시된 바이러스 폐 하중은 위약 처리 돼지들에 비해 두 연구에서 모두 하나를 제외한 전체 면역조절자 치료군에서 산술적으로 감소되었다; 그러나 그러한 감소는 통계적으로 유의하지는 않았다. 면역조절자 투여가 바이러스 폐 하중 또는 바이러스혈증을 강화한다는 증거 또는 조짐이 없다. 상기 후자 진술은 고농도 IFN-α 에서 돼지 말초혈 단핵세포의 시험관내 인큐베이션이 PRRSV 흡수를 강화한다는 문헌들에서 보고되었던 선행기술 관찰사실과 상반된다. 본 연구에서는 면역조절자가 PRRSV 혈청 바이러스혈증 또는 폐 하중을 강화한다는 조짐이 없다.

실시예 4: PRRS 바이러스의 NACD.2-균주를 이용한 실험실에서의 챌린지 제공 하루 전에 돼지에 대한 단일 근육내 주사로서 투여된 면역조절자의 긍정적 영향.

생장 중인 돼지에서 면역조절자의 투여량을 적정하기 위한 연구가 수행되었다. 연구 제 0 일에 5 개의 치료군, 4 개의 PRRS 바이러스-챌린지 제공 군 (2 mL 의 5.38×10⁵ TCID50 PRRSV (균주 NADC-20) 현탁액을 1 회 비강내 투여한 군 A [연구 제 -1 일에 50 ㎍ 면역조절자 투여)], B [연구 제 -1 일에 5% 덱스트로스 물 투여], C [연구 제 -1 일에 75 ㎍ 의 면역조절자 투여] 및 D [연구 제 -1 일에 25 ㎍ 의 면역조절자 투여]), 및 1 개의 허위 챌린지 제공 군 (군 E - 엄격한 대조군) 을 평가했다. 돼지들은 연구 제 0 일에 대략 7.5 내지 8.5 주령이었다. 돼지를 8 마리씩 6 개의 우리에서 (3 개의 우리가 한 모둠이고, 인접 모둠에 3 개의 우리) 기거하도록 하고, 제 3 모둠에서는 8 마리의 엄격한 대조군 돼지들의 우리 1 개에 두어, 각 면역조절자 치료 군은 각 우리에서 2 마리씩의 돼지로 대표되었다.

결과는 p-값이 0.10 이면 통계적으로 유의한 것으로 간주했다. 유의한 치료 영향은 연구 제 12 일의 호흡 스코어에 대해 관찰되었다 (p-값이 0.0719). 연구 제 3, 4, 6, 7 및 12 일에서의 대조군 (군 B) 대 각각의 면역조절자 군 사이의 짝을 이룬 비교에서, 연구 제 7 일의 대조군 (p-값이 0.0902) 과 비교해 유의하게 더 큰 (더욱 무기력함) 태도 스코어가 면역조절자 50 pg 치료 군에서 관찰되었다. 역으로, 유의하게 더 낮은 (정상에 근접) 태도 스코어는 연구 제 12 일 (p-값이 0.0932) 과 비교해 면역조절자 75 ㎍ 치료 군에서 관찰되었다. 각 날짜에 각각의 면역조절자 군들과의 짝을 이룬 대조군 비교는 25 ㎍ (제 4 및 7 일) 및 75 ㎍ (오직 제 7 일) 의 투여량으로 투여된 면역조절자에 대한 유의하게 더 낮은 혈청 바이러스혈증, 및 50 ㎍ 투여량을 투여한 연구 제 14 일의 유의하게 더 높은 혈청 바이러스혈증을 결과로서 제공했다. 그러나, 오직 25 ㎍ 군 및 75 ㎍ 군에 대한 연구 제 7 일에 관찰된 감소만이 임상적으로 관련성이 있는 것으로 간주되는데, 이는 25 ㎍ 군에서 제 4 일에 관찰된 형질전환 바이러스혈증 카운트 사이의 차이가 28 대 18 뿐이기 때문이다. 총체적 또는 현미경 수준의 폐 병소, 임상 스코어, 바이러스 폐 하중, 체중, 체온 또는 체중 대 폐 중량 비율에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 본 연구에서는 한가지 부작용 이벤트가 보고되었으며, 조사중인 수의학 제품과는 무관한 것으로 결정되었다.

본 연구의 목적은 25 ㎍, 50 ㎍ 또는 75 ㎍ 의 면역조절자를 최근 이유한 돼지에게 PRRSV 의 NADC-20 균주로 연구 제 0 일에 실험실에서 챌린지 제공하기 1 일 전 (연구 제 -1 일) 에 단일 근육내 주사를 투여함으로써 면역조절자의 투여량을 적가하기 위한 것이었다. 면역조절자의 유효성은 위약 치료 PPRSV 챌린지 제공 돼지와 비교했다.

효능에 대한 일차적 응답 변수는 태도 및 호흡에 대한 매일 임상 스코어 (연구 제 -2 일부터 연구 제 14 일까지), 혈청 바이러스혈증 (연구 제 -2, 4, 7, 10 일 및 검시일), 검시일의 총체적 및 현미경 수준의 폐 병리학 및 폐 바이러스혈증 (PRRSV 챌린지 제공 후 제 14 또는 15 일[±1d]) 이다. 체온 (연구 제 -2, -1, 0, 4, 7, 10 일 및 검시일) 및 체중 (연구 제 0, 7, 10 일 및 제 14 일) 은 효능의 부차적 및 간접적 측정치로 기록했다. 체중은 돼지들을 치료군 및 우리에 배정하기 위해 연구 제 7 일 (2011 년 6 월 7 일) 에 수집했다.

연구 디자인

이는 이용된 시판 공급 최근 이유 돼지들이 PRRSV 및 미코플라스마 효프뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae) 에 대해 혈청-음성임을 확인하기 위한 실험 챌린지 연구이다. 치료군의 목록을 하기 표 40 및 표 41 에 제공한다.

표 40: 치료군.

표 41: 이벤트의 스케쥴.

표 42: 시험 시스템 개요 표

차단은 기능의 분리를 통해 실행했다. 매일 관찰, 임상 스코어 제공, 총체적 및 현미경 수준의 폐 병리학 평가, 시료 가공 또는 실험 결과 해석에 관여하는 임의의 연구 인력들은 치료군 번호 및 투여되는 시험 물질 사이의 연관성에 대해 차단시켰다. 배정 목록 및 치료 코드 키는 연구 현장에서는 제거했고, 연구 유효기간 동안 후원자에 의해 유지되었다.

돼지들은 Excel 에서 RAND() 함수를 이용해 최고 체중부터 최저 체중까지 연속하여 체중 내림차로 분류하여 차단했고, 성별은 고려하지 않았다.

동물

본 연구에 이용한 돼지들은 PRRSV 예방접종을 전혀 하지 않았고, PRV 단계가 없으며, 브루셀라 계열이 없는 상태의 무리인 단일 시판 돼지 농장 출신이었다. 돼지들은 확인된 PRRSV 및 미코플라스마 효뉴모니애 혈청-음성이었다. ELISA 결과는 본 연구 파일에서 유지되었다.

본 연구에 포함되기 위해서는, 돼지가 임의의 시기에 PRRSV 예방접종을 받은 바 없어야 하며; 대락적인 연령, 출신 농장 및 PRRSV 상태를 입증할 추적가능한 기록은 갖고 있어야 하며; 연구 제 -1 일에는 -105℉ 의 직장 체온은 갖고 있어야 하고; 연구 제 -1 일 및 제 0 일에 0 의 호흡 스코어 및 우울 스코어를 갖고 있어야 하며; 제 -1 일 및 제 0 일에 일반적 건강 관찰로 결정되는 바 신체적으로 건강해야 한다.

면역조절자

본 연구에 사용한 면역조절자는 실시예 1 에서 상기 기재된 동일한 면역조절자이다.

표 43: 시험 물질 제조를 위한 희석 단계.

면역조절자 치료군으로 배정된 돼지들에게 면역조절자 및 5% 덱스트로스 물의 2 mL 현탁액을 단일 1-회 근육내 주사를 제공하여 25, 50 또는 75 ㎍ 의 면역조절자 플라스미드 DNA 를 전달했다. 돼지들은 일반적인 건강 관찰을 위해 매일 2 회 관찰했으며, 특별하게는 호흡 및 태도와 관련된 임상 스코어의 평가 및 기록을 위해 1 일 1 회 관찰했다.

연구 과정

연구 제 -2 일에 시작하여, 제 -1 일 (투여량 투여 전), 제 0 일 (챌린지 제공 전), 제 2, 4, 7, 10 일 (검시 전), 및 검시일에 각각의 참여한 돼지에 대해 체온을 직장에서 결정했다. 돼지의 체중은 연구 제 -7 일 (치료 및 우리 배정을 위해), 제 0, 7, 10 및 14 일에 수득했다.

NADC (National Animal Disease Center) - 20 PRRS 바이러스는 본래 비정형 PRRS 낙태급습에서 낙태되고, 1996 년도 진단 조사의 일환으로 안락사된 암퇘지 (NO 35358) 유래의 간 조직으로 접종된 MARC-145 세포에서 단리되었다. 단리물은 미국 아이오와주 에임즈시의 NADC 에서 유지되고 있다.

후속하여 각각의 돼지들에게 2 mL 의 5.38 X10⁵ TCID50/ml 현탁액을 비강내로 (콧구멍마다 1 mL 씩) 투여했다. 감염 성공율을 높이기 위해, PRRSV 현탁액을 일회용 3.0 mL 주사기의 말단에 부착된 소아과용 점막 분무기 (Wolfe Tory Medical, Inc.Salt Lake City, UT) 를 이용하여 투여했다. 접종물은 흡입 동안 점차 증가하여 투여되었다.

감염성 PRRS 바이러스 하중의 정량적 평가는 모든 돼지들에 대해 연구 제 -2, 4, 7, 10 일 및 검시일에 하기 과정에 따라 바이러스 단리 (VI) 에 의해 결정되었다.

바이러스혈증의 결정은 혈청을 2% 말 혈청, 1x 항생제/항진균제, 및 1x L-글루타민을 함유하는 MEM 배지 중의 혈청을 10 배씩의 일련의 희석물을 제조하여 달성했다. 0.2 ml 부피의 희석된 혈청 시료를 미리 시딩된 Marc-145 세포를 포함하고 있는 96-웰 조직 배양 플레이트에 3 개씩 옮겼다. 37℃ 에서 5% CO₂ 분위기 중 배양 4 일 후, 바이러스의 존재여부를 PRRSV 모노클로날 항체 SDOW-17-F 를 이용하는 면역형광 검정 (IFA) 에서 결정했다. TCID50 은 Spearman-Karber 방법을 이용해 산출했다.

폐 조직 중의 바이러스 하중은 검시시 수집한 폐 조직 시료에서 결정했다. 폐 중의 바이러스 하중은 우측 중간엽에서 수집한 기관지 폐포 (BAL) 액으로부터 결정했다. 시료 유래의 바이러스의 정량을 수행했다.

검시 시, 폐를 흉강으로부터 떼어냈고, 촬영했으며 (각 사진에서 포착된 돼지 귀 태그가 있는 등쪽 및 배쪽 측면 제공), 병리학자는 Halbur 등의 문헌 (1995) 에 기재되어 있는 스코어 제공 시스템을 바탕으로 총체적 병소를 스코어로 제공했다. 간략하게, 5 점 (5.0) 인 잠재적 지점이 전엽, 중간염 및 부속엽의 등쪽 및 배쪽 측면 각각에 지정되었다. 15 점 (15.0) 은 등쪽 하부엽 (dorsal caudal lobe) 에 지정되었고, 12 반 점 (12.5) 은 하부엽의 배쪽 측면에 지정되었다.

각 폐 엽 (폐의 등쪽 및 배쪽 측면) 을 관찰하고, 전체 병소로 영향을 받은 폐의 추산되는 백분율은 후원자 제공 데이터 캡쳐 형태로 문서화되었다. 후원자는 해당 엽에 대한 최대 스코어에 영향받은 엽의 백분율을 곱해 각 엽에 최종 병소 스코어를 지정했다. 예를 들어, 20% 의 등쪽 하부 엽에서 병소가 관찰된 경우, 해당 엽에 대한 병소 스코어는 하기와 같이 산출되었다: (20*15)/100 = 병소 스코어가 3 임.

폐 조직 단편에서 현미경 수준의 병소를 평가하기 위해, 약 1 cm 두께 x 5 cm 길이 x 5 cm 너비 시료를 각 폐로부터 취했다 (도 22):

a) 좌측 앞쪽 엽의 앞부분,

b) 좌측 앞쪽 엽의 뒷부분 및

c) 좌측 뒤쪽 엽의 앞부분.

시료들은 48 시간 이상 10% 중성 완충 포르말린에서 고정시키 후, 자동화된 조직 가공기에서 가공하여 파라핀 내에 포매했다.

폐 단편은 하기 네가지 기준을 근거로 시험해 간질성 폐렴의 어림되는 중증도 스코어를 제공했다:

A. 폐포 격벽 비대: 0 - 비대화 없음 (정상); 1 - 약함 (상대적); 2 - 경증 (상대적); 3 - 중증 (상대적)

B. 폐포 격벽 비대의 분포: 0 - 병변 없음 (정상); 1 - 초점 격벽 비대; 2- 다초점 격벽 비대; 3 - 격벽 비대 확산

C. BALT 발생: 0 - 최소 세포 내지 정상 BALT; 1 - 갯수가 미약하게 증가; 2 - 갯수가 약하게 증가; 3 - 갯수가 심하게 증가.

D. 기도에서의 염증의 증거: 0 - 없음; 1 - 미약함; 2 - 약함; 3- 심함.

모든 돼지들은 연구 제 -2 일부터 연구 제 14 일까지 매일 1 회 관찰하여 호흡 및 태도에 대한 스코어를 제공했다.

표 44: 스코어 제공 기준.

통계적 방법

질환 모델의 평가는 두 대조군 사이의 총체적 폐 및 마이크로 폐 데이터를 분석하는 것으로 이루어진다. 통계적으로 유의한 차이는 챌린지 비제공 엄격 대조군과 비교해 챌린지 제공 대조군이 적합한 질환을 나타냄을 보여주기 위해 필요했다. 총체적 폐 스코어 (각 엽의 총합) 는 군 유효성에 대한 변량 분석을 이용해 비교되었다. 각각의 네 (4) 마이크로 폐 스코어 (폐포 격벽 비대, 격벽의 분포) 비대화, 기도 염증 및 BALT 발생) 를 무-파라미터 Wilcoxon Ranked Sum 시험을 이용해 비교했다.

상기 모델 검증이 충족되는 한, 나머지 분석들은 군 2 내지 5 (챌린지 제공 대조군 및 면역조절자 치료 군) 을 포함했다.

임상 스코어 (호흡 및 태도 스코어) 는 Fisher's Exact 시험에 의해 각각의 연구일에 대해 분석했다. 전체적 치료 군 유효성이 임의의 한 날짜에 유효한 경우, 해당 날짜에 대해서는 대조군 대 각 면역조절자 군 (3 개의 비교) 사이의 짝을 이룬 비교들을 수행했다.

반복적 측정값 (혈청 바이러스혈증, 체중, 체온) 이 있는 데이터는 변수의 반복적 측정 분석을 이용해 분석했으며, 이용가능한 곳에 기준선 공변량을 포함했다. 최소 AIC 결과가 있는 공변량 구조를 이용했다. 필요에 따라 더욱 근접한 근사값 정규 데이터 분포에 대한 아크 싸인 변환을 적용했다.

단일 종결점이 있는 데이터 (총체적 폐 스코어, 폐 바이러스혈증 (BAL) 및 체중 대 폐 중량 비율) 는 변량 분석으로 분석했다. 상기 모든 모델들은 모델의 인자로서 우리를 포함했고, 적절한 곳에 종속 변수의 변환을 포함했다.

마이크로 폐 (격벽, D-격벽 및 BALT) 스코어는 무-파라미터 Wilcoxon Ranked Sum 시험을 이용해 분석했다.

모든 분석은 SAS 9.2 을 이용해 수행했으며, 0.1 의 알파를 유의한 유효성 구분에 이용했다.

결과

총체적 및 마이크로 폐 스코어가 모두 엄격한 대조군을 챌린지 제공 대조군과 비교시 유의한 치료 유효성을 나타냈다 (총체적, 격벽, 격벽 분포, 기도 및 BALT 에 대해 각각 p-값이 0.0021, 0.0038, 0.0631, 0.0001 및 0.0016). 따라서, 질환 모델 검증이 충족되었다.

호흡 스코어는 연구 제 12 일 (p-값이 0.0719) 에만 유의한 치료군 차이를 나타냈다. 여타 연구일에 대해서는, 호흡 스코어가 유의한 치료 군 차이를 제공하지 않았다 (p-값이 0.1202 이상). 연구 제 12 일의 대조군 대 각각의 면역조절자 군 사이의 짝을 이룬 비교 (3 개의 비교) 는 유의한 짝을 이룬 치료 차이를 보여주지 않았다 (p-값이 0.2174 이상).

태도 스코어는 제 3, 4, 6, 7, 및 12 일에 유의한 치료군 차이를 나타냈다 (p-값이 각각 0.0349, 0.0831, 0.0349, 0.0073, 0.0699). 여타 연구일에 대해서는, 호흡 스코어가 유의한 치료군 차이를 제공하지 않았다 (p-값이 0.1960 이상). 연구 제 3, 4, 6, 7 및 12 일의 대조군 대 각각의 면역조절자 치료 군 사이의 짝을 이룬 비교. 면역조절자 50 ㎍ 치료군에 대해서는 연구 제 7 일의 대조군에 비해 유의하게 더 큰 태도 스코어가 관찰되었다 (p-값이 0.0902). 역으로, 연구 제 12 일에는 면역조절자 75 ㎍ 치료 군에서 유의하게 더 낮은 태도 스코어가 관찰되었다 (p-값이 0.0932).

도 26 에 제시된 바와 같이 혈청 바이러스혈증 데이터는 통계적으로 유의한 치료 × 일별 상호작용 (p=0.0797) 을 제공했다. 각각의 날짜에 대한 각 면역조절자 군들과의 짝을 이룬 대조군 비교는 면역조절자 25 ㎍ (제 4 및 7 일) 및 면역조절자 75 ㎍ (오직 제 7 일) 에 대한 유의하게 더 낮은 혈청 바이러스혈증 및 연구 제 14 일의 면역조절자 50 ㎍ 에 대한 유의하게 더 높은 혈청 바이러스혈증을 결과로 제공했다.

총체적 폐 병리학 (각 동물에 대해 총합 전체 엽 스코어로 나타냄) 은 통계적으로 유의한 치료군 차이를 나타내지 않았다 (전체적 치료 유효성이 0.8685 였음).

도 28 에 제시된 마이크로 폐 총계 병리학 스코어는 치료군들 사이에서 임의의 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다 (격벽, 기도 및 BALT 조직에 대한 p-값이 0.6726, 0.2801 및 0.2901). 총계 분포 격벽 비대화 스코어는 유의한 치료 차이를 보여줬다 (p-값이 0.0075). 대조군 대 각 면역조절자 군 사이의 짝을 이룬 비교에 대해, 유의한 차이는 대조군 및 면역조절자 75 ㎍ 군 사이에서만 관찰되었다 (p-값 = 0.0043).

논의 및 결론

위약 챌린지 제공 군에 비해 연구 제 7 일째의 면역조절자 치료군 전부에서 기하 평균 혈청 바이러스혈증이 대폭 감소되었다. 또한, 도 27 에 제시된 바와 같이, 위약 치료 챌린지 제공 돼지들에 비해 25 ㎍ 및 50 ㎍ 치료 돼지들에서 평균 바이러스 폐 하중이 눈에 띄게 더 낮았다. 유사한 결과가 또다른 연구에서도 관찰되어, 평균 바이러스 폐 하중이 면역조절자 치료 돼지에서 현격한 감소를 나타냈다. PRRSV 폐 하중 감소에 있어서 면역조절자가 측정가능한 수준의 효능을 제공하고 있음이 명백하다.

실시예 5. 신생아 아기돼지에서의 대장균 챌린지 모델에서의 면역조절자 조성물의 효능.

본 연구는 병원성 대장균 (Escherichia coli) K88 챌린지에 의한 질병에 취약한 신생아 아기돼지에서의 면역조절자 조성물의 효능을 평가하기 위해 수행되었다. 본 연구에서의 모든 암퇘지는 그들의 배설물 시료에서 대장균 K88 에 대해 음성이었다. 치료 관련한 부작용 이벤트가 보고된 바 없었다. 본 연구에서의 분만 후 수 시간 내에 모든 아기돼지들에게 챌린지 제공했다. 암퇘지 4009, 2694, 10040, 4001, 및 2088 유래의 아기돼지들을 대장균 배양 회분 1 로 챌린지 제공했다. 암퇘지 2082, 217 및 215 유래의 아기돼지들은 대장균 배양 회분 2 로 챌린지 제공했다.

32 마리의 아기돼지들이 연구 동안 검시되었다. 31 마리 돼지에 대한 폐사 또는 조기 종료의 원인은 대장균증이었다. 아기돼지 한마리 (305 T2) 는 암퇘지와 두자 폐사한 채 발견되었다. 한 마리 (331 T1) 를 제외하고, 모든 돼지들은 대장균증 체중 손실로 폐사하거나 또는 안락사되었다 (31 마리 돼지). 연구 기간 동안 생존한 모든 아기돼지들 (37 마리 돼지) 은 체중이 증가했다. 체중 증체는 240 내지 1,540 그램의 범위였다. 암퇘지 2088 에서 출생한 아기돼지들은 여타 암퇘지에서 출생한 아기돼지들과 비교해 임상적 징후를 갖지 않았다. 오직 2 마리의 아기돼지 (342 T1 및 336 T3) 가 한 번의 관찰에서 배설물 스코어가 2 였다. 해당 암퇘지 유래의 아기돼지들을 포함하거나 또는 포함하지 않고 분석을 수행했다. 식염수를 처리했던 23 마리 중 13 마리 (57%) 돼지가 대장균증으로 인해 폐사했다. 면역조절자 조성물 1X 로 치료했던 22 마리 중 9 마리 (41%) 돼지가 대장균증으로 인해 폐사했다. 면역조절자 조성물 5X 로 치료한 23 마리 중 9 마리 (39%) 가 대장균증으로 인해 폐사했다. 한 암퇘지 (2088) 유래의 아기돼지들을 배제하고 하기와 같이 분석했다: 식염수를 처리했던 20 마리 중 13 마리 (65%) 의 돼지가 대장균증으로 인해 폐사했다. 면역조절자 조성물 1X 로 치료했던 19 마리 중 9 마리 (53%) 돼지가 대장균증으로 인해 폐사했다.

IC-Ex.1 5X 로 치료한 20 마리 중 9 마리 (45%) 돼지가 대장균증으로 인해 폐사했다. 대장균 균주 MVS #2 는 출생시 챌린지 제공한 병에 취약한 신생아 아기돼지에서 폐사, 임상적 징후 및 설사를 유발할 수 있었다. 아기돼지들을 면역조절자 조성물로 치료하는 것은 대조군에 비해 모든 치료군 (1X 및 5X) 에서 폐사를 수치적으로 감소시켰으나, 통계적으로는 상이하지 않았다.

재료 및 방법

시험 동물. 농촌인 네브라스카 웨스트포인트 소재 Klitz 농장이 소유한 Nine Hermitage maternal lines - classic hybrid^TM 임신 암퇘지를 시험하여, 그들의 변에서 대장균 K88 에 대해 음성임을 확인했다. 8 마리의 임신한 암퇘지를 구매하여, Klitz 농장 시설 내의 분만사 유닛 4 로 이동시켰다. 암퇘지에게 대장균 K88 예방접종을 제공하지 않았으며, 분만 전 30 일 이상 동안 항미생물제를 제공하지 않았다. 한 배에서 태어난 8 마리의 신생아 아기돼지가 연구에 편입되었다. 암퇘지 및 아기돼지들은 임상적 데이터에 방해가 될 질환을 갖고 있지 않았다.

동물 사료 및 물. 암퇘지들은 피더를 통해 포유 배급에 자유롭게 접근하여 제공받게 했으며, 자동 급수기 (automatic waterer) 를 통해 물에 자유롭게 접근하도록 했다. 급수기 및 피더는 매일 체크하여 필요하면 청결하게 했다. 아기돼지에 대한 사료의 유일한 공급원은 암퇘지로부터의 유즙 (수유) 이였다.

수반되는 의약제공. 나트륨 모넨신 (Sodium monensin) 혼합 사료를 암퇘지에 투여했다.

거주. 암퇘지를 분만사 유닛 4 에서 기거하도록 했다. 연구 동안, 동물들을 매일 약 12 시간 동안 빛, 70℉ 내지 73℉ 의 고온 및 저온 범위, 및 49 내지 69% 의 범위의 습도에 노출시켰다. 73℉ 및 49 내지 69% 의 범위의 습도.

연구 디자인 개요.

치료군의 상세사항은 표 52 에 수록했다. 연구에는 아기돼지의 군 3 개가 있었다. 군 T1, T2 및 T3 에서의 아기돼지들은 각각 식염수, IC-Ex.1 1X 및 5X 를 제공받았다. 연구 중인 모든 아기돼지들에게는 근육내 경로를 통해 2 mL 의 적절한 시험 물질을 주사했다.

K88 선모 항원에 대한 시험. 임신한 암퇘지 유래의 배설물 시료를 수집하여 실험실로 옮겨왔다. 시료를 희석하고, MacConkey 아가 플레이트에 도말하고, 약 37℃ 에서 밤새 인큐베이션했다. 대장균형 콜로니는 플레이트로부터 선별해, 대장균 K88 선모에 특이적인 항원 (Abcam Scientifics) 을 이용해 혈구응집 시험에서 시험했다. 연구용으로 선별 및 구입한 임신한 암퇘지는 K88 선모인 대장균에 음성이었다.

무작위화 및 배정. 각각의 암퇘지는 분만하여 7 내지 12 마리의 아기돼지를 제공했다. 아기돼지들은 이중의 독특한 귀 태그로 식별했다. 같은 배에서 출생한 것에서는, 아기돼지들을 체중을 내림차순으로 순서를 매겨, 앞에서 6 번째 (한 암퇘지가 7 마리 아기돼지를 분만) 또는 9 번째 (7 마리 암퇘지는 10 내지 12 마리의 아기돼지를 분만) 순위의 아기돼지까지를 연구에 포함시켰다. 각각의 한 배에 난 아기돼지들 중 본 연구에 포함되는 아기돼지들은 3 개의 치료군 중 하나에 무작위로 배정했다 (표 52). 69 마리의 아기돼지들이 본 연구에 포함되었다.

챌린지 배양 제조. 2 개 뱃치의 챌린지 배양을 제조했다. 각각의 뱃치에 대해, 대장균 K-88 단리물 (MVS #2, 4 번째 계대) 의 바이알 1 개를 초저온 냉동고에서 꺼내 실온에서 해동했다. 대장균 K-88 배양을 루프로 한 번 바이알에서 꺼내, 5% 양 혈액 아가 (BA) 플레이트에 도말했다. BA 플레이트를 밤새 37℃ 에서 5% CO₂ 인큐베이터 중에 인큐베이션했다. BA 플레이트 상의 콜로니를 순도 및 베타 용혈 구역에 대해 관찰했다. BA 플레이트 유래의 5 개의 베타 용혈 플레이트를 집어내어, 10 mL 의 예비승온 트립신 대두 브로쓰 (Tryptic Soy broth) (TSB) 를 포함하는 관에 옮겨, 여러번 피펫으로 분산시켜 균일한 현탁액을 형성했다. 현탁액을 200 mL 의 예비가온 TSB 를 포함하는 플라스크에 옮겼다. 플라스크를 약 6 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 배양액을 600 nm 에서의 광학 밀도 (OD) 에 대해 시험했다. 뱃치 1 및 2 배양에 대한 OD 는 각각 1.16 및 1.12 였다. 배양액을 0.85 OD 로 희석시키고, 뱃치 1 및 2 로 각각 500 mL 및 450 mL 씩 챌린지 제공을 위한 분만사 유닛 4 로 옮겼다.

챌린지 과정. 아기돼지들은 대략 챌린지 제공 1 시간 전 및 1 시간 후 (총 2 시간) 암퇘지로부터 분리했다. 연구 중인 모든 아기돼지들은 5 mL 의 제조 챌린지 배양으로 경구로 챌린지 제공했다.

시험 재료.

식염수: 유효기간이 2013 년 9 월인 식염수 롯트 번호 A110901-3 를 Vedco 사에서 구매했다. 각 100 mL 의 식염수는 0.9 g 의 소듐 클로라이드 및 주사용수를 포함했다. 식염수를 대조군 물질로 사용했다.

멸균수 : 유효기간이 2013 년 9 월인 롯트 번호 6000844 의 주사용 멸균수를 APP Pharmaceuticals, LLC 사로부터 100 mL 바이알에 든 것으로 구매했다. 멸균수는 면역조절자 조성물의 재수화에 이용했다.

5% 덱스트로스 : 유효기간이 2014 년 1 월인 롯트 번호 19-112-JT 의 5% 덱스트로스 USP 를 Hospira Inc.사로부터 250 mL 바이알에 든 것으로 구매했다. 5% 덱스트로스는 재수화 면역조절자 조성물 희석에 이용했다.

면역조절자 조성물 제조: 면역조절자 바이알을 냉장고에서 꺼내 실온까지 승온시켰다. 각 바이알은 2 mL 의 멸균수를 첨가해 사용 직전에 재수화했다. 바이알을 30 초 동안 흔들고, 실온에 5 분 동안 두었다. 재수화된 면역조절자 조성물은 표 45 에서의 희석 계획에 따라 5% 덱스트로스를 사용해 희석했다. 희석된 면역조절자 조성물은 사용할 때까지 (약 2 시간) 냉매와 함께 저장했다.

표 45. 면역조절자 조성물 희석 계획.

치료. 챌린지 제공 후 약 2 시간 째에, 아기돼지들을 치료했다. 각각의 아기돼지에게 목의 우측에서 근육내 경로로 2 mL 의 적절한 치료 (표 48 내지 51 참조) 를 제공했다. 군 T1, T2 및 T3 의 아기돼지들에게 각각 식염수, 면역조절자 조성물 1X, 및 5X 를 제공했다.

임상적 평가. 배정 전에 암퇘지 및 아기돼지를 연구 수의사가 관찰했으며, 건강한 것으로 나타났다. 챌린지 제공 후, 아기돼지들은 제 5 일까지 매일 2 회 관찰했다.

스코어 제공 상세사항. 아기돼지들을 개별적으로 검사하고, 면봉을 직장에 삽입하여 배설물 농도 평가를 보조했다. 동물들은 챌린지 제공 후 1 일 2 회 스코어를 제공했다 (표 46 및 47 참조):

표 46. 배설물 스코어.

표 47. 일반적인 신체적 조건 스코어.

체중. 아기돼지들은 챌린지 제공 전 (표 48 내지 51), 종료 전 또는 폐사 또는 안락사 당일에 칭량했다.

통계적 분석. 동물들에서 관찰기간 5 일 동안 1 일 이상 동안 일반적 신체 스코어가 2 이상인 경우 임상적으로 아픈 것으로 간주했다. 동물들에서 관찰기간 5 일 동안 2 회 이상의 관찰에 있어 배설물 스코어가 2 이상인 경우 배설물 스코어에 대해 양성인 것으로 간주했다.

결과

본 연구에서의 모든 암퇘지들은 그들의 배설물 시료에서 대장균 K88 에 대해 음성이었다. 아기돼지들은 치료와 연관된 부작용이 없었다. 본 연구에서의 모든 아기돼지들은 분만 후 수 시간 내에 챌린지 제공했다. 암퇘지 4009, 2694, 10040, 4001, 및 2088 유래의 아기돼지들은 대장균 뱃치 1 로 챌린지 제공하고, 예비 및 사후 역가가 각각 1.04×10⁹ CFU/mL 및 9.6×10⁸ CFU/mL 였다. 암퇘지 2082, 217, 및 215 유래의 아기돼지들은 대장균 배양 뱃치 2 로 챌린지 제공하고, 예비 및 사후 역가는 각각 9.9×10⁸ CFU/mL 및 9.0×10⁸ CFU/mL 였다.

32 마리의 아기돼지들을 연구 기간 동안 검시했다. 31 마리 아기돼지들에 대한 폐사 또는 조기 종료의 이유는 대장균증으로 인한 것이었다. 1 마리의 아기돼지 (305 T2) 를 암퇘지와 두었는데, 폐사한 것으로 나타났다.

1 마리의 돼지 (331 T1) 만 제외하고 모든 아기돼지들이 대장균증 체중 실조로 인해 폐사 또는 안락사되었다 (31 마리의 돼지). 연구 기간 동안 생존한 모든 돼지들 (37 마리의 돼지) 은 체중이 증가했다.

체중 증체는 240 내지 1,540 g 의 범위였다. 암퇘지 2088 에서 출생한 아기돼지들은 여타 암퇘지에서 출생한 아기돼지들에 비해 임상적 징후를 나타내지 않았다. 단 두마리 아기돼지 (342 T1 및 336 T3) 가 관찰 시 한 번 배설물 스코어가 2 였다. 상기 암퇘지 유래의 아기돼지들을 포함하거나 또는 포함하지 않고 분석을 수행했다. 식염수로 치료한 23 마리 중 13 마리 (57%) 의 돼지들이 대장균증으로 폐사했다. 면역조절자 조성물 1X 로 치료한 22 마리 중 9 마리 (41%) 의 돼지들이 대장균증으로 폐사했다. 면역조절자 조성물 5X 로 치료한 23 마리 중 9 마리 (39%) 의 돼지들이 대장균증으로 폐사했다. 한 암퇘지 (2088) 유래의 아기돼지들을 제외하고 분석은 하기와 같았다: 식염수로 치료한 20 마리 중 13 마리 (65%) 의 돼지들이 대장균증으로 폐사했다. 면역조절자 조성물 1X 로 치료한 19 마리 중 9 마리 (53%) 의 돼지들이 대장균증으로 폐사했다. 면역조절자 조성물 5X 로 치료한 20 마리 중 9 마리 (45%) 의 돼지들이 대장균으로 폐사했다.

대장균 균주 MVS #2 는 출생일에 챌린지 제공한 질병에 취약한 신생아 아기돼지에서 폐사, 임상적 징후 및 설사를 유도할 수 있다. 면역조절자 조성물로 치료한 아기돼지들은 대조군과 비교해 두 치료군 (1X 및 5X) 에서 모두 폐사를 수치적으로 감소시켰으나, 통계적으로는 상이하지 않았다. 본 연구는 통계 분석을 위한 적절한 위력을 제공할 더 큰 샘플에서 반복될 수 있다.

표 48. 치료 군에 대한 아기돼지들의 무작위화 및 배정 (암퇘지 ID 4009 및 2694)

표 49. 치료 군에 대한 아기돼지들의 무작위화 및 배정 (암퇘지 ID 10040 및 4001).

표 50. 치료 군에 대한 아기돼지들의 무작위화 및 배정.

표 51. 치료 군에 대한 아기돼지들의 무작위화 및 배정 (암퇘지 ID 217 및 215)

표 52. 치료군 .

표 53. 폐사 또는 안락사된 돼지들의 체중 - (암퇘지ID 4009 및 2694)

표 54. 폐사 또는 안락사된 돼지들의 체중 (암퇘지 ID 10040 및 4001).

표 55. 폐사 또는 안락사된 돼지들의 체중 (암퇘지 ID 2088 및 2082)

표 56. 폐사 또는 안락사된 돼지들의 체중 (암퇘지 ID 217 및 215)

표 57. 챌린지 제공 후 돼지 체중 증가 또는 감소 (암퇘지 ID 4009 및 2694)

표 58. 챌린지 제공 후 돼지 체중 증가 또는 감소 (암퇘지 ID 10040 및 4001).

표 59. 챌린지 제공 후 돼지 체중 증가 또는 감소 (암퇘지 ID 2088 및 2082)

표 60. 챌린지 제공 후 돼지 체중 증가 또는 감소 (암퇘지 ID 217 및 215)

표 61. 암퇘지 4009 에서 출생한 아기돼지들의 임상 스코어.

표 62. 암퇘지 2694 에서 출생한 아기돼지들의 임상 스코어.

표 63. 암퇘지 10040 에서 출생한 아기돼지들의 임상 스코어.

표 64. 암퇘지 4001 에서 출생한 아기돼지들의 임상 스코어.

표 65. 암퇘지 2088 에서 출생한 아기돼지들의 임상 스코어.

표 66. 암퇘지 2082 에서 출생한 아기돼지들의 임상 스코어.

표 67. 암퇘지 217 에서 출생한 아기돼지들의 임상 스코어.

표 68. 암퇘지 215 에서 출생한 아기돼지들의 임상 스코어.

표 69. 암퇘지 및 군에서 치료한 돼지의 챌린지 제공 후 폐사.

실시예 6. 자연 챌린지 이유 돼지 모델에서의 대장균 관련 설사를 예방 또는 경감시키는 면역조절자 (IC-Ex.1) 조성물의 효능.

본 연구의 목적은 상용 제한 조건에서 수용한 이유 돼지들에서 대장균증과 관련된 설사를 예방 또는 경감시키는 IC-Ex. 투여의 임상적 유효성을 결정하기 위한 것이었다.

시험 시스템은 2 개의 독립된 공급 농장 유래의 시판 이유 돼지들의 두 집단을 이용했다: 시더 돼지 (seeder pig) (N=50) 및 후보자 돼지 (N=454) 집단. 시더 돼지들은 연구 제 -8 일에 현장에 도착했다. 연구 제 -4 일에는 50% 의 시더 돼지들이 대장균증이 임상적으로 발병한 것으로 기록되었으며, 베타 용혈성 대장균 (bHEC) 에 양성인 것으로 확인되었다. 돼지들은 배설물 스코어를 근거로 임상적으로 발병한 것으로 결정되었다 (0 = 정상, 1 = 설사). 배설물 스코어 제공 방법은 참여한 돼지들에 적용될 때 연구의 효능 종결점으로서 이용되었다. 모든 후보자 돼지들 (참여에 대한 후보자들) 은 연구 제 -1 일에 칭량했다. 후보자들의 평균 도착 체중은 13.6 lbs 였다. 후보자 돼지들은 21 일령이었으며, 도착 당일자에 이유했다. 후보자 집단에서의 대장균증의 발생을 확립하기 위해, 도착시 모든 후보자 돼지들을 단일 우리에서 시더 돼지들과 합류시켰다. 하기의 일정표 일자에, 8% (36/454) 의 후보자 돼지들이 대장균증으로 임상적으로 발병한 것으로 기록되었는데, 이는 연구 제 0 일 개시에 필요한 5% 역치와 맞아떨어진다.

연구 제 0 일에, 모든 시더 돼지들은 연구에서 퇴출시켰고, 개별 배설물 스코어는 각각의 후보자 돼지에 대해 기록했으며, 임상적으로 발병한 후보자 돼지들을 제외시키고, 41 마리의 임상적으로 정상인 후보자 돼지들의 우리 10 개를 연구에 참여시켰고, 시험 물질을 투여했다. 배설물 스코어는 5 일 연속하여 모든 참여한 돼지들에서 기록했다 (연구 제 1 일 내지 제 5 일). 시험 시스템은 5 개의 치료군으로 이루어졌다: 2 mL 부피로 경구 (PO) 투여된 5% 덱스트로스 물 (D5W), 2 mL 부피로 PO 투여된 20 ㎍ 투여량의 IC-Ex.1 (PO_2), 10 mL 부피 중에 PO 투여된 20 ㎍ 투여량의 IC-Ex.1 (PO_10), 2 mL 부피 중에 근육내 (IM) 투여된 20 ㎍ 투여량의 IC-Ex.1 및 1 mL 부피 중에 직장내 (IR) 투여된 20 ㎍ 투여량의 IC-Ex.1. 모든 투여량의 IC-Ex.1 는 D5W 중의 현탁액으로 제조되었다. 제 0 일의 체중의 통계적 분석은, 치료군 사이의 통계적 차이를 제공하지 않았다 (p=0.1725). 본 연구에서, 이유시 투여된 20 ㎍ IM 투여량의 IC-Ex.1 는 장관독성 대장균 (F18) 과 연관된 설사 발생을 대조군과 대비하여 33.3% 예방했다 (신뢰 구간 [CI]; 21.9%, 43.1%). 추가로, PO_2, PO_10, IM, 및 IR 치료군은 대조군과 대비하여 각각 22.4% (CI; 17.8%, 27.1%), 18.5% (CI; 8.6%, 28.4%), 65.1%, (CI; 58.7%, 71.5%), 및 20.4% (CI; 12.8%, 28%) 만큼 설사 빈도를 경감시켰다. 5 개 치료군 사이에서 폐사에 있어 통계적으로 유의한 (p>0.05) 차이는 관찰되지 않았다. 배양에 대해 수집 및 제출된 50 (시더 돼지) 개의 배설물 샘플 중에, 제출된 샘플의 92.0% (n=46) 에서 대장균 F18 선모 항원이 검출되었다. 상기 샘플 집단에서 여타 선모 항원이 검출되지는 않았다. 추가로, 대장균 독소 유전자 EAST1 (100.0%, n=50), STa (92.0%, n=46), 및 STb (100.0%, n=50) 는 AIDA 부착 유전자 (12.0%, n=6) 와 함께 상기 샘플 집단에서 회수되었다.

본 연구에서, 이유시 투여된 2 mL 근육내 20 ㎍ 투여량의 IC-Ex.1 는 장관독성 대장균 (F18 선모 항원, EAST1, STa, 및 STb 독소 유전자 및 AIDA 부착소 유전자) 과 관련된 설사 발생을 예방했다. 추가로, 모든 치료군은 대조군과 대비하여 설사 빈도를 경감시켰다.

표 70. 연구 군들.

시험 시스템의 확립

표 71. 임상 스코어 제공 방법 및 대장균증으로 "임상적으로 발병한" 돼지 분류를 위한 기준.

bHEC+ 돼지에서의 대장균의 실험실 진단

잠재적 bHEC+ 돼지로부터 직장 면봉 채집. 직장 면봉법으로 도착일 및 베타-용혈성 (bHEC) 대장균의 단리 및 반정량적 평가를 위해 MRI 에 보낸 날 시더 돼지로부터 채집했다. 이들의 50% 이상이 대장균증의 임상 징후를 나타냈을 때 연구 현장에서 다시 직장 시료를 시더/bHEC+ 돼지로부터 채집했다. 약 50% 의 시더/bHEC+ 돼지들이 임상적으로 발병하고, bHEC+ 임을 확인한 후, 454 마리 돼지의 후보자 모음을 구입하고, 연구 현장 도착시 단일 우리에서 시더/bHEC+ 돼지들과 합류되도록 했다.

면봉 채집, 취급 및 실험 과정. 직장 면봉법으로 채집하고, Amies 이동 배지가 있는 관에 두었다. 관에는 돼지 ID, 연구 번호, 시료 유형 및 채집일이 라벨링되어 있었다. 시료는 냉매 팩과 함께 두었으며, 채집 후 24 시간 내에 운반했다. 모든 면봉 채집물은 하기 과정에 따라 가공했다:

직장 면봉을 5% 양 혈액 아가 (BA) 및 MacConkey 아가 (MAC) 상에 직접 도말했다. BA 플레이트를 첫번째 사분면에 도말하고, bHEC 의 부분정량이 가능하도록 분리를 위해 교차 도말했다. 4 개까지의 면봉 시료를 MAC 플레이트 상에 도말했다. BA 및 MAC 플레이트를 36℃±2℃ 에서 호기성으로 인큐베이션했다. 일차 단리물 BA 플레이트에는 bHEC 를 위한 하기 계획에 따라 스코어 제공했다. MAC 는 전형적 대장균 콜로니가 존재하는지 여부 결정을 보조하기 위해 이용되었다.

일차적 BA 유래의 추정 상의 bHEC 콜로니는 새로운 BA 및 MAC 상에서 서브컬쳐했다. 하나(또는 그 이상)의 단리물(들)이 평가 기법의 재량에 따라 선택되었다. 동일 접종물을 삼중 당 철 아가 (TSI) 및 Simmon's 시트레이트 아가 (SC) 슬랜트 접종에 이용했다. BA, MAC 및 TSI 슬랜트는 밤새 36℃±2℃ 에서 인큐베이션되었으며, SC 슬랜트는 2 일 동안 36℃±2℃ 에서 인큐베이션되었다.

단리물은 하기 기준이 충족된다면 bHEC 로 확인되었다:

단리물이 MAC 상에서 전형적 콜로니 형상을 갖고, BA 상에서 베타 용혈을 나타냄

산/산/H2S-/기체의 전형적 TSI 반응

전형적 음성 SC 반응

대장균 단리물이 MALDI Biotyper 분류 시스템을 이용해 추가로 확인되었다.

Iowa State University 에서 전부 확인된 단리물 상에서 유전자형 시험을 수행하여 하기 유전자들의 존재여부를 평가했다: EAST 1 독소, LT 독소, STa 독소, STb 독소, Stx1 독소, Stx2 독소, Stx2e 독소, F18 선모, F41 선모, K88 선모, K99 선모, 987P 선모, AIDA 부착소, EAEA 부착소, 및 PAA 부착소.

표 72. 시더 돼지들로부터 단리된 대장균의 유전자형 특징의 요약.

동물 편입 기준

시더 돼지들은 구매 전에 bHEC 를 보유했는지 여부를 확인하고/하거나 연구 현장으로 배달 전 bHEC+ 로 확인된 코호트 돼지가 동년배임을 확인했으며, 연구 현장으로 배달하기 전 14 일 이내에 임의의 항생제 투여를 제공받지 않음을 확인했다. 시더 돼지들은 최근 이유하고, 시각적 평가로 명백한 부상 또는 신체적 이상이 없었지만, 대장균증의 임상 징후를 나타낼 수는 있다. 또한, 시더 돼지들은 bHEC 를 보유한 것으로 실험실에서 확인되면 (약 50%), "임상적으로 발병한" 돼지로 분류되고 (프로토콜의 섹션 14 항목 9 에서 정의된 바와 같음), 후보자 돼지와 합류되기 전에 알칼리 배설물 pH 를 가졌다.

후보자 돼지들은 연구 현장 도착 14 일 이내에 임의의 항생제 치료를 제공받지 않았으며, 연구 현장에 도착 전 2 일 이하 이내에 이유했고, 이유일에 19 일령 이상이며, 시더 돼지들과 합류되기 전 시각적 평가를 근거로 일반적으로 건강한 것으로 간주되었으며; 도착시 체중부하 파행이 있는 돼지들은 수의사의 관찰을 근거로 상태가 중증인 것으로 간주되지 않는 한 연구 참여에 적격인 것으로 했다. 미약한 파행이 이동 후 일부 동물에서 예상되었다. 후보자 돼지들은 연구 제 0 일에 프로토콜의 섹션 15 항목 8 에 정의된 바와 같이 임상적으로 정상인 것으로 분류되었지만, 기록된 스코어를 근거로 하면 그의 우리 구성원들의 약 5% 이상에서는 대장균증이 임상적으로 발병되었다.

동물 제외 기준

후보자 돼지들은 우리 배치/치료 배정 또는 치료 투여시 연구 제 0 일에 하기 속성 중 하나 이상을 보유하는 경우 참여에서 제외되었다: 서혜부 및/또는 배꼽 헤르니아, 직장 탈출증 또는 여타 분명한 신체적 비정상 또는 수의사의 상태 평가로 결정되며, 프로토콜의 섹션 15 항목 9 에서 정의되는 바와 같이 "임상적으로 발병된" 것으로 분류되는 동물의 정상적 생장 기능을 혼란시킬 수 있는 손상, 수의사가 식별하는 바와 같은 비-체중부하 파행, 신경학적 질환의 징후, 빈사상태 또는 질병 말기 돼지, 가외의 돼지. 제외되는 돼지들은 동물 제외 양식서에 기록했다.

치료 이후 배제 기준

대장균증으로 인한 빈사상태로 간주된 참여한 돼지들은 연구에서 배제되었으며, 상주 수의사의 재량으로 안락사되었다. 이들 돼지들은 치료 실패로 간주되었다. 빈사상태가 되거나 또는 대장균증 이외의 이유로 폐사한 참여 돼지들도 배제되었다. 이들 돼지들은 최종 분석에서 치료 실패로 간주되지 않았다. 연구 목적을 혼동케 하거나 또는 연구 완료를 방해할 임의의 여타 질환 또는 병태가 발병한 참여 돼지들은 연구에서 배제되어 안락사되었다. 이러한 동물들은 치료 실패로 간주되지 않았으며, 최종 분석에서 배제되었다.

표 73. 연구 군들.

음성 대조군으로 배정된 돼지들에게는 PO IC-Ex.1 치료군으로 배정되는 돼지들에 대해 기재된 바와 같이 전달되는 D5W 의 단일 PO 투여를 투여했다.

연구

50 마리의 시더 돼지들을 입수하여, 일부 비율의 돼지들이 bHEC 를 보유한 것으로 확인된 후 연구 현장으로 전달되었다. 연구 현장 도착 후 모든 시더 돼지에서 직장 면봉이 채집되었다. 면봉들을 단리 및 bHEC 의 식별을 위해 MRI Laboratories 에 보냈다. 시더 돼지들을 프로토콜에 기재된 임상 스코어 제공 기준을 이용해 대장균증의 임상 징후에 대해 매일 스코어 제공했다. 오직 임상적으로 발병된 시더 돼지들만 상기 관찰 기간 동안 기록되었다. 개별 직장 면봉의 pH 는 기록일 중 하나 이상에 설사 스코어 1 로 기록되었다. 시더 돼지 코호트의 약 50% 는 임상적으로 발병된 것으로 분류되었으며, bHEC 를 보유하고 있는 것으로 확인되었고, 돼지들의 후보자 모음을 구매해, 시더 돼지들과 합류시켰다.

자연 챌린지 시기 후보자: 시더 합류 및 참여

자연 챌린지 시기의 개시는 후보자 돼지들이 시더 돼지들과 합류되는 날짜이다: 연구 제 -1 일. 자연 챌린지 시기의 종료는 돼지 후보자 모음의 약 5% 이상이 대장균증으로 임상적으로 발병된 것으로 확인된 날짜이다. 연구 제 0 일에, 36 마리의 돼지 (7.9%; 454 마리 중 36 마리) 가 임상적으로 발병된 것으로 간주되었으며, "1" 의 설사 스코어를 가졌고, 연구에서 배제되었다 (치료하지 않음). 편입 기준에 적합했던 돼지들 중 8 마리가 배제되었다 (초과 돼지). 남은 모든 돼지들이 상기 수록된 편입 기준을 충족했으며, 연구에 참여했다. 모든 시더 돼지들은 연구 제 0 일에 배제되고, 기록되었다.

연구에서는 상업적인 양돈 시설에서 제공한 돼지들을 이용했으며, 이유 이전 또는 이유시 항생제를 투여하지 않았다. 후보자 돼지들은 건강했으며, 구매시에는 진행중인 대장균증을 갖고 있지 않았다. 모든 돼지들은 그들이 연구 현장에 도착시 21 일령이었다. 연구 제 -1 일에 모든 후보자 돼지들에서 체중을 기록하고, 체중 양식서 상에 기록했다. 도착 다음날부터 시작하여 자연 감염 시기 종료일 (연구 제 0 일) 까지 매일 일반 건강 관찰을 모든 후보자 및 시더 돼지에서 실시하고 기록했다. 상기 시기 동안, 오직 임상적으로 발병하거나 또는 비정상적 발견사실을 스코어로 기록했다. 모든 후보자 돼지들은 대장균증의 임상 징후에 대해 매일 관찰했다.

임상적 유효 시기: 임상 스코어 제공 및 부작용 이벤트 보고

조사자들이 후보자 모음의 약 5% 이상이 일시에 대장균증으로 임상적으로 발병될 것을 확신할 때, 후보자 모음에서 모든 돼지들에 대해 배설물 스코어를 결정했다. 대장균증 발병의 역치가 임상 설사 스코어로 확인되면, 그러한 돼지들의 후보자 모음이 시험 물질의 투여 대상이 될 것으로 간주했다. 대상이 되는 후보자 돼지들이 있는 모든 연구 우리는 수를 매겨 순서대로 채워나갔다 (예를 들어: 우리 1, 2, 3 등). 모든 우리에서 돼지 개체수를 맞추도록 노력했다. 연구 제 0 일에 시작하여, 모든 참여 돼지들 (410 마리) 은 연구 제 5 일까지 부작용 이벤트 및 배설물 스코어에 대해 매일 관찰했다. 임상 관찰시 모든 참여 돼지에서 매일 일반 건강 관찰을 실시했다.

사용된 통계적 방법. 각각 통계 유의수로 0.05 의 알파를 이용해, 신뢰 구간에서의 예방 및 경감 분율 산출, (R 에서의 PF 및 MF 패키지 R, 버젼 3.1.3), 일반화된 선형 혼합 모델 (GLMM) 및 변량 분석 (ANOVA) (SAS®Version 9.3; SAS Institute, Cary, NC) 을 이용해 설사, 폐사 및 평균 1 일 증체의 일차적 파라미터를 평가했다. 돼지를 본 연구의 실험 단위으로 간주했다. 그러나, 예방된 분율 분석은 우리 (군 당 n=2) 를 분석의 실험 단위로서 간주했다.

표 74. 참여한 돼지들 체중 및 ADG 의 개요 (연구 제 0 일 및 제 5 일).

모델 검증. 5 일의 연구 기간 과정 동안 설사를 나타낸 대조군 돼지들 (연구 군 T01) 의 개체수는 상기 질병 모델이 치료군이 bHEC 관련 설사 발생 예방 및/또는 설사 발생 빈도 경감에 긍정적인 유효성을 갖는지 여부를 시험하기에 충분함을 입증한다. 이는 도 29 및 표 75 에서 나타나 있다.

표 75. 연구 제 1 내지 5 일 동안 설사의 누적 발생 및 예방된 분율.

표 76. 평균 백분율 설사일 (연구 제 1 내지 5 일) 및 경감된 분율.

STa 및 STb 독소, EAST1 독소, F18 선모 및 AIDA 부착소 유전자들이 대다수의 50 bHEC+ 시더 돼지들에 존재하는 것으로 나타났다. D5W 치료 군에서의 높은 발생율 (SD4 로 99%) 의 설사는 후보자 돼지들이 시더 돼지 집단과 합류시킴으로써 bHEC 로 적절히 챌린지 제공되었음을 증명한다.

이유 돼지에서 대장균증을 예방 또는 경감시키는 IC-Ex.1 의 유효성. 본 연구에서, 이유시 투여된 2 mL 근육내 20 ㎍ 투여량의 IC-Ex.1 가 장관독성 대장균 (F18 선모, EAST1, STa, 및 STb 독소 및 AIDA 부착소 유전자) 와 연관된 설사 발생을 예방했다. 추가로, 모든 치료군이 대조군에 비해 설사 빈도를 경감시켰다.

실시예 8. 면역학적 경로 및 IC-Ex.1 로 치료 후 생산되는 싸이토카인.

실험 과정의 목적은 IC-Ex.1 에 의해 자극되는 면역학적 경로 결정이다.

돼지로부터 채혈하여, 자석 세포 분리를 이용해 면역 세포들을 혈액 시료로부터 분리했다 (도 30). 수상 세포 및 단핵구를 포함하는 172a+ 세포 및 자연 살해 세포, T 및 B 세포를 포함하는 172a- 세포들을 시험관내 배양했다. 표 77 을 참조하면, 배양은 상이한 농도의 IC-Ex.1, 널리 특징분석된 면역자극제 CpG ODN, Gardiquimod, PAM3Cys 및 LPS, 또는 빈 대조군 지질로 자극하고, 18 시간 동안 인큐베이션했다. 상청액을 IFN-α, TNF-α, IL1 베타, IL10, IL12p40, Il4, IL6, IL8, IFN-γ 의 존재여부에 대해 ELISA 또는 Luminex Multiplexing 을 이용하여 검정했다.

유세포분석을 이용해 IC-Ex.1 치료 후 싸이토카인 생산에 원인을 제공하는 세포 유형을 결정했다. 세포 배양은 브레펠딘 A (Brefeldin A) 로 처리했다. 브레펠딘 A 는 골지체를 억제하여, 세포에서 생산된 싸이토카인이 세포 내에 머무르도록 작용한다. 그렇게 머무르는 싸이토카인은 형광-표지 항체로 검출될 수 있다.

표 77. 면역자극제 농도.

결과

A. 생리학적으로 관련있는 투여량의 IC-Ex.1 가 많은 양의 IFN-α 를 유도한다.

도 31 은 생리학적으로 관련있는 농도의 IC-Ex.1 가 CD172a+ 세포에서 IFN-α 의 발현을 자극함을 보여준다. IFN-α 는 바이러스 및 여타 세포내 병원체에 대한 숙주 방어에서 중요하다.

대조적으로, CD172a-세포들은 IC-Ex.1 로 자극 후 싸이토카인을 생산하지 않아, IC-Ex.1 가 이들 세포에서 강력한 싸이토카인 발현 활성화제가 아님을 시사한다. 이들 세포는 활성화될 단핵구 또는 수지 세포로부터의 정보를 필요로 하므로, IC-Ex.1 의 일차적 표적이 아닐 공산이 크다. 그러나, 이들 세포들은 생체내에서의 IC-Ex.1 응답에 관여되지 않을 수 있지만, 그들의 관여는 IC-Ex.1 와의 직접적인 상호작용을 포함하지 않을 수 있다. 도 32 를 참조하면, CD172a-세포는 IC-Ex.1 또는 공지된 면역자극제로 자극 후 IFN-α 를 생산하지 않는다. 동일한 이유로, IFN-α 은 CD172a- 에 의해 생산되지 않으며, IFN-α 는 또한 IC-Ex.1 또는 공지된 자극제로 자극 후 CD172a- 세포에서 생산되지 않는다 (도 33).

B. 형질세포형 수상 세포는 IC-Ex.1 에 의해 활성화되어 IFN-α 를 생산한다

유세포분석을 채용하여 IC-Ex.1 에 의해 활성화되고, IC-Ex.1 자극에 의해 싸이토카인을 생산하는 세포 유형 또는 유형들을 식별했다. 도 34 A 내지 D 를 참조하면, 대조군 지질로 자극을 제공받은 CD14+ 단핵구, 통상적 수상 세포 (cCDs), 또는 형질세포형 수상 세포 (pDCs) 가 유의한 양의 IFN-α 생산하지 못했다. 유사하게, 도 35 A 내지 C, 도 36 A 내지 C, 및 도 37 A 내지 C 는 CpG ODN, IC-Ex.1 (100 ng/mL), 및 IC-Ex.1 (10 ng/mL) 가 각각 CD14+ 단핵구 또는 cDC 를 자극하지 않음을 보여준다. 그러나, CpG ODN, IC-Ex.1 (100 ng/mL), 및 IC-Ex.1 (10 ng/mL) 가 pDC 에서 IFN-α 생산을 자극하지 않았다 (각각, 도 35 D, 36 D 및 37 D).

IC-Ex.1 대 리포좀의 직접적인 비교는 pDC 의 자극 유효성은 단독으로 리포좀으로 인한 것이 아니며, 리포좀 및 상기 기재된 바와 같은 핵산 분자의 조합으로 인한 것일 공산이 크다는 것을 보여준다. 도 38 A 내지 C 및 도 39 A 내지 C 는 100 ng/mL 농도의 IC-Ex.1 도 100 ng/mL 농도의 리포좀도 CD14+ 단핵구 또는 cDC 에서 IFN-α 생산을 유발하지 않음을 보여준다. 도 38 D 및 도 39 D 는 pDC 에서 IFN-α생산을 자극하는 IC-Ex.1 (100 ng/mL) 의 능력을 보여주며, 리포좀 (100 ng/mL) 이 pDC 에서 IFN-α 를 생산하지 못했음을 보여준다.

심지어 10 ng/mL 의 IC-Ex.1 가 싸이토카인 생산에 효율적이다. IC-Ex.1 (10 ng/mL) 및 리포좀 (10 ng/mL) 은 CD14+ 단핵구 또는 cDC 에서 IFN-α를 생산하지 못했지만 (도 40 A 내지 C 및 도 41 A 내지 C), 10 ng/mL 의 IC-Ex.1 는 pDC 에서 IFN-α 의 생산을 자극하기에 충분했다. 10 ng/mL 의 리포좀은 10 ng/mL 의 IC-Ex.1 와 유사한 결과를 제공하지 못했다 (도 40D 및 도 41 D).

도 42 를 참조하면, 인터페론 생산 세포로 식별된 세포들의 백분율은 pDC 에서 CpG ODN 및 IC-Ex.1 (100 ng/mL 및 10 ng/mL) 에 대해 최고였다. 평균 형광 강도 (MFI) 도 또한 pDC 에서 CpG ODN 및 IC-Ex.1 (100 ng/mL 및 10 ng/mL) 에 대해 최고였다 (도 43).

C. 생리학적으로 관련있는 투여량의 IC-Ex.1 가 IFN-γ 및 IL-4 를 유도한다.

CD172+ 풍부화 세포는 생리학적으로 관련있는 투여량의 IC-Ex.1 으로 자극시 IFN-γ 를 생산한다. 그러한 생산은, 세포 유형들 사이의 상호작용이 IFN-γ생산에 필요하기 때문에 CD172+ 세포 분획에 남아있는 CD172-세포들로 인한 것일 수 있다. 도 44 를 참조하면, 여타 공지된 면역자극원들과 비교시, IC-Ex.1 이 놀랍게도 IFN-γ 생산의 가장 강력한 유도제이며, 심지어 시험했던 최소 농도의 IC-Ex.1 (1 ng/mL) 조차도 검출가능한 IFN-γ 의 생산을 유도했다. cGAMP 는 또한 IFN-γ 의 생산을 유도하는 그의 능력에 대해 시험했다. 도 44 는 또한 cGAMP 가 IFN-γ 생산을 유도함을 보여주는데, 이는 IFN-γ 을 생산하는 STING 경로 활성화 능력을 나타낸다.

CD172+ 풍부화 세포는 또한 생리학적으로 관련된 투여량의 IC-Ex.1 로 자극시 IL-4 를 생산한다. 도 45 는 1 ㎍/mL 의 IC-Ex.1 가 최고 투여량의 CpG ODN (5 ㎍/mL) 에 필적할 수준으로 IL-4 생산을 유도함을 보여준다.

여타 싸이토카인들은 또한, 양성 대조군으로의 자극보다 더 낮은 수준이라도, IC-Ex.1 로 자극 후 생산된다. 예를 들어, IC-Ex.1 는 IL-1β, IL-6, IL-8 및 IL-10 의 약한 유도 인자이다. 도 46 내지 48 은 상기 싸이토카인의 IC-Ex.1 유도된 발현을 CpG ODN 의 것과는 유사한 수준이나, LPS (1 ㎍/mL) 및 PAM3Cys (10 ㎍/mL) 의 것보다는 낮은 수준으로 유도함을 보여준다.

실시예 9: IC-Ex.1 는 단핵구-유도성 대식 세포를 PRRS 바이러스로부터 보호해 준다.

바이러스 감염에 대한 내성을 부여해 주는 IC-Ex.1 의 능력을 조사했는데, 이는 IC-Ex.1 가 IFN-α 의 유도인자이며, IFN-α 가 바이러스 감염에 대한 숙주 방어의 중요 구성요소이기 때문이다. 실시예 8 에 기재된 바와 같은 돼지 혈액으로부터 유도된 단핵구의 시험관내 배양을 박테리아 감염에 대한 내성을 증가시키는 것으로 공지된 IC-Ex.1 또는 IFN-γ 으로 처리했다. 처리 후,세포에 PRRS 를 접종하고, 감염율에 대해 평가했다.

결과

PRRS 에 대한 노출 전에 IC-Ex.1 로 치료한 더 적은 세포들은 치료하지 않은 세포에 비해 감염되어 있었다. 도 49 는 IFN-γ 로 예비처리된 세포와 같이 PRRS 로 감염된 세포들의 백분율을 제공함을 보여준다. IC-Ex.1 예비처리 후 감염된 세포의 백분율은 예비처리없이 PRRS 로 감염된 세포의 백분율의 절반 미만이었다.

상기를 고려할 때, 본 발명의 여러 목적이 달성되었으며 여타 유리한 결과들도 이룬 것을 알 수 있을 것이다.

본 발명의 범위를 벗어나지 않고 상기 제품, 조성물 및 방법에 있어서 다양한 변화를 구현하는 것이 가능하므로, 상기 상세한 설명에 포함되고, 첨부된 도면에서 제시되는 모든 대상은 설명을 위한 것으로 해석되어야 하며, 제한의 의미로 해석되어서는 안 된다.

SEQUENCE LISTING <110> <120> ENHANCED IMMUNE RESPONSE IN PORCINE SPECIES <130> BAYER <150> 62/199,848 <151> 2015-07-31 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4242 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of plasmid pGCMB75.6 <400> 1 tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 60 ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 120 gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 180 tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac 240 atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 300 cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 360 agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 420 ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 480 gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 540 cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagccg atctgataac ggtaccgata agctggcggc 600 cgattaagct acagaagttg 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gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 2100 aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 2160 cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gggcgcgcct aggcttttgc aaagatcgat 2220 caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct 2280 ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc 2340 tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc 2400 gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc 2460 acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg 2520 ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag 2580 aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc 2640 ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt 2700 cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc 2760 gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc 2820 tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg 2880 ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag 2940 cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg 3000 cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg 3060 aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct 3120 tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc 3180 gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accctaggcg cgctcatgag cggatacata 3240 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 3300 ccacctaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca 3360 gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga 3420 ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg 3480 actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat 3540 caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag 3600 ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga 3660 agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa 3720 ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcccattcg ccattcaggc 3780 tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 3840 aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 3900 gttgtaaaac gacggccagt gagcgcgcgt aatacgactc actatagggc gaattgggta 3960 ccgggccccc cctcgagcag gatctataca ttgaatcaat attggcaatt agccatatta 4020 gtcattggtt atatagcata aatcaatatt ggctattggc cattgcatac gttgtatcta 4080 tatcataata tgtacattta tattggctca tgtccaatat gaccgccatg ttgacattga 4140 ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg 4200 gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gc 4242 <210> 4 <211> 4242 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucelotide sequence of plasmid pLacZMB75.6 <400> 4 tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 60 ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 120 gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 180 tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac 240 atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 300 cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 360 agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 420 ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 480 gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 540 cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagccg atctgataac ggtaccgata agctggcggc 600 cgattaagct acagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga 660 caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc 720 tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac 780 tcccaggttc aattacagct cttaagcagc cgccaaaaca aaattcctca aaaatcatca 840 tcgaatgaat ggtgaaataa tttccctgaa taactgtagt gttttcaggg cgcggcataa 900 taattaacta tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa ggggttaata 960 aggaatattt gatgtatagt gccttgacta gagatcataa tcagccatac cacatttgta 1020 gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg 1080 aatgcaattg 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ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 1980 tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 2040 caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 2100 aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 2160 cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gggcgcgcct aggcttttgc aaagatcgat 2220 caagagacag gatgaggatc gtttcgcagc ttttcattct gactgcaacg ggcaataagt 2280 ctctgtgtgg attaaaaaaa gagtgtctga tagcagcttc tgaactggtt acctgccgtg 2340 agtaaattaa aattttattg acttaggtca ctaaggcgcc ttgcgctgag gttgcgtcgt 2400 gatatcatca gggcagaccg gttacatccc cctaacaagc tgtataaaga gaaatactat 2460 ctcattggcg ttgcccgcac ctgacagtgc gacgttgggc tgcgtccgtc gaccaacggt 2520 accgaggtaa cagcccaatc tatccatgat ctcggccagg ccgggtcggc cgttatgcag 2580 cccggctcgg gtatgaagcc attaaggagc cgacccagcg cgaccgggcg gccggtcacg 2640 ctgcctctgc tgaagcctgc ctgtcactcc ctgcgcggcg tacccgccgt tctcatcgag 2700 taggctccgg atcgcgaccc cggacgggcc ctgggcccag gagcggccta tgacaaatgc 2760 cgggtagcga tccggcattc agcattgact gcgcacggat ccagtccttg caggagcctt 2820 atgccgaccg tagcaaaaaa tgagcccgag ccgatcgcga gttgtgatcc ggtcccgccg 2880 attgccggtc gcgatgacgg tcctgtgtaa gcgttatcgt taccaattgt ttaagaagta 2940 tatacgctac gaggtacttg ataacttctg cgtagcatac atgaggtttt gtataaaaat 3000 ggcgggcgat atcaacgcag tgtcagaaat ccgaaacagt ctgcgggact ctggggttcg 3060 aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct 3120 tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc 3180 gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accctaggcg cgctcatgag cggatacata 3240 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 3300 ccacctaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca 3360 gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga 3420 ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg 3480 actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat 3540 caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag 3600 ggagcccccg 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Claims (25)

1. 하기 단계를 포함하는, 수용자 돼지 종들 대상체에서의 면역 응답성 유발 방법:
   유효량의 면역조절자 조성물을 돼지 종들 대상체에게 투여하는 단계, 여기서 상기 면역조절자 조성물은 하나 이상의 면역자극성 CpG 모티프, 하나 이상의 비-면역자극성 CpG 모티프를 포함하는 핵산 서열, 및 양이온성 리포좀을 포함함.
2. 제 1 항에 있어서, 리포좀 전달 비히클이 다층 소포 지질 및 압출 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질을 함유하는, 수용자 돼지 종들 대상체에서의 면역 응답성 유발 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 리포좀 전달 비히클이 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 콜레스테롤; N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP) 및 콜레스테롤; 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-히드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드 (DOTIM) 및 콜레스테롤; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질의 쌍을 함유하는, 수용자 돼지 종들 대상체에서의 면역 응답성 유발 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 면역조절자 조성물이 추가로 생물작용제를 함유하거나 또는 그와 병용하여 투여되는, 수용자 돼지 종들 대상체에서의 면역 응답성 유발 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 투여가 감염원에 대한 노출 전에 행해지는, 수용자 돼지 종들 대상체에서의 면역 응답성 유발 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 투여가 감염원에 대한 노출 이후에 행해지는, 수용자 돼지 종들 대상체에서의 면역 응답성 유발 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 면역조절자 조성물이 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 수용자 돼지 종들 대상체에서의 면역 응답성 유발 방법.
8. 제 4 항에 있어서, 생물작용제가 면역 강화제 단백질, 면역원, 백신, 항미생물제 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 수용자 돼지 종들 대상체에서의 면역 응답성 유발 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 돼지 종들 대상체가 식품 생산용 돼지 동물인, 수용자 돼지 종들 대상체에서의 면역 응답성 유발 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 함유하는, 수용자 돼지 종들 대상체에서의 면역 응답성 유발 방법.
11. 돼지에게 면역조절자 조성물을 투여하는 것을 포함하는 양돈가 사육 돼지의 생산 개선 방법으로서, 여기서 상기 면역조절자 조성물이 하나 이상의 면역자극성 CpG 모티프를 포함하는 핵산 서열 및 양이온성 리포좀을 함유하는, 양돈가 사육 돼지의 생산 개선 방법.
12. 돼지에게 면역조절자 조성물을 투여하는 것을 포함하는 양돈가 사육 돼지의 생존능 개선 방법으로서, 여기서 상기 면역조절자 조성물이 하나 이상의 면역자극성 CpG 모티프를 포함하는 핵산 서열 및 양이온성 리포좀을 함유하는, 양돈가 사육 돼지의 생존능 개선 방법.
13. 돼지에게 유효량의 면역조절자 조성물을 투여하는 것을 포함하는 돼지에서의 설사 감소 방법으로서, 상기 면역조절자가 하기를 함유하는 돼지에서의 설사 감소 방법:
    a. 양이온성 지질 전달 비히클; 및
    b. 면역원을 코드하지 않는 핵산 분자,
    여기서 상기 투여는 대장균 (Escherichia coli) 으로 챌린지 후 상기 돼지에서 설사를 감소시킴.
14. 제 13 항에 있어서, 핵산 분자가 박테리아-유도 핵산 벡터 또는 그의 단편인, 돼지에서의 설사 감소 방법.
15. 제 13 항에 있어서, 핵산 분자가 DNA 플라스미드인, 돼지에서의 설사 감소 방법.
16. 제 13 항에 있어서, 리포좀 전달 비히클이 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 콜레스테롤; N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP) 및 콜레스테롤; 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-히드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드 (DOTIM) 및 콜레스테롤; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질의 쌍을 함유하는, 돼지에서의 설사 감소 방법.
17. 제 13 항에 있어서, 투여가 대장균 (Escherichia coli) 으로의 상기 챌린지 전에 발생하는, 돼지에서의 설사 감소 방법.
18. 제 13 항에 있어서, 면역조절자 조성물이 생물작용제를 추가로 함유하거나 또는 그와 병용하여 투여되는, 돼지에서의 설사 감소 방법.
19. 돼지에게 면역조절자 조성물을 투여하는 것을 포함하는 돼지에서의 증체 증가 방법으로서, 상기 면역조절자가 하기를 함유하는 돼지에서의 증체 증가 방법:
    a. 양이온성 지질 전달 비히클; 및
    b. 면역원을 코드하지 않는 핵산 분자,
    여기서 상기 투여는 돼지 생식기 호흡 증후군 바이러스 (PRRSV) 로 챌린지 후 상기 돼지에서 증체를 증가시킴.
20. 제 18 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 박테리아-유도 핵산 벡터 또는 그의 단편인, 돼지에서의 증체 증가 방법.
21. 제 18 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 DNA 플라스미드인, 돼지에서의 증체 증가 방법.
22. 제 18 항에 있어서, 리포좀 전달 비히클이 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 콜레스테롤; N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP) 및 콜레스테롤; 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-히드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드 (DOTIM) 및 콜레스테롤; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질의 쌍을 함유하는, 돼지에서의 증체 증가 방법.
23. 제 18 항에 있어서, 투여가 PRRSV 로의 상기 챌린지 전에 발생하는, 돼지에서의 증체 증가 방법.
24. 제 18 항에 있어서, 상기 면역조절자 조성물이 생물작용제를 추가로 함유하거나 또는 그와 병용하여 투여되는, 돼지에서의 증체 증가 방법.
25. 제 23 항에 있어서, 생물작용제가 PRRSV 백신인, 돼지에서의 증체 증가 방법.

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