TWI759317B

TWI759317B - 牛物種中增加的生育力

Info

Publication number: TWI759317B
Application number: TW106124943A
Authority: TW
Inventors: 傑森尼克爾; 丹尼爾凱爾; 阿爾伯特亞伯拉罕; 華倫塔利; 理查德奧爾德瑞克理克; 泰瑞塞提; 里蘭特維克氏; 斯圖爾特尼波林克
Original assignee: 德商拜耳動物保健有限公司
Priority date: 2016-07-26
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2022-04-01
Also published as: JP2019525935A; DOP2019000018A; AU2017301528A1; KR20190032434A; CL2019000185A1; EP3490598A1; CA3031778A1; CO2019000724A2; WO2018022583A1; UY37346A; BR112019001599A2; AR109167A1; US10933131B2; NZ750181A; PE20190566A1; SG11201900710YA; MX2019001126A; IL264380A; KR102473370B1; CN109689095B

Abstract

本發明是關於有效增加牛受孕之免疫調節的組成物以及方法。

Description

牛物種中增加的生育力

本發明是有關用於在乳牛中免疫調節的組成物以及方法。特別地，本發明是關有效增加牛之第一次配種受孕率(first service conception rate)的組成物以及方法。

在乳牛中，最高的發病率和死亡率發生在圍產期。已顯示免疫功能在產犢時減弱，其中白血球計數減少且白血球功能降低，如經由骨髓過氧化酶和吞噬分析所證實。如果可以在產犢期間增強免疫功能，那麼對免疫功能敏感的生殖結果便能夠獲得改善。

由於多種因素，乳牛生育力在國際間呈現下降趨勢，前述多種因素包括牛群數量增加、發情檢測的靈敏度和特異性降低、產犢時體型得分滑落還有產後體型得分喪失增加。McDougall,J.Reproduction and Development 52,185-194(2006)。需要高水準的繁殖能力來保持最理想的牛群健康和生產力。在本技藝中需要能夠增加乳牛(cows)和母牛(heifers)生產力的組成物與方法。

本發明是有關用於在乳牛與母牛中增加受孕率的免疫調節劑組成物。在一些具體例中，免疫調節劑組成物可包含陽離子脂質體遞送媒劑和經分離的細菌衍生核酸分子，該核酸分子不編碼在乳牛與母牛中用於增加受孕率的免疫原。

在一些具體例中，該核酸分子包含至少一種免疫刺激性CpG模體(motif)以及至少一種非免疫刺激性CpG模體。在另一個具體例中，該核酸分子與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3，或SEQ ID NO：4的序列具有至少80%序列同源性。在一些具體例中，該核酸分子包含SEQ ID NO：1。在其他具體例中，該核酸分子包含SEQ ID NO：2。在其他具體例中，該核酸分子包含SEQ ID NO：3。在其他具體例中，該核酸分子包含SEQ ID NO：4。

在一些具體例中，該脂質體遞送媒劑包含選自由多層囊泡脂質和擠出脂質組成之群的脂質。在另一個具體例中，該脂質體遞送媒劑包含選自由N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)和膽固醇；N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)和膽固醇；1-[2-(油醯基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑啉氯化物(DOTIM)和膽固醇；以及二甲基二十八烷基溴化銨(DDAB)和膽固醇組成之群的脂質對。

在一些具體例中，該免疫調節劑組成物進一步包含生物劑。在更多具體例中，該生物劑選自由免疫增強蛋白、免疫原、疫苗，抗微生物劑或其任何組合組成之群。在一些具體例中，該免疫調節劑組成物進一步包含醫藥學上可接受的載劑。

在一些具體例中，該免疫調節劑組成物是用於投藥並選自由靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、透過噴霧-氣溶膠、經口、眼內、氣管內、子宮內，陰道內以及鼻內組成之群。

在一些具體例中，乳牛的受孕率相對於對照群體的受孕率增加。

在一些具體例中，非循環乳牛的受孕率相對於對照群體的受孕率增加。

在一些具體例中，母牛的第一次配種受孕率相對於對照群體的第一次配種受孕率增加。

在一些具體例中，非循環乳牛的第一次配種受孕率相對於對照群體的第一次配種受孕率增加。

在一些具體例中，如依據p值

0.05所測量，乳牛的受孕率相對於對照群體的第一次配種受孕率增加。

在一些具體例中，如依據p值

0.05所測量，非循環乳牛的受孕率相對於對照群體的受孕率增加。

在一些具體例中，如依據p值

0.05所測量，乳牛的第一次配種受孕率相對於對照群體的第一次配種受孕率增加。

在一些具體例中，如依據p值

0.05所測量，非循環乳牛的第一次配種受孕率相對於對照群體的第一次配種受孕率增加。

本發明亦有關增加乳牛受孕率的方法，包含向乳牛投與有效量的免疫調節劑組成物。在一些具體例中，該免疫調節劑組成物可包含陽離子脂質體遞送媒劑以及不編碼免疫原的核酸分子。

本發明亦有關增加乳牛受孕率的方法，包含向乳牛投與有效量的免疫調節劑組成物。在一些具體例中，該免疫調節劑組成物可包含陽離子脂質體遞送媒劑以及不編碼免疫原的經分離細菌衍生核酸分子。

本發明亦有關增加非循環乳牛之受孕率的方法，包含向乳牛投與有效量的免疫調節劑組成物。在一些具體例中，該免疫調節劑組成物可包含陽離子脂質體遞送媒劑以及不編碼免疫原的核酸分子。

本發明亦有關增加非循環乳牛之受孕率的方法，包含向乳牛投與有效量的免疫調節劑組成物。在一些具體例中，該免疫調節劑組成物可包含陽離子脂質體遞送媒劑以及不編碼免疫原的經分離細菌衍生核酸分子。

本發明亦有關增加乳牛之第一次配種受孕率的方法，包含向乳牛投與有效量的免疫調節劑組成物。在一些具體例中，該免疫調節劑組成物可包含陽離子脂質體遞送媒劑以及不編碼免疫原的核酸分子。

本發明亦有關增加乳牛之第一次配種受孕率的方法，包含向乳牛投與有效量的免疫調節劑組成物。在一些具體例中，該免疫調節劑組成物可包含陽離子脂質體遞送媒劑以及不編碼免疫原之經分離細菌衍生核酸分子。

本發明亦有關增加非循環乳牛之第一次配種受孕率的方法，包含向乳牛投與有效量的免疫調節劑組成物。在一些具體例中，該免疫調節劑組成物可包含陽離子脂質體遞送媒劑以及不編碼免疫原的核酸分子。

本發明亦有關增加非循環乳牛之第一次配種受孕率的方法，包含向乳牛投與有效量的免疫調節劑組成物。在一些具體例中，該免疫調節劑組成物可包含陽離子脂質體遞送媒劑以及不編碼免疫原之經分離細菌衍生核酸分子。

在一些具體例中，該核酸分子包含至少一種免疫刺激性CpG模體以及至少一種非免疫刺激性CpG模體。在又一個具體例中，該核酸分子與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3，或SEQ ID NO：4的序列至少80%的序列同源性。在一些具體例中，該核酸分子包含SEQ ID NO：1。在其他具體例中，該核酸分子包含SEQ ID NO：2。在其他具體例中，該核酸分子包含SEQ ID NO：3。在其他具體例中，該核酸分子包含SEQ ID NO：4。

在一些具體例中，該脂質體遞送媒劑包含選自由多層囊泡脂質和擠出脂質組成之群的脂質。在更多具體例中，該脂質體遞送媒劑包含選自由N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)和膽固醇；N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)和膽固醇；1-[2-(油醯基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑啉氯化物(DOTIM)和膽固醇；以及二甲基二十八烷基溴化銨(DDAB)和膽固醇組成之群的脂質對。

在一些具體例中，該免疫調節劑組成物進一步包含生物劑。在其他具體例中，該生物劑選自由免疫增強蛋白、免疫原、疫苗，抗微生物劑或其任何組合組成之群。在一些具體例中，該免疫調節劑組成物進一步包含醫藥學上可接受的載劑。

在一些具體例中，該免疫調節劑組成物用於投藥並選自由靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、透過噴霧-氣溶劑、經口、眼內，氣管內和鼻內組成之群。

圖1顯示pMB75.6質體(SEQ ID NO：1)的圖譜。

圖2顯示pGCMB75.6質體(SEQ ID NO：2)的圖譜。

圖3顯示pLacZMB75.6質體(SEQ ID NO：3)的圖譜。

依據治療組別之循環乳牛與非循環乳牛，圖4A顯示第一次授精之受孕概率(估算邊際平均值和平均值標準誤差(SEM))，而圖4B顯示在配種程序計畫開始之後三週內的懷孕概率(估算邊際平均值和SEM)。星號表示非循環組中，處理之間的差異。

根據本發明，免疫調節劑組成物及其使用方法是用於增加乳牛的受孕率。免疫調節劑組成物包括陽離子脂質體遞送媒劑以及不編碼免疫原的經分離細菌衍生核酸分子。以下將更詳細地討論該等組成物以及使用該等免疫調節劑組成物的方法。

I.組成物

可用於本發明的組成物，諸如本文所述的組成物，通常能夠用作為前期預防性療法、後期預防性療法或用於感染性疾病的治療療法。此等組成物在本文中稱為免疫調節劑組成物。免疫調節劑組成物包含至少一種能夠增加乳牛受孕率的免疫刺激性質體或免疫刺激性DNA序列。在一些態樣中，免疫調節劑組成物亦可包括脂質體遞送媒劑。

A.核酸

在一些態樣中，本發明關於用以增加乳牛受孕率的核酸分子。本文所述的核酸分子可以包括在免疫刺激性質體中，作為線性雙股或單股DNA、胺基酸序列、核糖核酸(RNA)或其組合。在一些態樣中，本發明關於含有免疫刺激性質體或免疫刺激性DNA序列的核酸分子，載劑以及宿主細胞(體外，體內或離體)。

本文所述的核酸分子富含CpG模體。此等CpG模體可以透過特異性類鐸受體(例如TLR9和TLR21)誘導免疫刺激。此外，本文所述的核酸分子亦含有非CpG免疫刺激性模體。在一些態樣中，該等核酸分子含有約2-20% CpG模體，超過在隨機核酸序列中預期之CpG模體頻率。在一些態樣中，該等核酸分子含有約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、35、40%或更多CpG模體，超過在隨機核酸序列中預期之CpG模體頻率。在一些態樣中，該等核酸分子含有約10% CpG模體，超過在隨機核酸序列中預期之CpG模體頻率。在一些態樣中，與脊椎動物DNA相比，觀察到富含超過10倍的CpG模體。在一些態樣中，與脊椎動物DNA相比，該等核酸分子含有約2至50倍或更多CpG模體。在一些態樣中，與脊椎動物DNA相比，該等核酸分子含有約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、35、40、45、50、55倍或更多CpG模體。

在一些態樣中，本發明關於確實包含抗生素抗性基因的免疫刺激性質體或DNA序列。舉例而言，本文所述的pMB75.6質體包含抗生素抗性基因康黴素。pMG75.6的序列作為SEQ ID NO：1提供於表1中。

在一些態樣中，本發明關於不包含抗生素抗性基因的免疫刺激性質體或DNA序列。質體可能沒有任何可選擇或可篩選的標記基因。舉例而言，本文所述的pGCMB75.6質體不包含任何全長或功能性可選擇或可篩選標記基因。pGCMB75.6的序列作為SEQ ID NO：2提供於表1中。

在一些態樣中，本文所述的免疫刺激性質體較佳不包含編碼全長或功能性可選擇或可篩選標記的核酸序列。在一些態樣中，免疫刺激性質體不包含抗生素抗性基因。舉例而言，該等質體不包含康黴素抗性基因。在一些態樣，本文所述的質體較佳不編碼免疫原。

在一些態樣中，免疫刺激性質體可包含編碼並非抗生素抗性基因的可選擇或可篩選標記基因的核酸序列。舉例而言，本文所述的pLacZMB75.6質體包含作為可篩選標記的LacZ基因。pLacZMB75.6的圖譜提供於圖3中，而pLacZMB75.6的核苷酸序列作為SEQ ID NO：3提供於表1中。如圖3中所示，pLacZMB75.6類似於pGCMB75.6，但包含一個LacZ可篩選標記。

應當理解，pMB75.6、pGCMB75.6或pLacZMB75.6質體的核苷酸序列可在一定程度上變化，而不會顯著不利地影響其免疫刺激性質。在一些態樣中，本發明有關包含與pMB75.6的序列(SEQ ID NO：1)具有至少80%序列同一性之核酸序列的免疫刺激性質體。該免疫刺激性質體較佳包含與pMB75.6的序列(SEQ ID NO：1)具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少86%至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列。在一些態樣中，該免疫刺激性質體更佳地包含pMB75.6的序列(SEQ ID NO：1)。

在一些態樣中，本發明有關包含與pGCMB75.6(SEQ ID NO：2)的序列具有至少80%序列同一性之核酸序列的免疫刺激性質體。該免疫刺激性質體較佳包含與pGCMB75.6之序列(SEQ ID NO：2)具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少86%至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列。在一些態樣中，該免疫刺激性質體更佳地包含pGCMB75.6的序列(SEQ ID NO：2)。

在一些態樣中，本發明有關由與pMB75.6之序列(SEQ ID NO：1)具有至少80%序列同一性的核酸序列組成的免疫刺激性質體。該免疫刺激性質體較佳由與pMB75.6之序列(SEQ ID NO：1)具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列組成。在一些態樣中，該免疫刺激性質體更佳地由pMB75.6的序列(SEQ ID NO：1)組成。

在一些態樣中，本發明關於由與pGCMB75.6之序列(SEQ ID NO：2)具有至少80%序列同一性的核酸序列組成的免疫刺激性質體。該免疫刺激性質體較佳由與pGCMB75.6之序列(SEQ ID NO：2)具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%，至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列組成。在一些態樣中，該免疫刺激性質體更佳地由pGCMB75.6的序列(SEQ ID NO：2)組成。

本發明的另一個重要態樣提供能夠刺激免疫反應的免疫刺激性DNA序列或免疫刺激性質體，包括在高度嚴苛條件下與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2雜交的核酸序列。合適的核酸序列包括那些與本發明的核酸同源、基本上相似或相同者。在一些態樣中，同源核酸序列將具有與SEQ ID NO：1或個別互補序列至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列相似性。在其他態樣中，同源核酸序列將具有與SEQ ID NO：2或個別互補序列至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列相似性。序列相似性可以使用許多技藝中已知的演算法(例如BLAST，描述於Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Biol.215：403-10,1990中)來計算。由於遺傳密碼的簡併性，核酸可能在序列上與上述核酸不同。一般來說，參考序列將是18個核苷酸，更常是30個或更多個核苷酸，並且可以包含用於比較目的之組成物的整個核酸序列。

在本文中預期可以與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2雜交的核苷酸序列。嚴苛的雜交條件包括諸如在50℃或更高以及0.1X SSC(15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉)下雜交的條件。另一個例子是在42℃、於50%甲醯胺、5X SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)，5X登哈特溶液、10%硫酸葡聚醣，和20μg/ml經變性剪切鮭魚精子DNA的溶液中培育過夜，然後在約65℃下藉由在0.1X SSC中洗滌。例示性嚴苛雜交條件是如上述具體條件至少約80%、85%、90%或95%嚴苛的雜交條件。其他嚴苛雜交條件是本技藝中已知的，而且也可用於鑑定本發明的核酸同源物(Current Protocols in Molecular Biology,Unit 6,pub.John Wiley & Sons,N.Y.1989)。

可以使用本文所述DNA分子的突變核苷酸，只要該突變體包括能夠維持如本文所述在乳牛中增加受孕率的核酸序列即可。具有這種突變的DNA 序列通常差別在於一個或多個核苷酸或胺基酸。序列變化可以是取代、插入，缺失或其組合。選殖基因的誘變技術是本技藝已知的。關於位點特異性誘變的方法可見於Gustin et al.,Biotechniques 14：22,1993；Barany,Gene 37：111-23,1985；Colicelli et al.,Mol.Gen.Genet.199：537-9,1985；以及Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,CSH Press 1989,pp.15.3-15.108中，且所有均透過引用的方式併入本文。總之，本發明有關能夠活化個體之胞質DNA監視分子的核酸序列及其變體或突變體。此外，本發明含括由所述核酸序列編碼的中間RNA以及任何編碼的所得胺基酸序列。

在一些態樣中，若免疫刺激性質體的核苷酸序列與SEQ ID NO：1和2中提供的序列不同，則質體中的CpG二核苷酸較佳保持不變。或者，若改變質體的核苷酸序列使得CpG二核苷酸被消除，則質體的序列可以在另一位置予以改變，使得質體中的CpG二核苷酸總數維持相同。除了已經存在於核苷酸序列pGCMB75.6中的CpG二核苷酸之外，還可以將更多CpG二核苷酸引入質體中。因此，例如本文所述的免疫刺激性質體較佳包含至少約200個、至少約220個、至少約240個、至少約260個、至少約270個、至少約275個、至少約280個、至少約283個、至少約285個，或至少約288個CpG二核苷酸。舉例而言，免疫刺激性質體可包含283個CpG二核苷酸。

在一些態樣中，若免疫刺激性質體的核苷酸序列與本文提供的序列不同時，則改變質體中的CpG模體類型以調節胞質DNA監測分子的所得活化狀態。舉例而言，可以增加免疫刺激性CpG模體的數目，以增加回應於免疫刺激性質體/DNA之特定閾值的特異性胞質DNA監測分子的活化狀態。作為進一步的實例，可以增加非免疫刺激性CpG模體的數目以減少特異性胞質DNA監測分子的活化狀態及/或增加其他DNA監測分子的活化狀態。

特別地，本發明有關包含本文所述的任何免疫刺激性質體或DNA序列以及醫藥學上可接受之載劑的醫藥調配物。

B.免疫調節劑

美國專利申請公開第2012/0064151 A1號和第2013/0295167 A1號中描述了與本文所述免疫刺激性質體一起使用的合適免疫調節劑組成物，其整體內容以引用的方式併入本文。

免疫調節劑組成物包含脂質體遞送媒劑以及本文所述免疫刺激性質體或DNA序列中的至少一者。

合適的脂質體遞送媒劑包含能夠將核酸分子遞送至待處理個體之組織的脂質組成物。脂質體遞送媒劑較佳能夠在個體中維持足夠時間的穩定，以遞送核酸分子及/或生物劑。例如，脂質體遞送媒劑在接受者個體體內穩定至少約5分鐘、至少約1小時，或至少約24小時。

本發明的脂質體遞送媒劑包含能夠促進核酸分子遞送到細胞中的脂質組成物。當核酸分子編碼一或多種蛋白質時，核酸：脂質體複合物較佳具有每微克(μg)遞送核酸每毫克(mg)總組織蛋白至少約1皮克(pg)表現蛋白質的轉染效率。例如，核酸：脂質體複合物的轉染效率可以是每μg遞送核酸每mg總組織蛋白至少約10pg表現蛋白質；或每μg遞送核酸每mg總組織蛋白至少約50pg表現蛋白質。複合物的轉染效率可以低至每μg遞送核酸每mg總組織蛋白1飛克(fg)，其中上述量更佳。

本發明的較佳脂質體遞送媒劑的直徑為約100至500奈米(nm)。例如，脂質體遞送媒劑的直徑可以是約150nm和450nm之間或約200nm和400nm之間。

合適的脂質體包括任何脂質體，例如那些常用於例如習於本技藝者已知的基因遞送方法者。較佳的脂質體遞送媒劑包括多層囊泡(MLV)脂質和擠出脂質。MLV的製備方法是本技藝中所熟知的。更佳的脂質體遞送媒劑包含具有聚陽離子脂質組成物的脂質體(即陽離子脂質體)及/或具有與聚乙二醇綴合之膽固醇骨架的脂質體。例示性陽離子脂質體組成物包括，但不限於N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)和膽固醇、N-[1-(2,3二油醯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)和膽固醇、1-[2-(油醯基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)-咪唑啉氯化物(DOTIM)和膽固醇、二甲基二十八烷基溴化銨(DDAB)和膽固醇，及其組合。用作遞送媒劑的最佳脂質體組成物包括DOTIM和膽固醇。

合適的核酸分子包括本文所述的任何免疫刺激性質體。編碼核酸序列編碼蛋白質或肽的至少一部分，而非編碼序列不編碼蛋白質或肽的任何部分。根據本發明，「非編碼」核酸可包括轉錄單元的調節區，例如啟動子區。術語「空載體」可與術語「非編碼」交替使用，且特別意指不存在蛋白質編碼部分的核酸序列，例如沒有基因插入片段的質體載體。表現由本文所述質體編碼的蛋白質不是胞質DNA監測分子活化所必需的；因此質體不需要含有與轉錄控制序列可操作連接的任何編碼序列。然而，透過將編碼免疫原及/或細胞介素的核酸序列(DNA或RNA)併入組成物中，可獲得更多好處(即，抗原特異性和免疫增強)。編碼免疫原及/或細胞介素的此核酸序列可納入本文所述的免疫刺激性質體中，或可納入組成物的個別核酸(例如，個別質體)中。

可以使用本技藝中的標準方法或美國專利第6,693,086號中所述的方法使脂質體與本文所述的免疫刺激性質體複合，其整體內容以引用的方式併入本文。添加到脂質體的適當質體濃度包括有效遞送足量質體至個體中，以便引起全身性免疫反應的濃度。例如，約0.1μg至約10μg質體可與約8nmol脂質體組合、約0.5μg至約5μg質體可與約8nmol脂質體組合，或可將約1.0μg質體與約8nmol脂質體組合。組成物中質體與脂質的比率(μg質體：nmol脂質)可以是依重量至少約1：1質體：脂質(例如，1μg質體：1nmol脂質)。例如，質體相對脂質的比率可為至少約1：5、至少約1：10或至少約1：20。本文表示的比率是基於組成物中陽離子脂質的量，而不是組成物中脂質的總量。本發明組成物中質體與脂質的比率適宜地為依重量約1：1至約1：80質體：脂質；依重量約1：2至約1：40質體：脂質；依重量約1：3至約1：30質體：脂質；或依重量約1：6至約1：15質體：脂質。

C.生物劑

除了脂質體遞送媒劑以及本文所述的至少一種質體之外，本文所述任何免疫調節劑組成物可進一步包含至少一種生物劑。

合適的生物劑是有效預防或治療疾病的藥劑。這樣的生物劑包括免疫增強蛋白、免疫原、疫苗，抗微生物劑或其任何組合。合適的免疫增強蛋白是那些已知可增強免疫的蛋白質。作為非限制性實例，細胞介素(包括蛋白質家族)是已知的免疫增強蛋白家族。合適的免疫原是引起體液性及/或細胞性免疫反應的蛋白質，使得對個體投與免疫原會產生對抗在個體組織內遇到的相同或相似蛋白質的免疫原特異性免疫反應。免疫原可以包括由細菌、病毒、寄生蟲或真菌表現的病原性抗原。較佳的抗原包括衍生自在個體體內引起感染性疾病的生物體的抗原。根據本發明，免疫原可以是引發體液性及/或細胞性免疫反應的天然存在或合成衍生之蛋白質的任何部分。因此，抗原或免疫原的大小可以小至約5-12個胺基酸並大至如全長蛋白，包括其間的任何大小。抗原可以是多聚體蛋白或融合蛋白。抗原可以是純化的抗原。或者，免疫增強蛋白或免疫原可由免疫刺激性質體或由納入免疫調節劑組成物中的另一種核酸所編碼。若免疫增強蛋白或免疫原是由免疫調節劑組成物中的核酸分子所編碼，則將編碼免疫增強蛋白或免疫原的核酸序列可操作連接於轉錄控制序列，使得免疫原在個體的某一個組織中表現，從而除了非特異性免疫反應外在個體體內引起免疫原特異性免疫反應。篩選免疫原性(諸如病原體抗原免疫原性或細胞介素活性)的技術為習於技藝者所熟知並包括多種體外和體內分析。

若生物劑是疫苗，則該疫苗可包括活的、感染性病毒性，細菌性或寄生蟲疫苗，或殺死、不活化的病毒性、細菌性或寄生蟲疫苗。一或多種疫苗(活的或殺死的病毒性疫苗)也可以與本發明的免疫調節劑組成物組合使用。合適的疫苗包括那些在技藝中已知用於禽類或牛物種的疫苗。

生物劑可以是抗微生物劑。合適的抗微生物劑包括：喹諾酮類(quinolones)(較佳氟喹諾酮)、β-內醯胺類(β-lactams)，以及巨環內酯類-林可黴素類鏈陽菌素類(macrolide-lincosamidestreptogramin,MLS)抗生素。

合適的喹諾酮包括班氟沙星(benofloxacin)、賓氟沙星(binfloxacin)，西諾沙星(cinoxacin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、克林沙星(clinafloxacin)、達氟沙星(danofloxacin)、二氟沙星(difloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、恩氟沙星(enrofloxacin)、氟羅沙星(fleroxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、依巴沙星(ibafloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、馬波沙星(marbofloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、奧比沙星(orbifloxacin)、帕珠沙星(pazufloxacin)、普拉沙星(pradofloxacin)、培氟沙星(perfloxacin)、沙拉沙星(sarafloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、替馬沙星(temafloxacin)以及妥舒沙星(tosufloxacin)。較佳的氟喹諾酮包括環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、莫西沙星和普拉沙星。合適的萘啶酮包括萘啶酸。合適的β-內醯胺包括青黴素(例如阿莫西林(amoxicillin)、胺芐西林(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、芐星青黴素(benzathine penicillin)、芐青黴素(benzylpenicillin)、羧芐西林(carbenicillin)、氯唑西林(cloxacillin)、阿莫克拉(co-amoxiclav)[即阿莫西林(amoxicillin)/克拉維酸(clavulanic acid)]、雙氯西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、甲氧西林(methicillin)、美洛西林(mezlocillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、苯氧基甲基青黴素(phenoxymethylpenicillin)、哌拉西林(piperacillin)、普魯卡因青黴素(procaine penicillin)、替莫西林(temocillin)及替卡西林(ticarcillin))；頭孢菌素(例如、頭孢克洛(cefaclor)、頭孢羅寧(cefalonium)、頭孢孟多(cefamandole)、頭孢匹林(cefapririn)、頭孢唑啉(cefazolin)、頭孢吡肟(cefepime)、頭孢克肟(cefixime)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢西丁(cefoxitin)、頭孢匹羅(cefpirome)、頭孢泊肟(cefpodoxime)、頭孢喹肟(cefquinome)、頭孢他啶(ceftazidime)、頭孢噻呋(ceftiofur)、頭孢三嗪(ceftriaxone)、頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢胺芐(cephalexin)、頭孢噻吩(cephalothin)及頭孢替坦(defotetan))；碳青黴烯和青黴烯(例如多利培南(doripenem)、厄他培南(ertapenem)、法羅培南(faropenem)、亞胺培南(imipenem)和美羅培南(meropenem))；單環內醯胺(例如，胺曲南(aztreonam)、諾卡殺菌素A(nocardicin A)、煙草毒素(tabtoxinine)-β內醯胺，和替吉莫南(tigemonam))；和β內醯胺酶抑制劑(例如克拉維酸、舒巴坦(sulbactam)、他唑巴坦(tazobactam))。較佳的β內醯胺包括頭孢菌素，特別是頭孢唑啉。

合適的MLS抗生素包括克林達黴素(clindamycin)、林可黴素(lincomycin)、吡利黴素(pirlimycin)，以及任何巨環內酯類抗生素。較佳的林可醯胺類抗生素為吡利黴素。

其他抗微生物劑包括胺基糖苷類、氯羥吡啶(clopidol)、待美嘧唑(dimetridazoles)、紅黴素(erythromycin)、新黴素B(framycetin)、呋喃唑酮(furazolidone)、鹵夫酮(halofuginone)、2-吡啶酮(2-pyridones)、氯苯胍 (robenidine)、磺胺類(sulfonamides)、四環素類、甲氧芐啶(trimethoprim)，各種截短側耳素(pleuromutilin)(例如，泰妙菌素(tiamulin)和伐奈莫林(valnemulin))，以及各種鏈黴素(例如莫能菌素(monensin)、甲基鹽黴素(narasin)，和鹽黴素(salinomycin))。

II.方法 A.免疫刺激的方法

在本發明的一個具體例中，透過對牛物種雌性成員投與有效量的免疫調節劑組成物而在牛物種的雌性成員體內引起免疫反應。有效量足以在牛物種的雌性成員體內引發免疫反應。免疫調節劑包括脂質體遞送媒劑以及核酸分子。

在一個具體例中，免疫調節劑的有效量為每隻動物約1微克至約1000微克。在另一個具體例中，免疫調節劑的有效量為每隻動物約5微克至約500微克。在又一具體例中，免疫調節劑的有效量為每隻動物約10微克至約100微克。在另一個具體例中，免疫調節劑的有效量為每隻動物約10微克至約50微克。

在本發明的另一個具體例中，透過投與有效量的免疫調節劑在牛物種雌性成員體內引起免疫反應，該免疫調節劑包括脂質體遞送媒劑、經分離的核酸分子，以及生物劑。可預想該生物劑可以與免疫調節劑混合或共投與或與免疫調節劑獨立投與。獨立投與可以是在投與免疫調節劑之前或之後。還可以預想投與該免疫調節劑或生物劑多於一次可被用於擴展增強免疫。此外，超過一種生物劑可以與免疫調節劑共投與、在免疫調節劑之前投與、在免疫調節劑投與之後投與，或同時投與。

B.受孕率

本發明的方法可用於增加乳牛受孕率。在較佳具體例中，乳牛受孕率相對於對照群體的受孕率增加。在一些較佳具體例中，如依據p值

0.05所測量，乳牛受孕率相對於對照群體的受孕率增加。

本發明的方法可用於增加乳牛的第一次配種受孕率。如本文所用，第一次配種受孕率意指因第一次授精而懷孕之人工授精的配種乳牛比率。在較佳具體例中，乳牛的第一次配種受孕率相對於對照群體的第一次配種受孕率增加。在一些較佳具體例中，如依據p值

本發明方法可用於增加非循環乳牛的受孕率。如本文所用，「非循環」意指透過觀察或透過尾漆掉落，在配種計畫開始前大約30天未檢測出發情的乳牛。在較佳具體例中，非循環乳牛的受孕率相對於對照群體的受孕率增加。在一些較佳具體例中，如依據p值

本發明方法可用於增加非循環乳牛的第一次配種受孕率。在較佳具體例中，非循環乳牛的第一次配種受孕率相對於對照群體的第一次配種受孕率增加。在一些較佳具體例中，如依據p值

C.投與

多種投與途徑可供選擇。當然，選擇的特定模式將取決於所用的具體生物劑、個體的年齡和一般健康狀況、要治療的具體病症和治療效力所需的劑量。本發明的方法可使用產生有效程度之免疫反應，但不引起臨床上不可接受的副作用的任何投與模式來實施。該等組成物可以方便地以單位劑型存在並且可以藉由技藝中已知的任何方法來製備。

牛物種的免疫接種可以在任何年齡進行。疫苗可以靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、透過噴霧/氣溶膠、經口、眼內、氣管內、鼻內，或藉由本技藝已知的其他方法投與。此外，可預期的是，可以基於常規免疫接種時間表使用本發明方法。該免疫調節劑也可靜脈內、肌肉內、皮下、透過噴霧、經口、眼內、氣管內、鼻，或藉由本技藝中已知的其他方法投與。在一個具體例中，皮下投與免疫調節劑。在另一個具體例中，肌肉內投與免疫調節劑。在又另一個具體例中，免疫調節劑作為噴霧投與。在又一個具體例中，經口投與免疫調節劑。

在一個具體例中，該免疫調節劑本身是在分娩之前投與給動物。在另一個具體例中，該免疫調節劑本身是在分娩之後投與給動物。在又另一個具體例中，該免疫調節劑本身是在分娩同時投與給動物。在又另一個具體例中，該免疫調節劑本身是在分娩之前以及在分娩同時投與給動物。在又一個具體例中，該免疫調節劑組成物在分娩之前與免疫接種同時共投與。在又另一個具體例中，該免疫調節劑組成物在分娩同時與免疫接種同時共投與。共投與可包括投與疫苗和免疫調節劑至動物的相同大略位置的兩個相鄰不同部位(亦即，在動物頸部相鄰處的注射)、動物的相同大略位置的相反側(亦即，一者在頸部的一側)，或者在相同的動物的不同位置。在另一個具體例中，該免疫調節劑組成物在免疫接種前及分娩前投與。在另一個具體例中，該免疫調節劑組成物在免疫接種後但在分娩前投與。在又一個具體例中，該免疫調節劑組成物在分娩後投與給在分娩前已免疫接種的動物。習於技藝者將認知到，投與途徑可以根據個體和個體的健康或狀態而改變。

在一個具體例中，該免疫調節劑本身是在配種前投與給動物。在另一個具體例中，該免疫調節劑本身是在配種後投與給動物。在又另一個具體例中，該免疫調節劑本身是在與配種同時投與給動物。在又另一個具體例中，該免疫調節劑本身是在配種之前，以及與配種同時投與給動物。在其他具體例中，該免疫調節劑組成物在配種前與免疫接種同時共投與。在再另一個具體例中，該免疫調節劑組成物在與配種同時和免疫接種同時共投與。共投與可包括投與疫苗和免疫調節劑至動物的相同大略位置的兩個相鄰不同部位(亦即，在動物頸部相鄰處的注射)、動物的相同大略位置的相反側(亦即，一者在頸部的一側)，或者在相同的動物的不同位置。在另一個具體例中，該免疫調節劑組成物在免疫接種前及配種前投與。在另一個具體例中，該免疫調節劑組成物在免疫接種後但在配種前投與。在又一個具體例中，該免疫調節劑組成物在配種後投與給在配種前已免疫接種的動物。習於技藝者將認知到，投與途徑可以根據個體和個體的健康或狀態而改變。

在一個具體例中，該免疫調節劑是在攻毒前約1至約14天或攻毒後約1至約14天投與。在另一個具體例中，該免疫調節劑是在攻毒前約1至約7天或攻毒後約1至約7天投與。在又一個具體例中，該免疫調節劑在攻毒前1、2、3、4、5、6、7天或攻毒後1、2、3、4、5、6、7天投與。在一個較佳具體例中，該免疫調節劑在攻毒後前3天或攻毒後3天投與。

其他遞送系統可以包括定時釋放、延遲釋放或持續釋放遞送系統。這樣的系統可避免重複投與組成物而增加便利性。許多類型的釋放遞送系統是可用的且為技藝中具有通常技術者所熟知。它們包括以聚合物為基礎的系統，例如聚(乳酸交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己內酯、聚酯醯胺、聚原酸酯、聚羥基丁酸及聚酐。包含藥物的前述聚合物的微膠囊描述在例如美國專利第5,075,109號中。

遞送系統還包括本身為脂質的非聚合物系統，脂質包括固醇，例如膽固醇，膽固醇酯和脂肪酸或中性脂肪，例如單，二和三-甘油酯；水凝膠釋放系統；sylastic系統；以肽為基礎的系統；蠟塗層；使用常規黏合劑和賦形劑的壓縮片劑；部分融合的植入物；及類似物。具體實例包括，但不限於侵蝕系統，其中包含呈於基質中形式之本發明藥劑，例如那些在美國專利第4,452,775號、第4,675,189號與第5,736,152號中所述者；以及擴散系統，其中活性組分以控制速率從聚合物滲透，諸如在美國專利第3,854,480號、第5,133,974號和第5,407,686號中所述。此外，可以使用以泵為基礎的硬體遞送系統，其中一些適於植入。

由於可在不偏離本發明範疇的情況下對上述組成物、產品和方法進行各種修改，上文說明以及下文提供的實例的所有內容意欲應具有說明性而非限制性。

定義

術語「有效量」是指實現期望生物學作用所需或足夠之量。例如，用於治療或預防感染性疾病的免疫調節劑有效量是在暴露於微生物後產生免疫反應，從而使個體體內的微生物數量降低，並且較佳根除微生物的必需量。任何具體施用的有效量可以根據這些因素(諸如待治療疾病或病症、個體體型，或疾病或病症的嚴重程度)而改變。技藝中具有通常技術者可以根據經驗確定免疫調節劑的有效量，而不需要過度實驗。

如本文所使用的術語「牛」是指牛物種的任何成員，其能夠養育後代，包括但不限於雌性牛，乳牛和母牛。

術語「細胞介素」意指免疫增強蛋白家族。細胞介素家族包括造血生長因子、介白素、干擾素、免疫球蛋白超家族分子、腫瘤壞死因子家族分子和趨化因子(即調節細胞遷移和活化，特別是吞噬細胞的蛋白質)。例示性細胞介素包括但不限於介白素-2(IL-2)、介白素-12(IL-12)、介白素-15(IL-15)、介白素18(IL-18)，干擾素-α(IFNα)以及干擾素-γ(IFNγ)。

術語「引發」可以與術語活化、刺激、產生或上調交替使用。

術語在個體體內「引發免疫反應」意指特異性地控制或影響免疫反應的活性，並且可以包括活化免疫反應、上調免疫反應、增強免疫反應及/或改變免疫反應(諸如透過引發某類型免疫反應，其反過來將個體體內普遍的免疫反應從有害的或無效的改變成有利的或具保護性)。

術語「可操作地連接」意指轉染(即，轉形，轉導或轉染)至宿主細胞時核酸分子能夠被表現的方式，將核酸分子連接至轉錄控制序列。轉錄控制序列是控制轉錄起始、延伸和終止的序列。特別重要的轉錄控制序列是那些控制轉錄起始者，諸如啟動子、增強子，操縱子和阻抑子序列。各種此等轉錄控制序列為習於技藝者所熟知。較佳的轉錄控制序列包括那些在禽類、魚類、哺乳動物、細菌，植物和昆蟲細胞中發揮功能者。雖然任何轉錄控制序列可與本發明一起使用，但該等序列可以包括天然存在的天然地與編碼免疫原或免疫刺激蛋白之序列締合的轉錄控制序列。

術語「核酸分子」和「核酸序列」可以交替使用，且包括DNA、RNA，或DNA或RNA衍生物。該術語還包括寡核苷酸和更大的序列，包括編碼蛋白質或其片段的核酸分子，以及包含調節區、內含子或其他非編碼DNA或RNA的核酸分子。典型地，寡核苷酸具有長度從約1至約500個核苷酸，並且更典型地為長度至少約5個核苷酸的核酸序列。核酸分子可以衍生自任何來源，包括哺乳動物、魚類、細菌、昆蟲、病毒，植物或合成來源。核酸分子可透過諸如重組DNA技術(例如聚合酶鏈反應(PCR)、擴增、選殖)或化學合成的技藝已知方法來製造。核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括但不限於天然對位基因變體和經修飾的核酸分子，其中核苷酸已經以此等修飾基本上不干擾核酸分子編碼用於本發明方法中之免疫原或免疫刺激蛋白之能力這樣的方式被插入、缺失、取代，或倒置。核酸同源物可以使用多種習於技藝者已知的方法來製造(參見，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labs Press, 1989)，其以引用的方式併入本文。篩選免疫原性(諸如病原體抗原免疫原性或細胞介素活性)的技術為習於技藝者所熟知，並包括多種體外和體內分析。

術語「可選擇標記」及「可選擇標記基因」意指編碼保護生物體之產物的基因，該基因在通常會殺死生物體或抑制其生長的選擇劑(例如抗生素)或條件下表現。可選擇標記基因是最常用的抗生素抗性基因(例如，康黴素抗性基因、胺芐青黴素抗性基因、氯黴素抗性基因、四環素抗性基因等)。因此，例如，當大腸桿菌細胞進行轉形程序將編碼康黴素抗性基因的質體引入，然後於含有康黴素的培養基之上或之中生長，僅有成功攝入質體並表現康黴素抗性基因的大腸桿菌細胞得以存活下來。術語「可選擇標記」和「可選擇標記基因」亦包括編碼涉及合成生物體生長所必需之化合物之酶的基因。當引入不能合成必需化合物的營養缺陷型生物體時，這些基因允許生物體在已經補充有必需化合物的培養基中生長。例如，由於一個涉及離胺酸生合成之酶突變或不存在而通常無法在未補充有離胺酸的培養基上生長，則細菌細胞對那個胺基酸離胺酸來說是營養缺陷型。當這種細菌進行轉形程序以引入編碼涉及離胺酸生合成之酶的質體，已成功攝入質體並表現該酶的細菌在未補充有離胺酸的培養基上生長時將得以存活。術語「可選擇標記」和「可選擇標記基因」進一步包括允許毒/解毒劑選擇的基因。例如，ccdB基因編碼結合到DNA迴旋酶(一種關於細胞分裂必需的酶)的蛋白質。在結合至DNA迴旋酶之後，ccdB基因產物妨害基因複製並誘導細胞死亡。因此，表現ccdB基因產物的細菌無法存活下來。ccdA基因編碼充當ccdB基因產物之天然抑制劑的蛋白質(以下簡稱「解毒劑」)。因此，當在其細菌基因組中具有ccdB基因的細菌進行轉形程序以引入編碼ccdA基因產物之質體時，只有成功地攝入質體並表現ccdA基因的細胞會存活下來。

術語「可篩選標記」和「可篩選標記基因」意指編碼某個產物的基因，該產物容許觀察者區別表現可篩選標記基因之細胞以及未表現可篩選標記基因之細胞。可篩選標記基因系統是技藝中所熟知的，並且包括例如，lacZ基因和編碼螢光蛋白(如綠色螢光蛋白(GFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、紅色螢光蛋白(RFP)、藍色螢光蛋白(BFP)，或青色螢光蛋白(CFP))的基因。

實例

下面實例說明本發明的各種具體例。

實例1：免疫調節劑組成物在非循環乳牛中增加受孕率的效力

本研究之目的是要評估在產犢時調節免疫功能對於經處理乳牛之生殖結果的效用。

免疫調節劑

在本研究中使用的免疫調節劑是上文實例1中所述的組成物。研究動物

由紐西蘭懷卡托區(Waikato district)的兩處商用乳業農場A與B取得875頭年齡

2歲的荷蘭牛(Friesian)、娟姍牛(Jersey)或雜交種。根據最近被產下及哺乳中來選擇乳牛。若乳牛在產犢前30天內用抗生素、非類固醇消炎藥或皮質類固醇治療，或是若牠們在產犢時顯示有任何疾病的顯著證據。則予以排除。其餘動物依據年齡被分組(母牛相對於乳牛)並且從預先準備的隨機化列表呈現之動物依序配對分派至處理組或安慰劑組。

處理

處理是隨機的，且在任何後處理採樣片沒有納入處理分配而牛奶樣品在取得時被分派唯一的號碼，其於後續實驗室分析期間使用。產犢當天(第0天)與之後的身體檢查和登錄當天，透過肌肉內注射將適當處理投與到右臀肌中。在注射前，用70%甲基化酒精浸濕的棉球擦拭注射部位。在第3天晚上或第4天早上，且再次在第7天產後利用注射在右臀肌來重複進行處理。

配種管理

在配種程序計畫開始前約30天施用尾漆(熱檢測助劑)。透過觀察或尾漆脫落而未檢測到發情的那些乳牛用黃體素、GnRH和前列腺素F_2α的組合予以處理，並且飼養至設定時間人工授精。就前37天在農場A以及前47天在農場B來說，那些檢測為正在發情的母牛透過人工授精進行配種。之後，未閹割公牛加入牛群。總交配期長度分別為77天(農場A)和80天(農場B)。在配種程序開始後83天與113天(農場A)以及在這個配種程序開始後90與120天(農場B)，透過經直腸超音波檢查乳牛。檢測為懷孕的乳牛具有評估的妊娠階段。若評估妊娠階段是在配種記錄的7天內，無論是人工授精或自然交配，則記錄的日期被認為是受孕日。

結果

計算出三週發情率(submission rate)(在配種程序開始時三週內受檢測且授精的母牛比率)、第一次配種受孕率(因第一次授精而懷孕之人工授精配種的乳牛比率)與3週和6週懷孕率(in calf rate)(在配種程序的前三週與前六週內確認懷孕的乳牛比率)，以及最終懷孕率。

最初以二變項(卡方)分析來分析二項式再現性結果。進行多變項邏輯廻歸模型，包括處理、牛群、年齡(2歲，3歲和>3歲)、在配種程序開始泌乳的天數(歸類為50至71天，以及

72天)和品種(紐西蘭牛相對其他品種)的說明性變項。此外，每頭乳牛計算交配計劃開始至受孕間隔並且使用Kaplan-Meier存活分析來計算至受孕的中位數日。

針對品種代碼與年齡對處理組進行平衡，並使用卡方檢定計算p值，如表1中所示。

另外，在處理組和對照組之間，從產犢到配種計畫開始的平均值時間和中位數時間是相同的，如表2中所示。比較處理組與對照組從產犢到配種計畫開始的中位數天數的P值是使用曼惠特尼(Mann-Whitney)檢定來計算。

如表3中所示，就在配種計畫開始(PSM)後21天內因人工授精而發情(3週內發情)的概率、PSM之後因第一次授精而受孕的概率(第一次配種受孕)、PSM之後在21天與42天懷孕(分別在3週內與6週內懷孕)的概率，以及在二變項層級上的整體懷孕來說，處理組與對照組之間沒有差異。使用卡方檢定計算P值。

在控制潛在效應修正因子(包括品種(紐西蘭、娟姍及雜交)、年齡(2，3和4歲)、牛群(1和2)、卵巢循環活力(循環以及非循環，依據CIDR裝置插入)與從產犢至PSM之時間(50至71天，與

72天)的多變項廻歸分析中，相較於對照組中的對應乳牛，經處理組的非循環乳牛有較高的概率在第一次配種受孕並在3週內懷孕。針對循環乳牛以及非循環乳牛依據處理組來區別，圖4A顯示第一次授精受孕的概率圖(估算邊際平均值和平均值標準誤差(SEM))，而圖4B顯示在配種程序計畫開始後3週內懷孕的概率(估算邊際平均值及SEM)。星號表示在非循環組內的處理之間有差異。從PSM至懷孕的中位數時間分別為15天(處理組)和16天(對照組)(P=0.27)。

在數值上，相比於未處理的對照乳牛，更多經處理乳牛因第一次配種而受孕(經處理69%對未處理65%)，在三週時為63%對61%，而在6週時為80%對76%。依據非循環狀態交互作用進行處理(其中那些未被診斷為發情且針對這個情況進行處理的乳牛)，經處理乳牛在進入配種程序三週時有更高的第一次配種受孕率以及更高的懷孕概率。

<110> 德商拜耳動物保健有限公司(Bayer Animal Health GmbH)

<120> 牛物種中增加的生育力

<140> TW 106124943

<141> 2017-07-25

<150> US 62/366,772

<151> 2016-07-26

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4242

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質體pMB75.6的核苷酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 4242

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 質體pGCMB75.6的核苷酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 4242

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質體pLacZMB75.6的核苷酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 4242

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質體pMB75.6_AscI的核苷酸序列

<400> 4

Claims

一種免疫調節劑組成物用於製造增加非患病的乳牛受孕率的藥物之用途，其中該免疫調節劑組成物包含：a.陽離子脂質體遞送媒劑，其中該脂質體遞送媒劑包含選自由以下組成之群的脂質對：N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)和膽固醇；N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)和膽固醇；1-[2-(油醯基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑啉氯化物(DOTIM)和膽固醇；以及二甲基二十八烷基溴化銨(DDAB)和膽固醇；以及b.經分離的細菌衍生核酸分子，其具有與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的序列具有至少80%序列同一性，其中該核酸分子具有至少260個CpG二核苷酸；且其包含限於編碼可選擇或可篩選標記或可選擇或可篩選標記之一部分者的編碼序列。
如請求項1之用途，其中該核酸分子包含至少一種免疫刺激性CpG模體以及至少一種非免疫刺激性CpG模體。
如請求項1之用途，其中該核酸分子包含SEQ ID NO：1。
如請求項1之用途，其中該核酸分子包含SEQ ID NO：2。
如請求項1之用途，其進一步包含生物劑。
如請求項5之用途，其中該生物劑選自由免疫增強蛋白、免疫原、疫苗，抗微生物劑或其任何組合組成之群。
如請求項1之用途，其中投與選自由靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、透過噴霧-氣溶膠、經口、眼內、氣管內以及鼻內組成之群。
如請求項1之用途，其進一步包含醫藥學上可接受的載劑。
如請求項1至4中任一項之用途，其中該核酸分子係由SEQ ID NO：1組成。
如請求項1之用途，其中如依據p值
0.05所測量，牛的受孕率相對於對照群體的受孕率增加。
如請求項1之用途，其中非循環乳牛的受孕率增加。