KR101966989B1 - 조류 종에서의 면역반응 강화 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조류 종의 멤버에서 비-항원-특이적 면역반응을 효과적으로 유도하기 위한 면역 활성화의 방법에 관한 것이다. 본 방법은 특히, 조류 종의 멤버를 전염병으로부터 보호하고, 전염병에 걸린 동물을 치료하는데 효과적이다.

Description

조류 종에서의 면역반응 강화 {Enhanced Immune Response in Avian Species}

본 발명은 조류 종에서의 면역 활성 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 호흡기성 및 전신성 비-특이적 및 항원-특이적 면역반응을 유도하는 방법을 포함하고, 이는 전염병에 대한 동물 면역, 예방접종 및 치료에 유용하다.

백신은 전염병을 예방하고 기존 질병을 치료하는데 사용된다. 전염병은 바이러스, 박테리아, 기생충, 및 기타 진균류를 포함하는 감염원에 의하여 야기된다. 포유류, 조류, 어류, 및 영장류를 포함하는 모든 형태의 종에 대한 전염병을 예방하고 치료하기 위하여 많은 시약과 방법이 개발되어 왔다.

예방접종 프로그램은 식품 산업에 있어 상업적으로 사육되는 동물을 위하여 특히 중요하다. 조류는 많은 형태의 전염에 있어서 주요한 대상이 된다. 사육자와 상업용 닭, 칠면조 및 기타 가금류는 병원균의 환경적 노출로부터 보호하기 위하여 일상적으로 예방접종이 이루어진다. 양계업에 있어서 경제적으로 가장 중요한 질병 중에 하나는 마릭병 (Marek's disease)인데, 이는 닭에게 자연적으로 발생하는 림프증식성 질병이다. 이 질병은 수평적으로 퍼지는 전염성이 높은 포진바이러스 (herpesvirus)에 의해 발생하며, 양계업에 커다란 경제적 손실을 가져오고 있다. 마릭병의 증상은 전염된 조류의 신경계, 생식기관, 내장기관, 눈과 피부에 걸쳐 넓게 나타나며, 운동신경 마비, 기관기능 감소, 만성적인 영양결핍을 일으켜 궁극적으로 죽음에 이르게 된다.

부화한 조류는 탄생 후에 병원성 미생물에 짧게 노출된다. 비록 초기에는 이러한 조류가 모체로부터 물려받은 항체에 의하여 병원균으로부터 보호되지만 이러한 보호는 단지 일시적이고, 조류 자체의 미성숙한 면역체계가 병원균으로부터 조류를 보호하기 시작하여야 한다. 대개 가장 민감한 어린 조류의 전염을 예방하는 것이 바람직하다. 또한, 특히 비좁은 공간에 조류가 갇혀있는 경우 질병이 빠르게 퍼지게 되므로 늙은 조류의 전염을 예방하는 것이 바람직하다.

대부분의 상업적 가금류의 경우, 새롭게 부화한 병아리들은 부화시 비경구적으로 특정 백신이 주어진다. 병원균에 대한 노출은 아주 어린 시기에 이루어지기 때문에, 병아리들은 사육장 또는 인공부화기에 놓이기 전에 예방접종이 이루어져야 한다. 예방접종 계획의 경우 개개의 조류들 별로 이루어져야 하고, 우연한 자가접종의 가능성을 수반한다. 나아가 이러한 예방접종은 언제나 효과가 있는 것은 아니다. 어린 병아리들은 아마도 예방접종 후 충분한 보호 면역체계를 형성할 기회를 갖기 전에 너무 빨리 치명적인 형태의 질병에 노출되게 될 것이다.

일부 살아있는 바이러스성 백신은 조류가 부화하기 전 알에 투여될 수 있다. 이러한 과정을 "인 오보 예방접종 (in ovo vaccination)"이라 한다. 인 오보 예방접종된 조류는 대상 질병에 대한 저항성을 발달시킨다. 그러나, 부화한 조류에 사용되는 다수의 백신은 백신 제제의 배아 병원성 때문에 인 오보 예방접종에 사용될 수 없다. 말기 배아는 검사된 대부분의 백신 바이러스에 대한 전염에 매우 민감하다. 새로 부화한 병아리에 비-병원성인 모든 백신 바이러스가 말기 배아에 안전한 것은 아니다. 예를 들어 새로 부화한 병아리의 신생아 백신으로서 일상적으로 사용되는 기관지염 바이러스 (infectious bronchitis virus; IBV) 및 뉴 캐슬병 바이러스 (Newcastle disease virus; NDV)의 백신 균주는 배아 다음의 인 오보 접종에 치명적이다. 이러한 바이러스는 인 오보 사용에 안전하게 제공되도록 변형되어왔다. 바이러스의 변형은 면역반응의 발생을 약화시키고 그리하여 말기 배아를 보호하는 덜 효과적인 백신 제제가 된다.

전염병과 경제적 손실로부터의 보호를 제공하는데 필요로 하는 이질적인 백신들로 인해 예방접종 프로그램이 복잡하게 된다. 그러므로 전염병으로부터 조류의 보호를 강화하고 투여가 용이한 비-항원-특이적 면역반응을 유도하는 방법에 대한 필요성이 있다. 또한, 하나 이상의 감염원에 대한 보호 기능을 제공하는 면역반응을 유도하는 방법을 갖는 것이 바람직하다. 나아가 장시간 지속되거나 백신의 보조 접종이 요구되지 않는 면역반응을 유도하는 방법의 필요성이 있다. 본 발명은 가금류의 병적 상태를 감소시키고, 하나 이상의 감염원에 대한 보호 기능을 제공하며, 일반적으로 당분야에서 알려진 다른 제품보다 장시간의 보호를 제공하는 조류에서의 비-항원-특이적인 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

도 1은 다르게 처리된 발육계란 그룹 간의 부화율을 도표로 나타낸 것이다. 분석한 연구그룹에는 T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 (challenged) 경우; T2, 0.1㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T4, 10.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우가 포함되었다.
도 2는 부화 후 일당 우리마다 평균 일일 치사율을 도표로 나타낸 것이다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T2, 0.1㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E.coli로 챌린지한 경우; T4, 10.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 3은 초기의 발육계란의 수를 기준으로 우리마다 임의의 특정 연구일에 조류의 생존 비율을 도표로 나타낸 것이다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E.coli로 챌린지한 경우; T2, 0.1㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T4, 10.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 4는 부화 후 조류의 생존 능력을 도표로 나타낸 것이다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T2, 0.1㎍ 면역조절제/계란 및 E.coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T4, 10.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 5는 생존율, 부화 치사율, 부화 후 연구 7일 동안 치사율을 도표로 나타낸 것이다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 6은 생존율, 부화 치사율, 부화 후 연구 14일 동안 치사율을 도표로 나타낸 것이다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 7은 생존율, 부화 치사율, 부화 후 연구 21일 동안 치사율을 도표로 나타낸 것이다. T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 8은 생존율, 부화 치사율, 부화 후 연구 28일 동안 치사율을 도표로 나타낸 것이다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 9는 생존율, 부화 치사율, 부화 후 연구 35일 동안 치사율을 도표로 나타낸 것이다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 10은 생존율, 부화 치사율, 부화 후 연구 45일 동안 치사율을 도표로 나타낸 것이다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 11은 18일 된 배아에서부터 연구 45일 동안 그룹당 누적된 치사율을 보여준다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T2, 0.1㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E.coli로 챌린지한 경우; T4, 10.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 12는 부화 후 연구 0일에서부터 연구 45일 동안 그룹당 누적된 치사율을 보여준다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T2, 0.1㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T4, 10.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 13은 연구 0일에서부터 연구 7일까지 관찰된 총 평균 체중 증가를 보여준다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T2, 0.1㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E.coli로 챌린지한 경우; T4, 10.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 14는 연구 0일에서부터 연구 14일까지 관찰된 총 평균 체중 증가를 보여준다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T2, 0.1㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E.coli로 챌린지한 경우; T4, 10.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 15는 연구 0일에서부터 연구 21일까지 관찰된 총 평균 체중 증가를 보여준다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T2, 0.1㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E.coli로 챌린지한 경우; T4, 10.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 16은 연구 0일에서부터 연구 28일까지 관찰된 총 평균 체중 증가를 보여준다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T2, 0.1㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E.coli로 챌린지한 경우; T4, 10.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 17은 연구 0일에서부터 연구 35일까지 관찰된 총 평균 체중 증가를 보여준다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T2, 0.1㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E.coli로 챌린지한 경우; T4, 10.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 18은 연구 0일에서부터 연구 45일까지 관찰된 총 평균 체중 증가를 보여준다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T2, 0.1㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E.coli로 챌린지한 경우; T4, 10.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 19는 발육계란의 연구그룹당 부화한 닭의 수를 도표로 나타낸 것이다. 분석한 연구그룹은 T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T2, 0.1㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T4, 10.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우를 포함한다.
도 20은 연구 7일에 그룹당 생존한 닭의 수를 도표로 나타낸 것이다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T2, 0.1㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T4, 10.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 21은 연구 7일에 그룹당 생존한 닭과 죽은 닭의 비교를 보여준다.
도 22는 연구 7일 동안 연구 그룹당 치사율을 보여준다. 범례: T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T2, 0.1㎍ 면역조절제/계란 및 E.coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T4, 10.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 23은 죽은 배아, 죽은 닭 및 생존한 닭 (녹색)을 포함한 각 그룹의 연구 마지막 (7일)에 생존해 있는 조류의 수를 도표로 나타낸 것이다. T1, 0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T2, 0.1㎍ 면역조절제/계란 및 E.coli로 챌린지한 경우; T3, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T4, 10.0㎍ 면역조절제/계란 및 E. coli로 챌린지한 경우; T5, 0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우; T6, 1.0㎍ 면역조절제/계란 및 챌린지하지 않은 경우
도 24는 발육계란의 연구 그룹당 부화한 닭의 비율을 도표로 나타낸 것이다. 분석한 연구그룹에는 표 4에 제시된 것들이 포함된다.
도 25는 부화 후 연구 7일 동안 E. coli로 챌린지되지 않은 연구그룹의 치사율을 보여준다. 분석한 연구그룹에는 표 4에 제시된 것들이 포함된다.
도 26은 부화 후 연구 7일 동안 E. coli로 챌린지된 연구그룹의 치사율을 보여준다. 분석한 연구그룹에는 표 4에 제시된 것들이 포함된다.
도 27은 부화 후 연구 7일 동안 각 연구그룹의 치사율을 도표로 나타낸 것이다. 분석한 연구그룹에는 표 4에 제시된 것들이 포함된다.
도 28은 부화 후 연구 7일 동안 각 연구그룹의 생존율을 나타낸다. 분석한 연구그룹에는 표 4에 제시된 것들이 포함된다.
도 29는 연구 7일에 각 연구그룹의 치사율을 나타낸다. 분석한 연구그룹에는 표 4에 제시된 것들이 포함된다.
도 30은 연구 7일 및 14일 동안의 각 연구그룹의 주간 치사율을 보여준다. 분석한 연구그룹에는 표 4에 제시된 것들의 서브그룹이 포함된다.
도 31은 연구 첫째 주의 비장세포 내 HVT의 MD 백신 복제에서 면역조절제의 효과를 도표로 나타낸 것이다. 분석한 연구그룹에는 표 5에 제시된 것들이 포함된다.
도 32는 연구 첫째 주의 PMBC 내 HVT의 MD 백신 복제에서 면역조절제의 효과를 도표로 나타낸 것이다. 분석한 연구그룹에는 표 5에 제시된 것들이 포함된다.
도 33은 연구 첫째 주의 비장세포 내 SB-1의 MD 백신 복제에서 면역조절제의 효과를 도표로 나타낸 것이다. 분석한 연구그룹에는 표 5에 제시된 것들이 포함된다.
도 34는 연구 첫째 주의 PMBC 내 SB-1의 MD 백신 복제에서 면역조절제의 효과를 도표로 나타낸 것이다. 분석한 연구그룹에는 표 5에 제시된 것들이 포함된다.
도 35는 연구 둘째 주의 비장세포 내 HVT의 MD 백신 복제에서 면역조절제의 효과를 도표로 나타낸 것이다. 분석한 연구그룹에는 표 5에 제시된 것들이 포함된다.
도 36은 연구 둘째 주의 PMBC 내 HVT의 MD 백신 복제에서 면역조절제의 효과를 도표로 나타낸 것이다. 분석한 연구그룹에는 표 5에 제시된 것들이 포함된다.
도 37은 연구 둘째 주의 비장세포 내 SB-1의 MD 백신 복제에서 면역조절제의 효과를 도표로 나타낸 것이다. 분석한 연구그룹에는 표 5에 제시된 것들이 포함된다.
도 38은 연구 둘째 주의 PMBC 내 SB-1의 MD 백신 복제에서 면역조절제의 효과를 도표로 나타낸 것이다. 분석한 연구그룹에는 표 5에 제시된 것들이 포함된다.
도 39는 인 오보 면역조절제를 받아 ND에 대항하여 예방접종이 이루어지고 챌린지된 병아리에서 기낭염 (air sacculities)의 감소를 도표로 나타낸 것이다. 분석한 연구그룹에는 표 7에 제시된 것들이 포함된다.
도 40은 표 7에서 제시된 연구그룹의 26일째 ELISA를 도표로 나타낸 것이다.
도 41은 표 8에서 제시된 연구그룹의 병아리에 대한 생존율을 도표로 나타낸 것이다.
도 42는 표 8에서 제시된 연구그룹 가운데 마릭병의 발생 빈도를 도표로 나타낸 것이다.

본 발명의 조류 종의 멤버 내에서 면역반응을 유도하는 방법은 유효한 양의 면역조절제 조성물을 조류 종의 멤버에 투여하여, 조류 종의 멤버에서 면역반응을 유도하는 것을 포함한다. 면역조절제 조성물은 리포좀 전달 비히클 및 적어도 하나의 핵산 분자를 포함한다. 특히, 면역조절제는 백신과 같은 적어도 하나의 생물학적 제제의 투여로 더욱 강화된 비-항원-특이적 면역반응을 유도한다.

이러한 방법은 전염병으로부터 조류를 보호하고 전염병을 보유한 그룹을 치료하기 위한 새로운 치료 전략을 제공한다. 또한, 본 발명의 면역조절제 조성물을 사용함으로써 인 오보 (in ovo)로 면역조절제가 투여된 경우 부화가능성 또는 부화 후 생존율이 감소되지 않으며, 백신과 함께 투여된 경우 부화가능성 또는 생존율이 감소되지 않는다. 나아가 백신 투여에 앞서 면역조절제의 선-투여 (pre-administration)는 비-항원-특이적 (non-antigen-specific) 면역반응을 더욱 강화시킨다. 종래에는 단지 부화 후에만 백신 투여가 가능하였으나, 본 발명의 방법은 또한 인 오보에 안전한 백신 사용이 가능하도록 한다. 더불어 본 발명의 방법은 면역조절제 조성물과 함께, 하나 이상의 백신을 배합할 수 있도록 한다. 마지막으로, 본 발명의 방법은 면역조절제가 백신과 배합하여 사용되는 경우, 보다 오랫동안 질병에 대한 보호를 제공한다.

Ⅰ. 조성물

a. 면역조절제

본 발명의 일 구체예로서, 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제6,693,086호에 기술된 바와 같이, 면역조절제 조성물은 리포좀 전달 비히클 및 적어도 하나의 핵산 분자를 포함한다.

적합한 리포좀 전달 비히클은, 처리되는 대상의 조직으로 핵산 분자를 전달할 수 있는 지질 조성물을 포함한다. 바람직하게, 리포좀 전달 비히클은 대상 내에서 충분한 시간 동안 남아, 핵산 분자 및/또는 생물학적 제제를 전달할 수 있다. 일 구체예로서, 리포좀 전달 비히클은 적어도 약 30분 동안 수용 대상 내에서 안정하다. 다른 구체예에서, 리포좀 전달 비히클은 적어도 약 1시간 동안 수용 대상 내에서 안정하다. 또 다른 구체예로서, 리포좀 전달 운송 수단은 적어도 약 24시간 동안 수용 대상 내에서 안정하다.

본 발명의 리포좀 전달 비히클은, 세포 내로 핵산 분자를 전달하기 위해 세포의 원형질막에 융합될 수 있는 지질 조성물을 포함한다. 일 구체예로서, 본 발명의 핵산 : 리포좀 복합체가 전달되는 경우, 전달되는 핵산 마이크로그램 (㎍)당 총 조직 단백질 밀리그램 (㎎)당 발현되는 단백질이 적어도 약 1 피코그램 (pg)이다. 다른 구체예로서, 핵산 : 리포좀 복합체의 형질감염 효율은 전달되는 핵산 ㎍당 총 조직 단백질 ㎎당 발현되는 단백질이 적어도 약 10pg이고; 또 다른 구체예로서, 핵산 : 리포좀 복합체의 형질감염 효율은 전달되는 핵산 ㎍당 총 조직 단백질 ㎎당 발현되는 단백질이 적어도 약 50pg이다. 상기 양들이 보다 바람직하지만, 복합체의 형질감염 효율은 전달되는 핵산 ㎍당 총 조직 단백질의 ㎎당 발현되는 단백질이 1 펨토그램 (fg) 정도로 낮을 수 있다.

본 발명의 바람직한 리포좀 전달 비히클은 지름이 약 100 내지 500 나노미터 (nm)이고, 다른 구체예로서, 약 150 내지 450nm, 또 다른 구체예로서 약 200 내지 400nm이다.

적합한 리포좀에는 임의의 리포좀, 예컨대 당업자에게 공지된 유전자 전달 방법에서 통상적으로 사용되는 것들이 포함된다. 바람직한 리포좀 전달 비히클은 다층막 소포 (multilamellar vesicle) (MLV) 지질 및 압출 지질 (extruded lipid)을 포함한다. MLV의 제조 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 보다 바람직한 리포좀 전달 비히클은 다중 양이온성 지질 조성물 (즉, 양이온성 리포좀)을 갖는 리포좀 및/또는 폴리에틸렌 글리콜과 짝지은 콜레스테롤 백본을 갖는 리포좀을 포함한다. 바람직한 양이온성 리포좀 조성물의 예에는, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 콜레스테롤, N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP) 및 콜레스테롤, 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드 (DOTIM) 및 콜레스테롤, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 콜레스테롤, 및 이들의 조합이 포함되나, 이에 한하지 않는다. 전달 비히클로 사용하기에 가장 바람직한 리포좀 조성물은 DOTIM 및 콜레스테롤을 포함한다.

적합한 핵산 분자는 코딩 또는 넌-코딩 시퀀스, 및 DNA 또는 RNA와 같은 임의의 핵산 시퀀스도 포함한다. 코딩 핵산 시퀀스는 단백질 또는 펩티드의 적어도 일부를 인코딩하는 반면, 넌-코딩 시퀀스는 단백질 또는 펩티드 어떠한 부분도 인코딩하지 않는다. 본 발명에 따르면, "넌-코딩" 핵산은 프로모터 영역과 같은 전사 유닛의 조절 영역을 포함할 수 있다. 용어 "비어있는 벡터" (empty vector)는 "넌-코딩" (non-coding)과 상호 교환하여 사용될 수 있고, 특히 유전자 삽입이 없는 플라스미드 벡터와 같이 단백질 코딩 부분이 부존재하는 핵산 시퀀스를 말한다. 핵산 분자에 의하여 인코딩된 단백질의 발현은 비-항원-특이적 면역 반응의 유도가 요구되지 않아; 따라서, 핵산 분자는 전사 조절 시퀀스와 작용적으로 연결될 것이 필수적으로 요구되지 않는다. 그러나, 면역원 및/또는 시토킨 (cytokine)을 인코딩하는 핵산 시퀀스 (DNA 또는 RNA)를 조성물에 포함함으로써 또 다른 이점을 얻을 수 있다. (즉 항원-특이적인 강화된 면역력)

핵산 분자와 리포좀의 복합화는 당분야의 표준적인 방법 또는 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제6,693,086호에 기술된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 리포좀에 첨가되는 핵산 분자의 적합한 농도는, 전신성 면역반응이 유도되기에 충분한 양의 핵산 분자가 대상 내로 전달되기 위한 효과적인 농도를 포함한다. 핵산 분자가 면역원 또는 시토킨을 인코딩할 때, 리포좀에 첨가되는 핵산 분자의 적합한 양은, 원하는 방식으로 반응기 세포 면역력을 조절하기 위하여, 세포가 충분한 면역원 및/또는 시토킨을 생산할 수 있게 하는 충분한 양의 핵산 분자가 세포 내로 전달되기 위한 효과적인 농도를 포함한다. 일 구체예로서, 약 0.1㎍ 내지 약 10㎍의 핵산 분자가 약 8nmol의 리포좀과 조합되고, 또 다른 구체예로서 약 0.5㎍ 내지 약 5㎍의 핵산 분자가 약 8nmol의 리포좀과 조합되며. 또 다른 구체예로서, 약 1.0㎍의 핵산 분자가 8nmol의 리포좀과 조합된다. 일 구체예로서, 조성물 내 핵산 대 지질의 중량비는 (㎍ 핵산 : nmol 지질) 적어도 약 1 : 1 핵산 : 지질 (즉, 1㎍ 핵산 : 1nmol 지질), 및 다른 구체예로서, 중량비는 적어도 약 1 : 5, 및 또 다른 구체예로서, 중량비는 적어도 약 1 : 10, 및 또 다른 구체예로서, 중량비는 적어도 약 1 : 20이다. 본원에 나타낸 비율은 조성물 내 양이온성 지질을 기준으로 한 것이고, 조성물 내 지질의 총량을 기준으로 한 것은 아니다. 또 다른 구체예로서, 본 발명의 조성물 내 핵산 대 지질의 중량비는 약 1 : 1 내지 약 1 : 64 핵산 : 지질이다.; 다른 구체예로서, 중량비가 약 1 : 5 내지 약 1 :50 핵산 : 지질이다.; 또 다른 구체예로서, 중량비가 약 1 : 10 내지 1 : 40 핵산 : 지질이다. 또 다른 구체예로서, 중량비가 약 1 : 15 내지 약 1 : 30 핵산 : 지질이다. 또 다른 핵산 : 지질의 중량비는 약 1 : 8 내지 1 : 16, 바람직하게는 약 1 : 8 내지 1 : 32이다.

b. 생물학적 제제

본 발명의 다른 구체예로서, 면역조절제는 리포좀 전달 비히클, 핵산 분자, 및 적어도 하나의 생물학적 제제를 포함한다.

적합한 생물학적 제제는 조류의 질병을 예방하거나 또는 치료하는데 효과적인 제제이다. 이러한 생물학적 제제는 면역 강화제 단백질, 면역원, 백신 또는 이들 임의의 조합을 포함한다. 적합한 면역 강화제 단백질은 면역력을 강화시키는 것으로 공지된 단백질이다. 비-한정 예시로서, 시토킨 패밀리를 포함하여, 면역력 강화 단백질 패밀리로 공지되어 있다. 적합한 면역원은, 대상의 조직 내에서 접하게 되는 동일하거나 유사한 단백질에 대항하여 면역원-특이적 면역 반응을 증가시키는 대상에 대해 면역원을 투여하는 것처럼, 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하는 단백질이다. 면역원은 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균류에 의해 발현되는 병원성 항원을 포함한다. 바람직한 항원은 대상 내에서 전염병을 일으키는 항원을 포함한다. 본 발명에 따르면, 면역원은 자연적으로 존재하거나 또는 합성에 의하여 얻어지며, 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하는 단백질의 임의의 일부분일 수 있다. 따라서, 항원 또는 면역원의 크기는 약 5-12 아미노산 정도로 작을 수 있고, 완전한 길이의 단백질 정도로 클 수 있으며, 그 사이의 크기를 포함한다. 항원은 멀티머 (multimer) 단백질 또는 융합 단백질일 수 있다. 항원은 원시 세포 또는 재조합 세포로부터 얻어진 정제된 펩티드 항원일 수 있다. 면역 강화제 단백질 및 면역원의 핵산 시퀀스는 예컨대, 비-특이적 면역 반응을 포함하여, 대상 내에서 면역원-특이적 면역 반응을 유도함으로써 대상의 조직 내에서 발현되는 면역원처럼, 전사 조절 시퀀스와 작동적으로 연결된다.

본 발명의 다른 구체예로서, 생물학적 제제는 백신이다. 백신은 생균성 전염성 바이러스성 백신 또는 사균성 비활성 바이러스성 백신을 포함할 수 있다. 일 구체예로서, 하나 이상의 백신, 생균성 또는 사균성 바이러스성 백신이 본 발명의 면역조절제 조성물과 조합되는데 사용될 수 있다. 적합한 백신은 조류 종 분야에서 공지된 것을 포함한다. 백신의 예로는, 이들로 제한하는 것은 아니나, 마릭병 바이러스 (Marek's disease virus) (MDV), 뉴 캐슬병 바이러스 (New Castle Disease virus) (NDV), 병아리 빈혈 바이러스 (chick anemia virus) (CAV), 전염성 활액낭의 질병 바이러스 (infectious bursal disease virus) (IBDV), 전염성 기관지염 바이러스 (infectious bronchitis virus) (IBV), 칠면조 포진 바이러스 (turkey herpesvirus) (HVT), 전염성 후두기관염 바이러스 (infectious laryngotracheitis virus) (ILTV), 조류 뇌척수염 바이러스 (avian encephalomyelitis virus) (AEV), 계두 바이러스 (fowlpox virus) (FPV), 가금 콜레라 (fowl cholera), 조류 독감 바이러스 (avian influenza virus) (AIV), 레오 바이러스 (reovirus), 조류 백혈병 바이러스 (avian leukosis virus) (ALV), 망상내피세포증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus) (REV), 조류 아데노 바이러스 (avian adenovirus) 및 출혈성 장염 바이러스 (hemorrhagic enteritis virus) (HEV), 콕시듐 (coccidia), 및 당분야에 공지된 다른 질병으로부터 보호하기 위한 백신으로서 당업자에게 공지된 것이 포함된다. 다른 구체예로 백신은 미국 특허 제5,427,791호, 제6,048,535호, 및 제6,406,702호에 기술된 것과 같은 백신일 수 있다. 예시적인 구체예로서, 마릭병으로부터 보호하기 위한 백신은 본 발명의 면역조절제 조성물과 함께 배합하여 사용될 수 있다.

Ⅱ. 방법

a. 면역 자극 방법

본 발명의 일 구체예로서, 조류 종의 멤버에 면역조절제 조성물의 유효한 양을 투여함으로써 조류 종의 멤버 내의 면역 반응이 유도된다. 유효한 양은 조류 종의 멤버에게 면역 반응을 유도하기에 충분한 것이다. 면역조절제는 리포좀 전달 비히클 및 핵산 분자를 포함한다.

일 구체예로서, 면역조절제의 유효한 양은 약 0.05 마이크로그램 내지 약 10 마이크로그램이다. 다른 구체예로서, 면역조절제의 유효한 양은 약 0.1 마이크로그램 내지 약 5 마이크로그램이다.

본 발명의 다른 구체예로서, 리포좀 전달 비히클, 분리된 핵산 분자, 및 생물학적 제제를 포함하는 면역조절제 조성물의 유효한 양을 투여함으로써, 조류 종의 멤버에게서 면역 반응이 유도된다. 생물학적 제제는 면역조절제와 함께 동시 투여하거나 또는 이들을 개별적으로 투여하는 것을 고려할 수 있다. 개별적인 투여는 면역조절제 투여 전 또는 후에 이루어질 수 있다. 또한 강화된 면역력을 연장하기 위하여 하나 이상의 면역조절제 또는 생물학적 제제를 투여하는 것을 고려할 수 있다. 나아가, 본원 실시예에서 설명하는 바, 하나 이상의 생물학적 제제는 면역조절제와 함께 동시 투여되거나, 면역조절제 투여에 앞서 투여되거나 또는 면역조절제 투여 이후에 투여될 수 있다. 일 구체예로서, 면역조절제의 유효한 양은 리포좀 전달 비히클 약 0.05 마이크로그램 내지 약 5 마이크로그램 및 분리된 핵산 분자 및 TCID50 바이러스 생물학적 제제 약 300 내지 약 30000이다. 다른 구체예로서, 면역조절제 리포좀 전달 비히클 약 0.1 마이크로그램 내지 약 3 마이크로그램 및 분리된 핵산 분자 및 EID50 바이러스 생물학적 제제 약 100 내지 약 1000이다.

b. 질병

본 발명의 방법은 면역반응의 유도로 처리될 수 있는 질병으로부터 대상이 보호되도록, 대상 내에서 면역반응을 유도한다. 본원에서 사용되는 용어 "질병으로부터 보호되는"이란 질병의 증상을 감소시키고; 질병 발생을 감소시키며 질병의 극렬함을 감소시키는 것을 말한다. 대상을 보호한다는 것은 조성물이 대상에 투여되는 경우, 질병 발생으로부터의 예방 및/또는 질병 증상, 징후, 또는 원인을 치료 또는 완화시키는 본 발명의 치료적 조성물의 능력이라 할 수 있다. 따라서 질병으로부터 조류 종의 멤버를 보호한다는 것은 질병 발생 예방 (예방을 위한 치료) 및 질병을 지닌 조류 종 멤버의 치료 둘 다를 포함한다. 특히, 질병으로부터 대상을 보호하는 것은, 일부 예시로서 덧붙이자면, 지나치게 활성화된 면역 반응 또는 해로운 면역 반응을, 억제하거나, 감소하거나, 저해하거나, 또는 방지할 수 있는, 이롭거나 또는 보호하는 면역반응을 유발함으로써, 조류 종의 멤버 내의 면역 반응을 유도하게 되어 달성된다. 용어 "질병" ("disease")은 조류 종의 멤버의 정상적인 건강상태로부터 이탈한 임의의 상태를 말하고, 질병 증상이 존재하는 상태, 또한 이탈 (즉, 전염, 유전자 돌연변이, 유전적 결함, 등)이 일어났지만, 그러나 아직 증상이 드러나지 않은 컨디션을 포함한다.

본 발명의 방법은 질병의 예방, 질병에 대항한 반응기 세포 면역력의 자극, 질병의 제거, 질병의 완화, 및 1차적 질병의 발생 결과에 따른 2차적 질병의 예방을 위하여 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 병원균의 광범위한 종류의 전염으로부터 보호하기 위한 조성물의 투여를 포함한다. 투여되는 조성물은 특정한 반응을 유도하는 특정 항원을 포함하거나, 또는 포함하지 않을 수도 있다. 본 발명의 방법은, 이들로 제한하는 것은 아니나, 바이러스, 박테리아, 진균류, 및 기생충을 포함하는 감염성 미생물 제제에 따른 질병으로부터 수용체 대상을 보호할 것이라 생각된다. 예시적인 바이러스성 전염성 질병은, 이들로 제한하는 것은 아니나, 닭 감염성 빈혈증 바이러스 (chicken infectious anemia virus) (CIAV), 마릭병 바이러스 (Marek's disease virus) (MDV), 닭 포진 바이러스 (herpesvirus chicken) (HCV), 칠면조 포진 바이러스 (herpesvirus turkey) (HTV), 전염성 활액낭의 질병 바이러스 (infectious bursal disease virus) (IBDV), 뉴 캐슬병 (New Castle Disease) (NDV), 전염성 기관지염 바이러스 (infectious bronchitis virus) (IBV), 전염성 후두기관염 바이러스 (infectious laryngotracheitis virus) (ILTV), 파라믹소 바이러스 타입 (paramyxovirus type), 조류 뇌척수염 바이러스 (avian encephalomyelitis virus) (AEV), 계두 바이러스 (fowlpox virus) (FPV), 조류 독감 바이러스 (avian influenza virus) (AIV), 레오 바이러스 (reovirus), 조류 백혈병 바이러스 (avian leukosis virus) (ALV), 망상내피세포증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus) (REV), 조류 아데노 바이러스 (avian adenovirus), 출혈성 장염 바이러스 (hemorrhagic enteritis virus) (HEV), 폐 바이러스(pneumovirus), 비둘기 매독 바이러스 (pigeon pox virus), 이들의 재조합, 및 당업계에 공지된 바이러스의 감염으로 인한 것들을 포함한다. 예시적인 박테리아성 전염은, 이들로 제한하는 것은 아니나, 그람 양성 또는 음성 박테리아 및 진균류 예컨대, Escherichia coli , Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma meleagridis , Mycoplasma synoviae , Bordetella Sp , Pasteurella multocida , Clostridium perfringens , Clostridium colinum , Campylobacter jejuni , Salmonella Sp , Salmonella enteritidis , Salmonella pullorum, Salmonella gallinarum , Clostridium botulinum , Hemophilus gallinarum, Erysipelothrix insidiosa , riemerella anatipestifer ( RA ), 및 당업계에 공지된 다른 박테리아의 감염에 따른 것을 포함한다. 예시적인 진균류 또는 사상균 전염은, 이들로 제한하는 것은 아니나, Aspergillus fumigates , Aspergillus flavus , Candida albicans , 및 당업계에 공지된 다른 진균류 및 사상균의 전염에 따른 것을 포함한다. 예시적인 질병 컨디션은, 이들로 제한하는 것은 아니나, 그람 양성 또는 음성 박테리아 및 진균류의 독소에 따른 것을 포함하며, 예컨대 clostridium perfringesns 독소, clostridium botulinum 독소, E. coli 장독소 , staphylococcus 독소, pasteurella leukotoxin , 및 fusarium mycotoxins 및 당업계에 공지된 다른 독소에 따른 것을 포함한다. 예시적인 기생충은, 이들로 제한하는 것은 아니나, Eimeria meleagridis , 콕시듐 종 (coccidia sp), Ascaridia galli , Heterakis gallinae , Capillaria annulata, Capillaria contorta , Capillaria obsignata , Syngamus trachea , 및 당업자계에 공지된 다른 기생충을 포함한다.

c. 대상

본 발명의 방법은 임의의 대상 또는 사육되거나 또는 야생인 조류 종의 멤버에 투여될 수 있다. 특히, 번식, 고기 또는 계란 생산을 위해 상업적으로 길러진 대상에 투여될 수 있다. 적합한 조류 대상은, 닭, 칠면조, 거위, 오리, 꿩, 메추라기, 비둘기, 타조, 새장에서 기르는 새, 동물학적 무리에 속하는 새 및 조류 및 이와 같은 것을 포함하나, 이에 한하지 않는다. 일 구체예로서, 조류 종의 멤버는 닭 또는 칠면조로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 높은 밀도 육추사 내에서 길러진 새, 예컨대 구이용 영계 및 산란계는 감염원에 대한 환경적 노출에 특히 취약하기 때문에, 당업자는 본 발명의 방법이 그들에 대하여 크게 이로울 것이라는 점을 알 수 있을 것이다.

d. 투여

다양한 투여 루트가 이용될 수 있다. 물론, 선택되는 특정한 모드는 선택되는 특정한 생물학적 제제, 대상의 나이 및 일반적인 건강상태, 치료되는 특정한 컨디션 및 치료상의 효능을 위해 요구되는 투여량에 의존할 것이다. 본 발명의 방법은 임상적으로 용납될 수 없는 부작용을 일으키는 것을 제외하고, 면역 반응의 효과적인 레벨을 생산하는 임의의 투여 모드를 사용하여 실시할 수 있다. 조성물은 단위 제형으로 알맞게 존재할 수 있고 당업자계에 공지된 임의의 방법에 의하여 제조될 수 있다.

새의 예방접종은 임의의 시기에 수행될 수 있다. 일반적으로, 살아있는 미생물은 18일 된 배아 (인 오보) 및 그 이상의 시기에 예방접종이 수행되고, 비활성의 미생물 또는 백신의 다른 타입은 3주 이상의 시기에 예방접종이 수행된다. 인 오보 예방접종의 경우, 배아 발달의 마지막 분기에 예방접종이 수행될 수 있다. 백신은, 피하 투여, 깃털 모낭 내 (feather follicle) 투여, 분무 투여, 경구 투여, 안구 내 투여, 기관 내 투여, 비강 내 투여, 인 오보 (in ovo) 투여, 또는 당업자에게 공지된 다른 방법에 의하여 투여될 수 있다. 경구 백신은 물을 마시면서 투여될 수 있다. 나아가, 본 발명의 방법은 일상적인 예방접종 스케쥴을 기준으로 사용하는 것을 고려할 수 있다. 일 구체예로서, 본 발명의 면역조절제 조성물은 인 오보에 투여된다. 다른 구체예로서, 면역조절제 조성물은 E. coli로 챌린지한 이 후 분무에 의해 투여된다.

다른 전달 시스템은 지속적인 방출, 지연성 방출 또는 일관된 방출 전달 시스템을 포함한다. 이러한 시스템은 조성물의 반복되는 투여를 피할 수 있어 편의를 증가시킨다. 많은 타입의 방출 전달 시스템이 가능하고 통상의 당업자에게 공지되어 있다. 여기에는, 폴리(락티드-글리콜리드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리하이드록시부티르산, 및 폴리무수물 등의 폴리머 기반 시스템이 포함된다. 약물을 함유하는 상술한 폴리머의 마이크로캡슐은, 예를 들어, 미국 특허 제5,075,109호에 기술되어있다. 전달 시스템은 또한 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스터 및 지방 산 또는 모노-디 및 트리-글리세리드와 같은 중성 지방을 포함하는 지질인 넌-폴리머 시스템; 히드로겔 방출 시스템; 실라스틱 시스템; 펩티드 기반 시스템; 왁스 코팅; 종래의 바인더 및 부형제를 사용한 압축된 정제; 부분적으로 융합된 이식; 등을 포함한다.

구체적인 예에는, 미국 특허 제4,452,775호, 제4,675,189호 및 제5,736,152호에서 기술된 바와 같이, 제제가 매트릭스 내부의 형태 내에 포함되는 침식 시스템 및 미국 특허 제3,854,480호, 제5,133,974호 및 제5,407,686호에서 기술된 바와 같이, 폴리머로부터 조절된 비율로 활성 성분이 침투하는 살포 시스템을 포함한다. 또한, 펌프-기반의 하드웨어 전달 시스템이 사용될 수 있고, 이들의 일부는 이식용으로 조정된다.

본 발명의 범위에서 벗어나지 않고, 상기 조성물, 생성물 및 방법에서 다양한 변화가 이루어질 수 있으므로, 상기 상세한 설명 및 하기 실시예에 포함된 모든 사항들은 설명을 위한 것이고, 의미를 제한하고자 하는 것은 아니라고 해석되어야 한다.

정의

용어 "유효한 양"은 원하는 생물학적 효과가 달성되기 위해 필요한 양 또는 충분한 양을 말한다. 예컨대, 전염병의 치료 또는 예방을 위한 면역조절제의 유효한 양은 미생물에 대한 노출에 따른 항원 특이적 면역반응의 발달을 일으키고, 이렇게 함으로써 대상 내의 미생물 양의 감소를 일으키고, 바람직하게는 미생물의 박멸을 일으키기에 충분한 양이다. 임의의 특정한 적용을 위한 유효한 양은 질병 또는 치료되는 컨디션, 대상의 크기, 또는 질병 또는 컨디션의 극렬함과 같은 요인에 의존하여 다양할 수 있다. 통상의 당업자는 과도한 실험을 필요로 하지 않고 면역조절제의 유효한 양을 경험상 결정할 수 있다.

용어 "시토킨"은 면역 강화 단백질 패밀리를 말한다. 시토킨 패밀리는 조혈 성장 인자, 인터류킨, 인터페론, 이뮤노글로불린 수퍼패밀리 분자, 종양 괴사 인자 패밀리 분자, 케모킨 (즉 세포의 이동 및 활성을 조절하는 단백질, 특히 포식세포)을 포함한다. 예시적인 시토킨은, 이들로 제한하는 것은 아니나, 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-15 (IL-15), 인터류킨-18 (IL-18), 인터페론-α (IFNα) 인터페론-α (IFNα), 및 인터페론-α (IFNα)를 포함한다.

용어 "유도하다"는 활성화하다, 자극하다, 발생시키다 또는 상향조절하다와 같은 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

용어 대상 내의 "면역반응 유도"는 특정적으로 면역반응 활성화를 조절하는 것 또는 면역반응 활성화에 영향을 끼치는 것을 말하고, 면역반응을 활성화하는 것, 면역반응을 상향조절하는 것, 면역반응을 강화하는 것, 및/또는 면역반응을 바꾸는 것을 포함할 수 있다 (예를 들어 해롭거나 또는 효과없는 것에서부터 이롭거나 또는 보호하는 것까지 대상 내에서 면역반응의 일반적인 타입을 차례로 변화시키는 면역반응의 타입을 유도함으로써).

용어 "작용적으로 연결된"은 숙주세포 안으로 세포감염되는 경우 분자는 발현될 수 있는 점에서 핵산 분자를 전사 조절 시퀀스에 연결시키는 것 말한다. 전사 조절 시퀀스는 전사의 개시, 신장 및 종결을 조절하는 시퀀스이다. 특히 중요한 전사 조절 시퀀스는 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 및 리프레서 시퀀스와 같은, 전사 개시를 조절하는 것이다. 이와 같은 전사 조절 시퀀스의 다양성을 당업자에게 공지되어 있다. 바람직한 전사 조절 시퀀스는 조류, 어류, 포유류, 박테리아, 식물, 및 곤충류 세포에서 작용하는 것을 포함한다. 임의의 전사 조절 시퀀스가 본 발명에 사용될 수 있는 반면, 시퀀스는 면역원 또는 면역 자극 단백질을 인코딩하는 시퀀스와 자연적으로 관련된 자연적으로 일어나는 전사 조절 시퀀스가 포함될 수 있다.

용어 "핵산 분자" 및 "핵산 시퀀스"는 상호 교환적으로 사용될 수 있고, DNA, RNA 또는 DNA 나 RNA의 유도체를 포함한다. 상기 용어는 또한 단백질 또는 이의 절편을 인코드하는 핵산 분자 및 조절 영역, 인트론, 또는 다른 넌-코딩 DNA 또는 RNA로 구성된 핵산 분자 둘 다를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 더 큰 시퀀스를 포함한다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드는 약 1 내지 약 500 뉴클레오티드의 핵산 시퀀스를 가지고, 더 전형적으로, 적어도 길이가 약 5 뉴클레오티드이다. 핵산 분자는 포유류, 어류, 박테리아, 곤충류, 바이러스, 식물, 또는 합성의 공급원을 포함하는 임의의 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 핵산 분자는 재조합 DNA 기술 (예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 증폭, 클로닝) 또는 화학적 합성과 같은 당업자에게 공지된 일반적인 방법에 의해 생산될 수 있다. 핵산 분자는 자연의 핵산 분자 및 이와 상동체를 포함하고, 이들로 제한하는 것은 아니나, 자연적인 대립형질 변형 및 뉴클레오티드가 삽입되거나, 제거되거나, 대체되거나, 또는 도치되어 있는 변형된 핵산 분자를 포함하며, 이와 같은 변형은 면역원 또는 면역 자극 단백질을 인코드하는 핵산 분자의 능력을 대체로 방해하지 않는다는 점에서 본 발명의 방법에서 유용하다. 핵산 상동체는 본원에 참고문헌으로 포함된, 당업자에게 공지된 다수의 방법 (예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989 를 참고)을 사용하여 생산할 수 있다. 병원균 항원 변역원성과 같은, 면역원성을 위한 스크린 테크닉 또는 시토키닌 활성은 당업자에게 공지되어있고, 다양한 인 비트로 (in vitro) 및 인 비보 (in vivo) 어쎄이를 포함한다.

실시예

본 발명의 다양한 구체예를 하기 실시예에 나타내었다.

실시예 1. 재료 및 방법

면역조절제

본 연구에서 사용된 면역조절제는 양이온성 지질 및 넌-코딩 DNA를 포함하는 조성물이었다. 합성 면역조절제 지질 성분 [1-[2-[9-(Z)-옥타데케노일옥시]]-2-[8](Z)-헵타데케닐]-3-[하이드록시에틸]이미다졸리늄 클로라이드 (DOTIM) 및 합성의 중성 지방 콜레스테롤을 조제하여 지름이 대략 200nm인 리포좀을 제조하였다 (미국 특허 제6,693,086호 참조). DNA 성분은 양으로 하전된 (양이온성) 리포좀과 관련하여 음으로 하전된 것으로, E. coli 안에서 생산된 4292 염기-페어 넌-코딩 DNA 플라스미드 (pMB 75.6)였다 (미국 특허 제6,693,086호 참조).

600개의 계란/그룹에 투여되는 투여량에 대한 면역조절제 희석 도식

그룹	표적 투여량 (마이크로그램/계란)	계산된 투여량 (마이크로그램)	스톡 부피 (mL)	희석제 (D5W) 부피 (mL)	총 부피 (mL)	동물당 투여량 부피 (mL)
T1	0	0	0	25.00	25.00	0.05
T2	0.1	0.11	0.15	24.85	25.00	0.05
T3	1.0	1.02	1.50	23.50	25.00	0.05
T4	10.0	9.97	14.70	10.3	25.00	0.05
T5	0	0	0	25.00	25.00	0.05
T6	1.0	1.02	1.50	23.50	25.00	0.05

연구 동물

배양 18일에 생존 능력을 확인하기 위해 상업적으로 이용 가능한 닭 계란 (Meat Broiler)이 사용되었다. 건강한 배아는 연구에 포함시키고, 생식 능력이 없는 배아, 죽은 배아, 및 건강하지 않은 배아는 폐기시켰다. 병아리는 종래의 캘리포니아 스타일 커튼-사이드의 가금류 하우스에 사육하였다. 0일째 각 우리에는 50 직류 새 (straight run bird)를 놓았다. 병아리는 연구 동물의 나이와 체중에 따른 MRC 권고사항을을 준수한 먹이 배급 양을 공급하였고, 병아리는 각 우리의 물 공급기에 연결된 벨 급수기를 통하여 제공되는 물에 무제한 접근하도록 하였다.

실험적 전염 및 챌린지

병아리를 면역 반응의 효과를 확인하기 위하여 유기체에 챌린지하였다. 챌린지, 또는 실험적 전염은 E. coli와 같은 유기체 접종원에 대한 노출을 포함하였다. 유기체를 2.63×10⁵ 농도로 사용하고, 부화 트레이 내에 있는 동안 각 발육된 계란에 0.15mL의 접종원을 분무하여 투여하였다.

실시예 2. 면역조절제의 투여에 의한 부화율 증가

실시예 1에서 설명한 바와 같이, 18일령의 부화된 닭 계란에 면역조절제를 투여한 후, E. coli에 노출시켜 면역조절제의 효능을 확인하기 위한 연구를 실시하였다. 연구에는 E. coli (T1-4)로 챌린지된 하나의 그룹 및 챌린지되지 않은 다른 그룹 (T5 및 T6), 2개의 그룹 (표 2)을 포함시켰다. E. coli로 챌린지된 그룹 내에서, 없음 (TI), 0.1㎍ (T2), 1.0㎍ (T3), 및 10.0㎍ (T4)의 투여량을 포함하는 각각 다른 투여량의 면역조절제가 투여된 4개의 서브-그룹이 존재하였다. 비-챌린지된 그룹에는 면역조절제가 투여되지 않은 것 (T5) 또는 면역조절제 1.0㎍가 투여된 (T6) 2개의 서브-그룹이 포함되었다.

연구 처리 그룹

그룹	면역조절제	E. coli
T1	0	있음
T2	0.1㎍/kg	있음
T3	1.0㎍/kg	있음
T4	10.0㎍/kg	있음
T5	0	없음
T6	1.0㎍/kg	없음

연구 0일에, 면역조절제를 받은 18일령의 계란을 인 오보 주사하였다. 1일에, 챌린지된 그룹 (T1-T4) 내의 19일령의 계란은 농도 2.63×10⁵로 E. coli를 포함한 접종원 0.15mL로 함께 각각 분무되었다.

모든 그룹의 분석결과로부터 발육된 계란의 부화율에 통계상으로 중요한 처리 효과를 알 수 있었다. 2개의 비-챌린지된 대조 그룹 (T5, 91%에서 0㎍/kg 대 T6, 89%에서 1.0㎍/kg)간에 중요한 차이는 없었다. 또한, 2개의 비-처리된 그룹간 (T1-챌린지 된 및 T5-비챌린지된)의 비교결과, 비-챌린지된 그룹 (85% 대 91%, 각각) 내에서 부화하는 계란이 보다 많이 발육됨을 알 수 있었다. 따라서, 챌린지 모델은 부화율을 평가하는 효과적인 모델임을 확인하였다.

면역조절제로 처리된 그룹들에 있어서, T3 (1.0 ㎍/kg-처리된 계란) 그룹은 비-처리된/챌린지된 T1 (84.5%) 또는 T4 (10.0 ㎍/kg-처리된 계란) (85%)보다 많은 새들을 부화하였다 (91.5%). 비-처리된/비 챌린지된 조절 그룹 (T5) 과 이와 같은 2개의 처리 그룹 (상기 기술된 T1, 및 T4)간에 비슷한 차이를 보였다. 남아있는 쌍별 그룹간 임의의 비교에서 다른 중요한 점은 발견되지 않았다. (도 1)

우리당, 그룹당, 연구 일당 죽는 새의 비율에 대한 중요한 차이는 없었다 (도 2). 임의의 특정 연구 일에 생존한 새의 비율로부터 처리 및 시간 간의 통계상으로 중요한 상관관계는 나타나지 않았으나, 중요한 처리 효과를 분명하게 보여주었다 (도 3). T3, T5, 및 T6 그룹 내에는 T1, T2, 및 T4 그룹에 비하여 임의의 날에 상당히 더 많은 새가 존재하였다. 또한, T5에는 T3보다 상당히 더 많은 생존한 새가 존재하였다. 부화 후 새의 생존율 평가로부터 상기와 같은 비슷한 정도의 중요한 점을 발견하였다 (도 4 내지 도 12).

연구 7일, 14일, 21일, 또는 28일에 관찰된 우리에서 체중은 중요한 차이가 없었다 (도 13 내지 도 16). 연구 35일에 총 우리 내 체중의 분석으로부터 T5 및 T2 그룹간 (평균 87kgs 대 75kgs, 각각)의 중요한 차이를 알 수 있었다 (도 17). 연구 말일 (연구 45일)에 우리에서 체중은 T1 (105kgs)에 비하여, 그룹 T5 (120kgs) 및 T6 (117kgs)이 더 컸고, T2 (106kgs) 및 T4 (105kgs)에 비하여, T5가 더 컸다. (도 18)

요약하면, 상업적 구이용 영계 (broiler)에서 E. coli 감염에 앞서 인 오보 투여된 경우 면역조절제의 효과를 평가하였다. 면역조절제로 처리된 그룹에 대하여, T3 그룹은, 비-처리된/챌린지된 T1 (85%) 또는 T4 (85%) 그룹보다 보다 많은 새들을 부화하였다 (92%). 비-처리된/비-챌린지된 대조 그룹 (T5)과 동일한 처리 그룹 T1 및 T4 간에 비슷한 차이를 보였다. 치사율 (도 2 내지 도 12) 및 체중에는 중요한 차이가 없었다 (도 13 내지 도 18). 본 연구에서, 면역조절제는 부화에 앞서 E. coli로 챌린지된 상업적 구이용 영계의 부화율의 증가에서 효과적이었고, 특히 1.0㎍의 투여량에서, 면역조절제를 받은 그룹간에서 강화된 면역력을 나타내었다.

실시예 3. 면역조절제의 투여에 의한 비-항원-특이적 면역력의 증가

실시예 1에서 설명한 바와 같이, E. coli에 노출된 예방접종된 닭의 마릭병에 대한 면역조절제의 효과를 확인하기 위한 연구를 실시하였다. 연구는 E.coli로 챌린지된 하나의 그룹 (T1-T4) 및 챌린지되지 않은 다른 그룹 (T5 및T6), 2개의 그룹을 포함하였다. E. coli로 챌린지된 그룹에는, 없음 (T1), 0.1㎍ (T2), 1.0㎍ (T3), 1.0㎍의 투여량과 1 투여량 (T4)의 마릭병 백신을 포함하여, 면역조절제를 각각 다른 투여량으로 투여한 4개의 서브-그룹이 존재하였다 (표 3). 비-챌린지된 그룹은 면역조절제가 투여되지 않은 그룹 (T5) 또는 면역조절제 1.0㎍이 투여된 그룹 (T6)의 2개의 서브-그룹을 포함하였다.

연구 처리 그룹

그룹	인 오보 투여	발육된 계란의 수	우리의 수
T1	0㎍ 면역조절제/계란	1000	12
T2	0.1㎍ 면역조절제/계란	1000	12
T3	1.0㎍ 면역조절제/계란	1000	12
T4	1.0㎍ 면역조절제 + 마릭병 백신 1 투여량/계란	1000	12
T5	0㎍ 면역조절제/계란	1000	12
T6	1.0㎍ 면역조절제/계란	1000	12

상업적 구이용 영계 계란을 18일 동안 배양하여, 생존력을 검란한 후 (캔들링한 후), 18일령의 발육된 계란에 면역조절제를 인 오보 주사하였다. 다음으로, 챌린지된 그룹 내의 19일령의 발육된 계란은 각각 밀리리터당 농도 2.8×10⁷에서 E. coli를 포함한 접종원 0.15mL로 분무되었다. 연구 0일에 계란이 부화하였고, 45일간 연장하였다.

부화한 발육 계란의 수를 각 그룹 (그룹당 또는 부화 트레이당 n=1000)에 대하여 기록하였다 (도 19). 부화한 병아리 중, 부화 후 7일에 생존해 남아있는 병아리의 수를 기록하였다 (도 20). 부화 후 7일에 그룹당 생존한/죽은 병아리의 수도 기록하였다 (도 21). 챌린지된 그룹의 면역조절제가 증가함에 따라 치사율 퍼센트는 감소하였고, 면역조절제와 함께 마릭 백신이 동시 투여된 경우 치사율 퍼센트가 더욱 감소하였다 (도 22).

데이터는 면역조절제 처리 그룹 및 E. coli로 챌린지되지 않은 비-처리 그룹간에 부화율에 있어 감소가 없음을 입증한다 (도 23). 부화율은 면역조절제 처리 그룹 및 E. coli로 챌린지된 비-처리 그룹간에 상당히 더 높았다. 면역조절제 및 마릭 백신의 투여를 받은 발육된 계란의 부화율은 비-처리 및 비-챌린지된 대조군의 경우와 비슷하였다. 요약하면, 면역조절제는 챌린지 조건 하에서 부화율을 증가시켰고, 마릭 백신의 동시투여로 면역조절제의 보호 반응은 강화되었다. 결과는 비-항원-특이적 면역반응이 면역조절제의 투여 또는 면역조절제 및 마릭 백신의 투여로 유도된다는 것을 나타낸다.

실시예 4. 면역조절제의 투여 및 생물학적 제제의 추가적인 투여로 강화된 비-항원-특이적 면역 반응 유도

E. coli에 노출된 마릭병 예방접종된 닭에서 면역조절제의 효과를 확인하기 위한 연구를 실시하였다. 연구에는 표 4에서 나타난 바와 같이 다르게 처리된 9개의 그룹을 포함시켰다.

연구 그룹 처리

그룹	인 오보 투여	계란 수	마릭병 예방접종 (18일 된 배아)	면역조절제로 처리된 18일 된 배아	E. coli로 챌린지된 19일 된 배아	면역조절제로 처리된 0일 된 닭
T1	0㎍ 면역조절제/계란	400	있음	없음	없음	없음
T2	0㎍ 면역조절제/계란	400	있음	없음	있음	없음
T3	1.0㎍ 면역조절제/계란	400	있음	없음	없음	있음
T4	1.0㎍ 면역조절제/계란	400	있음	없음	있음	있음
T5	1.0㎍ 면역조절제/계란	400	있음	있음	없음	없음
T6	1.0㎍ 면역조절제/계란	400	있음	있음	있음	없음
T7	1.0㎍ 면역조절제/계란	400	있음	있음	없음	있음
T8	1.0㎍ 면역조절제/계란	400	있음	있음	있음	있음
T9	0㎍ 면역조절제/계란	400	없음	없음	없음	없음

상업적 구이용 영계 계란을 18일 동안 배양하여, 생존력을 검란한 후 (캔들링한 후), 18일령의 발육된 계란에 면역조절제를 인 오보 주사하였다. 다음으로, 챌린지된 그룹 내의 19일령의 발육된 계란은 각각 밀리리터당 농도 2.63×10⁵에서 E. coli를 포함한 접종원 0.15mL로 분무되었다. 연구 0일에 계란이 부화하였고, 45일간 연장하였다.

부화된 발육 계란의 퍼센트를 각 그룹에 대하여 계산하였다 (도 24). 부화된 병아리 중, 챌린지된 그룹 (도 26) 및 비-챌린지된 그룹 (도 25) 둘 다에 대한 부화 후 7일에 치사율 퍼센트를 계산하였다. 챌린지된 그룹은 비슷하게 처리된 비-챌린지된 그룹 보다 더 높은 치사율 퍼센트를 나타내었다 (도 27). 그룹당 생존한 병아리의 퍼센트를 3일 (18일 동안 생존한 배아)에서 7일까지 뿐만이 아니라 부화시부터 7일까지 (도 28) 계산하였다 (도 29, n=400). 챌린지된 대조 그룹 (82.2%, 도 28)에 비하여, 챌린지에 앞서 면역조절제로 처리된 새의 생존율 (>98.2%, 도 28)이 상당히 더 높았다. 또한, 챌린지된 대조 그룹 (82.2%, 도 28)에 비하여, 7일에 챌린지 전 후 면역조절제로 부화시 처리된 새의 7일째 생존율 (95%, 도 28)이 상당히 더 높았다. 이러한 결과를 그룹당 400개의 계란을 포함하는 세트를 사용하여 정리하였다 (도 29). 대조 그룹에 비하여 (67.0%, 도 29), 챌린지에 앞서 처리된 배아 (세트 400)가 7일째에 더 높은 생존율을 나타내었다 (>94.3%, 도 29). 마찬가지로, 면역조절제로 인 오보 처리된 새에서 상당히 더 높은 생존율을 나타내었다 (97.4%, 도 30, 2차 처리 없음, 14일에 챌린지된 대조 그룹과 비교함 (81.9%, 도 30)). 대조 그룹 81.9% (도 30)에 비하여, 1일 된 때, 포스트-챌린지, 93.9% (도 30), 1차 처리 없이, 면역조절제로 처리된 그룹에서 14일에 생존한 새의 수가 상당히 더 높게 나타났다. 대조 그룹 81.9% (도 30)에 비하여, 면역조절제로 인 오보 처리된 후, 1일 된, 95.8% (도 30) 그룹에서 14일에 또한 생존한 새의 수가 상당히 더 높게 나타났다. 도 30에 다른 처리를 한 챌린지된 그룹 및 챌린지되지 않은 그룹의 주간 치사율을 나타내었다.

데이터는 면역조절제로 처리된 (1회 또는 2회 처리된)그룹과 E. coli로 챌린지되지 않은 비-처리된 그룹간의 부화율에 감소가 없음을 입증한다. 부화율은 E. coli 챌린지에 앞서 면역치료제로 처리된 그룹에서 더 높았다. 이러한 효과는 면역조절제가 마릭 백신과 함께 동시투여된 경우에 강화되었다. 또한, 면역조절제 처리는 비-챌린지된 그룹간의 치사율의 감소와 상관관계가 있었다. 치사율은 마릭 백신과 함께 동시투여된 경우 및 마릭 백신과 함께 면역조절제의 투여에 앞서 면역조절제와 함께 사전에 처리된 경우 더욱 감소하였다. 이러한 결과는 챌린지된 그룹 내에서 나타났다. 요약하면, 면역조절제는 챌린지 조건 하에서 부화율을 높이고 마릭 백신의 동시투여로 면역조절제의 보호 반응이 강화되었다. 상기 결과는 면역조절제의 투여에 의해 유도되는 비-항원-특이적 면역반응이 마릭 백신과 동반되어 면역조절제가 투여되는 경우 강화됨을 나타낸다. 마릭 백신과 함께 면역조절제가 동시투여되는 것은 비-항원-특이적 면역 반응을 더욱더 강화시킨다.

실시예 5. 감염 후 면역조절제의 투여 및 생물학적 제제의 추가적인 투여로 강화된 비-항원-특이적 면역 반응 유도

챌린지된 대조 그룹 (82.2%, 도 28)에 비하여, 챌린지 후 면역조절제로 처리된 새에 있어서 (95%, 도 28) 생존율이 상당히 더 높게 나타났다. 이러한 결과는 그룹당 400개의 계란을 포함한 세트를 사용하여 정리하였다 (도 29).

상기 결과는 마릭 백신과 동반되어 면역조절제가 투여되는 경우 E. coli 챌린지 후 면역조절제에 의해 유도되는 비-항원-특이적 면역반응이 강화됨을 나타낸다. 마릭 백신 후 면역조절제의 포스트-투여는 비-항원-특이적 면역반응을 강화하였다.

실시예 6. 2가의 생물학적 제제와 함께 면역조절제의 투여는 2가의 생물학적 제제의 초기 복제를 저해하지 않음

면역조절제가 마릭병 2가의 백신의 초기 복제에 부정적으로 영향을 줄 수 있는지 확인하기 위한 연구를 실시하였다. 마릭병 2가의 백신에는 HVT (칠면조 포진 바이러스 (herpes virus)) 및 SB1 (닭 포진 바이러스)가 포함되었다.

상업적 구이용 영계 계란을 18일 동안 배양하여, 생존력에 대해 검란을 실시하였다. 계란은 그룹당 20개의 계란으로 A-C, 3개의 그룹으로 분리하였다. 각 계란을 표 5에서 나타낸 바와 같이 예방접종하였다.

처리

처리 그룹	인 오보 투여	18일령 발육된 계란의 수 (부화한 계란)	마릭병 예방접종 (18일된 배아)	면역조절제로 처리한 18일 된 배아
A	0㎍ 면역조절제/계란	20 (12)	HVT-SB1	없음
B	1.0㎍ 면역조절제/계란	20 (18)	HVT-SB1	있음
C	0㎍ 면역조절제/계란	20 (14)	없음	없음

인 비보에서 백신 바이러스 복제에 대한 면역조절제의 효과를 평가하기 위해, 비장 세포 (SPC) 및 말초형 단핵세포 (PBMC) 둘 다로부터 배치 후 7일 및 14일에 바이러스 재분리를 수행하였다.

MD 백신 바이러스 감염은 바이러스 복제의 레벨 내에서 새에서 새로 (bird-to-bird) 변이로 공지되어 있기 때문에, 닭의 3배 풀 (triplicate pool)을 사용하여 재분리를 수행하였다 (풀당 2마리 닭, 샘플링 포인트당 3개의 풀).

풀 간의 변동성에도 불구 하고, 면역조절제의 존재 내에서 HVT 및 SB-1의 복제에 뚜렷한 경향을 나타내었다. 본 데이터는 첫째 주 동안 SB-1 복제에 대해 가장 중요하였지만, 그러나 HVT 및 SB-1의 전체의 경향에 있어서는 두 시점 (부화 후 7일 및 14일)에 두 조직에 대해 유사하였다. 데이터를 도 31 내지 도 38에 요약하였다. 도 31은 첫째 주에 비장 세포 내 HVT의 MD 백신 복제에 대한 면역조절제의 효과를 나타낸다. 도 32는 첫째 주에 PBMC 내 HVT의 MD 백신 복제에 대한 면역조절제의 효과를 나타낸다. 도 33은 첫째 주에 비장 세포 내 SB-1의 MD 백신 복제에 대한 면역조절제의 효과를 나타낸다. 도 34는 첫째 주에 PBMC 내 SB-1의 MD 백신 복제에 대한 면역조절제의 효과를 나타낸다. 도 35는 둘째 주에 비장 세포 내 HVT의 MD 백신 복제에 대한 면역조절제의 효과를 나타낸다. 도 36은 둘째 주에 PBMC 내 HVT의 MD 백신 복제에 대한 면역조절제의 효과를 나타낸다. 도 37은 둘째 주에 비장 세포 내 SB-1의 MD 백신 복제에 대한 면역조절제의 효과를 나타낸다. 도 38은 둘째 주에 PBMC 내 SB-1의 MD 백신 복제에 대한 면역조절제의 효과를 나타낸다.

면역조절제는 MD 백신 복제에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 면역조절제는 처음 2주 포스트-감염에서 HVT 및 SB-1의 복제를 증가시키는 보조의 효과를 가지는 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 면역조절제가 MD 백신 효과에 긍정적인 영향을 미칠 수 있음을 암시한다.

실시예 7. 변형된 살아있는 생물학적 제제 및 면역조절제의 투여는 변형된 살아있는 생물학적 제제를 방해함

뉴 캐슬병에 노출된, 변형된 살아있는 뉴 캐슬병 예방접종된 닭에서의 면역조절제의 효과를 확인하기 위한 연구를 실시하였다. 연구는 표 6에서 나타난 바와 같이 다르게 처리된 9개의 그룹을 포함하였다.

연구 그룹 처리

일	처리	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9
-3	면역조절제 (㎍) 인 오보				0.112	0.56	1.12
	PBS 인 오보	X	X	X				X	X	X
0	연구에서 배양되기 위해 무작위로 병아리를 배정함	X	X	X	X	X	X	X	X	X
	연구에서 추려낸 병아리로부터 항-NDV 적정 농도를 위해 혈액 채취	X	X	X	X	X	X	X	X	X
	에어로졸에 의한 면역조절제 (㎍)							0.112	0.56	1.12
	면역조절제 에어로졸			X	X	X	X	X	X	X
	PBS 에어로졸	X	X
7	항-NDV 적정 농도를 위해 혈액 채취	X	X	X	X	X	X	X	X	X
14	항-NDV 적정 농도를 위해 혈액 채취	X	X	X	X	X	X	X	X	X
21	항-NDV 적정 농도를 위해 혈액 채취	X	X	X	X	X	X	X	X	X
	NDV에 챌린지		X	X	X	X	X	X	X	X
22-26	NDV 전염의 임상적 징후를 위한 관찰	X	X	X	X	X	X	X	X	X
26	기낭염에대한 총 병리학	X	X	X	X	X	X	X	X	X
	기관의 조직병리학	X	X	X	X	X	X	X	X	X

상업적 구이용 영계 계란을 18일 동안 배양하여, 생존력에 대해 검란을 실시하였다. 계란은 그룹당 60개의 계란으로 T1-T9, 9개의 그룹으로 분리하였다. 그룹 T9는 부화 후 첫째 밤에 해충의 공격을 받았고, 연구 과정 중 알려지지 않은 원인에 의해 일부가 죽었다. 폐사되는 때에, 그룹당 새의 수는 표 7에 나타난 바와 같다.

그룹당 새

그룹	처리	새의 수
1	처리 없음, 챌린지 없음	60
2	챌린지 만	60
3	백신 + 챌린지	60
4	백신 + 챌린지 + 0.112㎍ 면역조절제 인 오보	58
5	백신 + 챌린지 + 0.56㎍ 면역조절제 인 오보	58
6	백신 + 챌린지 + 1.12㎍ 면역조절제 인 오보	57
7	백신 + 챌린지 + 0.112㎍ 면역조절제 에어로졸	60
8	백신 + 챌린지 + 0.56㎍ 면역조절제 에어로졸	59
9	백신 + 챌린지 + 1.12㎍ 면역조절제 에어로졸	50

그룹 T4-T6 내 18일령의 발육된 계란에 면역조절제를 인 오보로 주하였다. 그룹 T1-T3 및 T7-T9는 살린 (saline) 내에서 주사되었다. 0일에, 계란은 부화하였고 그룹 T1-T2 내의 병아리에는 살린과 함께 분무하고, 그룹 T3-T6은 뉴 캐슬 백신, Intervet/Schering-Plough Animal Health에서 제조된 Newhatch-C2를 받았고, 그룹 T7-T9는 면역조절제로 분무하고 예방접종하였다.

부화 후 7, 14 및 21일째에, 항-NDV 적정을 위해 혈청을 채취하였다. 21일째에 그룹 T2-T9 병아리를 약독형 뉴 캐슬병 바이러스로 챌린지하였다. 26일째에, 병아리를 추려내어, 혈액을 뽑아, 기낭염에 대한 총체적인 병리상태를 시험하고, 혈청 분석을 실시하였다.

데이터는 7일, 14일, 및 21일의 그룹간에 혈청테스트에서 중요한 차이가 없음을 입증한다. 그러나 챌린지 후 5일, 26일에 이 오보로 면역조절제를 받은 새는 백신 단독을 포함한 모든 다른 그룹에 걸쳐 극적인 항-NDV 적정 농도 증가를 보였다 (도 40).

기낭염은 인 오보 조절제를 받은 병아리, T2-T5 사이에서 극적으로 감소하였다 (도 39). 상기 결과는 면역조절제의 인-오보 투여가 NDV 예방접종을 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 8. 치명적 챌린지 내에서 생물학적 제제와 함께 투여한 면역조절제의 효과성

18일령의 발육된 계란 내 일상적인 마릭병 예방접종과 함께 면역조절제의 단일 투여량의 방해를 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 연구는 치명적 챌린지에 대항한 마릭병 예방접종의 효능를 비교한 것이다.

총 160개의 발육된 계란을 8개의 그룹으로 분리하였다. 부화 시 각각의 셰더 새에 연구 0일, 마릭병 바이러스를 감염시켰다. 부화한 셰더 새의 수는 160마리 중 148마리였다 (계란/새의 초기 수 대 연구 마지막의 실제 수 (괄호 내)를 나타낸 하기 표 8 참조). 3주 후, 각 그룹에, 예방접종되지 않고 비 처리된 새 15마리 (접촉성) 및 처리된 새 65마리 (예방접종)의 80마리 새를 추가하였다 (각 그룹의 처리에 대한 하기 표 8 참조).

처리

룸	그룹	백신	투여량	루트	셰더	접촉	예방접종
2	A	HVT/SB1	1X	인 오보	20 (19)	15 (15)	65 (59)
3	B	HVT/SB1 + 면역조절제	1X	인 오보	20 (19)	15 (15)	65 (58)
4	A	HVT/SB1	1X	인 오보	20 (19)	15 (15)	65 (58)
5	B	HVT/SB1 + 면역조절제	1X	인 오보	20 (19)	15 (15)	65 (58)
6	A	HVT/SB1	1X	인 오보	20 (18)	15 (14)	65 (59)
7	B	HVT/SB1 + 면역조절제	1X	인 오보	20 (18)	15 (14)	65 (58)
8	A	HVT/SB1	1X	인 오보	20 (18)	15 (14)	65 (59)
9	B	HVT/SB1 + 면역조절제	1X	인 오보	20 (18)	15 (14)	65 (57)

연구 42일에, 생존하고 있는 셰더 새는 제거하여, 해부하였다. 연구 63일에 (접촉 및 예방접종 42일), 생존하고 있는 연구 새를 제거하여, 해부하였다.

도 41은 감염된 셰더 새, 예방접종되지 않은 접촉 새, 예방접종만 된 새, 예방접종된/면역조절제 새의 생존 곡선을 나타낸다. 예방접종되지 않은 접촉 군의 데이터는 8개 우리의 평균인 반면, 각각의 예방접종된 그룹은 각 4개 우리의 평균이다. 관찰되는 바와 같이, 예방접종만 된 경우 및 예방접종된/면역조절제 새의 생존 곡선 경사에서 유사점이 있다.

도 42는 감염된 셰더 새, 예방접종되지 않은 접촉 새, 예방접종만 된 새, 예방접종된/면역조절제 새 간의 마릭병의 평균 발생 빈도를 나타낸다. 셰더 및 접촉 군의 데이터 보두 우리 8개의 평균인 반면, 예방접종된 그룹은 각각 우리 4개의 평균이다. 관찰되는 바와 같이, 예방접종만 된 그룹 및 예방접종된/면역조절제 그룹은 마릭병 발생 정도가 훨씬 더 낮았다. 예방접종된/면역조절제 그룹은 예방접종보다 낮은 마릭병 발생 정도를 가졌다.

도 41 내지 도 42로부터 알 수 있듯이, 면역조절제는 마릭병 백신 보호에 유해한 효과를 나타내지 않는다. 실제로, 그것은 백신의 효능 증가를 유도하였다.

Claims (22)

1. a. 양이온성 리포좀 전달 비히클; 및
   b. 유전자 삽입이 없는 단리된 박테리아-유래의 핵산 벡터 또는 그의 절편인 핵산 분자를 포함하며,
   0.05 내지 10 ㎍의 면역조절제 조성물을 계란에 인 오보 투여함으로써 대장균으로 챌린지(challenge)된 배양 계란의 부화율을 향상시키기 위한,
   면역조절제 조성물.
2. 제1항에 있어서, 리포좀 전달 비히클은 다층막 소포 지질(multilamellar vesicle lipid) 및 압출 지질(extruded lipid)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 지질을 포함하는, 조성물.
3. 제1항에 있어서, 리포좀 전달 비히클은, DOTMA 및 콜레스테롤; DOTAP 및 콜레스테롤; DOTIM 및 콜레스테롤; 및 DDAB 및 콜레스테롤;로 구성된 그룹으로 부터 선택되는 지질의 쌍을 포함하는, 조성물.
4. 제1항에 있어서, 핵산 분자가 DNA 플라스미드인, 조성물.
5. 제1항에 있어서, 0.1 내지 5 ㎍의 상기 면역조절제 조성물이 계란에 인 오보 투여되는, 조성물.
6. 제1항에 있어서, 1.0 ㎍의 상기 면역조절제 조성물이 계란에 인 오보 투여되는, 조성물.
7. 제1항에 있어서, 배양 18일차에 배양 계란에 투여되는, 조성물
8. 제1항에 있어서, 마릭병 바이러스(Marek's disease virus, MDV), 뉴 캐슬병 바이러스(New Castle Disease virus, NDV), 병아리 빈혈 바이러스(chick anemia virus, CAV), 전염성 활액낭의 질병 바이러스(infectious bursal disease virus, IBDV), 전염성 기관지염 바이러스(infectious bronchitis virus, IBV), 칠면조 포진 바이러스(turkey herpesvirus, HVT), 전염성 후두기관염 바이러스(infectious laryngotracheitis virus, ILTV), 조류 뇌척수염 바이러스(avian encephalomyelitis virus, AEV), 계두 바이러스(fowlpox virus, FPV), 가금 콜레라(fowl cholera), 조류 독감 바이러스(avian influenza virus, AIV), 레오 바이러스(reovirus), 조류 백혈병 바이러스(avian leukosis virus, ALV), 망상내피세포증 바이러스(reticuloendotheliosis virus, REV), 조류 아데노 바이러스(avian adenovirus), 출혈성 장염 바이러스(hemorrhagic enteritis virus, HEV), 및 이들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택되는 것으로부터 보호하기 위한 백신인 생물학적 제제를 더 포함하는, 조성물.
9. 제1항에 있어서, 양이온성 리포좀 전달 비히클은 DOTIM 및 콜레스테롤을 포함하는, 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 챌린지 이전인, 조성물.
11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 챌린지 이후인, 조성물.
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