TWI555846B - 鳥類中增強之免疫反應 - Google Patents

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Description

鳥類中增強之免疫反應
本發明是有關於一種在一鳥類中免疫活化的方法。特別地，本發明包括用於引起呼吸以及全身性、非特異性以及抗原-特異性免疫反應的方法，其可應用於動物免疫、疫苗接種以及對於傳染病的治療。
疫苗用於預防傳染病以及治療已確定的疾病。傳染病是由包括諸如病毒、細菌、寄生蟲以及其他真菌的傳染媒介物(infectious agents)所引起。針對所有種類的物種(包括哺乳動物、鳥、魚以及靈長類動物)已發展出一些預防以及治療傳染病的試劑與方法。
疫苗接種計畫對於使用於食品產業中的商業飼養動物來說非常重要。就一些類型的感染而言，鳥類是主要目標。為種畜(breeders)與商業雞、火雞以及其他家禽畜群(poultry flocks)常規地接種疫苗以保護牠們而對抗環境暴露之病原菌。對於家禽產業來說，在經濟上最為重要的疾病之一是馬立克病(Marek’s disease)，它是一種天然發生在雞隻中的淋巴增生疾病(lymphoproliferative disease)。這個疾病是由水平傳播的高度傳染性疱疹病毒所引起，且對於家禽產業已是經濟損失的主因。馬立克病的症狀似乎廣泛遍及受感染之鳥類的神經、生殖器官、內臟、眼以及皮膚，致使運動麻痺(motor paralysis)、降低器官功能性(organ functionality)以及最終導致死亡的慢性營養不足(chronic undernourishment)。
孵化中的鳥在出生之後很快地就暴露於病原性微生物。雖然這些鳥最初會受到母體衍生的抗體所保護而抵禦病原菌，但這樣的保護僅是短暫的，因此鳥本身不成熟的免疫系統必須開始保護鳥而抵禦病原菌。既然幼鳥是最為易感的(susceptible)，通常期待在幼鳥中防止感染。通常亦期待在較年長的鳥中預防感染，特別是當鳥兒們是豢養在封閉的區域內，會導致疾病快速傳播。
在大多數的商業畜群(commercial flocks)中，會在孵化時非經口地給予新孵化出的小雞某些疫苗。因為暴露於病原菌通常發生在相當幼齡時，牠們常常需要在安置於育成或育雛舍(rearing or brooder houses)之前就接種疫苗。這樣的一個疫苗接種計畫需要處理獨立的鳥且涉及意外自我注射(accidental self-injection)的可能風險。另外，這些疫苗並非總是有效的。在小雞有機會發展出適當的保護性免疫力之前，牠們在接種疫苗之後可能非常快就暴露於疾病的致病形式。
一些活毒疫苗可以在鳥孵化之前投至蛋中。這個步驟被意指為“卵內疫苗接種(in ovo vaccination)”。經卵內疫苗接種的鳥對標的疾病發展出抗性。但是，一些使用於已孵化鳥的疫苗無法使用在卵內疫苗接種，因為疫苗劑(vaccine agents)的胚胎致病力(embryonic pathogenicity)。晚期胚胎對於大多數經檢驗的疫苗病毒的感染是非常敏感的。對晚期胚胎來說，並非所有對剛孵化的小雞是非致病性的疫苗病毒也是安全的。例如，在新孵化的小雞中慣用作為新生疫苗之傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)以及新城雞瘟病毒(Newcastle disease virus,NDV)的疫苗株(vaccine strains)，對於胚胎而言在卵內接種之後是致命的。這些病毒已經過修飾而使得它們在卵內使用上是安全的。修飾病毒會弱化所引起的免疫反應，因而在保護晚期胚胎來說是一種較不有效的疫苗劑。
提供保護免於傳染病所需的此種不同疫苗以及經濟損失的疫苗接種計畫是複雜的。因此，存在者一種對於引起一個會增強保護鳥免於傳染病並且容易投藥的非-抗原-特異性免疫反應(non-antigen-specific immune response)之方法的需求。此外，期待有一種引起針對超過一種傳染媒介物提供保護作用的免疫反應的方法。另外，存在者一種對於引起一具有較長持續期間或者不需要後續疫苗注射(booster shots of a vaccine)之免疫反應的方法的需求。本發明提供種在鳥類中引起一非-抗原-特異性免疫反應的方法，它亦會減低畜群的發病率(morbidity)、針對超過一種的傳染媒介物提供保護作用，並且提供要比該技藝中一般所熟知的其他產品達較長時間期間的保護。
本發明之在鳥類個體中引起免疫反應的方法，包括將一有效量的免疫調節劑組成物投藥給該鳥類個體，而在該鳥類的該員中引起一免疫反應。該免疫調節劑組成物包括一脂質體遞送載體(liposome delivery vehicle)以及至少一核酸分子。特別地，該免疫調節劑引起一種藉由投與至少一諸如疫苗的生物劑(biological agent)而被進一步增強的非-抗原-特異性免疫反應。
該等方法提供用以保護鳥類免於傳染病以及治療帶有傳染病之族群的新穎治療策略。此外，透過使用本發明的免疫調節劑組成物，當該免疫調節劑以卵內投藥之後不會降低孵化率(hatchability)或孵化後的存活率(survival rate)，且當與一疫苗共投藥時不會降低孵化率或孵化後的存活率。再者，在投藥一疫苗之前預先投藥該免疫調節劑更增強非-抗原-特異性免疫反應。本發明的方法亦允許先前僅可在孵化之後投藥的疫苗在卵內使用的安全用途。此外，本發明的方法允許將超過一種的疫苗與免疫調節劑組成物組合。最後，當該免疫調節劑組合疫苗使用時，本發明的方法提供較長的保護對抗一疾病。
I.　組成物
a.免疫調節劑(Immunomodulator)
在本發明的一個具體例中，該免疫調節劑組成物包括一脂質體遞送載體以及至少一如美國專利第6,693,086號中所述的核酸分子，並且併入此處做為參考文獻。
一適當的脂質體遞送載體包含有一脂質體組成物，能夠將核酸分子遞送到要被治療的個體的組織。一脂質體遞送載體較佳地能夠在一個體體內維持穩定達到足以遞送一核酸分子和/或一生物劑的充分時間。在一個具體例中，該脂質體遞送載體在接受者個體體內是穩定的達至少約30分鐘。在另一個具體例中，該脂質體遞送載體在接受者個體體內是穩定的達至少約1小時。在又另一個具體例中，該脂質體遞送載體在接受者個體體內是穩定的達至少約24小時。
本發明的一脂質體遞送載體包含有一能夠與一細胞的細胞膜融合而將一核酸分子遞送至一細胞內的脂質組成物。在一個具體例中，當遞送本發明的一核酸：脂質體複合物時，是每微克(μg)被遞送的核酸之至少約每毫克(mg)總組織蛋白質的1皮克(pg)表現出的蛋白質。在另一個具體例中，一核酸：脂質體複合物的轉染效率是每μg被遞送的核酸之至少約每mg總組織蛋白質的10 pg表現出的蛋白質；以及在另一個具體例中，為每μg被遞送的核酸之至少約每mg總組織蛋白質的50 pg表現出的蛋白質。該複合物的轉染效率可低至每μg被遞送的核酸之每mg總組織蛋白質的1毫沙克(fg)表現出的蛋白質，以上述數量更佳。
本發明的一個較佳脂質體遞送載體在直徑上是介於約100以及500奈米(nm)之間，在另一個具體例中，介於約150以及450 nm之間以及在又另一個具體例中，介於約200以及400 nm之間。
適當的脂質體包括任一種脂質體，諸如在例如熟悉該技藝者所熟知的基因遞送方法中通常使用者。較佳的脂質體遞送載體包含有複層囊泡(multilamellar vesicle；MLV)脂質以及擠製脂質(extruded lipids)。用於製備MLV的方法在該技藝中是已知的。更佳的脂質體遞送載體包含有具有聚陽離子脂質組成物(polycationic lipid composition)(亦即，陽離子脂質體)和/或具有一膽固醇骨架綴合至聚乙二醇(polyethylene glycol)的脂質體。例示性陽離子脂質體組成物包括，但不限於N-[1-(2,3-二油氧基)丙基]-N,N,N-三甲基銨氯化物(N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride)(DOTMA)與膽固醇、N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基銨氯化物(N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride)(DOTAP)與膽固醇、1-[2-(油氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑鎓氯化物(1-[2-(oleoyloxy)ethyl]-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoli nium chloride)(DOTIM)與膽固醇、溴化二甲基十八烷基銨(dimethyldioctadecylammonium bromide)(DDAB)與膽固醇，以及它們的組合。一個供使用作為一遞送載體的最佳脂質體組成物包括DOTIM與膽固醇。
一個適當的核酸分子包括任一種核酸序列，諸如編碼或非編碼序列，以及DNA或RNA。編碼核酸序列編碼一蛋白質或肽的至少一部分，而非編碼序列未編碼一蛋白質或肽的任何部分。依據本發明，「非編碼」核酸可包括一轉錄單元(transcription unit)的調節區域(regulatory regions)，諸如一啟動子區域。「空載體(empty vector)」可與「非編碼」一詞交替地使用，並且特別意指一種在沒有蛋白質編碼部分(protein coding portion)時的核酸序列，諸如一個不帶有基因插入物(gene insert)的質體載體。表現由該核酸分子所編碼的蛋白質對於引起非-抗原-特異性免疫反應來說並非必須的；因此該核酸分子不必然需要可操作地連結至一轉錄控制序列。但是，透過將編碼一免疫原和/或一細胞激素的核酸序列(DNA或RNA)納入該組成物中可獲得更多優點(亦即，抗原-特異性以及增強的免疫性)。
具有一脂質體與一核酸分子複合可使用技藝中標準方法或如同在美國專利第6,693,086號中所述方法而達成，且其併入本文做為參考文獻。加入脂質體的核酸分子的適當濃度包括有效將一充分數量的核酸分子遞送至一個體中而引起全身性免疫反應的濃度。若該核酸分子編碼一免疫原或一細胞激素，加入脂質體的核酸分子的適當濃度包括有效將一充分數量的核酸分子遞送至一細胞中，而以一種所欲的方式使得該細胞可生成充分免疫原和/或細胞激素蛋白質以調節效應子細胞免疫性的濃度。在一個具體例中，從約0.1 μg至約10 μg的核酸分子組合約8 nmol脂質體，在另一個具體例中，從約0.5 μg至約5 μg的核酸分子組合約8 nmol脂質體，以及在另一個具體例中，約1.0 μg的核酸分子組合約8 nmol脂質體。在一個具體例中，在一組成物中核酸相對於脂質的比例(μg核酸：nmol脂質)以重量計是至少約1：1核酸：脂質(亦即，1 μg核酸：1 nmol脂質)，以及在另一個具體例中，至少約1：5，以及在又另一個具體例中，至少約1：10，以及在再一個具體例中至少約1：20。此處所表示的比例是以陽離子脂質在組成物中的數量為基礎，而不是脂質在該組成物中的總數量。在另一個具體例中，在本發明的一組成物中核酸相對於脂質的比例以重量計是約1：1至約1：64核酸：脂質；以及在另一個具體例中，以重量計為約1：5至約1：50核酸：脂質；以及另一個具體例，以重量計為約1：10至約1：40核酸：脂質；以及在另一個具體例中，以重量計為約1：15至約1：30核酸：脂質。核酸：脂質的另一個比例是從約1：8至1：16，以約1：8至1：32是較佳的。
b.生物劑(Biological agent)
在本發明的另一個具體例中，該免疫調節劑包括一脂質體遞送載體、一核酸分子以及至少一生物劑。
適當的生物劑是有效預防或治療禽病(avian disease)的藥劑。此等生物劑包括免疫增強劑蛋白、免疫原、疫苗或它們的任一種組合。適當的免疫增強劑蛋白質包括那些已知會增強免疫性的蛋白質。藉由非限定實例，包括一個蛋白質家族的細胞激素是一種已知的免疫性增強蛋白質家族。適當的免疫原會引起體液性和/細胞性免疫反應的蛋白質，而使得將該免疫原投與至個體會發動一免疫原-特異性免疫反應來抵禦在個體組織中所遭遇到的相同或類似蛋白質。一免疫原可包括由細菌、病毒、寄生蟲或真菌所表現的一病原性抗原。較佳的抗原包括在一個體體內造成傳染病的抗原。依據本發明，一免疫原可以是一蛋白質的任一個部分，天然存在或合成衍生的，它會引起體液性和/或細胞性免疫反應。就其本身而論，一抗原或免疫原的大小可為小至約5-12個胺基酸以及大至一個全長蛋白質，包括它們之間的大小。抗原可以是一種集合體蛋白或融合蛋白。抗原可以是從天然或重組型細胞衍生而來之經純化的胜肽抗原。免疫增強劑蛋白質以及免疫原的核酸序列可操作地連結至一轉錄控制序列，以使得免疫原在一個體的組織內表現，藉此在非-特異性-免疫反應以外於該個體體內引起一免疫原-特異性免疫反應。
在本發明的另一個具體例中，該生物劑是一疫苗。疫苗可包括一活的、傳染性、病毒性疫苗或一死的、不活化的病毒性疫苗。在一個具體例中，一或多種疫苗，活毒或死毒疫苗可組合本發明的免疫調節劑組成物使用。適當的疫苗包括那些在技藝中已知用於鳥類者。在未受到限制的情況下，例示性疫苗包括那些在該技藝中使用於保護抵抗馬立克病病毒(MDV)、新城雞瘟病毒(NDV)、雞貧血病毒(chick anemia virus,CAV)、傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、火雞疱疹病毒(turkey herpesvirus,HVT)、傳染性喉頭氣管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、鳥類腦脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)、禽痘病毒(fowlpox virus,FPV)、家禽霍亂(fowl cholera)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、里奧病毒(reovirus)、鳥類白血病病毒(avian leucosis virus,ALV)、網狀內皮增殖病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)、鳥類腺病毒(avian adenovirus)與出血性腸炎病毒(hemorrhagic enteritis virus,HEV)、球蟲(coccidia)，以及其他在該技藝中已知的疾病。在另一個實例中，疫苗可以是一種如同依據美國專利第5,427,791、6,048,535以及6,406,702號中所述的疫苗。在一個例示性具體例中，用於防護馬立克病的疫苗可以組合本發明的免疫調節劑組成物使用。
II.　方法
a.　免疫刺激的方法
在本發明的一個具體例中，在鳥類個體中藉由將一有效量的免疫調節劑組成物投藥給該鳥類個體的該員而引起免疫反應。該有效量足以在該鳥類個體內引起免疫反應。該免疫調節劑包括一脂質體遞送載體以及一核酸分子。
在一個具體例中，該免疫調節劑的有效量是從約0.05微克至約10微克。在另一個具體例中，該免疫調節劑的有效量是從約0.1微克至大約5微克。
在本發明的另一個具體例中，一免疫反應在鳥類個體中藉由將一有效量的免疫調節劑組成物而引起，該免疫調節劑組成物包括一脂質體遞送載體、一經分離的核酸分子以及一生物劑。可預期的是該生物劑可以與該免疫調節劑一起共投藥或獨立地投藥。可以在該免疫調節劑投藥之前或之後獨立投藥。亦可預期的是投藥該免疫調節劑或生物劑超過一次可用以延長增強的免疫性。另外，如同此處在實施例中所述，超過一種的生物劑可以與該免疫調節劑一起共投藥、在該免疫調節劑之前投藥或在該免疫調節劑投藥之後投藥。在一個具體例中，該有效量的免疫調節劑是從約0.05微克至約5微克的脂質體遞送載體與該經分離的核酸分子以及從約300至約30000 TCID50病毒生物劑。在另一個具體例中，有效量的免疫調節劑是從約0.1微克至約3微克的脂質體遞送載體以及經分離的核酸分子與從約100至約1000 EID50病毒生物劑。
b.　疾病
本發明的方法在一個體中引起免疫反應而使得該個體受到保護免於一種會引起免疫反應的疾病。如此處所用的，慣用語“保護免於一種疾病(protected from a disease)”意指減低該疾病的症狀；減少該疾病的出現，以及減低該疾病的嚴重性。保護一個體可意指當本發明的治療性組成物投藥給一個體時，預防該疾病發生和/或治癒或減輕疾病症狀、徵兆或病因的能力。就其本身而論，保護該鳥類個體免於疾病包括防止疾病出現(預防性處理)以及治療已帶病之鳥的個體(治療性處理)。特別地，保護一個體免於疾病藉由誘發有益的或保護性免疫反應而在該鳥類個體體內引起一免疫反應，該有益的或保護性免疫反應在某些情況下可以額外地壓抑、減低、抑制或阻斷過度活化或有害的免疫反應而達成。「疾病」一詞意指任一種偏離該鳥類個體正常健康並包括一種當疾病症狀存在時的狀態，還有偏離(例如，感染、基因突變、遺傳缺陷等)已發生但是未經證實的症狀時的病況。
本發明的方法可用於預防疾病、刺激對抗疾病的效應細胞免疫性、消除疾病、減輕疾病以及預防起因於發生首發病(primary disease)的續發病(secondary disease)。
本發明的方法包括投藥該組成物以保護抵抗廣泛多種的病原菌感染。經投與的組成物可以或可以不包括對它會引起起特異性反應的抗原。可預期的是本發明的方法能夠保護接受者個體免於起因傳染微生物媒介物(包括，但不限於病毒、細菌、真菌以及寄生蟲)的疾病。在未受到限制的情況下，例示性病毒傳染病包括那些起因於下列的感染：雞傳染貧血病毒(CIAV)、馬立克病病毒(MDV)、雞疱疹病毒(HCV)、火雞疱疹病毒(HTV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、新城雞瘟病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性喉頭氣管炎病毒(ILTV)、第3型副黏液病毒(paramyxovirus type 3)、鳥類腦脊髓炎病毒(AEV)、禽痘病毒(FPV)、家禽霍亂、禽流感病毒(AIV)、里奧病毒(reovirus)、鳥類白血病病毒(avian leucosis virus,ALV)、網狀內皮增殖病病毒(REV)、鳥類腺病毒、出血性腸炎病毒(HEV)、肺炎病毒(pneumovirus)、鴿痘病毒(pigeon pox virus)，它們的重組型，以及其他在該技藝中已知的病毒。在未受到限制的情況下，例示性細菌感染包括那些起因於下列的感染：格蘭陽性或陰性細菌與真菌，諸如大腸桿菌(Escherichia coli)、雞敗血性黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum)、火雞黴漿菌(Mycoplasma meleagridis)、滑膜黴漿菌(Mycoplasma synoviae)、包台拉菌屬(Bordetella Sp)、敗血性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、產氣莢膜芽胞梭菌(Clostridium perfringens)、大腸芽胞梭菌(Clostridium colinum)、空腸曲桿菌(Campylobacter jejuni)、沙門桿菌(Salmonella sp)、腸炎沙氏桿菌(Salmonella enteritidis)、雛白痢沙氏桿菌(Salmonella pullorum)、雞沙氏桿菌(Salmonella gallinarum)、肉毒桿菌(Clostridium botulinum)、禽嗜血桿菌(Hemophilus gallinarum)、豬丹毒桿菌(Erysipelothrix insidiosa)、鴨疫里默氏桿菌(riemerella anatipestifer,RA)，以及其他在該技藝中已知的細菌。在未受到限制的情況下，例示性真菌或黴菌感染包括那些起因於下列的感染：薰煙麴菌(Aspergillus fumigates)、黃麴菌(Aspergillus flavus)、白色念珠菌(Candida albicans)或其他在該技藝中已知的傳染性真菌或黴菌。在未受到限制的情況下，例示性的病況包括那些起因於下列者：源自於格蘭陽性或陰性細菌與真菌的毒素，諸如產氣莢膜芽胞梭菌毒素、肉毒桿菌毒素、大腸桿菌腸毒素、葡萄球菌毒素、巴氏桿菌白血球毒素以及鐮菌毒素(fusarium mycotoxins)與其它在該技藝中已知的毒素。在未受到限制的情況下，例示性寄生蟲包括艾美鞭毛蟲(Eimeria meleagridis)、球蟲屬(coccidian sp)、鴿蛔蟲(Ascaridia galli)、雞盲腸蟲(Heterakis gallinae)、環紋毛細線蟲(Capillaria annulata)、鳥食道毛細線蟲(Capillaria contorta)、雞毛細線蟲(Capillaria obsignata)、雞張口絲蟲(Syngamus trachea)，以及其他在該技藝中已知的寄生蟲。
c.　個體
本發明的方法可以投藥給鳥類的任何個體或成員，不論是馴養的或野生的。特別地，它可以被投藥給那些商業上飼養用於育種、生產肉或蛋的個體。在未受到限制的情況下，適當的鳥個體包括雞、火雞、鵝、鴨、雉雞、鵪鶉、鴿子、鴕鳥、飼於籠中之鳥類、動物園與禽舍或類似者中的鳥類。在一個具體例中，鳥類的成員是選自於由小雞或火雞所構成的群組。熟悉該項技藝者將預期到本發明的方法主要對於飼養在高密度育雛舍的鳥[諸如肉雞(broiler)以及產蛋雞(layer chickens)]來說是非常有益的，因為牠們對於環境暴露於傳染媒介物是有弱點的。
d.　投藥
多樣的投藥途徑是可用的。當然，所選定的特定模式將視所選定的特別生物劑、個體的年齡以及整體健康狀態、要被治療的特定病況以及治療效用所需的劑量。本發明的方法可使用任一種產生有效程度的免疫反應而不會在臨床上致使無法接受的不利作用之投藥模式來實施。該等組成物方便地以單位劑量形式存在，並且可以藉由任何在該技藝中所熟知的方法製備。
鳥類的疫苗接種可以在任何年齡實施。通常，疫苗接種實施就活的微生物而言在18日齡以上之胚胎(卵內)，以及就去活的微生物或其他類型的疫苗而言3週齡以上。就卵內疫苗接種來說，疫苗接種可以在胚胎發育的最後四分之一實施。疫苗可皮下地、羽囊(feather follicle)、透過噴霧、經口地、眼內地、氣管內地、經鼻地、卵內或透過其他在該技藝中已知的方法投藥。口服疫苗可以在飲用水中投藥。再者，可預期的是本發明的方法可依據慣常疫苗接種計畫表來使用。在一個具體例中，本發明的免疫調節劑組成物卵內地投藥。在另一個具體例中，該免疫調節劑組成物在以大腸桿菌攻毒後以例如噴霧般投藥。
其他的遞送系統可包括時間釋放的、延遲釋放或持續釋放遞送系統。此等系統可避免重複投藥組成物，因而增加方便性。一些類型的釋放遞送系統是可使用的，並且對於在該技藝中具有通常技術者來說是已知的。它們包括以聚合物為基礎的系統，諸如聚(乳酸交酯-乙交酯)[poly(lactide-glycolide)]、共聚草酸(copolyoxalates)、聚己內酯(polycaprolactones)、聚酯醯胺(polyesteramides)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚羥丁酸(polyhydroxybutyric acid)以及聚酐(polyanhydrides)。含有藥物的前述聚合物的微膠囊描述於，例如，美國專利第5,075,109號中。遞送系統亦包括非聚合物系統，其為脂質，包括固醇類，諸如膽固醇、膽固醇酯以及脂肪酸或中性脂肪，諸如單-雙以及三-甘油酯；水膠釋放系統；矽膠系統；以肽為基礎的系統；蠟包膜；使用傳統黏合劑與賦形劑的壓錠；部分融合的植入物；以及類似物。特定實例包括，但不限於腐蝕系統，其中本發明的一劑是呈包含在基質內的形式，諸如那些描述於美國專利第4,452,775、4,675,189以及5,736,152號中者以及擴散系統，其中活性成分以一控制速率從諸如描述於美國專利第3,854,480、5,133,974以及5,407,686號中的聚合物中滲入。此外，可使用以泵為基礎的硬體遞送系統，它們之中的某些適於移植。
因為在未偏離本發明之範疇的情況下，可在上述組成物、產物以及方法中產生各種改變，上述說明與下述提供之實施例中所包含的內容意欲解釋為說明用而非為限定之意。
定義
「有效量」一詞意指實現所欲的生物作用所必須或足夠的數量。例如，用以治療或預防傳染病的免疫調節劑的有效量為在暴露於微生物之後引出抗原特異性免疫反應所需之量，因而該數量在該個體體內造成微生物數量的降低或較佳地消滅該微生物。有關任一種特定用途的有效量可隨著諸如欲治療的疾病或病況、個體的大小或疾病或病況的嚴重性的因素而改變。熟悉該技藝者可在實驗上決定免疫調節劑的數量而無須過度實驗。
「細胞激素」一詞意指一個免疫增強蛋白質家族。該細胞激素家族包括造血生長因子(hematopoietic growth factor)、介白素(interleukins)、干擾素、免疫球蛋白超家族分子、腫瘤壞死因子家族分子以及趨化素(chemokines)(亦即，調節細胞移動與活化的蛋白質，特別是吞噬細胞(phagocytic cells)。在未受到限制的情況下，例示性細胞激素包括介白素-2、介白素-12、介白素-15、介白素-18、干擾素-α(IFNα)、干擾素-α(IFNα)以及干擾素-α(IFNα)。
「引起(elicit)」一詞可與術語活化、刺激、產生或上調交替地使用。
在一個體體內「引起一免疫反應(eliciting an immune response)」一詞意指特異性地控制或影響免疫反應的活性，並且可包括活化免疫反應、上調免疫反應、增強免疫反應和/或改變免疫反應(諸如藉由引起一種類型的免疫反應，其依次在一個體中將主要類型的免疫反應從有害或者是無效的改變成有益或保護性的)。
「可操作地連結(operatively linked)」一詞意指當被轉染至一宿主細胞內時(亦即，轉形、轉導或轉染)，將一核酸分子以該分子能夠被表現這樣的一種方式連結至一轉錄控制序列。轉錄控制序列是控制轉錄起始、延長以及終止的序列。尤其重要的轉錄控制序列是那些控制轉錄起始的序列，諸如啟動子、增強子、操作子以及抑制子序列。多樣的此等轉錄控制序列對於熟悉該技藝者來說是已知的。較佳的轉錄控制序列包括那些在鳥、魚、哺乳動物、細菌、植物以及昆蟲細胞中作用者。雖然任一種轉錄控制序列可與本發明一起使用，該等序列可包括與編碼一免疫原或免疫刺激蛋白的序列天然地相關之天然存在的轉錄控制序列。
術語“核酸分子”以及“核酸序列”可交替地使用並且包括DNA、RNA或者DNA或RNA的衍生物。該等術語亦包括寡核苷酸以及較大的序列，包括編碼一蛋白質或其一片段的核酸分子，以及包含有調節區域、內含子或其他非編碼DNA或RNA的核酸分子。典型地，一寡核苷酸具有一核酸序列從約1至約500個核苷酸長，以及更典型地，至少約5個核苷酸長。該核酸分子可以衍生自任何來源，包括哺乳動物、魚、細菌、昆蟲、病毒、植物或合成的來源。一核酸分子可以藉由該技藝中一般所熟知的方法而製成，諸如重組型DNA技術(例如，聚合酶鏈反應(PCR)、擴增、選殖)或化學合成。核酸分子包括天然的核酸分子及其同源物，包括，但不限於天然的對偶基因變異體或經修飾的核酸分子，其中核苷酸以此修飾本質上不會干擾用於本發明之方法中的核酸分子編碼免疫原或免疫刺激蛋白的能力的此類方式被插入、刪除、置換或轉位。一核酸同源物可以使用一些熟悉該技藝者已知的方法而製成(參見，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning: A laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labs Press,1989)，其併入此處做為參考文獻。篩選免疫原性(諸如病原菌抗原免疫原性或細胞激素活性)的技術對於熟悉該技藝者而言是已知的，並且包括各種不同的活體外與活體內分析。
下列實施例說明本發明的各種具體例。
實施例1.　材料與方法 免疫調節劑
使用於本研究中的免疫調節劑是一種包含有一陽離子脂質以及非編碼DNA的組成物。該合成的免疫調節劑脂質組分[1-[2-9-(Z)-十八油醯氧基]]-2-[8](Z)-十七醯基]-3-[羥乙基]咪唑鎓氯化物([1-[2-9-(Z)-octadecenoyloxyl]]-2-[8](Z)-heptadecenyl]-3-[hydroxyethyl]imidazolinium chloride,DOTIM)，及一合成的中性脂質膽固醇被配方以製成直徑約200nm的脂質體(參見美國專利第6,693,086號)。DNA組分是一種在大腸桿菌中生成的4242鹼基對非編碼DNA質體(pMB 75.6)，其帶負電，與帶正電(陽離子)的脂質體(參見美國專利第6,693,086號)締合。
研究動物
在培育的第18天以光檢查商業上可取得的雞蛋(肉種雛雞(Meat Broilers))來決定成活力(viability)。在本研究中包括健康的胚胎，而無受精、死亡以及不健康的胚胎被丟棄。小雞住在傳統加州式有側簾的雞籠。每個畜舍在第0天置放50隻未鑑別的小雞(straight run birds)。針對研究動物的年齡以及重量定量餵養小雞符合的MRC建議的飼糧，且小 雞可任意飲用經由接附於供水的水龍頭的水。
實驗感染以及攻毒
以生物對小雞攻毒以決定免疫反應的效力。攻毒或實驗感染包括暴露於微生物(諸如大腸桿菌(E.coli))的接種物。以2.63X105的濃度使用該等生物並且當在孵化盤上時藉由將0.15mL的接種物噴灑至各個受精蛋上而來投藥。
實施例2. 投藥免疫調節劑會增加孵化率
如實施例1中所述，進行一個研究以決定一投藥至18-日齡受精雞蛋隨後暴露於大腸桿菌(E.coli)，以測定免疫調節劑效力之研究。本研究包括2組(表2)，1組以大腸桿菌(T1-4)攻毒而另一組未攻毒(T5與T6)。在以大腸桿菌攻毒的組別中，有4小組各自投藥不同劑量的免疫調節劑，包括無(T1)、0.1μg(T2)、1.0μg(T3)與10.0μg(T4)。未攻毒組包括2個小組，牠們未投藥免疫調節劑(T5)或投藥1.0μg的免疫調節劑(T6)。
在研究的第0天，接受免疫調節劑的18-日齡受精蛋被卵內注射。在第1天，攻毒組(T1-T4)中的19日齡受精蛋各自噴灑含有大腸桿菌(濃度為2.63X105)的0.15 mL接種物。
對於受精蛋的孵化率來說，所有組別的分析在統計學上有顯著的處理效果。在2個非攻毒對照組(T5，0 μg/kg為91%相對於T6，1.0 μg/kg為89%)之間沒有顯著差異。此外，2個非-處理的組別(T1-經攻毒以及T5-未攻毒)之間的比較，在非-攻毒的組別中孵化出更多的受精蛋(各自地85%相對於91%)。因此，攻毒模型確認作為一個用以評估孵化率的有效模型。
關於那些以免疫調節劑處理的組別，T3組(1.0 μg/kg-經處理的蛋)(91.5%)要比非-處理/攻毒的T1(84.5%)或T4(10.0 μg/kg-經處理的蛋)(85%)孵化出更多的鳥(第1圖)。類似的差異亦出現在非-處理/非-攻毒的對照組(T5)中以及這些2個相同處理的組別(T1，如上所述，以及T4)。在任何其餘的成對組別比較中沒有其他顯著的發現(第1圖)。
在每個畜舍、每組、每個研究日死亡的鳥的比例方面沒有顯著差異(第2圖)。在任一個特定研究日存活下來的鳥的比例在處理以及時間之間沒有統計學上顯著的交互作用，但確實有顯示出顯著的處理效果(第3圖)。當與T1、T2以及T4組相較之下，T3、T5以及T6組中的鳥在任一天有明顯較多的鳥。此外，T5鳥亦要比T3有更多存活鳥。在孵化之後評估鳥的成活力(viability)產生如上的類似顯著發現(第4圖至第12圖)。
在第7、14、21或28天觀察到在畜舍重量方面沒有顯著差異(第13圖至第16圖)。在第35天的總畜舍重量分析於T5與T2組之間產生顯著差異(平均為87 kgs相對於75 kgs，各別地)(第17圖)。在研究終止(第45天)時，就組別T5(120 kgs)與T6(117 kgs)來說，當與T1(105 kgs)相較之下的畜舍重量是較大的，而就T5來說當與T2(106 kgs)和T6(105 kgs)相較之下是較大的(第18圖)。
總括而言，評估免疫調節劑在大腸桿菌感染之前卵內投藥至商業肉雞(commercial broilers)的效用。對於那些以免疫調節劑處理的組別來說，T3組(92%)要比非-處理/攻毒T1(85%)或T4(85%)組孵化出較多的鳥。類似的差異亦顯示在非-處理/非-攻毒對照組(T5)以及相同處理的組別T1與T4之間。在死亡率(第2圖至第12圖)以及體重(第13圖至第18圖)方面沒有顯著差異。在這個研究中，免疫調節劑有效增加在孵化之前以大腸桿菌攻毒的商業肉雞蛋的孵化率，特別在劑量為1.0 μg時，表示在接受免疫調節劑的組別中有增強免疫力。
實施例3.　投藥免疫調節劑會增加非-抗原-特異性免疫力
如實施例1中所述，進行一個研究以決定一免疫調節劑在經馬立克病疫苗接種的小雞暴露於大腸桿菌方面的效果。該研究包括2組，1組以大腸桿菌攻毒(T1-T4)而其他組未攻毒(T5與T6)。在大腸桿菌攻毒的組別中，有4小組各自投藥不同劑量的免疫調節劑，包括無(T1)、0.1 μg(T2)、1.0 μg(T3)、1.0 μg加上1劑量的馬立克病疫苗(T4)(表3)。非-攻毒的組別包括2個小組，牠們未投藥免疫調節劑(T5)或投藥1.0 μg的免疫調節劑(T6)。
培育商業肉雞蛋歷時18天，以光檢查成活力並且繼而接受免疫調節劑的18-日齡受精蛋被卵內注射。接著，在攻毒組中19-日齡受精蛋各自噴灑含有大腸桿菌(每毫升濃度為2.8X107)的0.15 mL接種物。在持續達45天的研究的第0天孵化蛋。
針對各組紀錄孵化的受精蛋數目(每組或孵化盤n=1000)(第19圖)。在孵化的雞隻中，記錄在孵化後第7天仍存活的雞隻(第20圖)。亦記錄在孵化後第7天每組的活/死亡雞隻數目(第21圖)。在經攻毒的組別中死亡率百分比隨著增加的免疫調節劑而降低，而馬立克病疫苗與免疫調節劑的共投藥更降低死亡率百分比(第22圖)。
數據證實，在經免疫調節劑處理的組別以及非-處理的組別(未以大腸桿菌攻毒)之間在孵化率方面沒有降低(第23圖)。孵化率在經免疫調節劑處理的組別以及非-處理的組別(未以大腸桿菌攻毒)之間是明顯較高的。接受免疫調節劑以及1個劑量的馬立克病疫苗的受精蛋孵化率是類似於非-處理以及非-攻毒的對照組。總括而言，免疫調節劑在攻毒的情況下會增加孵化率而免疫調節劑的保護反應在馬立克病疫苗共投藥的情況下會增強。結果顯示，免疫調節劑或免疫調節劑與馬立克病疫苗的投藥會引起非-抗原-特異性免疫反應。
實施例4.　投與免疫調節劑會引起在額外投與一生物劑而被增強的非-抗原-特異性免疫反應
進行研究以決定一免疫調節劑對於經馬立克病疫苗接種的小雞暴露於大腸桿菌方面的效果。該研究包括9組，它們如表4中所示受到不同的處理。
培育商業肉雞蛋歷時18天，以光檢查成活力並且繼而接受免疫調節劑的18日齡受精蛋被卵內注射。接著，在攻毒組中19日齡受精蛋各自噴灑含有大腸桿菌(每毫升濃度為2.63 X 105)的0.15 mL接種物。在持續達45天的研究的第0天孵化蛋。
針對各組計算孵化的受精蛋百分比(第24圖)。在孵化的雞隻中，針對攻毒(第26圖)以及非-攻毒(第25圖)的組別計算在孵化後第7天的死亡率百分比。攻毒組證實要比經類似處理的非-攻毒組有較高的死亡率百分比(第27圖)。計算每組從孵化到第7天以及第3天(18天活胚胎)至第7天的存活雞隻百分比(第29圖，n=400)。相較於經攻毒的對照組(82.2%，第28圖)，就在攻毒之前經免疫調節劑處理的鳥來說有明顯較高的存活率(>98.2%，第28圖)。而且，相較於經攻毒的對照組(82.2%，第28圖)，就孵化時以免疫調節劑處理於第7天攻毒之前或之後的鳥來說，在第7天有明顯較高的存活率(95%，第28圖)。這些結果使用每組含有400顆蛋的一個系列來重複(第29圖)。相較於對照組(67.0%，第29圖)，以攻毒之前經處理的胚胎而言，在第7天有較高的存活率(系列400)(>94.3%，第29圖)。類似地，就在卵內以免疫調節劑處理的鳥來說有明顯較高的存活率(97.4%，第30圖，無第2次處理，在第14天相較於經攻毒的對照組(81.9%，第30圖))。相較於對趙組81.9%(第30圖)，在攻毒之後沒有第1次處理，於第1天時以免疫調節劑處理的組別中在第14天有明顯較高的存活鳥，93.9%(第30圖)。與對照組相較之下，81.9%(第30圖)，在卵內以及接而在第1天時以免疫調節劑處理的組別中在第14天也有明顯較高的存活鳥，95.8%(第30圖)。第30圖顯示經攻毒以及未攻毒的組別在不同處理情況下的每週死亡率。
數據證實，在未經大腸桿菌攻毒的免疫調節劑處理組(處理1次或2次)與非-處理的組別之間沒有降低孵化率。在大腸桿菌攻毒之前以免疫調節劑處理的組別中孵化率是較高的。當免疫調節劑與馬立克病疫苗共投藥時會增強這個效果。而且，在非-攻毒的組別中免疫調節劑處理與死亡率降低是有關聯的。死亡率在共投藥馬立克病疫苗以及在投藥免疫調節劑和馬立克病疫苗之前預先以免疫調節劑處理的情況下會進一步降低死亡率。這些結果在經攻毒的組別中重複。總地來說，免疫調節劑在攻毒的情況下會增加孵化率且當與馬立克病疫苗共投藥時會增強免疫調節劑的保護反應。結果顯示，當伴隨著馬立克病疫苗投藥時會提高投藥免疫調節劑所引起的非-抗原-特異性免疫反應。免疫調節劑與馬立克病疫苗的共投藥更會增強非-抗原-特異性免疫反應。
實施例5.　在感染之後投與免疫調節劑會引起以額外投藥一生物劑而被增強的非-抗原-特異性免疫反應
與經攻毒的對照組(82.2%，第28圖)相較之下，以免疫調節劑處理的鳥類而言，來說在攻毒之後有明顯較高的存活率(95%，第28圖)。這些結果使用每組含有400顆蛋的一個系列來重複(第29圖)。
結果顯示，當伴隨有馬立克病疫苗投藥時會增強在大腸桿菌攻毒之後由投藥免疫調節劑所引起的非-抗原-特異性免疫反應。在馬立克病疫苗之後的免疫調節劑的後投藥會增強非-抗原-特異性免疫反應。
實施例6.　免疫調節劑與一個二價生物劑的投藥不會抑制該二價生物劑的早期複製(early replication)
進行一個研究以決定一免疫調節劑是否會負面地衝擊馬立克病疫苗二價疫苗的早期複製。馬立克病二價疫苗包括HVT(火雞疱疹病毒)以及SB1(雞疱疹病毒)。
將商業肉雞蛋培育18天，以光檢查成活力。將蛋分成3組，A-C，每組有20顆蛋。每顆蛋如表5中所示接種疫苗。
為評估免疫調節劑在活體外對於疫苗病毒複製的效果，在配置之後的第7以及14天從脾臟細胞(SPC)以及末梢血液單核細胞(PBMC)執行病毒的再分離(reisolation)。
MD疫苗病毒感染已知在病毒複製程度方面有鳥-對-鳥變異，使用三重複池的雞(pools of chickens)執行再分離(每池2隻雞，每個取樣點3池)。
儘管在池中的變異性，在有免疫調節劑的存在下，HVT與SB-1有清楚的趨勢複製。這個數據在第1週期間對SB-1複製最為明顯，但是HVT與SB-1就2種組織在2個時間點(孵化後7以及14天)的整體趨勢是相似的。數據彙整於第31圖至第38圖中。第31圖顯示免疫調節劑在第1週時對HVT在脾臟細胞中的MD疫苗複製的作用。第32圖顯示免疫調節劑在第1週時對HVT在PBMC中的MD疫苗複製的作用。第33圖顯示免疫調節劑在第1週時對SB-1細胞在脾臟細胞中的MD疫苗複製的作用。第34圖顯示免疫調節劑在第1週時對SB-1在PBMC中的MD疫苗複製的作用。第35圖顯示免疫調節劑在第2週時對HVT在脾臟細胞中的MD疫苗複製的作用。第36圖顯示免疫調節劑在第2週時對HVT在PBMC中的MD疫苗複製的作用。第37圖顯示免疫調節劑在第2週時對SB-1在脾臟細胞中的MD疫苗複製的作用。第38圖顯示免疫調節劑在第2週時對SB-1在PBMC中的MD疫苗複製的作用。
免疫調節劑對於MD疫苗複製不具有負向的影響。免疫調節劑似乎具有佐劑作用，增加HVT以及SB-1在感染後頭2週的複製。這個數據暗示免疫調節劑對於MD疫苗效力可能具有正向的影響。
實施例7.　投藥免疫調節劑與一個經修飾的活性生物劑不會干擾經修飾的活性生物劑
進行一個研究以決定免疫調節劑對一個經接種修飾的活性新城雞瘟的雞隻暴露於新城雞瘟的效果。這個研究包括9組，它們如表6中所示受到不同的處理。
將商業肉雞蛋培育18天，以光檢查成活力。將蛋分成9組，T1-T6，每組有60顆蛋。T9組在孵化後第1晚遭受到害蟲攻擊並且在研究的過程中因為未知的原因而死亡。在挑選時，每組的鳥的數目列示在表7。
將T4-T6組中的18日齡受精蛋卵內注射免疫調節劑。T1-T3組以及T7-T9組注射食鹽水。在第0天，蛋孵化且T1-T2組的雞隻噴灑食鹽水，T3-T6組接受新城雞瘟疫苗、Intervet/Schering-Plough Animal Health製造的Newhatch-C2，T7-T9噴灑免疫調節劑並接種疫苗。
在孵化後第7、14以及21天取得血清供用於抗-NDV力價。在第21天T2-T9組的雞隻以弱毒新城雞瘟病毒攻毒。在第26天選取雞隻、放血、針對氣囊炎檢驗大體病理學，並且進行血清分析。
數據證實，於第7、14以及21天組別之間在血清學上並沒有明顯差異。然而，在第26天，攻毒後的5天，卵內接受免疫調節劑的鳥已戲劇性地增加抗-NDV力價超過所有其他組別(包括僅有疫苗的組別)(第40圖)。
氣囊炎在T2-T5，接受卵內調節劑的雞隻之間戲劇性地降低(第39圖)。結果指出卵內投藥免疫調節劑不會干擾NDV疫苗接種。
實施例8.　投與免疫調節劑與生物劑在毒性攻毒的有效性
進行評估單一劑量的免疫調節劑干擾慣用的經馬立克病疫苗接種18日齡受精蛋之研究。研究與馬立克病疫苗接種對抗毒性攻毒的效力比較。
將總共160顆受精蛋分成8組。在孵化時，為每一隻脫殼的鳥接種馬立克病病毒，研究第0天。已孵化脫殼的鳥之數目為160顆蛋中有148隻(參見下表8有關蛋/鳥相對於括號中在研究結束時的實際鳥數目)。3週後，將超過80隻的鳥加入各組中，15隻未接種疫苗以及未經處理的鳥(接觸傳染(contacts))以及65隻經處理的鳥(接種疫苗)(參見下表8有關各組的處理)。
在研究的第42天，存活的脫殼之鳥被移出並且剖檢屍體。在研究的第63天(就接觸傳染以及疫苗接種而言第42天)，存活的研究鳥被移出並且剖檢屍體。
第41圖顯示經接種的脫殼之鳥、未接種疫苗的接觸傳染鳥、僅接種疫苗的鳥、接種疫苗/免疫調節劑的鳥的存活曲線。未接種疫苗的傳染接觸的數據是8舍的平均值，而各個接種疫苗的組別是個別4舍的平均值。如可觀察到的，就僅接種疫苗以及接種疫苗/免疫調節劑的鳥來說在存活曲線方面有相似的斜率。
第42圖顯示在接種的脫殼之鳥、未接種疫苗的接觸傳染鳥、僅接種疫苗的鳥、接種疫苗/免疫調節劑的鳥中，馬立克病的平均發生率。脫殼以及接觸傳染的數據是8舍的平均值，而接種疫苗的組別是個別4舍的平均值。如可觀察到的，僅接種疫苗的組別以及接種疫苗/免疫調節劑的組別具有相當低的馬立克病發生率。接種疫苗/免疫調節劑的組別要比僅接種疫苗的組別具有較低的馬立克病發生率。
如可在第41圖至第42圖中所觀察到的，免疫調節劑對馬立克病疫苗保護不具有害的作用。事實上，它引起疫苗效力的增加。
第1圖以圖表描述受精雞蛋在經不同處理的組別間的孵化率(hatch rate)。所分析的研究組別包括T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T2，0.1 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T4，10.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第2圖以圖表顯示孵化後每天每舍的平均每日死亡率。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T2，0.1 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T4，10.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第3圖以圖表說明以受精蛋的初始數目為基礎，每舍在任一特定研究日存活的鳥的百分比。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T2，0.1 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T4，10.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第4圖以圖表表示孵化後鳥的成活力。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T2，0.1 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T4，10.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第5圖以圖表說明直到研究第7天的存活率、孵化死亡率以及孵化後死亡率。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第6圖以圖表表示直到研究第14天的存活率、孵化死亡率以及孵化後死亡率。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第7圖以圖表描述直到研究第21天的存活率、孵化死亡率以及孵化後死亡率。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第8圖以圖表說明直到研究第28天的存活率、孵化死亡率以及孵化後死亡率。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第9圖以圖表描述直到研究第35天的存活率、孵化死亡率以及孵化後死亡率。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第10圖以圖表表示直到研究第45天的存活率、孵化死亡率以及孵化後死亡率。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第11圖顯示每組從18日齡胚胎直到研究第45天的漸增死亡率。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T2，0.1 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T4，10.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第12圖顯示每組從18日齡胚胎在孵化後，從研究第0天直到研究第45天的漸增死亡率。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T2，0.1 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T4，10.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第13圖顯示從研究的第0天至第7天所觀察到的總平均體重增加。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T2，0.1 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T4，10.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第14圖顯示從研究的第0天至第14天所觀察到的總平均體重增加。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T2，0.1 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T4，10.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第15圖顯示從研究的第0天至第21天所觀察到的總平均體重增加。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T2，0.1 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T4，10.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第16圖顯示從研究的第0天至第28天所觀察到的總平均體重增加。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T2，0.1 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T4，10.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第17圖顯示從研究的第0天至第35天所觀察到的總平均體重增加。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T2，0.1 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T4，10.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第18圖顯示從研究的第0天至第45天所觀察到的總平均體重增加。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T2，0.1 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T4，10.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第19圖以圖表描述每個研究組的受精蛋孵化出的小雞數目。所分析的研究組包括T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T2，0.1 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T4，1.0 μg免疫調節劑/蛋加上1劑量的馬立克病疫苗以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第20圖以圖表說明在研究第7天每組的存活小雞數目。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T2，0.1 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T4，1.0 μg免疫調節劑/蛋加上1劑量的馬立克病疫苗以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第21圖顯示每組在第7天的存活小雞與死亡小雞的比較。
第22圖顯示每個研究組直至研究日的第7天的死亡率百分比。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T2，0.1 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T4，1.0 μg免疫調節劑/蛋加上1劑量的馬立克病疫苗以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第23圖以圖表說明針對各組包括死亡胚胎、死亡的小雞以及存活的小雞(綠)在研究終止時(第7天)存活的鳥的數目。鍵：T1，0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T2，0.1 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T3，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及大腸桿菌攻毒；T4，1.0 μg免疫調節劑/蛋加上1劑量的馬立克病疫苗以及大腸桿菌攻毒；T5，0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒；以及T6，1.0 μg免疫調節劑/蛋以及未攻毒。
第24圖以圖表描述每研究組的受精雞蛋所孵化出的小雞百分比。所分析的研究組包括那些列於表4中者。
第25圖顯示針對未以大腸桿菌攻毒的研究組在孵化之後直至研究第7天的死亡率百分比。所分析的研究組包括那些列於表4中者。
第26圖顯示針對以大腸桿菌攻毒的研究組在孵化之後直至研究第7天的死亡率百分比。所分析的研究組包括那些列於表4中者。
第27圖顯示針對各研究組在孵化之後直至研究第7天的死亡率百分比。所分析的研究組包括那些列於表4中者。
第28圖顯示針對各研究組在孵化之後直至研究第7天的存活百分比。所分析的研究組包括那些列於表4中者。
第29圖顯示針對各研究組在研究第7天的存活百分比。所分析的研究組包括那些列於表4中者。
第30圖顯示針對各研究組在研究第7與14天的每週死亡率。所分析的研究組包括列於表4中的小組。
第31圖以圖表描述免疫調節劑在研究第1週在脾臟細胞中對於HVT的MD疫苗複製的效果。所分析的研究組包括那些列於表5中者。
第32圖以圖表描述免疫調節劑在研究第1週在PMBC中對於HVT的MD疫苗複製的效果。所分析的研究組包括那些列於表5中者。
第33圖以圖表描述免疫調節劑在研究第1週在脾臟細胞中對於SB-1的MD疫苗複製的效果。所分析的研究組包括那些列於表5中者。
第34圖以圖表描述免疫調節劑在研究第1週在PMBC中對於SB-1的MD疫苗複製的效果。所分析的研究組包括那些列於表5中者。
第35圖以圖表描述免疫調節劑在研究第2週在脾臟細胞中對於HVT的MD疫苗複製的效果。所分析的研究組包括那些列於表5中者。
第36圖以圖表描述免疫調節劑在研究第2週在PMBC中對於HVT的MD疫苗複製的效果。所分析的研究組包括那些列於表5中者。
第37圖以圖表描述免疫調節劑在研究第2週在脾臟細胞中對於SB-1的MD疫苗複製的效果。所分析的研究組包括那些列於表5中者。
第38圖以圖表描述免疫調節劑在研究第2週在PMBC中對於SB-1的MD疫苗複製的效果。所分析的研究組包括那些列於表5中者。
第39圖以圖表描述在接受卵內免疫調節劑的小雞體內的氣囊炎的降低。所分析的研究組包括那些列於表7中者。
第40圖以圖表說明針對表7中所列的研究組在第26天的ELISAs。
第41圖以圖表說明針對表8中所列的研究組的雞隻的存活率。
第42圖以圖表說明在所有列於表8中的研究組中馬立克病的出現。

Claims (22)

  1. 一種免疫調節劑組成物的用途，用於製造供增加以大腸桿菌攻毒的受精雞蛋的孵化率之藥物，其藉由將從約0.05至約10微克有效量的免疫調節劑組成物卵內投藥給該蛋，其中該免疫調節劑組成物包含：a.一陽離子脂質體遞送載體；以及b.一核酸分子，其不編碼一免疫原。
  2. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該脂質體遞送載體包含選自由下列成對脂質所構成的群組：DTMA與膽固醇；DOTAP與膽固醇；DOTIM與膽固醇，以及DDAB與膽固醇。
  3. 如申請專利範圍第2項的用途，其中該脂質體遞送載體為DOTIM與膽固醇之組合。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項的用途，其中該核酸分子是細菌衍生之核酸載體或其片段。
  5. 如申請專利範圍第4項的用途，其中該核酸分子是DNA質體。
  6. 如申請專利範圍第1至3項中任一項的用途，其中該免疫調節劑組成物之投藥係在攻毒之前。
  7. 如申請專利範圍第1至3項中任一項的用途，其中該免疫調節劑組成物之投藥係在攻毒之後。
  8. 如申請專利範圍第1至3項中任一項的用途，其中該免疫調節劑組成物係在培育第18日投藥。
  9. 如申請專利範圍第1至3項中任一項的用途，其中該有效 量是從約0.1至約5微克/蛋。
  10. 如申請專利範圍第9項的用途，其中該有效量是約1.0微克/蛋。
  11. 如申請專利範圍第1至3項中任一項的用途，其中該免疫調節劑進一步包含一生物劑，其中該生物劑是用於保護抵抗馬立克病病毒(MDV)、新城雞瘟病毒(NDV)、雞貧血病毒(CAV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、火雞疱疹病毒(HVT)、傳染性喉頭氣管炎病毒(ILTV)、鳥類腦脊髓炎病毒(AEV)、禽痘病毒(FPV)、家禽霍亂(fowl cholera)、禽流感病毒(AIV)、里奧病毒(reovirus)、鳥類白血病病毒(ALV)、網狀內皮增殖病病毒(REV)、鳥類腺病毒、出血性腸炎病毒(HEV)、及其組合之疫苗。
  12. 一種免疫調節劑組成物的用途，用於製造供降低以大腸桿菌攻毒的受精雞蛋所孵化的雞死亡率之藥物，其藉由將從約0.05至約10微克有效量的免疫調節劑組成物卵內投藥給該鳥類個體，其中該免疫調節劑組成物包含有：a.一陽離子脂質體遞送載體；以及b.一核酸分子，其不編碼一免疫原。
  13. 如申請專利範圍第12項的用途，其中該脂質體遞送載體包含選自由下列成對脂質所構成的群組：DTMA與膽固醇；DOTAP與膽固醇；DOTIM與膽固醇以及DDAB與膽固醇。
  14. 如申請專利範圍第13項的用途，其中該脂質體遞送載體 為DOTIM與膽固醇之組合。
  15. 如申請專利範圍第12至14項中任一項的用途，其中該核酸分子是細菌衍生之核酸載體或其片段。
  16. 如申請專利範圍第15項的用途，其中該核酸分子是DNA質體。
  17. 如申請專利範圍第12至14項中任一項的用途，其中該免疫調節劑組成物之投藥是在攻毒之前。
  18. 如申請專利範圍第12至14項中任一項的用途，其中該免疫調節劑組成物之投藥是在攻毒之後。
  19. 如申請專利範圍第12至14項中任一項的用途，其中該免疫調節劑組成物係在培育第18日投藥。
  20. 如申請專利範圍第12至14項中任一項的用途，其中該有效量是從約0.1至約5微克/蛋。
  21. 如申請專利範圍第20項的用途，其中該有效量是約1.0微克/蛋。
  22. 如申請專利範圍第12至14項中任一項的用途，其中該免疫調節劑進一步包含一生物劑，其中該生物劑是用於保護抵抗馬立克病病毒(MDV)、新城雞瘟病毒(NDV)、雞貧血病毒(CAV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、火雞疱疹病毒(HVT)、傳染性喉頭氣管炎病毒(ILTV)、鳥類腦脊髓炎病毒(AEV)、禽痘病毒(FPV)、家禽霍亂(fowl cholera)、禽流感病毒(AIV)、里奧病毒(reovirus)、鳥類白血病病毒(ALV)、網狀內皮增殖病病毒(REV)、鳥類腺病毒、出血性腸炎病毒(HEV)、及其組合之 疫苗。
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