KR20180035860A

KR20180035860A - 수생 종에서의 향상된 면역 반응

Info

Publication number: KR20180035860A
Application number: KR1020187005844A
Authority: KR
Inventors: 크리슈티안 바이쓰; 나탈리 씨 시마드; 얀 쾨슬링
Original assignee: 바이엘 애니멀 헬스 게엠베하
Priority date: 2015-07-31
Filing date: 2016-07-27
Publication date: 2018-04-06
Also published as: CL2018000201A1; TW201718006A; CA2994039A1; EP3328423A1; AR105539A1; EP3328423B1; CN108712912A; TWI733688B; WO2017021242A1; US20190008952A1; CN108712912B; DK3328423T3; AU2016304343A1; IL256947A; JP2018521108A

Abstract

본 발명은 일반적으로 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다. 특히, 면역조정자 조성물은 면역 반응을 유도하여 병원체와 싸우는 대상체의 능력을 향상시키는데 사용된다.

Description

수생 종에서의 향상된 면역 반응

본 발명은 일반적으로 선천 면역력 (innate immunity) 을 활성화시킴으로써 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다. 특히, 수생 종의 구성원에서 선천 면역력을 자극하기 위해 면역조정자 조성물 (immunomodulator composition) 이 사용된다.

본 발명은 수생 종 대상체에서 선천 면역력을 조정하기 위해 면역자극성 플라스미드 (immunostimulatory plasmids) 를 사용하는 방법에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 그들의 조합의 서열과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 4 의 서열과 적어도 84% 서열 일치성을 갖는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 1 의 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 4 의 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 2 의 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 3 의 서열을 포함할 수 있다.

기타 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 그들의 조합의 서열과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열로 이루어질 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 4 의 서열과 적어도 84% 서열 일치성을 갖는 핵산 분자로 이루어질 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 1 의 서열로 이루어질 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 4 의 서열로 이루어질 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 2 의 서열로 이루어질 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 3 의 서열로 이루어질 수 있다.

일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 전장 또는 기능적 선택가능 또는 스크린가능 마커를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 기타 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 항생제 저항성 유전자가 아닌 선택가능 또는 스크린가능 마커를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 제형에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 양이온성 리포솜 전달 비히클 (cationic liposome delivery vehicle) 및 본원에 기재된 임의의 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열을 포함하는 면역조정자 조성물에 관한 것이다.

일부 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열의 사용 방법에 관한 것이다. 적합한 사용 방법은 수생 종의 대상체에게의 치료적 투여를 포함한다. 그러한 치료적 투여는 대상체 또는 대상체들의 예방적 (prophylactic) 처리, 메타필락틱 (metaphylactic) 처리, 및 감염-후 (post-infection) 처리를 포함한다.

본 발명은 대상체에서 면역 반응을 자극 또는 유발하는 방법에 관한 것이다. 일부 양상에서, 상기 방법은 대상체에게 본원에 기재된 면역조정자 조성물을 투여함으로써 대상체에서 면역 반응을 자극하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 대상체에게 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열을 투여함으로써 대상체에서 면역 반응을 자극하는 것을 포함한다.

기타 목적 및 특색은 이후에 부분적으로 분명하고 부분적으로 언급될 것이다.

하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 특정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 실시양태의 상세한 설명과 조합하여 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1 은 pMB75.6 플라스미드 (SEQ ID NO: 2) 의 맵을 보여준다;
도 2 는 pGCMB75.6 플라스미드 (SEQ ID NO: 1) 의 맵을 보여준다;
도 3 은 pLacZ75.6 플라스미드 (SEQ ID NO: 4) 의 맵을 보여준다;
도 4 는 물고기 탱크 (fish tank) M5 에 관한 챌린지-후 (post-challenge) 일일 사망률 백분율 (daily mortality percentage) 을 그래프로 보여준다.
도 5 는 물고기 탱크 M6 에 관한 챌린지-후 일일 사망률 백분율을 그래프로 보여준다.
도 6 은 백신 연구의 각각의 군으로부터의 조합된 사망률에 관한 카플란-마이어 생존 곡선을 보여준다. 수직축은 특정 시각 DPC (수평축) 에서의 생존 확률이다. 곡선의 마지막에 있는 십자 기호는 검열된 (censored) 데이타 (27 DPC 을 지나 살아 있는 물고기) 를 나타낸다. DPC: 챌린지 후 일수 (days post challenge).
도 7 은 백신 연구로부터의 물고기의 12 개의 군 사이의 쌍별 비교 (pair-wise comparison) 를 보여주며, 연결된 군들 (녹색 동그라미로 표시된 노드로서 나타냄) 은 그들 사이에 유의한 차이를 보이지 않는다 (α=0.05).
도 8 은 덱스트로스 5%-처리된 대조군과 비교할 때 백신 연구 군에 관한 생존의 상대 백분율을 그래프로 보여준다. 실험의 마지막에 누적 사망률 사이에 비교를 수행했다 (RPSend). 덱스트로스 5 % 군과 기타 처리 사이의 유의한 누적 사망률 차이 (α = 0.05) 는 * 로 표시되어 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명에 따라서, 수령자 대상체 (recipient subject) 에서 면역 반응을 유발할 수 있는 조성물, 뿐만 아니라 사용 방법이 발견되었다. 특히, 본 발명은 핵산 조성물, 또는 면역조정자 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다. 수생 종의 구성원의 면역계를 조정하기 위해 그러한 면역조정자 조성물이 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. 본 발명은 미생물, 예컨대, 제한 없이, 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 진균, 효모, 기생충 및 당업계에 알려진 기타 미생물에 의해 야기되는 감염성 질환의 치료 및 예방에서 특히 유용하다. 상기 조성물 및 면역조정자 조성물의 사용 방법은 아래에서 더욱 상세히 논의된다.

I. 조성물

본 발명에서 유용한 조성물, 예컨대 본원에 기재된 조성물은 일반적으로 감염성 질환에 관한 예방적 요법, 메타필락틱 요법, 또는 치료 요법으로서 사용될 수 있다. 그러한 조성물은 본원에서 면역조정자 조성물로서 언급된다. 면역조정자 조성물은 적어도 수령자 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 면역자극성 플라스미드, 또는 면역자극성 DNA 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 면역 반응은 선천 면역 반응이다. 일부 양상에서, 면역 반응은 선천 면역 반응 및 후천 면역 반응의 조합이다. 일부 양상에서, 면역조정자 조성물은 또한 리포솜 전달 비히클을 포함할 수 있다.

A. 핵산

일부 양상에서 본 발명은 감염성 질환 야기 물질의 치료 또는 예방에 유용한 핵산 분자에 관한 것이다. 본원에 기재된 핵산 분자는 면역자극성 플라스미드에, 선형 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA, 아미노산 서열, 리보핵산 (RNA), 또는 그들의 조합으로서 포함될 수 있다. 일부 양상에서, 본 발명은 면역자극성 플라스미드 또는 면역자극성 DNA 서열을 함유하는 핵산 분자, 벡터, 및 숙주 세포 (시험관내, 생체내, 또는 생체외) 에 관한 것이다.

본원에 기재된 핵산 분자는 CpG 모티프가 풍부하다. 그러한 CpG 모티프는 특정 톨-유사 수용체, 예컨대 TLR9 및 TLR21 을 포함하는 면역 감시 수용체를 통해 면역 자극을 유도할 수 있다. 게다가 본원에 기재된 핵산 분자는 비-CpG 면역자극성 모티프를 또한 함유한다. 일부 양상에서, 핵산 분자는 무작위 핵산 서열에서 예상되는 CpG 모티프의 빈도를 넘는 약 2-20% CpG 모티프를 함유한다. 일부 양상에서, 핵산 분자는 무작위 핵산 서열에서 예상되는 CpG 모티프의 빈도를 넘는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40%, 또는 더 많은 CpG 모티프를 함유한다. 일부 양상에서, 핵산 분자는 무작위 핵산 서열에서 예상되는 CpG 모티프의 빈도를 넘는 약 10% CpG 모티프를 함유한다. 일부 양상에서, 척추동물 DNA 와 비교할 때, 10-배 초과의 CpG 모티프의 풍부도 (enrichment) 가 관찰된다. 일부 양상에서, 핵산 분자는 척추동물 DNA 와 비교할 때 약 2 내지 50 배, 또는 더 많은 CpG 모티프를 함유한다. 일부 양상에서, 핵산 분자는 척추동물 DNA 와 비교할 때 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 배 또는 더 많은 CpG 모티프를 함유한다.

일부 양상에서, 본 발명은 항생제 저항성 유전자를 포함하지 않는 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열에 관한 것이다. 플라스미드에는 임의의 선택가능 또는 스크린가능 마커 유전자가 없을 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 pGCMB75.6 플라스미드는 임의의 전장 또는 기능적 선택가능 또는 스크린가능 마커 유전자를 포함하지 않는다. pGCMB75.6 의 서열은 SEQ ID NO: 1 에 제공되어 있다.

일부 양상에서, 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 전장 또는 기능적 선택가능 또는 스크린가능 마커에 관해 코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 항생제 저항성 유전자를 포함하지 않는다. 예를 들어, 플라스미드는 카나마이신 저항성 유전자를 포함하지 않는다. 일부 양상에서, 본원에 기재된 플라스미드는 바람직하게는 면역원을 인코딩하지 않는다.

일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 항생제 저항성 유전자가 아닌 선택가능 또는 스크린가능 마커 유전자에 관해 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 pLacZMB75.6 플라스미드는 LacZ 유전자를 스크린가능 마커로서 포함한다. pLacZMB75.6 의 맵은 도 3 에 제공되어 있고, pLacZMB75.6 의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4 로서 제공된다. 도 3 에서 보여지는 바와 같이, pLacZMB75.6 은 pGCMB75.6 과 유사하지만, LacZ 스크린가능 마커를 함유한다.

pMB75.6 (SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3 (AscI 제한 자리를 갖는 p MB75.6)), pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 1) 또는 pLacZMB75.6 (SEQ ID NO: 4) 플라스미드의 뉴클레오티드 서열은 그들의 면역자극 특성에 유의하게 악영향을 주지 않으면서 어느 정도 다를 수 있다고 이해될 것이다. 일부 양상에서, 본 발명은 pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 1) 의 서열과 적어도 89% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 1) 의 서열과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 1) 의 서열을 포함한다.

일부 양상에서, 본 발명은 pLacZMB75.6 (SEQ ID NO: 4) 의 서열과 적어도 84% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 pLacZMB75.6 (SEQ ID NO: 4) 의 서열과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 pLacZMB75.6 (SEQ ID NO: 4) 의 서열을 포함한다.

일부 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2 의 서열과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 의 서열과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 의 서열을 포함한다.

일부 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 3 의 서열과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 서열과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 서열을 포함한다.

일부 양상에서, 본 발명은 pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 1) 의 서열과 적어도 89% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열로 이루어지는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 1) 의 서열과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 1) 의 서열로 이루어진다.

일부 양상에서, 본 발명은 pLacZMB75.6 (SEQ ID NO: 4) 의 서열과 적어도 84% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열로 이루어지는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 pLacZMB75.6 (SEQ ID NO: 4) 의 서열과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 pLacZMB75.6 (SEQ ID NO: 4) 의 서열로 이루어진다.

일부 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2 의 서열과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열로 이루어지는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 의 서열과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 의 서열로 이루어진다.

일부 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 3 의 서열과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열로 이루어지는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 서열과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 서열로 이루어진다.

본 발명의 또다른 중요한 양상은 높은 스트린전시 (stringency) 조건 하에 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 또는 SEQ ID NO: 4 에 하이브리드화하는 핵산 서열을 포함하는 면역 반응을 자극할 수 있는 면역자극성 DNA 서열 또는 면역자극성 플라스미드를 제공한다. 적합한 핵산 서열은 본 발명의 핵산과 상동성인, 실질적으로 유사한, 또는 일치하는 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 상동성 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 당해 상보적 서열에 대해 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 의 서열 유사성을 가질 것이다. 기타 양상에서, 상동성 핵산 서열은 SEQ ID NO: 4 또는 당해 상보적 서열에 대해 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 의 서열 유사성을 가질 것이다. 기타 양상에서, 상동성 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2 또는 당해 상보적 서열에 대해 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 의 서열 유사성을 가질 것이다. 기타 양상에서, 상동성 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3 또는 당해 상보적 서열에 대해 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 의 서열 유사성을 가질 것이다. 서열 유사성은 당업계에 알려진 다수의 알고리즘, 예컨대 Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990 에 기재된, BLAST 를 사용하여 계산될 수 있다. 핵산은 유전 부호의 축퇴로 인해 위에서 기재된 핵산과 서열에서 상이할 수 있다. 일반적으로, 레퍼런스 서열은 18 개의 뉴클레오티드, 더욱 통상적으로 30 개 이상의 뉴클레오티드일 것이고, 비교 목적을 위해 조성물의 전체 핵산 서열을 포함할 수 있다.

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 또는 SEQ ID NO: 4 에 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 본원에서 고려된다. 스트린전트 (stringent) 하이브리드화 조건은 50℃ 이상 및 0.1X SSC (15 mM 소듐 클로라이드/1.5 mM 소듐 시트레이트) 에서의 하이브리드화와 같은 조건을 포함한다. 또다른 예는 42℃ 에서 50% 포름아미드, 5X SSC (150 mM NaCl, 15 mM 트리소듐 시트레이트), 50 mM 소듐 포스페이트 (pH 7.6), 5X 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 ㎍/㎖ 변성된 (denatured), 베어낸 (sheared) 연어 정자 DNA 용액 중에서 밤샘 인큐베이션, 그에 뒤이어 0.1X SSC 중에서 약 65℃ 에서 세척이다. 예시적 스트린전트 하이브리드화 조건은 상기 특정 조건과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 또는 95% 만큼 스트린전트한 하이브리드화 조건이다. 기타 스트린전트 하이브리드화 조건은 당업계에 알려져 있고, 본 발명의 핵산의 상동체를 동정하는데 또한 이용될 수 있다 (Current Protocols in Molecular Biology, Unit 6, pub. John Wiley & Sons, N.Y. 1989).

돌연변이체 포함 핵산 서열이 본원에 기재된 바와 같은 선천 면역 반응을 자극하는 능력을 유지하는 한, 본원에 기재된 DNA 분자의 돌연변이체 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 그러한 돌연변이의 DNA 서열은 통상적으로 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 만큼 상이할 것이다. 서열 변화는 치환, 삽입, 결실, 또는 그들의 조합일 수 있다. 클로닝되는 유전자의 돌연변이생성에 관한 기술은 당업계에 알려져 있다. 자리 특이적 돌연변이생성에 관한 방법은 Gustinet al., Biotechniques 14:22, 1993; Barany, Gene 37:111-23, 1985; Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. 199:537-9, 1985; 및 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp. 15.3-15.108 및 본원에서 참조로 포함되는 모든 문헌에서 찾을 수 있다. 요약하면, 본 발명은 대상체에서 선천 면역 반응을 자극할 수 있는 핵산 서열 및 그의 변이체 또는 돌연변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 기재된 핵산 서열에 의해 인코딩되는 중간 RNAs, 뿐만 아니라 임의의 결과적인 인코딩되는 아미노산 서열을 망라한다.

일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOs. 1, 2, 3, 및 4 에서 제공되는 서열과 다른 경우에, 플라스미드 내의 CpG 디뉴클레오티드는 바람직하게는 온전하게 (intact) 남아 있다. 대안적으로, 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 변경되어 CpG 디뉴클레오티드가 제거되는 경우에, 플라스미드의 서열은 또다른 위치에서 변경되어 플라스미드 내의 CpG 디뉴클레오티드의 총수가 동일하게 유지될 수 있다. pGCMB75.6 또는 pLacZMB75.6 의 뉴클레오티드 서열에 이미 존재하는 것들에 더하여 추가의 CpG 디뉴클레오티드가 또한 플라스미드 내로 도입될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 적어도 약 200, 적어도 약 220, 적어도 약 240, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 275, 적어도 약 280, 적어도 약 283, 적어도 약 285, 또는 적어도 약 288 개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 면역자극성 플라스미드는 283 개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 본원에서 제공되는 서열과 다른 경우에, 플라스미드 내의 CpG 모티프 유형이 변화되어 시토졸 DNA 감시 분자의 결과적인 활성화를 조정한다. 예를 들어, 면역 자극성 CpG 모티프의 수가 증가되어 면역자극성 플라스미드/DNA 의 특정 역치에 반응하는 특정 시토졸 DNA 감시 분자의 활성화를 증가시킬 수 있다. 추가의 예로서, 비-면역 자극성 CpG 모티프의 수가 증가되어 특정 시토졸 DNA 감시 분자의 활성화를 감소 및/또는 기타 DNA 감시 분자의 활성화를 증가시킬 수 있다.

특히, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 면역자극성 플라스미드 또는 DNA 서열 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 제형에 관한 것이다.

B. 면역조정자

본원에 기재된 면역자극성 플라스미드와 함께 사용하기에 적합한 면역조정자 조성물은 미국 특허 출원 공개 번호 2012/0064151 A1 및 2013/0295167 A1 에 기재되어 있으며, 이들 둘의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

면역조정자 조성물은 리포솜 전달 비히클 및 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열 중 적어도 하나를 포함한다.

적합한 리포솜 전달 비히클은 핵산 분자를 치료되는 대상체의 조직으로 전달할 수 있는 지질 조성물을 포함한다. 리포솜 전달 비히클은 바람직하게는 핵산 분자 및/또는 생물작용제를 전달하기에 충분한 양의 시간 동안 대상체에서 안정적으로 유지될 수 있다. 예를 들어, 리포솜 전달 비히클은 수령자 대상체에서 적어도 약 5 분 동안, 적어도 약 1 시간 동안, 또는 적어도 약 24 시간 동안 안정적이다.

본 발명의 리포솜 전달 비히클은 세포의 원형질 막과 융합하여 핵산 분자를 세포 내로 전달할 수 있는 지질 조성물을 포함한다. 핵산 분자가 하나 이상의 단백질을 인코딩할 때, 핵산:리포솜 복합체는 바람직하게는 전달되는 핵산의 마이크로그램 (㎍) 당 총 조직 단백질의 밀리그램 (㎎) 당 적어도 약 1 피코그램 (pg) 의 발현되는 단백질의 트랜스펙션 효율을 갖는다. 예를 들어, 핵산: 리포솜 복합체의 트랜스펙션 효율은 전달되는 핵산의 ㎍ 당 총 조직 단백질의 ㎎ 당 적어도 약 10 pg 의 발현되는 단백질; 또는 전달되는 핵산의 ㎍ 당 총 조직 단백질의 ㎎ 당 적어도 약 50 pg 의 발현되는 단백질일 수 있다. 복합체의 트랜스펙션 효율은 전달되는 핵산의 ㎍ 당 총 조직 단백질의 ㎎ 당 1 펨토그램 (fg) 의 발현되는 단백질 만큼 낮을 수 있으며, 상기 양이 더욱 바람직하다.

본 발명의 바람직한 리포솜 전달 비히클은 직경이 약 100 내지 500 나노미터 (㎚) 이다. 예를 들어, 리포솜 전달 비히클은 직경이 약 150 내지 450 ㎚ 또는 약 200 내지 400 ㎚ 일 수 있다.

적합한 리포솜은 임의의 리포솜, 예컨대, 예를 들어, 당업자에게 알려진 유전자 전달 방법에서 통상적으로 사용되는 것들을 포함한다. 바람직한 리포솜 전달 비히클은 다층 소포 (multilamellar vesicle) (MLV) 지질 및 압출된 지질을 포함한다. MLVs 의 제조 방법은 당업계에서 잘 알려져 있다. 더욱 바람직한 리포솜 전달 비히클은 폴리양이온성 지질 조성물을 갖는 리포솜 (즉, 양이온성 리포솜) 및/또는 폴리에틸렌 글리콜에 접합된 콜레스테롤 백본을 갖는 리포솜을 포함한다. 예시적 양이온성 리포솜 조성물은, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 콜레스테롤, N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP) 및 콜레스테롤, 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-히드록시에틸)-이미다졸리늄 클로라이드 (DOTIM) 및 콜레스테롤, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 콜레스테롤, 및 그들의 조합을 포함하나, 그에 제한되지 않는다. 전달 비히클로서 사용하기에 가장 바람직한 리포솜 조성물은 DOTIM 및 콜레스테롤을 포함한다.

적합한 핵산 분자는 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드 중 임의의 것을 포함한다. 코딩 핵산 서열은 단백질 또는 펩티드의 적어도 일부를 인코딩하나, 비(non)-코딩 서열은 단백질 또는 펩티드의 임의의 일부를 인코딩하지 않는다. 본 발명에 따르면, "비-코딩" 핵산은 전사 단위의 조절 영역, 예컨대 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 용어 "빈 (empty) 벡터" 는 용어 "비-코딩" 과 호환되게 사용될 수 있고, 특히 단백질 코딩 부분의 부재 하의 핵산 서열, 예컨대 유전자 삽입이 없는 플라스미드 벡터를 지칭한다. 본원에 기재된 플라스미드에 의해 인코딩되는 단백질의 발현은 면역 반응의 유도에 요구되지 않는다; 그러므로, 플라스미드는 전사 제어 서열에 작동가능하게 연결된 임의의 코딩 서열을 함유할 필요가 없다. 그러나, 면역원 및/또는 사이토카인을 인코딩하는 핵산 서열 (DNA 또는 RNA) 을 조성물에 포함시킴으로써 추가의 이점이 얻어질 수 있다 (즉, 항원-특이적 및 향상된 면역력). 면역원 및/또는 사이토카인을 인코딩하는 그러한 핵산 서열은 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드에 포함될 수 있거나, 또는 조성물 내의 별개의 핵산 (예를 들어, 별개의 플라스미드) 에 포함될 수 있다.

리포솜과 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드, 또는 면역자극성 DNA 서열의 복합체화는 당업계에서 표준인 또는 미국 특허 번호 6,693,086 (이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 에 기재된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 리포솜에 첨가되는 플라스미드의 적당한 농도는 전신 면역 반응이 유발되기에 충분한 양의 플라스미드를 대상체 내로 전달하기에 효과적인 농도를 포함한다. 예를 들어, 약 0.1 ㎍ 내지 약 10 ㎍ 의 플라스미드가 약 8 nmol 리포솜과 조합될 수 있거나, 약 0.5 ㎍ 내지 약 5 ㎍ 의 플라스미드가 약 8 nmol 리포솜과 조합될 수 있거나, 또는 약 1.0 ㎍ 의 플라스미드가 약 8 nmol 리포솜과 조합될 수 있다. 조성물 내의 플라스미드 대 지질의 비 (㎍ 플라스미드:nmol 지질) 는 중량에 의해 적어도 약 1:1 플라스미드:지질일 수 있다 (예를 들어, 1 ㎍ 플라스미드:1 nmol 지질). 예를 들어, 플라스미드 대 지질의 비는 적어도 약 1:5, 적어도 약 1:10, 또는 적어도 약 1:20 일 수 있다. 본원에서 표현되는 비는 조성물 내의 양이온성 지질의 양을 기준으로 하고, 조성물 내의 지질의 총량을 기준으로 하지 않는다. 본 발명의 조성물 내의 플라스미드 대 지질의 비는 적합하게는 약 1:1 내지 약 1:80 플라스미드:지질 (중량에 의해); 약 1:2 내지 약 1:40 플라스미드:지질 (중량에 의해); 약 1:3 내지 약 1:30 플라스미드: 지질 (중량에 의해); 또는 약 1:6 내지 약 1:15 플라스미드:지질 (중량에 의해) 이다.

C. 생물작용제

본원에 기재된 임의의 면역조정자 조성물은 본원에 기재된 플라스미드 중 적어도 하나 및 리포솜 전달 비히클에 더하여, 적어도 하나의 생물작용제를 추가로 포함할 수 있다.

적합한 생물작용제는 질환의 예방 또는 치료에 유효한 물질이다. 그러한 생물작용제는 면역 인핸서 단백질, 면역원, 백신, 항균제 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 적합한 면역 인핸서 단백질은 면역력을 향상시키는 것으로 알려진 단백질이다. 비-제한적 예로서, 사이토카인 (단백질의 패밀리를 포함함) 이 알려진 면역력 향상 단백질 패밀리이다. 적합한 면역원은 체액 및/또는 세포 면역 반응을 유발하는 단백질이며, 대상체에 대한 면역원의 투여는 대상체의 조직 내에서 부딪히는 동일 또는 유사한 단백질에 대항하여 면역원-특이적 면역 반응을 증가시킨다. 면역원은 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균에 의해 발현되는 병원성 항원을 포함할 수 있다. 바람직한 항원은 대상체에 감염성 질환을 야기하는 유기체로부터 유래된 항원을 포함한다. 본 발명에 따르면, 면역원은 체액 및/또는 세포 면역 반응을 유발하는 자연 발생적 또는 합성적으로 유도된 단백질 임의의 일부일 수 있다. 따라서, 항원 또는 면역원의 크기는 약 5-12 개 아미노산 만큼 작을 수 있고 전장 단백질 만큼 클 수 있다 (그 사이의 임의의 크기를 포함함). 항원은 멀티머 단백질 또는 융합 단백질일 수 있다. 항원은 정제된 항원일 수 있다. 대안적으로, 면역 인핸서 단백질 또는 면역원은 면역자극성 플라스미드 또는 면역조정자 조성물에 포함된 또다른 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 면역 인핸서 단백질 또는 면역원이 면역조정자 조성물 내의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 경우, 면역 인핸서 단백질 또는 면역원을 인코딩하는 핵산 서열은 전사 제어 서열에 작동가능하게 연결되어, 면역원이 대상체의 조직에서 발현되면, 그에 의해 비-특이적 면역 반응에 더하여 대상체에서 면역원-특이적 면역 반응을 유발한다. 면역원성에 대한 선별 기술, 예컨대 병원체 항원 면역원성 또는 사이토카인 활성은 당업자에게 알려져 있고, 여러 가지 시험관내 및 생체내 어세이를 포함한다.

생물작용제가 백신인 경우, 백신은 살아 있는, 감염성, 바이러스, 박테리아 또는 기생충 백신, 또는 사멸된, 불활성화된, 바이러스, 박테리아 또는 기생충 백신, 또는 서브유닛 백신, 또는 당업계에 알려진 임의의 백신을 포함할 수 있다. 하나 이상의 백신이 본 발명의 면역조정자 조성물과의 조합으로 사용될 수 있다. 적합한 백신은 수생 종에 대해 당업계에 알려진 것을 포함한다.

생물작용제는 항균제일 수 있다. 적합한 항균제는 하기를 포함한다: 퀴놀론, 바람직하게 플루오로퀴놀론, β-락탐, 및 마크콜라이드-린코사마이드-스트렙토그라민 (MLS) 항생제.

적합한 퀴놀론은 베노플록사신 (benofloxacin), 빈플록사신 (binfloxacin), 시녹사신 (cinoxacin), 시프로플록사신 (ciprofloxacin), 클리나플록사신 (clinafloxacin), 다노플록사신 (danofloxacin), 디플록사신 (difloxacin), 에녹사신 (enoxacin), 엔로플록사신 (enrofloxacin), 플레록사신 (fleroxacin), 겜미플록사신 (gemifloxacin), 이바플록사신 (ibafloxacin), 레보플록사신 (levofloxacin), 로메플록사신 (lomefloxacin), 마르보플록사신 (marbofloxacin), 목시플록사신 (moxifloxacin), 노르플록사신 (norfloxacin), 오플록사신 (ofloxacin), 오르비플록사신 (orbifloxacin), 파주플록사신 (pazufloxacin), 프라도플록사신 (pradofloxacin), 퍼플록사신 (perfloxacin), 사라플록사신 (sarafloxacin), 스파르플록사신 (sparfloxacin), 테마플록사신 (temafloxacin), 및 토수플록사신 (tosufloxacin) 을 포함한다. 바람직한 플루오로퀴놀론은 시프로플록사신, 다노플사신, 엔로플록사신, 목시플록사신, 및 프라도플록사신을 포함한다. 적합한 나프티리돈은 날리딕스산을 포함한다.

적합한 β-락탐은 페니실린 (예를 들어, 아목시실린, 암피실린, 아즈로실린, 벤자틴 페니실린, 벤질페니실린, 카르베니실린, 클록사실린, 코-아목시클라브 [즉 아목시실린/클라불란산], 디클록사실린, 플루클록사실린, 메티실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 페녹시메틸페니실린, 피페라실린, 프로카인 페니실린, 테모실린, 및 티카르실린); 세팔로스포린 (예를 들어, 세파클로르, 세파로늄, 세파만돌, 세파프리린, 세파졸린, 세페핌, 세픽심, 세포탁심, 세폭시틴, 세프피롬, 세프포독심, 세프퀴놈, 세프타지딤, 세프티오푸르, 세프트리아족손, 세푸록심, 세팔렉신, 세팔로틴, 및 데포테탄); 카르바페넴 및 페넴 (예를 들어, 도리페넴, 에르타페넴, 파로페넴, 이미페넴 및 메로페넴); 모노박탐 (예를 들어, 아즈트레오남, 노카르디신 A, 타브톡시닌-β-락탐 및 티게모남); 및 β-락타마제 저해제 (예를 들어, 클라불란산, 술박탐 및 타조박탐) 를 포함한다. 바람직한 β-락탐은 세팔로스포린, 특히 세파졸린을 포함한다.

적합한 MLS 항생제는 클린다마이신, 린코마이신, 피를리마이신 및 임의의 마크콜라이드 항생제를 포함한다. 바람직한 린코사마이드 항생제는 피를리마이신이다.

기타 항균제는 아미노글리코시드, 클로피돌, 디메트리다졸, 에리트로마이신, 프라마이세틴, 푸라졸리돈, 할로푸기논, 2-피리돈, 로베니딘, 술폰아미드, 테트라사이클린, 트리메토프림, 다양한 플레우로무틸린 (예를 들어, 티아물린 및 발네물린) 및 다양한 스트렙토마이신 (예를 들어, 모넨신, 나라신 및 살리노마이신) 을 포함한다.

II. 방법

본 발명의 목적은 면역조정자 조성물, 면역자극성 플라스미드 (또는 DNA 서열), 및 감염되지 않은 대상체에게 보호 면역력을, 감염된 대상체에게 보호 면역력을, 감염되지 않은 대상체에게 향상된 면역력을, 감염된 대상체에게 향상된 면역력을, 감염된 대상체에게 치료적 면역력을, 또는 이들의 조합을 제공하는 방법을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명의 조성물은 대상체를 예방적으로 면역화하는데 사용되거나 또는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열을 대상체에게 투여하고, 대상체에서 면역계를 자극하는 것을 포함한다.

A. 대상체의 면역계 자극 방법

본 발명은 수령자 대상체에서 면역계를 자극하거나, 또는 향상시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 면역조정자 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 면역조정자 조성물은 수령자 대상체에서 면역 반응을 자극하고, 상기 면역 반응은 감염과 싸우는 것을 돕는다. 일부 양상에서, 면역조정자 조성물은 시토졸 DNA 감시 분자를 활성화시킨다. 일부 양상에서, 면역조정자 조성물은 백신과 같은 적어도 하나의 생물작용제의 작용을, 그러한 백신 전에 투여될 때, 백신과 동시-투여될 때, 백신접종 후 투여될 때, 또는 백신과 혼합될 때, 향상시킨다. 일부 양상에서, 상기 방법은 감염성 질환으로부터 수령자 대상체를 보호하고, 감염성 질환을 갖는 집단을 치료하기 위한 새로운 치료 전략을 제공한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 면역조정자 조성물 없는 백신의 사용과 비교할 때, 면역조정자가 백신과의 조합으로 사용될 때 질환에 대항하여 더욱 신속한, 더 긴 및 더 양호한 보호를 제공한다.

본원에 기재된 임의의 리포솜 전달 비히클, 본원에 기재된 임의의 면역자극성 플라스미드 (또는 DNA 서열), 및 임의로 본원에 기재된 임의의 생물작용제를 포함하는, 면역조정자 조성물의 유효량을 투여함으로써 수령자 대상체에서 면역 반응이 활성화될 수 있다. 생물작용제는 면역조정자와 혼합되거나 또는 동시-투여되거나 또는 그와 독립적일 수 있다고 여겨진다. 독립적 투여는 면역조정자 투여 전 또는 후일 수 있다. 또한 면역조정자 또는 생물작용제의 1 회 초과의 투여가 사용될 수 있다고 여겨진다. 나아가, 하나 초과의 생물작용제는 면역조정자와 동시-투여되거나, 면역조정자 전에 투여되거나, 면역조정자의 투여 후에 투여되거나, 또는 면역조정자와 동시에 투여될 수 있다.

B. 대상체의 생존성 개선 방법

본 발명은 수생 종들의 구성원의 생존성을 개선하는 방법에 관한 것이다. 생존성 개선 방법은 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 면역조정자 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 면역조정자 조성물을 수령하지 않는 대상체와 비교할 때 개선된 수령자 대상체의 생존성을 제공한다.

C. 생산 개선 방법

본 발명은 수산 양식되는 수생 종의 구성원의 생산을 개선하는 방법을 제공한다. 생산 개선 방법은 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 면역조정자 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 면역조정자 조성물을 수령하지 않는 대상체와 비교할 때 수령자 대상체의 개선된 생산을 제공한다. 생산 개선의 평가 방법은 당업계에 알려져 있다. 당업자는 개선된 생산이 면역조정자 조성물을 수령하는 대상체와 면역조정자 조성물을 수령하지 않는 대상체 사이에서 건강, 체중, 크기, 육질, 및 기타 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

D. 사료 이용 (Feed Utilization) 개선 방법

본 발명은 수산 양식되는 수생 종의 구성원의 사료 이용을 개선하는 방법에 관한 것이다. 사료 이용 개선 방법은 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 면역조정자 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 면역조정자 조성물을 수령하지 않는 대상체와 비교할 때 수령자 대상체의 개선된 사료 이용을 제공한다. 사료 이용의 평가 방법은 당업계에 알려져 있다. 당업자는 개선된 사료 이용이 면역조정자 조성물을 수령하는 대상체와 면역조정자 조성물을 수령하지 않는 대상체 사이에서 건강, 체중, 크기, 육질, 및 기타 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

E. 생존률 개선 방법

본 발명은 수산 양식되는 수생 종의 구성원의 생존률을 개선하는 방법에 관한 것이다. 생존률 개선 방법은 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 면역조정자 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 면역조정자 조성물을 수령하지 않는 대상체와 비교할 때 수령자 대상체의 개선된 생존률을 제공한다. 개선된 생존률의 평가 방법은 당업계에 알려져 있다. 당업자는 개선된 생존률이 면역조정자 조성물을 수령하는 대상체와 면역조정자 조성물을 수령하지 않는 대상체 사이에서 건강, 체중, 크기, 육질, 및 기타 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

유효량의 본원에 기재된 임의의 면역조정자 조성물이 대상체에게 투여될 수 있다. 유효량은 수령자 대상체에서 면역 반응을 활성화시키기에 충분하다. 그러한 활성화 측정 방법은 당업계에 알려져 있다. 또한, 당업자는 유효량이 연령, 체중, 대상체의 종 및 감염 단계 뿐만 아니라 당업계에 알려진 기타 요인들에 좌우될 것임을 알 것이다. 적합한 유효량은 대상체 당 약 0.1 ㎍ 내지 1,000 ㎍ 의 범위일 수 있다. 일부 양상에서, 유효량은 약 0.1 ㎍ 내지 약 10 ㎍, 약 0.1㎍ 내지 약 5 ㎍, 약 0.5 ㎍ 내지 약 5 ㎍, 약 0.25 ㎍ 내지 약 5 ㎍, 약 0.05 ㎍ 내지 약 10 ㎍, 약 5 ㎍ 내지 약 15 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 15 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 20 ㎍, 약 20 ㎍ 내지 약 30 ㎍, 약 30 ㎍ 내지 약 40 ㎍, 약 40 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 70 ㎍, 약 70 ㎍ 내지 약 90 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 150 ㎍, 약 150 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 200 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 약 250 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 300 ㎍ 내지 약 350 ㎍, 약 350 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 400 ㎍ 내지 약 450 ㎍, 약 450 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 500 ㎍ 내지 약 550 ㎍, 약 550 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 600 ㎍ 내지 약 650 ㎍, 약 650 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 700 ㎍ 내지 약 750 ㎍, 약 750 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 800 ㎍ 내지 약 850 ㎍, 약 850 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 900 ㎍ 내지 약 950 ㎍, 약 950 ㎍ 내지 약 1000 ㎍ 의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 일부 양상에서, 유효량은 약 0.5 ㎍ 내지 약 10 ㎍ 의 범위일 수 있다.

F. 사용 조건

본 발명의 방법은 대상체에서 면역 반응을 활성화시켜, 대상체는 면역 반응의 유발을 잘 받아들이는 질환으로부터 보호된다. 본원에서 사용되는, 구절 "질환으로부터 보호된다" 는, 질환의 증상의 감소; 질환의 발생의 감소; 질환의 임상적 또는 병적 중증도의 감소; 또는 질환을 야기하는 병원체의 셰딩 (shedding) 의 감소를 지칭한다. 대상체의 보호는 대상체에게 투여될 때, 질환의 발생을 방지 및/또는 질환 증상, 임상 징후, 병태 또는 원인을 치유, 및/또는 완화 또는 감소시키는 본 발명의 치료적 조성물의 능력을 지칭할 수 있다. 따라서, 질환으로부터의 대상체의 보호는 질환 발생의 방지 (예방적 처리) 및 질환을 갖는 대상체의 치료 (치료적 처리) 를 둘다 포함한다. 용어 "질환" 은 대상체의 정상적 건강으로부터의 임의의 이탈을 지칭하고, 질환 증상이 존재하는 상태, 뿐만 아니라 이탈 (예를 들어, 감염, 유전자 돌연변이, 유전적 결함 등) 이 발생했으나 증상이 아직 나타나지 않은 상태도 포함한다.

본 발명의 방법은 질환의 방지, 질환에 대항하는 효과기 세포 면역력의 자극, 질환의 제거, 질환의 완화, 및 일차 질환의 발생으로부터 초래되는 이차 질환의 방지에 사용될 수 있다.

일부 양상에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 백신의 단독 투여와 비교할 때 백신과 동시-투여될 때 대상체의 선천 면역 반응을 개선할 수 있다. 일부 양상에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 백신의 단독 투여와 비교할 때 백신과 함께 동시-투여될 때 대상체의 후천 면역 반응을 개선할 수 있다. 일반적으로, 백신은 투여된 후에 후천 면역력을 자극하는데 시간이 걸리므로 대상체를 즉시 보호하지는 않는다. 용어 "개선" 은, 본 발명에서, 백신에 의해 제공되는 후천 면역력을 통해 백신이 대상체를 보호하기 시작하기 전까지 대상체에서 선천 면역 반을 유발하는 것 및/또는 보호 기간을 연장하는 것을 지칭한다.

일부 양상에서, 본 발명의 방법은 다양한 병원체의 감염에 대항하여 보호하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 투여되는 조성물은 특이적 반응을 유발하는 특이적 항원을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 본 발명의 방법은, 제한 없이, 바이러스, 박테리아, 진균, 및 기생충을 포함하는 감염성 미생물 물질로부터 초래되는 질환으로부터 수령자 대상체를 보호할 것으로 여겨진다. 당업자는 본원에 기재된 바와 같은 면역조정자 조성물이 열거하기에 너무 많은 수많은 감염성 물질에 대항하여 효과적이라는 것을 인식 및 이해할 것이다. 본원에서 제공되는 감염성 물질은 예시적 목적을 위해 제공되고 사용 범위의 제한 없이 제공된다.

G. 투여

다양한 투여 경로가 이용가능하다. 선택되는 특정 방식은, 물론, 선택되는 특정 생물작용제, 대상체의 연령 및 일반적 건강 상태, 치료될 특정 병태 및 치료적 효능에 요구되는 투여량에 따라 좌우될 것이다. 본 발명의 방법은 임상적으로 수용불가능한 부작용을 야기하지 않으면서 유효 수준의 면역 반응의 활성화를 초래하는 임의의 투여 방식을 사용하여 실시될 수 있다. 조성물은 단위 투약 형태로 편리하게 제시될 수 있고, 당업계에 잘 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

면역조정자 조성물은 정맥내, 근육내, 진피내, 복강내, 피하, 분무에 의해, 난내 (in ovo), 경구, 안구내, 기관내, 비강내, 침지 (immersion), 목욕 동안 피부 또는 아가미를 통한 흡수에 의해 또는 당업계에 알려진 기타 방법에 의해 투여될 수 있다. 하나의 양상에서, 면역조정자는 피하 투여된다. 또다른 양상에서, 면역조정자는 근육내 투여될 수 있다. 또다른 양상에서, 면역조정자는 분무로서 투여된다. 또다른 양상에서, 면역조정자는 경구 투여된다. 또다른 양상에서, 면역조정자는 피하 투여될 수 있다.

하나의 관점에서, 면역조정자는 챌린지 (또는 감염) 전에 대상체에게 단독으로 투여될 수 있다. 또다른 양상에서, 면역조정자는 챌린지 (또는 감염) 후에 대상체에게 단독으로 투여될 수 있다. 또다른 양상에서, 면역조정자는 챌린지 (또는 감염) 와 동시에 대상체에게 단독으로 투여될 수 있다.

일부 양상에서, 면역조정자 조성물은 챌린지 전에 백신접종과 동시에 동시-투여될 수 있다. 일부 양상에서, 면역조정자 조성물은 챌린지 (또는 감염) 과 동시에 백신접종과 동시에 동시-투여될 수 있다. 일부 양상에서, 동시-투여는 백신 및 면역조정자를, 대상체의 동일한 일반적인 위치에서 서로 옆인 두 상이한 부위에 (즉, 대상체의 목에서 서로 옆에 주사), 동일한 일반적인 위치에서 대상체의 반대쪽에 (즉, 목의 각각의 쪽에 하나), 또는 동일 대상체의 상이한 위치에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 면역조정자 조성물은 백신접종 및 챌린지 전에 투여될 수 있다. 일부 양상에서, 면역조정자 조성물은 백신접종 후에 그러나 챌린지 전에 투여될 수 있다. 면역조정자 조성물은 챌린지 (또는 감염) 전에 백신접종된 대상체에게 챌린지 후에 투여될 수 있다.

당업자는 투여 경로가 대상체 및 대상체의 건강 또는 상태에 따라 달라질 수 있음을 인식할 것이다. 제공된 투여 경로는 예시적 목적을 위해 제공되고, 제한 없이 제공된다.

백신접종은 임의의 연령에서 수행될 수 있다. 백신은 피하로, 분무에 의해, 경구, 안구내, 기관내, 비강내, 난내, 침지에 의해 또는 당업계에 알려진 기타 방법에 의해 투여될 수 있다. 경구 백신은 식품 또는 물 중에서 투여될 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법은 일상적 백신접종 스케줄에 기초하여 사용될 수 있다고 여겨진다.

면역조정자 조성물은 또한 피하, 안구내, 기관내, 비강내, 난내, 또는 당업계에 알려진 기타 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 면역조정자 조성물은 난내 투여될 수 있다. 대안적으로, 면역조정자 조성물은 분무로서 투여될 수 있다.

난으로의 투여는 챌린지 (또는 감염) 전에 또는 챌린지 후에 수행될 수 있다.

면역조정자는 대상체에게, 챌린지 전 약 1 내지 약 14 일, 또는 챌린지 후 약 1 내지 약 14 일에 투여될 수 있다. 예를 들어, 면역조정자는 챌린지 전 약 1 내지 약 7 일, 또는 챌린지 후 약 1 내지 약 7 일에 투여될 수 있다. 면역조정자는 적합하게는 챌린지 전 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 일, 또는 챌린지 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 일에 투여된다.

기타 전달 시스템은 서방성 (time-release), 지연 방출성 (delayed release) 또는 지속 방출성 (sustained release) 전달 시스템을 포함할 수 있다. 그러한 시스템은 조성물의 반복되는 투여를 회피하여 편의성을 증가시킬 수 있다. 많은 유형의 방출 전달 시스템이 이용가능하고, 당업자에게 알려져 있다. 그들은 중합체 기반 시스템 예컨대 폴리(락티드-글리콜리드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리히드록시부티르산, 및 폴리안하이드리드를 포함한다. 상기 약물 함유 중합체의 마이크로캡슐은 예를 들어 미국 특허 번호 5,075,109 에 기재되어 있다.

전달 시스템은 또한 스테롤 예컨대 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 및 지방산 또는 중성 지방 예컨대 모노-, 디- 및 트리-글리세리드를 포함하는 지질인 비-중합체 시스템; 하이드로겔 방출 시스템; 실라스틱 시스템; 펩티드 기반 시스템; 왁스 코팅; 종래의 결합제 및 부형제를 사용하는 압축 정제; 부분 융합된 임플란트; 등을 포함한다. 구체적 예는 미국 특허 번호 4,452,775, 4,675,189, 및 5,736,152 에 기재된 것과 같은 매트릭스 내의 형태로 본 발명의 제제가 함유되어 있는 침식 시스템, 및 미국 특허 번호 3,854,480, 5,133,974, 및 5,407,686 에 기재된 바와 같은 중합체로부터 활성 성분이 제어된 속도로 침투하는 확산 시스템을 포함하나, 그에 제한되지 않는다. 또한, 펌프-기반 하드웨어 전달 시스템이 사용될 수 있고, 이들 중 일부는 이식에 맞춰 적응된다.

본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서 상기 조성물, 생성물 및 방법에 다양한 변화가 가해질 수 있으므로, 상기 설명 및 아래 제공되는 실시예에 포함되는 모든 것은 예시적으로 해석될 것이고 제한적 의미로 해석되면 안된다는 것이 의도된다.

정의

용어 "유효량" 은 원하는 생물학적 효과를 실현하는데 필수적이거나 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 감염성 질환 치료 또는 예방을 위한 면역조정자의 유효량은 미생물에 노출시 면역 반응의 발달을 야기하여, 대상체 내의 미생물의 양의 감소 및 바람직하게는 미생물의 박멸을 야기하는 데 필수적인 양이다. 임의의 특정 적용을 위한 유효량은 치료되는 질환 또는 병태, 대상체의 크기 또는 질환 또는 병태의 중증도와 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 당업자는 과도한 실험을 필요하게 만들지 않으면서 면역조정자의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다.

용어 "사이토카인" 은 면역 향상 단백질 패밀리를 지칭한다. 사이토카인 패밀리는 조혈 성장 인자, 인터루킨, 인터페론, 면역글로불린 슈퍼패밀리 분자, 종양 괴사 인자 패밀리 분자 및 케모카인 (즉, 세포, 특히 포식 세포의 이주 및 활성화를 조절하는 단백질) 을 포함한다. 예시적 사이토카인은, 제한 없이, 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-12 (IL-12), 인터루킨-15 (IL-15), 인터루킨-18 (IL-18), 인터페론-α (IFN-α), 및 인터페론-γ (IFN-γ) 를 포함한다.

용어 "유발하다" 는 용어 활성화하다, 자극시키다, 생성하다 또는 상향조절하다와 호환되게 사용될 수 있다.

용어 대상체에서 "면역 반응을 유발하다" 는 면역 반응의 활성을 특이적으로 제어하거나 또는 이에 영향을 미치는 것을 지칭하고, 면역 반응 활성화, 면역 반응 상향조절, 면역 반응 향상 및/또는 면역 반응 변경 (예컨대, 유해한 또는 비효과적인 것으로부터 유익한 또는 보호적인 것으로 대상체 내의 면역 반응의 우세한 유형을 결국 변화시키는 유형의 면역 반응을 유발시킴으로써) 을 포함할 수 있다.

용어 "작동가능하게 연결된" 은 숙주 세포 내로 트랜스펙션 (즉, 형질전환, 형질도입, 또는 트랜스펙션) 될 때 분자가 발현될 수 있도록 하는 방식으로 전사 제어 서열에 핵산 분자를 연결하는 것을 지칭한다. 전사 제어 서열은 전사의 개시, 신장 및 종료를 제어하는 서열이다. 특히 중요한 전사 제어 서열은 프로모터, 인핸서, 작동자 및 억제자 서열과 같이 전사 개시를 제어하는 것이다. 다양한 이러한 전사 제어 서열이 당업자에게 알려져 있다. 바람직한 전사 제어 서열은 조류, 어류, 포유류, 박테리아, 바이러스, 식물 및 곤충 세포에서 기능하는 것을 포함한다. 임의의 전사 제어 서열이 본 발명에서 사용될 수 있지만, 이 서열은 면역원 또는 면역 자극 단백질을 인코딩하는 서열과 자연적으로 연합된 자연 발생적 전사 제어 서열을 포함할 수 있다.

용어 "핵산 분자" 및 "핵산 서열" 은 호환되게 사용될 수 있고, DNA, RNA, 또는 DNA 또는 RNA 의 유도체를 포함할 수 있다. 이 용어는 또한 올리고뉴클레오티드 및 더 큰 서열, 예컨대 플라스미드, 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드를 포함하고, 단백질 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산 분자, 및 조절 영역, 인트론 또는 기타 비-코딩 DNA 또는 RNA 를 포함하는 핵산 분자 둘다를 포함한다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드는 약 1 내지 약 500 뉴클레오티드의 핵산 서열을 갖고, 더욱 전형적으로는 길이가 약 5 뉴클레오티드 이상이다. 핵산 분자는 포유류, 어류, 박테리아, 곤충, 바이러스, 식물, 합성 공급원 또는 그들의 조합을 포함하는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 핵산 분자는 재조합 DNA 기술 (예를 들어, 폴리머라제 사슬 반응 (PCR), 증폭, 클로닝) 또는 화학적 합성과 같은 당업계에 흔히 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 핵산 분자는 천연 핵산 분자 및 그의 상동체를 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 방법에서 유용한 면역 반응을 유발하는 핵산 분자의 능력을 개질이 실질적으로 방해하지 않도록 하는 방식으로 뉴클레오티드가 삽입, 결실, 치환 또는 도치되어져 개질된 핵산 분자 및 천연 대립유전자 변이체를 포함한다. 핵산 상동체는 당업계에 알려진 다수의 방법을 이용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989 참조).

용어 "선택가능 마커" 및 "선택가능 마커 유전자" 는 유기체를 보호하는 생성물을 인코딩하는 유전자를 지칭하며, 여기서 상기 유전자는 유기체를 통상적으로 사멸하거나 그의 성장을 저해하는 조건 또는 선택적 제제 (예를 들어, 항생제) 로부터 발현된다. 선택가능 마커 유전자는 가장 흔한 항생제 내성 유전자 (예를 들어, 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 등) 이다. 따라서, 예를 들어 대장균 세포를, 카나마이신 내성 유전자를 인코딩하는 플라스미드를 도입하는 형질전환 절차에 적용시킨 다음, 카나마이신 함유 배지상 또는 그 안에서 성장시키는 경우, 성공적으로 플라스미드를 취해 카나마이신 내성 유전자를 발현시킨 대장균만이 살아남을 것이다. 용어 "선택가능 마커" 및 "선택가능 마커 유전자" 는 또한 유기체의 성장에 필수적인 화합물 합성에 관여된 효소를 코딩하는 유전자를 포함한다. 필수 화합물을 합성할 수 없는 영양요구성 유기체에 도입되는 경우, 이러한 유전자는 그 유기체를 필수 화합물이 보충된 배지에서 성장 가능하게 허용한다. 예를 들어, 리신 생합성에 관여된 효소 내 돌연변이 또는 이의 부재로 인해 아미노산 리신에 대해 영양요구성인 박테리아 세포는 통상적으로 리신이 보충되어지지 않은 배지 상에서 성장할 수 없다. 이러한 박테리아가 리신 생합성에 관여된 효소를 인코딩하는 플라스미드를 도입하는 형질전환 절차에 적용되는 경우, 성공적으로 플라스미드를 취해 효소를 발현시킨 박테리아는 리신이 보충되지 않은 배지에서 성장시 생존할 것이다. 용어 "선택가능 마커" 및 "선택가능 마커 유전자" 는 독/해독제 선택을 허용하는 유전자를 추가로 포함한다. 예를 들어, ccdB 유전자는 세포 분할에 필수 효소인 DNA 자이라제에 결합하는 단백질을 인코딩한다. DNA 자이라제에 결합되자마자, ccdB 유전자 생성물은 유전자 복제를 손상시키고 세포사를 유도한다. 즉, ccdB 유전자 생성물을 발현하는 박테리아는 살아남을 수 없다. ccdA 유전자는 ccdB 유전자 생성물의 천연 저해제로서 작용하는 단백질 ("해독제") 를 인코딩한다. 따라서, 박테리아 게놈에서 ccdB 유전자를 갖는 박테리아를 ccdA 유전자 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 도입하는 형질전환 절차에 적용시키는 경우, 성공적으로 플라스미드를 취해 ccdA 유전자를 발현하는 세포만이 살아 남을 것이다.

용어 "스크린가능 마커" 및 "스크린가능 마커 유전자" 는 스크린가능 마커 유전자를 발현하는 세포와 스크린가능 마커 유전자를 발현하지 않는 세포를 관찰자가 구별 가능하게 하는 생성물을 인코딩하는 유전자를 지칭한다. 스크린가능 마커 유전자 시스템은 당업계에 잘 알려져 있고, 이는 예를 들어 lacZ 유전자 및 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 청색 형광 단백질 (BFP) 또는 시안색 형광 단백질 (CFP) 과 같은 형광 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다.

본원에서 사용되는, 용어 "생산 개선" 은 면역조정자 조성물을 수령하는 대상체와 면역조정자 조성물을 수령하지 않는 대상체 사이에서 측정값 예컨대 건강, 체중, 크기, 육질, 또는 기타 파라미터의 개선을 언급한다.

본원에서 사용되는, 용어 "생존성 개선" 은 면역조정자 조성물을 수령하지 않는 대상체와 비교할 때 수령자 대상체의 개선된 생존을 언급한다.

본원에서 사용되는, 용어 "대상체" 는 수생 종의 임의의 상당한 변종을 포함하는 수생 종의 구성원을 언급한다. 대상체는 가축이든 또는 야생종이든 수생 종의 임의의 구성원일 수 있고, 번식, 고기 또는 알 생산을 위해 상업적으로 길러질 수 있다. 예시적 수생 종은, 제한 없이, 담수 또는 염수에서 사는, 임의의 종의 물고기, 갑각류, 연체동물을 포함한다. 대표적 종은, 제한 없이, 척색동물 문, 척추동물 아문, 및 어상강의 임의의 구성원을 포함하는 물고기를 포함한다. 추가의 예로서, 제한 없이, 그러한 물고기는 메기 (catfish), 얼룩 메기 (channel catfish), 눈동자개 (black bullhead), 노랑부리연어 (yellow bullhead), 갈색 메기 (brown bullhead), 잉어 (carp), 붕어 (crucian carp), 송어 (trout), 무지개 송어 (rainbow trout), 갈색 송어 (brown trout), 반점 민물 송어 (speckled brook trout), 연어 (salmon), 대서양 연어 (atlantic salmon), 은연어 (coho salmon), 치누크 (chinooK) 또는 킹 연어 (king salmon), 유럽산잉어 (tench), 유럽산잉어과물고기 (roach), 강꼬치고기 (pike), 민물농어 (pike-perch), 도버 서대기 (dover sole), 넙치 (turbot), 방어류 (yellowtail), 농어 (bass), 작은입 농어 (smallmouth bass), 큰입 농어 (largemouth bass), 줄무늬 농어 (striped bass), 줄무늬 농어 (stripers), 밀크피쉬 (milkfish), 틸라피아 (tilapia), 숭어 (gray mullet), 장어 (eels), 대구 (cod) 를 포함하고, 본 발명과 함께 실시할 수 있는 임의의 기타 변종 또는 수생 종은 당업자에게 명백할 것이다. 일부 양상에서, 대상체는 감염성 질환으로 진단될 수 있거나, 감염성 질환의 위험에 처할 수 있거나, 또는 감염성 질환을 경험할 수 있다. 대상체는 태아기, 신생아기, 청소년기, 성년기, 중년기 또는 노년기를 포함하는 임의 연령을 가질 수 있다.

표 1: 플라스미드 DNA 서열

실시예

하기 비-제한적 실시예는 본 발명을 추가로 설명하기 위해 제공된다.

실시예 1. IPNV 공동-서식 챌린지를 사용하는 불활성화된 IPNV 항원과 함께 제형화되었을 때 DNA 면역조정자를 수령하는 대서양 연어의 평가.

이 연구의 목적은 IPNV 공동-서식 전에 연어에게 투여된 DNA 면역조정자의 효능을 확인하는 것이었다.

면역조정자

이 연구에서 사용된 DNA 면역조정자는 CpG 디뉴클레오티드 서열을 함유하는 플라스미드 DNA 리포솜 복합체였다. 플라스미드 DNA 는 SEQ ID NO: 2 로 표시되는 pMB75.6 플라스미드이다. 플라스미드 DNA 리포솜 복합체를 5% 덱스트로스 용액 중에 제형화했다.

이 연구에서 사용된 몬타나이드 오일 (Montanide oil) (몬타나이드 ISA 763 A) 은 강한 장기간 면역 반응을 제공하는 유형 I 아주반트인 대사가능한 오일이다. Seppic 에 의해 공급되는, 몬타나이드 ISA 763 A VG 는 주입가능한, 대사가능한 오일 (미네랄 오일을 함유하지 않음) 및 만니톨로부터 수득되는 극도로 정제된 유화제 및 식물 기원의 정제된 올레산을 함유한다.

IPNV 항원

IPNV (감염성 췌장 괴사 바이러스 (Infectious pancreas necrosis virus)) 를 CHSE-214 세포주에서 100% 세포변성 효과 (CPE) 가 획득될 때까지 증식시켰다. 항원을 포르말린 불활성화시키고, 그 후 다양한 처리 전체에 걸쳐 일정한 농도에서 위에 열거된 면역조정자 중 어느 하나와의 조합으로 제형화했다.

Alpha Ject® 2-2

이 상업적으로 입수가능한 백신을 대조군으로서 사용했다. 이 백신은 절종증 및 IPNV 감염으로 인한 물고기의 사망을 방지하는데 사용되는 오일 에멀전이다.

IPNV 항원 백신 제형

IPNV 항원을 3 가지 상이한 농도/비율에서 DNA 면역조정자 또는 몬타나이드 오일 중 어느 하나와의 조합으로 1 가 백신으로서 제형화했다. 처리 조성물 요약은 표 2 에서 보여진다.

표 2. 백신 제형.

연구 동물

대서양 연어 (Salmo salar) 를 공급자로부터 문서로 기록된 면역 상태 및 백신접종되지 않은 상태로 얻었다. 성적으로 성숙된, 부상 입은 또는 기형인 물고기는 연구로부터 배제했다. 물고기를 탱크 당 총 360 마리의 처리 물고기에 관한 3 개의 탱크 내의 각각 30 마리 물고기로 이루어지는 12 개의 처리군 (처리군 A 내지 L) 으로 나누었다. 72 마리의 물고기로 이루어지는 또다른 군을 각각의 3 개의 탱크 내에서 셰더 (shedder), 또는 IPNV 를 활발히 셰딩하는 물고기로서 사용했다. 백신의 투여 전에, 시험 물고기를 마취시키고, 처리일 2 주 전에 PIT-태그의 주입에 의해 마크했다.

연구 디자인

물고기를 백신의 투여 전 최소 48 시간 동안 굶겼다. 처리군에게 처리일에 위에 표 2 에 기재된 다양한 투여량의 백신 또는 대조군 물질을 투여했다. 백신 또는 대조군 물질을 표 2 에 따라 복강내 투여했다. 연구를 3 개의 탱크에서 수행했다. 각각의 탱크는 각각 30 마리의 물고기로 이루어지는 12 개의 실험 군을 가졌다. 2 개의 탱크는 챌린지 실험을 위한 듀플리케이트로서 사용했다 (탱크 1 및 2, 표 3). 세번째 탱크는 면역조정 연구 동안 샘플링에 사용했다 (탱크 3, 표 3).

표 3. 연구 디자인. 이 표에서 DNA 면역조정자는 DNA 로 축약된다.

챌린지 실험을 백신접종 및 광주기 조작 후 대략 6 주, 최소 600 도일 (degree days) 후에 해수로 옮기는 것과 결부시켜 수행했다. 물고기를 챌린지 전 최소 25 시간 동안 굶겼다. 모든 탱크를 동시에 챌린지했다. 셰더에게 증식한 바이러스를 복강내 주입하고, 챌린지 시점에 지방질 지느러미를 잘라서 마크했다. 주입 및 마크 후에, 셰더를 도입했다. 원래 탱크 1 및 2 로부터의 물고기를 탱크 M5 및 M6 로 할당했고, 원래 탱크 3 으로부터의 물고기를 탱크 M2 로 옮겼다.

샘플링

각각의 시점에 관해, 물고기를 도태시키고, 조직, 예를 들어 머리-신장, 간 및 비장, 샘플을 면역프로파일링 (immunoprofiling) 을 위해 얻었다. 혈액을 또한 혈청학 및/또는 전사체 분석을 위해 수집했다. 각각의 시점에서, 처리 당 5 마리의 물고기를 도태시키고, 샘플링했다. 백신접종 전에, 일반적 집단으로부터의 10 마리의 물고기를 샘플링했다. 백신접종 후에, 탱크 3 으로부터의 샘플을 백신접종-후 24 및 48 시간에 수집했다. 챌린지 후에, 탱크 1 및 2 로부터의 샘플을 표준 확증적 손실 (standard confirmatory loss) (10% 의 사망률) 에 관해 취했다. 탱크 3 으로부터의 샘플을 챌린지-후 3 및 7 일에 수집했다. 챌린지 기간의 마지막에, 살아 남은 물고기를 도태시키고, 샘플링했다.

IPNV 챌린지 탱크 (탱크 1 및 2) 로부터의 죽은 물고기의 대표적 선별을 신장 샘플링하고, IPNV Ag ELISA 에서 시험했다. 선별을 총 10% 이하의 물고기 (30/탱크) 의 사망률의 시작, 중간, 및 마지막에 수행했다.

챌린지 동안 죽은 물고기의 대표적 선별 (시험에 포함된 물고기의 총수의 ~10%) 을 세균학적으로 조사했다.

결과

셰더의 도입 후에, 챌린지 연구는 음성 대조군에서 사망률이 안정되거나 또는 100% 에 도달할 때까지 진행되게 놔두었다. 사망률의 플래토 (plateaus) 는 탱크 1 및 2 에서 감염-후 제 22 일 및 제 28 일에 도달되었다 (도 4 & 도 5).

죽은 물고기를 IPNV Ag ELISA 및 세균학적 분석을 사용하여 샘플링했다. IPNV Ag ELISA 시험은 탱크 M6 으로부터의 물고기의 75.5% 및, 탱크 M5 내의 물고기의 62.5% 및 탱크 M2 내의 물고기의 단지 35.2% 가 IPNV 에 관해 양성이다는 것을 밝혔다 (표 4). 10% 의 사망률로부터 취한 샘플을 세균학 분석을 위해 제출했다. 다양한 탱크 내의 물고기로부터 취한 박테리아 성장이 없는 샘플의 백분율은 탱크 M5, M6 및 M2 에 관해 각각 77.5%, 64.9% 및 98.1% 였다 (표 5). 후속적으로 기록된 사망률의 대부분은 박테리아 성장에 관해 음성이었다.

표 4. IPNV Ag ELISA 결과.

표 5. 탱크 M5, M6 및 M2 로부터의 세균학적 결과.

각각의 처리군 (군 A 내지 L) 으로부터의 생존 시간을 이해 및 비교하기 위해서 조합된 데이타의 카플란-마이어 생존 곡선을 결정했다. 도 6 에서 관찰되는 바와 같이, 생존 확률은 2 개의 구별되는 집단으로 격립되었다. 더 낮은 생존 확률을 갖는 집단은 덱스트로스 (A) 또는 항원 없는 3 가지 상이한 투여량의 DNA 면역조정자 (B, C 및 D) 로 처리된 물고기로 구성되었으며, 한편 더 큰 생존 확률을 보이는 집단은 IPNV 항원 단독 (E), DNA 면역조정자와 함께 제형화된 IPNV 항원 (F, G 및 H) 또는 몬타나이드 오일과 함께 제형화된 IPNV 항원 (I, J 및 K), 및 상업용 백신 (L) 으로 처리된 군으로 구성되었다. 전체로서 비교할 때, 12 가지 상이한 처리 사이에 생존 곡선에서 통계적으로 유의한 차이가 발견되었다 (카이-제곱 = 110.6 df = 11; p-값 (<0.0001) = 2.2x10^-16).

처리를 2 개의 구별되는 클러스터 중에서 나누었다 (도 7). 하나의 클러스터는 덱스트로스-처리 (A) 뿐만 아니라 항원 없는 모든 DNA 면역조정자 처리 (B, C, D) 를 포함했다. 기타 클러스터는 IPNV 항원 단독 (E), DNA 면역조정자 제형화된 백신 (F, G, H), 몬타나이드 제형화된 항원 (I, J, K), 및 상업용 백신 (L) 으로 처리된 물고기로 구성되었다.

2 개의 클러스터 사이의 유의한 차이는 분명하며, 이에 따라 음성 대조군과 비교할 때 백신접종에 의해 물고기 생존이 유의하게 개선되었다는 것을 확인시켜 주지만, 상이한 백신 제형 사이에는 구별이 보이지 않았다.

실험의 마지막에 모든 처리군에서 상대 생존 백분율 (RPSend) 을 계산했다 (도 8). 5% 덱스트로스 음성 대조군과 모든 제형화된 백신 사이에 유의한 차이가 측정되었다.

스필버그 (Spielberg) 스케일을 사용하여 백신을 제형화하는데 사용된 아주반트의 모든 가능한 음성 효과를 평가했다. 특별한 이차 효과가 관찰되지 않았다. 조직 병변은 거의 비-존재했으며, 상업용 제품에서 부착 및 색소침착에 관해 오직 가끔 레벨 2 (낮은) 점수 및 DNA 면역조정자에 관해 레벨 1 점수가 있었다 (표 6). 샘플링된 임의의 물고기에서 백신 잔류물이 검출가능하지 않았다.

표 6. 탱크 M5 및 M6 에 관한 스필버그 점수.

결론

이 연구에서, 대서양 연어에서 백신으로서 불활성 IPNV 와 함께 제형화된 DNA 면역조정자의 효능을 평가했다. DNA 면역조정자가 단독으로 투여되었을 때 (처리 B, C 및 D) 그것은 최소 보호를 제공했으며, 사망률은 93.3 내지 100% 범위였고, 생존 확률은 덱스트로스-단독 대조군과 유의하게 상이하지 않았다. 이것은 DNA 면역조정자에 의해 유발된 선천 면역 반응이 챌린지 시점 (588 도일 또는 대략 7 주 백신접종-후) 까지 아마도 소멸되었을 것이므로 (이는 현 연구에서 평가되지 않았다) 예상된 것이었다.

도 8 에서 도시되는 바와 같이, IPNV 불활성화된 항원 단독의 존재는 5% 덱스트로스 군과 비교할 때 백신접종된 물고기의 생존 확률을 21.4% 의 RPSend 로 유의하게 증가시키기에 충분했다. 보호는 DNA 면역조정자 (F=28.7%, G=42.9%, H=41.1%) 및 몬타나이드 (I=42.9%, J=39.3%, K=23.2%) 의 아주반트 제형으로 추가로 증가되었다. 안전성 측면에서, 문제가 기록되지 않았고, DNA 면역조정자는 물고기에서 사용하기에 안전한 것으로 여겨졌다.

이 연구는 물고기 백신 아주반트로서의 DNA 면역조정자의 잠재적 사용, 대서양 연어에서 면역 반응 유도를 돕는 그것의 능력 뿐만 아니라 10 ug 이하로 투여되었을 때 그것의 안전성 프로파일을 보여줬다.

본 발명의 구성요소 또는 그의 바람직한 실시양태(들)를 소개할 때, 단수형 및 "상기" 는 하나 이상의 구성요소가 존재한다는 것을 의미한다. 용어 "포함하는", "포함되는" 및 "갖는" 은 포괄적인 것으로 의도되고, 열거된 구성요소 이외의 추가의 구성요소가 존재할 수 있다는 것을 의미한다.

상기에 비추어, 본 발명의 여러 목적이 달성되었고, 기타 유리한 결과가 획득되었음을 알 수 있을 것이다.

본 발명의 범위를 벗어나지 않고 상기 제품, 조성물 및 방법에 있어서 다양한 변화를 구현하는 것이 가능하므로, 상기 상세한 설명에 포함되고, 첨부된 도면에서 제시되는 모든 대상은 설명을 위한 것으로 해석되어야 하며, 제한의 의미로 해석되어서는 안 된다.

SEQUENCE LISTING <110> <120> ENHANCED IMMUNE RESPONSE IN AQUATIC SPECIES <130> BAYR <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4242 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of plasmid pGCMB75.6 <400> 1 tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 60 ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 120 gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 180 tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac 240 atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 300 cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 360 agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 420 ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 480 gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 540 cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagccg atctgataac ggtaccgata agctggcggc 600 cgattaagct acagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga 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ctccgcccca 420 ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 480 gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 540 cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagccg atctgataac ggtaccgata agctggcggc 600 cgattaagct acagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga 660 caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc 720 tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac 780 tcccaggttc aattacagct cttaagcagc cgcaagcttg atatcgaatt cctgcagccc 840 gggggatcca ctagttctag agcggccgcc accgcggtgg agctcgaatt atcagatcga 900 ttaataacta tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa ggggttaata 960 aggaatattt gatgtatagt gccttgacta gagatcataa tcagccatac cacatttgta 1020 gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg 1080 aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 1140 agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 1200 aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcatcagat ctgccggtct ccctatagtg 1260 agtcgtatta atttcgataa gccaggttaa cctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 1320 gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 1380 ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 1440 agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 1500 ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 1560 caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 1620 gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 1680 cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 1740 tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 1800 gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 1860 cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 1920 tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 1980 tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 2040 caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 2100 aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 2160 cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gggcgcgcct aggcttttgc aaagatcgat 2220 caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct 2280 ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc 2340 tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc 2400 gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc 2460 acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg 2520 ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag 2580 aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc 2640 ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt 2700 cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc 2760 gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc 2820 tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg 2880 ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag 2940 cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg 3000 cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg 3060 aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct 3120 tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc 3180 gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accctaggcg cgctcatgag cggatacata 3240 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 3300 ccacctaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca 3360 gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga 3420 ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg 3480 actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat 3540 caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag 3600 ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga 3660 agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa 3720 ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcccattcg ccattcaggc 3780 tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 3840 aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 3900 gttgtaaaac gacggccagt gagcgcgcgt aatacgactc actatagggc gaattgggta 3960 ccgggccccc cctcgagcag gatctataca ttgaatcaat attggcaatt agccatatta 4020 gtcattggtt atatagcata aatcaatatt ggctattggc cattgcatac gttgtatcta 4080 tatcataata tgtacattta tattggctca tgtccaatat gaccgccatg ttgacattga 4140 ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg 4200 gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gc 4242 <210> 4 <211> 4242 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucelotide sequence of plasmid pLacZMB75.6 <400> 4 tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 60 ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 120 gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 180 tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac 240 atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 300 cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 360 agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 420 ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 480 gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 540 cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagccg atctgataac ggtaccgata agctggcggc 600 cgattaagct acagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga 660 caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc 720 tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac 780 tcccaggttc aattacagct cttaagcagc cgccaaaaca aaattcctca aaaatcatca 840 tcgaatgaat ggtgaaataa tttccctgaa taactgtagt gttttcaggg cgcggcataa 900 taattaacta tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa ggggttaata 960 aggaatattt gatgtatagt gccttgacta gagatcataa tcagccatac cacatttgta 1020 gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg 1080 aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 1140 agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 1200 aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcatcagat ctgccggtct ccctatagtg 1260 agtcgtatta atttcgataa gccaggttaa cctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 1320 gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 1380 ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 1440 agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 1500 ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 1560 caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 1620 gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 1680 cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 1740 tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 1800 gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 1860 cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 1920 tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 1980 tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 2040 caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 2100 aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 2160 cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gggcgcgcct aggcttttgc aaagatcgat 2220 caagagacag gatgaggatc gtttcgcagc ttttcattct gactgcaacg ggcaataagt 2280 ctctgtgtgg attaaaaaaa gagtgtctga tagcagcttc tgaactggtt acctgccgtg 2340 agtaaattaa aattttattg acttaggtca ctaaggcgcc ttgcgctgag gttgcgtcgt 2400 gatatcatca gggcagaccg gttacatccc cctaacaagc tgtataaaga gaaatactat 2460 ctcattggcg ttgcccgcac ctgacagtgc gacgttgggc tgcgtccgtc gaccaacggt 2520 accgaggtaa cagcccaatc tatccatgat ctcggccagg ccgggtcggc cgttatgcag 2580 cccggctcgg gtatgaagcc attaaggagc cgacccagcg cgaccgggcg gccggtcacg 2640 ctgcctctgc tgaagcctgc ctgtcactcc ctgcgcggcg tacccgccgt tctcatcgag 2700 taggctccgg atcgcgaccc cggacgggcc ctgggcccag gagcggccta tgacaaatgc 2760 cgggtagcga tccggcattc agcattgact gcgcacggat ccagtccttg caggagcctt 2820 atgccgaccg tagcaaaaaa tgagcccgag ccgatcgcga gttgtgatcc ggtcccgccg 2880 attgccggtc gcgatgacgg tcctgtgtaa gcgttatcgt taccaattgt ttaagaagta 2940 tatacgctac gaggtacttg ataacttctg cgtagcatac atgaggtttt gtataaaaat 3000 ggcgggcgat atcaacgcag tgtcagaaat ccgaaacagt ctgcgggact ctggggttcg 3060 aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct 3120 tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc 3180 gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accctaggcg cgctcatgag cggatacata 3240 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 3300 ccacctaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca 3360 gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga 3420 ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg 3480 actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat 3540 caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag 3600 ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga 3660 agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa 3720 ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcccattcg ccattcaggc 3780 tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 3840 aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 3900 gttgtaaaac gacggccagt gagcgcgcgt aatacgactc actatagggc gaattgggta 3960 ccgggccccc cctcgaggtc gacggtatcg ataagcttga tatcgaattc ctgcagcccg 4020 ggggatccac tagttctaga gcggccgcca ccgcggtgga gctccagctt ttgttccctt 4080 tagtgagggt taattgcgcg cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 4140 tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 4200 ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gc 4242 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 5 gtgcgcggaa cccctatttg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 6 gcgtacccgc cgttctcatc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 7 gtctgacgct cagtggaacg 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 8 gttccagttt ggaacaagag tc 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 9 ggcaattagc catattagtc 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 10 gcagagctcg tttagtgaac cg 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 11 gatcataatc agccatacca c 21 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 12 cgtcttgagt ccaacccggt aagacac 27 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 13 ccacaggtgt ccactcccag gttc 24 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 14 ctagtcaagg cactatacat c 21 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 15 tccacagaat caggggataa cg 22 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 16 gctcactcat taggcacccc agg 23 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 17 cgcgtaatac gactcactat ag 22

Claims

수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법으로서,
a. 유효량의 면역조정자 조성물을 수생 종 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 면역조정자 조성물은 적어도 하나의 면역자극성 CpG 모티프, 적어도 하나의 비-면역자극성 CpG 모티프를 포함하는 핵산 서열, 및 양이온성 리포솜을 포함하는, 수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
제 1 항에 있어서, 리포솜 전달 비히클은 다층 소포 지질 및 압출된 지질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 지질을 포함하는, 수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
제 1 항에 있어서, 리포솜 전달 비히클은 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 콜레스테롤; N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP) 및 콜레스테롤; 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-히드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드 (DOTIM) 및 콜레스테롤; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 콜레스테롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 지질의 쌍을 포함하는, 수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
제 1 항에 있어서, 면역조정자 조성물은 추가로 생물작용제를 포함하는, 수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
제 1 항에 있어서, 투여는 감염원에의 노출 전에 수행되는, 수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
제 1 항에 있어서, 투여는 감염원에의 노출 후에 수행되는, 수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
제 1 항에 있어서, 면역조정자 조성물은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
제 4 항에 있어서, 생물작용제는 면역 인핸서 단백질, 면역원, 백신, 항균제, 및 그들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
제 1 항에 있어서, 수생 종 대상체는 물고기인, 수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
제 9 항에 있어서, 물고기는 연어인, 수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
제 9 항에 있어서, 물고기는 메기인, 수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
제 9 항에 있어서, 물고기는 잉어인, 수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
제 9 항에 있어서, 물고기는 송어인, 수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
제 9 항에 있어서, 물고기는 방어인, 수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
제 9 항에 있어서, 물고기는 농어인, 수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
제 9 항에 있어서, 대상체는 수산 양식되는 물고기인, 수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
제 1 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 수령자 수생 종 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
수산 양식되는 물고기의 생산의 개선 방법으로서, 물고기에게 면역조정자 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 면역조정자 조성물은 적어도 하나의 면역자극성 CpG 모티프를 포함하는 핵산 서열, 및 양이온성 리포솜을 포함하는, 수산 양식되는 물고기의 생산의 개선 방법.
수산 양식되는 물고기의 생존성의 개선 방법으로서, 물고기에게 면역조정자 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 면역조정자 조성물은 적어도 하나의 면역자극성 CpG 모티프를 포함하는 핵산 서열, 및 양이온성 리포솜을 포함하는, 수산 양식되는 물고기의 생존성의 개선 방법.
백신 항원에 대한 면역 반응의 개선 방법으로서, 수령자 수생 종 대상체에게 면역조정자 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 면역조정자 조성물은 적어도 하나의 면역자극성 CpG 모티프를 포함하는 핵산 서열, 및 양이온성 리포솜을 포함하는, 백신 항원에 대한 면역 반응의 개선 방법.