TWI733688B

TWI733688B - 水生物種中增強之免疫反應

Info

Publication number: TWI733688B
Application number: TW105123833A
Authority: TW
Inventors: 克莉絲坦威斯; 娜塔莉辛瑪德; 詹恩科斯林
Original assignee: 德商拜耳動物保健有限公司
Priority date: 2015-07-31
Filing date: 2016-07-28
Publication date: 2021-07-21
Also published as: KR20180035860A; EP3328423B1; CN108712912B; IL256947A; DK3328423T3; CN108712912A; US20190008952A1; CA2994039A1; JP2018521108A; TW201718006A; WO2017021242A1; EP3328423A1; CL2018000201A1; AR105539A1; AU2016304343A1

Abstract

本發明大體上是有關在水生物種個體中誘發免疫反應的方法。特別地，使用免疫調節劑組合物來引起免疫反應，以增強個體對抗病原的能力。

Description

水生物種中增強之免疫反應

本發明大體上是有關在個體中透過活化先天性免疫力來誘發免疫反應的方法。特別地，在水生物種的成員中使用免疫調節劑組合物來刺激先天性免疫力。

本發明是關於使用免疫刺激性質體在水生物種個體中調節先天性免疫力的方法。免疫刺激性質體可包含與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的序列，或其組合具有至少80%序列一致性的核酸序列。在一些態樣中，免疫刺激性質體可包含與SEQ ID NO：4的序列具有至少84%序列一致性的核酸分子。在一些態樣中，免疫刺激性質體可包含SEQ ID NO：1的序列。在一些態樣中，免疫刺激性質體可包含SEQ ID NO：4的序列。在一些態樣中，免疫刺激性質體可包含SEQ ID NO：2的序列。在一些態樣中，免疫刺激性質體可包含SEQ ID NO：3的序列。

在其他態樣中，免疫刺激性質體可由與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4的序列或其組合具有至少80%序列一致性的核酸序列組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體可由具有與SEQ ID NO：4的序列具有至少84%序列一致性的核酸分子組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體可由SEQ ID NO：1的序列組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體可由SEQ ID NO：4的序列組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體可由SEQ ID NO：2 的序列組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體可由SEQ ID NO：3的序列組成。

在一些態樣中，免疫刺激性質體較佳不包含編碼全長或功能性可選擇或可篩選標記的核酸序列。在其他態樣中，免疫刺激性質體包含編碼並非抗生素抗性基因之可選擇或可篩選標記的核酸序列。

本發明亦關於包含本文所述任一種免疫刺激性質體或DNA序列，以及醫藥上可接受之載體的藥物調配物。

本發明亦關於包括陽離子脂質體遞送載劑及本文所述任一種免疫刺激性質體或DNA序列的免疫調節劑組合物。

在一些態樣中，本發明是關於使用本文所述免疫刺激性質體或DNA序列的方法。合適的使用方法包括治療性投與給水生物種個體。這樣的治療投與包括個體(們)的預防性治療、後期預防性治療，以及感染後治療。

本發明是關於在個體中刺激或誘發免疫反應的方法。在一些態樣中，該方法包括透過向個體投與本文所述免疫調節劑組合物來刺激個體的免疫反應。在一些態樣中，該方法包括透過向個體投與本文所述免疫刺激性質體或DNA序列來刺激個體的免疫反應。

其他目的及特徵有一部分將會是明顯的而有一部分將在下面指出。

下面圖式構成本說明書的一部分，並且被納入以進一步說明本發明的某些態樣。可以透過參照這些圖式中的一或多個以及本文呈現之特定具體例的詳細說明而更充分理解本發明。

圖1顯示pMB75.6質體的圖譜(SEQ ID NO：2)；圖2顯示pGCMB75.6質體的圖譜(SEQ ID NO：1)；圖3顯示pLacZ75.6質體的圖譜(SEQ ID NO：4)；圖4圖解說明魚槽M5的攻擊後每日死亡率百分比。

圖5圖解說明魚槽M6的攻擊後每日死亡率百分比。

圖6顯示疫苗研究的每一組的合併死亡率之卡本-麥爾(Kaplan-Meier)存活曲線。垂直軸是在特定時間DPC(橫軸)的生存概率。曲線末端處的十字代表設限數據(censored data)(魚活著超過27 DPC)。DPC：攻擊後的天數。

圖7描述12組魚之間從疫苗研究起的成對比較，其中連接群(由綠色圓圈顯示的節點表示)期間沒有顯著差異(α=0.05)。

圖8圖解說明當與葡萄糖5%-處理對照組相比，疫苗研究組的相對存活百分比。在實驗結束時(RPSend)的累積死亡率之間進行比較。在5%葡萄糖組與其他治療之間，顯著累積死亡率差異(α=0.05)用*表示。

依據本發明，已發現能夠在接受者個體中誘發免疫反應的組合物，以及使用方法。特別地，本發明是關於核酸組合物或免疫調節劑組合物，及其用途。已發現這樣的免疫調節劑組合物可以用於調節水生物種成員的免疫系統。本發明特別可用於治療並預防由微生物引起的傳染病，微生物為諸如(但不限於)病毒、細菌、黴菌、真菌、酵母菌，寄生蟲和技藝中已知的其他微生物。下文會更詳細地探討該等組合物及使用該等免疫調節劑組合物的方法。

I. 組合物

如本文所述的那些可用於本發明中的組合物大體上能夠用作為傳染病的預防性療法、後期預防性療法或治療療法。此等組合物在本文中稱為免疫調節劑組合物。免疫調節劑組合物包括至少一種免疫刺激性質體或免疫刺激性DNA序列，其能夠在接受者個體中引起免疫反應。在一些態樣中，該免疫反應是先天性免疫反應。在一些態樣中，該免疫反應是先天性免疫反應和後天性免疫反應的組合。在一些態樣中，該等免疫調節劑組合物也可包括脂質體遞送載劑。

A. 核酸

在一些態樣中，本發明是有關用於治療或預防傳染病致病原的核酸分子。本文所述核酸分子可以包括在免疫刺激性質體(作為線性雙股或單股DNA)、胺基酸序列、核糖核酸(RNA)，或其組合中。在一些態樣中，本發明是有關核酸分子、載體和宿主細胞(活體外、活體內或離體)，其含有免疫刺激性質體或免疫刺激性DNA序列。

本文所述核酸分子富含CpG基序。這樣的CpG基序可經由免疫監視受體(包括特異性類鐸(Toll)受體，諸如TLR9與TLR21)來引起免疫刺激。此外，本文所述核酸分子也含有非CpG免疫刺激性基序。在一些態樣中，核酸分子含有約2-20%的CpG基序，超過在隨機核酸序列中預期的CpG基序頻率。在一些態樣中，核酸分子含有約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40%，或更多CpG基序，超過在隨機核酸序列中預期的CpG基序頻率。在一些態樣中，相較於脊椎動物DNA，核酸分子含有約2至50倍，或更多CpG基序。在一些態樣中，相較於脊椎動物DNA，核酸分子包含約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55倍或更多CpG基序。

在一些態樣中，本發明是有關免疫刺激性質體或DNA序列，其不包含抗生素抗性基因。質體可以是不含有任何可選擇或可篩選標記基因。例如，本文所述pGCMB75.6質體不包含任何全長或功能性可選擇或可篩選標記基因。於SEQ ID NO：1中提供pGCMB75.6的序列。

在一些態樣中，本文所述免疫刺激性質體較佳不包含編碼全長或功能性可選擇或可篩選標記的核酸序列。在一些態樣中，該免疫刺激性質體不包含抗生素抗性基因。例如，該質體不包含康黴素抗性基因。在一些態樣中，本文所述質體較佳不編碼免疫原。

在一些態樣中，免疫刺激性質體可包含編碼可選擇或可篩選標記基因的核酸序列，該可選擇或可篩選標記基因並非抗生素抗性基因。例如，本文所述pLacZMB75.6質體包含LacZ基因作為可篩選標記。於圖3中提供pLacZMB75.6的圖譜，而pLacZMB75.6的核苷酸序列提供如SEQ ID NO：4。如圖3中所示，pLacZMB75.6類似於pGCMB75.6，但含有一個LacZ可篩選標記。

應理解，pMB75.6質體的核苷酸序列(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3(具有一個AscI限制位點的pMB75.6)、pGCMB75.6質體的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)或pLacZMB75.6質體的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)可以在不明顯影響其免疫刺激性性質的情況下有某種程度的改變。在一些態樣中，本發明是關於包含與pGCMB75.6的序列(SEQ ID NO：1)具有至少89%序列一致性之核酸序列的免疫刺激性質體。免疫刺激性質體較佳包含與pGCMB75.6(SEQ ID NO：1)的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%序列一致性的核酸序列。在一些態樣中，免疫刺激性質體更佳包含pGCMB75.6的序列(SEQ ID NO：1)。

在一些態樣中，本發明是關於包含與pLacZMB75.6的序列(SEQ ID NO：4)具有至少84%序列一致性之核酸序列的免疫刺激性質體。免疫刺激性質體較佳包含與pLacZMB75.6的序列(SEQ ID NO：4)具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%序列一致性的核酸序列。在一些態樣中，免疫刺激性質體更佳包含pLacZMB75.6的序列(SEQ ID NO：4)。

在一些態樣中，本發明是關於包含與SEQ ID NO：2的序列具有至少80%序列一致性之核酸序列的免疫刺激性質體。免疫刺激性質體較佳包含與SEQ ID NO：2的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、在至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%序列一致性的核酸序列。在一些態樣中，免疫刺激性質體更較佳包含SEQ ID NO：2的序列。

在一些態樣中，本發明是關於包含與SEQ ID NO：3的序列具有至少80%序列一致性之核酸序列的免疫刺激性質體。免疫刺激性質體較佳包含與SEQ ID NO：3的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、在至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%序列一致性的核酸序列。在一些態樣中，免疫刺激性質體更佳包含SEQ ID NO：3的序列。

在一些態樣中，本發明是關於一種由與pGCMB75.6的序列(SEQ ID NO：1)具有至少89%序列一致性之核酸序列組成的免疫刺激性質體。免疫刺激性質體較佳由與pGCMB75.6的序列(SEQ ID NO：1)具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%序列一致性的核酸序列組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體更佳由pGCMB75.6的序列(SEQ ID NO：1)組成。

在一些態樣中，本發明是關於一種由與pLacZMB75.6的序列(SEQ ID NO：4)具有至少84%序列一致性之核酸序列組成的免疫刺激性質體。免疫刺激性質體較佳由與pLacZMB75.6的序列(SEQ ID NO：4)具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%序列一致性的核酸序列組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體更佳由pLacZMB75.6的序列(SEQ ID NO：4)組成。

在一些態樣中，本發明是關於一種由與SEQ ID NO：2的序列具有至少80%序列一致性之核酸序列組成的免疫刺激性質體。免疫刺激性質體較佳由與SEQ ID NO：2的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%一致性的核酸序列組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體更佳由SEQ ID NO：2的序列組成。

在一些態樣中，本發明是關於一種由與SEQ ID NO：3的序列具有至少80%序列一致性之核酸序列組成的免疫刺激性質體。免疫刺激性質體較佳由與SEQ ID NO：3的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%序列一致性的核酸序列組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體更佳由SEQ ID NO：3的序列組成。

本發明的另一個重要態樣提供能夠刺激免疫反應的免疫刺激性DNA序列或免疫刺激性質體，其包括在高度嚴苛條件下雜交至SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的核酸序列。合適的核酸序列包括那些同源的、實質上類似或等同於本發明的核酸者。在一些態樣中，同源核酸序列將與SEQ ID NO：1或各自互補序列具有至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或100%的序列相似性。在其他態樣中，同源核酸序列將與SEQ ID NO：4或各自互補序列具有至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或100%的序列相似性。在其他態樣中，同源核酸序列將與SEQ ID NO：2或各自互補序列具有至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或100%的序列相似性。在其他態樣中，同源核酸序列將與SEQ ID NO：3或各自互補序列具有至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或100%的序列相似性。序列相似性可以使用多種本技藝中已知的演算法(例如BLAST，描述於Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Biol.215：403-10,1990中)來計算。核酸可能因為遺傳密碼子簡併性而在序列方面與上述核酸有所差異。大體上，一個參考序列將有18個核苷酸，更通常為30個或更多個核苷酸，並且可以包含該組合物的整個核酸序列以供進行比較。

在本文中預期可雜交至SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3，或SEQ ID NO：4的核苷酸序列。嚴苛雜交條件包括例如在50℃或更高以及0.1X SSC(15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉)下雜交的條件。另一實例是在42℃下於50%甲醯胺、5X SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5X丹哈特氏(Denhardt’s)溶液、10%硫酸葡聚醣與20μg/ml變性、經剪切的鮭魚精子DNA的溶液中培育過夜，接著在0.1X SSC中在約65℃下洗滌。例示性嚴苛雜交條件是與上述特定條件至少約80%、85%、90%，或95%般嚴苛。其他嚴苛雜交條件為本技藝已知的，也可以用來鑑定本發明核酸的同源物(Current Protocols in Molecular Biology,Unit 6,pub.John Wiley & Sons,N.Y.1989)。

也可以使用本文所述DNA分子的突變體核苷酸，只要突變體包括保有如本文所述刺激先天性免疫反應之能力的核酸序列即可。這種突變的DNA序列通常差別在於一個或多個核苷酸或胺基酸。該序列變化可能是取代、插入，缺失或其組合。用於經選殖基因的誘變技術是本技藝中已知的。用於位點特異性誘變的方法可以在Gustin et al.,Biotechniques 14：22,1993；Barany,Gene 37：111-23,1985；Colicelli et al.,Mol.Gen.Genet.199：537-9,1985；以及Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,CSH Press 1989,pp.15.3-15.108中找到，且全部以引用的方式併入本文。歸納來說，本發明是關於核酸序列，及其變異體或突變體，它們能夠在個體中刺激先天性免疫反應。此外，本發明涵蓋由所述核酸序列編碼的中介RNA，以及任何所得胺基酸序列。

在一些態樣中，當免疫刺激性質體的核苷酸序列是由SEQ ID NO：1、2，3和4中提供之序列變化時，則在質體中的CpG二核苷酸較佳地保持不變。或者，如果質體的核苷酸序列改變，使得一個CpG二核苷酸被消除，則該質體的序列可以在另一位置處改變，使得CpG二核苷酸在質體中的總數保持不變。除了那些已經存在於pGCMB75.6或pLacZMB75.6核苷酸序列中的以外，可引入更多CpG二核苷酸至質體中。因此，舉例而言，本文所述免疫刺激性質體較佳包含至少約200個、至少約220個、至少約240個、至少約260個、至少約270個、至少約275個、至少約280個、至少約283個、至少約285個，或至少約288個CpG二核苷酸。例如，免疫刺激性質體可包含283個CpG二核苷酸。

在一些態樣中，當免疫刺激性質體的核苷酸序列是由本文提供的序列變化時，則在該質體中的CpG基序類型改變，以調節細胞溶質DNA監視分子的所得活化。例如，可以增加免疫刺激性CpG基序的數目，以增加對免疫刺激性質體/DNA的特定閾值具有反應性的特定細胞溶質DNA監視分子活化。透過更多實例，可以增加非免疫刺激性CpG基序的數目，以減少特定細胞溶質DNA監視分子的活化及/或增加其他DNA監視分子的活化。

特別是，本發明是關於包含本文所述任一種免疫刺激性質體或DNA序列及醫藥上可接受載體的醫藥調配物。

B. 免疫調節劑

在美國專利申請公開案第2012/0064151 A1號與第2013/0295167 A1號中描述與本文所述免疫刺激性質體一起使用的合適免疫調節劑組合物，這兩者的內容以整體引用的方式併入。

免疫調節劑組合物包含脂質體遞送載劑及本文所述免疫刺激性質體，或DNA序列中的至少一者。

合適的脂質體遞送載劑包含脂質組合物，其能夠將核酸分子遞送至待治療個體的組織。脂質體遞送載劑較佳能夠在個體體內維持一段充分時間的穩定，以遞送核酸分子及/或生物劑。例如，脂質體遞送載劑於接受者個體中穩定歷時至少約五分鐘、歷時至少約1小時，或歷時至少約24小時。

本發明脂質體遞送載劑包含脂質組合物，其能夠與細胞的質膜融合，以便將核酸分子遞送至細胞內。當核酸分子編碼一或多種蛋白質時，核酸：脂質體複合物較佳具有每微克(μg)遞送核酸每毫克(mg)總組織蛋白至少約1皮克(pg)表現蛋白的轉染效率。例如，核酸：脂質體複合物的轉染效率可以是每μg遞送核酸每mg總組織蛋白至少約10pg的表現蛋白；或每μg遞送核酸每mg總組織蛋白至少約50pg的表現蛋白。該複合物的轉染效率可以是低至每μg遞送核酸每mg總組織蛋白1毫微微克(fg)表現蛋白，其中上述量更佳。

本發明的較佳脂質體遞送載劑的直徑介於約100至500奈米(nm)之間。例如，脂質體遞送載劑的直徑可介於約150至450nm或介於約200與400nm之間。

合適的脂質體包括任何脂質體，例如習於技藝者所熟知的基因遞送方法。較佳的脂質體遞送載劑包括多層囊泡(MLV)脂質和擠壓脂質(extruded lipids)。製備MLV的方法在本技藝中是已知的。更佳的脂質體遞送載劑包括具有聚陽離子脂質組合物的脂質體(即，陽離子脂質體)及/或具有接合至聚乙二醇的膽固醇骨架的脂質體。例示性陽離子脂質體組合物包括，但不限於：N-[1-(2,3-二油基(dioleyl)氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)和膽固醇、N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)和膽固醇、1-[2-(油醯氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)-咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)和膽固醇、二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)和膽固醇，及其組合。用作為遞送載劑的最佳脂質體組合物包括DOTIM和膽固醇。

合適的核酸分子包括本文所述免疫刺激性質體中的任一者。編碼核酸序列編碼至少一部分蛋白質或肽，而非編碼序列不編碼蛋白質或肽的任何部分。根據本發明，「非編碼」核酸可包括一個轉錄單元的調控區，例如啟動子區。術語「空載體」可與術語「非編碼」交換使用，且特別是指在沒有蛋白質編碼部分的情況下的核酸序列，諸如不具有基因插入物的質體載體。本文所述質體編碼的蛋白質的表現對於引起免疫反應來說並非必要；因此質體不必包含任何可操作地連接至轉錄控制序列的任何編碼序列。然而，可以透過在組合物中納入編碼免疫原及/或細胞介素的核酸序列(DNA或RNA)得到更多優點(即，抗原特異性和增強的免疫力)。編碼免疫原及/或細胞介素的此等核酸序列可以被納入本文所述的免疫刺激性質體中，或者可以被納入組合物的各別核酸(例如，各別質體)中。

可使用技藝中的標準方法或如美國專利第6,693,086號(其內容以整體引用的方式併入本文)中所述方法將脂質體與本文所述免疫刺激性質體，或免疫刺激性DNA序列複合。添加至脂質體的適宜質體濃度包括有效遞送足量質體至個體中，使得全身性免疫反應得以被誘發的濃度。例如，約0.1μg至約10μg質體可以與約8nmol脂質體組合，約0.5μg至約5μg質體可以與約8nmol脂質體組合，或者大約1.0μg質體可以與約8nmol脂質體組合。在組合物中，質體對脂質的比率(μg質體：nmol脂質)可以是至少約1：1以重量計的質體：脂質(例如，1μg質體：1nmol脂質)。例如，質體對脂質的比率可以是至少約1：5，至少約1：10或至少約1：20。本文所表示的比率均是基於組合物中陽離子脂質的數量，而不是組合物中脂質的總量。在本發明的組合物中，質體對脂質的比率適當地為約1：1至約1：80以重量計的質體：脂質；約1：2至約1：40以重量計的質體：脂質；約1：3至約1：30以重量計的質體：脂質；或約1：6至約1：15以重量計的質體：脂質。

C.生物劑

除了脂質體遞送載劑和本文所述質體中的至少一者以外，本文所述免疫調節劑組合物中的任一者可進一步包含至少一種生物劑。

合適的生物劑是能有效地預防或治療疾病的藥劑。這樣的生物劑包括免疫增強蛋白、免疫原、疫苗，抗微生物劑或其任何組合。合適的免疫增強蛋白是那些已知會增強免疫力的蛋白質。透過一個非限制性實例的方式，細胞介素(其包括一個家族的蛋白質)是一種已知的免疫力增強蛋白家族。合適的免疫原是蛋白質，其會誘發體液性及/或細胞性免疫反應，使得向個體投與免疫原會發動對抗在個體組織內遭遇到之相同或類似蛋白質的免疫原特異性免疫反應。免疫原可包括由細菌、病毒，寄生蟲或真菌表現的致病性抗原。較佳的抗原包括從在個體中導致傳染病之生物衍生而來的抗原。根據本發明，免疫原可以是蛋白質的任何部分，天然存在的或合成衍生的，其誘發體液性及/或細胞性免疫反應。這樣，抗原或免疫原的大小可以是小到5至12個胺基酸，且大至全長蛋白質，包括其間的任何大小。抗原可以是多聚體蛋白或融合蛋白。抗原可以是經純化的抗原。或者，免疫增強蛋白或免疫原可以是由免疫刺激性質體或由被納入免疫調節劑組合物的另一個核酸所編碼。當免疫增強蛋白或免疫原是由在免疫調節劑組合物中的核酸分子所編碼時，將編碼免疫增強蛋白或免疫原的核酸序列可操作地連接至轉錄控制序列，使得免疫原在個體的組織中表現，藉此除了非特異性免疫反應外，還在個體體內誘發免疫原特異性免疫反應。篩選免疫原性(諸如病原體抗原免疫原性或細胞介素活性)的技術為那些習於技藝者所熟知且包括各種活體外與活體內分析。

當生物劑為疫苗時，該疫苗可以包括活的、傳染性、病毒性、細菌性，或寄生蟲疫苗或殺死的、失活化的、病毒性、細菌性或寄生蟲疫苗，或次單位疫苗，或技藝中已知的任何疫苗。一或多種疫苗可以與本發明的免疫調節劑組合物組合使用。合適的疫苗包括那些在本技藝中已知用於水生物種者。

生物劑可以是抗微生物劑。合適的抗微生物劑包括：喹諾酮類，較佳是氟喹諾酮類；β-內醯胺，以及巨環內酯-林可醯胺-鏈黴殺陽素(MLS)抗生素。

合適的喹諾酮類包括培諾沙星(benofloxacin)、賓氟沙星(binfloxacin)、西諾沙星(cinoxacin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、克林沙星(clinafloxacin)、達氟沙星(danofloxacin)、二氟沙星(difloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、恩諾沙星(enrofloxacin)、氟羅沙星(fleroxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、依巴沙星(ibafloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、麻保沙星(marbofloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、奧比沙星(orbifloxacin)、帕珠沙星(pazufloxacin)、普多沙星(pradofloxacin)、培氟沙星(perfloxacin)、沙拉沙星(sarafloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、替馬沙星(temafloxacin)和妥舒沙星(tosufloxacin)。較佳的氟喹諾酮類包括環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、莫西沙星，和普多沙星。合適的萘啶酮類(naphthyridones)包括萘啶酮酸。

合適的β-內醯胺包括青黴素(例如，阿莫西林(amoxicillin)、胺芐青黴素(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、芐星青黴素(benzathine penicillin)、芐青黴素(benzylpenicillin)、羧芐青黴素(carbenicillin)、氯唑西林(cloxacillin)、拉維酸(co-amoxiclav)[即阿莫西林(amoxicillin)/克拉維酸(clavulanic acid)]、得克西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、甲氧西林(methicillin)、美洛西林(mezlocillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、青黴素V(phenoxymethylpenicillin)、必倍西林(piperacillin)、普魯卡因青黴素(procaine penicillin)、替莫西林(temocillin)、替卡西林(ticarcillin))；頭孢菌素(例如頭孢克洛(cefaclor)、頭孢羅寧(cefalonium)、頭孢孟多(cefamandole)、頭孢立林(cefapririn)、頭孢唑林(cefazolin)、頭孢吡肟(cefepime)、頭孢克肟(cefixime)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢西丁(cefoxitin)、頭孢匹羅(cefpirome)、頭孢泊肟(cefpodoxime)、頭孢喹肟()cefquinome、頭孢他啶(ceftazidime)、頭孢噻呋(ceftiofur)、頭孢曲松(ceftriaxone)、頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢胺芐(cephalexin)、頭孢噻吩cephalothin()，和defotetan)；碳青黴烯類和青黴烯(例如多利培南(doripenem)、厄他培南(ertapenem)、法羅培南(faropenem)、亞胺培南(imipenem)和美羅培南(meropenem))；單內醯胺(例如胺曲南(aztreonam)、諾卡殺菌素A(nocardicin A)、煙草毒素-β內醯胺(tabtoxinine-β-lactam)，和替吉莫南(tigemonam))；以及β內醯胺酶抑制劑(例如克拉維酸、舒巴坦(sulbactam)、他唑巴坦(tazobactam))。較佳的β內醯胺類包括頭孢菌素，特別是頭孢唑啉。

合適的MLS抗生素包括克林黴素(clindamycin)、林可黴素(lincomycin)、吡利黴素(pirlimycin)，以及任何巨環內酯抗生素。較佳的林可醯胺抗生素是吡利黴素。

其他抗微生物劑包括胺基糖苷類、氯羥吡啶(clopidol)、地美硝唑(dimetridazole)、紅黴素(erythromycin)、新黴素 B、呋喃唑酮(furazolidone)、鹵夫酮(halofuginone)、2-吡啶酮、氯苯胍(robenidine)、磺醯胺類、四環素類、甲氧芐啶(trimethoprim)、各種截短側耳素(pleuromutilin)(例如泰妙素(tiamulin)和萬尼黴素(valnemulin))，以及各種鏈黴素(如莫能菌素(monensin)、甲基鹽黴素(narasin)，和鹽黴素(salinomycin))。

II. 方法

本發明的一個目的是提供免疫調節劑組合物、免疫刺激性質體(或DNA序列)以及方法，其刺激免疫力並為未感染的個體提供保護性免疫力、為已感染的個體提供保護性免疫力、為未感染的個體提供增強的免疫力、為已感染的個體提供增強的免疫力、為已感染的個體提供治療性免疫力，或其組合。這樣，本發明組合物可以用於預防性免疫個體或用於治療個體。本文所述方法包括向個體投與免疫刺激性質體或DNA序列，並且刺激個體體內的免疫系統。

A. 刺激個體之免疫系統的方法

本發明是關於在接受者個體體內刺激，或增強免疫系統的方法。該等方法包含向個體投與有效量的本文所述免疫調節劑組合物。在一些態樣中，免疫調節劑組合物在接受者個體中刺激免疫反應，而免疫反應有助於抵禦感染。在一些態樣中，免疫調節劑組合物活化細胞溶質DNA監視分子。在一些態樣中，當在疫苗之前投與、與疫苗共同投與、在接種疫苗之後投與，或與疫苗混合時，該免疫調節劑組合物提高了至少一種生物劑(諸如疫苗)的效力。在一些態樣中，該等方法為保護接受者個體免於傳染病以及治療患有傳染病的族群提供了嶄新的治療策略。在一些態樣中，該等方法當免疫調節劑與疫苗組合使用時，與使用沒有免疫調節劑組合物的疫苗相較之下，更為快速、更長久與更適當的保護以對抗疾病。

免疫反應可以在接受者個體中透過投與有效量的免疫調節劑組合物而被活化，該免疫調節劑組合物包括本文所述的任一種脂質體遞送載劑、本文所述任一種免疫刺激性質體(或DNA)序列，以及視情況選用本文所述任一種生物劑。預期生物劑可以與免疫調節劑混合或共同投與或單獨投與。這種單獨投與可以是在免疫調節劑投與之前或之後。還預期，使用超過一次投與的免疫調節劑或生物劑。此外，超過一種生物劑可以與免疫調節劑共同投與、在免疫調節劑之前投與、在免疫調節劑投與之後投與，或者與免疫調節劑同時投與。

B. 增進個體存活率的方法

本發明是關於增進水生物種成員之存活率的方法。增進存活率的方法包括向個體投與有效量的本文所述免疫調節劑組合物。在某些態樣中，與未接受免疫調節劑組合物的個體相比，該等方法提供了接受者個體增進的存活率。

C. 增進產量的方法

本發明是關於增進在水產養殖中養殖之水生物種成員產量的方法。增進產量的方法包括向個體投與有效量的本文所述免疫調節劑組合物。在一些態樣中，與未接受免疫調節劑組合物的個體相比，該等方法提供了接受者個體增進的產量。評估產量增進的方法在本技藝中是已知的。習於技藝者將認知到，產量增進可以藉由比較接受該免疫調節劑組合物之個體與那些未接受免疫調節劑組合物之個體間的健康、重量、尺寸、肉質，以及其他參數來進行測量。

D. 增進飼料利用率的方法

本發明是關於增進在水產養殖中養殖之水生物種成員的飼料利用率的方法。增進飼料利用率的方法包括向個體投與有效量的本文所述免疫調節劑組合物。在一些態樣中，與未接受免疫調節劑組合物的個體相比，該等方法提供了接受者個體增進的飼料利用率。評估飼料利用率的方法在本技藝中是已知的。習於技藝者將認知到，飼料利用率增進可以藉由比較接受該免疫調節劑組合物之個體與那些未接受免疫調節劑組合物之個體間的健康、重量、尺寸、肉質，以及其他參數來進行測量。

E. 增進存活率的方法

本發明是關於增進在水產養殖中養殖之水生物種成員的存活率的方法。增進存活率的方法包括向個體投與有效量的本文所述免疫調節劑組合物。在一些態樣中，與未接受免疫調節劑組合物的個體相比，該等方法提供了接受者個體增進的存活率。評估存活率的方法在本技藝中是已知的。習於技藝者將認知到，存活率增進可以藉由比較接受該免疫調節劑組合物之個體與那些未接受免疫調節劑組合物之個體間的健康、重量、尺寸、肉質，以及其他參數來進行測量。

有效量的本文所述任一免疫調節劑組合物可以被投與給個體。有效量足以在接受者個體中活化免疫反應。測量活化的方法在本技藝中是已知的。此外，習於技藝者將認知到，有效量將取決於年齡、體重，個體物種和感染階段，以及本技藝中已知的其他因素。合適的有效量範圍可以從每位受試者約0.1μg至1,000μg。在一些態樣中，有效量範圍可為約0.1μg到約10μg、約0.1μg至約5μg、約0.5μg到約5μg、約0.25μg至約5μg、約0.05μg到約10μg、約5μg至約15μg、約10μg至約15μg、約10μg至約20μg、約20μg至約30μg、約30μg至約40μg、約40μg至約50μg、約50μg至約70μg、約70μg至約90μg、約50μg至約100μg、約100μg至約150μg、約150μg至約200μg、約200μg至約250μg、約250μg至約300μg、約300μg至約350μg、約350μg至約400μg、約400μg到約450μg、約450μg至約500μg、約500μg至約550μg、約550μg至約600μg、約600μg至約650μg、約650μg至約700μg、約700μg至約750μg、約750μg至約800μg、約800μg至約850μg、約850μg至約900μg、約900μg至約950μg、約950μg至約1000μg。較佳地，在一些態樣中，有效量範圍為約0.5μg至約10μg。

F. 使用條件

本發明方法在個體體內活化免疫反應，使得個體受到保護免於會誘發免疫反應的疾病。如本文所用，詞組「保護免於疾病」是指減少疾病的症狀；降低疾病的發生；降低疾病的臨床或病理嚴重性；或減少引起疾病的病原體散布。保護個體可以指本發明的治療組合物當投與給個體時，防止疾病的發生、治癒，及/或減輕或減少疾病症狀、臨床徵象、病理學或原因的能力。這樣，保護個體免於疾病同時含括預防疾病發生(預防性治療)和治療患有疾病的個體(治療性治療)。術語「疾病」是指個體的正常健康狀態的任一種偏離，並且當出現疾病症狀時包括一個狀態時，以及出現偏離(例如感染、基因突變、基因缺陷等)但症狀尚未顯露的狀態。

本發明方法可用於預防疾病、刺激效應細胞免疫力對抗疾病、消除疾病、減輕疾病，並且防止因為原發性疾病發生所導致的繼發性疾病。

在一些態樣中，相較於投與疫苗本身，本文所述方法當與疫苗共同投與時可用於增進個體的先天性免疫反應。在一些態樣中，相較於投與疫苗本身，本文所述方法當與疫苗共同投與時可用於增進個體的後天性免疫反應。通常疫苗在投與之後不會立即保護個體，因為它需要時間來刺激後天性免疫力。術語「增進」指在本發明中，在個體體內誘發先天性免疫反應直到疫苗開始保護個體及/或經由疫苗所提供的後天性免疫力來延長保護期。

在一些態樣中，本發明的方法包括投與組合物以保護免於各種各樣病原體的感染。投與的組合物可以或可以不包括誘發某個特定反應的特定抗原。可預期的是，本發明方法將保護接受者個體免於因為傳染性微生物劑所導致的疾病，傳染性微生物劑包括，但不限於病毒、細菌，真菌和寄生蟲。習於技藝者將認知並理解到，免疫調節劑組合物，如本文所述，有效對抗眾多感染物(其不勝枚舉)。本文所提供的感染物是基於舉例為目的提供，且不受限於使用範疇來提供。

G. 投與

多種投與路徑可供選擇。選擇的特定模式，當然將取決於具體的選定生物劑、個體的年齡和整體健康狀況、待治療的具體病況和治療效力所需的劑量。本發明方法可以使用產生有效程度免疫反應活化而不引起臨床上無法接受之不利影響的任何投與模式來實施。該等組合物可以方便地以單位劑型存在並且可以透過任何技藝中熟知的方法來製備。

免疫調節劑組合物可以靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、透過噴霧、卵內、口服、眼內、氣管內、鼻內、透過浸潤、在缸盆期間經由皮膚或鰓吸收，或透過本技藝中已知的其他方法投與。在一個態樣中，皮下投與免疫調節劑。在另一個態樣中，肌肉內投與免疫調節劑。在另一個態樣中，該免疫調節劑作為噴霧投與。在另一個態樣中，可以口服投與該免疫調節劑。在另一個態樣中，可以皮下投與該免疫調節劑。

在一個態樣中，該免疫調節劑本身可以在攻擊(或感染)之前投與給個體。在另一個態樣中，該免疫調節劑本身可以在攻擊(或感染)之後投與給個體。在另一個態樣中，該免疫調節劑本身可以在攻擊(或感染)同時投與給個體。

在一些態樣中，該免疫調節劑組合物可以在攻擊之前與接種同時共同投與。在一些態樣中，該免疫調節劑組合物可以在攻擊(或感染)同時與免疫接種在同時共同給與。在一些態樣中，共同投與可以包括在相鄰兩個不同位點處投與疫苗及免疫調節劑至個體的相同大致位置中(即，在個體頸部的彼此相鄰處注射)，在大致相同位置處之個體的相反側(即，一個在頸部的一側)，或在同一個體的不同位置處。在一些態樣中，該免疫調節劑組合物可以在接種與攻擊之前投與。在一些態樣中，該免疫調節劑組合物可在接種之後但在攻擊之前投與。免疫調節劑組合物可以在攻擊後投與給在攻擊(或感染)之前已接種疫苗的個體。

習於技藝者將認知到，投與路徑可根據個體以及個體的健康狀況或狀態而改變。所提供的投與路徑是以示範為目的，並且在不受限制的情況下提供。

接種可在任何年齡時執行。可以皮下、透過噴霧、眼內、氣管內、鼻內、卵內、透過浸潤，或透過技藝中已知的其他方法投與疫苗。口服疫苗可以在飼料或水中投與。此外，可預期的是，本發明方法可根據常規接種時間表來使用。

免疫調節劑組合物也可經皮下、透過眼內、氣管內、鼻內、卵內，或透過技藝中已知的其他方法投與。例如，該免疫調節劑組合物可卵內投與。或者，該免疫調節劑組合物可作為噴霧投與。

可以在攻擊(或感染)之前或攻擊之後向卵進行投與。

該免疫調節劑可在攻擊之前約1天至約14天，或在攻擊之後約1天至約14天被投與給個體。例如，該免疫調節劑可以在攻擊前約1天至約7天或攻擊後約1天至約7天被投與。免疫調節劑適合在攻擊前1、2、3、4、5、6、7天或攻擊後1、2、3、4、5、6、7天被投與。

其他遞送系統可以包括時間-釋放、延遲釋放，或持續釋放遞送系統。此等系統可避免重複投與組合物，因而增加便利性。許多類型的釋放遞送系統是可用的且為技藝中具有通常知識者所熟知。它們包括基於聚合物的系統，例如聚(乳酸交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己內酯、聚酯醯胺、聚原酸酯、聚羥基丁酸以及聚酐。含有藥物的前述聚合物的微膠囊描述於例如美國專利第5,075,109號中。

遞送系統亦包括本身為脂質之非聚合物系統，脂質包括甾醇(例如膽固醇、膽固醇酯)，以及脂肪酸或中性脂肪(例如單-、二-和三甘油酯)；水凝膠釋放系統；矽橡膠系統；基於肽的系統；蠟塗料；壓縮錠劑，使用常規黏合劑和賦形劑；部分融合的植入物；以及類似物。具體實例包括，但不限於本發明的藥劑呈某個形式納入基質中的侵蝕系統，例如那些在美國專利第4,452,775號、第4,675,189號與第5,736,152號中所述者，以及擴散系統，其中活性組分以控制速率從聚合物滲入，如在美國專利第3,854,480號、第5,133,974號與第5,407,686號中所述。此外，可使用基於泵的硬體遞送系統，其中一些適於植入。

由於在上述組合物、產品及方法中可在不偏離本發明範疇的情況下進行改變，希望上述說明中以及下文實例中所包含的所有內容應被解釋為說明性的而不具有限制意義。

定義

術語「有效量」指需要或足以實現期望生物學效果的數量。例如，用於治療或預防傳染病的有效量免疫調節劑是必要的，以使在暴露於微生物之後發展出免疫反應，從而使個體內的微生物數量減少且較佳根除微生物的數量。任何特定應用的有效量可依據如下的因素而改變：待治療的疾病或病況、受試者的大小，或疾病或病況的嚴重性。本技藝中具有通常技術者可憑經驗確定免疫調節劑的有效量而不需要過度實驗。

術語「細胞介素」是指一個免疫增強蛋白家族。細胞介素家族包括造血生長因子、介白素、干擾素、免疫球蛋白超家族分子、腫瘤壞死因子(TNF)家族分子及趨化介素(即調控細胞，特別是吞噬細胞遷移和活化的蛋白質)。例示性細胞介素包括，但不限於介白素-2(IL-2)、介白素-12(IL-12)、介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)、干擾素α(IFN-α)以及干擾素γ(IFN-γ)。

術語「誘發」可與術語活化、刺激、產生或上調交替使用。

術語在個體中「誘發免疫反應」是指特異性地控制或影響免疫反應活性，且可包括活化免疫反應、上調免疫反應、增強免疫反應及/或改變免疫反應(例如透過誘發某型免疫反應，從而將個體體內的一個主要免疫反應類型從有害或無效轉換成有益或具有保護性)。

術語「可操作地連接」意指以分子在轉染(亦即轉形、轉導或轉染)至細胞中時能夠被表現的方式，將核酸分子連接至轉錄控制序列。轉錄控制序列是控制轉錄的起始、延長和終止的序列。特別重要的轉錄控制序列是那些控制轉錄起始的序列，諸如啟動子、增強子、操縱子和抑制子序列。各種這樣的轉錄控制序列是習於技藝者已知的。較佳的轉錄控制序列包括那些在禽類、魚類、哺乳動物、細菌、病毒，植物和昆蟲細胞中產生作用的序列。儘管本發明可使用任一種轉錄控制序列，但該等序列可以包括天然的轉錄控制序列，其與編碼免疫原或免疫刺激蛋白的序列自然締合。

術語「核酸分子」與「核酸序列」可交替使用，並包括DNA、RNA，或DNA或RNA的衍生物。該等術語還包括寡核苷酸，以及較大的序列(諸如質體，諸如本文所述免疫刺激性質體)，並且包括編碼蛋白質或其片段的核酸分子，還有包含調控區、內含子或其他非編碼DNA或RNA的核酸分子。通常，寡核苷酸具有約1個至約500個核苷酸的核酸序列，且更通常長度為至少約5個核苷酸。核酸分子可以衍生自任何來源，包括哺乳動物、魚類、細菌、昆蟲、病毒、植物、合成來源或其組合。核酸分子可以透過技藝中普遍已知的方法(諸如重組DNA技術(例如，聚合酶鏈反應(PCR)、擴增、選殖)或化學合成來製造。核酸分子包括天然的核酸分子及其同源物，包括但不限於天然對偶基因變異體和經修飾核酸分子，其中以此等修飾實質上不干擾核酸分子誘發可用於本發明方法中之免疫反應之能力這樣的方式插入、缺失、取代，或倒置核苷酸。核酸同源物可以使用多種習於技藝者已知的方法來生產(參見，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labs Press,1989)，其以引用的方式併入本文。

術語「可選擇標記」與「可選擇標記基因」意指編碼保護生物體之產物的基因，其中基因是從選擇劑(例如，抗生素)表現或通常會殺死生物體或抑制其生長的情況。可選擇標記基因是最常見的抗生素抗性基因(例如，康黴素抗性基因、胺芐青黴素抗性基因、氯黴素抗性基因、四環素抗性基因等)。因此，例如當大腸桿菌細胞進行轉形程序而引入編碼康黴素抗性基因的質體，然後生長在含有康黴素的培養基之上或其中時，只有已成功攝入質體並表現康黴素抗性基因的大腸桿菌細胞會存活下來。術語「可選擇標記」與「可選擇標記基因」也包括編碼涉入化合物合成之酶的基因，該化合物對於生物體生長來說是必需的。在引入不能合成必需化合物的營養缺陷型生物體時，這些基因允許生物體生長在已補充有必需化合物的培養基中。例如，因為在一個涉及離胺酸生物合成的酶突變或不存在，胺基酸離胺酸營養缺陷型的細菌細胞無法在未補充離胺酸的培養基上生長。當此等細菌進行轉形程序而引入編碼涉及離胺酸生物合成的酶的質體時，已成功攝入質體並表現酶的細菌將會在未補充離胺酸的培養基上生長而存活下來。術語「可選擇標記」與「可選擇標記基因」進一步包括允許毒物/解毒劑選擇的基因。例如，ccdB基因編碼結合至DNA迴旋酶的蛋白質，DNA迴旋酶對細胞分裂來說是必要的蛋白質。在結合至DNA迴旋酶之後，ccdB基因產物削弱基因複製且引起細胞死亡。因此，表現ccdB基因產物的細菌無法存活下來。ccdA基因編碼充當ccdB基因產物的天然抑制劑的蛋白質(以下簡稱「解毒劑」)。因此，當在其細菌基因組中具有ccdB基因的細菌接受轉形程序而引入編碼ccdA基因產物的質體時，只有成功攝入質體並表現ccdA基因的細胞會存活下來。

術語「可篩選標記」與「可篩選標記基因」意指編碼一種產物的基因，該產物允許觀察者區別表現可篩選標記基因的細胞以及未表現可篩選標記基因的細胞。可篩選標記基因系統是本技藝中已知的，包括例如lacZ基因和編碼螢光蛋白的基因，螢光蛋白為諸如綠色螢光蛋白(GFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、紅色螢光蛋白(RFP)、藍色螢光蛋白(BFP)，或青色螢光蛋白(CFP)。

如本文所用，「增進產量」意指在接受免疫調節劑組合物的個體與未接受免疫調節劑組合物的個體間增進諸如健康、體重、尺寸、肉質，或其他參數的測量值。

如本文所用，「增進存活率」意指相較於未接受免疫調節劑組合物的個體，增進接受者個體的存活率。

如本文所用，術語「個體」意指水生物種的成員，包括任何相當多樣的水生物種。個體可能是水生物種的任一成員，無論是圈養還是野生的，並可能在商業上飼養以供繁殖，產肉或產蛋。例示性水生物種包括，但不限於生活在淡水或鹹水中的魚類、甲殼類、軟體類的任何物種。代表性品種包括，但不限於魚包括脊索動物門、脊椎動物亞門和魚超綱的任何成員。透過更多實例，但不限於，例如魚類包括鯰魚、河鯰、黑鮰、黃鮰、棕鮰、鯉魚、鯽魚、鱒魚、虹鱒、褐鱒、斑點溪鱒、鮭魚、大西洋鮭、銀鮭、齊奴克或者高鰭粗鰭鮭、鬚鱥、擬鯉、梭子魚、暗斑梭鱸、鰨、鰈、鰤魚、鱸魚、小口鱸、大口鱸、條紋鱸、銀花鱸、虱目魚、吳郭魚、烏魚、鱔魚、鱈魚，以及其他任何各種物種或水生物種，使用其來實施本發明對於習於技藝者來說將是顯而易見。在一些態樣中，個體可能被診斷帶有傳染病、可能處於傳染病的風險下，或者可能正經歷傳染病。個體可以是任何年齡，包括卵內、新生、少年、成年、中年，或老年。

實例

提供下列非限制性實例以供進一步說明本發明。

實例1. 當與失活化IPNV抗原一起調配使用IPNV同棲攻擊時，接受DNA免疫調節劑的大西洋鮭的評估

本研究的目的是要確定在IPNV共棲之前，投與給鮭魚之DNA免疫調節劑的效力。

免疫調節劑

在本研究中所用的DNA免疫調節劑是含有CpG二核苷酸序列的質體DNA脂質體複合物。質體DNA是由SEQ ID NO：2 所表示的pMB75.6質體。質體DNA脂質體複合物調配在5%葡萄糖溶液中。

在本研究中所用的Montanide油(Montanide ISA 763 A)是可代謝的油，其為第I類佐劑，提供強大和長期免疫反應。Montanide ISA 763 A VG由Seppic供應，含有可注射、可代謝油(不含有礦物油)以及由甘露醇和植物來源的純化油酸得到的極精製乳化劑。

IPNV抗原

在CHSE-214細胞株中傳播IPNV(傳染性胰臟壞死病毒)，直到達到100%細胞病變效用(CPE)。抗原經福馬林不活化並且與上列免疫調節劑中的任一者組合調配，在各種治療中均為恆定濃度。

Alpha Ject® 2-2

這個商業上可購得的疫苗用作為對照。疫苗是用於防止魚類因為(癤瘡furunculose)和IPNV感染導致死亡的油乳液。

IPNV抗原疫苗調配物

IPNV抗原經調配成與DNA免疫調節劑或Montanide油組合的單價疫苗，呈三種不同濃度/比率。治療組合物歸納示於表2中。

研究動物

從供應商獲得未經免疫接種且免疫狀態經紀錄的大西洋鮭(Salmo salar)。性成熟，受傷或變形的魚被排除研究。在三個魚槽中，魚分成12個具有30隻魚的治療組，每個槽總計有360隻治療魚。在三個槽的每一者中，由72隻魚組成的另一組用作為散播組(shedder)，或積極散播IPNV的魚。投與疫苗之前，將試驗魚麻醉並藉由在治療日之前兩週注入PIT標誌而被標記。

研究設計

在投與疫苗之前，魚受餓最少48小時。治療組在治療當天分別投與上面表2中所述不同劑量的疫苗或對照物質。疫苗或對照物質是按照表2腹膜內投噢。在三個水槽中進行研究。每個水槽有12組各具有30隻魚的實驗組。兩個槽用作重複以供攻擊實驗用(槽1和2，表3)。第三個槽在免疫調節研究期間用於取樣(槽3，表3)。

在最少600度日後(大約接種後6週以及光週期操縱)，將攻擊實驗轉移到海水執行。供毒前，魚受餓最少25小時。所有槽同時攻擊。散播組腹膜內注射培養的病毒並且藉由在攻擊時切割脂鰭做標記。注射和標記之後，分別引入散播組。來自槽1和2的魚被分配到槽M5和M6，而來自槽3的魚被轉移到槽M2。

取樣

對於每一個時間點，魚被宰殺並取得組織(如頭腎、肝、脾)樣品用於免疫剖析(immunoprofiling)。也收集血液用於血清學及/或轉錄體分析。在每個時間點，每個處裡有5隻魚被宰殺並取樣。免疫接種前，從一般群體取樣10隻魚。免疫接種後，於免疫接種後24和48小時收集槽3的樣品。在攻擊後，槽1與2的樣品進行標準驗證性損失(死亡率為10%)。在攻擊後3天和7天後收集槽3的樣品。在攻擊期結束時，存活的魚被宰殺並取樣。

對IPNV攻擊槽(槽1和2)的代表性選擇死魚的腎臟進行取樣並在IPNV Ag ELISA中測試。該選擇是在死亡開始、中段與結束時進行，死亡率至多為魚的總計10%(30隻/槽)。

攻擊期間，代表性選擇的死魚(~納入試驗的魚總數的10%)進行細菌學檢查。

結果

引入散播組之後，攻擊研究被允許前進，直至死亡率趨於平緩或陰性對照組達到了100%。於槽1和2中，在傳染後第22和28天之間達到死亡率高原(圖4及圖5)。

死魚用IPNV Ag ELISA和細菌學分析進行採樣。IPNV Ag ELISA測試顯示，槽M6中有75.5%的魚為IPNV陽性，槽M5中有62.5%的魚為IPNV陽性，而在槽M2中只有35.2%的魚為IPNV陽性(表4)。從死亡的10%取得樣品提交至細菌學分析。槽M5、M6和M2的魚身上沒有細菌生長的樣品百分比分別為77.5%、64.9%及98.1%(表5)。隨後記錄的大多數死亡率為細菌生長陰性。

測定數據合併後的卡本-麥爾存活曲線，以理解和比較各處理組(組A至L)的存活時間。如在圖6中所觀察，在兩個不同群體中的存活概率被隱蔽。具有較低存活概率的群體是由用葡萄糖處理的魚(A)或3種不同劑量DNA免疫調節劑但沒有抗原處理的魚(B，C和D)組成，而呈現出更大的存活概率的族群是由只用IPNV抗原處理(E)、IPNV抗原與DNA免疫調節劑調配(F，G和H)或用Montanide油(I，J和K)，與商用疫苗(L)組成。當作為整體進行比較時，12個不同處理之間的存活曲線發現有統計顯著差異(卡方=110.6，df=11；p-值(<0.0001)=2.2x10-16)。

處理分在2各不同群中(圖7)。一群包括葡萄糖-治療(A)，以及DNA免疫調節劑但無抗原治療(B、C、D)。另一群是由只用IPNV抗原處理(E)、DNA免疫調節劑調配的疫苗處理(F、G、H)、Montanide油調配的抗原(I、J、K)，與商用疫苗(L)處理的魚組成。

兩群之間的顯著差異明顯，從而證實相較於陰性對照，魚存活率是因為接種疫苗而明顯增進，但是不同疫苗調配物之間沒有區別。

在實驗結束(RPSend)時計算所有處理組的相對存活百分比(圖8)。5%葡萄糖陰性對照組與所有調配疫苗之間測定有顯著差異。

使用史匹柏規模來評估用於調配疫苗之佐劑的可能負面影響。沒有觀察到特殊繼發效應。組織病變幾乎不存在的，只是在商用產品中偶有2級(低)計分及色素沉著，DNA免疫調節劑有1級計分(表6)。在任何取樣的魚隻中沒有偵測到疫苗殘留物。

結論

在本研究中，在大西洋鮭中評估與作為疫苗之滅活IPNV調配的DNA免疫調節劑的效力。當DNA免疫調節劑被單獨投藥時(治療B、C和D)，它給予最少的保護，其中死亡率範圍介於93.3%至100%之間而存活概率與只有葡萄糖的對照組沒有顯著差異。預期是因為由DNA免疫調節劑誘發的先天性免疫反應最有可能被攻擊時間點消除(588度日或免疫接種後大約7週)，雖然這不是目前研究中要被評估的。

如在圖8中所描繪，與5%葡萄糖組相比，單獨IPNV滅活的抗原存在就足夠明顯增加經免疫接種魚隻的存活概率，RPSend為21.4%。用DNA免疫調節劑的輔佐調配物(F=28.7%，G=42.9%，H=41.1%)和Montanide的輔佐調配物(I=42.9%，J=39.3%，K=23.2%)則進一步增加包護。在安全性方面，沒有紀錄有任何問題且DNA免疫調節劑被視為在魚類中使用是安全的。

本研究顯示，DNA免疫調節劑作為魚類疫苗佐劑的潛在用途，它在10μg或更低投與時能有助於在大西洋鮭體內引起免疫反應，以及其安全性概況。

當介紹本發明的要素或其較佳具體例(等)時，冠詞「一(a、an)」、「該(the)」和「該(said)」意欲表示有一或多個要素。術語「包含」、「包括」與「具有」意欲具有包容性，並且表示可以有所列要素以外的其他要素。

鑑於以上情況，可以看出本發明的幾個目的並獲得其他有利結果。

因為可以對上述的產品，組合物和方法進行變化，而不偏離本發明範疇的情況下，希望包含在上面說明和顯示在附圖中的所有內容應被解釋為說明性並且不具有限制意義。

<110>

<120> 水生物種中增強之免疫反應

<130> BAYR

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

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<223> 質體pGCMB75.6的核苷酸序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 質體pMB75.6的核苷酸序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 質體pMB75.6_AscI的核苷酸序列

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<212> DNA

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<223> 質體pLacZMB75.6的核苷酸序列

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Claims

一種有效量的免疫調節劑組合物的用途，其用於製造投與免疫原時治療或預防水生物種個體中感染的醫藥品，其中該免疫調節劑組合物包含與選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO；3及SEQ ID NO：4組成之群組的序列具有至少80%序列一致性的核酸序列，以及脂質體遞送載劑，其包含選自由以下組成之群組的脂質對：N-[1-(2,3-二油基(dioleyl)氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)和膽固醇；N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)和膽固醇；1-[2-(油醯氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)-咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)和膽固醇；二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)和膽固醇。
如請求項1之用途，其中該醫藥品投與是在暴露於包含免疫原的感染物之前。
如請求項1之用途，其中該醫藥品投與是在暴露於包含免疫原的感染物之後。
如請求項1之用途，其中該水生物種個體為魚。
如請求項4之用途，其中該魚為鮭。
如請求項4之用途，其中該魚為鯰魚。
如請求項4之用途，其中該魚為鯉魚。
如請求項4之用途，其中該魚為鱒魚。
如請求項4之用途，其中該魚為鰤魚。
如請求項4之用途，其中該魚為鱸魚。
如請求項4之用途，其中該個體為水產養殖中養殖的魚。
如請求項1之用途，進一步包含醫藥上可接受之載體。
一種免疫調節劑組合物之用途，其用於製造增進魚的存活率的醫藥品，其中該免疫調節劑組合物包含與選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4組成之群組的序列具有至少80%序列一致性的核酸序列，以及脂質體遞送載劑，其包含選自由以下組成之群組的脂質對：N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)和膽固醇；N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)和膽固醇；1-[2-(油醯氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)-咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)和膽固醇；二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)和膽固醇。
一種免疫調節劑組合物之用途，其用於製造增進水生物種對疫苗抗原之免疫反應的醫藥品，其中該免疫調節劑組合物包含與選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4組成之群組的序列具有至少80%序列一致性的核酸序列，以及脂質體遞送載劑，其包含選自由以下組成之群組的脂質對：N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)和膽固醇；N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)和膽固醇；1-[2-(油醯氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)-咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)和膽固醇；二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)和膽固醇。
如請求項1之用途，其中該免疫調節劑組合物包含與選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4組成之群組的序列具有至少80%序列一致性的核酸序列。
如請求項13之用途，其中該免疫調節劑組合物包含與選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4組成之群組的序列具有至少80%序列一致性的核酸序列。
如請求項14之用途，其中該免疫調節劑組合物包含與選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4組成之群組的序列具有至少80%序列一致性的核酸序列。