KR20180021874A - 시토졸 dna 감시 분자의 조절 방법 - Google Patents

시토졸 dna 감시 분자의 조절 방법 Download PDF

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KR20180021874A
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토마스 일크
앨버트 아브라함
제이슨 니켈
다니엘 케일
크리슈티안 바이쓰
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바이엘 애니멀 헬스 게엠베하
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Abstract

본 발명은 일반적으로 특정 선천적 면역성 신호 분자 및 경로를 활성화시킴으로써 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다. 특히, 면역조절자 조성물은 선천적 면역성 신호 분자 및 경로를 자극시키는데 사용된다.

Description

시토졸 DNA 감시 분자의 조절 방법 {METHODS OF MODULATING CYTOSOLIC DNA SURVEILLANCE MOLECULES}
교차-참조
본 출원은 "METHODS OF MODULATING CYTOSOLIC DNA SURVEILLANCE MOLECULES," 라는 제목으로 2015 년 6 월 26 일에 출원된, 미국 가특허출원 제 62/185,230 호의 35 U.S.C §119(e) 에 따른 우선권을 주장한다 (이 내용은 본원에 그 전체가 참조로서 인용됨).
기술분야
본 발명은 일반적으로 특정한 선천적 면역성 신호 분자 및 경로를 활성화함으로써 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다. 특히, 면역조절자 조성물은 선천적 면역성 신호 분자 및 경로를 자극하기 위해 사용된다.
발명의 요약
본 발명은 선천적 면역성 신호 분자 및 경로를 조정하기 위한 면역자극성 플라스미드의 사용 방법에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 의 서열과 적어도 89% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 4 의 서열과 적어도 84% 서열 일치성을 갖는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 1 의 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 4 의 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 2 의 서열을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 3 의 서열을 포함할 수 있다.
다른 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 의 서열과 적어도 89% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열 또는 이의 조합으로 이루어질 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 4 의 서열과 적어도 84% 서열 일치성을 갖는 핵산 분자로 이루어질 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 1 의 서열로 이루어질 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 4 의 서열로 이루어질 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 2 의 서열로 이루어질 수 있다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 SEQ ID NO: 3 의 서열로 이루어질 수 있다.
일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 전장 또는 기능적 선택가능 또는 선별가능 마커를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 다른 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 항생제 내성 유전자가 아닌 선택가능 또는 선별가능 마커를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된, 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열 중 임의의 것 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제형에 관한 것이다.
본 발명은 나아가 양이온성 리포좀 전달 비히클, 및 본원에 기재된, 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열 중 임의의 것을 포함하는 면역조절자 조성물에 관한 것이다.
일부 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된, 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열의 사용 방법에 관한 것이다. 적합한 사용 방법은 대상체로의 치료적 투여를 포함한다. 이러한 치료적 투여는 예방 치료, 집단예방 (metaphylactic) 치료, 및 대상체 또는 대상체들의 감염후 치료를 포함한다.
본 발명은 대상체에서 면역 반응을 자극 또는 유발시키는 방법에 관한 것이다. 일부 양상에서, 본 방법은 대상체에 본원에 기재된 면역조절자 조성물을 투여함으로써 대상체에서 면역 반응을 자극하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 본 방법은 대상체에 본원에 기재된, 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열을 투여함으로써 대상체에서 면역 반응을 자극하는 것을 포함한다.
방법은 또한 항미생물제를 대상체에게 SEQ ID NO:1 과 적어도 80% 상동성을 갖는 핵산 서열 및 지질 전달 비히클을 포함하는 면역조절자 조성물과의 조합으로 투여하는 것을 포함하며, 상기 조합이 대상체에서 체중을 증가시키는, 소 호흡기 질환으로 진단된 소의 증체량 증가를 제공한다.
또한 본원에 제공되는 것은 항미생물제를 대상체에게 SEQ ID NO:4 와 적어도 80% 상동성을 갖는 핵산 서열 및 지질 전달 비히클을 포함하는 면역조절자 조성물과의 조합으로 투여하는 것을 포함하며, 상기 조합이 대상체에서 체중을 증가시키는, 소 호흡기 질환으로 진단된 소의 증체량을 증가시키는 방법이다.
다른 과제 및 특징은 일부는 명백하고 일부는 본원에 이하에서 지적될 것이다.
하기의 도면은 본 발명의 명세서의 일부를 형성하고, 이는 본 발명의 특정 양상들을 추가로 입증하도록 포함된다. 이들 도면들 중 하나 이상을 본원에 제시된 특정 구현예들의 상세한 설명과 조합하여 참조함으로써 본 발명이 더 양호하게 이해될 것이다.
도 1 은 pMB75.6 플라스미드 (SEQ ID NO: 2) 의 맵을 보여준다;
도 2 는 pGCMB75.6 플라스미드 (SEQ ID NO: 1) 의 맵을 보여준다;
도 3 은 pLacZ75.6 플라스미드 (SEQ ID NO: 4) 의 맵을 보여준다;
도 4 는 대조군 (빨간색, 사각형, PBS 대조군) 과 비교한 IRF-3 의 IFN α1 (파란색, 다이아몬드) 활성화를 그래프로 나타낸다;
도 5 는 IRF-THP-1 세포를 본원에 기재된 면역조절자 조성물 또는 양성 대조군 (INFα1) 과 접촉시킨 결과를 그래프로 나타낸다. 면역조절자 조성물에는 SEQ ID NO. 2 DNA 비제형화된 것 (Seq No 2), 및 SEQ ID NO. 2 DNA 리포좀 운반체로 제형화된 것 (Seq No 2-F) 이 포함되었다.
도 6 은 IRF-3 리포터로 안정하게 트랜스펙션된 IRF-THP-1 세포를, 본원에 기재된 면역조절자 조성물과 접촉시킨 결과를 그래프로 나타낸다. 면역조절자 조성물에는 SEQ ID NO. 2 DNA 비제형화된 것 (파란색, 다이아몬드, Seq No 2), SEQ ID NO. 1 DNA 비제형화된 것 (빨간색, 사각형, Seq No 1), SEQ ID NO. 2-제형화된 것 (Seq No. 2-F, 초록색, 삼각형), SEQ ID NO. 1 제형화된 것 (Seq No 1-F, 보라색, 엑스자형), 및 PBS (음성 대조군, 파란색, 별형) 가 포함되었다;
도 7 은 IRF-THP-1 세포를 본원에 기재된 면역조절자 조성물 (195 ng/mL) 및 공지된 표준 리간드 도구 (250 ng/mL) 와 접촉시킨 결과를 그래프로 나타낸다. 면역조절자 조성물에는 SEQ ID NO. 2 비제형화된 것 (Seq No 2), SEQ ID NO. 1 비제형화된 것 (Seq No 1), SEQ ID NO. 2-제형화된 것 (Seq No 2-Form), SEQ ID NO. 1 제형화된 것 (Seq No 1-Form) 및 DOTIM/콜레스테롤 (제형 단독), 및 PBS 대조군 (음성 대조군) 이 포함되었다. 공지된 표준 리간드 도구에는 HSV-60-Lyovec; VACV-Lyovec; POLY-(dA/dT)-Lyovec 이 포함되었다;
도 8 은 IRF-THP-1 세포를, 본원에 기재된 면역조절자 조성물 (195 ng/mL) 및 공지된 표준 리간드 도구 (1000 ng/mL) 와 접촉시킨 결과를 그래프로 나타낸다. 면역조절자 조성물에는 SEQ ID NO. 2 비제형화된 것 (Seq No 2), SEQ ID NO. 1 비제형화된 것 (Seq No 1), SEQ ID NO. 2-제형화된 것 (Seq No 2-Form), SEQ ID NO. 1 제형화된 것 (Seq NO 1-Form) 및 DOTIM (제형 단독), 및 PBS 대조군 (음성 대조군) 이 포함되었다. 공지된 표준 리간드 도구에는 HSV-60-Lyovec; VACV-Lyovec; POLY-(dA/dT)-Lyovec 이 포함되었다;
도 9 는 IRF-THP-1 세포를, 공지된 시토졸 DNA 인지 활성화제 (HSV-60; 빨간색, 사각형; VACV 70; 초록색, 삼각형; POLY, 보라색, 엑스자형; PBS 음성 대조군, 파란색, 엑스자형; 리포좀, 파란색, 다이아몬드) 와 접촉시킨 결과를 그래프로 나타낸다;
도 10 은 IRF-THP-1 세포를, 본원에 기재된 면역조절자 조성물과 접촉시킨 결과를 그래프로 나타낸다. 면역조절자 조성물에는 SEQ ID NO. 2 (Seq No 2, 파란색, 다이아몬드); SEQ ID NO. 1 (Seq No 1, 빨간색, 사각형); SEQ ID NO. 2 + 리포좀 (Seq No 2-F, 초록색, 삼각형); SEQ ID NO. 1 + 리포좀 (Seq No 1, 보라색, 엑스자형); 및 PBS 음성 대조군 (파란색, 엑스자형) 이 포함되었다;
도 11 은 SEAP 신호를 측정하는 IRF-THP-1 세포에서 1.5 - 50 ㎍/mL 의 농도 범위에 걸친, IFN-α1 (파란색, 다이아몬드), SEQ ID NO. 2 비제형화된 것 (Seq No 2, 빨간색, 사각형), SEQ ID NO. 2 제형화된 것 (Seq No 2-F, 초록색, 삼각형), 및 PBS 대조군 (보라색, 엑스자형) 의 용량 반응 곡선을 나타낸다;
도 12 는 SEAP 신호를 측정하는 IRF-THP-1 세포에서 0.3 - 25 ㎍/mL 의 농도 범위에 걸친, SEQ ID NO. 2 비제형화된 것 (Seq No 2, 파란색 다이아몬드), SEQ ID NO. 1 비제형화된 것 (Seq No 1, 빨간색, 사각형), SEQ ID NO. 2 제형화된 것 (Seq No 2-F, 초록색, 삼각형), SEQ ID NO. 1 제형화된 것 (Seq No 1-F, 보라색, 엑스자형), 및 PBS 대조군 (검은색, 사각형) 의 용량 반응 곡선을 나타낸다;
도 13 은 SEQ ID NO. 2 비제형화된 것 (Seq No 2), SEQ ID NO. 1 비제형화된 것 (Seq No 1), SEQ ID NO. 2-제형화된 것 (Seq No 2-F), SEQ ID NO. 1 제형화된 것 (Seq No 1-F) 및 리포좀/제형 단독, PBS 대조군 (음성 대조군), 및 HSV-60-Lyovec; VACV-Lyovec; 및 Poly-(dA/dT)-Lyovec 를 포함하는 공지된 표준 리간드 도구와 접촉된 IRF-THP-1 세포의 자극을 그래프로 나타낸다;
도 14 는 SEQ ID NO. 2 비제형화된 (Seq No 2), SEQ ID NO. 1 비제형화된 것 (Seq No 1), SEQ ID NO 2-제형화된 것 (Seq No 2-Form), SEQ ID NO. 1 제형화된 것 (Seq No 1-Form) 및 리포좀/제형 단독, PBS 대조군 (음성 대조군), 및 HSV-60-Lyovec; VACV-Lyovec; 및 POLY-(dA/dT)-Lyovec 를 포함하는 공지된 표준 리간드 도구와 접촉된 IRF-THP-1 세포의 자극을 그래프로 나타낸다;
도 15 는 SEQ ID NO. 2 비제형화된 것 (Seq No 2), SEQ ID NO. 1 비제형화된 것 (Seq No 1), SEQ ID NO. 2-제형화된 것 (Seq No 2-Form), SEQ ID NO. 1 제형화된 것 (Seq No 1-Form), PBS 대조군 (음성 대조군), HSV-60-Lyovec; VACV-Lyovec; 및 POLY-(dA/dT)-Lyovec, Lyovec 단독을 포함하는 공지된 표준 리간드 도구, 및 LyoVec 로 제형화된 SEQ ID NO. 2, LyoVec 로 제형화된 SEQ ID NO. 1, 및 IFN-α1 과 접촉된 IRF-THP-1 세포의 자극을 그래프로 나타낸다;
도 16 은 비제형화된 (SEQ ID NO. 2-네이키드, 초록색 삼각형; 및 SEQ ID NO. 1 네이키드, 오렌지색 원형), 리포좀-제형화된 것 (Seq No 2-F, 파란색 다이아몬드; 및 Seq No 1-F, 보라색 엑스자형), 및 LyoVec-제형화된 것 (Seq No 2-LyoVec, 빨간색 사각형; 및 Seq No 1 LyoVec, 파란색 별형) 으로서 IRF-THP-1 세포에서의 SEQ ID NO. 2 및 SEQ ID NO. 1 의 용량 반응 곡선을 나타낸다;
도 17 은 Seq No 2/LyoVec (파란색, 다이아몬드), Seq No 1/LyoVec (빨간색, 사각형), LyoVec 단독 (초록색, 삼각형), 빈칸 (파란색, 별형), 및 IFNα1 (오렌지색, 원형) 을 포함하는 LyoVec 트랜스펙션제로 제형화된 것으로서 IRF-THP-1 세포에서의 SEQ ID NO. 2 및 SEQ ID NO. 1 의 용량 반응 곡선을 나타낸다;
도 18 은 SEQ ID NO. 2/ Mirus (Seq No 2, 파란색, 다이아몬드), SEQ ID NO. 1/ Mirus (Seq No 1, 빨간색, 사각형), Mirus 단독 (초록색, 삼각형), SEQ ID NO. 2 비제형화된 것 (Seq No 2, 보라색, 엑스자형), 빈칸 (파란색, 별형), 및 IFNα1 (오렌지색, 원형) 을 포함하는 Mirus 트랜스펙션제로 제형화된 것으로서 IRF-THP-1 세포에서의 SEQ ID NO. 2 및 SEQ ID NO. 1 의 용량 반응 곡선을 나타낸다;
도 19 는 SEQ ID NO. 2/ X-tremeGen (Seq No 2/XtremeGen, 파란색, 다이아몬드), SEQ ID NO. 1/ X-tremeGen (Seq No 1/xtremeGen, 빨간색, 사각형), X-tremeGen 단독 (초록색, 삼각형), SEQ ID NO. 1 비제형화된 것 (Seq No 1, 보라색, 엑스자형), 빈칸 (파란색, 별형), 및 IFNα1 (오렌지색, 원형) 을 포함하는 X-tremeGen 트랜스펙션제로 제형화된 것으로서 IRF-THP-1 세포에서의 SEQ ID NO. 2 및 SEQ ID NO. 1 의 용량 반응 곡선을 나타낸다;
도 20 은 IFNα1 양성 대조군으로의 자극 후 B16 BlueTM ISG 세포의 용량-반응을 보여준다;
도 21 은 PBS 대조군, IFNα1, SEQ ID NO. 2-제형화된 것 (Seq No 2-Form), SEQ ID NO. 1 제형화된 것 (Seq No 1-Form), SEQ ID NO. 2 비제형화된 것 (Seq No 2), SEQ ID NO. 1 비제형화된 것 (Seq No 1), 리포좀/제형 단독 (리포좀 대조군), 3'-3'-cGAMP, 및 POLY-(dA/dT) 와 접촉된 B16-BlueTM ISG 세포의 자극을 그래프로 나타낸다;
도 22 는 PBS 대조군, IFNα1, SEQ ID NO. 2-제형화된 것 (Seq No 2-Form), SEQ ID NO. 1 제형화된 것 (Seq No 1-Form), SEQ ID NO. 2 비제형화된 것 (Seq No 2), SEQ ID NO. 1 비제형화된 것 (Seq No 1), 및 리포좀/제형 단독 (리포좀 대조군) 과 접촉된 THP-1-BlueTM ISG 세포의 자극을 그래프로 나타낸다;
도 23 은 PBS 대조군, IFNα1, SEQ ID NO. 2-제형화된 것 (Seq No 2-F), SEQ ID NO. 1 제형화된 것 (Seq No 1-F), SEQ ID NO. 2 비제형화된 것 (Seq No 2), SEQ ID NO. 1 비제형화된 것 (Seq No 1), 및 리포좀/제형 단독 (리포좀 대조군) 과 접촉된 THP-1-BlueTM ISG-KD-STING 세포의 자극을 그래프로 나타낸다;
도 24A 및 도 24B 는 SEQ ID NO. 2 제형화된 것 (플라스미드-F) 의 시토졸 DNA 인지를 그래프로 나타낸다;
도 25A 및 도 25B 는 SEQ ID NO. 2 제형화된 것 (플라스미드-F) 의 면역조절 작용에서의 STING 의 중심적인 역할을 그래프로 나타낸다;
도 26A 및 도 26B 는 SEQ ID NO. 2 제형화된 것 (Seq No 2-F) 및 SEQ ID NO. 1 제형화된 것 (Seq No 1-F) 에 의해 유발된 면역조절 작용에서의 STING 의 중심적인 역할을 그래프로 나타낸다;
도 27A, 도 27B, 및 도 27C 는 돼지 말초 혈액 단핵 세포에서 인터페론 방출을 유도하기 위한 SEQ ID NO. 2 제형화된 것 (Seq No 2-F) 의 능력을 나타낸다;
도 28A, 도 28B, 및 도 28C 는 소 말초 혈액 단핵 세포에서 인터페론 방출을 유도하기 위한 SEQ ID NO. 2 제형화된 것 (Seq No 2-F) 의 능력을 나타낸다;
도 29 는 시험 과정 동안 측정된 직장 온도를 그래프로 나타낸다;
도 30A 및 도 30B 는 동물 상 (phase) 의 출발 및 종료 시 평균 체중을 그래프로 나타낸다;
도 31A, 도 31B, 도 31C, 도 31D, 도 31E, 및 도 31F 는 돼지 대상체로부터 수집된 혈액학적 데이터를 명시한다;
도 32A, 도 32B, 도 32C, 도 32D, 도 32E, 및 도 32F 는 돼지 대상체로부터 수집된 혈액학적 데이터를 명시한다;
도 33A, 도 33B, 도 33C, 도 33D, 도 33E, 도 33F, 도 33G, 및 도 33H 는 돼지 대상체로부터 수집된 혈액학적 데이터를 명시한다;
도 34A, 도 34B, 도 34C 및 도 34D 는 처리 전 후의 IL 1 및 IL 2 의 혈청 사이토카인 내용물의 함량 및 상대적인 변화를 명시한다;
도 35A, 도 35B, 도 35C, 및 도 35D 는 처리 전 후의 IL 4 및 IL 6 의 혈청 사이토카인 내용물의 함량 및 상대적인 변화를 그래프로 나타낸다;
도 36A, 도 36B, 도 36C, 및 도 36D 는 처리 전 후의 IL 8 및 IL 10 의 혈청 사이토카인 내용물의 함량 및 상대적인 변화를 나타낸다;
도 37A, 도 37B, 도 37C, 및 도 37D 는 처리 전 후의 IL 12 및 INFg 의 혈청 사이토카인 내용물의 함량 및 상대적인 변화를 그래프로 나타낸다;
도 38A 및 도 38B 는 처리 전 후의 TNFa 의 혈청 사이토카인 내용물의 함량 및 상대적인 변화를 나타낸다;
도 39A, 도 39B, 도 39C, 도 39D, 도 39E, 및 도 39F 는 저 또는 고 투여량의 시험 성분의 정맥내 투여 전 후의 IL 1, IL 2 및 IL 4 의 혈청 사이토카인 내용물의 함량 및 상대적인 변화를 나타낸다;
도 40A, 도 40B, 도 40C, 도 40D, 도 40E, 및 도 40F 는 저 또는 고 투여량의 시험 성분의 정맥내 투여 전 후의 IL 6, IL 8 및 IL 10 의 혈청 사이토카인 내용물의 함량 및 상대적인 변화를 나타낸다;
도 41A, 도 41B, 도 41C, 도 41D, 도 41E, 도 41F, 도 41G, 및 도 41H 는 처리 후 (저 또는 고 투여량의 시험 성분으로의 i.m. 및 s.c. 접종; 양은 접종 후 시점 -1, 2, 6, 24 및 48 시간에 측정됨) IL 1 mRNA 의 상대적인 양 및 비례적인 변화를 나타낸다;
도 42A, 도 42B, 도 42C, 및 도 42D 는 처리 후 (고 또는 저 투여량의 시험 성분으로의 i.m. 및 s.c. 접종; 양은 접종 후 시점 -1, 2, 6, 24 및 48 시간에 측정됨) IL 2 mRNA 의 상대적인 양 및 비례적인 변화를 나타낸다;
도 43A, 도 43B, 도 43C, 및 도 43D 는 처리 후 (고 또는 저 투여량의 시험 성분으로의 i.m. 및 s.c. 접종; 양은 접종 후 시점 -1, 2, 6, 24 및 48 시간에 측정됨) IL 2 mRNA 의 상대적인 양 및 비례적인 변화를 나타낸다;
도 44A, 도 44B, 도 44C, 도 44D, 도 44E, 도 44F, 도 44G, 및 도 44H 는 처리 후 (고 또는 저 투여량의 시험 성분으로의 i.m. 및 s.c. 접종; 양은 접종 후 시점 -1, 2, 6, 24 및 48 시간에 측정됨) IL 6 mRNA 의 상대적인 양 및 비례적인 변화를 나타낸다;
도 45A, 도 45B, 도 45C, 도 45D, 도 45E, 도 45F, 도 45G, 및 도 45H 는 처리 후 (고 또는 저 투여량의 시험 성분으로의 i.m. 및 s.c. 접종; 양은 접종 후 시점 -1, 2, 6, 24 및 48 시간에 측정됨) IL 10 mRNA 의 상대적인 양 및 비례적인 변화를 그래프로 나타낸다;
도 46A, 도 46B, 도 46C, 도 46D, 도 46E, 도 46F, 도 46G, 및 도 46H 는 처리 후 (고 또는 저 투여량의 시험 성분으로의 i.m. 및 s.c. 접종; 양은 접종 후 시점 -1, 2, 6, 24 및 48 시간에 측정됨) IL 12 mRNA 의 상대적인 양 및 비례적인 변화를 나타낸다;
도 47A, 도 47B, 도 47C, 도 47D 및 도 47E 는 고 투여량의 시험 성분의 투여 후 (i.m. 투여 및 s.c. 투여 경로가 조합됨; 양은 접종 후 시점 -1, 2, 6, 24 및 48 시간에 측정됨) 상이한 사이토카인의 비례적인 변화를 나타낸다;
도 48A, 도 48B, 도 48C, 도 48D 및 도 48E 는 고 투여량의 시험 성분의 투여 후 (i.m. 투여 및 s.c. 투여 경로가 조합됨; 양은 접종 후 시점 -1, 2, 6, 24 및 48 시간에 측정됨) 상이한 사이토카인의 비례적인 변화를 나타낸다;
도 49A 및 도 49B 는 고 (상부 패널) 또는 저 (하부 패널) 투여량의 시험 성분의 정맥내 투여 후 한마리의 돼지에서 관찰된 사이토카인 mRNA 발현의 변화를 나타낸다;
도 50A 및 도 50B 는 Seq No 2-F 및 대조군으로의 처리를 받은 거세소 (steer) 에서의 BRD 로 인한 폐 병변 (도 50A) 및 폐사율 (도 50B) 의 백분율을 나타낸다.
본 발명에 따르면, 수령자 대상체에서 시토졸 DNA 감시 분자를 활성화시킬 수 있는 조성물뿐 아니라 사용 방법이 발견된 바 있다. 특히, 본 발명은 신규한 핵산 조성물, 또는 면역조절자 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다. 이러한 면역조절자 조성물이 대상체의 면역계를 조절하는데 사용될 수 있다는 점이 발견되었다. 본 발명은 미생물, 예컨대 제한 없이, 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 진균, 효모, 기생충 및 기타 당업계에 공지된 미생물에 의해 야기된 전염병 치료 및 예방에 특히 유용하다. 본 조성물 및 면역조절자 조성물을 사용하는 방법은 하기에 더 자세히 논의한다.
I. 조성물
본 발명에서 유용한 조성물, 예컨대 본원에 기재된 조성물은 일반적으로 전염병의 예방 요법, 집단예방 요법, 또는 치료 요법으로서 이용될 수 있다. 이러한 조성물은 본원에서 면역조절자 조성물로 지칭된다. 면역조절자 조성물은 수령자 대상체에서 시토졸 DNA 감시 분자를 활성화시킬 수 있는, 적어도 면역자극성 플라스미드 또는 면역자극성 DNA 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 면역조절자 조성물은 또한 리포좀 전달 비히클을 포함할 수도 있다.
A. 핵산
일부 양상에서, 본 발명은 전염병 유발제의 치료 또는 예방에 유용한 핵산 분자에 관한 것이다. 본원에 기재된 핵산 분자는 면역자극성 플라스미드 내에 선형의 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA, 아미노산 서열, 리보핵산 (RNA) 또는 그 조합물로서 포함될 수 있다. 일부 양상에서, 본 발명은 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포 (시험관 내, 생체 내, 또는 생체 외) 에 관한 것으로서, 이는 면역자극성 플라스미드 또는 면역자극성 DNA 서열을 함유한다.
본원에 기재된 핵산 분자는 CpG 모티프가 풍부하다. 이러한 CpG 모티프는 특정 Toll-유사 수용체, 예컨대 TLR9 및 TLR21 을 통해 면역 자극을 유도할 수 있다. 부가적으로 본원에 기재된 핵산 분자는 또한 비-CpG 면역자극성 모티프를 함유한다. 일부 양상에서, 핵산 분자는 랜덤 핵산 서열에서 예상되는 CpG 모티프의 빈도에 비해 약 2-20% CpG 모티프를 함유한다. 일부 양상에서, 핵산 분자는 랜덤 핵산 서열에서 예상되는 CpG 모티프의 빈도에 비해 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40% 이상의 CpG 모티프를 함유한다. 일부 양상에서, 핵산 분자는 랜덤 핵산 서열에서 예상되는 CpG 모티프의 빈도에 비해 약 10% CpG 모티프를 함유한다. 일부 양상에서, 척추동물 DNA 와 비교하여, 10 배 초과의 CpG 모티프의 풍부가 관찰된다. 일부 양상에서, 핵산 분자는 척추동물 DNA 와 비교해 약 2 내지 50 배 이상의 CpG 모티프를 함유한다. 일부 양상에서, 핵산 분자는 척추동물 DNA 와 비교해 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 배 이상의 CpG 모티프를 함유한다.
일부 양상에서, 본 발명은 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열에 관한 것이다. 플라스미드에는 임의의 선택가능 또는 선별가능 마커 유전자가 없을 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 pGCMB75.6 플라스미드는 임의의 전체 길이 또는 기능적 선택가능 또는 선별가능 마커 유전자를 포함하지 않는다. pGCMB75.6 의 서열은 SEQ ID NO: 1 에 제공된다.
일부 양상에서, 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 전체 길이 또는 기능적 선택가능 또는 선별가능 마커를 코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는다. 예를 들어, 플라스미드는 카나마이신 내성 유전자를 포함하지 않는다. 일부 양상에서, 본원에 기재된 플라스미드는 바람직하게는 면역원을 인코딩하지 않는다.
일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 항생제 내성 유전자가 아닌 선택가능 또는 선별가능 마커 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 pLacZMB75.6 플라스미드는 LacZ 유전자를 선별가능 마커로서 포함한다. pLacZMB75.6 의 맵은 도 3 에 제공되며, pLacZMB75.6 의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4 로서 제공된다. 도 3 에서 제시되는 바와 같이, pLacZMB75.6 은 pGCMB75.6 과 유사하나, LacZ 선별가능 마커를 함유한다.
pMB75.6, pGCMB75.6 또는 pLacZMB75.6 플라스미드의 뉴클레오티드 서열은 이들의 면역자극성 특성에 상당한 악영향을 주지 않으면서 특정 범위까지 다양해질 수 있다는 것이 명백할 것이다. 일부 양상에서, 본 발명은 pGCMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 1) 과 적어도 89% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 pGCMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 1) 과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 pGCMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 1) 을 포함한다.
일부 양상에서, 본 발명은 pLacZMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 4) 과 적어도 84% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 pLacZMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 4) 과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 pLacZMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 4) 을 포함한다.
일부 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2 의 서열과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 의 서열과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 의 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 3 의 서열과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 서열과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 발명은 pGCMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 1) 과 적어도 89% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열로 이루어지는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 pGCMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 1) 과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 pGCMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 1) 로 이루어진다.
일부 양상에서, 본 발명은 pLacZMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 4) 과 적어도 84% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열로 이루어지는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 pLacZMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 4) 과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 pLacZMB75.6 의 서열 (SEQ ID NO: 4) 로 이루어진다.
일부 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2 의 서열과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열로 이루어지는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 의 서열과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 의 서열로 이루어진다.
일부 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 3 의 서열과 적어도 80% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열로 이루어지는 면역자극성 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 서열과 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다. 일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드는 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 의 서열로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 중요한 측면은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 또는 SEQ ID NO: 4 에 고 엄격성 조건 하에 하이브리드화하는 핵산 서열을 포함하는 면역 반응을 자극할 수 있는 면역자극성 DNA 서열 또는 면역자극성 플라스미드를 제공한다. 적합한 핵산 서열은 본 발명의 핵산과 상동성인, 실질적으로 유사 또는 동일한 것을 포함한다. 일부 양상에서, 상동성 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 각 상보 서열과 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 의 서열 유사성을 가질 것이다. 다른 양상에서, 상동성 핵산 서열은 SEQ ID NO: 4 또는 각 상보 서열과 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 의 서열 유사성을 가질 것이다. 다른 양상에서, 상동성 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2 또는 각 상보 서열과 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 의 서열 유사성을 가질 것이다. 다른 양상에서, 상동성 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3 또는 각 상보 서열과 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 의 서열 유사성을 가질 것이다. 서열 유사성은 당업계에 공지된 많은 알고리즘, 예컨대 문헌 [Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990] 에 기재된 BLAST 를 이용하여 산출될 수 있다. 핵산은 유전적 코드의 축퇴로 인해 상술된 핵산과 서열이 상이할 수 있다. 일반적으로, 참조 서열은 18 개의 뉴클레오티드, 더욱 통상적으로 30 개 이상의 뉴클레오티드일 수 있고, 비교 목적을 위해 조성물의 전체 핵산 서열을 포함할 수 있다.
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 또는 SEQ ID NO: 4 에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열이 본원에 고려된다. 엄격한 하이브리드화 조건은 50℃ 이상 및 0.1X SSC (15 mM 소듐 클로라이드/1.5 mM 소듐 시트레이트) 에서의 하이브리드화와 같은 조건을 포함한다. 또 다른 예는 42℃ 에서, 50% 포름아미드, 5X SSC (150 mM NaCl, 15 mM 트리소듐 시트레이트), 50 mM 소듐 포스페이트 (pH 7.6), 5X Denhardt 용액, 10% 덱스트란 술페이트, 및 20 ㎍/ml 변성, 전단된 연어 정자 DNA 의 용액 중 하룻밤 인큐베이션 후, 약 65℃ 에서 0.1X SSC 중 세정이다. 예의 엄격한 하이브리드화 조건은, 상기 특이적 조건 만큼 적어도 약 80%, 85%, 90%, 또는 95% 정도 엄격한 하이브리드화 조건이다. 기타 엄격한 하이브리드화 조건은 당업계에 공지되어 있고 또한 본 발명의 핵산의 상동체를 동정하는데 이용될 수 있다 (Current Protocols in Molecular Biology, Unit 6, pub. John Wiley & Sons, N.Y. 1989).
본원에 기재된 DNA 분자의 돌연변이 뉴클레오티드는, 본원에 기재된 바와 같은 시토졸 DNA 감시 분자를 활성화할 능력을 유지하는 핵산 서열을 포함하는 한, 이용될 수 있다. 이러한 돌연변이의 DNA 서열은 통상 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 상이할 것이다. 서열 변경은 치환, 삽입, 결실 또는 그의 조합일 수 있다. 클로닝된 유전자의 돌연변이유발 기술은 당업계에 공지되어 있다. 부위 특이적 돌연변이유발 방법은 문헌 [Gustin et al., Biotechniques 14:22, 1993; Barany, Gene 37:111-23, 1985; Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. 199:537-9, 1985; 및 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp. 15.3-15.108] 에서 찾을 수 있으며 모두 본원에 참조로서 삽입되어 있다. 요약하면, 본 발명은 대상체에서 시토졸 DNA 감시 분자를 활성화할 수 있는 핵산 서열 및 그의 변이체 또는 돌연변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 기재된 핵산 서열에 의해 인코딩된 중재 RNA 뿐 아니라 임의의 그에 따른 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOs. 1, 2, 3, 및 4 에 제공된 서열과 다른 경우, 플라스미드 내 CpG 디뉴클레오티드가 온전히 잔존되는 것이 바람직하다. 대안적으로, 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 CpG 디뉴클레오티드가 제거되도록 변경되면, 플라스미드의 서열은 플라스미드 내 CpG 디뉴클레오티드의 총 개수가 동일하게 남도록 또 다른 위치에서 변경될 수 있다. pGCMB75.6 또는 pLacZMB75.6 의 뉴클레오티드 서열에 이미 존재하는 것에 부가적으로 추가의 CpG 디뉴클레오티드가 또한 플라스미드에 도입될 수 있다. 따라서, 예를 들어 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드는 바람직하게는 적어도 약 200 개, 적어도 약 220 개, 적어도 약 240 개, 적어도 약 260 개, 적어도 약 270 개, 적어도 약 275 개, 적어도 약 280 개, 적어도 약 283 개, 적어도 약 285 개, 또는 적어도 약 288 개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어 면역자극성 플라스미드는 283 개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 양상에서, 면역자극성 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 본원에 제공되는 서열과 다른 경우, 플라스미드 중의 CpG 모티프 유형은 시토졸 DNA 감시 분자의 산출되는 활성화를 조정하기 위해 다양화된다. 예를 들어, 면역 자극성 CpG 모티프의 수는 면역자극성 플라스미드/DNA 의 특정 임계치에 반응하여 특정 시토졸 DNA 감시 분자의 활성화를 증가시키기 위해 증가될 수 있다. 추가 예로서, 비-면역 자극성 CpG 모티프의 수는 특정 시토졸 DNA 감시 분자의 활성화의 감소 및/또는 다른 DNA 감시 분자의 활성화의 증가를 위해 증가될 수 있다.
특히, 본 발명은 본원에 기재된 DNA 서열 또는 면역자극성 플라스미드 중 임의의 것 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제형에 관한 것이다.
B. 면역조절자
본원에 기재된 면역자극성 플라스미드를 사용하기에 적합한 면역조절자 조성물은, 그 전문 내용이 참조로 본원에 인용되는 U.S. 특허 출원 공보 제 2012/0064151 호 A1 및 제 2013/0295167 호 A1 에 기재되어 있다.
면역조절자 조성물은 리포좀 전달 비히클, 및 본원에 기재된, 면역자극성 플라스미드 또는 DNA 서열 중 하나 이상을 포함한다.
적합한 리포좀 전달 비히클은 치료된 대상체의 조직에 핵산 분자를 전달할 수 있는 지질 조성물을 포함한다. 리포좀 전달 비히클은 바람직하게는 충분한 시간 동안 대상체에서 안정적으로 잔존할 수 있어 핵산 분자 및/또는 생물작용제를 전달할 수 있다. 예를 들어, 리포좀 전달 비히클은 적어도 약 5 분, 적어도 약 1 시간 또는 적어도 약 24 시간 동안 수령자 대상체에서 안정적이다.
본 발명의 리포좀 전달 비히클은 세포 내로 핵산 분자를 전달할 수 있는 지질 조성물을 포함한다. 핵산 분자가 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 경우, 핵산:리포좀 복합체는 바람직하게는 전달된 핵산 마이크로그램 (㎍) 당 총 조직 단백질 밀리그램 (mg) 당 발현된 단백질 약 1 피코그램 (pg) 이상의 트랜스펙션 효율을 가진다. 예를 들어, 핵산:리포좀 복합체의 트랜스펙션 효율은 전달된 핵산 ㎍ 당 전체 조직 단백질 mg 당 발현된 약 10 pg 이상의 단백질; 또는 전달된 핵산 ㎍ 당 전체 조직 단백질 mg 당 발현된 약 50 pg 이상의 단백질일 수 있다. 복합체의 트랜스펙션 효율은 전달된 핵산 ㎍ 당 전체 조직 단백질 mg 당 발현된 단백질 1 펨토그램 (fg) 만큼 낮을 수 있으며, 이때 상기 양은 보다 바람직하다.
본 발명의 바람직한 리포좀 전달 비히클은 직경 약 100 내지 500 나노미터 (nm) 이다. 예를 들어, 리포좀 전달 비히클은 직경 약 150 내지 450 nm, 또는 약 200 내지 400 nm 일 수 있다.
적합한 리포좀은 임의의 리포좀, 예컨대 예를 들어 당업자에게 공지된 유전자 전달 방법에서 통상 사용되는 것을 포함한다. 바람직한 리포좀 전달 비히클은 다층 소포 (multilamellar vesicle; MLV) 지질 및 압출된 지질을 포함한다. MLV 의 제조 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 더욱 바람직한 리포좀 전달 비히클은 다중양이온성 지질 조성을 갖는 리포좀 (즉, 양이온성 리포좀) 및/또는 폴리에틸렌 글리콜에 컨쥬게이션된 콜레스테롤 백본을 갖는 리포좀을 포함한다. 예의 양이온성 리포좀 조성물은 제한 없이, 하기를 포함한다: N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 콜레스테롤, N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP) 및 콜레스테롤, 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-히드록시에틸)-이미다졸리늄 클로라이드 (DOTIM) 및 콜레스테롤, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 콜레스테롤, 및 그 조합물. 전달 비히클로서 사용하기 위한 가장 바람직한 리포좀 조성물은 DOTIM 및 콜레스테롤을 포함한다.
적합한 핵산 분자는 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드 중 임의의 것을 포함한다. 코딩 핵산 서열은 적어도 단백질 또는 펩티드의 일부를 인코딩하나, 비-코딩 서열은 단백질 또는 펩티드의 임의의 일부를 인코딩하지 않는다. 본 발명에 따르면, "비-코딩" 핵산은 전사 단위의 조절 영역, 예컨대 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 용어 "빈 (empty) 벡터" 는 용어 "비-코딩" 과 상호교환적으로 사용될 수 있고, 특히 유전자 삽입 없는 플라스미드 벡터와 같이 단백질 코딩 부분의 부재 하 핵산 서열을 지칭한다. 본원에 기재된 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질의 발현은 시토졸 DNA 감시 분자의 활성화에 요구되지 않는다; 그러므로, 플라스미드는 전사 제어 서열에 작동적으로 연결된 임의의 코딩 서열을 포함할 필요는 없다. 그러나, 추가적인 장점이 면역원 및/또는 사이토카인을 인코딩하는 핵산 서열 (DNA 또는 RNA) 를 조성물에 포함시킴으로써 수득될 수 있다 (즉, 항원-특이적 및 증강된 면역성). 면역원 및/또는 사이토카인을 인코딩하는 이러한 핵산 서열은 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드에 포함될 수 있거나, 또는 조성물 내 별도의 핵산 (예, 별도의 플라스미드) 에 포함될 수 있다.
본원에 기재된 면역자극성 플라스미드로 리포좀을 복합체를 형성하는 것 (complexing) 은 당업계의 표준 방법을 이용하거나 또는 U.S. 특허 제 6,693,086 호 (본원에 이들의 내용은 참조로서 그 전문이 인용되어 있음) 에 기재된 대로 달성될 수 있다. 리포좀에 부가되는 플라스미드의 적당한 농도는 전신 면역 반응이 유발되도록 대상체에 충분량의 플라스미드를 전달하기에 유효한 농도를 포함한다. 예를 들어, 약 0.1 ㎍ 내지 약 10 ㎍ 의 플라스미드가 약 8 nmol 리포좀과 조합될 수 있거나, 약 0.5 ㎍ 내지 약 5 ㎍ 의 플라스미드가 약 8 nmol 리포좀과 조합될 수 있거나, 또는 약 1.0 ㎍ 의 플라스미드가 약 8 nmol 리포좀과 조합될 수 있다. 조성물 내 플라스미드 대 지질 비 (㎍ 플라스미드:nmol 지질) 는 중량에 대해 적어도 약 1:1 플라스미드:지질일 수 있다 (예, 1 ㎍ 플라스미드:1 nmol 지질). 예를 들어, 플라스미드 대 지질의 비는 적어도 약 1:5, 적어도 약 1:10, 또는 적어도 약 1:20 일 수 있다. 본원에서 표시된 비는 조성물 내 양이온성 지질의 양을 기반으로 하고, 조성물 내 지질의 총량을 기반으로 하지 않는다. 본 발명의 조성물 내 플라스미드 대 지질의 비는 적합하게 약 1:1 내지 약 1:80 플라스미드:지질 (중량 기준); 약 1:2 내지 약 1:40 플라스미드:지질 (중량 기준); 약 1:3 내지 약 1:30 플라스미드: 지질 (중량 기준); 또는 약 1:6 내지 약 1:15 플라스미드:지질 (중량 기준) 이다.
C. 생물작용제
본원에 기재된 면역조절자 조성물 중 임의의 것은 본원에 기재된 플라스미드 중 하나 이상 및 리포좀 전달 비히클에 부가적으로 하나 이상의 생물작용제를 추가로 포함할 수 있다.
적합한 생물작용제는 질병의 예방 또는 치료에 유효한 작용제이다. 이러한 생물작용제는 면역 인핸서 단백질, 면역원, 백신, 항균제 또는 이의 임의 조합물을 포함한다. 적합한 면역 인핸서 단백질은 면역성을 증강시키는 것으로 공지된 단백질이다. 비제한적인 예로, 사이토카인 (단백질 패밀리 포함) 이 공지된 면역성 증강 단백질 패밀리이다. 적합한 면역원은 체액 및/또는 세포성 면역 반응을 유발하는 단백질로, 이 면역원을 대상체에 투여하면 대상체의 조직 내 맞닥뜨리는 동일 또는 유사 단백질에 대항하는 면역원-특이적 면역 반응이 증가된다. 면역원은 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균에 의해 발현된 병원성 항원을 포함할 수 있다. 바람직한 항원은 대상체에 전염병을 야기하는 유기체로부터 유래된 항원을 포함한다. 본 발명에 따르면, 면역원은 체액 및/또는 세포 면역 반응을 유발하는 천연 발생 또는 합성적으로 유래된 임의의 단백질 일부일 수 있다. 이와 같이, 항원 또는 면역원의 크기는 그 사이의 임의의 크기를 비롯해, 전장 단백질과 같이 크고 약 5-12 아미노산과 같이 작을 수 있다. 항원은 멀티머 단백질 또는 융합 단백질일 수 있다. 항원은 정제된 항원일 수 있다. 대안적으로, 면역 인핸서 단백질 또는 면역원은 면역자극성 플라스미드 또는 면역조절자 조성물에 포함된 또 다른 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 면역 인핸서 단백질 또는 면역원이 면역조절자 조성물 내 핵산 분자에 의해 인코딩되는 경우, 면역 인핸서 단백질 또는 면역원을 인코딩하는 핵산 서열은, 면역원이 대상체의 조직 내에서 발현되어 대상체에게 비특이적 면역 반응에 더해 면역원-특이적 면역 반응을 유발하도록 전사 제어 서열에 작동적으로 연결된다. 면역원성에 대한 선별 기술, 예컨대 병원체 항원 면역원성 또는 사이토카인 활성은 당업자에게 공지되어 있으며, 이는 각종 시험관 내 및 생체 내 어세이를 포함한다.
생물작용제가 백신인 경우, 백신은 살아 있는, 전염성, 바이러스, 박테리아 또는 기생충 백신, 또는 사멸된, 비활성화, 바이러스, 박테리아 또는 기생충 백신을 포함할 수 있다. 하나 이상의 백신, 살아있거나 사멸된 바이러스 백신이 본 발명의 면역조절자 조성물과 조합되어 사용될 수 있다. 적합한 백신은 조류 또는 소 종에 대해 당업계에 공지된 것을 포함한다.
생물작용제는 항미생물제일 수 있다. 적합한 항미생물제에는 하기가 포함된다: 퀴놀론, 바람직하게 플루오로퀴놀론, β-락탐, 및 마크로라이드-린코사마이드-스트렙토그라민 (MLS) 항생제.
적합한 퀴놀론에는 베노플록사신 (benofloxacin), 빈플록사신 (binfloxacin), 시녹사신 (cinoxacin), 시프로플록사신 (ciprofloxacin), 클리나플록사신 (clinafloxacin), 다노플록사신 (danofloxacin), 디플록사신 (difloxacin), 에녹사신 (enoxacin), 엔로플록사신 (enrofloxacin), 플레록사신 (fleroxacin), 게미플록사신 (gemifloxacin), 이바플록사신 (ibafloxacin), 레보플록사신 (levofloxacin), 로메플록사신 (lomefloxacin), 마르보플록사신 (marbofloxacin), 목시플록사신 (moxifloxacin), 노르플록사신 (norfloxacin), 오플록사신 (ofloxacin), 오르비플록사신 (orbifloxacin), 파주플록사신 (pazufloxacin), 프라도플록사신 (pradofloxacin), 퍼플록사신 (perfloxacin), 사라플록사신 (sarafloxacin), 스파르플록사신 (sparfloxacin), 테마플록사신 (temafloxacin), 및 토수플록사신 (tosufloxacin) 이 포함된다. 바람직한 플루오로퀴놀론에는 시프로플록사신, 다노플사신, 엔로플록사신, 목시플록사신, 및 프라도플록사신이 포함된다. 적합한 나프티리돈에는 날리딕스산이 포함된다.
적합한 β-락탐에는 페니실린 (예, 아목시실린, 암피실린, 아즈로실린, 벤자틴 페니실린, 벤질페니실린, 카르베니실린, 클록사실린, 코-아목시클라브 [즉 아목시실린/클라불란산], 디클록사실린, 플루클록사실린, 메티실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 페녹시메틸페니실린, 피페라실린, 프로카인 페니실린, 테모실린, 및 티카르실린); 세팔로스포린 (예, 세파클로르, 세파로늄, 세파만돌, 세파프리린, 세파졸린, 세페핌, 세픽심, 세포탁심, 세폭시틴, 세프피롬, 세프포독심, 세프퀴놈, 세프타지딤, 세프티오푸르, 세프트리아족손, 세푸록심, 세팔렉신, 세팔로틴, 및 데포테탄); 카르바페넴 및 페넴 (예, 도리페넴, 에르타페넴, 파로페넴, 이미페넴 및 메로페넴); 모노박탐 (예, 아즈트레오남, 노카르디신 A. 타브톡시닌-β-락탐 및 티게모남); 및 β-락타마아제 저해제 (예, 클라불란산, 술박탐 및 타조박탐) 이 포함된다. 바람직한 β-락탐에는 세팔로스포린, 특히 세파졸린이 포함된다.
적합한 MLS 항생제에는 클린다마이신, 린코마이신, 피르리마이신 및 임의의 마크로라이드 항생제가 포함된다. 바람직한 린코사마이드 항생제는 피르리마이신이다.
기타 항균제에는 아미노글리코시드, 클로피돌, 디메트리다졸, 에리트로마이신, 프라미세틴, 푸라졸리돈, 할로푸기논, 2-피리돈, 로베니딘, 술포나미드, 테트라사이클린, 트리메토프림, 각종 플레우로뮤틸린 (예, 티아뮬린 및 발네뮬린) 및 각종 스트렙토마이신 (예, 모넨신, 나라신 및 살리노마이신) 이 포함된다.
소 호흡기 질환, 또는 복합 소 호흡기 질환 (BRD) 은 소 산업에서 선두적인 경제적인 손실 요인이다. 소가 스트레스요인 (stressor) 에 노출되면, 이들의 선천적 및 후천적 면역 기능은 절충하여 소 기도의 정상 플로라의 일부인 미생물이 하부 기도에서 번성하여 콜로니를 형성하도록 한다. 하부 호흡계는 전형적으로 무균 지대이므로, 미생물 증식은 중병 및 심지어 사망을 유발할 수 있다.
본 발명의 면역조절자 조성물 및 BRD 에 대항하여 효과적인 항미생물제에 부가적으로 투여되는 조합 요법은 면역 반응을 자극시킬 뿐 아니라 병원균에 직접 작용하도록 발휘될 수 있다. 조합 요법은 회복 시간을 감소시킬 수 있거나 또는 심지어 예방적으로 투여되는 경우 전염을 방지할 수 있다. 이환율의 감소는 사육 가축의 생산성 증가를 산출할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "생산성" 은 증체량을 산출하는 사육 가축이 겪는 활성을 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "증체량" 은, 동물 당 평균 일일 습득 및/또는 평균 체중에서의 증가를 말할 수 있다. 병들고 고통스러워하는 동물은 체중을 습득할 수 있는 반면, 조합 요법을 받은 동물에서 관찰된 증체량은 병든 동물의 것을 앞설 수 있다. 그러므로, 본 발명의 일부 구현예는 항미생물제를 대상체에게 SEQ ID NO:1 과 적어도 80% 상동성을 갖는 핵산 서열 및 지질 전달 비히클을 포함하는 면역조절자 조성물과 조합으로 투여하는 것을 포함하며, 상기 조합이 대상체에서 체중을 증가시키는, 대상체에서 체중을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 항미생물제는 상기 나열된 것과 같은 항생제이다. 일부 양상에서, 항미생물제는 엔로플록사신이다.
다른 양상은 항미생물제를 대상체에게 SEQ ID NO:4 와 적어도 80% 상동성을 갖는 핵산 서열 및 지질 전달 비히클을 포함하는 면역조절자 조성물과 조합으로 투여하는 것을 포함하며, 상기 조합이 대상체에서 체중을 증가시키는, 대상체에서 증체량을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 항미생물제는 상기 나열된 것과 같은 항생제이다. 일부 양상에서, 항미생물제는 엔로플록사신이다.
II. 방법
본 발명의 과제는 면역조절자 조성물, 면역자극성 플라스미드 (또는 DNA 서열), 및 미감염된 대상체에 방어 면역성을, 감염된 대상체에 방어 면역성을, 미감염된 대상체에 증강된 면역성을, 감염된 대상체에 증강된 면역성을, 감염된 대상체에 치료적 면역성을 또는 이들의 조합을 제공하기 위해 시토졸 DNA 감시 분자를 활성화시키는 방법을 제공하는 것이다. 이와 같이, 본 발명의 조성물은 대상체를 예방적으로 면역화하는데 사용될 수 있거나, 또는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 방법은 본원에 기재된, 면역자극성 플라스미드, 또는 DNA 서열을 대상체에 투여하는 것, 및 대상체에서 시토졸 DNA 감시 분자를 활성화시키는 것을 포함한다.
A. 시토졸 DNA 감시 분자를 활성화시키는 방법
본 발명은 수령자 대상체에서 시토졸 DNA 감시 분자를 활성화시키는 방법에 관한 것이다. 방법은 대상체에게 시토졸 DNA 감시 분자를 활성화시키기 위해 유효량의 본원에 기재된 면역조절자 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 면역조절자 조성물은 시토졸 DNA 감시 분자를 활성화시킨다. 일부 양상에서, 면역조절자 조성물은 적어도 하나의 생물작용제, 예컨대 백신의 작업을, 이러한 백신 전에 투여되는 경우, 백신과 공동-투여되는 경우, 백신접종 후에 투여되는 경우, 또는 백신과 혼합되는 경우에 향상시킨다. 일부 양상에서, 방법은 수령자 대상체를 전염병으로부터 보호하고 전염병을 가진 집단을 처리하기 위한 신규한 치료 전략을 제공한다. 일부 양상에서, 방법은 면역조절자 조성물이 없는 백신의 사용과 비교하여, 면역조절자가 백신과 조합으로 사용되는 경우, 질환에 대항하여 좀더 빠르고, 길고 양호한 보호를 제공한다.
시토졸 DNA 감시 분자는 본원에 기재된 리포좀 전달 비히클 중 임의의 것, 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드 (DNA 서열의 경우) 중 임의의 것, 및 임의로 본원에 기재된 생물작용제 중 임의의 것을 포함하는, 유효량의 면역조절자 조성물을 투여함으로써 수령자 대상체에서 활성화될 수 있다. 생물작용제가 면역조절자와 혼합되거나 또는 이와 공동-투여되거나 또는 이들과 독립적으로 투여되는 것이 고려된다. 독립적인 투여는 면역조절자의 투여 전 또는 후일 수 있다. 또한 면역조절자 또는 생물작용제의 1 회 초과의 투여가 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 게다가, 1 회 초과의 생물작용제는 면역조절자와 공동-투여되거나, 면역조절자 전에 투여되거나, 면역조절자의 투여 후에 투여되거나, 또는 면역조절자와 동시에 투여될 수 있다.
당업계에 공지된 또는 아직 밝혀지지 않는 임의의 시토졸 DNA 감시 분자는 본원에 기재된 면역조절자 조성물을 사용하여 조절 또는 활성화될 수 있다. 당업자는 이러한 시토졸 DNA 감시 분자가 본원에 열거하기에는 너무 많다는 것을 인식할 것이다. 이와 같이, 본원에 기재된 면역조절자 조성물은 본원에 기재된 조성물의 적어도 하나의 면역조절자 성분을 인지할 수 있는 임의의 시토졸 DNA 감시 분자를 활성화 또는 조정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 이러한 시토졸 DNA 감시 분자는 AIM2, AP1, ASC, Atg9a, B-카테닌, 카스파아제-1, 시클릭 GMP-AMP 신타아제 (cGAS), DAI, DDX41, DEC205 DHX9, DHX36, DNA-PK, ERIS, IFI16, IKK 복합체, IKKε, IPSI, IRF1, IRF3, IRF7, ISRE1/7, ISRE7, JNK, Ku70, LGP2, LRRFIP1, MAPK, MDA-5, MITA, MKK3/6, MPYS, Mre11, Mx1, MyD88, NAP1, NFAT, NF-KB, NLRC5, OAS-3/OAS-L, 프로-카스파아제-1, p38, RIG-I, RNA Pol III, SOCS1, SOCS3, STING, TANK, TBK1, TLR1, TLR2.1, TLR3, TLR7, TLR9, TLR21, TMEM173, TRAF3, TRAF6, TRAM, TRIF, TREX1, TRIM32, TRIM56, 당업계에 공지된 기타 인터페론 반응 인자, 및 이의 조합을 포함한다.
유효량의 본원에 기재된 임의의 면역조절자 조성물을 대상체에 투여할 수 있다. 유효량은 수령자 대상체에서 적어도 하나의 (1) 시토졸 DNA 감시 분자를 활성화하기에 충분하다. 이러한 유효량은 수령자 대상체에서 적어도 하나의 (1) 시토졸 DNA 감시 분자의 활성화를 야기하는 임의의 양이다. 이러한 활성화를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 또한, 당업자는 유효량이 연령, 체중, 대상체의 종 및 감염 단계, 뿐 아니라 당업계에 공지된 다른 인자에 따라 달라질 것을 인지할 것이다. 적합한 유효량은 대상체 당 약 0.1 ㎍ 내지 1,000 ㎍ 의 범위일 수 있다. 일부 양상에서, 유효량은 약 0.1 ㎍ 내지 약 10 ㎍, 약 0.1 ㎍ 내지 약 5 ㎍, 약 0.5 ㎍ 내지 약 5 ㎍, 약 0.25 ㎍ 내지 약 5 ㎍, 약 0.05 ㎍ 내지 약 10 ㎍, 약 5 ㎍ 내지 약 15 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 15 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 20 ㎍, 약 20 ㎍ 내지 약 30 ㎍, 약 30 ㎍ 내지 약 40 ㎍, 약 40 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 70 ㎍, 약 70 ㎍ 내지 약 90 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 150 ㎍, 약 150 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 200 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 약 250 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 300 ㎍ 내지 약 350 ㎍, 약 350 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 400 ㎍ 내지 약 450 ㎍, 약 450 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 500 ㎍ 내지 약 550 ㎍, 약 550 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 600 ㎍ 내지 약 650 ㎍, 약 650 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 700 ㎍ 내지 약 750 ㎍, 약 750 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 800 ㎍ 내지 약 850 ㎍, 약 850 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 900 ㎍ 내지 약 950 ㎍, 약 950 ㎍ 내지 약 1000 ㎍ 의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 일부 양상에서, 유효량은 약 0.5 ㎍ 내지 약 10 ㎍ 의 범위일 수 있다. 그러나, 바람직하게는 다른 양상에서, 유효량은 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍ 의 범위일 수 있다. 그리고, 바람직하게는 다른 양상에서, 유효량은 약 40 ㎍ 내지 약 70 ㎍ 의 범위일 수 있다.
B. 면역 반응을 조절하는 방법
본원에 기재된 면역조절자 조성물은 수령자 대상체에 의해 고정된 면역 반응을 조절하는데 특히 유용하다. 대상체에서의 이러한 면역 반응 조절 방법은 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 면역조절자 조성물을 투여하고, 면역 반응을 조절하는데 수반되는 신호 경로를 활성화하는 면역 감시 수용체를 활성화하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 이러한 방법은 선천적 면역 반응을 자극하는데 사용될 수 있다. 일부 양상에서, 이러한 방법은 후천적 면역 반응을 자극하는데 사용될 수 있다. 일부 양상에서, 이러한 방법은 염증성 면역 반응을 억제하는데 사용될 수 있다. 일부 양상에서, 이러한 방법은 면역 반응 동안 염증을 억제하는데 사용될 수 있다. 일부 양상에서, 이러한 방법은 선천적 면역 반응을 자극하고 선천적 면역 반응 동안 염증을 억제하는데 사용될 수 있다. 일부 양상에서, 이러한 방법은 후천적 면역 반응을 자극하고 후천적 면역 반응 동안 염증을 억제하는데 사용될 수 있다. 일부 양상에서, 이러한 방법은 또한 염증을 억제하면서, 선천적 면역 반응 및 후천적 면역 반응을 자극하는데 사용될 수 있다.
C. 사용 조건
본 발명의 방법은 면역 반응을 잘 유발시키는 질병으로부터 대상체를 보호하도록 대상체에서 적어도 하나의 (1) 시토졸 DNA 감시 분자를 활성화시킨다. 본원에서 이용되는 바와 같이, 문구 "질병으로부터 보호" 란, 질병의 증상을 감소시키는 것; 질병 발병을 감소시키는 것; 질병의 임상적 또는 병적 중증도를 감소시키는 것; 또는 질병을 야기하는 병원체의 발산 (shedding) 을 감소시키는 것을 지칭한다. 대상체를 보호하는 것은 본 발명의 치료적 조성물을 대상체에 투여시, 질병의 발병을 막고/막거나, 질병 증상, 임상적 징후, 병리 또는 유발원을 완화 또는 감소시키는 이의 능력을 지칭할 수 있다. 이와 같이, 대상체를 질병으로부터 보호하는 것은, 질병 발병을 예방하고 (예방적 치료) 질병이 있는 대상체를 치료하는 것 (치료적 치료) 모두를 포함한다. 용어 "질병"은 정상적인 건강 상태에서 벗어난 대상체의 임의의 건강 상태를 지칭하며, 질병 증상이 존재하는 상태뿐 아니라 이탈 (예, 감염, 유전자 돌연변이, 유전적 결점, 등) 이 발생되었으나 증상이 아직 드러나지 않은 병태도 포함한다.
본 발명의 방법은 질병 방지, 질병에 대항하는 효과기 세포 면역성의 자극, 질병 제거, 질병 완화 및 1 차 질병의 발병으로부터 야기된 2 차 질병의 방지에 사용될 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 기재된 방법은 백신이 공동 투여될 때 대 백신이 단독 투여될 때 대상체의 획득 면역 반응의 개선에 사용될 수 있다. 일반적으로, 백신이 일단 투여되면 획득 면역성을 자극하는데 시간이 소요되므로 대상체를 즉시 보호하지는 않는다. 용어 "개선" 이란, 본 발명에서, 백신이 백신에 의해 주어진 획득 면역성을 통해 대상체를 보호하고/하거나 보호 기간을 연장하기 시작할 때까지 대상체에서 선천적 면역 반응을 유발하는 것을 지칭한다.
일부 양상에서, 본 발명의 방법은 각종 병원체의 감염에 대항해 보호하도록 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 투여된 조성물은 특정 반응을 유발하도록 특이적 항원을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 발명의 방법은 비제한적으로 바이러스, 박테리아, 진균, 및 기생충을 비롯한 감염성 미생물 물질로부터 야기된 질병으로부터 수령자 대상체를 보호할 것으로 고려된다. 당업자는 본원에 기재된 바와 같은 면역조절자 조성물이 열거하기에 너무 많은 수많은 전염성 물질에 대항해 효과적이라고 인지 및 이해할 것이다. 본원에서 제공된 전염성 물질은 예의 목적을 위해 제공되고 사용 범위의 제한 없이 제공된다.
D. 투여
각종 투여 경로가 이용가능하다. 선택된 특정 양태는 물론 특정의 선택된 생물작용제, 대상체의 연령 및 일반적인 건강 상태, 치료될 특정 병태 및 치료학적 효능에 요구되는 투여량에 따라 좌우될 것이다. 본 발명의 방법은 임상적으로 허용불가한 부작용을 야기하지 않으면서 유효 수준의 시토졸 DNA 감시 분자의 활성화를 초래하는 임의의 투여 양태를 이용하여 실시될 수 있다. 조성물은 단위 투약 형태로 편리하게 제시될 수 있고 당업계에 익히 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
면역조절자 조성물은 정맥내로, 근육내로, 유방내, 피부내, 복강내, 피하로, 분무로, 깃털여포법에 의한 알 내 (in ovo), 경구로, 안구내로, 기관내로, 비강내로, 점막으로, 직장내, 경피로, 침지 (수생 종에 대한 투여) 에 의해, 또는 당업계에 공지된 기타 방법으로써 투여될 수 있다. 하나의 양상에서, 면역조절자는 피하 투여된다. 또 다른 양상에서, 면역조절자는 근육내 투여될 수 있다. 또 다른 양상에서, 면역조절자는 분무로서 투여된다. 또 다른 양상에서, 면역조절자는 경구내 투여될 수 있다. 또 다른 양상에서, 면역조절자는 피하 투여될 수 있다.
하나의 관점에서, 면역조절자는 챌린지 (또는 감염) 전에 대상체에 단독으로 투여될 수 있다. 또 다른 양상에서, 면역조절자는 챌린지 (또는 감염) 후 대상체에 단독으로 투여될 수 있다. 또 다른 양상에서, 면역조절자는 챌린지 (또는 감염) 과 동시에 대상체에 단독으로 투여될 수 있다.
일부 양상에서, 면역조절자 조성물은 챌린지 이전 백신접종과 동시에 공동-투여될 수 있다. 일부 양상에서, 면역조절자 조성물은 챌린지 (또는 감염) 과 동시에 예방 접종과 동시에 공동-투여될 수 있다. 일부 양상에서, 공동-투여는 백신 및 면역조절자를, 대상체의 동일한 일반적인 위치에서 서로 옆의 두 상이한 부위에 (즉, 대상체의 목에서 나란히 주사), 동일한 일반적인 위치에서 대상체의 반대편에 (즉, 목의 각 측면 위에 하나씩) 또는 동일 대상체의 상이한 위치에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 면역조절자 조성물은 백신접종 및 챌린지 이전에 투여될 수 있다. 일부 양상에서, 면역조절자 조성물은 백신접종 후, 그러나 챌린지 이전에 투여될 수 있다. 면역조절자 조성물은 챌린지 (또는 감염) 전 백신접종된 대상체에 챌린지 후에 투여될 수 있다.
당업자는 투여 경로가 대상체 및 대상체의 건강 또는 상태에 따라 달라질 수 있음을 인지할 것이다. 조류 및 소 종에 제공된 투여 경로는 예의 목적을 위한 것으로 비제한적으로 제공된다.
조류 종의 백신접종은 임의의 연령에서 수행될 수 있다. 백신접종은 살아있는 미생물에 대해서 18 일령 배아 (알 내) 및 그 이상의 배아에 투여될 수 있고, 불활성화된 미생물 또는 기타 유형의 백신에 대해서는 3 주령 이상의 것에 투여될 수 있다. 알 내 백신접종을 위해, 백신접종은 발달의 마지막 사분기에 투여될 수 있다. 백신은 피하, 깃털여포법에 의해, 분무로써, 경구, 안구내, 기관내, 비강내, 알 내, 또는 당업계에 공지된 기타 방법에 의해 투여될 수 있다. 경구 백신은 음료수에 투여될 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법은 일상적인 백신접종 스케쥴에 기초하여 이용될 수 있음이 고려된다.
면역조절자 조성물은 또한 조류 종에 피하, 깃털여포법에 의해, 분무로써, 안구내, 기관내, 비강내, 알 내, 또는 당업계에 공지된 기타 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 면역조절자 조성물은 알 내 투여될 수 있다. 대안적으로, 면역조절자 조성물은 분무로서 투여될 수 있다.
면역조절자 조성물은 조류 배아에 그의 발달의 마지막 사분기에 알 내 투여될 수 있다. 예를 들어, 면역조절자 조성물은 18 일령 또는 19 일령 배아에 알 내 투여될 수 있다. 알로의 투여는 챌린지 (또는 감염) 이전 또는 챌린지 후일 수 있다.
면역조절자는 조류 또는 소 종의 동물에, 챌린지 전 약 1 내지 약 14 일 전, 또는 챌린지 후 약 1 내지 약 14 일 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, 면역조절자는 챌린지 전 약 1 내지 약 7 일 전에 투여될 수 있거나, 또는 챌린지 후 약 1 내지 약 7 일 후에 투여될 수 있다. 면역조절자는 적합하게 챌린지 전 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 일 전, 또는 챌린지 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 일 후에 투여된다.
소 종의 백신접종은 임의 연령에서 수행될 수 있다. 백신은 정맥내, 근육내, 진피내, 복강내, 피하, 분무로써, 경구, 안구내, 기관내, 비강내, 점막으로, 직장내, 경피로, 또는 당업계에 공지된 기타 방법에 의해 투여될 수 있다. 나아가, 본원에 기재된 방법은 일상의 백신접종 스케쥴에 기반하여 이용될 수 있다는 점이 고려된다.
다른 전달 시스템은 서방형 (time-release), 지연형 (delayed release) 또는 지속형 (sustained release) 전달 시스템을 포함할 수 있다. 이러한 시스템은 반복적인 조성물 투여를 피해 편의를 증가시킬 수 있다. 많은 종류의 방출 전달 시스템이 이용가능하고 당업자에게 공지되어 있다. 이에는 중합체 기반 시스템, 예컨대 폴리(락티드-글리콜리드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리히드록시부티르산 및 폴리안히드리드가 포함된다. 앞서의 중합체 함유 약물의 마이크로캡슐은 예를 들어 미국 특허 제 5,075,109 호에 기재되어 있다.
전달 시스템은 또한 스테롤 포함 지질, 예컨대 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 지방산 또는 중성 지방, 예컨대 모노-, 디- 및 트리-글리세리드; 히드로겔 방출 시스템; 실라스틱 시스템; 펩티드 기반 시스템; 왁스 코팅; 통상의 결합제 및 부형제를 이용한 압축된 정제; 부분 융합된 임플란트; 등인 비(非)-중합체 시스템을 포함한다. 구체예에는 이에 제한되지 않지만, 본 발명의 제제가 U.S. 특허 제 4,452,775 호, 제 4,675,189 호, 및 제 5,736,152 호에 기재된 것과 같은 매트릭스 내 형태로 함유된 침식 시스템, 및 활성 성분이 제어된 속도로 U.S. 특허 제 3,854,480 호, 제 5,133,974 호, 및 제 5,407,686 호에 기재된 바와 같은 중합체로부터 침투하는 확산 시스템이 포함된다. 추가적으로, 펌프-기반 하드웨어 전달 시스템이 이용될 수 있고, 이들 중 일부는 이식에 적합된다.
본 발명의 영역에서 벗어나지 않으면서 상기 조성물, 생성물 및 방법에 각종 변경이 가해질 수 있는 바, 상기 기술 및 하기에 주어진 실시예에 포함된 모든 물질은 예시적인 것이며 제한되는 의미로서 해석되어서는 안된다는 것이 의도된다.
정의
용어 "유효량"은 원하는 생물학적 효과를 실현하는데 필수적이거나 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 전염병 치료 또는 예방을 위한 면역조절자의 유효량은 미생물에 노출시 면역 반응의 발달을 야기하여, 대상체 내 미생물의 양 감소를 도모하고, 바람직하게는 미생물의 박멸을 도모하는 데 필수적인 양이다. 임의의 특정 적용을 위한 유효량은 치료되는 질병 또는 병태, 대상체의 크기 또는 질병 또는 병태의 중증도와 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 당업자는 과도한 실험을 필요하게 만들지 않으면서 면역조절자 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다.
용어 "사이토카인"은 면역 증강 단백질 패밀리를 지칭한다. 사이토카인 패밀리에는 조혈 성장 인자, 인터류킨, 인터페론, 면역글로불린 슈퍼패밀리 분자, 종양 괴사 인자 (TNF) 패밀리 분자 및 케모카인 (즉, 세포, 특히 포식 세포의 이동 및 활성화를 조절하는 단백질) 이 포함된다. 예의 사이토카인에는 제한 없이 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-12 (IL-12), 인터류킨-15 (IL-15), 인터류킨-18 (IL-18), 인터페론-α (IFNα), 및 인터페론-γ (IFNγ) 가 포함된다.
용어 "유발하다"는, 활성화하다, 자극시키다, 생성하다 또는 상향조절하다라는 용어와 상호교환해서 사용될 수 있다.
대상체에서 용어 "면역 반응을 유발하다"란 면역 반응의 활성을 특이적으로 제어하거나 이에 영향을 끼치는 것을 지칭하고, 이에는 면역 반응 활성화, 면역 반응 상향조절, 면역 반응 증강 및/또는 면역 반응 변경 (예컨대, 해가 되거나 효과적이지 못한 것으로부터 유익하거나 보호적인 것으로 대상체 내 우세한 유형의 면역 반응을 결국 변경시키는 면역 반응의 유형을 유발시킴으로써) 을 포함할 수 있다.
용어 "작동적으로 연결된"이란, 트랜스펙션 될 때 (즉, 형질전환, 형질도입, 또는 트랜스펙션시), 분자가 숙주 세포 내로 발현될 수 있도록 하는 방식으로 전사 제어 서열에 핵산 분자를 연결하는 것을 지칭한다. 전사 제어 서열은 전사의 개시, 신장 및 종료를 제어하는 서열이다. 특히 중요한 전사 제어 서열은 프로모터, 인핸서, 작동자 및 억제자 서열과 같이 전사 개시를 제어하는 것이다. 각종 이러한 전사 제어 서열이 당업자에게 공지되어 있다. 바람직한 전사 제어 서열에는 조류, 어류, 포유류, 박테리아, 바이러스, 식물 및 곤충 세포에서 기능하는 것이 포함된다. 임의의 전사 제어 서열이 본 발명에 이용될 수 있지만, 이 서열은 면역원 또는 면역 자극 단백질을 인코딩하는 서열과 자연적으로 연합된 자연 발생적 전사 제어 서열을 포함할 수 있다.
용어 "핵산 분자" 및 "핵산 서열"은 상호 교환해서 사용될 수 있으며, 이에는 DNA, RNA, 또는 DNA 또는 RNA 의 유도체가 포함될 수 있다. 이 용어는 또한 올리고뉴클레오티드 및 더 큰 서열, 예컨대 플라스미드, 본원에 기재된 면역자극성 플라스미드를 포함하고, 단백질 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산 분자와 조절 영역, 인트론 또는 기타 비-코딩 DNA 또는 RNA 를 포함하는 핵산 분자 양자 모두를 포함한다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드는 약 1 내지 약 500 뉴클레오티드의 핵산 서열을 갖고, 더욱 전형적으로는 길이가 약 5 뉴클레오티드 이상이다. 핵산 분자는 포유류, 어류, 박테리아, 곤충, 바이러스, 식물, 합성 공급원 또는 그 조합물을 비롯해 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 핵산 분자는 재조합 DNA 기술 (예, 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR), 증폭, 클로닝) 또는 화학적 합성과 같은 당업계에 통상 공지되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 핵산 분자는 천연 핵산 분자 및 그의 상동체를 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 방법에서 유용한 면역 반응을 유발하는 핵산 분자의 능력을, 이러한 개질이 실질적으로 방해하지 않도록 하는 방식으로 뉴클레오티드가 삽입, 결실, 치환 또는 역위되어져 개질된 핵산 분자 및 천연 대립유전자 변이체를 포함한다. 핵산 상동체는 당업계에 공지된 다수의 방법을 이용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 본원에 참조로 통합되어 있는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989)] 참조).
용어 "선택가능 마커" 및 "선택가능 마커 유전자"는 유기체를 보호하는 생성물을 인코딩하는 유전자를 지칭하며, 여기서 상기 유전자는 유기체를 통상적으로 사멸시키거나 그의 성장을 저해하는 조건 또는 선택적 제제 (예, 항생제) 로부터 발현된다. 선택가능 마커 유전자는 가장 흔한 항생제 내성 유전자 (예, 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 클로르암페니콜 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 등) 이다. 따라서, 예를 들어 E. coli 세포를, 카나마이신 내성 유전자를 인코딩하는 플라스미드를 도입하는 형질전환 절차에 적용시킨 다음, 카나마이신 함유 배지상 또는 그 안에서 성장시키는 경우, 성공적으로 플라스미드를 취해 카나마이신 내성 유전자를 발현시킨 E.coli 만이 살아 남을 것이다. 용어 "선택가능 마커" 및 "선택가능 마커 유전자"는 또한 유기체의 성장에 필수적인 화합물 합성에 관여된 효소를 코딩하는 유전자를 포함한다. 필수 화합물을 합성할 수 없는 영양요구성 유기체에 도입되는 경우, 이러한 유전자는 그 유기체를 필수 화합물이 보충된 배지에서 성장 가능하는 것을 허용한다. 예를 들어, 리신 생합성에 관여된 효소 내 돌연변이 또는 이의 부재로 인해 아미노산 리신에 대해 영양요구성인 박테리아 세포는 통상적으로 리신이 보충되어지지 않은 배지 상에서 성장할 수 없다. 이러한 박테리아가 리신 생합성에 관여된 효소를 인코딩하는 플라스미드를 도입하는 형질전환 절차에 적용되는 경우, 성공적으로 플라스미드를 취해 효소를 발현시킨 박테리아는 리신이 보충되지 않은 배지에서 성장시 생존할 것이다. 용어 "선택가능 마커" 및 "선택가능 마커 유전자"는 독/해독제 선택을 허용하는 유전자를 추가로 포함한다. 예를 들어, ccdB 유전자는 세포 분할에 필수 효소인 DNA 자이라아제에 결합하는 단백질을 인코딩한다. DNA 자이라아제에 결합되자마자, ccdB 유전자 생성물은 유전자 복제를 손상시키고 세포사를 유도한다. 즉, ccdB 유전자 생성물을 발현하는 박테리아는 살아남을 수 없다. ccdA 유전자는 ccdB 유전자 생성물의 천연 저해제로서 작용하는 단백질 ("해독제") 를 인코딩한다. 따라서, 박테리아 게놈에서 ccdB 유전자를 갖는 박테리아를 ccdA 유전자 생성물을 인코딩하는 플라스미드를 도입하는 형질전환 절차에 적용시키는 경우, 성공적으로 플라스미드를 취해 ccdA 유전자를 발현하는 세포만이 살아 남을 것이다.
용어 "선별가능 마커" 및 "선별가능 마커 유전자"는 선별가능 마커 유전자를 발현하는 세포와 선별가능 마커 유전자를 발현하지 않는 세포를 관찰자가 구별 가능하게 하는 생성물을 인코딩하는 유전자를 지칭한다. 선별가능 마커 유전자 시스템은 당업계에 익히 공지되어 있고, 이는 예를 들어 lacZ 유전자 및 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 청색 형광 단백질 (BFP) 또는 시안색 형광 단백질 (CFP) 과 같은 형광 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다.
본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 중추신경계를 갖는 살아있는 유기체를 지칭한다. 특히, 대상체에는 이에 제한되는 것은 아니나, 인간 대상체 또는 환자 및 반려동물이 포함된다. 예의 반려동물에는 가축 포유동물 (예, 개, 고양이, 말), 유의미한 상업 가치를 갖는 포유동물 (예, 조류 종, 소 종, 젖소, 육우, 스포츠 동물), 유의미한 과학적 가치가 있는 포유동물 (예, 멸종 위기에 처한 종의 포획 또는 자유 견본), 또는 그 밖의 가치를 갖는 포유동물이 포함될 수 있다. 적합합 대상체는 또한 하기를 포함한다: 마우스, 래트, 개, 고양이, 유제류, 예컨대 소, 돼지, 양, 말 및 염소, 토끼목, 예컨대 토끼 (rabbit, hare), 기타 설치류 및 영장류, 예컨대 원숭이, 침팬지 및 유인원. 대상체는 가축이거나 야생이든 간에 조류 종의 임의 일원일 수 있고, 사육, 고기 또는 알 생산을 위해 시중에서 길러질 수 있다. 예의 조류 종은 제한 없이 닭, 칠면조, 거위, 오리, 꿩, 메추라기, 비둘기, 타조, 새장에 갇힌 새, 동물학상 수집 조류장 내 새 등이 포함된다. 대상체는 가축이거나 야생이든 간에 소 종의 임의 일원일 수 있고, 사육, 고기 또는 우유 생산을 위해 시중에서 길러질 수 있다. 예의 소 종에는 제한 없이 앤텔로프, 버팔로, 야크, 소, 들소, 등이 포함된다. 소의 종에는 제한 없이, 암소 (cows), 황소 (bulls), 수송아지, 암송아지, 황소 (ox), 육유 (beef cattle), 젖소 등이 포함된다. 대상체는 양식 종의 임의 일원일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니나, 이에는 물고기, 갑각류, 연체동물, 담수 또는 염수에의 생물의 임의 종이 포함된다. 일부 양상에서, 대상체는 전염병이 있다고 진단되어질 수 있거나, 전염병의 위험에 처할 수 있거나 또는 전염병을 경험할 수 있다. 대상체는 자궁 내, 막 태어나거나, 청소년기, 성인기, 중간 연령 또는 노년기를 비롯한 임의 연령대일 수 있다.
실시예
하기의 비제한적인 실시예는 본 발명을 추가로 설명하도록 제공된다.
실시예 1: 단핵구 세포주를 사용하여 면역조절자 조성물로 시토졸 DNA 감시 분자를 활성화시킴.
본원에 기재된 면역조절자 조성물은 DNA 감시 분자에 의해 활성화된 전사 인자인 인터페론 조절 인자 3 (IRF-3) 을 활성화시키는데 사용되었다. 급성 단구성 백혈병 환자로부터 유래된 인간 대식세포-유사 (단핵구) 세포주 (THP-1) 가 단핵구 기능에 대한 모델 시스템으로서 사용된다. THP1-Blue ISG 세포 (Invitrogen) 를 인터페론 조절 인자 (IRF)-유도성 분비 알칼리 포스파타아제 (SEAP) 수용체 구축물 (IRF-THP1 세포) 의 적합한 통합에 의해 생성시켰다. THP-1 세포는 내생적으로 기능적 STING (Stimulator of interferon genes: 인터페론 유전자의 자극제) 경로 분자 뿐 아니라 시토졸 DNA 인지 수용체를 함유한다. STING 는 신호를 받고, 그 자체가 IRF-3 을 통해 작용하는 시토졸 DNA 감시 분자이다. STING 의 활성화는 SEAP 생성을 유도하는데, 이것은 이후 배양 상청액에서 검출가능하다. 따라서, IRF-3 수용체 SEAP 구축물의 활성화는 STING 경로의 활성화와 연관된다.
안정적으로 트랜스펙션된 IRF-THP-1 세포주를, 상이한 IRF 경로의 포괄적인 활성화제인 IFN-α1 에 의해, 그 기능성을 시험하였다. IRF-THP-1 세포를 IRF-3 활성화를 위해 양성 대조군으로서 인간 인터페론 α1 (IFN α1) 과 접촉시켰다. 특정 SEAP 신호가 IFN-α1 투여에 따라 검출되었고, 명백한 용량-반응 관련성이 관찰되었다. 도 4 는 IRF-3 의 IFN α1 활성화를 그래프로 나타낸다. IRF-의존성 신호축은 IRF-THP-1 세포주에서 기능적이다.
비제형화된 플라스미드 및 리포좀-제형화된 플라스미드 (도 5, Seq No 2-F) 로서의 SEQ ID NO. 2 로의 초기 실험은 SEQ ID NO. 2 비제형화된 것이 심지어 매우 높은 농도 (50 ㎍/mL) 에서도 특정 신호를 도출하지 않는다는 것을 제시하였다. 반대로, Seq No 2-F 는 IFN-α1 대조군과 필적할만한 규모로 SEAP 신호를 ng/mL 범위에서 상승시켰다 (도 5).
IRF-THP-1 세포를 본원에 기재된 면역조절자 조성물과 접촉시켰다. 면역조절자 조성물에는 SEQ ID NO. 2 비제형화된 것 (Seq No 2), SEQ ID NO. 1 비제형화된 것 (Seq No 1), SEQ ID NO. 2-리포좀 (DOTIM/콜레스테롤) 운반체로 제형화된 것 (Seq No 2-F), SEQ ID NO. 1 리포좀 (DOTIM/콜레스테롤) 운반체로 제형화된 것 (Seq No 1-F), 및 PBS (음성 대조군) 가 포함되었다. 리포좀 성분 없이, DNA 단독으로는 IRF-3 을 활성화시키지 않았다 (도 6). DNA/리포좀 조성물은 최저 농도에서 IRF-3 을 활성화시켰다 (도 6).
IRF-THP-1 세포를 본원에 기재된 면역조절자 조성물 및 대조군과 접촉시켰다. 면역조절자 조성물에는 SEQ ID NO. 2 비제형화된 것 (Seq No 2), SEQ ID NO. 1 비제형화된 것 (Seq No 1), SEQ ID NO. 2- 리포좀 (DOTIM) 운반체로 제형화된 것 (Seq No 2-F), 및 SEQ ID NO. 1 리포좀 (DOTIM) 운반체로 제형화된 것 (Seq No 1-F) 이 포함되었다. 대조군에는 PBS (음성 대조군), 리포좀 성분 (제형 단독), HSV-60-Lyovec (공지된 세포질 DNA 인지 활성화제), VACV-Lyovec (공지된 세포질 DNA 인지 활성화제), 및 Poly-(dA/dT)-Lyovec (공지된 세포질 DNA 인지 활성화제) 가 포함되었다. 리포좀 성분 없이, DNA 단독으로는, IRF-3 을 활성화시키지 않았다 (도 7 및 도 8). DNA/리포좀 조성물은 IRF-3 을 활성화시켰다 (도 7 및 도 8). 리포좀 성분은 그 자체가 IRF3 리포터 유전자 발현에 대해 영향을 주지 않았다 (도 7 및 도 8).
본원에 기재된 면역조절자 조성물은 공지된 세포질 DNA 인지 활성화제에 의한 활성화와 유사하게, 일부 경우에서는 더욱 양호하게, 시토졸 DNA 감시 분자를 활성화시켰다 (도 9 및 도 10).
비제형화된 플라스미드로서 및 리포좀-제형화된 플라스미드 (Seq No 2-F) 로서의 SEQ ID NO. 2 의 용량-반응 곡선은 고려되는 전체 농도 범위 (도 11; 1.5625 - 50 ㎍/ml) 에 걸쳐 "네이키드" 플라스미드 (Seq No 2) 가 PBS 희석 대조군과 동일하고, 따라서, 자극적이지 않다는 것을 확인하였다. 대조적으로, Seq No 2-F 는 최고 희석 (1.5625 ㎍/ml 및 3.125 ㎍/ml) 에서 SEAP 신호를 상승시킨 반면, 더 높은 농도에서는 심지어 PBS 대조군 아래로, SEAP 분비 용량의 손실을 도출하였다. 현미경 검사는 더 높은 농도에서 Seq No 2-F 의 세포독성이 이 효과에 대한 이유일 수 있음을 제안한다. 양성 대조군 인터페론-α1 은 용량-의존적 반응을 상승시켰다.
비제형화된 플라스미드로서 및 리포좀-제형화된 플라스미드 (Seq No 2-F, Seq No 1-F) 로서의 Seq No 2 및 Seq No 1 의 용량-반응 곡선은 고려되는 전체 농도 범위 (0.39 - 25 ㎍/ml) 에 걸쳐 두 비제형화된 플라스미드가 특정한 신호를 보이지 않는다는 것을 확인하였다 (도 12). 대조적으로, Seq No 2-F 및 Seq No 1-F 는 최고 희석 (0.39 ㎍/ml, 0.78 ㎍/ml 및 1.5625 ㎍/ml) 에서 SEAP 신호를 상승시킨 반면, 더 높은 농도에서는 심지어 PBS 대조군 아래로, SEAP 분비 용량의 손실을 도출하였다. 현미경 검사는 더 높은 농도에서 Seq No 2-F 및 Seq No 1-F 의 세포독성이 이 효과에 대한 이유일 수 있음을 제안한다.
비제형화된 플라스미드로서 Seq No 2 및 Seq No 1 은 심지어 25 ㎍/ml 에서도, PBS 배경에 대해 특정한 신호를 보이지 않는다 (도 13). 대조적으로, 리포좀-제형화된 플라스미드 (Seq No 2-F, Seq No 1-F) 는 195 ng/ml 에서 현저한 자극을 나타내었던 반면, 리포좀 대조군은 신호를 보이지 않았다. STING 경로를 지정하는 표준 리간드 HSV-60-LyoVec 및 VACV-70-LyoVec 과 비교하여, Seq No 2-F 및 Seq No 1-F 는 더 강한 자극 용량을 나타내었다. 여러 개의 상이한 세포질 인지 경로를 지정하는 Poly(dA/dT)/LyoVec 가 비록 더 높은 농도일지라도, 본 시험 시스템에서 가장 강한 신호를 나타내었다.
비제형화된 플라스미드로서 Seq No 2 및 Seq No 1 은 PBS 배경에 대해 특정한 신호를 보이지 않는다. 대조적으로, 리포좀-제형화된 플라스미드 (Seq No 2-F, Seq No 1-F) 는 동일한 농도에서 현저한 자극을 나타내었던 반면, 리포좀 대조군은 신호를 보이지 않았다 (도 14). STING 경로를 지정하는 표준 리간드 HSV-60-LyoVec 및 VACV-70-LyoVec 뿐 아니라 Poly(dA/dT)/LyoVec 과 비교하여, Seq No 2-F 및 Seq No 1-F 는 유사한 농도로 적용했을 때, 더 강한 자극 용량을 나타내었다.
도 14 에서 제시되는 바와 같이, 비제형화된 플라스미드로서 Seq No 2 및 Seq No 1 은 PBS 배경에 대해 특정한 신호를 보이지 않는다. 대조적으로, 리포좀-제형화된 플라스미드 (Seq No 2-F, Seq No 1-F) 는 동일한 농도에서 현저한 자극을 나타내었던 반면, 리포좀 대조군은 신호를 보이지 않았다. STING 경로를 지정하는 표준 리간드 HSV-60-LyoVec 뿐 아니라 Poly(dA/dT)/LyoVec 과 비교하여, Seq No 2-F 및 Seq No 1-F 는 유사한 농도로 적용되었을 때, 더 강한 자극 용량을 나타내었다 (도 15). 트랜스펙션제 LyoVec 그 자체는 IRF-THP-1 세포를 자극하지 않는다. 비제형화된 플라스미드 Seq No 2 및 Seq No 1 이 복합화 성분으로서 LyoVec 과 함께 적용되는 경우, IRF 경로의 자극은 명백하다.
비제형화된, 리포좀-제형화된 버전 (Seq No 2-F 및 Seq No 1-F) 으로서 및 LyoVec-제형화된 버전으로서 IRF-THP-1 리포터 유전자 시스템 중의 Seq No 2 및 Seq No 1 의 용량 반응 곡선을 sub-㎍/ml 농도 범위로 생성하였다 (도 16). 비제형화된 플라스미드는 비활성이었던 반면, 리포좀-제형화된 버전은 LyoVec 제형에 비해 우수한 투여량 반응을 나타내었고, 리포좀이 낮은 농도 범위에서 우수한 제형임을 제안한다.
비제형화된, 트랜스펙션제-제형화된 (LyoVec (도 17), Mirus (도 18), X-tremeGen (도 19)) 버전으로서 IRF-THP-1 리포터 유전자 시스템 중의 Seq No 2 및 Seq No 1 의 용량 반응 곡선을 sub-㎍/ml 농도 범위로 생성하였다. 비제형화된 플라스미드는 비활성이었던 반면, 트랜스펙션제-제형화된 버전은 명백한 투여량 반응과 함께 IRF 자극 신호를 나타내었다. 이것은 THP-1 세포의 세포질 DNA 인지 메커니즘에 대한 플라스미드의 자극 전위에 대한 추가의 지표이다.
실시예 2: 흑색종 세포주를 사용하는 면역조절자 조성물로의 시토졸 DNA 감시 분자의 활성화.
B16-Blue™ ISG 세포는 쥣과 B16 F1 흑색종 세포주로부터 유래되었다. 이들은 다량체성 ISRE 에 의해 향상된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 통제 하에, 분비된 배아 알칼리 포스파타아제 (SEAP) 리포터 유전자를 발현한다. B16-Blue™ ISG 세포의 IFN, 시클릭 디뉴클레오티드, 예컨대 cGAMP, 또는 유형 I IFN 유도제, 예컨대 트랜스펙션된 폴리(dA:dT) 로의 자극은, I-ISG54 프로모터의 활성화 및 SEAP 의 생성을 촉발시킨다.
B16-Blue™ ISG 세포주를 상이한 IRF 경로의 포괄적인 활성화제인 IFN-α1 에 의해, 그 기능성을 시험하였다. 특정 SEAP 신호가 IFN-α1 투여량에 따라 검출되었고, 명백한 용량-반응 관련성이 명백하였다 (도 20). 상기 실험은 IRF-의존성 신호축이 상기 세포주에서 기능적이라는 것을 암시한다.
B16-Blue™ ISG 세포는 리포좀 제형화된 플라스미드 Seq No 2-F 및 Seq No 1-F 에 의해 625 ng/ml 에서 자극되었던 반면, 비제형화된 플라스미드는 PBS 대조군과 비교하여 8 배 더 높은 농도 (5 ㎍/ml) 에서 특정한 신호를 나타내지 않았다 (도 21). 마찬가지로, 리포좀 제형 단독은 자극성이지 않았다. 대조군 3',3'-cGAMP 및 폴리-dA/dT 는 예상되는 특정 신호를 나타내었다.
실시예 3. STING 녹아웃 세포주를 사용하는 면역조절자 조성물로의 시토졸 DNA 감시 분자의 활성화.
THP1-Blue™ ISG-KD-STING 세포를 STING 유전자 발현의 녹아웃을 통해 THP1-Blue™ ISG 세포로부터 생성하였다. 그 결과, THP1-Blue™ ISG-KD-STING 세포는 STING 발현의 상당한 감소를 나타낸다.
비교예에서, 인터페론-α1 (IFN-α1) 은 IRF 에 대한 이의 신호가 STING 에 의존적이지 않으므로, 대조군으로서 사용하였다. 기타 시험 화합물의 신호를 1 로서 IFN-α1 신호 세트에 표준화하였다. 비제형화된 플라스미드로서 Seq No 2 및 Seq No 1 및 리포좀 제형 단독은 THP-1-Blue™ ISG (도 22) 또는 THP-1-Blue™ ISG-STING 세포 (도 23) 모두에서, 5 ㎍/ml 에서 PBS 배경에 대해 특정 신호를 나타내지 않았다. 대조적으로, 리포좀-제형화된 플라스미드 (Seq No 2-F, Seq No 1-F) 는 312.5 ng/ml 에서 THP-1-Blue™ ISG 세포의 현저한 자극을 나타낸 반면, THP-1-Blue™ ISG-STING 에서 이 신호는 67% (Seq No 2-F) 에서 91% (Seq No 1-F) 까지 하향조절되었다. 이 결과는 STING-매개된 경로가 본원에 기재된 면역조절자에 의해 활성화된 하나의 시토졸 DNA 감시 경로라는 것을 나타낸다.
실시예 4: 인간 단핵 세포주 및 쥣과 흑색종 세포주를 사용하는 면역조절자 조성물로의 시토졸 DNA 인지의 활성화.
Seq No 2 면역조절자의 시토졸 DNA 인지를 THP1-Blue™ 및 B16-Blue™ 세포주를 사용하여 탐구하였다. 세포 배양물을 Seq No 2-F, 비제형화된 Seq No 2, 또는 적합한 대조군 조성물로 처리하였다.
THP1-Blue™ 세포주를 리포좀 제형화된 Seq No 2-F 에 의해 자극시켰다. Seq No 2-F 처리된 세포에 대한 SEAP 신호는 SEAP 신호를 생성하기 위해 양성 대조군으로 처리된 세포보다 대략 4 배 컸다. 그러나, 비제형화된 플라스미드로 처리된 THP1-Blue™ 세포는 시험된 임의의 농도에서 특정한 신호를 보이지 않았다 (도 24A).
유사하게, B16-Blue™ 세포주는 또한 Seq No 2-F 처리에 의해 자극되었으나, 비제형화된 플라스미드로는 자극되지 않았다. Seq No 2-F 로의 자극은 양성 대조군으로의 자극보다 낮은 농도에서 큰 신호를 발생시켰다 (도 24B). 이들 결과는 Seq No 2-F 가 시토졸 DNA 인지를 위한, 강력한, 활성화 리간드인 것을 보여준다.
실시예 5: STING 녹아웃 및 녹다운 세포주를 사용하는 면역조절자 조성물로의 시토졸 DNA 감시 분자의 활성화.
B16-Blue™ ISG-KO-STING 세포는 STING 유전자의 안정한 녹아웃을 통해 쥣과 B16-F1 흑색종-유래된 세포주인 B16-Blue™ ISG 세포주로부터 생성되었다. 이들은 다량체성 ISRE 에 의해 향상된 IFN-유도성 ISG54 프로모터로 구성되는 I-ISG54 프로모터의 통제 하에, 분비된 배아 알칼리 포스파타아제 (SEAP) 리포터 유전자를 발현한다. 이들 세포는 시토졸 DNA, DMXAA, 기본형 (canonical) 및 비-기본형 CDN 에 반응하지 않지만, 유형 I 및 유형 II IFN 에 반응하는 능력은 보유한다. 이들 세포의 IFN 로의 자극은 I-ISG54 프로모터의 활성화 및 SEAP 의 생성을 촉발시킨다.
THP-1-Blue™ ISG-KD-STING 세포 및 THP-1-Blue™ 세포의 Seq No 2-F 로의 처리를 비교하였다. 녹-다운 세포에서 발생하는 SEAP 신호는 THP-1-Blue™ 세포에서 발생하는 신호의 50% 미만이었다 (도 25A). B16-Blue™ ISG-KO-STING 세포의 Seq No 2-F 로의 처리를 또한 B16-Blue™ 의 Seq No 2-F 로의 처리와 비교하였다. B16-Blue™ 세포의 처리가 양성 대조군의 것과 유사한 SEAP 신호를 산출한 반면 (도 25B), 녹아웃 세포의 처리는 PBS 대조군의 것 외에 신호를 발생시키지 않았다 (도 25B).
상기 결과는 IRF 경로의 Seq No 2-F 활성화가 STING-의존적이라는 것을 암시한다.
실시예 6: STING 녹아웃 세포주 및 STING 야생형 세포주를 사용하는 면역조절자 조성물로의 시토졸 DNA 감시 분자의 활성화 비교.
STING 가 Seq No 2-F 및 Seq No 1-F 인지에 필수적인 것인지 측정하기 위해 STING 녹아웃 세포주 및 STING 야생형 세포주를 사용하였다.
이들 세포주는 그 신호 전달 경로가 STING 유전자의 결실에 의해 영향을 받지 않아야만 하는 사이토카인인 (이것은 본 실험에서 행해진 관찰임) 인터페론-β (IFN-β) 로의 인큐베이션에 의해 첫번째로 입증되었다. 도 26 을 참고하면, 공지된 STING 경로 활성화제인, LyoVec 와 복합체를 형성한 헤르페스 심플렉스 (Herpes simplex) 바이러스 DNA (HSV-LyoVec) 및 시클릭 디뉴클레오티드 2',3'-cGAMP 를 세포주 특성을 입증하기 위해 사용하였다. 두 작용제가 부모 B16-Blue ISG 세포주에서 상당한 신호를 발생시켰던 반면, 이들 신호는 B16-Blue ISG-KO-STING 세포에서 완전히 소멸되었다.
복합체를 형성하지 않은 Seq No 2 또는 Seq No 1 플라스미드의 적용은 두 세포주에서, PBS 대조군과 비교하여, 신호를 산출하지 않거나 또는 오직 미약한 신호만을 산출하였다. 리포좀-복합체의 SEQ ID NO. 2 (Seq No 2-F) 및 SEQ ID NO. 1 (Seq No 1-F) 은 모체 B16-Blue ISG 세포주에서 강한 신호를 산출했던 반면, B16-Blue ISG-KO-STING 세포에서는 신호가 관찰되지 않았다.
함께 취합하여, 상기 데이터는 인터페론-반응 요소 판독을 한 쥣과 B16 흑색종 세포에서 적어도, STING 경로가 Seq No 2-F 및 Seq No 1-F 의 인지에 필수적이라는 것을 암시한다.
실시예 7: 돼지에서 인터페론 방출의 생체 외 유도.
본 연구의 목적은 돼지로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PMBC) 에서의 인터페론 생성에 대한 Seq No 2-F 의 영향을 측정하기 위한 것이었다.
수포성 구내염 바이러스 (VSV: Vesicular stomatitis virus) 세포용해 어세이를 단리된 PMBC 에서 유형 1 인터페론 발현을 검출하기 위해 사용하였다. 3 마리의 개별 돼지로부터 단리된 PMBC 에 대해 VSV 어세이를 수행하였다. PMBC 를 동시자극 (UV-비활성화된 헤르페스 바이러스) 과 함께 또는 없이 제형화된 Seq No 2-F 로 처리하였다. 표 1 을 참고하면, 2, 4 및 6 일 경과에 걸쳐 상이한 농도의 Seq No 2 로 분석을 실시하였다.
표 1: 돼지 PMBC 로부터의 인터페론 방출
Figure pct00001
Figure pct00002
동결보존된 세포에 대항하여 신선하게 단리된 PMBC 의 자극 행동을 비교하기 위해, 또다른 VSV 어세이 (시험 IV) 를 돼지로부터 냉동된 PBMC 로 수행하였다. 이를 위해, 돼지 번호 2008 의 신선하고 동결보존된 세포를 직접 비교에 대해 사용하였다.
결과
Seq No 2-F 는 PMBC 에서 인터페론 방출의 고도로 효과적인 자극제인 것으로 밝혀졌다. 부가적인 동시자극은 부가적인 효과가 검출되지 않았으므로, 인터페론 방출에서 추가 증가를 산출하지 않았다. 방출된 인터페론의 생물학적 활성은 실험 단위 (EU: experimental unit) 로 기재하였다. 실험 단위는 50% CPE 로 정의되었다. ml 로의 EU 단위의 계산은 하기 식: 2x X 10 = EU / ml 으로 실시하였다.
독성 / 과민증
표 1 을 참고하면, 최고 농도의 SEQ ID NO. 2, 100 - 25 ㎍/ml 은, 면역조절자-관련 과민증, 및 감소된 인터페론 방출 또는 이의 결핍을 산출하였다. 세포의 현미경 분석으로 독성을 암시하는 형태학적 변화를 검출하였다. 인터페론 방출에 대한 어세이를 또한 3 ㎍/ml 내지 0.003 ug/ml 의 범위의, SEQ ID NO. 2 의 저 농도로 수행하였다. 저 농도 중 어느 것도 고 농도에서 보인 것과 유사한 독성을 나타내지 않았다.
인터페론 방출
Seq No 2-F 의 투여는 인터페론 방출을 산출하였다. 모든 3 마리의 돼지에서 (시험 I, II, 및 III), Seq No 2-F 는 용량-의존적인 방식으로 IFN 방출을 유도하였다 (도 27A-C). 방출된 IFN 의 양은 각각의 동물에서 개별적으로 상이하였다.
Seq No 2-F 로 처리된 동결보존된 PBMC 는 IFN 을 방출하였다; 그러나, 방출된 IFN 의 평균 양은 신선하게 단리된 세포로부터 방출된 IFN 보다 대략 4 배 낮았다 (표 1, 시험 I 및 시험 IV 참고).
실시예 8: 소에서 IFN 방출의 생체 외 유도.
본 연구의 목적은 소로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PMBC) 에서의 인터페론 생성에 대한 제형화된 Seq No 2 의 효과를 측정하는 것이었다.
유형 1 인터페론 발현을 검출하기 위해 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 세포용해 어세이를 사용하였다. VSV 어세이 (시험 I, II, 및 III) 를 3 마리의 개별 소로부터 단리된 PMBC 에 대해 수행하였다. PMBC 를 동시자극 (UV-비활성화된 헤르페스 바이러스) 과 함께 또는 없이 제형화된 Seq No 2-F 둘다로 처리하였다. 표 2 를 참고하면, 2 및 4 일 경과에 걸쳐 상이한 농도의 Seq No 2-F (3 ㎍/ml 내지 0.003 ㎍/ml) 로 분석을 실시하였다.
표 2: 소 PMBC 로부터의 인터페론 방출
Figure pct00003

동결보존된 세포에 대항하여 신선하게 단리된 PMBC 의 자극 행동을 비교하기 위해, VSV 어세이 (시험 IV) 를 시험 I 에서 사용된 소로부터 냉동된 PBMC 로 수행하여, 동결보존된 세포와 소로부터 신선하게 단리된 세포 사이의 직접 비교를 하였다.
Seq No 2-F 는 PMBC 에서의 인터페론 방출의 고도로 효과적인 자극제인 것으로 밝혀졌다. 부가적인 동시자극은 부가적인 효과가 검출되지 않았으므로, 인터페론 방출에서 추가 증가를 산출하지 않았다. Seq No 2-F 의 투여는 IFN 방출을 야기하였다. 모든 3 마리의 소에서 (시험 I, II, 및 III), Seq No 2-F-유도된 IFN 는 도 28A-C 에서 나타내는 바와 같이 용량-의존적인 방식으로 방출된다. 방출된 IFN 의 양은 각각의 동물에서 개별적으로 상이하였다. Seq No 2-F 로 처리된 동결보존된 PBMC 는 IFN 을 방출하였다; 그러나, 방출된 IFN 의 평균 양은 신선하게 단리된 세포로부터 방출된 IFN 보다 대략 5 배 낮았다 (표 2, 시험 I 및 시험 IV 참고).
실시예 9: 면역조절자 투여량 및 투여 경로의 교차 연구
면역조절자 투여량 및 투여 방법이 돼지에서의 사이토카인 발현에 준 영향을 비교하기 위해 교차 연구를 수행하였다.
Seq No 2-F 를 1 주에 1 회 (7 일 간격) 고 또는 저 투여량에서 피하로 또는 4 주의 기간 동안 고 또는 저 투여량에서 근육내로 제공하였다. 2 마리의 돼지에서 시험 성분을 제 5 주에 고 또는 저 투여량에서 천천히 정맥내로 투여하였다. Latin Square 디자인에 따른 스케줄을 표 3 에 명시한다.
돼지를 피하로 또는 근육내로 투여하였던 고 또는 저 투여량의 Seq No 2-F 로 처리하였다. 처리 전 1 시간 및 처리 후 2 시간, 6 시간, 24 시간, 및 48 시간에 혈청 및 전체 혈액 세포를 수집하여, 순환하는 혈액 세포 중의 사이토카인의 혈청 사이토카인 수준 및 mRNA 발현을 조사하였다. 처리는 표 3 에 제시된 바와 같이 교차하는 동물에서 4 회 반복하였다. 처리 사이의 간격은 7 일이었다.
표 3: 처리 할당 스케줄 (투여량/투여 경로)
Figure pct00004
마지막 시험 생성물 투여 후 2 일에 돼지를 안락사시키고, 총체적 병리학 동안 주사 부위를 검사하였다. 주사 부위의 조직 시료를 조직학 검사를 위해 샘플링하였다.
동물
돼지는 매우 건강한 돼지떼 (VOF G. v. Beek, Runderweg 10, 8219 Lelystad) 로부터 유래하였으며, 이들에게는 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스, 돼지 이유후 전신성 소모성 증후군 (post weaning multisystemic wasting syndrome), 마이코플라즈마 히오뉴모니아에 (Mycoplasma hyopneumoniae), 악티노바실루스 플뢰로뉴모니아에 (Actinobacillus pleuropneumoniae) 가 없다. 도착시 수의사 점검으로 돼지가 폐렴, 설사, 피부 또는 꼬리의 염증성 변화, 또는 기타 질병의 징후가 없었음을 밝혔다.
투여 섭생, 빈도 및 지속기간
Seq No 2-F 를 처리 스케줄에 따라 단일 샷으로 투여하였다. 근육내 또는 피하 투여를 위한 고 투여량은 205 ㎍ 이었고, 저 투여량은 2 ml 의 부피 내 20 ㎍ 이었다. 정맥내 투여를 위한 고 투여량은 5 ml 중의 50 ㎍ 이었고, 저 투여량은 5 ml 의 부피 중의 10 ㎍ 이었다.
관찰
체온을 면역조절자 투여 전 -1 일 및 투여 후 6, 24, 및 48 시간에 기록하였다. 체중을 제 -7 일에의 수술 전에 및 제 23 일 (4 마리의 돼지) 또는 제 30 일 (2 마리의 돼지) 각각에의 부검 전에 기록하였다.
분석 방법
혈액학: WBC 계수, 백혈구 백분율 조성 산정 (differential blood cell composition) (림프구, 단핵세포 및 과립구), 적혈구 계수, 헤모글로불린, 헤마토크릿, 평균 혈구 (corpuscular) 값을 표준 실험실 기술에 의해 평가하였다.
혈청 사이토카인 분석: 하기 돼지 사이토카인을 단백질 어레이 기술 (Pierce, Search light®) 에 의해 측정하였다: IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IFNγ, TNFa. Pierce SearchLight Proteome Arrays 는 웰 당 16 개 단백질까지 측정하는 멀티플렉스 어세이이다. SearchLight Arrays 는 96-웰 플레이트의 각 웰 내에 상이한 모노클로날 항체를 스폿팅함으로써 생성된다.
사이토카인 mRNA 분석: IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12 의 발현을 qPCR 기술 (Applied Biosystems) 에 의해 평가하였다. 총 RNA 를 제조자의 지침에 따라 TRIzol 시약 (Invitrogen, Breda, The Netherlands) 을 사용하여 단리하였다. 남아있는 RNA 를 50 ㎕ 의 RNase 가 없는 물에 용해시키고, Nanodrop ND-1000 (Isogen Life Sciences, IJsselstein, The Netherlands) 을 사용하여 분광광도로 정량하였다. cDNA 합성 및 Q-PCR 조건은 표준 실험실 절차에 따라 수행하였다. 사용된 프라이머에 대한 정보를 표 4 에 명시한다. 미량의 게놈 DNA 의 증폭을 감소시키기 위해, 프라이머를 상이한 엑손에 위치시켰다. 발현 안정성 및 쌍 방식 변이를 추정하기 위한 계산을 자유롭게 이용가능한 GeNorm 프로그램 (http://medgen.ugent.be/jvdsomp/genorm) 으로 수행하였다.
모든 사이토카인 mRNA 발현을 Actin B (ACTB) 의 발현과 비교하였고, 사이토카인 mRNA 의 양/ACTB mRNA 의 양을 계산함으로써 상대적인 양으로 표현하였다.
표 4. 사이토카인 mRNA 분석
Figure pct00005
통계적 분석
서술적 분석을 수행하였다. 사이토카인 mRNA 발현의 예비 추론 통계적 분석을 2-방식 ANOVA 분석 (시간; 처리) 을 실행함으로써 수행하였다. 모든 통계적 데이터는 GraphPad Prism, Windows 에 대해 버전 4 (GraphPad Software, San Diego, Ca, USA) 로 분석하였다.
결과
시험 물질 면역조절자의 투여 후 임상적인 반응은 관찰되지 않았다. 직장 체온은 도 29 에 명시된다. 체온은 돼지의 정상 온도 범위 내였다. 1 마리의 동물 (번호 7840) 이 제 3 처리일에 열성 (febrile) 온도 근처로 증가를 나타내었으나, 온도 증가는 처리와 관련되지 않았다.
시험 기간 동안 체중 증가와 관련하여 돼지 사이에서 차이를 볼 수 없었다 (도 30A 및 30B).
혈액학적 데이터가 도 31A-F, 32A-F, 및 33A-H 에 제시된다. 일반적으로, 혈액학적 데이터는 처리 전후에 정상 범위 내에 있는 것으로 밝혀졌다. 눈에 띄는 것은 처리 후 적혈구 (RBC), 헤모글로불린 (HB) 및 헤마토크릿의 평균이 저하된 것이지만, 평균은 생리학적 범위 내에 머물렀다. 평균 혈구 부피 (MCV), 혈소판, 림프구, 및 단핵구/과립구 계수는 거의 일정하게 남아있었다.
혈청 사이토카인 단백질 어레이로부터의 데이터를 표 5 (섹션 12 로부터) 에 제시한다. 평균의 계산 및 그래프 제시를 위해 "검출 한계 아래" 의 모든 값을 0.2 pg/ml 의 최저 검출가능한 수준으로 변환시켰다. 특정한 사이토카인은 혈청에서 지속적으로 검출되지 않았다, 즉, IL-1, IL-4, IL-10, IFNγ 및 TNF 는 돼지의 2/3 초과에서 검출된 반면, IL-2 및 IL-12 는 오직 돼지의 ½ 에서 검출되고, IL-6 은 하나를 제외하고는 (처리 제 4 일에 돼지 번호 7840) 검출되지 않았다. 결과를 반복된 측정 (고 투여량, 저 투여량, 근육내, 피하) 과 관련하여 도 34A-D, 35A-D, 36A-D, 37A-D, 및 38A 및 B 에 그래프로 나타내고, 정맥내 투여 후 단일 측정과 관련하여 도 39A-F, 40A-F, 및 41A-H 에 그래프로 나타내었다. 그래프는 상이한 사이토카인의 평균 함량 및 또한 시험 물질의 투여 후 사이토카인 함량의 비례적인 편차를 나타낸다. 처리-전 측정과 비교하여 눈에 띄는 변화가 IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IFNγ 및 TNF 에 대해서는 관찰되지 않았다. 2 배 초과의 평균 증가가 고 투여량의 시험 물질 면역조절자로의 근육내 투여 후에 IL-1 에 대해서 그리고 고 투여량의 시험 물질 면역조절자로의 근육내 및 피하 처리 후에 IL-2 에 대해서 관찰되었다.
표 5: 돼지 사이토카인 단백질 어레이에 의해 측정된 처리 전 후의 혈청 사이토카인 함량
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
혈액 세포 중의 사이토카인 IL-1, IL-2, IL-6, IL-10 및 IL-12 의 mRNA 의 상대적인 양을 도 41-48 에 제시한다. 기준선 값과 비교하여 300% 까지의 IL-1 의 증가가 고 및 저 투여량의 근육내 투여 후 및 고 투여량의 피하 투여 후에 관찰되었다. 처리 48 시간 후 mRNA 함량이 기준선 값으로 돌아간 후, (예비) 2-방식 ANOVA 분석 (시간, 처리) 은 편차의 원인으로서 (p-값 0.07) 시간에 대한 추세를 밝혔다. IL-2 및 IL-6 의 발현 수준에 대해 명확한 영향은 관찰되지 않았다. 200 또는 300% 까지의 IL-10 mRNA 의 발현 수준의 증가가 근육내 투여 후 돼지에서 처리 후 6 시간에 시작하는 모든 처리 그룹에서 관찰되었고, 피하로 처리된 돼지에서 처리 후 24 시간에 관찰되었다. (예비) 2-방식 ANOVA 분석 결과는 편차의 근원으로서 (p < 0.05) 시간을 밝혔다. IL-12 의 mRNA 발현 수준에서의 변화에 대해 일관적인 발견이 관찰되지 않았다.
투여 경로와 관련없이 고 및 저 투여량 투여를 비교하면, 더 강한, 투여량 관련 효과가 IL-1 및 IL-10 변화에 대해 존재하는 것으로 보인다 (도 47 및 48).
고 또는 저 투여량의 시험 물질의 정맥내 투여의 효과를 한마리의 돼지에서 각각 검사하고, 도 49A 및 B 에 명시한다.
교차 연구에서 고 및 저 투여량의 근육내 및 피하 투여 후 지질-DNA Complex Seq No 2-F 의 효과를 혈액 세포 중 상이한 사이토카인의 mRNA 발현에서의 변화, 혈청 사이토카인 함량에서의 변화, 혈액학적 발견, 임상적 징후의 출현 및 성능 범주를 연구함으로써 평가하였다. 상이한 사이토카인의 범위에 대해 혈청 사이토카인 함량에 대한 효과는 보이지 않았지만, IL-1 및 IL-10 의 mRNA 발현 분석으로 처리 후 순환 혈액 세포에서 (용량-의존적) 증가를 밝혔다. IL-1 은 전-염증성 사이토카인이며, 이것은 다수의 상이한 세포 유형에 의해 생성되고 그에 작용한다. 전-염증성 매개체의 기능 다음으로, IL-1 은 강력한 Th2 자극제이다. IL-10 은 가장 중요한 항-염증성 사이토카인 중 하나인 것으로 간주되며, Th1 사이토카인의 강력한 억제제이고, 단핵구/대식세포 전-염증성 사이토카인 합성의 불활성화제로서 알려져 있다.
시험 물질의 임의의 투여 후 임상 징후가 관찰되지 않았으므로, 치료는 부작용을 초래하지 않았다. 또한 WBC 또는 백혈구 백분율 산정에 대해서도 영향이 관찰되지 않았다. 적혈구 계수, 헤모글로불린 및 헤마토크릿의 기재된 변화가 시험 물질 그 자체 또는 시험 물질의 투여와 관련이 있는지의 여부는 결정적이지 않은 것으로 남아있지만, 스트레스 상황은 카테터를 사용함으로써 치료 단계 동안 가능한 한 많이 제거되었다.
실시예 10: 면역조절자 투여의 타이밍
본 연구의 목적은 감염 전 Seq No 2-F 를 투여하는 것 및 Seq No 2-F 의 후속 투여가 만헤이미아 하에몰리티카 (Mannheimia haemolytica) 감염 및 BRD 에 대항하여 효과적인지를 결정하고자 하는 것이었다.
40 마리의 3-개월령 홀스테인 거세소 (Holstein steer) 에게 60 mL 및 108 CFUs/mL 의 만헤이미아 하에몰리티카로의 접종 1 일 전 및 접종 1 일 후에 Seq No 2-F 를 투여하였다. 접종 후 5 일에 부검을 수행하였다.
결과는 접종 1 일 전 및 접종 1 일 후 처리를 받은 거세소에서의 폐 병변 백분율이 대조군 (대략 10% 및 27%, 각각) 에 비해 대략 10% 적었다는 것을 보여준다 (도 50A). BRD 로 인한 폐사율은 대조군과 비교하여 처리를 받은 거세소에서 상당히 감소하였다. 대조군 거세소의 20% 와 비교하여, 처리된 거세소의 오직 2.5% 만이, BRD 로 인한 폐사율을 경험하였는데 (도 50B), 이는 만헤이미아 하에몰리티카에 대한 노출 전 첫번째 처리 및 노출 후 1 일에 두번째 노출이 폐 병변 및 질병에 대항하여 보호적 효과를 갖는다는 것을 암시한다.
실시예 11: BRD 로 진단된 소에 대한 조합 요법
본 연구의 목적은 Seq No 2-F, 항생제, 및 Seq No 2-F 및 항생제를 포함하는 조합 요법으로 소에서의 BRD 치료의 효능 및 순 회수 (net return) 를 비교하려는 것이었다.
연구 집단
BRD 에 대해 고위험군으로 간주되었던 400 내지 500 lbs 사이의 평균 체중을 가진 212 마리의 갓 젖을 뗀 어린 암소를 참여를 위해 선택하였다. 어린 암소를 3 가지 처리 그룹으로 나눴다. 진단 후, 첫번째 그룹 (n = 78) 에는 피하주사한 5.7 ml/cwt 의 Baytril® 100 (엔로플록사신) 을 수여하였다. Baytril® 100 은 BRD 의 처리에 사용된 항미생물제이다. 두번째 그룹 (n = 77) 에는 근육내 전달된 2 mL 의 Seq No 2-F 를 수여하였다. 세번째 그룹 (n = 57) 에는 피하 전달된 5.7 ml/cwt 의 Baytril® 100 및 근육내 전달된 2 ml 의 Seq No 2-F 를 수여하였다. 3 일 유예기간 후-진단 후, 어린 암소를 60 일 후-진단까지 관찰하였다.
3 일 유예기간 후 어느 때라도, 송아지가 여전히 BRD 진단의 임상적 요구사항을 충족시키는 경우에는, 송아지를 연구로부터 빼내 Draxxin® (툴라트로마이신) 를 투여할 것이다. 송아지가 상기 두번째 치료에 반응하지 않으면, 송아지를 다시 빼내서 Bio-Mycin® 200 (옥시테트라사이클린) 으로 세번째 처리할 것이다. 3 회 처리 후, 송아지는 만성 BRD 를 갖는 것으로 진단되어 처리를 중단할 것이다.
결과
표 6 을 참고하면, Seq No 2-F 및 Baytril® 100 의 조합은 Seq No 2-F 단독 또는 Baytril® 100 단독과 비교해 BRD 경우의 상당히 감소된 백분율이 용이하다. 조합 요법을 받은 어린 암소에 대한 평균 증체량은 또한 비교 단일 요법 그룹을 상당히 앞섰다. 조합 요법 및 Baytril® 100 처리 단독을 받은 그룹은 오직 Seq No 2-F 만을 받은 그룹과 비교하여 후속 처리를 위해 다시 빼내는 송아지 백분율이 감소하였다. 조합 요법을 받은 그룹은 또한 다른 그룹과 비교하여 만성 BRD 의 백분율이 감소하였다. 비록 그 차이가 통계적으로 유의하지는 않지만, 조합 요법 그룹 중의 송아지의 오직 18.9% 만 만성 BRD 를 발달시킨 반면, Seq No 2-F 단독을 받은 송아지의 38.7% 가 만성 BRD 를 발달시켰다.
표 6: 개별 및 조합 요법 비교
Figure pct00009
상기 결과는 본 발명의 면역조절자를 BRD 에 대항하여 효과적인 항생제와 조합하는 것이 한무리의 건강을 향상시킬 수 있음을 보여준다. 게다가, 이들 개선은 한 마리당 대략 $110 의 경제적 장점을 갖고, 따라서 생산자에게 비용-효과적인 강력한 조합 요법을 제공한다는 것을 보여주었다.
실시예 12: BRD 의 중간 위험을 가진 소에 대한 집단예방 (Metaphylaxis)
본 연구의 목적은 Seq No 2-F 가 가축사육장 소에서 BRD 를 통제하기 위해 투여되는 경우, 시판 항생제 Micotil 에 비해 열등한 지를 측정하는 것이었다.
연구 집단
본 연구를 위해 590 lbs 의 평균 체중을 가지고 BRD 에 대해 중간 위험이 있는 것으로 결정된, 젖을 뗀 송아지를 선택하였다. 진단 시, 첫번째 그룹 (n = 1002) 에는 2 ml/cwt 의 Micotil 를 투여하였고, 두번째 그룹 (n = 1002) 에는 2 ml 의 Seq No 2-F 를 투여하였다. 3 일의 유예기간을 포함하여, 소를 56 일 동안 관찰하였다.
결과
이환율, 폐사율, 평균 일일 습득 (ADG), 건조 물질 섭취 (DMI), 및 사료 대 증체량 비율을 측정하고 연구 그룹 간에 비교하였다. 열등함을 고려하기 위해서는 두 그룹 사이에 BRD 이환율에서의 10% 차이가 필요했다. Seq No 2-F 를 받은 그룹과 Micotil 을 받은 그룹 사이의 BRD 이환율의 누적발생률에서의 차이는 대략 6% 이었고, 오차 범위는 ± 1.3% 미만이었다. 표 7 을 참고하면, 측정된 거의 모든 다른 임상 파라미터가 또한 상당히 상이하지 않았다. 하나의 예외는, Micotil 를 받은 그룹보다 Seq No 2-F 를 받은 그룹에서 BRD 처리까지의 시간이 상당히 적었다는 것이었다.
표 7: 열등함 분석 결과
Figure pct00010
본 연구는 면역조절자 Seq No 2-F 가 항생제 Micotil 에 비해 열등하지 않다는 것으로 결정되었다는 것을 보여준다. 항생제 요법에 대한 내성이 한무리 건강과 가축 작업에 대한 지속가능성에 잠재적인 위험이므로, 효과적인 비-항생제 항미생물제 요법은 생산자에게 귀중한 옵션이다.
실시예 13: BRD 로 진단된 소에 대한 조합 요법
본 연구의 목적은 BRD 로 진단된 소에서 Draxxin®, Draxxin® 및 Seq No 2-F, 또는 Seq No 2-F 단독의 유효성을 비교하려는 것이었다.
연구 그룹
본 연구를 위해, 625 lbs 의 평균 체중을 가진 젖을 뗀 송아지를 세 가지 처리 그룹으로 나누었다. 첫번째 그룹에는 진단 시에 1.1 ml/cwt 의 Draxxin® 을 피하로 투여하였다. 두번째 그룹에는 1.1 ml/cwt 의 Draxxin® 을 피하로, 2 ml 의 Seq No 2-F 를 근육내로 투여하였고, 세번째 그룹에는 2 ml 의 Seq No 2-F 를 근육내로 투여하였다. 3 일 유예기간 후 처리, 및 연구를 진단 후 56 일에 종결지었다.
결과
표 8 을 참고하면, Seq No 2-F 및 Draxxin® 의 조합은 Seq No 2-F 단독으로의 처리와 비교하여 BRD 이환율을 상당히 감소시켰다 (21.8% 및 45.8%, 각각). 조합 요법은 또한 Draxxin® 단독으로의 처리와 비교하여 더 낮은 BRD 이환율을 산출하였다 (21.8% 및 29.2%, 각각). 만성 BRD 가 있는 소의 백분율은 Seq No 2-F 요법 단독 (8.9%) 또는 Draxxin® 요법 단독 (4.0%) 보다 조합 요법 (2.9%) 에 대해서 더 낮았다. BRD 에 기인하는 폐사율도 또한 Seq No 2-F 단독으로의 처리 또는 Draxxin® 단독으로의 처리에 비해 조합 요법을 받은 그룹에서 감소하였다.
조합 요법은 또한 단일 요법 접근법보다 더 큰 생산과 연관되었다. 평균 일일 습득 및 평균 증체량은 조합 요법보다 높았으며, 이것은 오직 Draxxin® 로의 치료에 비해, 대략 $34/마리의 경제적 장점을 산출하였다.
표 8: 개별 및 조합 요법
Figure pct00011
본 발명의 요소 또는 그의 바람직한 구현(들)을 도입하는 경우, 부정관사 "하나의", "그" 및 "상기"는 상기 요소 중 하나 이상이 존재한다는 것을 의미하는 것으로 사용된다. 용어 "포함", "포함하는" 및 "갖는" 은 포괄적인 의미이고, 열거된 요소 이외에 추가적인 요소가 존재할 수 있음을 의미한다.
상기 관점에서, 본 발명의 몇몇의 목적이 달성되고 기타 이로운 결과가 이루어짐을 알 수 있을 것이다.
각종 변경을 상기 생성물, 조성물 및 방법에 본 발명의 영역에서 벗어나지 않게 행할 수 있으므로, 상기 상세한 설명에 포함되고 수반된 도면에 나타낸 모든 것은 예시로서 해석해야 하며 제한의 의미를 두지 말아야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> <120> METHODS OF MODULATING CYTOSOLIC DNA SURVEILLANCE MOLECULES <130> BAYR <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4242 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of plasmid pGCMB75.6 <400> 1 tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 60 ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 120 gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 180 tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac 240 atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 300 cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 360 agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 420 ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 480 gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 540 cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagccg atctgataac ggtaccgata agctggcggc 600 cgattaagct acagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg 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tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 300 cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 360 agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 420 ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 480 gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 540 cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagccg atctgataac ggtaccgata agctggcggc 600 cgattaagct acagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga 660 caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc 720 tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac 780 tcccaggttc aattacagct cttaagcagc cgccaaaaca aaattcctca aaaatcatca 840 tcgaatgaat ggtgaaataa tttccctgaa taactgtagt gttttcaggg cgcggcataa 900 taattaacta tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa ggggttaata 960 aggaatattt gatgtatagt gccttgacta gagatcataa tcagccatac cacatttgta 1020 gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg 1080 aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 1140 agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 1200 aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcatcagat ctgccggtct ccctatagtg 1260 agtcgtatta atttcgataa gccaggttaa cctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 1320 gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 1380 ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 1440 agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 1500 ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 1560 caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 1620 gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 1680 cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 1740 tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 1800 gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 1860 cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 1920 tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 1980 tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 2040 caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 2100 aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 2160 cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gggcgcgcct aggcttttgc aaagatcgat 2220 caagagacag gatgaggatc gtttcgcagc ttttcattct gactgcaacg ggcaataagt 2280 ctctgtgtgg attaaaaaaa gagtgtctga tagcagcttc tgaactggtt acctgccgtg 2340 agtaaattaa aattttattg acttaggtca ctaaggcgcc ttgcgctgag gttgcgtcgt 2400 gatatcatca gggcagaccg gttacatccc cctaacaagc tgtataaaga gaaatactat 2460 ctcattggcg ttgcccgcac ctgacagtgc gacgttgggc tgcgtccgtc gaccaacggt 2520 accgaggtaa cagcccaatc tatccatgat ctcggccagg ccgggtcggc cgttatgcag 2580 cccggctcgg gtatgaagcc attaaggagc cgacccagcg cgaccgggcg gccggtcacg 2640 ctgcctctgc tgaagcctgc ctgtcactcc ctgcgcggcg tacccgccgt tctcatcgag 2700 taggctccgg atcgcgaccc cggacgggcc ctgggcccag gagcggccta tgacaaatgc 2760 cgggtagcga tccggcattc agcattgact gcgcacggat ccagtccttg caggagcctt 2820 atgccgaccg tagcaaaaaa tgagcccgag ccgatcgcga gttgtgatcc ggtcccgccg 2880 attgccggtc gcgatgacgg tcctgtgtaa gcgttatcgt taccaattgt ttaagaagta 2940 tatacgctac gaggtacttg ataacttctg cgtagcatac atgaggtttt gtataaaaat 3000 ggcgggcgat atcaacgcag tgtcagaaat ccgaaacagt ctgcgggact ctggggttcg 3060 aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct 3120 tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc 3180 gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accctaggcg cgctcatgag cggatacata 3240 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 3300 ccacctaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca 3360 gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga 3420 ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg 3480 actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat 3540 caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag 3600 ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga 3660 agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa 3720 ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcccattcg ccattcaggc 3780 tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 3840 aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 3900 gttgtaaaac gacggccagt gagcgcgcgt aatacgactc actatagggc gaattgggta 3960 ccgggccccc cctcgaggtc gacggtatcg ataagcttga tatcgaattc ctgcagcccg 4020 ggggatccac tagttctaga gcggccgcca ccgcggtgga gctccagctt ttgttccctt 4080 tagtgagggt taattgcgcg cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 4140 tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 4200 ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gc 4242 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 5 ggccgccaag atataactga 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 6 ggacctctgg gtatggcttt c 21 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 7 ccaagcaggc tacagaattg aaa 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 8 tagcactccc tccagagctt tg 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 9 gacaaagcca ccacccctaa 20 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 10 ctcgttctgt gactgcagct tatc 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 11 aagcctacat gacgatgaag atga 24 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 12 cctggaaggt ttttctttgg ttt 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 13 attgcatgct tttcctgctg tt 22 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 14 gctgagttat gcactatgca cgtta 25

Claims (30)

  1. 하기 단계를 포함하는, 수령자 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법:
    a. 면역조절자 조성물을 대상체에 투여하는 단계, 면역조절자 조성물은 적어도 하나의 면역자극성 CpG 모티프, 적어도 하나의 비-면역자극성 CpG 모티프를 포함하는 핵산 서열, 및 양이온성 리포좀을 포함함; 및
    b. 면역 감시 수용체를 활성화시키는 단계, 면역 감시 수용체는 선천적 면역 반응에 관여하는 신호 경로를 활성화시킴.
  2. 제 1 항에 있어서, 신호 경로가 TLR9, TLR21, cGAS, IFI16, DDX41, DNA-PK, DAI, Mre11, LRRFIP1, AIM2, RNA-Polymerase III/RIG-I, STING, ASC, NFκB, AP1, MAPK, IRF3, 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 신호 분자를 포함하는, 수령자 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법.
  3. 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법:
    a. 대상체에 면역조절자 조성물을 투여하는 단계, 면역조절자 조성물은 SEQ ID NO: 1 의 서열과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 핵산 서열 및 리포좀 전달 비히클을 포함함, 및
    b. 면역 감시 수용체를 활성화시키는 단계, 면역 감시 수용체는 선천적 면역 반응에 관여하는 신호 경로를 활성화시킴.
  4. 제 3 항에 있어서, 리포좀 전달 비히클이 다층 소포 지질 및 압출된 지질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 지질을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 리포좀 전달 비히클이 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 콜레스테롤; N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP) 및 콜레스테롤; 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-히드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드 (DOTIM) 및 콜레스테롤; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 콜레스테롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 지질의 쌍을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  6. 제 3 항에 있어서, 투여가 정맥내로, 근육내로, 유방내, 피부내, 복강내, 피하로, 분무로, 에어로졸로, 알 내 (in ovo), 점막으로, 경피로, 침지로, 경구로, 안구내로, 기관내로, 및 비강내로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  7. 제 3 항에 있어서, 면역조절자 조성물이 생물작용제를 추가로 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  8. 제 3 항에 있어서, 투여가 감염원에 대한 노출 전에 행해지는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  9. 제 3 항에 있어서, 투여가 감염원에 대한 노출 후에 행해지는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  10. 제 3 항에 있어서, 대상체가 포유류 종, 양식 종, 및 조류 종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  11. 제 3 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  12. 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법:
    a. 대상체에 면역조절자 조성물을 투여하는 단계, 면역조절자 조성물은 SEQ ID NO: 4 의 서열과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 핵산 서열 및 리포좀 전달 비히클을 포함함, 및
    b. 면역 감시 수용체를 활성화시키는 단계, 면역 감시 수용체는 선천적 면역 반응에 관여하는 신호 경로를 활성화시킴.
  13. 제 12 항에 있어서, 리포좀 전달 비히클이 다층 소포 지질 및 압출된 지질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 지질을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 리포좀 전달 비히클이 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 콜레스테롤; N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP) 및 콜레스테롤; 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-히드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드 (DOTIM) 및 콜레스테롤; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 콜레스테롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 지질의 쌍을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  15. 제 12 항에 있어서, 투여가 정맥내로, 근육내로, 유방내, 피부내, 복강내, 피하로, 분무로, 에어로졸로, 알 내, 점막으로, 경피로, 침지로, 경구로, 안구내로, 기관내로, 및 비강내로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  16. 제 12 항에 있어서, 면역조절자 조성물이 생물작용제를 추가로 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 생물작용제가 면역 인핸서 단백질, 면역원, 백신, 항미생물제, 및 이의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  18. 제 12 항에 있어서, 투여가 감염원에 대한 노출 전에 행해지는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  19. 제 12 항에 있어서, 투여가 감염원에 대한 노출 후에 행해지는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  20. 제 12 항에 있어서, 대상체가 포유류 종, 양식 종, 및 조류 종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  21. 제 12 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  22. 하기 단계를 포함하는, 수령자 대상체에서 면역 반응을 유발하기 위해 STING 신호 경로를 조절하는 방법:
    a. 대상체에 면역조절자 조성물을 투여하는 단계, 면역조절자 조성물은 적어도 하나의 면역자극성 CpG 모티프, 적어도 하나의 비-면역자극성 CpG 모티프를 포함하는 핵산 서열, 및 양이온성 리포좀을 포함함.
  23. 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법:
    a. 대상체에 면역조절자 조성물을 투여하는 단계, 면역조절자 조성물은 SEQ ID NO: 4 의 서열과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 핵산 서열 및 리포좀 전달 비히클을 포함함, 및
    b. 면역 감시 수용체를 활성화시키는 단계, 면역 감시 수용체는 면역 반응 조절에 관여하는 신호 경로를 활성화시킴.
  24. 제 23 항에 있어서, 면역 감시 수용체가 선천적 면역 반응을 자극하는데 관여하는 신호 경로를 활성화시키는, 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 면역 감시 수용체가 후천적 면역 반응을 자극하는데 관여하는 신호 경로를 활성화시키는, 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법.
  26. 제 23 항에 있어서, 면역 감시 수용체가 염증성 면역 반응을 억제하는데 관여하는 신호 경로를 활성화시키는, 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법.
  27. 하기 단계를 포함하는, 소 호흡기 질환으로 진단받은 소의 증체량을 증가시키는 방법:
    항미생물제를 대상체에게 SEQ ID NO:1 과 적어도 80% 상동성을 갖는 핵산 서열 및 지질 전달 비히클을 포함하는 면역조절자 조성물과 조합으로 투여하는 단계, 상기 조합이 대상체에서 증체량을 증가시킴.
  28. 제 27 항에 있어서, 항미생물제가 엔로플록사신인, 소 호흡기 질환으로 진단받은 소의 증체량을 증가시키는 방법.
  29. 하기 단계를 포함하는, 소 호흡기 질환으로 진단받은 소의 증체량을 증가시키는 방법:
    항미생물제를 대상체에게 SEQ ID NO:4 와 적어도 80% 상동성을 갖는 핵산 서열 및 지질 전달 비히클을 포함하는 면역조절자 조성물과 조합으로 투여하는 단계, 상기 조합이 대상체에서 증체량을 증가시킴.
  30. 제 29 항에 있어서, 항미생물제가 엔로플록사신인, 소 호흡기 질환으로 진단받은 소의 증체량을 증가시키는 방법.
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