CN109689095A

CN109689095A - 牛物种中增加的生育力

Info

Publication number: CN109689095A
Application number: CN201780056532.9A
Authority: CN
Inventors: J.尼克尔; D.凯尔; A.阿布拉罕; W.塔利; R.G.M.奥尔德里克林克; T.塞特耶; L.维克斯; S.尼贝林克
Original assignee: Bayer Animal Health GmbH
Current assignee: Bayer Animal Health GmbH
Priority date: 2016-07-26
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2019-04-26
Anticipated expiration: 2037-07-25
Also published as: JP2019525935A; DOP2019000018A; SG11201900710YA; TW201817427A; WO2018022583A1; CL2019000185A1; IL264380A; CN109689095B; EP3490598A1; NZ750181A; KR102473370B1; TWI759317B; US10933131B2; KR20190032434A; UY37346A; US20190388538A1; AU2017301528A1; CO2019000724A2; PE20190566A1; BR112019001599A2

Abstract

本发明涉及用于免疫调节的组合物和方法，其有效用于增加母牛中的受孕率。

Description

牛物种中增加的生育力

发明领域

本发明涉及用于母牛中的免疫调节的组合物和方法。具体地，本发明包括有效用于增加母牛中的首次授精受孕率(first service conception rate)的组合物和方法。

发明背景

奶牛中的最高发病率和死亡率发生在围产期。已经显示免疫功能在产犊前后受损，具有降低的白细胞计数和降低的白细胞功能，如通过髓过氧化物酶和吞噬作用测定所证实的。如果在产犊前后可以增强免疫功能，则可以改善可能对免疫功能敏感的繁殖结果。

由于多种因素，奶牛生育力在国际范围内下降，所述因素包括增加的畜群规模、降低的发情检测灵敏度和特异性、下降的产犊时身体状况评分以及增加的产后身体状况评分损失率。McDougall, J. Reproduction and Development 52, 185-194 (2006)。高水平的繁殖性能是维持最佳畜群健康和生产力所必需的。本领域需要能够增加母牛和小母牛的繁殖能力的组合物和方法。

发明概述

本发明涉及用于增加母牛和小母牛中的受孕率的免疫调节剂组合物。在一些实施方案中，所述免疫调节剂组合物可包含阳离子脂质体递送媒介物(a cationic liposomedelivery vehicle)和分离的细菌衍生的核酸分子(an isolated bacterially-derivednucleic acid molecule)，所述核酸分子不编码免疫原，所述免疫调节剂组合物用于增加母牛和小母牛中的受孕率。

在一些实施方案中，所述核酸分子包含至少一个免疫刺激性CpG基序和至少一个非免疫刺激性CpG基序。在进一步的实施方案中，所述核酸分子与SEQ ID NO: 1、SEQ IDNO: 2、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的序列具有至少80%的序列同源性。在一些实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1。在其它实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:2。在其它实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 3。在其它实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 4。

在一些实施方案中，所述脂质体递送媒介物包含选自多层囊泡脂质和挤出脂质的脂质。在进一步的实施方案中，所述脂质体递送媒介物包含选自以下的脂质对：N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)和胆固醇；N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)和胆固醇；1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)和胆固醇；以及二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)和胆固醇。

在一些实施方案中，所述免疫调节剂组合物进一步包含生物剂(a biologicalagent)。在进一步的实施方案中，所述生物剂选自：免疫增强蛋白(immune enhancerproteins)、免疫原、疫苗、抗微生物剂或其任何组合。在一些实施方案中，所述免疫调节剂组合物进一步包含药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，所述免疫调节剂组合物用于施用并选自：静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、经喷雾-气溶胶、口服、眼内、气管内、子宫内、阴道内和鼻内。

在一些实施方案中，母牛中的受孕率相对于对照群体中的受孕率增加。

在一些实施方案中，非发情周期母牛(non-cycling cows)中的受孕率相对于对照群体中的受孕率增加。

在一些实施方案中，母牛中的首次授精受孕率相对于对照群体中的首次授精受孕率增加。

在一些实施方案中，非发情周期母牛中的首次授精受孕率相对于对照群体中的首次授精受孕率增加。

在一些实施方案中，母牛中的受孕率相对于对照群体中的首次授精受孕率增加，如通过≤0.05的p值所测量的。

在一些实施方案中，非发情周期母牛中的受孕率相对于对照群体中的受孕率增加，如通过≤0.05的p值所测量的。

在一些实施方案中，母牛中的首次授精受孕率相对于对照群体中的首次授精受孕率增加，如通过≤0.05的p值所测量的。

在一些实施方案中，非发情周期母牛中的首次授精受孕率相对于对照群体中的首次授精受孕率增加，如通过≤0.05的p值所测量的。

本发明还涉及增加母牛中的受孕率的方法，包括向所述母牛施用有效量的免疫调节剂组合物。在一些实施方案中，所述免疫调节剂组合物可包含阳离子脂质体递送媒介物和不编码免疫原的核酸分子。

本发明还涉及增加母牛中的受孕率的方法，包括向所述母牛施用有效量的免疫调节剂组合物。在一些实施方案中，所述免疫调节剂组合物可包含阳离子脂质体递送媒介物和分离的细菌衍生的不编码免疫原的核酸分子。

本发明还涉及增加非发情周期母牛中的受孕率的方法，包括向所述母牛施用有效量的免疫调节剂组合物。在一些实施方案中，所述免疫调节剂组合物可包含阳离子脂质体递送媒介物和不编码免疫原的核酸分子。

本发明还涉及增加非发情周期母牛中的受孕率的方法，包括向所述母牛施用有效量的免疫调节剂组合物。在一些实施方案中，所述免疫调节剂组合物可包含阳离子脂质体递送媒介物和分离的细菌衍生的不编码免疫原的核酸分子。

本发明还涉及增加母牛中的首次授精受孕率的方法，包括向所述母牛施用有效量的免疫调节剂组合物。在一些实施方案中，所述免疫调节剂组合物可包含阳离子脂质体递送媒介物和不编码免疫原的核酸分子。

本发明还涉及增加母牛中的首次授精受孕率的方法，包括向所述母牛施用有效量的免疫调节剂组合物。在一些实施方案中，所述免疫调节剂组合物可包含阳离子脂质体递送媒介物和分离的细菌衍生的不编码免疫原的核酸分子。

本发明还涉及增加非发情周期母牛中的首次授精受孕率的方法，包括向所述母牛施用有效量的免疫调节剂组合物。在一些实施方案中，所述免疫调节剂组合物可包含阳离子脂质体递送媒介物和不编码免疫原的核酸分子。

本发明还涉及增加非发情周期母牛中的首次授精受孕率的方法，包括向所述母牛施用有效量的免疫调节剂组合物。在一些实施方案中，所述免疫调节剂组合物可包含阳离子脂质体递送媒介物和分离的细菌衍生的不编码免疫原的核酸分子。

在一些实施方案中，所述免疫调节剂组合物进一步包含生物剂。在进一步的实施方案中，所述生物剂选自：免疫增强蛋白、免疫原、疫苗、抗微生物剂或其任何组合。在一些实施方案中，所述免疫调节剂组合物进一步包含药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，所述免疫调节剂组合物用于施用并选自：静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、经喷雾-气溶胶、口服、眼内、气管内和鼻内。

附图简述

图1显示了pMB75.6质粒(SEQ ID NO：1)的图谱。

图2显示了pGCMB75.6质粒(SEQ ID NO：2)的图谱。

图3显示了pLacZMB75.6质粒(SEQ ID NO：3)的图谱。

图4A显示了根据治疗组、对于发情周期和非发情周期母牛、对首次授精受孕的概率(估计的边际平均值和平均值的标准误差(SEM))的图表，并且图4B显示了根据治疗组、对于发情周期和非发情周期母牛、在育种计划的按计划开始后3周内怀孕的概率(估计的边际平均值和SEM)。星号表示非发情周期组内治疗之间的差异。

发明详述

根据本发明，免疫调节剂组合物及其使用方法用于增加母牛中的受孕率。所述免疫调节剂组合物包括阳离子脂质体递送媒介物和分离的细菌衍生的不编码免疫原的核酸分子。下面更详细讨论了所述组合物和使用免疫调节剂组合物的方法。

I. 组合物

可用于本发明中的组合物，例如本文所述的那些，一般能够用作针对感染性疾病的预防性疗法、补救预防性疗法(metaphylactic therapy)或治疗疗法。此类组合物在本文中被称为免疫调节剂组合物。所述免疫调节剂组合物至少包括能够增加母牛中的受孕率的免疫刺激性质粒或免疫刺激性DNA序列。在一些方面，所述免疫调节剂组合物也可包括脂质体递送媒介物。

A. 核酸

在一些方面，本发明涉及可用于增加母牛中的受孕率的核酸分子。本文所述的核酸分子可作为线性双链或单链DNA、氨基酸序列、核糖核酸(RNA)或其组合包括在免疫刺激性质粒中。在一些方面，本发明涉及含有免疫刺激性质粒或免疫刺激性DNA序列的核酸分子、载体和宿主细胞(体外、体内或离体)。

本文所述的核酸分子富含CpG基序。此类CpG基序可经由特异性Toll-样受体诸如TLR9和TLR21诱导免疫刺激。另外，本文所述的核酸分子还含有非CpG免疫刺激性基序。在一些方面，核酸分子含有超过随机核酸序列中预期的CpG基序频率约2-20%的CpG基序。在一些方面，核酸分子含有超过随机核酸序列中预期的CpG基序频率约3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%或更多的CpG基序。在一些方面，核酸分子含有超过随机核酸序列中预期的CpG基序频率约10%的CpG基序。在一些方面，观察到与脊椎动物DNA相比多于10倍的CpG基序的富集。在一些方面，核酸分子含有与脊椎动物DNA相比约2倍至50倍或更多的CpG基序。在一些方面，核酸分子含有与脊椎动物DNA相比约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55倍或更多的CpG基序。

在一些方面，本发明涉及确实包含抗生素抗性基因的免疫刺激性质粒或DNA序列。例如，本文所述的pMB75.6质粒包含抗生素抗性基因卡那霉素。pMG75.6的序列作为SEQ IDNO：1提供在表1中。

在一些方面，本发明涉及不包含抗生素抗性基因的免疫刺激性质粒或DNA序列。所述质粒可缺乏任何可选择或可筛选的标记基因。例如，本文所述的pGCMB75.6质粒不包含任何全长或功能性可选择或可筛选的标记基因。pGCMB75.6的序列作为SEQ ID NO: 2提供在表1中。

在一些方面，本文所述的免疫刺激性质粒优选不包含编码全长或功能性可选择或可筛选的标记物的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒不包含抗生素抗性基因。例如，所述质粒不包含卡那霉素抗性基因。在一些方面，本文所述的质粒优选不编码免疫原。

在一些方面，所述免疫刺激性质粒可包含编码不是抗生素抗性基因的可选择或可筛选的标记基因的核酸序列。例如，本文所述的pLacZMB75.6质粒包含LacZ基因作为可筛选的标记物。pLacZMB75.6的图谱提供于图3中，并且pLacZMB75.6的核苷酸序列作为SEQ IDNO: 3提供在表1中。如图3中所示，pLacZMB75.6类似于pGCMB75.6，但含有LacZ可筛选的标记物。

应理解，pMB75.6、pGCMB75.6或pLacZMB75.6质粒的核苷酸序列可在一定程度上改变，而不显著不利地影响其免疫刺激性特性。在一些方面，本发明涉及包含与pMB75.6 (SEQID NO: 1)的序列具有至少80%序列同一性的核酸序列的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选包含与pMB75.6 (SEQ ID NO: 1)的序列具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选包含pMB75.6 (SEQ ID NO: 1)的序列。

在一些方面，本发明涉及包含与pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 2)的序列具有至少80%序列同一性的核酸序列的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选包含与pGCMB75.6(SEQ ID NO: 2)的序列具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选包含pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 2)的序列。

在一些方面，本发明涉及免疫刺激性质粒，其由与pMB75.6 (SEQ ID NO: 1)的序列具有至少80%序列同一性的核酸序列组成。所述免疫刺激性质粒优选由以下核酸序列组成，其与pMB75.6 (SEQ ID NO: 1)的序列具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选由pMB75.6 (SEQ ID NO: 1)的序列组成。

在一些方面，本发明涉及免疫刺激性质粒，其由与pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 2)的序列具有至少80%序列同一性的核酸序列组成。所述免疫刺激性质粒优选由以下核酸序列组成，其与pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 2)的序列具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选由pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 2)的序列组成。

本发明的另一个重要方面提供了能够刺激免疫应答的免疫刺激性DNA序列或免疫刺激性质粒，其包括在高严格条件下与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2杂交的核酸序列。合适的核酸序列包括与本发明的核酸同源、基本上类似或相同的那些。在一些方面，同源的核酸序列将与SEQ ID NO: 1或相应的互补序列具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性。在其它方面，同源的核酸序列将与SEQ ID NO: 2或相应的互补序列具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性。可使用本领域中已知的许多算法，诸如Altschul, S. F., 等人，J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990中描述的BLAST，来计算序列相似性。所述核酸可由于遗传密码的简并性而与上述核酸在序列上不同。通常，参考序列将为18个核苷酸，更通常为30或更多个核苷酸，并且可包含组合物的整个核酸序列用于比较目的。

本文考虑可以与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2杂交的核苷酸序列。严格杂交条件包括以下条件，诸如在50℃或更高以及0.1X SSC (15 mM氯化钠/1.5 mM柠檬酸钠)的杂交。另一个实例是在42℃在50%甲酰胺、5X SSC (150 mM NaCl，15 mM柠檬酸三钠)、50 mM磷酸钠(pH 7.6)、5X Denhardt氏溶液、10%硫酸葡聚糖和20 µg/ml变性、剪切的鲑精DNA的溶液中温育过夜，随后在0.1X SSC中在约65℃洗涤。示例性严格杂交条件是严格性为上述特定条件的至少约80%、85%、90%或95%的杂交条件。其它严格杂交条件是本领域中已知的，并且也可用于鉴定本发明的核酸的同源物(Current Protocols in Molecular Biology, Unit6, pub. John Wiley & Sons, N.Y. 1989)。

可使用本文所述的DNA分子的突变体核苷酸，只要突变体包含维持如本文所述的增加母牛中的受孕率的能力的核酸序列。此类突变的DNA序列将通常相差一个或多个核苷酸或氨基酸。序列变化可为取代、插入、缺失或其组合。用于诱变克隆的基因的技术是本领域中已知的。用于位点特异性诱变的方法可见于Gustin等人，Biotechniques 14:22,1993；Barany, Gene 37:111-23, 1985；Colicelli等人，Mol. Gen. Genet. 199:537-9,1985；和Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989,pp. 15.3-15.108，并且它们均通过引用并入本文。总之，本发明涉及能够激活对象中的胞质DNA监视分子的核酸序列及其变体或突变体。本发明也涵盖由所述核酸序列编码的中间RNA以及编码的任何所得氨基酸序列。

在一些方面，在免疫刺激性质粒的核苷酸序列与SEQ ID NO: 1和2中提供的序列不同的情况下，所述质粒中的CpG二核苷酸优选保持完整。可选地，如果改变质粒的核苷酸序列使得CpG二核苷酸被消除，则可在另一位置改变质粒的序列，使得质粒中的CpG二核苷酸的总数保持相同。除了核苷酸序列pGCMB75.6中已经存在的那些以外，另外的CpG二核苷酸也可被引入质粒中。因此，例如，本文所述的免疫刺激性质粒优选包含至少约200、至少约220、至少约240、至少约260、至少约270、至少约275、至少约280、至少约283、至少约285或至少约288个CpG二核苷酸。例如，所述免疫刺激性质粒可以包含283个CpG二核苷酸。

在一些方面，在免疫刺激性质粒的核苷酸序列与本文提供的序列不同的情况下，改变所述质粒中的CpG基序类型以调节所得的胞质DNA监视分子的激活。例如，可增加免疫刺激性CpG基序的数量，以增加响应于免疫刺激性质粒/DNA的特定阈值的特定胞质DNA监视分子的激活。作为进一步的实例，可增加非免疫刺激性CpG基序的数量，以减少特定胞质DNA监视分子的激活和/或增加其它DNA监视分子的激活。

具体而言，本发明涉及药物制剂，其包含本文所述的免疫刺激性质粒或DNA序列中的任一种以及药学上可接受的载体。

B. 免疫调节剂

与本文所述免疫刺激性质粒一起使用的适合的免疫调节剂组合物描述于美国专利申请公开号2012/0064151 A1和2013/0295167 A1中，其两者的内容以其整体通过引用由此并入。

所述免疫调节剂组合物包含脂质体递送媒介物、和本文所述的免疫刺激性质粒或DNA序列中的至少一种。

合适的脂质体递送媒介物包含能够将核酸分子递送至被治疗对象的组织的脂质组合物。脂质体递送媒介物优选能够在对象中保持足够长时间的稳定以递送核酸分子和/或生物剂。例如，所述脂质体递送媒介物在受体对象中稳定至少约五分钟、至少约1小时或至少约24小时。

本发明的脂质体递送媒介物包含能够促进核酸分子递送入细胞的脂质组合物。当核酸分子编码一种或多种蛋白时，核酸：脂质体复合物优选具有至少约1皮克(pg)表达的蛋白/毫克(mg)总组织蛋白/微克(μg)递送的核酸的转染效率。例如，核酸：脂质体复合物的转染效率可以是至少约10 pg表达的蛋白/mg总组织蛋白/μg递送的核酸；或至少约50 pg表达的蛋白/mg总组织蛋白/μg递送的核酸。复合物的转染效率可低如1毫微微克(fg)表达的蛋白/mg总组织蛋白/μg递送的核酸，上述量是更优选的。

本发明优选的脂质体递送媒介物的直径为约100至500纳米(nm)之间。例如，所述脂质体递送媒介物的直径可以为约150至450 nm之间或者约200至400 nm之间。

合适的脂质体包括任何脂质体，例如常用于例如本领域技术人员已知的基因递送方法中的那些脂质体。优选的脂质体递送媒介物包含多层囊泡(MLV)脂质和挤出脂质。用于制备MLV的方法是本领域众所周知的。更优选的脂质体递送媒介物包含具有聚阳离子脂质组合物的脂质体(即阳离子脂质体)和/或具有与聚乙二醇缀合的胆固醇主链的脂质体。示例性阳离子脂质体组合物包含但不限于N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)和胆固醇、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)和胆固醇、1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)和胆固醇、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)和胆固醇以及其组合。用作递送媒介物的最优选的脂质体组合物包含DOTIM和胆固醇。

合适的核酸分子包括本文所述的免疫刺激性质粒中的任一。编码核酸序列编码蛋白或肽的至少一部分，而非编码序列不编码蛋白或肽的任何部分。根据本发明，“非编码”核酸可以包含转录单元的调节区，例如启动子区。术语“空载体”可以与术语“非编码”互换使用，并且具体是指不存在蛋白编码部分的核酸序列，例如没有基因插入物的质粒载体。胞质DNA监视分子的激活不需要由本文所述质粒编码的蛋白质的表达；因此，质粒不需要包含与转录控制序列可操作地连接的任何编码序列。然而，可通过在组合物中包含编码免疫原和/或细胞因子的核酸序列(DNA或RNA)而获得另外的优点(即抗原特异的和增强的免疫力)。编码免疫原和/或细胞因子的此核酸序列可包括在本文所述的免疫刺激性质粒中，或可以包括在组合物中的单独核酸(例如，单独质粒)中。

脂质体与本文所述的免疫刺激性质粒的复合可使用本领域的标准方法或如美国专利号6,693,086中所述来实现，所述专利的内容以其整体通过引用由此并入。待添加至脂质体的质粒的合适浓度包括将足够量的质粒有效地递送至对象内、从而引发全身性免疫应答的浓度。例如，约0.1 μg至约10 μg的质粒可以与约8 nmol脂质体组合，约0.5 μg至约5 μg的质粒可以与约8 nmol脂质体组合，或者约1.0μg的质粒可以与约8 nmol脂质体组合。组合物中的质粒与脂质的比率(μg质粒：nmol脂质)可以为以重量计至少约1:1质粒：脂质(例如，1μg质粒：1 nmol脂质)。例如，质粒与脂质的比率可以为至少约1:5、至少约1:10或至少约1:20。本文表述的比率基于组合物中阳离子脂质的量，且不是基于组合物中脂质的总量。本发明组合物中质粒与脂质的比率合适地为以重量计约1:1至约1:80质粒：脂质；以重量计约1:2至约1:40质粒：脂质；以重量计约1:3至约1:30质粒：脂质；或以重量计约1:6至约1:15质粒：脂质。

C. 生物剂

除了本文所述的脂质体递送媒介物和质粒中的至少一种以外，本文所述的免疫调节剂组合物中的任一种还可以包含至少一种生物剂。

合适的生物剂是有效预防或治疗疾病的药剂。此类生物剂包括免疫增强蛋白、免疫原、疫苗、抗微生物剂或其任何组合。合适的免疫增强蛋白是已知增强免疫力的那些蛋白。作为非限制性实例，包括一个蛋白家族的细胞因子是已知的增强免疫力的蛋白家族。合适的免疫原是引发体液和/或细胞免疫应答的蛋白，使得向对象施用免疫原提高针对在对象的组织内遇到的相同或类似蛋白的免疫原特异性免疫应答。免疫原可包括由细菌、病毒、寄生虫或真菌表达的致病性抗原。优选的抗原包括源自在对象中引起感染性疾病的生物体的抗原。根据本发明，免疫原可为天然存在或合成来源的蛋白的任何部分，其引发体液和/或细胞免疫应答。因此，抗原或免疫原的大小可为小如约5-12个氨基酸，并且大如全长蛋白，包括这两者之间的任何大小。所述抗原可为多聚体蛋白或融合蛋白。所述抗原可为纯化的抗原。可选地，所述免疫增强蛋白或免疫原可以由免疫调节剂组合物中所包含的免疫刺激性质粒或另一种核酸编码。在免疫增强蛋白或免疫原由免疫调节剂组合物中的核酸分子编码的情况下，编码免疫增强蛋白或免疫原的核酸序列可操作连接至转录控制序列，使得在对象的组织中表达免疫原，由此在对象中引发除非特异性免疫应答之外的免疫原特异性免疫应答。筛选免疫原性例如病原体抗原免疫原性或细胞因子活性的技术是本领域技术人员已知的，并且包括各种体外和体内测定。

在生物剂是疫苗的情况下，所述疫苗可包括活的感染性的病毒的、细菌的或寄生虫疫苗或者杀死的灭活的病毒的、细菌的或寄生虫疫苗。一种或多种疫苗(活的或杀死的病毒疫苗)可与本发明的免疫调节剂组合物组合使用。合适的疫苗包括本领域已知用于禽类或牛物种的那些。

所述生物剂可以是抗微生物剂。合适的抗微生物剂包括：喹诺酮类、优选氟喹诺酮类，β-内酰胺类，和大环内酯-林可酰胺链阳菌素(MLS)抗生素。

合适的喹诺酮类包括培诺沙星、宾氟沙星、西诺沙星、环丙沙星、克林沙星、达氟沙星、二氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、氟罗沙星、吉米沙星、依巴沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、麻保沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、奥比沙星、帕珠沙星、普多沙星、培氟沙星、沙拉沙星、司巴沙星、替马沙星和托氟沙星。优选的氟喹诺酮类包括环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、莫西沙星和普多沙星。合适的萘啶酮类包括萘啶酮酸。合适的β-内酰胺类包括青霉素(例如，阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、苄星青霉素、苄青霉素、羧苄青霉素、氯唑西林、共阿莫西拉[即，阿莫西林/克拉维酸]、双氯西林、氟氯西林、甲氧西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、苯氧基甲基青霉素、哌拉西林、普鲁卡因青霉素、替莫西林和替卡西林)；头孢菌素(例如，头孢克洛、头孢噻肟、头孢孟多、头孢匹林、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢克肟、头孢噻肟、头孢西丁、头孢匹罗、头孢泊肟、头孢喹肟、头孢他啶、头孢噻呋、头孢曲松、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢噻吩和头孢替坦(defotetan))；碳青霉烯类和青霉烯类(例如，多利培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南和美罗培南)；单环内酰胺类(monobactams)(例如，氨曲南、诺卡菌素A、烟毒素-β-内酰胺(tabtoxinine-β-lactam)和替吉莫南)；和β-内酰胺酶抑制剂(例如，克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦)。优选的β-内酰胺类包括头孢菌素类，特别是头孢唑啉。

合适的MLS抗生素包括克林霉素、林可霉素、吡利霉素和任何大环内酯抗生素。优选的林可酰胺抗生素是吡利霉素。

其它抗微生物剂包括氨基糖苷类、氯羟吡啶、迪美唑类、红霉素、弗氏菌丝素、呋喃唑酮、卤夫酮、2-吡啶酮、氯苯胍、磺胺类、四环素类、甲氧苄啶、各种截短侧耳素(例如，泰莫林和伐奈莫林)和各种链霉素(例如，莫能菌素、甲基盐霉素和盐霉素)。

II. 方法

A. 免疫刺激方法

在本发明的一个实施方案中，通过向牛物种的雌性成员施用有效量的免疫调节剂组合物，在牛物种的雌性成员中引发免疫应答。所述有效量足以在牛物种的雌性成员中引发免疫应答。免疫调节剂包括脂质体递送媒介物和核酸分子。

在一个实施方案中，免疫调节剂的有效量为每只动物约1微克至约1000微克。在另一个实施方案中，免疫调节剂的有效量为每只动物约5微克至约500微克。在又另一个实施方案中，免疫调节剂的有效量为每只动物约10微克至约100微克。在进一步的实施方案中，免疫调节剂的有效量为每只动物约10微克至约50微克。

在本发明的另一个实施方案中，通过施用有效量的免疫调节剂、分离的核酸分子和生物剂，在牛物种的雌性成员中引发免疫应答，所述免疫调节剂包括脂质体递送媒介物。考虑生物剂可与免疫调节剂混合或共同施用，或者其独立施用。独立施用可在施用免疫调节剂之前或之后。还考虑可应用免疫调节剂或生物剂的多于一次施用，以延长增强的免疫力。此外，多于一种生物剂可与免疫调节剂共同施用、在免疫调节剂之前施用、在免疫调节剂施用之后施用，或者同时施用。

B. 受孕率

本发明的方法可用于增加母牛中的受孕率。在优选的实施方案中，母牛中的受孕率相对于对照群体中的受孕率增加。在一些优选的实施方案中，母牛中的受孕率相对于对照群体中的受孕率增加，如通过≤0.05的p值所测量的。

本发明的方法可用于增加母牛中的首次授精受孕率。如本文所用，首次授精受孕率是指培育至人工授精的、受孕于第一次授精的母牛的比例。在优选的实施方案中，母牛中的首次授精受孕率相对于对照群体中的首次授精受孕率增加。在一些优选的实施方案中，母牛中的首次授精受孕率相对于对照群体中的首次授精受孕率增加，如通过≤0.05的p值所测量的。

本发明的方法可用于增加非发情周期母牛中的受孕率。如本文所用，“非发情周期(non-cycling)”是指在计划的育种开始前约30天，通过观察或通过尾部涂料(tail paint)的去除而没有检测到在发情中的母牛。在优选的实施方案中，非发情周期母牛中的受孕率相对于对照群体中的受孕率增加。在一些优选的实施方案中，非发情周期母牛中的受孕率相对于对照群体中的受孕率增加，如通过≤0.05的p值所测量的。

本发明的方法可用于增加非发情周期母牛中的首次授精受孕率。在优选的实施方案中，非发情周期母牛中的首次授精受孕率相对于对照群体中的首次授精受孕率增加。在一些优选的实施方案中，非发情周期母牛中的首次授精受孕率相对于对照群体中的首次授精受孕率增加，如通过≤0.05的p值所测量的。

C. 施用

多种施用途径是可得的。选择的具体模式当然将取决于选择的具体生物剂、对象的年龄和总体健康状态、所治疗的具体状况和治疗效力所需的剂量。本发明的方法可使用任何施用模式来实施，其产生有效水平的免疫应答而不引起临床上不可接受的副作用。所述组合物可方便地以单位剂型呈现，并且可通过本领域众所周知的方法中的任一制备。

可以在任何年龄进行牛物种的疫苗接种。可静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、通过喷雾/气溶胶、口服、眼内、气管内、鼻内、或通过本领域中已知的其它方法施用疫苗。另外，考虑可基于常规疫苗接种方案来使用本发明的方法。也可静脉内、肌内、皮下、通过喷雾、口服、眼内、气管内、鼻内、或通过本领域中已知的其它方法施用免疫调节剂。在一个实施方案中，皮下施用所述免疫调节剂。在另一个实施方案中，肌内施用所述免疫调节剂。在又另一个实施方案中，所述免疫调节剂作为喷雾施用。在进一步的实施方案中，口服施用所述免疫调节剂。

在一个实施方案中，在分娩之前向动物单独施用免疫调节剂。在另一实施方案中，在分娩之后向动物单独施用免疫调节剂。在又另一实施方案中，在分娩的同时向动物单独施用免疫调节剂。在仍另一个实施方案中，在分娩之前和分娩的同时向动物单独施用免疫调节剂。在进一步的实施方式中，在分娩之前，在疫苗接种的同时共同施用所述免疫调节剂组合物。在又进一步的实施方式中，在分娩的同时，在疫苗接种的同时共同施用所述免疫调节剂组合物。共同施用可包括在动物上的相同惯用位置中在彼此相邻的两个不同部位(即在动物的颈部彼此相邻地注射)、在动物的相同惯用位置的相对侧上(即颈部每一侧上一次)、或在相同动物的不同位置上施用疫苗和免疫调节剂。在另一个实施方案中，在疫苗接种和分娩之前施用所述免疫调节剂组合物。在进一步的实施方式中，在疫苗接种之后、但在分娩之前施用所述免疫调节剂组合物。在进一步的实施方式中，在分娩后，向在分娩前已经接种疫苗的动物施用所述免疫调节剂组合物。技术人员将认识到，施用途径可根据对象和对象的健康或状态而变化。

在一个实施方案中，在育种之前向动物单独施用免疫调节剂。在另一实施方案中，在育种之后向动物单独施用免疫调节剂。在又另一实施方案中，在育种的同时向动物单独施用免疫调节剂。在仍另一个实施方案中，在育种之前和育种的同时向动物单独施用免疫调节剂。在进一步的实施方式中，在育种之前，在疫苗接种的同时共同施用所述免疫调节剂组合物。在又进一步的实施方式中，在育种的同时，在疫苗接种的同时共同施用所述免疫调节剂组合物。共同施用可包括在动物上的相同惯用位置中在彼此相邻的两个不同部位(即在动物的颈部彼此相邻地注射)、在动物的相同惯用位置的相对侧上(即颈部每一侧上一次)、或在相同动物的不同位置上施用疫苗和免疫调节剂。在另一个实施方案中，在疫苗接种和育种之前施用所述免疫调节剂组合物。在进一步的实施方式中，在疫苗接种之后、但在育种之前施用所述免疫调节剂组合物。在进一步的实施方式中，在育种后，向在育种前已经接种疫苗的动物施用所述免疫调节剂组合物。技术人员将认识到，施用途径可根据对象和对象的健康或状态而变化。

在一个实施方式中，在攻击之前约1至约14天或者在攻击之后约1至约14天施用所述免疫调节剂。在另一实施方式中，在攻击之前约1至约7天或者在攻击之后约1至约7天施用所述免疫调节剂。在又另一实施方式中，在攻击之前1、2、3、4、5、6、7天或攻击之后1、2、3、4、5、6、7天施用所述免疫调节剂。在优选的实施方案中，在攻击前3天或攻击后3天施用所述免疫调节剂。

其它递送系统可包括定时释放、延迟释放或持续释放递送系统。此类系统可以避免组合物的反复施用，从而增加便利性。许多类型的释放递送系统是本领域普通技术人员可获得的和已知的。它们包括基于聚合物的系统例如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己酸内酯、聚酰胺酯、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酸酐。含有药物的上述聚合物的微胶囊在例如美国专利号5,075,109中描述。

递送系统还包括：非聚合物系统，其为脂质，包括甾醇如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪如单-双甘油酯和甘油三酯；水凝胶释放系统；硅橡胶系统(sylasticsystem)；基于肽的系统；蜡涂层；使用常规粘合剂和赋形剂的压制片剂；部分融合的植入物；等等。具体实例包括但不限于侵蚀系统，其中本发明的药剂以某种形式包含在基质中，例如美国专利号4,452,775、4,675,189和5,736,152中所述的那些，以及扩散系统，其中活性组分以受控速率从聚合物渗透，例如美国专利号3,854,480、5,133,974和5,407,686中所述。另外，可以使用基于泵的硬件递送系统，其中一些适合用于植入。

因为可以在上述组合物、产品和方法中进行多种变化而不背离本发明范围，所以预期上文描述和下文给出的实施例中包含的所有内容应被解释为说明性而非限制性的涵义。

定义

术语“有效量”是指实现期望的生物效应所必需或足以实现期望的生物效应的量。例如，用于治疗或预防感染性疾病的免疫调节剂的有效量是暴露于微生物后引起免疫应答的发生所必需、因而引起对象内微生物量的降低并且优选微生物的根除的量。对于任何具体应用的有效量可以根据例如以下的因素而变化：所治疗的疾病或状况、对象的大小、或疾病或状况的严重性。本领域普通技术人员无需过度实验就可以通过经验确定免疫调节剂的有效量。

如本文所用的术语“母牛”是指能够生育后代的牛物种的任何成员，包括但不限于雌性牛、母牛和小母牛。

术语“细胞因子”是指增强免疫的蛋白家族。细胞因子家族包括造血生长因子、白介素、干扰素、免疫球蛋白超家族分子、肿瘤坏死因子家族分子和趋化因子(即调节细胞、特别是吞噬细胞的迁移和激活的蛋白)。示例性细胞因子包括而不限于白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL12)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)、干扰素-α(IFNα)和干扰素-γ(IFNγ)。

术语“引发”可与术语激活、刺激、产生或上调互换使用。

术语在对象中“引发免疫应答”是指特异性控制或影响免疫应答的活性，并且可以包括激活免疫应答、上调免疫应答、增强免疫应答和/或改变免疫应答(例如通过引发一类免疫应答，其进而将对象中免疫应答的优势类型从有害或无效的类型转变为有益或保护性的类型)。

术语“可操作连接”是指以这样的方式将核酸分子连接至转录控制序列，所述方式使得当被转染(即转化、转导或转染)入宿主细胞时能够表达所述分子。转录控制序列是控制转录的起始、延伸和终止的序列。尤其重要的转录控制序列是控制转录起始的那些序列，例如启动子、增强子、操纵子和阻抑子序列。多种此类转录控制序列是本领域技术人员已知的。优选的转录控制序列包括在禽类、鱼类、哺乳动物、细菌、植物和昆虫细胞中发挥功能的那些。尽管本发明可使用任何转录控制序列，但所述序列可包括天然存在的转录控制序列，其与编码免疫原或免疫刺激蛋白的序列天然结合。

术语“核酸分子”和“核酸序列”可以互换使用，并且包括DNA、RNA、或DNA或RNA的衍生物。该术语还包括寡核苷酸和更大的序列，包括编码蛋白或其片段的核酸分子以及包含调节区、内含子或其它非编码DNA或RNA的核酸分子。通常，寡核苷酸具有长度为约1到约500个核苷酸的核酸序列，并且更通常，长度为至少约5个核苷酸。核酸分子可以源自任何来源，包括哺乳动物、鱼类、细菌、昆虫、病毒、植物或合成来源。核酸分子可以通过本领域通常已知的方法来产生，例如重组DNA技术(例如，聚合酶链式反应(PCR)、扩增、克隆)或化学合成。核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括但不限于天然等位基因变体和经修饰的核酸分子，其中已以这样的方式插入、缺失、取代或倒置核苷酸，所述方式使得此类修饰基本上不干扰核酸分子编码可用于本发明的方法的免疫原或免疫刺激蛋白的能力。核酸同源物可使用本领域技术人员已知的许多方法来产生(参见，例如，Sambrook等人，MolecularCloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press，1989)，其通过引用并入本文。筛选免疫原性例如病原体抗原免疫原性或细胞因子活性的技术是本领域技术人员已知的，并且包括各种体外和体内测定。

术语“可选择的标记物”和“可选择的标记基因”是指编码产物的基因，所述产物保护其中表达所述基因的生物体免于通常会杀死该生物体或抑制其生长的选择剂(例如，抗生素)或状况。可选择的标记基因是最常用的抗生素抗性基因(例如，卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因等)。因此，例如，当大肠杆菌细胞经受转化程序以引入编码卡那霉素抗性基因的质粒、且然后在含有卡那霉素的培养基上或其中生长时，只有已成功摄取质粒并表达卡那霉素抗性基因的大肠杆菌细胞才将存活。术语“可选择的标记物”和“可选择的标记基因”还包括编码参与对于生物体的生长所必需的化合物的合成的酶的基因。当被引入到不能合成必需化合物的营养缺陷型生物体中时，此类基因允许生物体在已补充有必需化合物的培养基中生长。例如，这样的细菌细胞通常无法在尚未补充有赖氨酸的培养基中生长，所述细胞由于参与赖氨酸生物合成的酶中的突变或所述酶的缺乏而对于氨基酸赖氨酸营养缺陷。当此类细菌经受转化程序以引入编码参与赖氨酸生物合成的酶的质粒时，已成功摄取所述质粒并表达所述酶的细菌当在尚未补充有赖氨酸的培养基中生长时将存活。术语“可选择的标记物”和“可选择的标记基因”还包括允许毒物/解毒剂选择的基因。例如，ccdB基因编码结合DNA促旋酶(对于细胞分裂所必需的酶)的蛋白。结合DNA促旋酶之后，ccdB基因产物损害基因复制并诱导细胞死亡。因此，表达ccdB基因产物的细菌不能存活。ccdA基因编码充当ccdB基因产物的天然抑制剂的蛋白(“解毒剂”)。因此，当在其细菌基因组中具有ccdB基因的细菌经受转化程序以引入编码ccdA基因产物的质粒时，只有成功摄取所述质粒并表达ccdA基因的细胞才将存活。

术语“可筛选的标记物”和“可筛选的标记基因”是指编码产物的基因，所述产物允许观察者区分表达可筛选的标记基因的细胞和不表达可筛选的标记基因的细胞。可筛选的标记基因系统是本领域中众所周知的，并且包括例如lacZ基因和编码荧光蛋白的基因，所述荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)或青色荧光蛋白(CFP)。

表1：质粒DNA序列

实施例

下列实施例示例本发明的各种实施方案。

实施例1：免疫调节剂组合物在增加非发情周期母牛中的受孕率中的功效

本研究的目的是评估在产犊时调节免疫功能对治疗的母牛的繁殖结果的影响。

免疫调节剂

本研究中使用的免疫调节剂是上文实施例1中描述的组合物。

研究动物

从新西兰怀卡托地区的两个商业乳畜农场A和B获得875头Friesian、Jersey或杂交母牛，年龄≥2岁。根据新产犊和哺乳选择母牛。如果它们在产犊前30天内使用抗生素、非甾体类抗炎剂或皮质类固醇治疗，或者如果它们在产犊时表现出任何疾病的明显证据，则排除母牛。剩余的动物按年龄(小母牛对母牛)分隔，并在根据预先制备的随机化列表呈现的连续动物对内分配至治疗组或安慰剂组。

治疗

随机进行治疗，并且治疗分配不包括在治疗后取样表的任一上，并且在接收(accession)时对乳样品指定唯一的编号，其在随后的实验室分析期间应用。在产犊当天(第0天)以及身体检查和登记之后，通过肌内注射到右臀肌中来施用适当的治疗。在注射之前，使用在70％甲基化酒精中湿润的棉球擦拭注射部位。在产后第3天晚上或第4天早晨、并在产后第7天再次在右臀肌中注射而重复治疗。

育种管理

在计划的育种计划开始之前约30天施用尾部涂料(热检测辅助剂)。用黄体酮、GnRH和前列腺素F_2α的组合处理通过观察或去除尾部涂料而没有检测到在发情中的那些母牛，并将其饲养至设定时间的人工授精。对于最初的农场A场地的37天和农场B场地的47天，通过人工授精使经检测处于持续发情中的那些母牛育种。此后，将该牛群与完整公牛一起管理(run)。对于农场A和B，交配期的总长度分别为77天和80天。在育种计划开始后83天和113天(农场A)以及此育种计划开始后90和120天(农场B)，通过经直肠超声检查法检查母牛。检测到怀孕的那些母牛具有估计的妊娠阶段。在估计的妊娠阶段是在记录的育种的7天内的情况下(无论是人工授精还是自然交配)，记录的日期被接受为受孕日。

结果

计算三周服从率(在育种计划开始三周内检测和授精的母牛比例)、首次授精受孕率(育种至人工授精的、受孕于第一次授精的母牛比例)以及3周和6周怀犊率(在育种计划的最初三周和六周内确认怀孕的母牛比例)、和最终怀孕率。

首先，在双变量(卡方)分析中分析二项式繁殖结果。然后，采用多变量逻辑回归模型，其包括治疗、牛群、年龄(2、3和> 3岁龄)、育种计划开始时的产奶天数(分类为50至71天和≥72天)和品种(Friesian对其它品种)的解释变量。此外，对每头母牛计算计划的交配开始到受孕的间隔，并使用Kaplan-Meier生存分析来计算至受孕的中值天数。

针对品种代码和年龄平衡治疗组，并使用卡方检验计算p值，如表1中所描述。

表1：根据品种代码和年龄的治疗组和对照组中的母牛数量

*使用Fisher精确检验计算P值。

此外，从产犊到计划的交配开始的平均值和中值时间在治疗组和对照组之间是相同的，如表2中所描述。使用Mann-Whitney检验计算比较治疗组和对照组的从产犊到计划的育种开始的中值天数的P值。

表2：治疗组和对照组中的母牛的从产犊到育种计划开始的平均值、标准误差(SE)和中值天数

如表3中所示，在双变量水平，对于在计划的交配开始(PSM)后21天内服从人工授精的概率(3周内服从)、PSM后对第一次授精受孕的概率(对首次授精受孕)、至PSM后21天和42天怀孕的概率(分别为3周内怀孕和6周内怀孕)和整体怀孕，治疗组和对照组之间没有差异。使用卡方检验计算P值。

表3：根据治疗组的母牛数量(％)

在控制潜在的效应调节物(包括品种(Holstein、Jersey和杂交)、年龄(2、3和4+岁)、牛群(1和2)、卵巢周期活动(基于插入CIDR装置的发情周期和非发情周期)和从产犊到PSM的时间(50到71天和≥72天))的多变量回归分析中，与在对照组中的其对应物相比，治疗组中非发情周期母牛在3周内对首次授精受孕和怀孕的概率较高。图4A显示了根据治疗组、对于发情周期和非发情周期母牛、对首次授精受孕的概率(估计的边际平均值和平均值的标准误差(SEM))的图表，并且图4B显示了根据治疗组、对于发情周期和非发情周期母牛、在育种计划的按计划开始后3周内怀孕的概率(估计的边际平均值和SEM)。星号表示非发情周期组内治疗之间的差异。对于治疗组和对照组，PSM至怀孕的中值时间分别为15天和16天(P = 0.27)。

与未治疗的对照相比，对首次授精受孕的数量上更多的治疗的母牛(69％对65％)至3周(63％对61％)和6周(80％对76％)是怀孕的。存在通过非发情周期状态相互作用的治疗，由此在诊断为没有检测到在发情中并且针对该状况进行治疗的那些母牛中，治疗的母牛至进入育种计划三周具有较高的首次授精受孕率和较高比例的怀孕。

序列表

<110>

<120> 牛物种中增加的生育力

<130> BAYR

<150> Pat. Appln. Number - TBA

>151> Date -

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4242

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒pGCMB75.6的核苷酸序列

<400> 1

tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 60

ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 120

gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 180

tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac 240

atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 300

cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 360

agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 420

ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 480

gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 540

cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagccg atctgataac ggtaccgata agctggcggc 600

cgattaagct acagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga 660

caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc 720

tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac 780

tcccaggttc aattacagct cttaagcagc cgcaagcttg atatcgaatt cctgcagccc 840

gggggatcca ctagttctag agcggccgcc accgcggtgg agctcgaatt atcagatcga 900

ttaataacta tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa ggggttaata 960

aggaatattt gatgtatagt gccttgacta gagatcataa tcagccatac cacatttgta 1020

gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg 1080

aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 1140

agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 1200

aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcatcagat ctgccggtct ccctatagtg 1260

agtcgtatta atttcgataa gccaggttaa cctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 1320

gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 1380

ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 1440

agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 1500

ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 1560

caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 1620

gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 1680

cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 1740

tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 1800

gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 1860

cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 1920

tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 1980

tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 2040

caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 2100

aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 2160

cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gggcgcgcct aggcttttgc aaagatcgat 2220

caagagacag gatgaggatc gtttcgcagc ttttcattct gactgcaacg ggcaataagt 2280

ctctgtgtgg attaaaaaaa gagtgtctga tagcagcttc tgaactggtt acctgccgtg 2340

agtaaattaa aattttattg acttaggtca ctaaggcgcc ttgcgctgag gttgcgtcgt 2400

gatatcatca gggcagaccg gttacatccc cctaacaagc tgtataaaga gaaatactat 2460

ctcattggcg ttgcccgcac ctgacagtgc gacgttgggc tgcgtccgtc gaccaacggt 2520

accgaggtaa cagcccaatc tatccatgat ctcggccagg ccgggtcggc cgttatgcag 2580

cccggctcgg gtatgaagcc attaaggagc cgacccagcg cgaccgggcg gccggtcacg 2640

ctgcctctgc tgaagcctgc ctgtcactcc ctgcgcggcg tacccgccgt tctcatcgag 2700

taggctccgg atcgcgaccc cggacgggcc ctgggcccag gagcggccta tgacaaatgc 2760

cgggtagcga tccggcattc agcattgact gcgcacggat ccagtccttg caggagcctt 2820

atgccgaccg tagcaaaaaa tgagcccgag ccgatcgcga gttgtgatcc ggtcccgccg 2880

attgccggtc gcgatgacgg tcctgtgtaa gcgttatcgt taccaattgt ttaagaagta 2940

tatacgctac gaggtacttg ataacttctg cgtagcatac atgaggtttt gtataaaaat 3000

ggcgggcgat atcaacgcag tgtcagaaat ccgaaacagt ctgcgggact ctggggttcg 3060

aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct 3120

tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc 3180

gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accctaggcg cgctcatgag cggatacata 3240

tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 3300

ccacctaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca 3360

gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga 3420

ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg 3480

actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat 3540

caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag 3600

ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga 3660

agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa 3720

ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcccattcg ccattcaggc 3780

tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 3840

aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 3900

gttgtaaaac gacggccagt gagcgcgcgt aatacgactc actatagggc gaattgggta 3960

ccgggccccc cctcgagcag gatctataca ttgaatcaat attggcaatt agccatatta 4020

gtcattggtt atatagcata aatcaatatt ggctattggc cattgcatac gttgtatcta 4080

tatcataata tgtacattta tattggctca tgtccaatat gaccgccatg ttgacattga 4140

ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg 4200

gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gc 4242

<210> 2

<211> 4242

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒pMB75.6的核苷酸序列

<400> 2

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120

gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180

caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240

ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300

cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360

agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420

cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccgg 660

gccccccctc gagcaggatc tatacattga atcaatattg gcaattagcc atattagtca 720

ttggttatat agcataaatc aatattggct attggccatt gcatacgttg tatctatatc 780

ataatatgta catttatatt ggctcatgtc caatatgacc gccatgttga cattgattat 840

tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt 900

tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc 960

cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 1020

gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 1080

tgccaagtcc gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc 1140

agtacatgac cttacgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 1200

ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 1260

ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc 1320

aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc 1380

gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga 1440

gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctcccct 1500

cgaagccgat ctgataacgg taccgataag ctggcggccg attaagctac agaagttggt 1560

cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga gaccaataga 1620

aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct attggtctta 1680

ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccaggttcaa ttacagctct 1740

taagcagccg caagcttgat atcgaattcc tgcagcccgg gggatccact agttctagag 1800

cggccgccac cgcggtggag ctcgaattat cagatcgatt aataactatg ctcaaaaatt 1860

gtgtaccttt agctttttaa tttgtaaagg ggttaataag gaatatttga tgtatagtgc 1920

cttgactaga gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa 1980

acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact 2040

tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 2100

aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc 2160

atgtctggat catcagatct gccggtctcc ctatagtgag tcgtattaat ttcgataagc 2220

caggttaacc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 2280

cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 2340

gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 2400

aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 2460

gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 2520

aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 2580

gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 2640

ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 2700

cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 2760

ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 2820

actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 2880

tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 2940

gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 3000

ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 3060

cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 3120

ttggtcatga gcgcgcctag gcttttgcaa agatcgatca agagacagga tgaggatcgt 3180

ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc 3240

tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc 3300

tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg 3360

aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag 3420

ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg 3480

ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg 3540

caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac 3600

atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg 3660

acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc 3720

ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg 3780

aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc 3840

aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc 3900

gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc 3960

ttcttgacga gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc 4020

caacctgcca tcacgagatt tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg 4080

aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt 4140

cttcgcccac cctaggcgcg ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 4200

aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc ac 4242

<210> 3

<211> 4242

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒pMB75.6_AscI的核苷酸序列

<400> 3

tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 60

ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 120

gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 180

tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac 240

atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 300

cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 360

agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 420

ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 480

gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 540

cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagccg atctgataac ggtaccgata agctggcggc 600

cgattaagct acagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga 660

caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc 720

tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac 780

tcccaggttc aattacagct cttaagcagc cgcaagcttg atatcgaatt cctgcagccc 840

gggggatcca ctagttctag agcggccgcc accgcggtgg agctcgaatt atcagatcga 900

ttaataacta tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa ggggttaata 960

aggaatattt gatgtatagt gccttgacta gagatcataa tcagccatac cacatttgta 1020

gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg 1080

aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 1140

agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 1200

aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcatcagat ctgccggtct ccctatagtg 1260

agtcgtatta atttcgataa gccaggttaa cctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 1320

gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 1380

ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 1440

agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 1500

ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 1560

caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 1620

gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 1680

cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 1740

tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 1800

gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 1860

cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 1920

tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 1980

tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 2040

caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 2100

aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 2160

cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gggcgcgcct aggcttttgc aaagatcgat 2220

caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct 2280

ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc 2340

tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc 2400

gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc 2460

acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg 2520

ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag 2580

aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc 2640

ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt 2700

cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc 2760

gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc 2820

tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg 2880

ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag 2940

cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg 3000

cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg 3060

aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct 3120

tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc 3180

gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accctaggcg cgctcatgag cggatacata 3240

tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 3300

ccacctaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca 3360

gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga 3420

ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg 3480

actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat 3540

caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag 3600

ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga 3660

agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa 3720

ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcccattcg ccattcaggc 3780

tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 3840

aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 3900

gttgtaaaac gacggccagt gagcgcgcgt aatacgactc actatagggc gaattgggta 3960

ccgggccccc cctcgagcag gatctataca ttgaatcaat attggcaatt agccatatta 4020

gtcattggtt atatagcata aatcaatatt ggctattggc cattgcatac gttgtatcta 4080

tatcataata tgtacattta tattggctca tgtccaatat gaccgccatg ttgacattga 4140

ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg 4200

gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gc 4242

<210> 4

<211> 4242

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒pLacZMB75.6的核苷酸序列

<400> 4

tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 60

ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 120

gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 180

tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac 240

atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 300

cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 360

agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 420

ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 480

gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 540

cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagccg atctgataac ggtaccgata agctggcggc 600

cgattaagct acagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga 660

caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc 720

tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac 780

tcccaggttc aattacagct cttaagcagc cgccaaaaca aaattcctca aaaatcatca 840

tcgaatgaat ggtgaaataa tttccctgaa taactgtagt gttttcaggg cgcggcataa 900

taattaacta tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa ggggttaata 960

aggaatattt gatgtatagt gccttgacta gagatcataa tcagccatac cacatttgta 1020

gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg 1080

aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 1140

agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 1200

aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcatcagat ctgccggtct ccctatagtg 1260

agtcgtatta atttcgataa gccaggttaa cctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 1320

gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 1380

ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 1440

agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 1500

ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 1560

caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 1620

gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 1680

cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 1740

tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 1800

gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 1860

cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 1920

tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 1980

tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 2040

caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 2100

aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 2160

cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gggcgcgcct aggcttttgc aaagatcgat 2220

caagagacag gatgaggatc gtttcgcagc ttttcattct gactgcaacg ggcaataagt 2280

ctctgtgtgg attaaaaaaa gagtgtctga tagcagcttc tgaactggtt acctgccgtg 2340

agtaaattaa aattttattg acttaggtca ctaaggcgcc ttgcgctgag gttgcgtcgt 2400

gatatcatca gggcagaccg gttacatccc cctaacaagc tgtataaaga gaaatactat 2460

ctcattggcg ttgcccgcac ctgacagtgc gacgttgggc tgcgtccgtc gaccaacggt 2520

accgaggtaa cagcccaatc tatccatgat ctcggccagg ccgggtcggc cgttatgcag 2580

cccggctcgg gtatgaagcc attaaggagc cgacccagcg cgaccgggcg gccggtcacg 2640

ctgcctctgc tgaagcctgc ctgtcactcc ctgcgcggcg tacccgccgt tctcatcgag 2700

taggctccgg atcgcgaccc cggacgggcc ctgggcccag gagcggccta tgacaaatgc 2760

cgggtagcga tccggcattc agcattgact gcgcacggat ccagtccttg caggagcctt 2820

atgccgaccg tagcaaaaaa tgagcccgag ccgatcgcga gttgtgatcc ggtcccgccg 2880

attgccggtc gcgatgacgg tcctgtgtaa gcgttatcgt taccaattgt ttaagaagta 2940

tatacgctac gaggtacttg ataacttctg cgtagcatac atgaggtttt gtataaaaat 3000

ggcgggcgat atcaacgcag tgtcagaaat ccgaaacagt ctgcgggact ctggggttcg 3060

aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct 3120

tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc 3180

gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accctaggcg cgctcatgag cggatacata 3240

tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 3300

ccacctaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca 3360

gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga 3420

ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg 3480

actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat 3540

caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag 3600

ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga 3660

agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa 3720

ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcccattcg ccattcaggc 3780

tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 3840

aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 3900

gttgtaaaac gacggccagt gagcgcgcgt aatacgactc actatagggc gaattgggta 3960

ccgggccccc cctcgaggtc gacggtatcg ataagcttga tatcgaattc ctgcagcccg 4020

ggggatccac tagttctaga gcggccgcca ccgcggtgga gctccagctt ttgttccctt 4080

tagtgagggt taattgcgcg cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 4140

tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 4200

ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gc 4242

Claims

1.用于增加母牛中的受孕率的免疫调节剂组合物，其中所述免疫调节组合物包含：

a. 阳离子脂质体递送媒介物；和

b. 分离的细菌衍生的核酸分子，所述核酸分子不编码免疫原。

2.权利要求1的免疫调节剂组合物，其中所述核酸分子包含至少一个免疫刺激性CpG基序和至少一个非免疫刺激性CpG基序。

3.前述权利要求中任一项的免疫调节剂组合物，其中所述核酸分子与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的序列具有至少80％的序列同源性。

4.前述权利要求中任一项的免疫调节剂组合物，其中所述脂质体递送媒介物包含选自多层囊泡脂质和挤出脂质的脂质。

5.前述权利要求中任一项的免疫调节剂组合物，其中所述脂质体递送媒介物包含选自以下的脂质对：N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)和胆固醇；N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)和胆固醇；1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)和胆固醇；以及二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)和胆固醇。

6.前述权利要求中任一项的免疫调节剂组合物，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:1。

7.权利要求1-5中任一项的免疫调节剂组合物，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 2。

8.前述权利要求中任一项的免疫调节组合物，其还包含生物剂。

9.权利要求8的免疫调节组合物，其中所述生物剂选自免疫增强蛋白、免疫原、疫苗、抗微生物剂或其任何组合。

10.前述权利要求中任一项的免疫调节剂组合物，其用于选自静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、通过喷雾-气溶胶、口服、眼内、气管内和鼻内的施用。

11.前述权利要求中任一项的免疫调节剂组合物，其还包含药学上可接受的载体。

12.前述权利要求中任一项的免疫调节组合物，其中所述母牛中的受孕率相对于对照群体中的受孕率增加，如通过≤0.05的p值所测量的。

13.增加母牛中的受孕率的方法，包括向所述母牛施用有效量的免疫调节剂组合物，其中所述免疫调节剂组合物包含：

a. 阳离子脂质体递送媒介物；和

14.权利要求13的方法，其中所述核酸分子包含至少一个免疫刺激性CpG基序和至少一个非免疫刺激性CpG基序。

15.权利要求13或14的方法，其中所述核酸分子与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的序列具有至少80％的序列同源性。

16.权利要求13-15中任一项的方法，其中所述脂质体递送媒介物包含选自多层囊泡脂质和挤出脂质的脂质。

17.权利要求13-16中任一项的方法，其中所述脂质体递送媒介物包含选自以下的脂质对：N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)和胆固醇；N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)和胆固醇；1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)和胆固醇；以及二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)和胆固醇。

18.权利要求13-17中任一项的方法，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1。

19.权利要求13-17中任一项的方法，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 2。

20.权利要求13-19中任一项的方法，其还包含生物剂。

21.权利要求20的方法，其中所述生物剂选自免疫增强蛋白、免疫原、疫苗、抗微生物剂或其任何组合。

22.权利要求13-21中任一项的方法，其中所述施用选自静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、通过喷雾-气溶胶、口服、眼内、气管内和鼻内。

23.权利要求13-22中任一项的方法，其还包含药学上可接受的载体。

24.权利要求13-23中任一项的方法，其中所述母牛中的受孕率相对于对照群体中的受孕率增加，如通过≤0.05的p值所测量的。