CN108025062A - 猪科动物物种中增强的免疫应答 - Google Patents

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Abstract

本发明一般涉及在猪科动物物种对象中引发免疫应答的方法。特别地，免疫调节剂组合物用于诱导免疫应答以增强对象对抗感染性病原体的能力。

Description

猪科动物物种中增强的免疫应答
交叉引用
本申请根据35 U.S.C §119（e）要求临时美国专利申请号62/199,848的权益，所述临时美国专利申请于2015年7月31日提交，并且名称为ENHANCED IMMUNE RESPONSE IN PORCINESPECIES，其内容整体引入本文作为参考。
发明领域
本发明总体涉及通过激活先天性免疫在对象中引发免疫应答的方法。具体而言，免疫调节剂组合物用于刺激猪科动物物种成员中的先天性免疫。
发明概述
本发明涉及使用免疫刺激性质粒来调节猪科动物物种对象中的先天性免疫的方法。所述免疫刺激性质粒可以包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或其组合的序列具有至少80%序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以包含与SEQ ID NO：4的序列具有至少84%序列同一性的核酸分子。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以包含SEQ ID NO：1的序列。在一些，所述免疫刺激性质粒可以包含SEQ ID NO：4的序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以包含SEQ ID NO：2的序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以包含SEQ ID NO： 3的序列。
在其他方面，所述免疫刺激性质粒可以由与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4或其组合的序列具有至少80%序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以由与SEQ ID NO：4的序列具有至少84%序列同一性的核酸分子组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以由SEQ ID NO：1的序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以由SEQ ID NO：4的序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以由SEQ ID NO：2的序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以由SEQ ID NO：3的序列组成。
在一些方面，所述免疫刺激性质粒优选不包含编码全长或功能性可选择或可筛选的标记物的核酸序列。在其他方面，所述免疫刺激性质粒包含编码不是抗生素抗性基因的可选择或可筛选的标记物的核酸序列。
本发明还涉及包含本文所述的免疫刺激性质粒或DNA序列中的任一种以及药学上可接受的载体的药物制剂。
本发明还涉及包含阳离子脂质体递送媒介物以及本文所述的免疫刺激性质粒或DNA序列中的任一种的免疫调节剂组合物。
在一些方面，本发明涉及使用本文所述的免疫刺激性质粒或DNA序列的方法。合适的使用方法包括对猪科动物物种的对象进行治疗性施用。此类治疗性施用包括对一个或多个对象的预防性治疗、整体预防性（metaphylactic）治疗和感染后治疗。
本发明涉及刺激或引发对象中的免疫应答的方法。在一些方面，所述方法包括通过向对象施用本文所述的免疫调节剂组合物而刺激该对象中的免疫应答。在一些方面，所述方法包括通过向对象施用本文所述的免疫刺激性质粒或DNA序列而刺激该对象中的免疫应答。在一些方面，所述免疫调节剂还可以包含生物制剂或与生物制剂组合施用，所述生物制剂例如疫苗。
本发明还提供了减少猪中的腹泻的方法，所述方法包括向猪施用有效量的免疫调节剂组合物，其中所述免疫调节剂包含阳离子脂质递送媒介物和不编码免疫原的核酸分子，其中所述施用在用大肠杆菌（Escherichia coli）攻击后减少所述猪中的腹泻。
本发明还提供了增强猪中重量增加的方法，所述方法包括向猪施用免疫调节剂组合物，所述免疫调节剂包含阳离子脂质递送载体和不编码免疫原的核酸分子，其中所述施用增强在用猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）攻击后所述猪中的重量增加。
其他目标和特征将是一部分显而易见的，且一部分在下文中指出。
附图简述
以下附图形成本说明书的部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。本发明可以通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文提供的具体实施方案的详细描述而更好地理解。
图1显示了pMB75.6质粒（SEQ ID NO：2）的图谱；
图2显示了pGCMB75.6质粒（SEQ ID NO：1）的图谱；
图3显示了pLacZ75.6质粒（SEQ ID NO：4）的图谱；
图4图示说明了对于第0天（实心，浅灰色）、第3天（实心，深灰色）、第7天（斜线）、第10天（黑色菱形）、第14天（实心，深红色）、第18 天（实心，粉红色）、第21天（实心，蓝色）、第24天（实心，浅蓝色）和第28天（实心，深蓝色），每个处理组（Txt 1：仅疫苗；Txt 2：疫苗和200 μg免疫调节剂组合物；Txt 3：疫苗和50 μg免疫调节剂组合物；Txt 4：疫苗和10 μg免疫调节剂组合物；以及Txt 5：稀释剂（5%右旋糖和水））针对H1N1的血凝抑制的几何平均数；
图5图示说明了对于第0天（实心，浅灰色）、第3天（实心，深灰色）、第7天（斜线）和第21天（实心，蓝色），每个处理组（Txt 1：仅疫苗；Txt 2：疫苗和200 μg免疫调节剂组合物；Txt3：疫苗和50 μg免疫调节剂组合物；Txt 4：疫苗和10 μg免疫调节剂组合物；以及Txt 5：稀释剂（5%右旋糖和水））针对H3N2的血凝抑制的几何平均数；
图6图示说明了对于第0天（实心，浅灰色）、第3天（实心，深灰色）、第7天（斜线）、第10天（黑色菱形）、第14天（实心，深红色）、第18 天（实心，粉红色）、第21天（实心，蓝色）、第24天（实心，浅蓝色）和第28天（实心，深蓝色），每个处理组（Txt 1：仅疫苗；Txt 2：疫苗和200 μg免疫调节剂组合物；Txt 3：疫苗和50 μg免疫调节剂组合物；Txt 4：疫苗和10 μg免疫调节剂组合物；以及Txt 5：稀释剂（5%右旋糖和水））针对H1N1的血凝抑制的实际平均值；
图7图示说明了对于第0天（实心，浅灰色）、第3天（实心，深灰色）、第7天（斜线）和第21天（实心，蓝色），每个处理组（Txt 1：仅疫苗；Txt 2：疫苗和200 μg免疫调节剂组合物；Txt3：疫苗和50 μg免疫调节剂组合物；Txt 4：疫苗和10 μg免疫调节剂组合物；以及Txt 5：稀释剂（5%右旋糖和水））针对H3N2的血凝抑制的实际平均值；
图8图示说明了对于每个处理组（Txt 1：仅疫苗；Txt 2：疫苗和200 μg免疫调节剂组合物；Txt 3：疫苗和50 μg免疫调节剂组合物；Txt 4：疫苗和10 μg免疫调节剂组合物；以及Txt 5：稀释剂（5%右旋糖和水）），在第21天时血清转换为H1N1和H3N2分离物的猪的百分比；
图9图示说明了对于每个处理组，在攻击后猪的每天平均姿态得分，所述处理组包括无疫苗/未受攻击的（空心菱形）、无疫苗/受攻击的（实心正方形）、Rx I疫苗加上10 μg免疫调节剂加上攻击（空心三角形）、Rx II疫苗加上50 μg免疫调节剂加上攻击（空心正方形）、RxIII疫苗加上攻击（星形）；
图10图示说明了对于每个处理组，在攻击前到攻击后第10天猪的平均体温，所述处理组包括无疫苗/未受攻击的（空心菱形）、无疫苗/受攻击的（空心正方形）、Rx I疫苗加上10μg免疫调节剂加上攻击（实心三角形）、Rx II疫苗加上50 μg免疫调节剂加上攻击（实心正方形）、Rx III疫苗加上攻击（星形）；
图11图示说明了对于处理组，在用强毒PRRS病毒攻击之前和之后按组计的平均体重，所述处理组包括无疫苗/未受攻击的（实心菱形）、无疫苗/受攻击的（实心正方形）、Rx I疫苗加上10 μg免疫调节剂加上攻击（空心三角形）、Rx II疫苗加上50 μg免疫调节剂加上攻击（十字形）、Rx III疫苗加上攻击（星形）；
图12图示说明了从第-39天到第10天按组计的平均体重增加，包括从第-39天到第0天（黑色）、第-39天到第6天（灰色）和第-39天到第10天（虚线）的增加；
图13图示说明了在第0天（黑色）、第6天（灰色）和第10天（虚线）时，按组计的平均攻击后体重；
图14图示说明了对于第0至6天（黑色）、第0天至第10天（灰色）和第6天至第10天（虚线）的攻击后体重增加。
图15图示说明了对于第0至6天（黑色）、第0天至第10天（灰色）和第6天至第10天（虚线）的攻击后体重增加百分比。
图16图示说明了按组计的肺重量，所述组包括未受攻击的（实心正方形）、受攻击的（空心菱形）、Rx 1疫苗加上10 μg免疫调节剂加上攻击（实心和空心正方形）、Rx 2疫苗加上50μg免疫调节剂加上攻击（空心正方形）和Rx 3（实心和空心菱形）；
图17图示说明了作为体重百分比按组计的肺重量，所述组包括无疫苗/未受攻击的、无疫苗/受攻击的、Rx I疫苗加上10 μg免疫调节剂/受攻击的、Rx II疫苗加上50 μg免疫调节剂/受攻击的和Rx III疫苗/受攻击的；
图18图示说明了从处理组中分离的PRRS病毒，所述组包括未受攻击的（空心圆圈）、无疫苗/受攻击的（实心正方形）、Rx I疫苗加上10 μg免疫调节剂/受攻击的（实心三角形）、RxII疫苗加上50 μg免疫调节剂/受攻击的（实心圆圈）和Rx III疫苗/受攻击的（实心菱形）；
图19图示说明了对于按组分离的肺病毒滴度；
图20图示说明了基于肺泡间隔增厚和增厚的分布，关于处理组的肺病理学得分，所述处理组包括对照、攻击、Rx I疫苗加上10 μg免疫调节剂/受攻击的、Rx II疫苗加上50 μg免疫调节剂/受攻击的和Rx III疫苗/受攻击的；
图21图示说明了每个处理组中的个体动物的干扰素滴度，所述处理组包括无疫苗/无攻击、无疫苗/攻击、Rx I疫苗加上10 μg免疫调节剂/受攻击的、Rx II疫苗加上50 μg免疫调节剂/受攻击的和Rx III疫苗/受攻击的；
图22描绘了从其中获取组织样品以评价微观损伤的肺区域；
图23图示说明了相对于安慰剂处理的猪，处理组中PRRSV的病毒肺载量；
图24显示了在对照组和每个免疫调节剂处理组（第-1天、第0天和第2天）之间，由关于每只动物的叶得分总和代表的肉眼所见肺病理学；
图25显示关于对照组和每个免疫调节剂处理组（第-1天、第0天和第2天）的IFN-α血清水平；
图26图示说明了对于处理组在第-2、4、7、10和14天时的血清病毒血症平均值，所述处理组包括安慰剂、25μg免疫调节剂、50 μg免疫调节剂、75 μg免疫调节剂和阴性对照；
图27显示了在处理组之间的平均PRRSV病毒肺载量，所述处理组包括安慰剂、25μg免疫调节剂、50 μg免疫调节剂、75 μg免疫调节剂和阴性对照；
图28显示了在处理组之间的微观肺损伤得分，所述处理组包括安慰剂、25μg免疫调节剂、50 μg免疫调节剂、75 μg免疫调节剂和阴性对照；和，
图29显示了跨越处理组，在断奶仔猪中与产肠毒性大肠杆菌（F18菌毛、EAST1、STa和STb毒素、以及AIDA粘附素基因）相关的腹泻的流行率。
图30说明了使用磁性细胞分离所分离的不同血细胞类型。
图31显示了IC-Ex.1的生理相关浓度刺激CD172a+细胞中IFN-α的表达
图32图示显示了CD172a-细胞在用IC-Ex.1或已知的免疫刺激剂刺激后不产生IFN-α。
图33图示显示了TNF α在CD172a-细胞中不产生。
图34A-D分别说明了在CD14+、两种类型的常规树突细胞和浆细胞样树突细胞中，用细胞培养基对照刺激后的IFN-α产生。
图35A-D分别说明了在CD14+、两种类型的常规树突细胞和浆细胞样树突细胞中，用CpGODN刺激后的IFN-α产生。
图36A-D分别说明了在CD14+、两种类型的常规树突细胞和浆细胞样树突细胞中，用IC-Ex.1（100 ng/mL）刺激后的IFN-α产生。
图37A-D分别说明了在CD14+、两种类型的常规树突细胞和浆细胞样树突细胞中，用IC-Ex.1（10 ng/mL）刺激后的IFN-α产生。
图38A-D分别说明了在CD14+、两种类型的常规树突细胞和浆细胞样树突细胞中，用IC-Ex.1（100ng/mL0刺激后的IFN-α产生。
图39A-D分别说明了在CD14+、两种类型的常规树突细胞和浆细胞样树突细胞中，用脂质体（100 ng/mL）刺激后的IFN-α产生。
图40A-D分别说明了在CD14+、两种类型的常规树突细胞和浆细胞样树突细胞中，用IC-Ex.1（10ng/mL）刺激后的IFN-α产生。
图41A-D分别说明了在CD14+、两种类型的常规树突细胞和浆细胞样树突细胞中，用脂质体（10 ng/mL）刺激后的IFN-α产生。
图42图示说明了产生IFN-α的细胞的百分比。
图43图示显示了通过产生IFN-α的细胞生成的平均荧光强度。
图44图示显示了用不同免疫刺激剂或免疫刺激剂浓度刺激后的IFN-γ的比较产生。
图45说明了用IC-Ex.1和已知的免疫刺激剂刺激后CD172a+细胞中的IL-4产生。
图46说明了用IC-Ex.1和已知的免疫刺激剂刺激后CD172a+细胞中的IL-1β产生。
图47说明了用IC-Ex.1和已知的免疫刺激剂刺激后CD172a+细胞中的IL-6产生。
图48说明了用IC-Ex.1和已知的免疫刺激剂刺激后CD172a+细胞中的IL-8产生。
图49比较了在用对照或IC-Ex.1处理后，感染猪繁殖与呼吸病毒的巨噬细胞的百分比。
发明详述
根据本发明，已发现了能够引发受体对象中的免疫应答的组合物，以及使用方法。具体而言，本发明涉及核酸组合物或免疫调节剂组合物及其用途。已发现，此类免疫调节剂组合物可以用于调节猪科动物物种成员的免疫系统。本发明可特别用于治疗和预防由微生物引起的感染性疾病，所述微生物诸如，但不限于，病毒、细菌、霉菌、真菌、酵母、寄生虫和本领域中已知的其他微生物。下面更详细讨论了所述免疫调节剂组合物的组成及使用方法。
I. 组合物
可用于本发明中的组合物，例如本文所述的那些，一般能够用作针对感染性疾病的预防性疗法、整体预防性疗法或治疗疗法。此类组合物在本文中被称为免疫调节剂组合物。所述免疫调节剂组合物包括至少一种能够诱导受体对象中的免疫应答的免疫刺激性质粒或免疫刺激性DNA序列。在一些方面，免疫应答是先天性免疫应答。在一些方面，免疫应答是先天性免疫应答和获得性免疫应答的组合。在一些方面，所述免疫调节剂组合物也可以包括脂质体递送媒介物。
A. 核酸
在一些方面，本发明涉及可用于治疗或预防感染性疾病致病剂的核酸分子。本文所述的核酸分子可以作为线性双链或单链DNA、氨基酸序列、核糖核酸（RNA）或其组合包括在免疫刺激性质粒中。在一些方面，本发明涉及含有免疫刺激性质粒或免疫刺激性DNA序列的核酸分子、载体和宿主细胞（体外、体内或离体）。
本文所述的核酸分子高度富集CpG基序。在一些方面，核酸分子含有超过脊椎动物核酸序列中发现的CpG基序的频率多于20%的CpG基序。这种CpG基序包括免疫刺激性和非刺激性CpG基序。
在一些方面，本发明涉及不包含抗生素抗性基因的免疫刺激性质粒或DNA序列。所述质粒可以缺乏任何可选择或可筛选的标记基因。例如，本文所述的pGCMB75.6质粒不包含任何全长或功能性可选择或可筛选的标记基因。pGCMB75.6的序列提供于SEQ ID NO: 1中。
在一些方面，本文所述的免疫刺激性质粒优选不包含编码全长或功能性可选择或可筛选的标记物的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒不包含抗生素抗性基因。例如，所述质粒不包含卡那霉素抗性基因。在一些方面，本文所述的质粒优选不编码免疫原。
在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以包含编码不是抗生素抗性基因的可选择或可筛选的标记基因的核酸序列。例如，本文所述的pLacZMB75.6质粒包含LacZ基因作为可筛选的标记物。pLacZMB75.6的图谱提供于图3中，并且pLacZMB75.6的核苷酸序列提供为SEQID NO: 4。如图3中所示，pLacZMB75.6类似于pGCMB75.6，但含有LacZ可筛选的标记物。
应当理解的是，可以在不显著不利影响其免疫刺激性特性的特定程度上改变pGCMB75.6或pLacZMB75.6质粒的核苷酸序列。在一些方面，本发明涉及包含与pGCMB75.6（SEQ ID NO: 1）的序列具有至少89%序列同一性的核酸序列的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选包含与pGCMB75.6（SEQ ID NO: 1）的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选包含pGCMB75.6（SEQ ID NO: 1）的序列。
在一些方面，本发明涉及包含与pLacZMB75.6（SEQ ID NO: 4）的序列具有至少84%序列同一性的核酸序列的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选包含与pLacZMB75.6（SEQ ID NO: 4）的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选包含pLacZMB75.6（SEQ IDNO: 4）的序列。
在一些方面，本发明涉及包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少80%序列同一性的核酸序列的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选包含SEQ ID NO：2的序列。
在一些方面，本发明涉及包含与SEQ ID NO：3的序列具有至少80%序列同一性的核酸序列的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选包含与SEQ ID NO：3的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选包含SEQ ID NO：3的序列。
在一些方面，本发明涉及由与pGCMB75.6（SEQ ID NO: 1）的序列具有至少89%序列同一性的核酸序列组成的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选由与pGCMB75.6（SEQID NO: 1）的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选由pGCMB75.6（SEQ ID NO: 1）的序列组成。
在一些方面，本发明涉及由与pLacZMB75.6（SEQ ID NO: 4）的序列具有至少84%序列同一性的核酸序列组成的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选由与pLacZMB75.6（SEQ ID NO: 4）的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选由pLacZMB75.6（SEQ IDNO: 4）的序列组成。
在一些方面，本发明涉及由与SEQ ID NO：2的序列具有至少80%序列同一性的核酸序列组成的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选由与SEQ ID NO：2的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选由SEQ ID NO：2的序列组成。
在一些方面，本发明涉及由与SEQ ID NO：3的序列具有至少80%序列同一性的核酸序列组成的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选由与SEQ ID NO：3的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选由SEQ ID NO：3的序列组成。
本发明的另一个重要方面提供了能够刺激免疫应答的免疫刺激性DNA序列或免疫刺激性质粒，其包括在高严格条件下与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO: 4杂交的核酸序列。合适的核酸序列包括与本发明的核酸同源、基本上类似或相同的那些。在一些方面，同源的核酸序列将与SEQ ID NO: 1或相应的互补序列具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80% 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性。在其他方面，同源的核酸序列将与SEQ ID NO:4或相应的互补序列具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80% 81%、82%、83%、84%、85%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性。在其他方面，同源的核酸序列将与SEQ ID NO: 2或相应的互补序列具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80% 81%、82%、83%、84%、85%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性。在其他方面，同源的核酸序列将与SEQ ID NO: 3或相应的互补序列具有至少约75%、76%、77%、78%、79%、80% 81%、82%、83%、84%、85%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性。可以使用本领域中已知的许多算法，例如Altschul，S. F.，等人，J. Mol. Biol. 215:403-10，1990中描述的BLAST，以计算序列相似性。所述核酸可以由于遗传密码的简并性而与上述核酸在序列上不同。通常，参考序列将为18个核苷酸，更通常为30或更多个核苷酸，并且可以包含组合物的整个核酸序列用于比较目的。
本文设想了可以与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO: 4杂交的核苷酸序列。严格杂交条件包括条件例如在50℃或更高以及0.1X SSC（15 mM氯化钠/1.5 mM柠檬酸钠）下的杂交。另一个实例是在42℃在50%甲酰胺、5X SSC（150 mM NaCl，15mM柠檬酸三钠）、50 mM磷酸钠（pH 7.6）、5X Denhardt氏溶液、10%硫酸葡聚糖和20 µg/ml变性、剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，随后在0.1X SSC中在约65℃下洗涤。示例性严格杂交条件是严格性为上述特定条件的至少约80%、85%、90%或95%的杂交条件。其他严格杂交条件是本领域中已知的，并且也可以用于鉴定本发明的核酸的同源物（Current Protocolsin Molecular Biology，Unit 6，pub. John Wiley & Sons，N.Y. 1989）。
可以使用本文所述的DNA分子的突变体核苷酸，只要突变体包含维持刺激如本文所述的先天性免疫应答的能力的核酸序列。此类突变的DNA序列通常相差一个或多个核苷酸。序列变化可以是置换、插入、缺失或其组合。用于诱变克隆的基因的技术是本领域中已知的。用于位点特异性诱变的方法可见于Gustin等人，Biotechniques 14:22，1993；Barany，Gene 37:111-23，1985；Colicelli等人，Mol. Gen. Genet. 199:537-9，1985；和Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，CSH Press 1989，第15.3-15.108页，并且所有都引入本文作为参考。总之，本发明涉及能够刺激对象中的先天性免疫应答的核酸序列及其变体或突变体。本发明也涵盖了由所述核酸序列编码的中间RNA，以及由本文所述的核酸编码的任何所得氨基酸序列。
在一些方面，免疫刺激性质粒的核苷酸序列与SEQ ID NO 1、2、3和4中提供的序列不同时，所述质粒中的CpG二核苷酸优选保持完整。可替代地，如果改变质粒的核苷酸序列、使得CpG二核苷酸被消除，则可以在另一位置改变质粒的序列，使得质粒中的CpG二核苷酸的总数保持相同。除了pGCMB75.6或pLacZMB75.6的核苷酸序列中已存在的那些以外，另外的CpG二核苷酸也可以被引入质粒中。因此，例如，本文所述的免疫刺激性质粒优选包含至少约200、至少约220、至少约240、至少约260、至少约270、至少约275、至少约280、至少约283、至少约285或至少约288个CpG二核苷酸。例如，所述免疫刺激性质粒可以包含283个CpG二核苷酸。
在一些方面，当免疫刺激性质粒的核苷酸序列与本文提供的序列不同时，质粒中的CpG基序类型被改变以调节胞质DNA监视分子的所得激活。例如，可以增加免疫刺激性CpG基序的数目，以增加响应于免疫刺激性质粒/DNA的特定阈值的特异性胞质DNA监视分子的激活。作为进一步的实例，非免疫刺激性CpG基序的数目可以增加，以减少特异性胞质DNA监视分子的激活和/或增加其他DNA监视分子的激活。
具体而言，本发明涉及包含本文所述的免疫刺激性质粒或DNA序列中的任一种以及药学上可接受的载体的药物制剂。
B. 免疫调节剂
用于随本文所述的免疫刺激性质粒使用的合适的免疫调节剂组合物描述于美国专利申请公开号2012/0064151 A1和2013/0295167 A1，其两者的内容整体引入本文作为参考。
所述免疫调节剂组合物包含脂质体递送媒介物以及本文所述的免疫刺激性质粒或DNA序列中的至少一种。
合适的脂质体递送媒介物包含能够将核酸分子递送至被治疗对象的组织的脂质组合物。脂质体递送媒介物优选能够在对象中保持足够长时间的稳定以递送核酸分子和/或生物制剂。例如，所述脂质体递送媒介物在受体对象中稳定至少约五分钟、至少约1小时或至少约24小时。
本发明的脂质体递送媒介物包含能够与细胞的质膜融合以便将核酸分子递送入细胞的脂质组合物。当核酸分子编码一种或多种蛋白时，核酸∶脂质体复合物优选具有至少约1皮克（pg）表达的蛋白/毫克（mg）总组织蛋白/微克（μg）递送的核酸的转染效率。例如，核酸∶脂质体复合物的转染效率可以是至少约10 pg表达的蛋白/mg总组织蛋白/μg递送的核酸；或者至少约50 pg表达的蛋白/mg总组织蛋白/μg递送的核酸。复合物的转染效率可以低至1毫微微克（fg）表达的蛋白/mg总组织蛋白/μg递送的核酸，上述量是更优选的。
本发明优选的脂质体递送媒介物直径为约100至500纳米（nm）。例如，所述脂质体递送媒介物的直径可以为约150至450 nm或者约200至400 nm。
合适的脂质体包括任何脂质体，例如常用于，例如，本领域技术人员已知的基因递送方法中的脂质体。优选的脂质体递送媒介物包含多层囊泡（multilamellar vesicle，MLV）脂质和挤出脂质。用于制备MLV的方法是本领域众所周知的。更优选的脂质体递送媒介物包含具有聚阳离子脂质组合物的脂质体（即阳离子脂质体）和/或具有与聚乙二醇缀合的胆固醇主链的脂质体。示例性阳离子脂质体组合物包含但不限于N-[1-（2,3-二油基氧基）丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵（DOTMA）和胆固醇、N-[1-（2,3-二油酰基氧基）丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵（DOTAP）和胆固醇、1-[2-（油酰基氧基）乙基]-2-油基-3-（2-羟乙基）咪唑啉鎓氯化物（DOTIM）和胆固醇、二甲基双十八烷基溴化铵（DDAB）和胆固醇以及其组合。用作递送媒介物的最优选的脂质体组合物包含DOTIM和胆固醇。
合适的核酸分子包括本文所述的任何免疫刺激性质粒。编码核酸序列编码蛋白或肽的至少一部分，而非编码序列不编码蛋白或肽的任何部分。根据本发明，“非编码”核酸可以包含转录单元的调节区，例如启动子区。术语“空载体”可以与术语“非编码”互换使用，并且具体是指不存在蛋白编码部分的核酸序列，例如没有基因插入物的质粒载体。由本文所述的质粒编码的蛋白的表达不是诱导免疫应答所必需的；因此所述质粒不需要含有可操作连接至转录控制序列的任何编码序列。然而，可以通过在组合物中包含编码免疫原和/或细胞因子的核酸序列（DNA或RNA）而获得另外的优点（即抗原特异的和增强的免疫力）。此类编码免疫原和/或细胞因子的核酸序列可以包含于本文所述的免疫刺激性质粒中，或者可以包含于所述组合物中的单独的核酸（例如，单独的质粒）中。
可以使用本领域标准的方法或美国专利号6,693,086（其内容以其整体引入本文作为参考）描述的方法实现脂质体与本文所述的免疫刺激性质粒或免疫刺激性DNA序列的复合。添加至脂质体的质粒的合适浓度包括将足够量的质粒有效地递送至对象内、使得引发全身性免疫应答的浓度。例如，约0.1 μg至约10 μg质粒可以与约8 nmol脂质体组合，约0.5 μg至约5 μg质粒可以与约8 nmol脂质体组合，或者约1.0 μg质粒可以与约8 nmol脂质体组合。组合物中的质粒与脂质的比率（ μg质粒: nmol脂质）可以为以重量计至少约1:1质粒:脂质（例如，1 μg质粒: 1 nmol脂质）。例如，质粒与脂质的比例可以为至少约1:5，至少约1:10，或至少约1:20。本文表述的比率基于组合物中阳离子脂质的量，而不是基于组合物中脂质的总量。本发明的组合物中核酸与脂质的比率合适地为以重量计约1:1至约1:80质粒:脂质；以重量计约1:2至约1:40质粒:脂质；以重量计约1:3至约1:30质粒:脂质；或者以重量计约1:6至约1:15质粒:脂质。
C. 生物制剂
除了本文所述的脂质体递送媒介物和至少一种质粒以外，本文所述的任何免疫调节剂组合物还可以包含至少一种生物制剂。
合适的生物制剂是有效预防或治疗疾病的制剂。此类生物制剂包括免疫增强剂蛋白、免疫原、疫苗、抗微生物剂或其任何组合。合适的免疫增强剂蛋白是已知增强免疫的那些蛋白。作为非限制性实例，细胞因子（其包括一个蛋白家族），是已知增强免疫力的蛋白家族。合适的免疫原是引发体液和/或细胞免疫应答的蛋白，使得向对象施用免疫原获得针对在对象的组织内遇到的相同或类似蛋白的免疫原特异性免疫应答。免疫原可以包括由细菌、病毒、寄生虫或真菌表达的致病性抗原。优选的抗原包括源自在对象中引起感染性疾病的生物体的抗原。根据本发明，免疫原可以是天然存在或合成来源的蛋白的任何部分，其引发体液和/或细胞免疫应答。因此，抗原或免疫原的大小可以是小至约5-12个氨基酸，并且大至全长蛋白，包括这两者之间的任何大小。所述抗原可以是多聚体蛋白或融合蛋白。所述抗原可以是纯化的抗原。可替代地，所述免疫增强剂蛋白或免疫原可以由所述免疫调节剂组合物中所包含的免疫刺激性质粒或另一种核酸编码。当免疫增强剂蛋白或免疫原由免疫调节剂组合物中的核酸分子编码时，编码免疫增强剂蛋白或免疫原的核酸序列可操作连接至转录控制序列，使得在对象的组织中表达免疫原，由此在对象中引发除非特异性免疫应答之外的免疫原特异性免疫应答。筛选免疫原性例如病原体抗原免疫原性或细胞因子活性的技术是本领域技术人员已知的，并且包括各种体外和体内测定。
当生物制剂是疫苗时，所述疫苗可以包括活的感染性的病毒的、细菌的或寄生虫疫苗或者杀死的灭活的病毒的、细菌的或寄生虫疫苗。一种或多种疫苗（活的或杀死的病毒疫苗）可以与本发明的免疫调节剂组合物组合使用。合适的疫苗包括本领域中已知的用于猪科动物物种的那些。
所述生物制剂可以是抗微生物剂。合适的抗微生物剂包括：喹诺酮类，优选氟喹诺酮类、β内酰胺类和大环内酯-林可酰胺类-链阳性菌素（MLS）抗生素。
合适的喹诺酮类包括培诺沙星、宾氟沙星、西诺沙星、环丙沙星、克林沙星、达氟沙星、二氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、氟罗沙星、吉米沙星、依巴沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、麻保沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、奥比沙星、帕珠沙星、普多沙星、培氟沙星、沙拉沙星、司巴沙星、替马沙星和托氟沙星。优选的氟喹诺酮类包括环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、莫西沙星和普多沙星。合适的萘啶酮类包括萘啶酮酸。
合适的β内酰胺类包括青霉素（例如，阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、苄星青霉素、苄青霉素、羧苄青霉素、氯唑西林、可拉维酸[即阿莫西林/克拉维酸]、双氯西林、氟氯西林、甲氧西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、苯氧甲基青霉素、哌拉西林、普鲁卡因青霉素、替莫西林和替卡西林）；头孢菌素类（例如，头孢克洛、头孢洛宁、头孢孟多、头孢匹林、头孢唑林、头孢吡肟、头孢克肟、头孢噻肟、头孢西丁、头孢匹罗、头孢泊肟、头孢喹肟、头孢他啶、头孢噻呋、头孢曲松、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢噻吩和头孢替坦）；碳青霉烯类和青霉烯类（例如，多利培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南和美罗培南）；单环β内酰胺类（例如，氨曲南、诺卡霉素A、烟草毒素-β-内酰胺和替吉莫南）；和β内酰胺酶抑制剂（例如，克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦）。优选的β-内酰胺类包括头孢菌素类，特别是头孢唑啉。
合适的MLS抗生素包括克林霉素、林可霉素、吡利霉素和任何大环内酯抗生素。优选的林可酰胺抗生素是吡利霉素。
其他抗微生物剂包括氨基糖苷类、氯羟吡啶、迪美唑类、红霉素、弗氏菌丝素、呋喃唑酮、卤夫酮、2-吡啶酮、氯苯胍、磺胺类、四环素类、甲氧苄啶、各种截短侧耳素（例如，泰妙菌素和沃尼妙林）和各种链霉素（例如，莫能菌素、甲基盐霉素和盐霉素）。
II. 方法
本发明的目标是提供刺激免疫且提供对未感染的对象的保护性免疫、对感染的对象的保护性免疫、对未感染的对象的增强免疫力、对感染的对象的增强免疫力、对感染的对象的治疗性免疫力或其组合的免疫调节剂组合物、免疫刺激性质粒（或DNA序列）和方法。因此，本发明的组合物可以用于预防性保护对象或用于治疗对象。本文所述的方法包括向对象施用本文所述的免疫刺激性质粒或DNA序列，且刺激对象中的免疫系统。
A. 刺激对象的免疫系统的方法
本发明涉及在受体对象中刺激或增强免疫系统的方法。该方法包括向对象施用有效量的本文所述的免疫调节剂组合物。在一些方面，免疫调节剂组合物刺激受体对象中的免疫应答，并且免疫应答帮助抵抗感染。在一些方面，免疫调节剂组合物激活胞质DNA监视分子。在一些方面，当在此类疫苗之前施用、与疫苗共施用、疫苗接种后施用或与疫苗混合时，所述免疫调节剂组合物增强至少一种生物制剂（例如疫苗）的作用。在一些方面，所述方法提供了用于保护受体对象免于感染性疾病并且治疗患有感染性疾病的群体的新的治疗策略。在一些方面，当免疫调节剂与疫苗组合使用时，相比使用没有所述免疫调节剂组合物的疫苗，所述方法提供了针对疾病的更快速、更长并且更好的保护。
可以通过施用有效量的免疫调节剂组合物而在受体对象中激活免疫应答，所述免疫调节剂组合物包含本文所述的任何脂质体递送媒介物、本文所述的任何免疫刺激性质粒（或DNA序列）和任选地与本文所述的任何生物制剂组合。如本文使用的，“与……组合”应理解为意指生物制剂可以与免疫调节剂混合或共施用，或者其独立施用。这种独立施用可以在施用免疫调节剂之前或之后。还设想了组合施用可以包括免疫调节剂的多于一次施用或可以使用生物制剂。此外，多于一种生物制剂可以与免疫调节剂共施用、在免疫调节剂之前施用、在免疫调节剂施用之后施用或者与免疫调节剂同时施用。
B. 改善对象的存活力的方法
本发明涉及改善猪科动物物种成员的存活力的方法。改善存活力的方法包括向对象施用有效量的本文所述的免疫调节剂组合物。在一些方面，与未接受免疫调节剂组合物的对象相比，所述方法提供了受体对象的改善的存活力。
C. 改善生产的方法
本发明涉及改善猪科动物物种成员的生产的方法。改善生产的方法包括向对象施用有效量的本文所述的免疫调节剂组合物。在一些方面，与未接受免疫调节剂组合物的对象相比，所述方法提供了受体对象的改善的生产。评价改善的生产的方法是本领域已知的。技术人员将认识到，比较接受免疫调节剂组合物的对象与未接受免疫调节剂组合物的那些对象之间的健康、重量、大小、肉质和其他参数，可以测量改善的生产。
可以向对象施用有效量的本文所述的任何免疫调节剂组合物。所述有效量足以激活受体对象中的免疫应答。测量这种激活的方法是本领域中已知的。此外，技术人员将认识到，有效量将取决于对象的年龄、重量、物种和感染的阶段以及本领域中已知的其他因素。合适的有效量的范围可以为每个对象约0.1 μg至1,000 μg。在一些方面，所述有效量的范围可以为约0.1 μg至约10 μg、约0.1 μg至约5 μg、约0.5 μg至约5 μg、约0.25 μg至约5 μg、约0.05 μg至约10 μg、约5 μg至约15 μg、约10 μg至约15 μg、约10 μg至约20 μg、约20 μg至约30 μg、约30 μg至约40 μg、约40 μg 至约50 μg、约50 μg至约70 μg、约70 μg至约90μg、约50 μg至约100 μg、约100 μg至约150 μg、约150 μg至约200 μg、约200 μg至约250 μg、约250 μg至约300 μg、约300 μg至约350 μg、约350 μg至约400 μg、约400 μg至约450 μg、约450 μg至约500 μg、约500 μg至约550 μg、约550 μg至约600 μg、约600 μg至约650 μg、约650 μg至约700 μg、约700 μg至约750 μg、约750 μg至约800 μg、约800 μg至约850 μg、约850 μg至约900 μg、约900 μg至约950 μg、约950 μg至约1000 μg。优选地，在一些方面，所述有效量范围为约0.5 μg至约10 μg。又优选地，在其他方面，所述有效量范围为约50μg至约100 μg。并且优选地，在其他方面，所述有效量范围为约40 μg至约70 μg。
D. 使用条件
本发明的方法在对象中激活免疫应答，使得对象被保护免于易受引发免疫应答治疗的疾病。如本文使用的，短语“保护免于疾病”是指减轻疾病的症状；减少疾病的发生；减轻疾病的临床或病理严重性；或者减少引起疾病的病原体的脱落。保护对象可以是指本发明的治疗组合物当向对象施用时预防疾病发生、治疗和/或减缓或减轻疾病症状、临床体征、病理学或病因的能力。因此，保护对象免于疾病包括预防疾病发生（预防性治疗）和治疗患有疾病的对象（治疗性治疗）。术语“疾病”是指对象的正常健康的任何偏离，并且包括当存在疾病症状时的状态以及其中已发生偏离（例如感染、基因突变、遗传缺陷等）、但症状尚未显现的状况。
本发明的方法可以用于预防疾病、刺激针对疾病的效应细胞免疫、消除疾病、减缓疾病和预防由原发性疾病的发生导致的继发性疾病。
在一些方面，相比于仅仅施用疫苗，当与疫苗共同施用时，本文所述的方法可以用于改善对象的先天性免疫应答。在一些方面，相比于仅仅施用疫苗，当与疫苗共同施用时，本文所述的方法可以用于改善对象的获得性免疫应答。由于需要时间来刺激获得性免疫，因此通常疫苗施用一次不立即保护对象。术语“改善”在本发明中是指在对象中引发先天性免疫应答，直到疫苗开始保护对象和/或通过由疫苗给予的获得性免疫来延长保护期间。
在一些方面，本发明的方法包括施用组合物来针对广泛种类病原体的感染进行保护。施用的组合物可以包含或可以不包含引发特异性应答的特异性抗原。设想了本发明的方法将保护受体对象免于由感染性微生物病原体导致的疾病，所述感染性微生物病原体包括而不限于病毒、细菌、真菌和寄生虫。在一些方面，本发明的方法包括施用所述组合物以减轻或减少由于感染病原体的感染症状或严重程度。技术人员将认识和理解，本文所述的免疫调节剂组合物针对许多感染病原体（其太多而无法列举）是有效的。本文提供的感染病原体是出于示例性目的而提供，并且不限制使用范围而提供。
本文所述的免疫调节剂组合物对于其可以有用的代表性状况包括由感染病原体（infectious agent）引起的对象中的那些。这些状况可以包括但不限于：放线杆菌病、非洲猪瘟、炭疽、萎缩性鼻炎、奥耶斯基氏病、肉毒杆菌中毒、布鲁氏菌病、bullnose、古典猪瘟、梭菌性肠毒血症、大肠杆菌病、乳猪中的触染性脓皮病、脑心肌炎、肠道病毒感染、渗出性表皮炎、口蹄疫、腐蹄病、格拉泽氏病、多脂性猪疾病、猪霍乱、包涵体鼻炎、肠腺瘤病、关节病、钩端螺旋体病、李斯特菌病（败血症/内脏）、肝损伤、乳房炎-子宫炎-无乳综合症、恶性浮肿、支原体肺炎、支原体多发性关节炎、支原体多发性浆膜炎、猪耳坏死综合征、坏死性鼻炎、坏死性口炎、水肿病、骨髓炎、外耳炎、细小病毒感染、巴斯德氏菌病、玫瑰糠疹、胸膜肺炎、多发性关节炎、猪流行性腹泻、猪繁殖与呼吸综合征（PPRS）、增殖性出血性肠病、假结核病、肾盂肾炎、狂犬病、癣、轮状病毒感染、沙门氏菌病、链球菌性脑膜炎、链球菌性脑膜炎和关节炎、猪痢疾、猪丹毒、猪瘟、猪流感、猪痘、猪水疱病、猪泰法病（talfan）、猪捷申病（teschen）、破伤风、传染性胃肠炎、水泡病、猪水疱疹、水疱性口炎、呕吐和消耗性疾病、白斑肾以及本领域已知的其他状况。
本文所述的免疫调节剂组合物可以用于治疗或预防其的示例性感染病原体包括被对象先天性免疫应答影响的那些感染病原体。这样的感染病原体可以包括但不限于：放线杆菌属物种（Actinobacillus sp.）、胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）、猪放线杆菌（Actinobacillus suis）、化脓放线菌（Actinomyces pyogenes）、甲型疱疹病毒亚科（Alphaherpersvirinae）、口蹄疫病毒属（Aphthovirus）、炭疽杆菌（Bacillus anthracis）、β疱疹病毒亚科（Betaherpesvirinae）、支气管炎博德特氏菌（Bordetella bronchiseptica）、流产布鲁氏菌（Brucella abortus）、猪布鲁氏菌（Brucella suis）、杯状病毒属（Calicivirus）、弯曲杆菌属物种（Campylobacter sp.）、猪肠弯曲杆菌（Campylobacter hyointestinalis）、鼻粘膜弯曲杆菌（Campylobacter mucosalis）、心病毒属（Cardiovirus）、产气荚膜梭菌（Clostridial perfringens）、肉毒梭菌（Clostridium botulinum）、败血梭菌（Clostridium septicum）、破伤风梭菌（Clostridium tetani）、冠状病毒属（Coronavirus）、巨细胞病毒属（Cytomegalovirus）、肠道病毒属（Enterovirus）、猪红斑丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、大肠杆菌、猪真细菌（Eubacterium suis）、猪红斑丹毒丝菌、黄病毒科（Flaviviridae）、坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum）、血凝性脑脊髓炎病毒、副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）、问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans）、莱利斯塔德病毒（Lelystad virus）、单核细胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、狂犬病病毒属（Lyssavirus）、小孢子菌（Microsporum nanum）、支原体属物种（Mycoplasma sp.）、猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）、猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）、猪滑液支原体（Mycoplasma hyosynoviae）、多杀性巴斯德菌（Pasteurella multocida）、瘟病毒属（Pestivirus）、细小RNA病毒科（Picornaviridae）、猪动脉病毒、猪圆环病毒（PCV）、猪肠道病毒、猪流行性腹泻病毒（PEDv）、猪疱疹病毒1型、猪疱疹病毒2型、猪细小病毒、瘟病毒属、弹状病毒科（Rhabdoviridae）、轮状病毒属（Rotavirus）、沙门氏菌属物种（Salmonella sp.）、猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis）、猪痢疾密螺旋体（Serpulina hyodysenteriae）、螺旋体（Spirochaetes）、葡萄球菌属（Staphylococci）、猪葡萄球菌（Staphylococcus hyicus）、链球菌属（Streptococci）、猪链球菌（Streptococcus suis）、猪痘病毒属（Suipoxvirus）、猪流感病毒（Swine influenzavirus）、披膜病毒科病毒（Togaviridae）、未分类的DNA病毒、水疱病毒属（Vesiculovirus）、假结核病耶尔森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）、以及本领域已知的其他。
本文所述的免疫调节剂组合物可以特别用于治疗或预防由感染病原体引起的肠道状况。这种状况包括影响对象的消化道/肠道系统的肠道状况。这些肠道状况包括但不限于非洲猪瘟、古典猪瘟、梭菌性肠毒血症、大肠杆菌病、口蹄疫、猪霍乱、肠腺瘤病、坏死性口炎、水肿病、猪流行性腹泻、增殖性出血性肠病、轮状病毒感染、沙门氏菌病、猪痢疾、猪水疱病、传染性胃肠炎、猪水疱疹、水泡性口炎和本领域已知的其他状况。
本文所述的免疫调节剂组合物对于其可以有用的示例性感染病原体包括被对象先天性免疫应答影响的那些感染病原体。这样的感染病原体可以包括但不限于：放线杆菌属物种、胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌、化脓放线菌、非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）、甲型冠状病毒（Alphacoronavirus）、甲型疱疹病毒亚科、口蹄疫病毒属、非洲猪瘟病毒属（Asfivirus）、动脉病毒属（Arterivirus）、炭疽杆菌、乙型冠状病毒（Betacoronavirus）、β疱疹病毒亚科、支气管炎博德特氏菌、猪痢疾密螺旋体（Brachyspira hyodysenteriae）、流产布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、杯状病毒属、弯曲杆菌属物种、猪肠弯曲杆菌、鼻粘膜弯曲杆菌、心病毒属、圆环病毒属（Circovirus）、古典猪瘟病毒（Classical swine fever virus）、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、败血梭菌、破伤风梭菌、冠状病毒属、巨细胞病毒属、肠心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus）、肠道病毒属、猪红斑丹毒丝菌、大肠杆菌、猪真细菌、猪红斑丹毒丝菌、大肠杆菌、黄病毒科、坏死梭杆菌、血凝性脑脊髓炎病毒、副猪嗜血杆菌、细胞内劳森菌（Lawsonia intracellularis）、问号钩端螺旋体血清型、莱利斯塔德病毒、单核细胞增多性李斯特氏菌、狂犬病病毒属、小孢子菌、支原体属物种、猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体、多杀性巴斯德菌、瘟病毒属、细小RNA病毒科、猪动脉病毒、猪肠道病毒、猪流行性腹泻病毒、猪疱疹病毒1型、猪疱疹病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）、猪萨佩罗病毒（Porcine sapelovirus）、猪捷申病毒（Porcine teschovirus）、瘟病毒属、狂犬病病毒、弹状病毒科、轮状病毒属、沙门氏菌属物种、猪霍乱沙门氏菌、猪痢疾密螺旋体、螺旋体、葡萄球菌属、猪葡萄球菌、链球菌属、猪链球菌、猪痘病毒属、猪流感病毒、披膜病毒科病毒、未分类的DNA病毒、水疱病毒属、假结核病耶尔森氏菌、以及本领域已知的其他。
本文所述的免疫调节剂组合物可以特别用于治疗或预防由感染病原体引起的状况或癌症。这些状况包括但不限于：放线杆菌病、非洲猪瘟、炭疽、萎缩性鼻炎、奥耶斯基氏病、肉毒杆菌中毒、布鲁氏菌病、bullnose、古典猪瘟、梭菌性肠毒血症、大肠杆菌病、先天性CNS体征、乳猪中的触染性脓皮病、脑心肌炎、肠道病毒感染、渗出性表皮炎、口蹄疫、腐蹄病、格拉泽氏病、多脂性猪疾病、猪霍乱、包涵体鼻炎、肠腺瘤病、关节病、钩端螺旋体病、李斯特菌病（败血症/内脏）、肝脏病变、乳房炎-子宫炎-无乳综合症、恶性浮肿、支原体肺炎、支原体多发性关节炎、支原体多发性浆膜炎、猪耳坏死综合征、坏死性鼻炎、坏死性口炎、水肿病、骨髓炎、外耳炎、细小病毒感染、巴斯德氏菌病、玫瑰糠疹、胸膜肺炎、多发性关节炎、猪流行性腹泻、猪繁殖与呼吸综合征（PPRS）、增殖性出血性肠病、假结核病、肾盂肾炎、狂犬病、癣、轮状病毒感染、沙门氏菌病、链球菌性脑膜炎、链球菌性脑膜炎和关节炎、猪痢疾、猪丹毒、猪瘟、猪流感、猪痘、猪水疱病、猪泰法病、猪捷申病、破伤风、传染性胃肠炎、水泡病、猪水疱疹、水疱性口炎、呕吐和消耗性疾病、白斑肾以及本领域已知的其他。
E. 施用
多种施用途径是可用的。选择的具体模式当然将取决于选择的具体生物制剂、对象的年龄和总体健康状态、所治疗的具体状况和治疗效力所需的剂量。本发明的方法可以使用任何施用模式来实施，其产生有效水平的免疫应答激活而不引起临床上不可接受的副作用。所述组合物可以方便地以单位剂型提供，并且可以通过本领域众所周知的任何方法制备。
所述免疫调节剂组合物可以静脉内、肌内、皮内、腹膜内、乳房内、经皮、直肠内、经粘膜、皮下、通过喷雾、口服、眼内、气管内、鼻内、局部、眼部或通过本领域中已知的其他方法来施用。在一个方面，皮下施用所述免疫调节剂。在另一个方面，可以肌内施用所述免疫调节剂。在另一个方面，作为喷雾施用所述免疫调节剂。在另一个方面，可以口服施用所述免疫调节剂。在另一个方面，可以皮下施用所述免疫调节剂。
在一个方面，可以在攻击（或感染）之前向对象单独施用所述免疫调节剂。在另一个方面，可以在攻击（或感染）之后向对象单独施用所述免疫调节剂。在另一个方面，可以在攻击（或感染）的同时向对象单独施用所述免疫调节剂。
在一些方面，可以在攻击之前，在疫苗接种的同时共同施用所述免疫调节剂组合物。在一些方面，可以在攻击（或感染）的同时，在疫苗接种的同时共同施用所述免疫调节剂组合物。在一些方面，共同施用可以包括在对象上的相同惯用位置中在彼此相邻的两个不同部位（即在对象的颈部上彼此相邻地注射）、在对象的相同惯用位置的相对侧上（即颈部每一侧上一次）、或在相同对象的不同位置上施用疫苗和免疫调节剂。在一些方面，可以在疫苗接种和攻击之前施用所述免疫调节剂组合物。在一些方面，可以在疫苗接种之后、但在攻击之前施用所述免疫调节剂组合物。可以在攻击之后向已在攻击（或感染）之前疫苗接种的对象施用所述免疫调节剂组合物。
技术人员将认识到，施用途径可以根据对象和对象的健康或状态而变化。出于示例性目的提供了施用途径，并且不加限制。
疫苗接种可以在任何年龄执行。可以皮下、通过喷雾、口服、肌内、乳房内、皮内、经皮、直肠内、粘膜、眼内、气管内、鼻内、局部、眼部或通过本领域已知的其他方法来施用疫苗。口服疫苗可以在饲料或水中施用。另外，设想了可以基于常规疫苗接种方案来使用本发明的方法。
也可以皮下、通过喷雾、口服、肌内、乳房内、皮内、经皮、直肠内、粘膜、眼内、气管内、鼻内、局部、眼部或通过本领域已知的其他方法来施用免疫调节剂组合物。例如，可以肌内施用免疫调节剂组合物。可替代地，可以皮下施用免疫调节剂组合物。
可以在攻击之前约1至约14天或者在攻击之后约1至约14天向对象施用所述免疫调节剂。例如，可以在攻击之前约1至约7天或者在攻击之后约1至约7天施用所述免疫调节剂。在攻击之前1、2、3、4、5、6、7天或攻击之后1、2、3、4、5、6、7天合适地施用所述免疫调节剂。
其他递送系统可以包括定时释放、延迟释放或持续释放的递送系统。此类系统可以避免组合物的反复施用，从而提高便利性。许多类型的释放递送系统是可用的，并且为本领域普通技术人员所知。它们包括基于聚合物的系统例如聚（丙交酯-乙交酯）、共聚草酸酯、聚己酸内酯、聚酰胺酯、聚正酯、聚羟基丁酸和聚酐。含有药物的上述聚合物的微胶囊在例如美国专利号5,075,109中描述。
递送系统也包括非聚合物系统，其为脂质，包括甾醇例如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪例如单、双和三甘油酯；水凝胶释放系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；蜡质包衣；使用常规结合剂和赋形剂的压制片剂；部分融合的植入物等。具体实例包括但不限于侵蚀系统（本发明的制剂以基质内形式包含其中，例如描述于美国专利号4,452,775、4,675,189和5,736,152中的那些）和扩散系统（其中活性成分以受控速率从聚合物渗出，例如描述于美国专利号3,854,480、5,133,974和5,407,686）。此外，可以使用基于泵的硬件递送系统，其中一些适于植入。
因为在不背离本发明范围的情况下可以对上述组合物、产品和方法进行多种变化，所以预期上文描述和下文给出的实施例中包含的所有内容均应被解释为说明性而非限制性的涵义。
定义
术语“有效量”是指必需或足以实现期望的生物效应的量。例如，用于治疗或预防感染性疾病的免疫调节剂的有效量是暴露于微生物后引起免疫应答的发生所必需的量，因而引起对象内微生物量的降低并且优选微生物的根除。对于任何具体应用的有效量可以根据这种因素例如所治疗的疾病或状况、对象的大小或疾病或状况的严重性而变化。本领域普通技术人员无需过度实验，通过经验就可以确定免疫调节剂的有效量。
术语“细胞因子”是指增强免疫的蛋白家族。细胞因子家族包括造血生长因子、白介素、干扰素、免疫球蛋白超家族分子、肿瘤坏死因子（TNF）家族分子和趋化因子（即调节细胞、特别是吞噬细胞的迁移和活化的蛋白）。示例性细胞因子包括而不限于白介素-2（IL-2）、白介素-12（IL12）、白介素-15（IL-15）、白介素-18（IL-18）、干扰素-α（IFNα）和干扰素-γ（IFNγ）。
术语“引发”可以与术语活化、刺激、产生或上调互换使用。
术语在对象中“引发免疫应答”是指特异性控制或影响免疫应答的活性，并且可以包括活化免疫应答、上调免疫应答、增强免疫应答和/或改变免疫应答（例如通过引发一类免疫应答，其进而将对象中免疫应答的优势类型从有害或无效的类型转变为有益或保护性的类型）。
术语“可操作连接”是指以这样的方式将核酸分子连接至转录控制序列，所述方式使得当被转染（即转化、转导或转染）入宿主细胞时能够表达所述分子。转录控制序列是控制转录的起始、延伸和终止的序列。尤其重要的转录控制序列是控制转录起始的那些序列，例如启动子、增强子、操纵子和抑制子序列。多种此类转录控制序列是本领域技术人员已知的。优选的转录控制序列包括在禽类、鱼类、哺乳动物、细菌、病毒、植物和昆虫细胞中发挥功能的那些。尽管本发明可以使用任何转录控制序列，但所述序列可包括天然存在的转录控制序列，其与编码免疫原或免疫刺激蛋白的序列天然结合。
术语“核酸分子”和“核酸序列”可以互换使用，并且包括DNA、RNA、或DNA或RNA的衍生物。该术语还包括寡核苷酸和更大的序列，例如质粒，例如本文所述的免疫刺激性质粒，且包括编码蛋白或其片段的核酸分子以及包含调节区、内含子或其他非编码DNA或RNA的核酸分子。通常，寡核苷酸具有长度为约1到约500个核苷酸的核酸序列，并且更通常，长度为至少约5个核苷酸。核酸分子可以源自任何来源，包括哺乳动物、鱼类、细菌、昆虫、病毒、植物、合成来源或其组合。核酸分子可以通过本领域众所周知的方法来产生，例如重组DNA技术（例如，聚合酶链式反应（PCR）、扩增、克隆）或化学合成。核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括但不限于天然等位基因变体和经修饰的核酸分子，其中已以这样的方式插入、缺失、置换或倒置核苷酸，所述方式使得此类修饰基本上不干扰核酸分子引发可用于本发明的方法的免疫应答的能力。核酸同源物可以使用本领域技术人员已知的许多方法来产生（参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Labs Press，1989），其引入本文作为参考。
术语“可选择的标记物”和“可选择的标记基因”是指编码产物的基因，所述产物保护其中表达所述基因的生物体免于通常会杀死该生物体或抑制其生长的选择剂（例如，抗生素）或状况。可选择的标记基因是最常用的抗生素抗性基因（例如，卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因等）。因此，例如，当大肠杆菌细胞经受转化程序以引入编码卡那霉素抗性基因的质粒，然后在含有卡那霉素的培养基上或其中生长时，只有已成功摄取质粒并表达卡那霉素抗性基因的大肠杆菌细胞才将存活。术语“可选择的标记物”和“可选择的标记基因”还包括编码参与对于生物体的生长所必需的化合物的合成的酶的基因。当被引入到不能合成必需化合物的营养缺陷型生物体时，此类基因允许生物体在已补充有必需化合物的培养基中生长。例如，由于参与赖氨酸生物合成的酶中的突变或不存在所述酶而对于氨基酸赖氨酸营养缺陷的细菌细胞通常无法在尚未补充有赖氨酸的培养基中生长。当此类细菌经受转化程序以引入编码参与赖氨酸生物合成的酶的质粒时，已成功摄取所述质粒并表达所述酶的细菌当在尚未补充有赖氨酸的培养基中生长时将存活。术语“可选择的标记物”和“可选择的标记基因”还包括允许毒物/解毒剂选择的基因。例如，ccdB基因编码结合DNA促旋酶（对于细胞分裂所必需的酶）的蛋白。结合DNA促旋酶之后，ccdB基因产物损害基因复制并诱导细胞死亡。因此，表达ccdB基因产物的细菌不能存活。ccdA基因编码充当ccdB基因产物的天然抑制剂的蛋白（“解毒剂”）。因此，当在其细菌基因组中具有ccdB基因的细菌经受转化程序以引入编码ccdA基因产物的质粒时，只有成功摄取所述质粒并表达ccdA基因的细胞才将存活。。
术语“可筛选的标记物”和“可筛选的标记基因”是指编码产物的基因，所述产物允许观察者区分表达可筛选的标记基因的细胞和不表达可筛选的标记基因的细胞。可筛选的标记基因系统是本领域中众所周知的，并且包括，例如，lacZ基因和编码荧光蛋白的基因，所述荧光蛋白例如绿色荧光蛋白（GFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、红色荧光蛋白（RFP）、蓝色荧光蛋白（ BFP）或青色荧光蛋白（CFP）。
如本文使用的，术语“对象”是指猪科或猪科动物物种（Suidae or porcinespecies）的成员，无论是家养的还是野生的。具体而言，术语“对象”是指用于育种或肉类生产而商业饲养的那些。合适的猪对象包括但不限于家猪（swine）、阉公猪（hogs）、猪（pigs）、小母猪（gilts）、乳猪（suckling pigs）、断奶仔猪（weaned pigs）、待肥育猪（feederpigs）、公猪（boar）和本领域已知的其他猪科动物物种成员。在一些方面，对象可以被诊断为患有感染性疾病、可以具有感染性疾病的风险或者可以正在经历感染性疾病。对象可以是任何年龄的，包括在子宫内的、新生的、青春期的、成年的、中年的或老年的。
当介绍本发明或其优选实施方案的要素时，冠词“一个”、“一种”、“该”和“所述”意指存在所述要素中的一者或多者。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在是包括性的，并且意指可以存在除了列出的要素以外的另外的要素。
实施例
提供以下非限制性实施例以进一步举例说明本发明。
实施例1：当与杀死的商业猪流感疫苗共施用时，免疫调节剂复合物增强了血凝抑制抗体的诱导。
本实施例的目的是评估当与杀死的商业猪流感疫苗共施用时，免疫调节剂对血凝抑制（HI）抗体诱导的作用。
方法
将35头猪在现场接受并放入五个围栏（处理组T1、T2、T3、T4和T5）中。将猪随机化以在每个处理组中获得相似的重量。在第0天和第14天时，T2到T4接受不同量的免疫调节剂与推荐剂量的SIV商业疫苗。免疫调节剂和商业疫苗通过皮下接种在肩胛下区域的淋巴结附近非常接近地施用。T1仅接受商业疫苗，并且T5仅接受稀释剂。除了在第18天时从猪ID 114以外，在第0、3、7、10、14、18、21、24和28天时从每只剩余的猪收集血液用于得到血清。加工血液用于得到血清并且转移到实验室用于最终加工和血凝抑制（HAI）测试。
所有实验室程序都根据标准方法执行。血清样品用受体破坏酶预处理并吸附到鸡红细胞，然后开始HAI测定以减少与cRBC的非特异性结合。非特异性相互作用可能导致假阳性，提示血凝抑制的存在。预处理导致初始1:5稀释，使得在HAI测定中测试的第一稀释度为1:10。预处理的血清连续2倍稀释。然后使恒定量的病毒（4 — 8个血凝单位）与每个稀释度一起温育。在大约45分钟的温育期后，加入1%培养的红血细胞（cRBC）溶液。就血凝的抑制观察培养板。滴度计算为在所有重复中完全抑制4至8个病毒血凝单位的血清的末个稀释度。
关于针对猪流感病毒（SIV）H1N1的抗血凝抗体，测试了来自第0、3、7、10、14、18、21、24和28天的血清样品。另外，还对于关于SIV H3N2的抗血凝抗体，测试了来自第0、3、7和21天的血清样品。由于在用H1N1的初始测试过程中获得的结果，测试了这些具体日期。
免疫调节剂
本研究中使用如本文所述的免疫调节剂组合物。具体而言，使用了包括SEQ ID NO：2、DOTIM和药物载体的本文所述的免疫调节剂组合物（“IC-Ex.1”）。
表1：免疫调节剂的稀释
1微克
2在取出体积用于稀释之前的原液体积和稀释剂的总体积
3剩余用于施用的体积（200ug/2mL剂量待用于处理组2和5，总共14只动物；50ug/2mL剂量待用于处理组3，总共7只动物；10ug/2mL剂量待用于处理组4，总共7只动物）。
动物
猪是纯种或杂交种，并且初乳被剥夺直到运输到测试地点。从猪流感阴性农场购买总共35只混合性别的动物，并将35只动物纳入研究内。猪的初始年龄在到达时为大约八周，并且在接种时为九至十周。初始体重适合于接种时的猪的年龄。
仔猪在出生后没有接种疫苗，并且没有用已知干扰疫苗接种的任何处理进行处理。在到达临床地点后，观察所有仔猪的一般健康状况。在研究开始之前使动物适应七天。动物每天观察一次临床体征。体温每天获取一次。
仔猪选自没有猪流感病史的猪群以及未就SIV进行疫苗接种的亲本母猪/小母猪。每个个体进行评估并且确定为处于良好健康中。仔猪通过关于猪流感病毒的血清学（血凝抑制（HAI））呈阴性。在第-1或0天，所有仔猪都进行临床观察，并且或者放入处理组内或排除，最多7头仔猪/处理组。如果动物在处理施用前21天内接受了将干扰疫苗接种的处理，那么将它们排除在研究之外。
研究设计
表2：研究设计。
处理组 描述 疫苗接种（天）6 血液收集（天） 动物数目
T1 商业SIV1疫苗（IM）2 0、14 0、3、7、10、14、18、21、24、28 7
T2 商业SIV疫苗（IM）+3免疫调节剂4 200微克（SC）5 0、14 0、3、7、10、14、18、21、24、28 7
T3 商业SIV疫苗（IM）+3免疫调节剂50微克（SC） 0、14 0、3、7、10、14、18、21、24、28 7
T4 商业SIV疫苗（IM）+3免疫调节剂10微克（SC） 0、14 0、3、7、10、14、18、21、24、28 7
T5 稀释剂（5%右旋糖和水）（SC） 0、14 0、3、7、10、14、18、21、24、28 5-7
1 SIV = 猪流感病毒商业USDA许可的疫苗 - 例如FLUSURE Pfizer Animal Health，在肩胛下区域IM给予2mL剂量
2IM = 肌内注射途径
3在肩胛下区域单独施用每个组分
4免疫调节剂
5 SC = 皮下注射途径 - 在肩胛下区域中
6第0天是施用当天。
在整个研究期间和适应过程中观察动物的临床体征。从攻击施用当天开始并且继续直到尸检当天，每天早晨评价每只研究动物的异常呼吸、异常姿态和发热的临床体征。
下表用作关于异常呼吸和姿态的临床体征的临床得分分类指定的指导。临床得分是相对于在现场相似的、正常的、健康的动物进行限定。
表3：临床评分指导。
临床得分 呼吸
0 正常的速率和特征。
1 略微增加的速率和/或略微异常的特征。
2 适度增加的速率和/或异常的特征。
3 严重增加的速率和明显异常的特征（可能显示出张口呼吸）。
临床得分 姿态
0 正常 – 活泼、警觉、反应灵敏。正常食欲/瘤胃填充。
1 轻度抑郁 - 反应减退和/或食欲下降。
2 适度到明显抑郁 - 可能不愿意站立。
3 濒死 – 没有帮助无法站立。
观察动物的异常临床体征，包括厌食、咳嗽、发热、来自眼和鼻的浆液性溢液、共济失调、昏迷、惊厥、红斑、过度兴奋、多涎、跛行、斜卧（recumbence）、里急后重和震颤。
研究第0天对于所有动物是相同的，并且是对组T2、T3和T4中的动物施用免疫调节剂处理的当天。所有接受免疫调节剂的动物都进行皮下注射。所有接受疫苗的动物都根据标签说明进行施用。所有接受免疫调节剂的动物都在肩胛下区域的淋巴结附近进行注射。疫苗和免疫调节剂彼此非常接近地分开施用。
在断奶和运送之前，动物在来源农场时放血用于获得血清，目的是确定用于纳入研究中的适合性。最少三头猪/窝进行取样。
在研究第0天时（在疫苗接种之前）以及在第3天、第7天、第10天、第14天、第18天、第21天、和第24天和第28天时，收集血液样品（大约5-7mL/动物/收集）用于SIV血清学。
使用BBL标准操作程序（SOP）加工血液样品用于获得血清，并且将每个样品等分成两个单独的体积。用8单位的血凝（HA）病毒，使用BBL SOP通过HAI测定来测试血清样品。用同源和异源病毒测试血清样品。
在研究第-7、0、7、14和21和28天时或在尸检前称重动物。只有死亡或出于人道原因而实施安乐死的动物才通过兽医进行尸检，以确定病因。通过由主治兽医施用的巴比妥过量对猪实施安乐死。在测试设施处原地根据SOP处理尸检。在研究第28天时，根据设施SOP通过由主治兽医施用的巴比妥过量，通过人道方法对所有剩余动物实施安乐死。
结果
不存在起因于免疫调节剂测试物品的明显的临床表现。在研究期间两头猪死亡。在两种情况下死亡原因都是直肠脱垂。由于跛行和应激发作，另外两头猪从研究中去除。在第28天时，所有剩余的猪在血液收集后进行称重并且实施安乐死。
表4提供了来自第0、3、7、10、14、18、21、24和28天血清样品关于针对SIV H1N1分离物的抗血凝抗体测试的数据。关于来自第0、3、7和21天血清样品对于针对Sly H3N2分离物的抗血凝抗体测试的数据参见表5。具有针对H1N1为20和针对H3N2为10的HI滴度的测试血清样品报告为阳性。这是由于血清对每种病毒类型的非特异性背景。
表4：针对SIV H1N1的血凝抑制滴度
NS – 无样品
5 - 表示<10的滴度
10 - 非特异性背景
攻击病毒 - H1N1 SIV批次VS24Nov09lowa73-SIVp1
疫苗接种天数 = 第0天和第14天。
表5：针对SIV H3N2的血凝抑制滴度。
NS – 无样品
5 - 表示<10的滴度
10 - 非特异性背景
攻击病毒 - H1N1 SIV批次VS24Nov09lowa73-SIVp1
疫苗接种天数 = 第0天和第14天。
讨论
本研究的目的是评估当与杀死的商业猪流感疫苗共施用时，免疫调节剂组合物对血凝抑制（HI）抗体诱导的作用。为此，将总共35头初乳剥夺的猪分成5个处理组，并且每个处理组接受各种量免疫调节剂与商业SIV疫苗的初始接种和14天后的加强。在二十八天的研究期间，不存在起因于免疫调节剂测试物品的明显的临床表现。然而，由于死亡或出于人道原因的安乐死，总共四头猪从研究中去除。
收集的所有血清样品关于对H1N1的血凝抑制进行测定。选择数目的研究日还关于对H3N2的血凝抑制进行测定。图4和5呈现了对于每个测定日，对于每个处理组计算的几何平均数。与仅接种针对H1N1分离物的疫苗的组相比，对于接受与商业疫苗组合的200ug和10ug免疫调节剂的处理组，存在几何平均数中的显著增加。与仅接种疫苗的组相比，对于接受50ug免疫调节剂与商业疫苗的处理组，也存在几何平均数中的增加，尤其是在第21天时。当接种免疫调节剂时，对H3N2的血清转换也更早出现。
HAI滴度的实际平均值也呈现于图6和7中。这些图表示每个处理组内更多的个体滴度。在第14天的加强之后，这对于处理组3最明显。虽然只有两头猪血清转换为H1N1，但一头猪具有高HAI滴度（参见表5）。
存在对两种SIV分离物的血清转换。参见表6A和6B以及图8（第21天结果），其呈现了与每个处理组中猪的总数相比，其中使用这种方法检测到血清转换的猪数目。
表6A：血清转换的概括
血清转换*为H1N1的猪数目/总数
*滴度> 10的动物 = 血清转换
**在一个样品中的高背景。
表6B：血清转换的概括
血清转换*为H3N2的猪数目/总数
总之，当与杀死的商业猪流感疫苗共施用时，免疫调节剂复合物增强了血凝抑制抗体的诱导。
实施例2：免疫调节剂与猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）疫苗帮助猪肺中的早期病毒清除。
进行研究以评估免疫应答的强度和质量，以及通过与50 μg（RxII）或10 μg（RxI）剂量的免疫调节剂同时给予的PRRS修饰的活疫苗（MLV）疫苗在猪中引发保护性免疫水平。将参数与用相同的MLV疫苗进行免疫接种，但不含免疫调节剂进行施用的相同的宿主应答比较。通过测量与未接种疫苗和受攻击的对照相比，在接种疫苗和受强毒PRRS病毒攻击的动物中观察到的临床综合征的减少，确定保护性免疫的水平。
在受控的PRRS攻击中，与接受单独的PRRS疫苗的组（RxIII）中的动物相比，RxII（PRRS疫苗+ 50微克免疫调节剂）组具有更高的体重增加、更低的肺部病毒载量，并且在所有动物中都具有可检测的干扰素。该研究提示，免疫调节剂连同PRRS疫苗帮助肺中的早期病毒清除，这在PRRS疫苗接种的（RxIII）动物中未观察到。
研究设计
组Rx1（T5）接受PRRS MLV PrimePac疫苗+10 μg免疫调节剂。组Rx II（T4）接受PRRSMLV PrimePac疫苗+ 50 μg免疫调节剂。Rx III组（T5）接受单独的PRRS MLV PrimePac疫苗。
表7：研究设计。
组 处理 套房 围栏 动物数目
T1 无疫苗/无攻击 A 1 6
T2 无疫苗/受攻击的 A 5 6
T3（Rx III） 商业PRRS疫苗/受攻击的 A 3和6 9
T4（Rx II） 通过SC途径的商业PRRS 疫苗 + 50微克的免疫调节剂 + 受攻击的 A 2和8 9
T5（Rx I） 通过SC途径的商业PRRS疫苗 + 10微克的免疫调节剂 + 受攻击的 A 4和7 9
SC =皮下注射途径。
免疫调节剂
本研究中使用的免疫调节剂是上文实施例1中描述的免疫调节剂。
动物
免疫调节剂阳离子脂质体-质粒复合物作为在5 mL（1.25 mL填充）小瓶中包含的冻干粉末供应。测试物品被运送且贮存在2-8℃下且未冷冻。将免疫调节剂配制在pH 6.8的Tris-HCl乳糖缓冲液中。免疫调节剂在使用前通过加入无菌注射用水（SWFI）USP立即重构。容器和重构体积如下：
5 mL小瓶含有425µg（参考CoA）：用1.25 mL SWFI重构
10mL水，无菌，不含防腐剂（用于注射/USP），Abbott编号：488710100（FisherScientific AB4887-10-1）。
使用无菌技术在层流罩下用无菌注射用水重构免疫调节剂。将冻干的免疫调节剂从冷藏贮存（2-8℃）中取出，并且允许小瓶在重构前达到室温大约5分钟。注射器和18号针头用于测量分别0.5 mL（2mL小瓶）或1.25mL（5mL小瓶）无菌注射用水，并且逐渐注射到一个2mL或5mL冻干的免疫调节剂的小瓶中。在标签和研究药物制备工作表上记录重构的时间。将小瓶轻轻旋转（不涡旋）至少30秒，并允许静置至少5分钟。将小瓶再次轻轻旋转（不涡旋）至少30秒。重构的免疫调节剂材料具有白色半透明的外观。重构的小瓶用冰袋贮存直至使用。在4-6小时内使用时，重构的免疫调节剂材料是稳定的。如表8中所示，将重构的免疫调节剂在5%右旋糖的无菌水溶液中稀释。
表8：免疫调节剂稀释。
注意：将稀释的免疫调节剂保持在冰浴中。在稀释后4小时内使用稀释的免疫调节剂。记录最后幼崽（calf）的稀释时间和注射时间。
本研究中使用总共39头体重相似的SPF猪（表9至13），其不含所有主要的猪病原体，包括PRRS病毒、支原体和圆环病毒。动物通过血清学对于PRRS抗体呈阴性。在适应时，猪的初始年龄为大约7至9周。所有仔猪在出生后都没有接种疫苗，并且没有用已知干扰PRRS疫苗接种的任何处理进行处理。在研究开始之前使动物适应七天。动物每天观察一次临床体征。体温每天获取一次。
在整个研究期间和适应过程中观察动物的临床体征。从攻击施用当天开始并且继续直到尸检当天，每天早晨评价每只研究动物的异常呼吸、异常姿态和发热的临床体征。出于福利原因，一些动物每天观察多于一次。没有动物具有呼吸或姿态得分3，并且因此不需要药剂，并且没有出于人道原因被调查者实施安乐死。
下表用作关于异常呼吸和姿态的临床体征的临床得分分类指定的指导。临床得分相对于在现场相似的、正常的、健康的动物进行限定。小心考虑动物之间的正常差异并区分正常的生理应答与病理应答。
呼吸评分：
0 = 正常。胸式呼吸伴随一些腹部运动
1 = 轻度呼吸窘迫。一些腹式呼吸
2 = 中度呼吸窘迫。夸张的腹部和费力的呼吸
3 = 严重呼吸窘迫。非常费力的呼吸，腹式呼吸。口张开，鼻子和耳朵发绀。
活动/抑郁评分：
0 = 正常。猪在打开门时反应轻快/发咕噜声。猪活跃，好玩又好奇。看向门口，靠近大门且嗅探。显示对食物和水的兴趣。如果激动，它们可能排尿和排便。
1 = 轻度。在刺激时起来但慢，或者未显示多少兴趣或好奇。会很快回来躺下。对食物有一些兴趣
2 = 中等。明显不活跃且不愿起来/移动。伏地，蹒跚，不协调。
3 = 严重。无反应，不起来。
治疗方法
在7天适应期后，给T3至T5组（Rx III至Rx I）中的那些动物接种疫苗。所有接受免疫调节剂（T4＆T5）的动物都进行皮下注射。所有接受PRRS疫苗T3至T5的动物都用在2 ml体积的PRRS MLV毒株PrimePac中以大约5 x 104组织培养感染剂量50（TCID50）剂量进行肌内施用。如本文使用的，“TCID50”是指在50%的接种细胞中产生病理变化所需的病原体的量。所有接受免疫调节剂的动物都在肩胛下区域的淋巴结附近注射。疫苗和免疫调节剂彼此非常接近地分开施用。在组T1和T2中的动物用2 ml耗尽培养上清液进行注射，所述耗尽培养上清液来自用于生长病毒的未感染细胞（MARC-145细胞）。
在疫苗接种后四周，用在2 ml体积中的大约2 x 104 TCID50的PRRS病毒株NADC-20攻击组T2-T5中的动物，一半剂量肌内给予，且另一半鼻内给予。分配到组T2的未接种疫苗和受攻击的动物用于建立起因于强毒NADC-20 PRRS病毒感染的临床综合征的严重程度，而分配给T1组的动物用于提供正常的生长和健康参数。
基于血清和肺中的病毒载量以及通过比较体重（BW）变化以及抑郁和呼吸体征的表现，来确定通过疫苗接种引发的保护性免疫的程度。对于攻击后10天每天监测临床参数。通过测量ZMAC细胞中血清中的感染性病毒滴度，在攻击后0、4、7和10天时测定病毒血症（血液）的水平。通过病毒学方法确定肺组织中的病毒载量。
在攻击后10天，对所有研究动物实施安乐死，并收集肺样品用于获得病毒载量。有经验的病理学家在宏观和微观水平上评价肺中的病理变化。
为了测量病毒特异性免疫的发展，在第-7、0、4、7、14和28天时（攻击前）和免疫后以及在第38天时（在实施安乐死之前），从每只动物收集外周血样品。从这些样品中获得血清和PBMC，并且测量每只动物的体液和细胞介导的免疫的强度。使用血清病毒中和测试来确定抗体滴度，并且执行PRRS病毒特异性干扰素（IFN）分泌细胞（IFN-SC）分别针对疫苗病毒（PrimePac）以及攻击病毒（NADC-20）的频率。
在研究第-7、0、7、14和21、28天以及在实施安乐死之前（第38天）将动物称重。在研究过程中没有动物死亡或出于人道原因而被实施安乐死，并且因此没有执行临时尸检。
统计分析
接受和分析的数据由血清（在第4天、第7天和第10天时测量）和肺和IFN滴度、体重（在第0、6和10天时测量）、临床得分和温度（对于处理后10天每天测量）和尸检时的三类评分组成。记录范围从0到3的肺泡间隔增厚、增厚的分布和气道中的炎症细胞的得分。
在分析之前，通过对应用自然对数转换的每个滴度加一（+1）变换所有肺滴度。计算最小二乘平均值，并且反变换以表示每个组对于任何时间段的中心趋势（即，几何平均值）且制表）。IFN滴度未被转化。
在记录多次测量时，使用重复测量的方差分析（如果基线 - 最近的研究第0天 –是可用的，则使用协方差分析）。如果参数仅测量一次，则使用方差分析。在所有模型中，TRT的固定效应就5个处理组之间的差异进行测试。由于多个处理组，使用对p值的邦费罗尼调整（Bonferroni adjustment）。
对于尸检得分和临床得分，使用卡方分析。0.05的α水平视为统计学显著的。所有分析都使用SAS 9.2软件执行。
结果与讨论
没有注意到治疗相关的不良事件。按组计的在攻击后的每天平均姿态得分包括在图9（平均每天姿态得分）中。在攻击后按组计的个体动物姿态得分包括在表9至13中。在研究自始至终，未接种疫苗且未受攻击的组具有姿态得分0（表9：每天姿态得分 - Rx）。对于研究第2至10天，未接种疫苗和受攻击的组具有范围为0.3至1的平均姿态得分（表10：未接种疫苗/受攻击的每天姿态得分）。对于研究第2至10天， PPRS疫苗接种+免疫调节剂10 μg和受攻击的组（RxI）具有范围为0.1至0.7的平均姿态得分（表11：每天姿态得分 - RxI）。对于研究第4至8天，PPRS疫苗接种+免疫调节剂50 μg和受攻击的组（RxII）具有范围为0.1-0.2的平均姿态得分，且在研究第7、9和10天时没有姿态得分（表12：每天姿态得分 - RxII）。对于研究第2以及4至10天，PPRS疫苗接种和受攻击的组（RxIII）具有范围为0.1至0.8的平均姿态得分（表13：每天姿态得分 - III）。
表9：每天姿态得分 - Rx。
表10：未接种疫苗/受攻击的每天姿态得分。
表11：每天姿态得分 - RxI。
表12：每天姿态得分 - RxII。
表13：每天姿态得分 - RxIII。
按组计在研究第-1天时的平均体温范围为103.7℉至104.3℉。受攻击的动物在研究第5天时具有峰值体温，并且按组计其范围为104.0℉至107.1℉，如图10中所示。按天计的个体动物体温包括在表14至18中。
在用强毒PPRS病毒攻击之前和之后，按组计的平均体重包括在图11中。从第-39天到第10天按组计的平均体重增加（第10天的体重 - 第-39天的体重）包括在图12中从第-39天开始。在受PRRS病毒攻击的组中，当与未接种疫苗或PRRS疫苗接种（RxIII）组相比，IC-Ex.1免疫调节剂施用组（RxI和RxII）在第10天时具有较高的体重增加。个体动物体重包括在表19至23中。在研究结束时（第10天），在受PRRS病毒攻击的组中，IC-Ex.1免疫调节剂组（RxI和RxII）具有较高的体重，分别为125.5和125.7磅；这是与分别具有116.9和117.7磅的未接种疫苗或PRRS疫苗接种（RxIII）组相比（图13）。在受PRRS病毒攻击的组中的攻击之后，IC-Ex.1免疫调节剂+ PRRS疫苗接种组（RxI和RxII）具有较高的体重增加，分别为14.2（12.7%）和13.9（12.5%）磅（图14和15 ）；这是与分别具有7.5（6.8%）和11.4（10.8%）磅的未接种疫苗或PRRS疫苗接种（RxIII）组相比。攻击后的个体动物体重包括在表19至23中。
表19：体重（磅）Rx未接种疫苗且未受攻击的。
表20：体重（磅）未接种疫苗受攻击的。
表21：体重（磅）Rx I接种疫苗受攻击的。
表22：体重（磅）Rx II接种疫苗受攻击的。
表23：体重（磅）Rx III接种疫苗受攻击的。
按组计的平均肺重量包括在图16中。按组计的作为体重百分比的平均肺重量包括在图17中。与关于未受攻击的对照的0.77相比，受攻击的组中的所有动物都具有较高的肺与体重比，并且范围为1.06（RxI）至1.19（未接种疫苗的对照）。
在攻击后第4、7天和10天时，从血清样品中分离PRRS病毒。未受攻击的对照动物对于病毒分离仍然呈阴性，支持研究中实施的生物安全的完整性。在研究第10天时，未接种疫苗受攻击的动物中的所有动物对于病毒分离都呈阳性，并且范围为0.06X104至3.16X104TCID50/ml。用PRRS疫苗接种的动物在第10天时在血清中具有低病毒滴度。在RxI组中，在第10天时，9只动物中的7只对于病毒分离呈阴性。在RxII组中，在第10天时，9只动物中的5只对于病毒分离呈阴性。在RxIII组中，如表29所示，在第10天时，9只动物中的7只对于病毒分离呈阴性。
表29：攻击后血清中的PRRSV滴定。
从个体动物肺样品中分离PRRS病毒。未受攻击的对照动物的肺样品对于病毒分离呈阴性，支持研究中实施的生物安全的完整性。在RxII组中，九只动物中的两只对于病毒分离呈阴性，并且一只动物在其肺样品中具有小于102个病毒。在受攻击的组中的所有其他动物中，肺样品具有范围为1.78X102至1.0X105的滴度（图18和19）。关于每只动物的微观肺损伤描述于表30至34中。在受攻击的动物中，来自组RxII中的动物的肺具有最低的平均肺泡间隔增厚和增厚的分布，对应于该组中较低的病毒回收（图20）。
表30：肺病理学 - 未接种疫苗且未受攻击的（Rx）。
病理得分标准 肺泡间隔增厚的分布
肺泡间隔增厚 0 - 无损伤（正常）
0 - 无增厚（正常） 1 - 间隔的局灶性增厚
1 - 轻度（相对） 2- 间隔的多灶性增厚
2 - 中度（相对） 3- 间隔的弥散性增厚
3 - 重度（相对）。
表31：肺病理学 - 未接种疫苗且受攻击的。
病理得分标准 肺泡间隔增厚的分布
肺泡间隔增厚 0 - 无损伤（正常）
0 - 无增厚（正常） 1 - 间隔的局灶性增厚
1 - 轻度（相对） 2- 间隔的多灶性增厚
2 - 中度（相对） 3- 间隔的弥散性增厚
3 - 重度（相对）。
表32：肺病理学 - 接种疫苗且受攻击的Rx I。
病理得分标准 肺泡间隔增厚的分布
肺泡间隔增厚 0 - 无损伤（正常）
0 - 无增厚（正常） 1 - 间隔的局灶性增厚
1 - 轻度（相对） 2- 间隔的多灶性增厚
2 - 中度（相对） 3- 间隔的弥散性增厚
3 - 重度（相对）。
表33：肺病理学 - 接种疫苗且受攻击的Rx II。
病理得分标准 肺泡间隔增厚的分布
肺泡间隔增厚 0 - 无损伤（正常）
0 - 无增厚（正常） 1 - 间隔的局灶性增厚
1 - 轻度（相对） 2- 间隔的多灶性增厚
2 - 中度（相对） 3- 间隔的弥散性增厚
3 - 重度（相对）。
表34：肺病理学 - 接种疫苗且受攻击的Rx III。
病理得分标准 肺泡间隔增厚的分布
肺泡间隔增厚 0 - 无损伤（正常）
0 - 无增厚（正常） 1 - 间隔的局灶性增厚
1 - 轻度（相对） 2- 间隔的多灶性增厚
2 - 中度（相对） 3- 间隔的弥散性增厚
3 - 重度（相对）。
个体动物的干扰素滴度包括在图21和表35中。与RxIII（ PRRS疫苗）组中的9只动物中的4只相比，RxII（PRRS疫苗 + 50 μg免疫调节剂）组中所有的9只动物和RxI（PRRS疫苗+ 10 μg免疫调节剂）中的9只动物中的7只具有可检测的干扰素滴度。
表35：Prime Pac - IFN滴度 - 攻击日。
总之，在受控的PRRS攻击中，与接受单独的PRRS疫苗的组（RxIII）中的动物相比，RxII（PRRS疫苗+ 50 µg免疫调节剂）组具有更高的体重增加、肺中更低的病毒载量，并且在所有动物中都具有可检测的干扰素。该研究提示，免疫调节剂连同PRRS疫苗帮助肺中的早期病毒清除，这在PRRS疫苗接种的（RxIII）动物中未观察到。
实施例3：在用PRRS病毒的实验室攻击之前或之后，施用于猪的免疫调节剂的单次肌内注射减少了肺损伤。
进行研究以确定免疫调节剂减少受PRRS攻击和最近断奶的猪中的肺损伤的有效性。在研究第0天用PRRS病毒人工攻击猪。研究评估了5个处理组，用4x106 PRRSV（毒株NADC-20）的一次性鼻内接种物的4个受攻击的组（B组[在研究第2天时施用免疫调节剂]、C[在研究第-1天时施用免疫调节剂]、D [在研究第0天时施用免疫调节剂]和E [施用5%右旋糖作为安慰剂对照]），以及在研究第0天时的1个假攻击的组（A组）。猪在研究第0天时为大约九至十周龄。四个受PRRSV攻击的组各自在每个围栏中呈现。临床得分从研究第-2天至研究第16天每天记录。猪提交用于经过两天期间（研究第15和16天）的尸检，用于评估肺损伤以及通过肺灌洗和病毒分离的PRRSV回收。与E组安慰剂对照猪中32.9%的总肺叶受累平均值相比，C组和D组中的免疫调节剂处理的猪具有统计上更低的（p值分别为0.0095和0.0247）肺损伤得分（分别为9.7%和13.9%）。在研究时间过程期间报告了一个不良事件，但被鉴定为与研究兽医产品无关。
研究设计
表36：处理组。
表37：测试系统概括表
不知情通过功能分离来完成。任何参与每天观察、临床评分、肉眼所见和微观肺病理学评价、样品加工或实验室结果解释的研究人员保持对处理组编号和施用的测试材料之间的关联不知情。分配清单和处理代码键从研究现场去除，并且对于研究的活体内（in-life）阶段持续时间由发起人保留。
动物
猪是约克夏猪X长白猪X汉普夏猪杂交。在测试材料施用时，猪在9至10周龄之间。研究群体的人口统计数据在下表38中提供。
表38：研究群体人口统计数据。
使用IDEXX Laboratories Herdchek PRRS病毒抗体测试试剂盒系列号：09418-LF113有效期：2011年11月1日，就PRRSV抗体分析在研究第-14（2011年4月27日）天时从所有n=46头候选猪中收集的血清。所有候选猪都被确定为对于PRRSV呈阴性。
为了包括在研究中，猪在任何时候都必须仍未接受PRRS疫苗接种；具有验证出生日期、原产地以及关于PRRS和支原体的SPF状态证明的可追溯的记录；在研究第-1天时104℉的直肠温度；在研究第-1和0天时的呼吸得分和抑郁得分为0；在测试材料施用当天没有与PRRS攻击无关的并发损害或疾病；并在研究第-1天时如通过一般健康观察确定的是身体健康的。
如果在测试材料施用或攻击感染当天猪具有下述属性：受到将混淆研究结果或阻止研究完成的并发损害或非靶系统疾病的影响；或在研究第-1和0天时的呼吸得分不等于0，则猪被排除用于测试材料施用和攻击感染的资格之外。
免疫调节剂
本研究中使用的免疫调节剂在上文实施例1中描述。
分配给免疫调节剂处理组的猪接受2mL免疫调节剂和5%右旋糖水的悬浮液的单次一次性肌内注射，以递送50 μg免疫调节剂质粒DNA。每天两次观察猪的一般健康观察结果。
研究程序
在研究第-2、-1、0、2、4、7、10、14天和尸检当天时，记录关于所有猪的直肠体温。使用Welch Allyn SureTemp-plus®数字温度计收集直肠体温。
在研究第-14（对于分配至处理组）、-7、0、7、10和14天时，获得关于所有猪的体重。在研究第10天时记录的重量由于缺少数据形式而丧失用于分析的资格，导致关于研究第10天的不完整数据集。
用于本研究的接种物由从ZMAC细胞（猪肺泡巨噬细胞）中的单次传代中回收的NADC-20 PRRSV的两个分离原种（原种#31411和#41911）的库制备。原种#31411具有5X106的滴度，并且随后以1:25稀释以获得2X106 TCID50/ml。随后将稀释的原种与具有2X106TCID50/ml的原始滴度的原种41911组合。滴定合并的接种物并测定为具有1.8X106 TCID50/ml的滴度。为了测定滴定，制备接种物的十倍连续稀释物，并且将100 μl/孔的每种稀释物一式四份铺平板。基于在各孔中观察到的ZMAC细胞的细胞凋亡和/或细胞死亡来评分病毒的存在。滴度通过使用Reed和Muench方法来计算。
随后向每头猪鼻内（1 mL/鼻孔）施用2 mL的1.8X106 TCID50/mL PRRS病毒，用于大约4X106 TCID50/mL PRRSV的最终接种物。为了方便操作的进行且最小化对猪的应激，将每头猪放入购自Lomir Biomedical Inc.（Malone，NY）的Panepinto吊索中。
为了增加感染的成功，使用附接到一次性使用的3 mL注射器的末端的儿科粘膜雾化装置（Wolfe Tory Medical，Inc. Salt Lake City，UT）施用PRRSV悬浮液。在吸气过程中增量地施用接种物。
相对于在研究第0天时的PRRSV攻击，在研究第-2、4、7、10和14天时，测定血清病毒血症的水平。猪的外周血中感染性PRRS病毒的存在从得自凝血静脉血样的血清进行测定。将静脉血（5-10 cc）收集在红色顶部Vacutainer管中并允许凝固。收集后两小时内从这些管中收获血清（1-2 cc），并以等分试样贮存于-80℃下直至进一步分析。通过在RPMI-1640中制备血清的10倍连续稀释物来完成病毒血症的测定。将0.1 ml体积的稀释的血清样品一式三份转移到96孔组织培养板中，所述96孔组织培养板含有在0.1 ml体积中的大约3 x104个ZMAC细胞（猪肺泡巨噬细胞）的悬浮液。在37℃下在5% CO2大气中培养3天后，对病毒诱导的致细胞病变效应的存在进行评分。使用Reed和Muench的方法测定组织培养感染剂量50（TCID 50）的数目。
在尸检时收集的肺组织样品中测定肺组织中的病毒载量。通过从右中叶收集的支气管肺泡灌洗液（BAL）测定肺中的病毒载量。使用连接到置于通向右中叶的支气管内的导管的20 mL注射器，通过将10 ml无菌生理盐水输注到该叶内，获得BAL样品。在轻轻按摩叶之后，通过用与输注相同的注射器抽吸流体来取出输注的流体。回收大约5 ml灌洗液。通过在RPMI-1640中制备BAL流体的10倍连续稀释物来完成肺组织中病毒载量的测定。将0.1 ml体积的稀释的血清样品一式三份转移到96孔组织培养板，所述96孔组织培养板含有在0.1ml体积中的3 x 104个猪肺泡巨噬细胞的悬浮液。在37℃下在5% CO2大气中培养3天后，对病毒诱导的致细胞病变效应的存在进行评分。使用Reed和Muench的方法测定TCID50。
在尸检时，从胸腔中取出肺，拍照（其中猪耳朵标签在每张照片中捕获的背面和腹面）且基于由Halbur等人（1995）描述的评分系统，通过驻留的兽医病理学评分肉眼所见损伤。简言之，将五（5.0）个潜在点指定给前叶、中叶和副叶的每个背面和腹面。将十五个点（15.0）指定给背侧尾叶，并且将十二点五（12.5）个点指定给尾叶的腹面。观察每个肺叶（肺的背面和腹面），并且在发起人提供的数据捕获表格上记录受到肉眼所见损伤影响的肺的估计百分比。通过将叶的最高得分乘以受影响的叶的百分比，将最终的损伤得分指定给每个叶。例如，如果20%的背侧尾叶已观察到损伤，则该叶的损伤得分计算为（20*15）/100 =损伤得分3。
为了评价肺组织切片中的微观损伤，从每个肺获取大约1 cm厚x 5 cm长x 5 cm宽的样品（参见图22）：
a）左颅叶的头部部分，
b）左颅叶的尾部部分，和
c）左尾叶的头部部分。
将样品在10%中性缓冲福尔马林中固定至少48小时，然后在自动化组织处理器中加工并在石蜡中包埋。切下3-5 μm厚的切片并且用苏木精和伊红染色。组织加工（石蜡包埋、切片和染色）在University of Illinois Veterinary Diagnostic Laboratory的组织学实验室进行。
检查肺切片并且基于下述四个标准给出间质性肺炎严重程度的估计得分：
A. 肺泡间隔增厚：0 - 无增厚（正常）；1 – 轻度（相对）；2 - 中等（相对）；3 - 重度（相对）
B. 肺泡间隔膜增厚的分布：0 - 无损伤（正常）；1 - 间隔的局灶性增厚；2 - 间隔的多灶性增厚；3 - 间隔的弥散性增厚
C. 支气管相关淋巴组织（BALT）发展：0 – 针对正常BALT的最低限度的细胞；1 - 数目中的轻度增加；2 - 数目中的适度增加；3 - 数目中的严重增加。
D. 气道炎症证据：0 - 无；1 – 轻度；2 - 中等；3 - 重度。
使用绿色顶部Vacutainer管（肝素钠），通过静脉穿刺在研究第-2、4、7和14天时从研究动物获得静脉血（8-10 mL）。在通过使用Ficoll-Hypaqe1077的密度离心收集血液后4小时内，从这些样品中分离外周血单核细胞。将分离的细胞悬浮于补充有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中。细胞不含任何外源刺激物（以测量细胞因子的自发产生）或在2 μg/mLtoll样受体9（TLR9）激动剂ODN D19（Qiagen，Valencia，CA）的存在下进行温育，所述ODND19是含有CpG的A型寡聚脱氧核苷酸（ODN）。随后在培养16小时后收集细胞培养物上清液并且冷冻直至进一步使用。如先前所述（Calzada-Nova等人，2010），使用特异性ELISA测定所得到的培养上清液中IFN-α的量。
统计方法
疾病模型的评估由分析两个对照组之间的肉眼所见肺和微观肺数据组成。与未受攻击的严格对照组相比，需要统计上显著的差异来显示受攻击的对照组显示出足够的疾病。使用用于组效应的方差分析检验来比较肉眼所见肺得分（每个叶的总和）。使用非参数威尔科克森秩和检验比较三个（3）微观肺得分（肺泡间隔增厚、气道炎症和BALT发展）中的每一个。剩余的分析包括关于组2到5（受攻击的对照和免疫调节剂组），条件是满足上述疾病模型验证。
使用重复测量的方差分析对具有重复测量的数据（即IFN-α）进行分析，并且在适当时包括基线协变量。使用具有最小AIC结果的协方差结构。根据需要应用反正弦变换，以更紧密地接近正态数据分布。
具有单一终点的数据（肉眼所见肺得分）用方差分析进行分析。以上所有模型都掺入围栏作为模型中的一个因素。使用非参数威尔科克森秩和检验来分析微观肺（隔膜、气道和BALT）得分。所有分析均使用SAS 9.2执行，并且0.1的α用于区分显著效应。
结果
当比较严格对照组和受攻击的对照组（对于肉眼所见、隔膜、气道和BALT，p值分别为0.0015、0.0037、0.0249和0.0010）时，肉眼所见和微观肺得分两者均显示出显著的治疗效应。因此，疾病模型验证得到满足。
由每只动物的肺叶得分总和表示的肉眼所见肺病理学显示出对照组和每个免疫调节剂组之间的统计学显著差异（对于免疫调节剂第-1天、免疫调节剂第0天和免疫调节剂第2天，p值为0.0095、0.0247和0.0736），如图24中所示。微观肺总病理得分并未显示出在处理组之间的任何统计学显著差异（对于隔膜、气道和BALT组织，为0.8786、0.5788和0.5865）。
如图25中所示的IFN-α结果对于在研究时的任何一天都没有导致任何统计学显著差异（总体治疗效应是0.1653）。
讨论与结论
在该研究中，相对于安慰剂对照动物，肉眼所见肺损伤得分在每个处理组中显著降低。基于这些数据，免疫调节剂可以降低健康的最近断奶仔猪中的肺损伤得分，所述猪对其他病毒或细菌呼吸道病原体具有有限的暴露：换言之，仅PRRSV呼吸道攻击。
干扰素水平如面对PRRSV攻击所预测的振荡。IFN-α水平的压制是PRRSV感染的标志性后遗症，并且在本研究中显而易见，其中相对于研究第-2天，IFN-α水平在研究第4和7天时收集的样品中极大降低。免疫调节剂在任何收集期都没有导致IFN-α水平中的显著差异。然而，令人感兴趣的是在研究第14天时从在研究第-1天时用免疫调节剂处理的猪（C组）和在研究第0天时处理的猪（D组）中收集的巨噬细胞的IFN-α生产中的近2倍增加。这些数据提示免疫调节剂可以在肺中提供引发作用，可能是通过在TLR9信号传导事件的后续激活之后增强驻留巨噬细胞产生更高水平的IFN-α的能力。这种观察可以需要可能是在两种治疗PRRSV模型中的进一步探索，使得在攻击前的第-14天时和再次在第-1天时用免疫调节剂处理猪。
在免疫调节剂处理的组中未观察到PRRS病毒血症中的统计学显著降低。然而在第7天时，在第-1天处理组中，存在血清病毒血症中的明显尽管并不显著的降低。相对于安慰剂处理的猪，图23中所示的病毒肺载量在两个研究中除了一个之外的所有免疫调节剂处理组中都算术地减少；然而，这些减少并非统计学显著的。不存在免疫调节剂施用增强病毒肺载量或病毒血症的证据或指示。后一种说法反驳了文献中报道的先前的观察结果，其提示猪外周血单核细胞在高浓度的IFN-α中的体外温育增强PRRSV摄取。本研究中不存在免疫调节剂增强PRRSV血清病毒血症或肺载量的指示。
实施例4：在用PRRS病毒的NADC.2毒株的实验室攻击前一天，作为单次肌内注射施用于猪的免疫调节剂的积极效应
进行研究以滴定生长猪中免疫调节剂的剂量。测试系统评估5个处理组，用2 mL 5.38x105 TCID50 PRRSV（毒株NADC-20）的一次性鼻内施用的4个受PRRS病毒攻击的组（A组[在研究第-1天时施用50 μg免疫调节剂]、B [在研究第-1天时施用5%右旋糖水]、C [在研究第-1天时施用75 μg免疫调节剂]和D [在研究第-1天时施用25 μg免疫调节剂]），以及在研究第0天时的1个假攻击的组（E组 - 严格对照）。猪在研究第0天时为大约7.5至8.5周龄。每个免疫调节剂处理的组由每个围栏中的两头猪代表，使得猪安置在具有8头猪的六个围栏（一个套房中的三个围栏和相邻套房中的三个围栏）中，以及在第三个套房中具有8头严格对照的猪的一个围栏。
结果在0.10的p值下视为统计学显著的。在研究第12天观察到关于呼吸得分的显著治疗效应（p值为0.0719）。对于在研究第3、4、6、7和12天时，对照组（B组）相对于每个免疫调节剂组之间的配对比较，与在研究第7天时的对照组相比，对于免疫调节剂50 pg处理的组观察到显著更高（更无精打采）的姿态得分（p值为0.0902）。相反，在研究第12天时，与对照组相比，在免疫调节剂75 μg处理的组中观察到显著更低的（接近正常）姿态得分（p值为0.0932）。在每天时与每个免疫调节剂组的配对对照组比较，导致对于以25 μg（第4和7天）和75 μg（仅第7天）的剂量施用的免疫调节剂，显著更低的血清病毒血症，以及以50 μg剂量施用的在研究第14天时显著更高的血清病毒血症。然而，仅对于25 μg组和75 μg组在研究第7天时观察到的减少视为临床相关的，因为在25 μg组中在第4天时观察到的经转化的病毒血症计数之间的差异仅为28相对于18。在肉眼所见或微观肺损伤、临床得分、病毒肺载量、体重、体温或体重与肺重量比中没有观察到显著差异。在本研究中报告了一个不良事件，但被确定为与研究兽医产品无关。
本研究的目的是在研究第0天时，在用PRRSV的NADC-20毒株的实验室攻击前一天（研究第-1天），通过向最近断奶的猪施用25 μg、50 μg或75 μg免疫调节剂的单次i.m.注射来滴定免疫调节剂的剂量。将免疫调节剂的有效性与安慰剂处理的受PRRSV攻击的猪相比较。
关于功效的主要应答变量是关于姿态和呼吸的每天临床得分（研究第-2天直到研究第14天）、血清病毒血症（研究第-2、4、7、10天和尸检当天）、在尸检当天时的肉眼所见和微观肺病理学以及肺病毒血症（PRRSV攻击后14或15 [±1d]天）。记录体温（研究第-2、-1、0、4、7、10天和尸检当天）和体重（研究第0、7、10和14天）作为功效的二级和间接测量。在研究第7天（2011年6月7日）还收集了体重，用于将猪分配给处理组和围栏。
研究设计
这是实验攻击研究，其利用对于PRRSV和猪肺炎支原体证实为血清阴性的商业来源的最近断奶的猪。下表40和表41中提供了处理组的列表。
表40：处理组。
表41：事件的时间表
表42：测试系统概括表
品种 约克夏猪X长白猪X汉普夏猪
动物属性 断奶仔猪/SPF用于PRRSV和支原体
设施属性 BL2淋浴设施：每个套房含有三个围栏。每个套房都是煤渣砌块结构和具有观察窗的滑动防偷挡门。每个套房都具有单独的空气处理单元。
研究动物的出生日期范围 2011年4月23日至2011年4月28日
在研究第0天时的年龄范围 7.5至8.5周龄
在处理分配时的重量范围 28.9磅至44.8磅[13.1 kg至20.3 kg]
在尸检时的重量范围 29.3磅至85.8磅[13.2 kg至38.9 kg]
PRRSV毒株 NADC-20
PRRSV滴度 5.38 X105 TCID50/ml悬浮液
接种途径 鼻内
接种剂量 2 ml（1 ml/鼻孔）5.38 X105 TCID50/ml悬浮液
严格对照的猪 在研究第-1天时假接种的/5%右旋糖水且不受PRRSV攻击
处理组安置 除了E组（严格对照的猪）以外，每个组都在每个围栏中呈现
围栏数目 总共12个围栏（每个围栏中具有代表A、B、C和D组的12头猪的6个围栏，以及具有代表E组的8头严格对照的猪的1个围栏）
不知情通过功能分离来完成。任何参与每天观察、临床评分、肉眼所见和微观肺病理学评价、样品加工或实验室结果解释的研究人员保持对处理组编号和施用的测试材料之间的关联不知情。分配清单和处理代码键从研究现场去除，并且对于研究的活体内（in-life）阶段持续时间由发起人保留。
使用Excel中的RAND（）函数，从最高体重到最低体重连续地，猪通过渐降的体重进行分类且分区，而不考虑性别。
动物
源自尚未接受任何PRRSV疫苗接种的单个商业养猪场的本研究中使用的猪是无PRV阶段和无布鲁氏菌病种类状态的兽群。猪被证实PRRSV和猪肺炎支原体血清阴性。ELISA结果保留在研究文件中。
为了包括在研究中，猪在任何时候都必须仍未接受PRRSV疫苗接种；具有验证大概年龄、起源农场和PRRS状态证明的可追溯的记录；在研究第-1天时具有105℉的直肠温度；在研究第-1和0天时具有呼吸得分和抑郁得分0；并在研究第-1和0天时如通过一般健康观察确定的是身体健康的。
免疫调节剂
本研究中使用的免疫调节剂是与上文实施例1中所述相同的免疫调节剂。
表43：用于测试材料制备的稀释步骤。
分配给免疫调节剂处理组的猪接受2 mL免疫调节剂和5%右旋糖水的悬浮液的单次一次性肌内注射，以递送25、50或75 μg免疫调节剂质粒DNA。猪每天观察两次一般健康观察，并且每天一次专门用于与呼吸和姿态相关的临床得分的评价和记录。
研究程序
在研究第-2和-1（在给药之前）、0（在攻击之前）、2、4、7、10（在尸检之前）天和尸检当天开始对于每头入选的猪直肠测定体温。在研究第-7（仅用于处理和围栏分配）、0、7、10和14天时获得猪的体重。
NADC（全国动物疾病中心（National Animal Disease Center））- 20 PRRS病毒最初在用来自母猪（NO 35358）的肝脏组织接种的MARC-145细胞中分离，所述母猪在非典型PRRS流产风暴中流产，并且在1996年作为诊断调查的一部分被实施安乐死。该分离物维持在Ames，IA的NADC。
随后向每头猪鼻内（1 mL/鼻孔）施用2 mL 5.38 X105 TCID50/ml悬浮液。为了增加感染的成功，使用附接到一次性使用的3 mL注射器的末端的儿科粘膜雾化装置（WolfeTory Medical，Inc. Salt Lake City，UT）施用PRRSV悬浮液。在吸气过程中增量地施用接种物。
根据下述程序在研究第-2、4、7、10天和尸检当天，通过病毒分离（VI）对所有猪测定感染性PRRS病毒载量的定量评价。
通过在含有2%马血清、1x抗生素/抗真菌剂和1x L-谷氨酰胺的MEM培养基中制备血清的10倍连续稀释物来完成病毒血症的测定。将0.2ml体积的稀释血清样品一式三份转移到含有预先接种的Marc-145细胞的96孔组织培养板中。在37℃下在5% CO2大气中培养4天后，使用PRRSV单克隆抗体SDOW-17-F在免疫荧光测定（IFA）中测定病毒的存在。TCID50使用Spearman-Karber方法进行计算。
在尸检时收集的肺组织样品中测定肺组织中的病毒载量。通过从右中叶采集的支气管肺泡灌洗液（BAL）测定肺中的病毒载量。实现来自样品的病毒定量。
在尸检时，从胸腔中取出肺，拍照（其中猪耳朵标签在每张照片中捕获的背面和腹面）且基于由Halbur等人（1995）描述的评分系统，通过病理学家评分肉眼所见损伤。简言之，将五（5.0）个潜在点指定给前叶、中叶和副叶的每个背面和腹面。将十五个点（15.0）指定给背侧尾叶，并且将十二点五（12.5）个点指定给尾叶的腹面。
观察每个肺叶（肺的背面和腹面），并且在发起人提供的数据捕获表格上记录受到肉眼所见损伤影响的肺的估计百分比。通过将叶的最高得分乘以受影响的叶的百分比，发起人对每个叶指定最终的损伤得分。例如，如果20%的背侧尾叶已观察到损伤，则该叶的损伤得分计算为（20x15）/100 = 损伤得分3。
为了评价肺组织切片中的微观损伤，从每个肺获取大约1 cm厚x 5 cm长x 5 cm宽的样品（图22）：
a）左颅叶的头部部分，
b）左颅叶的尾部部分，和
c）左尾叶的头部部分。
将样品在10%中性缓冲福尔马林中固定至少48小时，然后在自动化组织处理器中加工并在石蜡中包埋。
检查肺切片并且基于下述四个标准给出间质性肺炎严重程度的估计得分：
A. 肺泡间隔增厚：0 - 无增厚（正常）；1 – 轻度（相对）；2 - 中等（相对）；3 - 重度（相对）
B. 肺泡间隔增厚的分布：0 - 无损伤（正常）；1 - 间隔的局灶性增厚；2 - 间隔的多灶性增厚；3 - 间隔的弥散性增厚
C. BALT发展：0 – 针对正常BALT的最低限度的细胞；1 - 数目中的轻度增加；2 - 数目中的适度增加；3 - 数目中的严重增加。
D. 气道炎症证据：0 - 无；1 – 轻度；2 - 中等；3 - 重度。
从研究第2天开始，直到研究第14天，根据下述评分标准就呼吸和姿态每天对所有猪进行观察和评分。
表44：评分标准。
统计方法
疾病模型的评估由分析两个对照组之间的肉眼所见肺和微观肺数据组成。与未受攻击的严格对照组相比，需要统计上显著的差异来显示受攻击的对照组显示出足够的疾病。使用用于组效应的方差分析检验来比较肉眼所见肺得分（每个叶的总和）。使用非参数威尔科克森秩和检验比较四个（4）微观肺得分（肺泡间隔增厚、间隔增厚的分布、气道炎症和BALT发展）中的每一个。
剩余的分析包括关于组2到5（受攻击的对照和免疫调节剂处理的组），条件是满足上述疾病模型验证。
通过费舍尔精确检验分析每天的临床得分（呼吸和姿态得分）。如果总体处理组效应在任何一天时都显著，则在这天的对照组相对于每个免疫调节剂组之间执行配对比较（3次比较）。
使用重复测量的方差分析对具有重复测量的数据（血清病毒血症、体重、体温）进行分析，并且在适当时包括基线协变量。使用具有最小AIC结果的协方差结构。根据需要应用反正弦变换，以更紧密地接近正态数据分布。
具有单一终点的数据（肉眼所见肺得分、肺病毒血症（BAL）和体重与肺重量比）用方差分析进行分析。以上所有模型都在适当时掺入围栏作为模型和应变量的变换中的因素。
使用非参数威尔科克森秩和检验来分析微观肺（隔膜、Dseptal、气道和BALT）得分。
所有分析均使用SAS 9.2执行，并且0.1的α用于区分显著效应。
结果
当比较严格对照组和受攻击的对照组（对于肉眼所见、隔膜、隔膜分布、气道和BALT，p值分别为0.0021、0.0038、0.0631、0.0001和0.0016）时，肉眼所见和微观肺得分两者均显示出显著的治疗效应。因此，疾病模型验证得到满足。
呼吸得分仅在研究第12天时证实显著的处理组差异（p值为0.0719）。对于其他研究日，呼吸得分并未导致显著的处理组差异（p值为0.1202或更大）。在研究第12天时，对照组相对于每个免疫调节剂组之间的配对比较（3次比较）并未显示显著的配对处理差异（p值为0.2174或更大）。
姿态得分在第3、4、6、7和12天时证实显著的处理组差异（p值分别为0.0349、0.0831、0.0349、0.0073、0.0699）。对于其他研究日，呼吸得分并未导致显著的处理组差异（p值为0.1960或更大）。对于在研究第3、4、6、7和12天时，对照组相对于各自免疫调节剂处理组之间的配对比较，在研究第7天时，对于免疫调节剂50 μg处理组相对于对照组观察到显著更高的姿态得分（p值为0.0902）。相反，在研究第12天时，相对于对照组，在免疫调节剂75 μg处理的组中观察到显著更低的姿态得分（p值为0.0932）。
血清病毒血症数据导致统计学显著的处理x天相互作用（p=0.0797），如图26中所示。在每天时与每个免疫调节剂组的配对对照组比较导致对于免疫调节剂25 μg（第4和7天）和免疫调节剂75 μg（仅第7天）显著较低的血清病毒血症，以及在研究第14天时对于免疫调节剂50 μg显著较高的血清病毒血症。
肉眼所见肺病理学（由每只动物的肺叶得分总和表示）未显示出统计学显著的处理组差异（总体处理效应为0.8685）。
图28中显示的微观肺总病理得分并未显示出在处理组之间的任何统计学显著差异（对于隔膜、气道和BALT组织，p值分别为0.6726、0.2801和0.2901）。总分布间隔增厚得分显示显著的处理差异（p值为0.0075）。对于对照组相对于每个免疫调节剂组之间的配对比较，显著差异只能在对照组和免疫调节剂75 μg组之间观察到（p值= 0.0043）。
讨论与结论
在研究第7天时，相对于安慰剂攻击的组，几何平均血清病毒血症在所有免疫调节剂处理的组中极大降低。另外，相对于安慰剂处理的受攻击的猪，平均病毒肺载量在25 μg和50μg处理的猪中显著更低，如图27中所示。在另一项研究中观察到类似的结果，由此平均病毒肺载量在免疫调节剂处理的猪中显示显著降低。显而易见，免疫调节剂在减少PRRSV肺载量方面提供了可测量的效力水平。
实施例5. 免疫调节剂组合物在新生仔猪的受大肠杆菌攻击模型中的功效。
进行该研究以评估免疫调节剂组合物在通过强毒大肠杆菌K88攻击的易感新生仔猪中的功效。研究中的所有母猪在其粪便样品中对于大肠杆菌K88都呈阴性。未报告处理相关的不良事件。在分娩后几小时攻击研究中的所有仔猪。来自母猪4009、2694、10040、4001和2088的仔猪用大肠杆菌培养物批次1进行攻击。来自母猪2082、217和215的仔猪用大肠杆菌培养物批次2进行攻击。
在研究期间对32头仔猪进行尸检。关于31头仔猪的死亡原因或提前终止的原因是由于大肠杆菌病。一头仔猪（305 T2）被母猪放下且发现死亡。除了一头猪（331 T1）以外，所有仔猪由于大肠杆菌病减轻体重而死亡或实施安乐死（31头猪）。所有存活过研究持续时间的仔猪（37头猪）都增加了体重。体重增加范围为240至1,540克。母猪2088所生的仔猪与其他母猪所生的仔猪相比不具有临床体征。在一次观察中，仅两头仔猪（342 T1和336 T3）具有粪便得分2。分析包括或不包括来自这头母猪的仔猪执行。用盐水处理的23头猪中的13头（57%）由于大肠杆菌病而死亡。用免疫调节剂组合物1X处理的22头猪中的9头（41%）由于大肠杆菌病而死亡。用免疫调节剂组合物5X处理的23头猪中的9头（39%）由于大肠杆菌病而死亡。排除来自一头母猪（2088）的仔猪，分析如下：用盐水处理的20头猪中的13头（65%）由于大肠杆菌病而死亡。用免疫调节剂组合物1X处理的19头猪中的9头（53%）由于大肠杆菌病而死亡。
用IC-Ex.1 5X处理的20头猪中的9头（45%）由于大肠杆菌病而死亡。大肠杆菌毒株MVS#2能够在出生当天攻击的易感新生仔猪诱导死亡率、临床体征和腹泻。与对照相比，用免疫调节剂组合物处理仔猪在数量上降低了两个处理组（1X和5X）中的死亡率，但不是统计学不同的。
材料与方法
测试动物。 测试九个Hermitage母系 – 通过乡村West Point，NE的Klitz农场拥有的经典hybridTM怀孕母猪，且在其粪便中证实关于大肠杆菌K88呈阴性。购买了8头怀孕母猪，并且转移到Klitz农场设施内的分娩单元4。母猪分娩前至少30天没有接受大肠杆菌K88疫苗和抗微生物剂。八窝新生仔猪进入研究。母猪和仔猪没有可能混淆临床数据解释的并发疾病。
动物饲料和水。 母猪经由喂食器随意进食乳汁定额，并且经由自动饮水器自随意喝水。饮水器和喂食器每天检查一次，并根据需要进行清洁。关于仔猪的唯一食物来源是来自母猪的奶（哺乳）。
伴随药剂。 将莫能霉素钠混合的饲料施用于母猪。
安置。 母猪安置在分娩单元4中。在研究过程中，动物暴露于大约12小时的光/天以及范围为70℉至73℉的高温和低温，以及范围为49至69%的湿度。73℉，以及范围为49至69%的湿度。
研究设计概括。
处理组的细节在表52中列出。该研究具有三组仔猪。T1、T2和T3组的仔猪分别接受盐水、IC-Ex.1 1X和5X。研究中的所有仔猪都通过肌内途径用2 mL适当的测试材料进行注射。
关于K88菌毛抗原的测试。 来自怀孕母猪的粪便样品被收集并运输到实验室。将样品稀释且在MacConkey琼脂平板上划线培养且在~37℃下温育过夜。从平板中选择大肠杆菌样菌落，并在使用对于大肠杆菌K88菌毛特异性的抗血清的凝集测试（Abcam Scientifics）中进行测试。选择且购买用于研究的怀孕母猪对于具有K88菌毛的大肠杆菌呈阴性。
随机化。 每头母猪产下7到12头仔猪。仔猪用一式两份的独特耳标加以鉴定。在窝内，仔猪按体重的降序排列，并且排名前6（一头母猪产下7头仔猪）或9（7头母猪产下10至12头仔猪）头仔猪被包括在研究中。将来自每窝的研究中的仔猪随机分配到三个处理组之一（表52）。本研究内包括69头仔猪。
攻击培养物的制备。 制备了两批攻击培养物。对于每个分批，从超低温冰箱中取出大肠杆菌K-88分离物（MVS #2，第4代）的一个小瓶，且在室温下解冻。从小瓶中取出一环量的大肠杆菌K-88培养物，且在5%绵羊血琼脂（BA）平板上划线培养。使BA平板在37℃下在5%CO2培养箱中温育过夜。观察BA平板上的菌落的纯度和β溶血区。挑取来自BA平板的5个β溶血菌落并转移至含有10 mL预热的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）的试管中，并且通过移液数次将它分散以形成均匀悬浮液。将悬浮液转移到含有200 mL预热TSB的烧瓶中。将烧瓶在37℃下温育大约6小时。温育后，测试培养物在600 nm处的光密度（OD）。关于分批1和2培养物的OD分别为1.16和1.12。将培养物稀释至0.85 OD，并且将500 mL和450 mL的分批1和2分别运输至分娩单元4用于攻击。
攻击程序。 攻击前大约1小时和攻击后1小时（总共2小时）从母猪扣留仔猪。研究中的所有仔猪用5 mL制备的攻击培养物口服攻击。
测试材料。
盐水：从Vedco购买有效期为2013年9月的盐水批号A110901-3。每100 mL盐水含有0.9克氯化钠和注射用水。盐水用作对照材料。
无菌水：从APP Pharmaceuticals，LLC以100 mL小瓶购买有效期为2013年9月的无菌注射用水，批号6000844。无菌水用于再水合免疫调节剂组合物。
5%右旋糖：有效期为2014年1月的批号19-112-JT的5%右旋糖USP购自HospiraInc.的250 mL袋中。5%右旋糖用于稀释再水合的免疫调节剂组合物。
免疫调节剂组合物的制备：将免疫调节剂小瓶从冰箱中取出并允许升温至室温。在使用之前，通过加入2 mL无菌水立即将每个小瓶再水合。将小瓶旋转30秒，并使其在室温下静置5分钟。根据表45中的稀释方案，使用5%右旋糖稀释再水合的免疫调节剂组合物。将稀释的免疫调节剂组合物用冷包装贮存直至使用（大约2小时）。
表45. 免疫调节剂组合物稀释方案。
处理。 攻击后大约2小时，处理仔猪。每头仔猪在颈部右侧通过肌内途径给予2 mL适当的处理（参见表48至51）。T1、T2和T3组中的仔猪分别接受盐水、免疫调节剂组合物1X和5X。
临床评价。 入选前，通过研究兽医观察母猪和仔猪，且发现是健康的。攻击后，仔猪每天观察两次，直到第5天。
评分细节。 个别检查仔猪，并且将棉签轻轻插入直肠内，以帮助评价粪便稠度。攻击后每天两次对动物进行评分（参见表46和47）：
表46. 粪便得分。
0： 正常，固体粪便。
1： 半固体粪便。
2： 具有一些固体材料的水样粪便。
3： 没有固体材料的多水样粪便。
4 死亡或出于人道原因被去除且实施安乐死的动物接受得分4
表47. 一般身体状况得分。
0： 看起来正常。
1： 轻微脱水和/或轻微憔悴和/或粗糙的毛皮。
2： 脱水、憔悴，不管毛皮。
3： 猪没有帮助无法站立（虚弱）。
4 死亡或出于人道原因被去除且实施安乐死的动物接受得分4
体重。 在攻击之前（表48至51）、在终止之前或在死亡或实施安乐死当天称重仔猪。
统计分析。 如果动物在五天观察期的过程中的至少一天具有2或更高的一般身体得分，则它们视为临床上有病的。如果动物在五天观察期的过程中对于至少两次观察具有2或更高的粪便得分，则它们视为对于粪便得分呈阳性。
结果
研究中的所有母猪在其粪便样品中对于大肠杆菌K88都呈阴性。仔猪没有处理相关的不良事件。在分娩后几个小时攻击研究中的所有仔猪。来自母猪4009、2694、10040、4001和2088的仔猪用大肠杆菌培养物分批1进行攻击，并且前后滴度分别为1.04 X 109 CFU/mL和9.6 X 108 CFU/mL。来自母猪2082、217和215的仔猪用大肠杆菌培养物分批2进行攻击，并且前后滴度分别为9.9 X108 CFU/mL和9.0 X 108 CFU/mL。
在研究期间对32头仔猪进行尸检。关于31头仔猪的死亡原因或提前终止的原因是由于大肠杆菌病。一头仔猪（305 T2）被母猪放下且发现死亡。
除了一头猪（331 T1）以外，所有仔猪由于大肠杆菌病减轻体重而死亡或实施安乐死（31头猪）。所有存活过研究持续时间的猪（37头猪）都增加了体重。
体重增加范围为240至1,540克。母猪2088所生的仔猪与其他母猪所生的仔猪相比不具有临床体征。在一次观察中，仅两头仔猪（342 T1和336 T3）具有粪便得分2。分析包括或不包括来自这头母猪的仔猪执行。用盐水处理的23头猪中的13头（57%）由于大肠杆菌病而死亡。用免疫调节剂组合物1X处理的22头猪中的9头（41%）由于大肠杆菌病而死亡。用免疫调节剂组合物5X处理的23头猪中的9头（39%）由于大肠杆菌病而死亡。排除来自一头母猪（2088）的仔猪，分析如下：用盐水处理的20头猪中的13头（65%）由于大肠杆菌病而死亡。用免疫调节剂组合物1X处理的19头猪中的9头（53%）由于大肠杆菌病而死亡。用免疫调节剂组合物5X处理的20头猪中的9头（45%）由于大肠杆菌病而死亡。
大肠杆菌毒株MVS#2能够在出生当天攻击的易感新生仔猪中诱导死亡率、临床体征和腹泻。与对照相比，用免疫调节剂组合物处理仔猪在数量上降低了两个处理组（1X和5X）中的死亡率，但不是统计学不同的。该研究可以在更大的样品中重复，提供用于统计分析的足够能力。
表48. 仔猪随机化且分配至处理组（母猪ID 4009和2694）
表49. 仔猪随机化且分配至处理组（母猪ID 10040和4001）。
表50. 仔猪随机化且分配至处理组。
表51. 仔猪随机化且分配至处理组（母猪ID 217和215）
表52. 处理组。
表53. 死亡或实施安乐死的猪的体重 -（母猪ID 4009和2694）
表54. 死亡或实施安乐死的猪的体重（母猪ID 10040和4001）。
表55. 死亡或实施安乐死的猪的体重（母猪ID 2088和2082）
表56. 死亡或实施安乐死的猪的体重（母猪ID 217和215）
表57. 猪在攻击后的体重增加或减少（母猪ID 4009和2694）
表58. 猪在攻击后的体重增加或减少（母猪ID 10040和4001）。
表59. 猪在攻击后的体重增加或减少（母猪ID 2088和2082）
表60. 猪在攻击后的体重增加或减少（母猪ID 217和215）
表61. 母猪4009所生仔猪的临床得分。
FS = 粪便得分
0正常固体粪便，1半固体粪便，2具有一些固体材料的水样粪便，3没有固体材料的多水样粪便
PS = 身体得分
0看起来正常，1轻微脱水和/或轻微憔悴和/或粗糙的毛皮，2脱水、憔悴，不管毛皮，3猪没有帮助无法站立（虚弱）
T1 = 盐水 T2 = IC-Ex.1 1X T3 = IC-Ex.1 5X。
表62. 母猪2694所生仔猪的临床得分。
D = 由于严重临床体征而死亡或实施安乐死
FS = 粪便得分
0正常固体粪便，1半固体粪便，2具有一些固体材料的水样粪便，3没有固体材料的多水样粪便
PS = 身体得分
0看起来正常，1轻微脱水和/或轻微憔悴和/或粗糙的毛皮，2脱水、憔悴，不管毛皮，3猪没有帮助无法站立（虚弱）
T1 = 盐水 T2 = IC-Ex.1 1X T3 = IC-Ex.1 5X。
表63. 母猪10040所生仔猪的临床得分。
FS = 粪便得分
0正常固体粪便，1半固体粪便，2具有一些固体材料的水样粪便，3没有固体材料的多水样粪便
PS = 身体得分
0看起来正常，1轻微脱水和/或轻微憔悴和/或粗糙的毛皮，2脱水、憔悴，不管毛皮，3猪没有帮助无法站立（虚弱）
T1 = 盐水 T2 = IC-Ex.1 1X T3 = IC-Ex.1 5X。
表64. 母猪4001所生仔猪的临床得分。
FS = 粪便得分
0正常固体粪便，1半固体粪便，2具有一些固体材料的水样粪便，3没有固体材料的多水样粪便
PS = 身体得分
0看起来正常，1轻微脱水和/或轻微憔悴和/或粗糙的毛皮，2脱水、憔悴，不管毛皮，3猪没有帮助无法站立（虚弱）
T1 = 盐水 T2 = IC-Ex.1 1X T3 = IC-Ex.1 5X。
表65. 母猪2088所生仔猪的临床得分。
FS = 粪便得分
0正常固体粪便，1半固体粪便，2具有一些固体材料的水样粪便，3没有固体材料的多水样粪便
PS = 身体得分
0看起来正常，1轻微脱水和/或轻微憔悴和/或粗糙的毛皮，2脱水、憔悴，不管毛皮，3猪没有帮助无法站立（虚弱）
T1 = 盐水 T2 = IC-Ex.1 1X T3 = IC-Ex.1 5X。
表66. 母猪2082所生仔猪的临床得分。
FS = 粪便得分
0正常固体粪便，1半固体粪便，2具有一些固体材料的水样粪便，3没有固体材料的多水样粪便
PS = 身体得分
0看起来正常，1轻微脱水和/或轻微憔悴和/或粗糙的毛皮，2脱水、憔悴，不管毛皮，3猪没有帮助无法站立（虚弱）
T1 = 盐水 T2=Bay 98-7089 1X T3=Bay 98-7089 5X。
表67. 母猪217所生仔猪的临床得分。
FS = 粪便得分
0正常固体粪便，1半固体粪便，2具有一些固体材料的水样粪便，3没有固体材料的多水样粪便
PS = 身体得分
0看起来正常，1轻微脱水和/或轻微憔悴和/或粗糙的毛皮，2脱水、憔悴，不管毛皮，3猪没有帮助无法站立（虚弱）
T1 = 盐水 T2=Bay 98-7089 1X T3=Bay 98-7089 5X。
表68. 母猪215所生仔猪的临床得分。
FS = 粪便得分
0正常固体粪便，1半固体粪便，2具有一些固体材料的水样粪便，3没有固体材料的多水样粪便
PS = 身体得分
0看起来正常，1轻微脱水和/或轻微憔悴和/或粗糙的毛皮，2脱水、憔悴，不管毛皮，3猪没有帮助无法站立（虚弱）
T1 = 盐水 T2 = IC-Ex.1 1X T3 = IC-Ex.1 5X。
表69. 通过母猪和组处理的猪的攻击后死亡率。
T1 = 盐水 T2 = IC-Ex.1 1X T3 = IC-Ex.1 5X
*一头猪被母猪放下且被排除。
实施例6. 免疫调节剂（IC-Ex.1）组合物在天然攻击断奶仔猪模型中预防或减轻与大肠杆菌相关的腹泻的功效。
本研究的目的是确定施用IC-Ex.1以预防或减轻在商业限制条件内安置的断奶仔猪中与大肠杆菌病相关的腹泻的临床有效性。
测试系统利用来自两个分开的来源农场的两个商业断奶仔猪群体：种猪（N=50）和候选猪（N=454）群体。种猪在研究第-8天时到达现场。在研究第-4天时，50%的种猪被记录为临床受大肠杆菌病影响，并且证实对于β-溶血性大肠杆菌（bHEC）呈阳性。猪基于粪便得分（0 =正常，1 = 腹泻）确定为临床上受影响。当应用于入选的猪时，粪便评分方法用作研究的功效终点。所有候选猪（用于入选的候选者）在研究第-1天时称重。候选者的平均到达体重是13.6磅。候选猪是21日龄，并且在到达当天断奶。为了在候选群体内建立大肠杆菌病的爆发，所有候选猪在到达时在单个围栏中与种猪混合。在接下来的日历日中，8%（36/454）的候选猪被记录为临床上受大肠杆菌病的影响，其满足第0天起始研究所需的5%阈值。
在研究第0天时，将所有种猪从研究中去除，记录关于每头候选猪的个别粪便得分，去除临床上受影响的候选猪，并且41头临床上正常的候选猪的10个围栏入选研究，并且施用测试材料。连续5天（研究第1至5天）记录关于所有入选猪的粪便得分。测试系统由五个处理组组成：经口施用的2mL体积的5%右旋糖水（D5W）（PO），在2 mL体积中PO施用的20 μg剂量的IC-Ex.1（PO_2），在10 mL体积中PO施用的20 μg剂量的IC-Ex.1（PO_10），在2 mL体积中肌内施用（IM）的20 μg剂量的IC-Ex.1，以及在1 mL体积中直肠内施用（IR）的20 μg剂量的IC-Ex.1。将所有剂量的IC-Ex.1都制备为在D5W中的悬浮液。在第0天时体重的统计分析中未导致在处理组之间的统计学差异（p=0.1725）。在这项研究中，相对于对照组，在断奶时施用的20 μg IM 剂量的IC-Ex.1将与产肠毒素大肠杆菌（F18）相关的腹泻发生率预防33.3%（置信区间[CI]；21.9%，43.1%）。另外，相对于对照，PO_2、PO_10、IM和IR处理组将腹泻频率分别减轻22.4%（CI；17.8%，27.1%）、18.5%（CI；8.6%，28.4%）、65.1%（CI；58.7%，71.5%）和20.4%（CI；12.8%，28%）。在五个处理组之间没有观察到死亡率中的统计学显著（p> 0.05）的差异。在收集并提交用于培养的50个（种猪）粪便样品中，大肠杆菌F18菌毛抗原在92.0%（n=46）的提交样品中检测到。在这个样品群体中没有检测到其他菌毛抗原。另外，大肠杆菌毒素基因EAST1（100.0%，n=50）、STa（92.0%，n=46）和STb（100.0%，n=50）连同AIDA粘附基因（12.0%，n=6）在这个样品群体中得到回收。
在该研究中，在断奶时施用的2 mL肌内20 μg剂量的IC-Ex.1预防与产肠毒素大肠杆菌（F18菌毛抗原，EAST1、STa和STb毒素基因以及AIDA粘附素基因）相关的腹泻的出现。另外，所有的处理组相对于对照组减轻腹泻的频率。
表70. 研究组。
*PO（经口），IM（肌内），IR（直肠内）。
测试系统的建立
表71.用于将猪分类为受大肠杆菌病“临床上影响”的临床评分方法和标准。
临床观察 粪便得分 临床上受影响
正常粪便；不存在腹泻 0 否
具有很少固体材料或没有固体材料的水样/液体粪便 1 是
大肠杆菌在bHEC+猪中的实验室诊断
来自潜在的bHEC+猪的直肠拭子收集。在到达当天从种猪收集直肠拭子，且运送至MRI用于β-溶血性（bHEC）大肠杆菌的分离和半定量评价。当大约50%或更多的猪显示出大肠杆菌病的临床体征时，再次从在研究场所的种猪/bHEC+猪收集直肠样品。在大约50%的种猪/bHEC+猪临床上受影响并证实bHEC+后，购买454头猪的候选库，并且在到达研究场所时在一个围栏中与种猪/bHEC+猪混合。
拭子收集、处理和实验室程序。收集直肠拭子并且置于具有Amies运输培养基的管内。管标有猪ID、研究编号、样品类型和收集日期。样品与冰袋一起放置，且在收集后24小时内运送。所有的直肠拭子都根据下述程序进行加工：
将直肠拭子在5%绵羊血琼脂（BA）和MacConkey琼脂（MAC）上直接划线培养。将BA平板在第一象限内划线培养并且交叉划线培养用于分离，以允许bHEC的半定量。最多四个拭子样品在MAC平板上划线培养。将BA和MAC平板在36℃±2℃下好氧温育过夜。根据下述关于bHEC的方案对初级分离BA板进行评分。MAC用于帮助确定典型的大肠杆菌菌落是否存在。
将来自初级BA的推定bHEC集落在新鲜的BA和MAC上传代培养。根据评估技术人员的判断选择一个（或多个）分离物。相同的接种物用于接种三重糖铁琼脂（TSI）和西蒙氏柠檬酸盐琼脂（SC）斜面。将BA、MAC和TSI斜面在36±2℃下温育过夜，并且SC斜面在36±2℃下温育2天。
如果满足下述标准，则将分离物确认为bHEC：
●分离物在MAC上具有典型的菌落形态并且在BA上显示β溶血
●酸/酸/H2S-/气体的典型TSI反应
●典型的负面SC反应。
大肠杆菌分离物使用MALDI Biotyper分类系统进一步加以证实。
在Iowa State University对所有证实的分离物进行基因型测试，以评估下述基因的存在：EAST 1毒素、LT毒素、STa毒素、STb毒素、Stx1毒素、Stx2毒素、Stx2e毒素、F18菌毛、F41菌毛、K88菌毛、K99菌毛、987P菌毛、AIDA粘附素、EAEA粘附素和PAA粘附素。
表72. 从种猪中分离的大肠杆菌的基因型特征概括。
从50头种猪中分离的大肠杆菌的基因型特征的概括
EAST1毒素 STa毒素 STb毒素 F18菌毛 AIAD粘附素
分离物数目* 50 46 50 46 6
*测试来自每头种猪的多个分离物
注：在该样品群体中未鉴定另外的毒素、菌毛或粘附素基因。
动物包括标准
在购买之前，种猪被证实为具有bHEC，和/或是在递送至研究场所之前证实为bHEC+的群组猪的同类，在递送至研究场所之前的14天内没有接受任何抗生素施用。种猪最近断奶，并且通过肉眼评定没有明显的损伤或物理异常，但可能显示出大肠杆菌病的临床体征。并且，种猪经实验室证实具有bHEC（大约50%），归类为“临床上受影响的”猪（如方案第14节第9项所定义的），并且在与候选猪混合之前具有碱性粪便pH。
在到达研究场所的14天内候选猪没有接受任何抗生素处理，在到达研究场所之前的2天或更短时间内断奶，在断奶当天时为19日龄或更大年龄，在与种猪混合前基于肉眼评定视为一般健康的；在到达后，负重跛足的猪对于在研究中入选仍然有资格，除非基于兽医观察状况视为严重的。轻微跛行在运输后的一些动物中预期。候选猪在研究第0天时被分类为临床上正常的，如方案的第15节第8项所定义，但基于记录的得分，大约5%或更多它的围栏同伴临床上受大肠杆菌病影响。
动物排除标准
如果候选猪在围栏放置/处理分配或处理施用时在研究第0天时具有下述属性中的一种或多种，则从入选中排除候选猪：腹股沟和/或脐疝、直肠脱垂或其他显著的身体异常或可能混淆动物的正常生长表现的受伤，如由状况的兽医评价确定的，归类为如方案第15节第9项中定义的“临床上受影响的”，如通过兽医鉴定的非负重跛足，神经系统疾病体征，濒死或末期疾病的猪，额外的猪。在动物排除表格中记录排除的猪。
处理后去除标准
从研究中去除由于大肠杆菌病而视为垂死的入选猪，并根据主治兽医的判断实施安乐死。这些猪被视为治疗失败。因除大肠杆菌病外的原因而垂死或死亡的入选猪被去除。这些猪在最后的分析中并不被视为治疗失败。从研究中去除受任何其他疾病或状况影响的入选猪且实施安乐死，所述任何其他疾病或状况可能混淆研究目标或阻止研究完成。这些动物不被视为治疗失败，并从最后的分析中去除。
表73. 研究组。
研究组 组描述 处理施用（研究日） Bay 98-7089/动物剂量（μg） 剂量体积（mL） 给药途径 41头猪的围栏数目 入选的猪数目/组
T01 5%右旋糖对照 0 0 2 PO 2 82
T02 IC-Ex.1 0 20 2 PO 2 82
T03 IC-Ex.1 0 20 10 PO 2 82
T04 IC-Ex.1 0 20 2 IM 2 82
T05 IC-Ex.1 0 20 1 IR 2 82
*PO（经口），IM（肌内），IR（直肠内）。
分配至阴性对照组的猪施用如对于分配至PO IC-Ex.1处理组的猪所述递送的D5W的单次PO施用。
研究
在一定比例的猪已证实具有bHEC后，购买50头种猪且递送到研究场所。在到达研究场所后，对所有种猪收集直肠拭子。拭子被运送到MRI实验室用于bHEC的分离和鉴定。使用方案中描述的临床评分标准，每天对种猪进行大肠杆菌病的临床体征评分。在这个观察期过程中仅记录临床上受影响的种猪。在腹泻得分为1的至少一天时记录个别直肠拭子的pH。当种猪群组的大约50%被分类为临床上受影响的并证实具有bHEC时，购买候选猪库并且与种猪混合。
天然攻击阶段候选者：种猪混合和入选
天然攻击阶段的开始是候选猪与种猪混合的日期：研究第-1天。天然攻击阶段的结束是大约5%或更多的候选猪库被证实临床上受大肠杆菌病的影响的日期。在研究第0天时，36头猪（7.9%；454头中的36头）被视为临床上受影响的，具有腹泻得分“1”，并且从研究中去除（未经处理）。另外八头满足包括标准的猪被去除（多余的猪）。所有剩余的猪都满足如上文列出的包括标准，并在研究中入选。所有种猪都在研究第0天时取出并记录。
该研究利用源自商业限制猪设施并且在断奶前或断奶时不施用抗生素的猪。候选猪是健康的，并且在购买时没有进行中的大肠杆菌病。所有猪在它们到达研究场所当天都是21天大的。在研究第-1天时记录关于所有候选猪的体重并且记录在体重表格上。对所有候选猪和种猪进行每天一般健康观察，并且在到达后一天开始记录，直到自然感染阶段结束（研究第0天）。在这个阶段过程中，仅评分临床上受影响或异常的结果。每天观察所有候选猪的大肠杆菌病临床体征。
临床有效期：临床评分和不良事件报告
当研究者确信候选库的大约5%或更多在一天内临床上受大肠杆菌病影响时，确定关于候选库中的所有猪的粪便得分。当大肠杆菌病爆发的阈值通过临床腹泻得分加以证实时，候选猪库被视为对于测试材料施用有资格。所有研究围栏都按照编号用合格的候选猪序贯填充（例如：围栏1、2、3……）。努力维持跨越所有栏的平衡猪数目。从研究第0天时开始，每天观察所有入选的猪（410）的不良事件和粪便得分直到研究第5天。在临床观察时对所有登记的猪进行每天一般健康观察。
使用的统计方法。具有置信区间的预防和减轻分数计算（R和版本3.1.3中的PF和MF包）、广义线性混合模型（GLMM）和方差分析（ANOVA）（SAS®版本9.3；SAS Institute，Cary，NC ）用于评估腹泻、死亡率和平均每天增加的主要参数，分别使用0.05的α作为统计学显著性。猪被视为本研究中的实验单位。然而，预防分数分析将围栏（n=2/组）视为分析的实验单位。
表74. 入选猪体重和ADG概括（研究第0和5天）。
*调整的最小乘方平均值
ADG分析未导致处理组之间的统计学差异（p = 0.1725，使用ANOVA）
**关于组T02中的一只动物的数据从分析中去除，仅留下81只动物就该处理组进行评估。参见方案偏差#4（参见第11节）。
模型验证。在5天研究期过程中显示出腹泻的对照组猪（研究组T01）的数目证实这种疾病模型足以测试处理组是否在预防腹泻的发生和/或减轻 与bHEC相关的腹泻频率方面具有积极效应。这在图29和表75中示出。
表75. 在研究第1至5天期间腹泻的累积发病率和预防分数。
表76. 平均百分比腹泻日（研究第1至5天）和减轻分数。
†预防分数使用MFClusBoot函数进行计算。
发现STa和STb毒素、EAST1毒素、F18菌毛和AIDA粘附素基因存在于50头bHEC+种猪的大多数中。D5W处理组中腹泻的高发生率（通过SD4为99%）证实，候选猪通过与种猪群体混合而被bHEC充分攻击。
IC-Ex.1预防或减轻断奶仔猪中的大肠杆菌病的有效性。在这项研究中，在断奶时施用的2mL肌内20 μg剂量的IC-Ex.1预防与产肠毒素大肠杆菌（F18菌毛、EAST1、STa和STb毒素以及AIDA粘附素基因）相关的腹泻的发生。另外，所有处理组相对于对照都减轻了腹泻的频率。
实施例8. 用IC-Ex.1处理后产生的免疫学途径和细胞因子。
实验程序的目的是确定由IC-Ex.1刺激的免疫学途径。
从猪中抽取血液，并且使用磁性细胞分离从血液样品中分离免疫细胞（图30）。包含树突细胞和单核细胞的172a+细胞以及包含天然杀伤细胞、T和B细胞的172a-细胞在体外进行培养。参考表77，用不同浓度的IC-Ex.1、充分表征的免疫刺激剂CpG ODN、Gardiquimod、PAM3Cys和LPS或空的对照脂质刺激培养物并温育18小时。使用ELISA或Luminex Multiplexing测定上清液中IFN-α、TNF-α、IL1β、IL10、IL12p40、Il4、IL6、IL8、IFN-γ的存在。
流式细胞术用于确定在IC-Ex处理后负责细胞因子产生的细胞类型。用布雷菲德菌素A处理细胞培养物。布雷菲德菌素A作用于抑制高尔基复合体，使得细胞中产生的细胞因子保留在细胞内。这些保留的细胞因子可以用荧光团标记的抗体进行检测。
表77. 免疫刺激剂浓度。
结果
A. 生理相关剂量的IC-Ex.1诱导大量的IFN-α。
图31显示了生理相关浓度的IC-Ex.1刺激CD172a+细胞中的IFN-α表达。IFN-α在宿主防御病毒和其他细胞内病原体方面是重要的。
相比之下，CD172a-细胞在用IC-Ex.1刺激后不产生细胞因子，提示IC-Ex.1在这些细胞中不是有效的激活剂细胞因子表达。因为这些细胞需要来自激活的单核细胞或树突细胞的信息变得激活，所以它们可能不是IC-Ex.1的主要靶。然而，这些细胞可能涉及体内的IC-Ex.1应答，但它们的参与可能不包括与IC-Ex.1的直接相互作用。参考图32，CD172a-细胞在用IC-Ex.1或已知的免疫刺激剂刺激后不产生IFN-α。出于INFα不由CD172a-产生的相同原因，在用IC-Ex.1或已知刺激剂刺激后，TNFα也不在CD172a-细胞中产生（图33）。
B. 浆细胞样树突细胞被IC-Ex.1激活以产生IFN-α。
流式细胞术用于鉴定由IC-Ex.1激活且由于IC-Ex.1刺激而产生细胞因子的一个或多个细胞类型。参考图34 A-D，用对照脂质刺激的CD14+单核细胞、常规树突细胞（cCD）或浆细胞样树突细胞（pDC）未能产生显著量的IFN-α。类似地，图35A-C、图36A-C、和图37A-C显示CpG ODN、IC-Ex.1（100ng/mL）和IC-Ex.1（10ng/mL）分别不刺激CD14+单核细胞或cDC。然而，CpG ODN、IC-Ex.1（100ng/mL）和IC-Ex.1（10ng/mL）确实刺激了pDC中的IFN-α产生（分别为图35D、36D和37D ）。
IC-Ex.1与脂质体的直接比较显示pDC中的刺激效应最可能不是由于单独的脂质体而是如上所述的脂质体和核酸分子的组合。图38A-C和图39A-C显示100ng/mL浓度的IC-Ex.1和100ng/mL浓度的脂质体均不引发CD14+单核细胞或cDC中的IFN-α产生。图38D和图39D示出了IC-Ex.1（100 ng/mL）刺激pDC中的IFN-α产生的能力，而脂质体（100 ng/mL）未能在pDC中产生IFN-α。
甚至10 ng/mL的IC-Ex.1也足以生成细胞因子产生。尽管IC-Ex.1（10 ng/mL）和脂质体（10 ng/mL）未能在CD14+单核细胞或cDCs中产生IFN-α（图40A-C和图41A-C），但10 ng/mL的IC-Ex.1足以刺激pDC中的IFN-α产生。10 ng/mL的脂质体未能产生类似于10ng/mL的IC-Ex.1的结果（图40D和图41D）。
参考图42，鉴定为干扰素生产细胞的细胞百分比在pDC中对于CpG ODN和IC-Ex.1（100 ng/mL和10 ng/mL）是最高的。平均荧光强度（MFI））在pDC中对于CpG ODN和IC-Ex.1（100 ng/mL和10 ng/mL）也是最高的（图43）。
C. 生理相关剂量的IC-Ex.1诱导IFN-γ和IL-4。
当用生理相关剂量的IC-Ex.1刺激时，CD172+富集的细胞产生IFN-γ。由于细胞类型之间的相互作用对于IFN-γ产生是必需的，这种产生可以起因于CD172+细胞级分中剩余的CD172-细胞。参考图44，与其他已知的免疫刺激剂相比，IC-Ex.1令人惊讶地是IFN-γ产生最有效的诱导剂，并且甚至测试的浓度最少的IC-Ex.1（1 ng/mL）也诱导可检测量的IFN-γ产生。还测试了cGAMP诱导IFN-γ产生的能力。图44还显示了cGAMP诱导IFN-γ产生，这指示产生IFN-γ的STING途径激活能力。
当通过生理相关剂量的IC-Ex.1刺激时，CD172+富集的细胞也产生IL-4。图45显示了1 μg/mL的IC-Ex.1以与最高剂量的CpG ODN（5 μg/mL）相当的水平诱导IL-4产生。
其他细胞因子也在用IC-Ex.1刺激后产生，尽管其水平低于用阳性对照刺激的水平。例如，IC-Ex.1是IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10的弱诱导剂。图46-48显示了IC-Ex.1诱导的这些细胞因子的表达水平类似于CpG ODN的那种，但低于LPS（1 μg/mL）和PAM3Cys（10 μg/mL）的那种。
实施例9：IC-Ex.1保护单核细胞衍生的巨噬细胞免于PRRS病毒。
由于IC-Ex.1是IFN-α的诱导物并且因为IFN-α是宿主防御病毒感染的关键组分，所以探讨了IC-Ex.1赋予对病毒感染的抗性的能力。如实施例8中所述的来自猪血的单核细胞的体外培养物用已知增加对细菌感染的抗性的IC-Ex.1或IFN-γ进行处理。处理后，用PRRS接种细胞并评估感染率。
结果
与未经处理的细胞相比，在暴露于PRRS之前用IC-Ex.1处理的较少细胞受感染。图49显示了IC-Ex.1预处理导致由PRRS感染一定百分比的细胞，如用IFN-γ预处理的细胞。IC-Ex.1预处理后受感染细胞的百分比小于没有预处理由PRRS感染的细胞的百分比的一半。
鉴于上文，可见实现了本发明的几个目标，并且获得了其他有利的结果。
因为可以在上述产物、组合物和方法中做出各种改变而不背离本发明的范围，所以预期上文说明书中包含且在附图中显示的所有内容应该被解释为说明性而不是限制意义的。
序列表
<110>
<120> 猪科动物物种中增强的免疫应答
<130> BAYR
<150> 62/199,848
>151> 2015-07-31
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4242
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pGCMB75.6的核苷酸序列
<400> 1
tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 60
ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 120
gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 180
tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac 240
atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 300
cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 360
agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 420
ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 480
gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 540
cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagccg atctgataac ggtaccgata agctggcggc 600
cgattaagct acagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga 660
caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc 720
tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac 780
tcccaggttc aattacagct cttaagcagc cgcaagcttg atatcgaatt cctgcagccc 840
gggggatcca ctagttctag agcggccgcc accgcggtgg agctcgaatt atcagatcga 900
ttaataacta tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa ggggttaata 960
aggaatattt gatgtatagt gccttgacta gagatcataa tcagccatac cacatttgta 1020
gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg 1080
aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 1140
agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 1200
aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcatcagat ctgccggtct ccctatagtg 1260
agtcgtatta atttcgataa gccaggttaa cctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 1320
gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 1380
ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 1440
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 1500
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 1560
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 1620
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 1680
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 1740
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 1800
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 1860
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 1920
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 1980
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 2040
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 2100
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 2160
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gggcgcgcct aggcttttgc aaagatcgat 2220
caagagacag gatgaggatc gtttcgcagc ttttcattct gactgcaacg ggcaataagt 2280
ctctgtgtgg attaaaaaaa gagtgtctga tagcagcttc tgaactggtt acctgccgtg 2340
agtaaattaa aattttattg acttaggtca ctaaggcgcc ttgcgctgag gttgcgtcgt 2400
gatatcatca gggcagaccg gttacatccc cctaacaagc tgtataaaga gaaatactat 2460
ctcattggcg ttgcccgcac ctgacagtgc gacgttgggc tgcgtccgtc gaccaacggt 2520
accgaggtaa cagcccaatc tatccatgat ctcggccagg ccgggtcggc cgttatgcag 2580
cccggctcgg gtatgaagcc attaaggagc cgacccagcg cgaccgggcg gccggtcacg 2640
ctgcctctgc tgaagcctgc ctgtcactcc ctgcgcggcg tacccgccgt tctcatcgag 2700
taggctccgg atcgcgaccc cggacgggcc ctgggcccag gagcggccta tgacaaatgc 2760
cgggtagcga tccggcattc agcattgact gcgcacggat ccagtccttg caggagcctt 2820
atgccgaccg tagcaaaaaa tgagcccgag ccgatcgcga gttgtgatcc ggtcccgccg 2880
attgccggtc gcgatgacgg tcctgtgtaa gcgttatcgt taccaattgt ttaagaagta 2940
tatacgctac gaggtacttg ataacttctg cgtagcatac atgaggtttt gtataaaaat 3000
ggcgggcgat atcaacgcag tgtcagaaat ccgaaacagt ctgcgggact ctggggttcg 3060
aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct 3120
tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc 3180
gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accctaggcg cgctcatgag cggatacata 3240
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 3300
ccacctaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca 3360
gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga 3420
ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg 3480
actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat 3540
caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag 3600
ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga 3660
agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa 3720
ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcccattcg ccattcaggc 3780
tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 3840
aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 3900
gttgtaaaac gacggccagt gagcgcgcgt aatacgactc actatagggc gaattgggta 3960
ccgggccccc cctcgagcag gatctataca ttgaatcaat attggcaatt agccatatta 4020
gtcattggtt atatagcata aatcaatatt ggctattggc cattgcatac gttgtatcta 4080
tatcataata tgtacattta tattggctca tgtccaatat gaccgccatg ttgacattga 4140
ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg 4200
gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gc 4242
<210> 2
<211> 4242
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMB75.6的核苷酸序列
<400> 2
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccgg 660
gccccccctc gagcaggatc tatacattga atcaatattg gcaattagcc atattagtca 720
ttggttatat agcataaatc aatattggct attggccatt gcatacgttg tatctatatc 780
ataatatgta catttatatt ggctcatgtc caatatgacc gccatgttga cattgattat 840
tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt 900
tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc 960
cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 1020
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agtacatgac cttacgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 1200
ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 1260
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gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga 1440
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cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga gaccaataga 1620
aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct attggtctta 1680
ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccaggttcaa ttacagctct 1740
taagcagccg caagcttgat atcgaattcc tgcagcccgg gggatccact agttctagag 1800
cggccgccac cgcggtggag ctcgaattat cagatcgatt aataactatg ctcaaaaatt 1860
gtgtaccttt agctttttaa tttgtaaagg ggttaataag gaatatttga tgtatagtgc 1920
cttgactaga gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa 1980
acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact 2040
tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 2100
aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc 2160
atgtctggat catcagatct gccggtctcc ctatagtgag tcgtattaat ttcgataagc 2220
caggttaacc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 2280
cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 2340
gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 2400
aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 2460
gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 2520
aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 2580
gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 2640
ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 2700
cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 2760
ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 2820
actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 2880
tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 2940
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ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc 3240
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tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg 3360
aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag 3420
ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg 3480
ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg 3540
caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac 3600
atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg 3660
acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc 3720
ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg 3780
aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc 3840
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ttcttgacga gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc 4020
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<210> 3
<211> 4242
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<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMB75.6_AscI的核苷酸序列
<400> 3
tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 60
ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 120
gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 180
tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac 240
atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 300
cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 360
agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 420
ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 480
gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 540
cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagccg atctgataac ggtaccgata agctggcggc 600
cgattaagct acagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga 660
caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc 720
tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac 780
tcccaggttc aattacagct cttaagcagc cgcaagcttg atatcgaatt cctgcagccc 840
gggggatcca ctagttctag agcggccgcc accgcggtgg agctcgaatt atcagatcga 900
ttaataacta tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa ggggttaata 960
aggaatattt gatgtatagt gccttgacta gagatcataa tcagccatac cacatttgta 1020
gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg 1080
aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 1140
agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 1200
aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcatcagat ctgccggtct ccctatagtg 1260
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gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 1380
ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 1440
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 1500
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gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 1680
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 1740
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 1800
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 1860
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 1920
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 1980
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 2040
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 2100
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cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gggcgcgcct aggcttttgc aaagatcgat 2220
caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct 2280
ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc 2340
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actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat 3540
caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag 3600
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agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa 3720
ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcccattcg ccattcaggc 3780
tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 3840
aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 3900
gttgtaaaac gacggccagt gagcgcgcgt aatacgactc actatagggc gaattgggta 3960
ccgggccccc cctcgagcag gatctataca ttgaatcaat attggcaatt agccatatta 4020
gtcattggtt atatagcata aatcaatatt ggctattggc cattgcatac gttgtatcta 4080
tatcataata tgtacattta tattggctca tgtccaatat gaccgccatg ttgacattga 4140
ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg 4200
gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gc 4242
<210> 4
<211> 4242
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pLacZMB75.6的核苷酸序列
<400> 4
tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 60
ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 120
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atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 300
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ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 480
gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 540
cgggaccgat ccagcctccc ctcgaagccg atctgataac ggtaccgata agctggcggc 600
cgattaagct acagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga 660
caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc 720
tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac 780
tcccaggttc aattacagct cttaagcagc cgccaaaaca aaattcctca aaaatcatca 840
tcgaatgaat ggtgaaataa tttccctgaa taactgtagt gttttcaggg cgcggcataa 900
taattaacta tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa ggggttaata 960
aggaatattt gatgtatagt gccttgacta gagatcataa tcagccatac cacatttgta 1020
gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg 1080
aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 1140
agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 1200
aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcatcagat ctgccggtct ccctatagtg 1260
agtcgtatta atttcgataa gccaggttaa cctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 1320
gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 1380
ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 1440
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 1500
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 1560
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 1620
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 1680
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 1740
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 1800
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 1860
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 1920
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 1980
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 2040
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 2100
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 2160
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gggcgcgcct aggcttttgc aaagatcgat 2220
caagagacag gatgaggatc gtttcgcagc ttttcattct gactgcaacg ggcaataagt 2280
ctctgtgtgg attaaaaaaa gagtgtctga tagcagcttc tgaactggtt acctgccgtg 2340
agtaaattaa aattttattg acttaggtca ctaaggcgcc ttgcgctgag gttgcgtcgt 2400
gatatcatca gggcagaccg gttacatccc cctaacaagc tgtataaaga gaaatactat 2460
ctcattggcg ttgcccgcac ctgacagtgc gacgttgggc tgcgtccgtc gaccaacggt 2520
accgaggtaa cagcccaatc tatccatgat ctcggccagg ccgggtcggc cgttatgcag 2580
cccggctcgg gtatgaagcc attaaggagc cgacccagcg cgaccgggcg gccggtcacg 2640
ctgcctctgc tgaagcctgc ctgtcactcc ctgcgcggcg tacccgccgt tctcatcgag 2700
taggctccgg atcgcgaccc cggacgggcc ctgggcccag gagcggccta tgacaaatgc 2760
cgggtagcga tccggcattc agcattgact gcgcacggat ccagtccttg caggagcctt 2820
atgccgaccg tagcaaaaaa tgagcccgag ccgatcgcga gttgtgatcc ggtcccgccg 2880
attgccggtc gcgatgacgg tcctgtgtaa gcgttatcgt taccaattgt ttaagaagta 2940
tatacgctac gaggtacttg ataacttctg cgtagcatac atgaggtttt gtataaaaat 3000
ggcgggcgat atcaacgcag tgtcagaaat ccgaaacagt ctgcgggact ctggggttcg 3060
aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct 3120
tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc 3180
gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accctaggcg cgctcatgag cggatacata 3240
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 3300
ccacctaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca 3360
gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga 3420
ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg 3480
actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat 3540
caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag 3600
ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga 3660
agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa 3720
ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcccattcg ccattcaggc 3780
tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 3840
aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 3900
gttgtaaaac gacggccagt gagcgcgcgt aatacgactc actatagggc gaattgggta 3960
ccgggccccc cctcgaggtc gacggtatcg ataagcttga tatcgaattc ctgcagcccg 4020
ggggatccac tagttctaga gcggccgcca ccgcggtgga gctccagctt ttgttccctt 4080
tagtgagggt taattgcgcg cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 4140
tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 4200
ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gc 4242

Claims (25)

1.一种在受体猪科动物物种对象中引发免疫应答的方法，其包括：
将有效量的免疫调节剂组合物施用于猪科动物物种对象，其中所述免疫调节剂组合物包含含有至少一个免疫刺激性CpG基序、至少一个非免疫刺激性CpG基序的核酸序列和阳离子脂质体。
2.权利要求1的方法，其中所述脂质体递送媒介物包含选自多层囊泡脂质和挤出脂质的脂质。
3.权利要求1的方法，其中所述脂质体递送媒介物包含选自N-[1-（2,3-二油基氧基）丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵（DOTMA）和胆固醇、N-[1-（2,3-二油酰基氧基）丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵（DOTAP）和胆固醇、1-[2-（油酰基氧基）乙基]-2-油基-3-（2-羟乙基）咪唑啉鎓氯化物（DOTIM）和胆固醇、以及二甲基双十八烷基溴化铵（DDAB）和胆固醇的脂质对。
4.权利要求1的方法，其中所述免疫调节剂组合物进一步包含生物制剂或与生物制剂组合施用。
5.权利要求1的方法，其中所述施用是在暴露于感染病原体之前。
6.权利要求1的方法，其中所述施用是在暴露于感染病原体之后。
7.权利要求1的方法，其中所述免疫调节剂组合物包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列具有至少80%序列同一性的核酸序列。
8.权利要求4的方法，其中所述生物制剂选自免疫增强子蛋白、免疫原、疫苗、抗微生物剂及其任何组合。
9.权利要求1的方法，其中所述猪科动物物种对象是食物生产猪类动物。
10.权利要求1的方法，其进一步包含药学上可接受的载体。
11.一种改善农场饲养猪的生产的方法，其包括向猪施用免疫调节剂组合物，其中所述免疫调节剂组合物包含含有至少一个免疫刺激性CpG基序的核酸序列和阳离子脂质体。
12.一种改善农场饲养猪的存活力的方法，其包括向猪施用免疫调节剂组合物，其中所述免疫调节剂组合物包含含有至少一个免疫刺激性CpG基序的核酸序列和阳离子脂质体。
13.一种减少猪中的腹泻的方法，其包括向所述猪施用有效量的免疫调节剂组合物，其中所述免疫调节剂包含：
a. 阳离子脂质递送媒介物；和
b. 不编码免疫原的核酸分子，其中所述施用减少在用大肠杆菌攻击后所述猪中的腹泻。
14.权利要求13的方法，其中所述核酸分子是细菌衍生的核酸载体或其片段。
15.权利要求13的方法，其中所述核酸分子是DNA质粒。
16.权利要求13的方法，其中所述脂质体递送媒介物包含选自N-[1-（2,3-二油基氧基）丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵（DOTMA）和胆固醇、N-[1-（2,3-二油酰基氧基）丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵（DOTAP）和胆固醇、1-[2-（油酰基氧基）乙基]-2-油基-3-（2-羟乙基）咪唑啉鎓氯化物（DOTIM）和胆固醇、以及二甲基双十八烷基溴化铵（DDAB）和胆固醇的脂质对。
17.权利要求13的方法，其中施用在用大肠杆菌的所述攻击之前发生。
18.权利要求13的方法，其中所述免疫调节剂组合物进一步包含生物制剂或与生物制剂组合施用。
19.一种增强猪中的重量增加的方法，其包括向所述猪施用免疫调节剂组合物，所述免疫调节剂包含：
a. 阳离子脂质递送媒介物；和
b. 不编码免疫原的核酸分子，其中所述施用增强在猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）攻击后所述猪中的重量增加。
20.权利要求18的方法，其中所述核酸分子是细菌衍生的核酸载体或其片段。
21.权利要求18的方法，其中所述核酸分子是DNA质粒。
22.权利要求18的方法，其中所述脂质体递送媒介物包含选自N-[1-（2,3-二油基氧基）丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵（DOTMA）和胆固醇、N-[1-（2,3-二油酰基氧基）丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵（DOTAP）和胆固醇、1-[2-（油酰基氧基）乙基]-2-油基-3-（2-羟乙基）咪唑啉鎓氯化物（DOTIM）和胆固醇、以及二甲基双十八烷基溴化铵（DDAB）和胆固醇的脂质对。
23.权利要求18的方法，其中施用在用PRRSV的所述攻击之前发生。
24.权利要求18的方法，其中所述免疫调节剂组合物进一步包含生物制剂或与生物制剂组合施用。
25.权利要求23的方法，其中所述生物制剂是PRRSV疫苗。
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