CN108379576A - 牛物种中增强的免疫应答 - Google Patents

Abstract

本发明涉及牛物种中增强的免疫应答。本发明涉及免疫激活方法，其在牛物种的成员中有效引发非抗原特异性免疫应答。所述方法特别有效保护牛物种的成员免患传染病并且治疗患有传染病的动物。

Description

牛物种中增强的免疫应答

本申请是申请日为2011年12月20日的中国专利申请201180066905.3“牛物种中增强的免疫应答”的分案申请。

技术领域

本发明涉及在牛物种的成员中的免疫激活方法。具体而言，本发明包括引发全身性的、非特异性的和抗原特异性的免疫应答的方法，其用于动物施用和针对传染病的保护。

背景技术

牛是多种类型的病毒感染、细菌感染和寄生虫感染的首要目标。现代生产实践如牛肉和乳品产业中的牛的断乳、牛的运输、恶劣天气和营养需求也可以成为引起疾病发生的风险因素。牛呼吸性疾病(BRD)或如其通常被称为牛呼吸性疾病复合症发生在乳牛和肉牛中，并且是全世界牛产业经济损失的主要原因之一。这些损失是由于发病率、死亡率、降低的体重增加、治疗和预防费用、牛乳生产的损失和对畜体特征(carcasscharacteristics)的负面影响。

认为BRD的发病来自伴随有传染病原体的上文描述的多种环境和生理应激物。认为溶血曼海姆菌(Mannheimiahaemolytica)(溶血巴斯德氏菌(Pasteurellahaemolytica))、多杀性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)和睡眠嗜组织菌(Histophilus somni)(之前为睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus))是牛上呼吸道的正常菌群的一部分。相反，下呼吸道是相对无菌的环境，其由大量旨在阻止微生物进入的免疫途径所维护。当牛经受环境和生理应激物时，动物的先天和获得性免疫功能妥协，由此允许这些上述生物增殖并随后定殖于下呼吸道。已知各种牛病毒在肺中具有免疫抑制作用，如传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV、IBR或BHV 1)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)和副流感病毒3型(PI3)。然而，到目前为止，溶血曼海姆菌是BRD病例中最流行的细菌性病原体。

BRD目前的预防和治疗由向到达饲养场后的牛群施用抗生素(即metaphylaxis)、对病牛的抗生素治疗和针对BRD病毒及包括溶血曼海姆菌在内的细菌的接种组成。

目前的接种程序和药物疗法在如今的牛中不是最适于控制BRD存在不同原因。首先，宿主防御系统在抗击牛中的传染病中起主要的作用。常规治疗包括抗生素的施用来治疗或控制细菌感染。然而，还不存在针对病毒感染可用的批准的药物治疗。对于BRD，在大部分情况下不仅存在细菌感染还存在病毒感染。第二，接种时机常常是次优的。要使呼吸道疫苗最有效，产品应该在应激或运输之前2-4周施用，并且这通常在商品化牛生产中是不可行的。施用疫苗太早或太晚以致于无法达到最有效。

因此，存在对于刺激免疫系统并且建立攻击应答以降低或消除导致疾病的生物的方法的需要。重要的是该方法要易于施用，单独或与疫苗组合起作用，或帮助使此类疫苗更为有效，具有更长的持续时间或不需要增加注射以使免疫力最大化。本发明提供了在牛物种中引发非抗原特异性免疫应答的方法，其易于施用，单独或与疫苗组合起作用，诱导针对一种或多种传染病原体的保护性应答。

附图说明

图1.1图示说明根据如实施例1中描述施用的免疫调节剂的剂量的平均直肠温度数据。

图1.2图示说明根据如实施例1中描述施用的免疫调节剂的剂量的平均每日体重增加数据。

图1.3图示说明关于如实施例1中描述施用的免疫调节剂的剂量的模型修正的肺损伤得分。

图2.1图示说明根据如实施例2中描述施用的免疫调节剂的剂量的平均直肠温度数据。

图2.2图示说明根据如实施例2中描述施用的免疫调节剂的剂量的平均每日体重增加数据。

图2.3图示说明关于如实施例2中描述施用的免疫调节剂的剂量的模型修正的肺损伤得分。

图3.1图示说明关于如实施例3中描述施用的免疫调节剂的剂量的模型修正的肺损伤得分。

图3.2图示说明关于如实施例3中描述免疫调节剂施用日的模型修正的肺损伤得分。

图4.1图示说明如实施例4中描述受治疗组保护的动物的百分比。

图4.2图示说明如实施例4中描述受治疗组(<1%肺损伤和无肺损伤)保护的动物的百分比。

图5.1图示说明如实施例5中描述对于6个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言感染有BHV-1的细胞中的CD 25 EI表达指数(y轴)的测量值。

图5.2图示说明如实施例5中描述对于6个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言感染有BRSV的细胞中的CD 25 EI表达指数(y轴)的测量值。

图5.3图示说明如实施例5中描述对于6个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言感染有BVDV 1型的细胞中的CD 25 EI表达指数(y轴)的测量值。

图5.4图示说明如实施例5中描述对于6个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言感染有BVDV 2型的细胞中的CD 25 EI表达指数(y轴)的测量值。

图5.5图示说明如实施例5中描述对于6个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言感染有BHV-1的细胞中的IFNγ表达指数(y轴)的测量值。

图5.6图示说明如实施例5中描述对于6个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言感染有BRSV的细胞中的IFNγ表达指数(y轴)的测量值。

图5.7图示说明如实施例5中描述对于6个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言感染有BVDV 1型的细胞中的IFNγ表达指数(y轴)的测量值。

图5.8图示说明如实施例5中描述对于6个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言感染有BVDV 2型的细胞中的IFNγ表达指数(y轴)的测量值。

图5.9图示说明如实施例5中描述对于6个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言感染有BHV-1的细胞中的IL-4表达指数(y轴)的测量值。

图5.10图示说明如实施例5中描述对于6个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言感染有BRSV的细胞中的IL-4表达指数(y轴)的测量值。

图5.11图示说明如实施例5中描述对于6个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言感染有BVDV 1型的细胞中的IL-4表达指数(y轴)的测量值。

图5.12图示说明如实施例5中描述对于6个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言感染有BVDV 2型的细胞中的IL-4表达指数(y轴)的测量值。

图5.13图示说明如实施例5中描述对于6个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言感染有BVDV 1型的细胞中的模型修正血清抗体滴度估计值(y轴)。

图5.14图示说明如实施例5中描述对于6个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言感染有BVDV 2型的细胞中的模型修正血清抗体滴度估计值(y轴)。

图5.15图示说明如实施例5中描述对于6个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言感染有BHV-1的细胞中的模型修正血清抗体滴度估计值(y轴)。

图5.16图示说明如实施例5中描述模型修正的平均每日增加结果。

图6.1图示说明如实施例6中描述治疗组的BHV1 SNT滴度。

发明内容

本发明的在牛物种的成员中引发免疫应答的方法包括向牛物种的成员施用有效量的免疫调节剂组合物以引发免疫应答。免疫调节剂组合物包括脂质体递送载体和至少一种核酸分子。此外，当在此类疫苗之前施用，与此类疫苗共同施用，接种后施用或与疫苗混合时，免疫调节剂引发非抗原特异性免疫应答，其单独有效或者增强至少一种生物制剂如疫苗的作用。

该方法提供了保护牛物种免患传染病并且治疗患有传染病的群体的新的治疗策略。最后，当免疫调节剂与疫苗组合使用时，本发明的方法提供了针对疾病更快速、更长期并且更好的保护。

1. 组合物

a. 免疫调节剂

在本发明的一个实施方案中，免疫调节剂组合物包括脂质体递送载体和至少一种核酸分子，如美国专利号6,693,086所述，其通过引用并入本文。

合适的脂质体递送载体包括能够将核酸分子递送到被治疗的受试者组织的脂质组合物。脂质体递送载体优选能够在受试者中保持足够量时间的稳定以递送核酸分子和/或生物制剂。在一个实施方案中，脂质体递送载体在受体受试者中稳定至少约5分钟。在另一个实施方案中，脂质体递送载体在受体受试者中稳定至少约1小时。在仍另一个实施方案中，脂质体递送载体在受体受试者中稳定至少约24小时。

本发明的脂质体递送载体包括脂质组合物，其能够与细胞的质膜融合以将核酸分子递送入细胞。在一个实施方案中，当递送时，本发明的核酸∶脂质体复合物为至少约1皮克(pg) 表达的蛋白/每毫克(mg)总组织蛋白/每微克(μg)递送的核酸。在另一个实施方案中，核酸∶脂质体复合物的转染效率是至少约10 pg表达的蛋白/每mg总组织蛋白/每 μg递送的核酸；并且在仍另一个实施方案中，至少约50 pg表达的蛋白/每mg总组织蛋白/每 μg递送的核酸。复合物的转染效率可以低至1毫微微克(fg) 表达的蛋白/每mg总组织蛋白/每 μg递送的核酸，上述量是更优选的。

本发明优选的脂质体递送载体是直径约100到500纳米(nm)，在另一个实施方案中，直径约150到450 nm和在仍另一个实施方案中，直径约200到400 nm。

合适脂质体包括任何脂质体，例如常用于，例如，本领域技术人员已知的基因递送方法的脂质体。优选的脂质体递送载体包括多层脂质体(multilamellar vesicle，MLV)脂质和挤压的脂质。用于制备MLV的方法是本领域熟知的。更优选的脂质体递送载体包括具有聚阳离子脂质组合物的脂质体(即阳离子脂质体)和/或具有与聚乙二醇缀合的胆固醇主链的脂质体。示例性的阳离子脂质体组合物包括但不限于N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)和胆固醇、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)和胆固醇、1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)和胆固醇、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)和胆固醇以及其组合。用作递送载体的最优选脂质体组合物包括DOTIM和胆固醇。

合适的核酸分子包括任何核酸序列例如编码或非编码序列，以及DNA或RNA。编码核酸序列编码蛋白或肽的至少一部分，而非编码序列不编码蛋白或肽的任何部分。根据本发明，“非编码”核酸可以包括转录单位的调节区，例如启动子区。术语“空载体”可以与术语“非编码”互换使用，并且具体指不存在蛋白编码部分的核酸序列，例如不含基因插入片段的质粒载体。由核酸分子编码的蛋白表达不是引起非抗原特异性免疫应答所必需的；因此所述核酸分子不是必须可操作地连接至转录调控序列。然而，通过在组合物中包括编码免疫原和/或细胞因子的核酸序列(DNA或RNA)可以获得进一步的优势(即抗原特异和增强的免疫力)。

可以使用本领域标准的方法或美国专利号6,693,086(通过引用并入本文)描述的方法实现脂质体与核酸分子的复合。添加到脂质体的核酸分子的合适浓度包括能够有效将足够量的核酸分子递送入受试者的浓度，从而引发全身性的免疫应答。在一个实施方案中，约0.1 μg至约10 μg核酸分子与约8 nmol脂质体组合，在另一个实施方案中，约0.5 μg至约5 μg核酸分子与约8 nmol脂质体组合，并且在仍另一个实施方案中，约1.0 μg核酸分子与约8 nmol脂质体组合。在一个实施方案中，组合物中核酸与脂质的比例( μg核酸: nmol脂质)是按重量计至少约1:1核酸:脂质(即，1 μg核酸: 1 nmol脂质)，并且在另一个实施方案中，至少约1:5，并且在仍另一个实施方案中，至少约1:10，并且在进一步的实施方案中，至少约1:20。本文表述的比例基于组合物中阳离子脂质的量，而不是基于组合物中脂质的总量。在另一个实施方案中，本发明组合物中核酸与脂质的比例是按重量计约1:1至约1:80核酸:脂质；并且在另一个实施方案中，按重量计约1:2至约1:40核酸:脂质；并且在进一步的实施方案中，按重量计约1:3至约1:30核酸:脂质；并且在仍另一个实施方案中，按重量计约1:6至约1:15核酸:脂质。

b. 生物制剂

在本发明的另一个实施方案中，免疫调节剂包括脂质体递送载体、核酸分子和至少一种生物制剂。

合适的生物制剂是有效预防或治疗牛疾病的制剂。此类生物制剂包括免疫增强蛋白、免疫原、疫苗、抗微生物剂或其任何组合。合适的免疫增强蛋白是已知增强免疫的那些蛋白。作为非限制性的实例，包括蛋白家族的细胞因子是已知增强免疫的蛋白家族。合适的免疫原是引发体液和/或细胞免疫应答的蛋白，从而使向受试者施用免疫原获得针对在受试者的组织内遇到的相同或类似蛋白的免疫原特异性免疫应答。免疫原可以包括由细菌、病毒、寄生虫或真菌表达的致病性抗原。优选的抗原包括在受试者中导致传染病的抗原。根据本发明，免疫原可以是天然存在或合成来源的蛋白的任何部分，其引发体液和/或细胞免疫应答。因此，抗原或免疫原的大小可以是小至约5-12个氨基酸，并且大至全长蛋白，包括这两者之间的大小。抗原可以是多聚体蛋白或融合蛋白。抗原可以是衍生自天然或重组细胞的纯化的肽抗原。免疫增强蛋白和免疫原的核酸序列可操作地连接至转录调控序列，从而使免疫原在受试者组织中表达，由此在受试者中引发除非特异性免疫应答之外的免疫原特异性免疫应答。

在本发明的另一个实施方案中，生物制剂是疫苗。疫苗可以包括活的、传染性的、病毒的、细菌的或寄生虫疫苗或者杀死的、灭活的、病毒的、细菌的或寄生虫疫苗。在一个实施方案中，一种或多种疫苗、活的或杀死的病毒疫苗可以与本发明的免疫调节剂组合物组合使用。合适的疫苗包括本领域中已知的用于牛物种的疫苗。示例性疫苗包括而不限于本领域中用于针对传染性牛鼻气管炎(IBR)(1型牛疱疹病毒(BHV1))、副流感病毒3型(PI3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV 1型和2型)、睡眠嗜组织菌、牛支原体(Mycoplasma bovis)和本领域中已知的其它疾病进行保护的疫苗。在一个示例性的实施方案中，用于针对溶血曼海姆菌进行保护的疫苗可以与本发明的免疫调节剂组合物组合使用。

在本发明的仍另一个实施方案中，生物制剂是抗微生物剂。合适的抗微生物剂包括：喹诺酮类，优选氟喹诺酮类、β-内酰胺类和大环内酯-链阳性菌素-林可酰胺类(MLS)抗生素。

合适的喹诺酮类包括培诺沙星、宾氟沙星、西诺沙星、环丙沙星、克林沙星、达氟沙星、二氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、氟罗沙星、吉米沙星、依巴沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、麻保沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、奥比沙星、帕珠沙星、普多沙星、培氟沙星、替马沙星、托氟沙星、沙拉沙星、吉米沙星和司巴沙星。优选的氟喹诺酮类包括环丙沙星、恩诺沙星、莫西沙星、达氟沙星和普多沙星。合适的萘啶酮类包括萘啶酮酸。

合适的β-内酰胺类包括青霉素类，如苄星青霉素、苄青霉素(青霉素G)、苯氧甲基青霉素(青霉素V)、普鲁卡因青霉素、甲氧西林、苯唑西林、萘夫西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、替莫西林、阿莫西林、氨苄西林、复合阿莫西克拉维(阿莫西林和克拉维酸)、阿洛西林、羧苄西林、替卡西林、美洛西林、哌拉西林；头孢菌素类，如头孢洛宁、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢匹林、头孢喹肟、头孢噻呋、头孢噻吩、头孢克洛、头孢呋辛、头孢孟多、defotetan、头孢西丁、头孢曲松、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢克肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢匹罗；碳青霉烯类和青霉烯类，如亚胺培南、美罗培南、厄他培南、法罗培南、多尼培南，单环内酰胺类，如氨曲南(菌克单)、替吉莫南、诺卡杀菌素A、tabtoxinine-B-内酰胺；和β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、他唑巴坦和舒巴坦。优选的β-内酰胺类包括头孢菌素类，具体为头孢唑啉。

优选的MLS抗生素包括任何大环内酯、林可霉素、克林霉素、吡利霉素。优选的林可酰胺是吡利霉素。

其它抗微生物剂包括2-吡啶酮类、四环素类、磺胺类、氨基苷类、甲氧苄啶、地美硝唑、红霉素、新霉素B、呋喃唑酮，多种截短侧耳素类如硫姆林、伐奈莫林，多种链霉素、氯吡多、沙利霉素、莫能星、卤夫酮、甲基盐霉素、罗贝胍等。

2. 方法

a. 免疫刺激的方法

在本发明的一个实施方案中，通过给牛物种的成员施用有效量的免疫调节剂组合物在牛物种的成员中引发免疫应答。有效量足以在牛物种的成员中引发免疫应答。免疫调节剂包括脂质体递送载体和核酸分子。

在一个实施方案中，免疫调节剂的有效量为约1微克至约1000微克/每只动物。在另一个实施方案中，免疫调节剂的有效量为约5微克至约500微克/每只动物。在仍另一个实施方案中，免疫调节剂的有效量为约10微克至约100微克/每只动物。在进一步的实施方案中，免疫调节剂的有效量为约10微克至约50微克/每只动物。

在本发明的另一个实施方案中，通过施用有效量的免疫调节剂在牛物种的成员中引发免疫应答，所述免疫调节剂包括脂质体递送载体、分离的核酸分子和生物制剂。考虑生物制剂可以与免疫调节剂混合或共同施用，或者其独立施用。独立施用可以在免疫调节剂施用之前或之后。还考虑可以使用免疫调节剂或生物制剂的多于一次施用以扩大增强的免疫。此外，多于一种生物制剂可以与免疫调节剂共同施用，在免疫调节剂之前施用，在免疫调节剂施用之后施用，或者同时施用。

b. 疾病

本发明的方法在受试者中引发免疫应答，从而使受试者受到保护免患易受引发免疫应答治疗的疾病。如本文所用，短语“保护免患疾病”指减轻疾病的症状；降低疾病的发生，并且减轻疾病的临床严重性或病理严重性，或者降低导致疾病的病原体的脱落。保护受试者可以指本发明的治疗组合物当向受试者施用时预防疾病发生、治疗和/或减缓或减轻疾病症状、临床体征、病理学或原因的能力。BRD的临床体征的实例包括肺损伤、升高的体温、抑郁(如食欲缺乏、对外部刺激降低的应答、下垂的耳部)、流鼻涕和呼吸特征(如呼吸速率、呼吸努力)。因此，保护牛物种的成员免患疾病包括预防疾病发生(预防处理)和治疗患有疾病的牛物种的成员(治疗处理)。具体而言，保护受试者免患疾病通过在牛物种的成员中引发免疫应答而诱导有益的或保护性免疫应答来完成，所述免疫应答在某些情况下还可以压制、降低、抑制或阻断过度激活的或有害的免疫应答。术语“疾病”指牛物种的成员的正常健康的任何偏离，并且包括当存在疾病症状时的状态以及其中已发生偏离(如感染、基因突变、遗传缺陷等)但症状仍未显现的状况。

本发明的方法可以用于预防疾病、刺激针对疾病的效应细胞免疫、消除疾病、减缓疾病和预防由原发性疾病的发生导致的继发性疾病。

相比于单独施用疫苗，当与疫苗共同施用时，本发明还可以改善动物的获得性免疫应答。由于需要时间来刺激获得性免疫，因此通常疫苗施用一次不会立即保护动物。术语“改善”在本发明中指在动物中引发先天免疫应答直到疫苗开始保护动物和/或经过由疫苗给予的获得性免疫来延长保护期间。

本发明的方法包括施用组合物来提供针对广泛种类病原体的感染的保护。施用的组合物可以包括或可以不包括引发特异性应答的特异性抗原。考虑本发明的方法将保护受体受试者免患由传染性微生物病原体导致的疾病，所述传染性微生物病原体包括而不限于病毒、细菌、真菌和寄生虫。示例性的病毒传染病包括而不限于由传染性牛鼻气管炎(IBR)(1型牛疱疹病毒(BHV1))、副流感病毒3型(PI3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV 1型和2型)、牛腺病毒、牛冠状病毒(BCV)、牛嵌杯样病毒、牛细小病毒、BHV4、牛呼肠孤病毒、牛肠道病毒、牛鼻病毒、恶性卡他热病毒、牛白血病病毒、狂犬病病毒、水泡性口膜炎病毒(VSV)、蓝舌病(环状病毒)、其重组体和本领域中已知的其它病毒感染导致的病毒传染病。示例性的细菌感染包括而不限于由革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌和分枝杆菌如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、多杀性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、鹌鹑梭菌(Clostridium colinum)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、诺氏梭菌(Clostridium novyi)、肖氏梭菌(Clostridium chauveoi)、败毒梭菌(Clostridium septicum)、溶血梭菌(Clostridium hemolyticum)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、溶血曼海姆菌(Mannheimia haemolytica)、差异尿支原体(Ureaplasma diversum)、殊异支原体(Mycoplasma dispar)、牛支原体(Mycoplasma bovis)、牛鼻支原体(Mycoplasma bovirhinis)、睡眠嗜组织菌(Histophilus somni)、胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、钩端螺旋体属种(Leptospira spp.)、化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthrax)、坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)、梭杆菌属种(Fusobacterium spp.)、密螺旋体属种(Treponema spp.)、棒杆菌属(Corynebacterium)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)、分枝杆菌属种(Mycobacterium spp.)、嗜组织菌属种(Histophilus spp.)、莫拉氏菌属种(Moraxella spp.)、缪勒属种(Muellerius spp.)、支原体属种(Mycoplasma spp.)、沙门氏菌属种(Salmonella spp.)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)和本领域已知的其它细菌感染导致的细菌感染。示例性的真菌或霉菌感染包括而不限于由放线细菌属种(Actinobacterim spp.)、曲霉属种(Aspergillus spp.)和组织滴虫属种(Histomonas spp.)和本领域已知的其它传染性真菌或霉菌感染导致的真菌或霉菌感染。示例性的寄生虫包括而不限于新孢子虫属种(Neospora spp.)、毛圆线虫属(Trichostrongylus)、古柏线虫属(Cooperia)、无形体属种(Anaplasma spp)、巴贝虫属种(Babesia spp)、足螨属种(Chorioptes spp)、囊尾蚴属种(Cysticercus spp)、嗜皮菌属种(Dermatophilus spp)、牛毛虱(Damalinia bovis)、Dictylocaulus spp、艾美球虫属种(Eimeria spp)、附红细胞体属种(Eperythrozoon spp)、血矛线虫属种(Haemonchus spp)、蜱蝇属种(Melophagus spp)、缪勒线虫属种(Muellerius spp)、细颈线虫属种(Nematodirus spp)、狂蝇属种(Oestrus spp)、奥斯特线虫属种(Ostertagia spp)、痒螨属种(Psoroptes spp)、疥螨属种(Sarcoptes spp)、蛇形菌属种(Serpens spp)、类圆线虫属种(Strongyloides spp)、弓形体属种(Toxoplasma spp)、鞭形线虫属种(Trichuris spp)、毛癣菌属种(Trichophyton spp)和三毛滴虫属种(Tritrichomas spp)、拟片吸虫属种(Fascioloides spp)、边缘无形体(Anaplasma marginale)和本领域已知的其它寄生虫。

c. 受试者

本发明的方法可以向牛物种的任何受试者或成员施用，无论其是驯养的或野生的。具体而言，它可以向商业化饲养用于育种、肉类或乳类生产的那些受试者施用。合适的牛受试者包括而不限于羚、水牛、牦牛、牛和野牛。在一个实施方案中，牛物种的成员是牛。牛的物种包括而不限于奶牛、公牛、肉用公牛、小母牛、去势公牛、肉牛或乳牛。技术人员将理解本发明的方法将在很大程度上有利于饲养用于育种、肉类或乳类生产的牛，由于它们尤其容易环境暴露于传染病原体。

d. 施用

多种施用途径是可用的。所选的具体方式当然将取决于选择的具体生物制剂、受试者的年龄和总体健康状况、待治疗的具体状况和治疗效力所需的剂量。本发明的方法可以使用任何施用方式来实施，其产生有效水平的免疫应答而不引起临床上无法接受的副作用。所述组合物可以方便地存在于单位剂型中，并且可以通过本领域熟知的任何方法制备。

可以在任何年龄进行牛物种的接种。疫苗可以静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、通过喷雾/气溶胶、口服、眼内、气管内、鼻内或通过本领域已知的其它方法来施用。此外，考虑本发明的方法可以基于常规接种程序表使用。免疫调节剂也可以静脉内、肌内、皮下、通过喷雾、口服、眼内、气管内、鼻内或通过本领域已知的其它方法来施用。在一个实施方案中，免疫调节剂为皮下施用。在另一个实施方案中，免疫调节剂为肌内施用。在仍另一个实施方案中，免疫调节剂作为喷雾施用。在进一步的实施方案中，免疫调节剂为口服施用。

在一个实施方案中，免疫调节剂在攻击(或感染)之前单独向动物施用。在另一个实施方案中，免疫调节剂在攻击(或感染)之后单独向动物施用。在仍另一个实施方案中，免疫调节剂在攻击(或感染)的同时单独向动物施用。在进一步的实施方案中，免疫调节剂组合物在攻击之前接种的同时共同施用。在仍进一步的实施方案中，免疫调节剂组合物在攻击(或感染)的同时接种的同时共同施用。共同施用可以包括在动物的相同一般部位上彼此相邻的两个不同位点上(即在动物的颈部上彼此相邻地注射)、在动物的相对侧面的相同一般部位上(即颈部每一侧上一次)、或在相同动物的不同部位上施用疫苗和免疫调节剂。在另一个实施方案中，免疫调节剂组合物在接种和攻击之前施用。在进一步的实施方案中，免疫调节剂组合物在接种后但在攻击之前施用。在进一步的实施方案中，免疫调节剂组合物在攻击后向已在攻击(或感染)之前接种的动物施用。

在一个实施方案中，免疫调节剂在攻击之前约1天至约14天或攻击后约1天至约14天施用。在另一个实施方案中，免疫调节剂在攻击之前约1天至约7天或攻击后约1天至约7天施用。在仍另一个实施方案中，免疫调节剂在攻击之前1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或攻击后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天施用。

其他递送系统可以包括定时释放、延迟释放或缓慢释放的递送系统。这类系统可以避免组合物的重复施用，从而增加便利性。许多类型的释放递送系统是可用的，并且为本领域普通技术人员所知。它们包括基于聚合物的系统例如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己酸内酯、聚酰胺酯、聚正酯、聚羟基丁酸和聚酐。包含药物的上述聚合物的微胶囊描述于，例如美国专利号5,075,109。递送系统还包括非聚合物系统，其是脂质，包括甾醇例如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪例如单-双和三甘油酯；水凝胶释放系统；硅橡胶(sylastic)系统；基于肽的系统；蜡质涂层；使用常规结合剂和赋形剂的压制片剂；部分融合的植入物；等等。具体实例包括但不限于侵蚀系统(其中本发明的制剂包含在基质内形式中，例如描述于美国专利号4,452,775、4,675,189和5,736,152中的那些)和弥散系统(其中活性成分以受控速率从聚合物渗透，例如描述于美国专利号3,854,480、5,133,974和5,407,686)。此外，可以使用基于泵的硬件递送系统，其中一些适于植入。

因为在不背离本发明范围的情况下可以对上述组合物、产品和方法进行多种变化，所以旨在上文描述和下文给出的实施例中包含的所有内容均应被解释为说明性而非限制性的涵义。

定义

术语“有效量”指必需或足以实现所需生物效应的量。例如，用于治疗或预防传染病的免疫调节剂的有效量是暴露于微生物后引发免疫应答的发生所必需的量，从而造成受试者内微生物量的降低并且优选根除微生物。对于任何具体应用的有效量可以根据因素如待治疗的疾病或状况、受试者的大小或疾病或状况的严重性而变化。本领域普通技术人员无需过度实验，通过经验就可以确定免疫调节剂的有效量。

术语“细胞因子”是指免疫增强的蛋白家族。细胞因子家族包括造血生长因子、白介素、干扰素、免疫球蛋白超家族分子、肿瘤坏死因子家族分子和趋化因子(即调节细胞具体是吞噬细胞的迁移和活化的蛋白)。示例性的细胞因子包括而不限于白介素-2 (IL-2)、白介素-12 (IL12)、白介素-15 (IL-15)、白介素-18 (IL-18)、干扰素-α (IFNα)和干扰素-γ (IFNγ)。

术语“引发”可以与术语活化、刺激、产生或上调互换使用。

术语在受试者中“引发免疫应答”是指特异性控制或影响免疫应答的活性，并且可以包括活化免疫应答、上调免疫应答、增强免疫应答和/或改变免疫应答(例如通过引发一类免疫应答，其进而将受试者中免疫应答的优势类型从有害或无效的类型转变为有益或保护性的类型)。

术语“可操作地连接”是指以这样的方式将核酸分子连接到转录调控序列，从而使当被转染(即转化、转导或转染)入宿主细胞时所述分子被能够表达。转录调控序列是控制转录的起始、延伸和终止的序列。尤其重要的转录调控序列是控制转录起始的那些序列，例如启动子、增强子、操纵子和抑制子序列。多种此类转录调控序列是本领域技术人员已知的。优选的转录调控序列包括在禽、鱼、哺乳动物、细菌、植物和昆虫细胞中起作用的转录调控序列。尽管本发明可以使用任何转录调控序列，所述序列可以包括天然存在的转录调控序列，其与编码免疫原或免疫刺激蛋白的序列天然结合。

术语“核酸分子”和“核酸序列”可以互换使用，并且包括DNA、RNA、或DNA或RNA的衍生物。术语还包括寡核苷酸和更大的序列，包括编码蛋白或其片段的核酸分子以及包含调节区、内含子或其它非编码DNA或RNA的核酸分子。通常，寡核苷酸具有长度为约1到约500个核苷酸的核酸序列，并且更常见的，长度为至少约5个核苷酸。核酸分子可以来源于任何来源，包括哺乳动物、鱼、细菌、昆虫、病毒、植物或合成来源。核酸分子可以通过本领域通常已知的方法来产生，例如重组DNA技术(例如，聚合酶链式反应(PCR)、扩增、克隆)或化学合成。核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括但不限于天然等位基因变体和修饰的核酸分子，其中已经以这样的方式插入、缺失、取代或倒置核苷酸，从而使此类修饰基本上不干扰核酸分子编码可用于本发明方法的免疫原或免疫刺激蛋白的能力。核酸同源物可以使用本领域技术人员已知的大量方法来产生(参见，例如，Sambrook等, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989)，其通过引用并入本文。筛选免疫原性例如病原体抗原免疫原性或细胞因子活性的技术是本领域技术人员已知的，并且包括多种体外和体内测定。

具体实施方式

实施例

以下实施例阐明本发明的各个实施方案。

实施例1. 在发生天然的牛呼吸性疾病之前或之后接受DNA免疫调节剂的牛的评价。

该研究的目的是确定发生BRD的天然情况之前和之后向牛犊施用的DNA免疫调节剂的效力。

免疫调节剂

该研究中使用的免疫调节剂是包含阳离子脂质和非编码DNA的组合物。配制合成的免疫调节剂脂质组分[1-[2-[9-(Z)-十八碳烯酰基氧基]]-2-[8](Z)-十七碳烯基]-3-[羟乙基]咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)和合成的中性脂质胆固醇，以产生直径大约200 nm的脂质体(参见，美国专利6,693,086)。所述DNA组分是在大肠杆菌中产生的4242个碱基对的非编码DNA质粒，其带负电，与带正电(阳离子)的脂质体结合(参见，美国专利6,693,086)。

研究动物

从没有呼吸性疾病当前病史的牛群中选取84只断乳年龄的荷尔斯泰因去势牛犊。最初评价每个牛犊个体并确定其处于良好的健康状态。将84只牛犊分成7个治疗组，每组各12只牛犊。在该研究中仅包括没有针对溶血曼海姆菌接种疫苗的动物。动物在施用DNA免疫调节剂之前的30天内均不曾接受过抗微生物剂。

如下文表1.1中所示，在治疗当天向治疗组施用不同剂量的上述DNA免疫调节剂。在表1.2中提供了DNA免疫调节剂的稀释方案。从牛犊的肌内和颅至左肩、腹部至项韧带和尾背至颈静脉沟施用所述DNA免疫调节剂。

如下文所指，治疗第-1天指最初选择后研究的开始日期，在所述最初选择中评价所述牛犊并确定其适合于该研究。治疗第0天是继第-1天之后的一天，以此类推。

表1.1. 免疫调节剂的施用程序表

在第0天的早晨观察到大部分的牛犊经受了不同水平的BRD。到第5天时，观察到研究群体中剩余的所有牛犊已经满足了BRD发病率的病例定义。只有在因为严重的BRD指示使用安乐死的时候，牛才从研究群体中去除。没有观察到其它传染/非传染病并由此需要在该研究中去除。

评价

在研究的第1-5天，评价牛犊的各种健康指标。例如，在该研究期内每天测定每只牛犊的直肠温度和平均每日体重。从第1天到第5天每天大约在同一时间(+/- 3小时)评价动物。图1.1和1.2呈现了根据所施用免疫调节剂的剂量的直肠温度的平均值和平均每日体重增加。

在第5天，对所有的牛犊实施安乐死并进行尸体解剖。在尸体解剖时测定每个牛犊个体的肺损伤得分(基于通过视觉检查和手工触诊评价的肺实变(consolidation)程度)。

图1.3呈现了关于所施用免疫调节剂的剂量的肺损伤得分。在第-1天和第0天时，施用每一天的整体肺损伤得分分别是约11%和14%。对于500、200、50和阴性对照组而言，分别展示了11.2%、9.0%、10.8%和19.9%的肺损伤得分。对照组和治疗组(200 μg)之间的最大差异是约11%的降低。

图1.3中的模型修正的估计值反映了这样的原始平均值，其对所有统计模型共变量(即剂量、天和剂量x天)以及其中在整个研究期间圈养牛犊的围栏进行修正。因此，模型修正的估计值与原始平均值相比可以表现出差异。

还进行了后续的细菌学(肺培养物)和病毒学(鼻拭子)。在第5天处以安乐死的剩余牛犊(69)中，发现11.6%的牛犊在鼻分泌物中脱落牛疱疹病毒1型(BHV-1)。对于来自所有研究动物的肺培养物，41%为Mh阳性，31.3%为多杀性巴斯德氏菌(Pm)培养阳性，10.8%为Mh和Pm均培养阳性，并且在整个研究群体中没有分离到睡眠嗜组织菌。在该研究中没有进行牛支原体的培养。

结果

在该研究中，DNA免疫调节剂的剂量(即500 μg、200 μg和50 μg)在肺损伤得分中相比于阴性对照达到了显著降低(P=0.1284；见图1.3)。然而，DNA免疫调节剂施用日(即，第-1天或第0天)与肺损伤得分不显著相关。在DNA免疫调节剂的剂量组之间没有观察到肺损伤得分的统计学差异。直肠温度倾向于与DNA免疫调节剂的剂量显著相关(P=0.1190)，但与施用日不相关。就平均每日体重增加而言，在DNA免疫调节剂与阴性对照的剂量之间没有观察到明显的差异。

DNA免疫调节剂相比于阴性对照存在降低肺损伤的强烈倾向，由此提供该产品在BRD爆发过程中具有保护肺组织的潜能的证据。在该研究中，治疗施用日与肺损伤不相关，由此说明牛在与BRD相关的临床体征发生前一天还是在同一天接受DNA免疫调节剂均不重要。该结果是重要的，因为暴露于BRD病原体的时机在一般的生产系统中通常是未知的，并且由于牛在整个生产链中所经历的多种应激物的影响而进一步变得复杂。因此，在牛肉和乳品产业中为生产者提供这样的产品极其有价值，所述产品在与BRD发病相关的施用时机中提供灵活性。

实施例2. 在溶血曼海姆菌实验攻击的同时或之后一天接受DNA免疫调节剂的牛的评价

该研究的目的是确定在溶血曼海姆菌实验攻击的同时或之后一天向牛犊施用的DNA免疫调节剂的效力。

免疫调节剂

该研究中使用的免疫调节剂是上文实施例1中描述的组合物。

研究动物

从没有呼吸性疾病当前病史的牛群中选取84只断乳年龄和称重平均约为300磅 (136kg)的荷尔斯泰因去势牛犊。最初评价每个牛犊个体并确定其处于良好的健康状态。将84只牛犊分成7个治疗组，每组各12只牛犊。在该研究中仅包括没有针对溶血曼海姆菌接种疫苗的动物。动物在施用DNA免疫调节剂之前的30天内均不曾接受过抗微生物剂。如下文表2.1中所示，在治疗当天向治疗组施用不同剂量的DNA免疫调节剂。在表2.2中提供了DNA免疫调节剂的稀释方案。从牛犊的肌内和颅至左肩、腹部至项韧带和尾背至颈静脉沟施用所述DNA免疫调节剂。

如下文所指，治疗第0天指最初选择后研究的开始日期，在所述最初选择中评价牛犊并确定其处于良好的健康状态。治疗第1天是继第0天之后的一天，以此类推。

表2.1. 免疫调节剂和Mh攻击的施用程序表

实验攻击

在第0天，用共计3.12 x 10⁷个菌落形成单位(CFU)的溶血曼海姆菌攻击牛犊。通过呼吸道施用接种物。到第3天时，观察到研究群体中的所有牛犊已经满足了BRD发病率的病例定义。发病的中值日是一天。

评价

如在先前实施例中，在研究的第1-5天，评价牛犊的各种健康指标。在该研究期内每天测定每只牛犊的直肠温度和平均每日体重。在每天大约同一时间评价动物。图2.1和2.2呈现了与施用免疫调节剂的剂量相关的直肠温度的平均值和平均每日体重增加。

在第5天，对所有的牛犊实施安乐死并进行尸体解剖。根据实施例1中描述的方案在尸体解剖时测定每个牛犊个体的肺损伤得分。

图2.3呈现了与施用免疫调节剂的剂量相关的模型修正肺损伤得分。

结果

在该研究中，DNA免疫调节剂的剂量(即500 μg、200 μg和50 μg)相比于阴性对照显著降低肺损伤得分。然而，更低剂量(200 μg和50 μg)在降低肺损伤方面比500 μg剂量更胜一筹。DNA免疫调节剂施用日(即，第0天或第1天)与肺损伤得分不显著相关。在DNA免疫调节剂剂量组之间没有观察到肺损伤得分的统计学差异。与阴性对照相比，施用DNA免疫调节剂的牛犊中直肠温度显著降低，但与剂量不相关。就平均每日体重增加而言，在DNA免疫调节剂与阴性对照的剂量之间没有观察到明显的差异。

DNA免疫调节剂相比于阴性对照存在降低肺损伤的强烈倾向，由此提供该产品在BRD爆发过程中具有保护肺组织的潜能的证据。在该研究中，治疗施用日与肺损伤不相关，由此说明牛在与BRD相关的临床体征发生前一天还是在同一天接受DNA免疫调节剂均不重要。该结果是重要的，因为暴露于BRD病原体的时机在一般的生产系统中通常是未知的，并且由于牛在整个生产链中所经历的多种应激物的影响而进一步变得复杂。因此，在牛肉和乳品产业中为生产者提供这样的产品极其有价值，所述产品在与BRD发病相关的施用时机中提供灵活性。

实施例3. 在溶血曼海姆菌实验攻击的前两天或同时接受DNA免疫调节剂的牛的评价

该研究的目的是确定在溶血曼海姆菌实验攻击的前两天或同时向牛犊施用的DNA免疫调节剂的效力。

免疫调节剂

该研究中使用的免疫调节剂是上文实施例1中描述的组合物。

研究动物

从没有呼吸性疾病当前病史的牛群中选取96只称重平均约为800-1000磅 (363-454kg)的荷尔斯泰因去势牛犊。最初评价每个牛犊个体并确定其处于良好的健康状态。将96只牛犊分成8个治疗组，每组各12只牛犊。在该研究中仅包括没有针对溶血曼海姆菌接种疫苗的动物。动物在施用DNA免疫调节剂之前的30天内均不曾接受过抗微生物剂。如下文表3.1中所示，在治疗当天向治疗组施用不同剂量的DNA免疫调节剂。在表3.2中提供了DNA免疫调节剂的稀释方案。从牛犊的肌内和颅至左肩、腹部至项韧带和尾背至颈静脉沟施用所述DNA免疫调节剂。

如下文所指，治疗第-2天指向治疗组1-3施用所述免疫调节剂时研究的开始日期。治疗第0天是继第-2天之后的两天，以此类推。

表3.1. 免疫调节剂和Mh攻击的施用程序表

实验攻击

在第0天，用共计1.9 x 10¹⁰个CFUs攻击所述牛犊。通过呼吸道施用接种物。

评价

如在先前实施例中，在研究的第1-5天，评价牛犊的各种健康指标。在第5天，对所有的牛犊实施安乐死并进行尸体解剖。在尸体解剖时测定每个牛犊个体的肺损伤得分。

图3.1呈现了与施用免疫调节剂的剂量相关的模型修正肺损伤得分。图3.2呈现了与免疫调节剂施用日相关的模型修正肺损伤得分。

结果

在该研究中，DNA免疫调节剂的剂量(即200 μg、50 μg和25 μg)相比于阴性对照显著减少了肺损伤得分。然而，在DNA免疫调节剂的剂量组之间没有观察到肺损伤得分的统计学差异。DNA免疫调节剂施用日(即，第-2天和第0天)与肺损伤得分不显著相关。与第-2天相比，在第0天施用免疫调节剂时，观察到显著的肺损伤降低。

实施例4. 免疫调节剂与灭活Mh疫苗的Mh攻击共同施用

该研究的目的是确定与灭活Mh疫苗一起向经受溶血曼海姆菌实验攻击的牛犊共同施用的DNA免疫调节剂的效力。

免疫调节剂

该研究中使用的免疫调节剂是上文实施例1中描述的组合物。

研究动物

从没有呼吸性疾病当前病史的牛群中选取81只12周龄的荷尔斯泰因公牛牛犊。评价每个牛犊个体并确定其处于良好的健康状态。在该研究中仅包括没有针对溶血曼海姆菌接种疫苗的动物。动物在施用接种物之前的30天内均不曾接受过抗微生物剂。

实验感染和攻击

攻击或实验感染包括暴露于溶血曼海姆菌的接种物。对于第一种接种物，以1.7X10⁸/每只动物的浓度使用生物，而对于第二种接种物，以2.4X10¹⁰/每只动物的浓度使用所述生物。还利用喷雾通过另一呼吸道途径攻击所述动物。喷雾接种物中生物的浓度是1.9X10¹⁰/每只动物。

通过表3详细描述的12个治疗组测定向随后暴露于溶血曼海姆菌的牛犊施用的如上所述免疫调节剂的效力。

表4.3. 研究治疗组

油MH = 溶血曼海姆菌疫苗(Pulmo-Guard® PHM)

水MH = 溶血曼海姆菌疫苗(One Shot®)

NC =非混合的且非喷雾攻击的(用于背景总体病理学)

CC=接触且喷雾攻击的

SE=用作接种攻击(气管内攻击的)

除了SE和NC，所有动物均受喷雾攻击。

SC=注射的皮下途径

IM=注射的肌内途径

NA=不适用的

*T8组中的动物将在鼻内攻击后进行治疗。

在研究的第0天，向T1、T2和T12组中的所有动物皮下施用免疫调节剂。在第7天，向T3、T4和T5组皮下施用免疫调节剂。在第13天，向T6组皮下施用免疫调节剂，并向T7组肌内施用免疫调节剂。在第15天，向T8组皮下施用免疫调节剂。

接受疫苗的所有动物根据标签说明书进行接种。在淋巴结(颈)附近一起靠近施用免疫调节剂和疫苗－两次注射(一次注射疫苗，另一次注射免疫调节剂)。接受皮下途径注射的所有动物在下肩胛区的淋巴结附近注射。

在研究的第10天，将所有T11牛犊在货运拖车中运离场所大约24小时，以使牛犊应激。在研究的第11天，向所有T11动物经气管施用含有溶血曼海姆菌的20 mL接种物，4小时后用25 mL接种物对其进行施用。在研究的第14天，除T9外，将所有组混合并在货运拖车中运离场所大约24小时，以使牛犊应激。在研究的第14天，将除NC组外的所有动物混合至大的围栏内12至16小时，然后返回到它们各自的围栏中(每只动物拥有各自的围栏)。在研究的第15天，通过另一呼吸道途径向除T9和T11组外的所有组施用20 mL的溶血曼海姆菌。在研究期间每天观察动物的临床异常和死亡率。在购买动物之前进行筛选时，所有动物均呈阴性或具有低滴度。治疗之前所述动物具有高滴度，其说明在接受治疗之前该动物在血清学上转化成溶血曼海姆菌。

结果

T8组的动物具有显著更低的肺损伤。

该研究暗示在有疫苗或没有疫苗(T4和T5组与T3组相比)的情况下均发生早期保护(第7天)。见图4.1和4.2。

实施例5. 当与DNA免疫调节剂共同施用时，接种商品化活疫苗的牛中的获得性免疫的评价

该研究的目的是确定共同施用DNA免疫调节剂是否提高由改良的活病毒(MLV)疫苗提供的获得性免疫。

免疫调节剂

该研究中使用的免疫调节剂是上文实施例1中描述的组合物。

研究动物

从没有呼吸性疾病当前病史的牛群中选取72只断乳年龄的荷尔斯泰因去势牛犊。将72只牛犊分成6个治疗组，每组各12只牛犊。评价每个牛犊个体并确定其处于良好的健康状态。所有牛犊均没有针对BHV-1、 BVDV1型和2型及BRSV的血清抗体。此外，发现所有牛犊针对PI-3呈血清抗体阴性。随后通过免疫组织化学确定所述牛犊对牛病毒性腹泻病毒的持续感染呈阴性。

如下文表5.1中所示，在治疗当天向治疗组肌内施用疫苗和不同剂量的DNA免疫调节剂。在表5.2中提供了DNA免疫调节剂的稀释方案。在研究的第0天，向T1-T4组中的所有动物施用所述免疫调节剂。接受疫苗的所有动物根据标签说明书接种。从颅至肩膀前部一起靠近施用免疫调节剂和疫苗－两次注射(一次注射疫苗，另一次注射免疫调节剂)。

表5.1. 免疫调节剂和疫苗的施用程序表

组	靶向剂量	疫苗和/或免疫调节剂施用日	动物数量
				T1	MLV + 免疫调节剂(500 µg) IM	0	12
T2	MLV + 免疫调节剂(200 µg) IM	0	12
				T3	MLV + 免疫调节剂(100 µg) IM	0	12
T4	MLV + 免疫调节剂(50 µg) IM	0	12
				T5	MLV	0	12
T6	未治疗	NA	12

MLV = 溶血曼海姆菌疫苗(Bovi-shield®) –改良的活的4重(4-way)病毒呼吸道疫苗

IM= 注射的肌内途径。

评价

在第 0、13、28、27、34和41天采集自牛犊的合适血液样本的样品上进行免疫测试。对每一样本进行细胞介导免疫(CMI)测定。该研究的目标病原体是BHV-1、BVDV 1 和2以及BRSV。适当时，对于之前详细说明的目标病原体，实验室使用标准化的程序和方法。

结果

测定所有治疗组中样品采集每一天的CMI结果的模型修正数据。当比较DNA免疫调节剂治疗组－MLV疫苗组合与仅接受所述MLV疫苗的牛时，在所有治疗组、细胞类型和抗原之间没有检测到统计学差异(P>0.10)(见图 5.1-5.12)。具体而言，图5.1-5.4呈现了对于六个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言的CD 25 EI表达指数(y轴)的测量值。图5.5-5.8呈现了对于六个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言的IFNγ表达指数(y轴)的测量值。图5.9-5.12呈现了对于六个治疗组的每一组的所有五种细胞类型(x轴)而言的IL-4表达指数(y轴)的测量值。对在其各自图形中代表的4种BRD病毒病原体的每一种产生估计值。对于这些统计学评价，与“仅MLV”治疗组进行所有比较。

检测了BVDV 1 (第28天和第35天)和BVDV 2 (第42天)的统计学显著的(P<0.10)治疗x日期相互作用。在所列出的任何时间点上对BHV-1没有检测到任何显著发现 (P>0.10)。在图5.13-5.15上呈现了这些发现的图形展示。从分析中去除由于在阴性对照治疗组内观察到抗体血清转变的BRSV数据。注意，对于所有统计学评价，与“仅MLV”治疗组进行所有比较。

在该研究过程中还收集了个体动物体重。在图5.16中呈现了模型修正的平均每日体重增加结果的图形展示。当与仅MLV组进行比较时，在治疗组之间没有检测到任何显著发现(P>0.10)。

总而言之，相比于仅MLV疫苗的施用，当与MLV疫苗共同施用时，所述DNA免疫调节剂没有增强CMI。然而，当与MLV疫苗(具体是BVDV)共同施用时，500 μg的DNA免疫调节剂可提高体液免疫。然而应指出，尽管在获得性免疫中缺乏持续的改善，但以500 μg、200 μg、100 μg和50 μg的剂量共同施用DNA免疫调节剂没有削弱由MLV疫苗诱导的阳性免疫作用。此外，性能(例如，ADG)没有受施用DNA免疫调节剂负面影响。

实施例6. 当与DNA免疫调节剂共同施用时，接种商品化疫苗的牛中的获得性免疫的评价

该研究的目的是确定共同施用DNA免疫调节剂是否提高由含有灭活抗原的疫苗提供的获得性免疫。

免疫调节剂

该研究中使用的免疫调节剂是上文实施例1中描述的组合物。

研究动物

从没有呼吸性疾病当前病史的牛群中选取48只3-5月龄的荷尔斯泰因母牛。将48只牛分成6个治疗组，每组各8只牛。评价每个动物个体并确定其处于良好的健康状态。所有动物均没有针对BHV-1、BVDV 1型和2型的血清抗体。还通过PCR确定所述动物对牛病毒性腹泻病毒的持续感染呈阴性。没有在针对BRS病毒和PI3病毒的SNT滴度上选择到动物。

如下文表5.1中所示，在治疗当天向治疗组肌内施用疫苗和不同剂量的DNA免疫调节剂。疫苗包含作为灭活的抗原的BHV1和BVDV 1型及2型，以及改良的活的PI3病毒和BRS病毒。免疫调节剂和疫苗在动物的同一侧从颅至肩膀前部分开给予，或在动物相对一侧的同一区域分开给予，或在一个注射器中进行混合给予。在表5.2中提供了DNA免疫调节剂的稀释方案。

表6.1. 免疫调节剂和疫苗的施用程序表

疫苗=组合的(灭活的和改良的活的)4重病毒呼吸道疫苗(Rispoval®)

IM=注射的肌内途径。

评价

在第 0、3、5、7、9、11、14、17、20、23和27天采集自牛的合适血液样本的样品上进行免疫测试。该研究的目标病原体是BHV-1、BVDV 1和2。还测定了针对BRS病毒和PI3病毒的抗体滴度信息。对于先前详细说明的目标病原体，实验室使用标准化的血清中和试验 (SNT)作为程序。

结果

检测了BHV1(第27天)的统计学显著(P<0.010)的治疗x日期相互作用。在所有其它时间点上对BHV1以及在所列任何时间点上对BVDV 1型和2型没有检测到任何显著发现(P>0.10)。因为在研究开始时动物不是血清学阴性的，所以没有进一步评价BRSV和PI3滴度的结果。因此不能验证治疗的效果。在图6.1上呈现了这些发现的图形展示。注意，对于所有的统计学评价，与“疫苗和葡萄糖5%”治疗组进行所有比较。

Claims (13)

1.免疫调节剂组合物用于制备用于减轻或预防牛中由溶血曼海姆菌（Mannheimia haemolytica）导致的感染的临床体征的药物的用途，其中所述免疫调节剂组合物不含生物制剂并且包含：

a. 阳离子脂质体递送载体；和

b. 分离的非编码、细菌来源的核酸分子，其在大肠杆菌（Escherichia coli）中产生。

2.权利要求1的用途，其中所述脂质体递送载体包含选自多层脂质体脂质和挤压的脂质的脂质。

3.权利要求1的用途，其中所述脂质体递送载体包含选自DOTMA和胆固醇；DOTAP和胆固醇；DOTIM和胆固醇；以及DDAB和胆固醇的脂质对。

4.权利要求1的用途，其中包含所述免疫调节剂组合物的所述药物用于选自静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、通过喷雾/气溶胶、口服、眼内、气管内和鼻内的施用。

5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述药物包含1 μg至1000 μg的所述免疫调节剂组合物。

6.权利要求5的用途，其中所述免疫调节剂组合物包含0.1 μg至10 μg的所述核酸分子。

7.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述免疫调节剂组合物包含0.1 μg至10 μg的所述核酸分子。

8.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述核酸分子包含DNA质粒。

9.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述免疫调节剂组合物包含一定比例的核酸分子与脂质，所述核酸分子与脂质的比例是按重量计1:1至1:80核酸:脂质。

10.权利要求9的用途，其中所述核酸分子与脂质的比例是按重量计1:3至1:30核酸:脂质。

11.权利要求8的用途，其中所述免疫调节剂组合物包含一定比例的核酸分子与脂质，所述核酸分子与脂质的比例是按重量计1:1至1:80核酸:脂质。

12.权利要求1-4中任一项的用途，其中将所述药物配制用于肌内或皮下施用。

13.权利要求11的用途，其中将所述药物配制用于肌内或皮下施用。