CN101228272A

CN101228272A - 用于治疗阿尔茨海默病的具有较高安全性的经鼻腔内给药基因疫苗

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Publication number: CN101228272A
Application number: CNA200680022227XA
Authority: CN
Inventors: 原英夫; 田平武; 米满吉和; 井上诚; 德炭由美子; 长谷川护
Original assignee: Japan As Represented By President Of National Center For Geriatrics And Gerontology; Dnavec Corp
Current assignee: Japan As Represented By President Of National Center For Geriatrics And Gerontology; Dnavec Corp
Priority date: 2005-04-20
Filing date: 2006-04-20
Publication date: 2008-07-23
Also published as: JP4903159B2; JP2008536476A

Abstract

本发明是以提供一种对阿尔茨海默病具有更高安全性和有效性的疫苗疗法为目的。构筑携带有Aβ基因的负链RNA病毒载体后，以鼻腔内给药方式将其给药到24－25月龄的APP转基因小鼠体内。在测定血清中抗Aβ抗体水平时，与对照组相比给药组明显增高。组织学探讨结果显示，前脑叶，头顶叶，以及海马中的任一组织内，都显示了给药本发明载体所引起的老年斑的显著减少。脑内Aβ水平也有显著下降。并且，本发明载体的给药，没有引起对中枢神经系统的淋巴细胞浸润。

Description

用于治疗阿尔茨海默病的具有较高安全性的经鼻腔内给药基因疫苗

技术领域

0001

本发明是有关一种基于负链RNA病毒载体的用于阿尔茨海默病的治疗性基因疫苗。

技术背景

0002

随着日本急速步入老龄化社会，老年性痴呆症及其护理问题日渐成为巨大的社会问题。据报道，在日本，65岁以上的老人中有10％患有老年性痴呆症。阿尔茨海默病是导致老年性痴呆症的两大原因之一，约占老年性痴呆症患者的50％，但目前尚未推出有效的治疗方法。

0003

阿尔茨海默病的病理学改变有以下3点特征：即神经元细胞的萎缩/脱落；由β淀粉样蛋白(amyloid)(以下简称为Aβ)凝集和沉淀所引起的老年斑的形成；由异常tau蛋白质引起的神经元纤维性病变。阿尔茨海默病患者脑内生成的β淀粉样蛋白质主要是由β及γ分泌酶裂解β淀粉样前体蛋白后产生的40-43个氨基酸组成的。老年斑的中央为β淀粉样蛋白，在其周围含有胶质细胞，纤维型星形胶质细胞，及营养不良的神经突起构成的凝集体。目前，一种较有力的阿尔茨海默病发病机制″淀粉样蛋白级联假说″认为，β淀粉样蛋白的凝集及沉淀是形成老年斑的主要原因。

0004

基于该假说，阿尔茨海默病的新型疗法-免疫疗法尤为受到关注。该疫苗疗法旨在利用免疫学手法来清除脑内β淀粉样蛋白。ELan公司的Schenk等将前凝集Aβ42与佐剂同时给药到PDAPP-转基因小鼠的肌肉内，确认到了其脑内淀粉样沉淀的减少(专利文献1以及非专利文献1)。在Elan公司和Wyeth公司等的临床试验中，将合成Aβ42肽(AN-1792)和佐剂(QS21)同时进行肌肉内给药后，在被试验者的血清中发现了可识别β折叠结构的抗Aβ抗体(非专利文献2)。并且报道了脑的高级功能也有改善(非专利文献3)。然而很遗憾，在II期临床试验中有6％(298名中18名)的患者出现了脑脊髓膜炎的副作用，并有1例死亡报告。顾而中断了上述的临床试验。对死亡患者的脑组织进行病理分析时发现，在新皮质中没有老年斑的存在，而显示了疫苗的有效性。在老年斑消失的区域内，确认到了对Aβ分解物的小胶质细胞的吞噬作用。该结果表明结合于Aβ的抗体通过Fc受体介导，被小神经胶质细胞吞食。

0005

上述抗Aβ抗体对神经元，神经胶质细胞，淀粉样前体蛋白(APP)及细胞内Aβ不发生反应。由此很难判断，上述副作用是由抗体引起的脑部炎症。给药AN-1792疫苗时需要一种佐剂。这种佐剂具有很强的免疫赋活作用，还可诱导T淋巴细胞性细胞免疫。由此判断，上述副作用有可能是由于佐剂诱导的细胞免疫，使反应于Aβ或APP的TH1型CD4⁺T细胞浸润大脑后导致的，类似于实验性过敏性脑脊髓炎的脑脊髓膜炎。(非专利文献4)

0006

通过AN-1792疫苗试验确认了使用Aβ肽疫苗疗法的病理学有效性。然而为了使疫苗适用于临床应用，必须减低脑脊髓膜炎等的副作用。由该观点构思了2种新的治疗方案。一种是结合有载体蛋白的Aβ肽N末端片段与Th2佐剂并用的免疫疗法(专利文献2)。其中所述载体蛋白可被T细胞识别。还有一种是包含有腺病毒载体的经改良的疫苗接种法(专利文献3)。其中所述腺病毒载体包含有编码由Aβ肽和霍乱毒素B亚单位组成的融合蛋白质的核酸。进而，本发明者们还开发出了一种安全性更高的口服疫苗-腺相关病毒载体，该载体包含有编码诱导体液免疫的Aβ肽的肽片断的DNA(专利文献4)。由于上述腺相关病毒载体疫苗利用TH2细胞易于被诱导的肠道粘膜免疫系统，则无需任何佐剂；并且，通过对APP转基因小鼠的一次给药表现出如下的优秀特性，在肠道内具有可长达6个月的抗原呈递作用；呈现出减低脑内淀粉样沉淀及老年斑形成的效果；且未在其他脏器发现任何可被观察到的炎症。然而为了使阿尔茨海默病的疫苗疗法实用化，还需要发明更加安全有效，更为先进的疫苗。

0007

【特許文献1】WO 99/27944

【特許文献2】WO 02/096350

【特許文献3】WO 2004/050876

【特許文献4】WO 2004/111250

【特許文献5】WO 00/70070

【特許文献6】特开2000-253876

【特許文献7】WO 2001/072340

【非特許文献1】Schenk D.et al，Nature 400：173-177，1999

【非特許文献2】Hock C.et al.Nat.Med.8：1270-1275，2002

【非特許文献3】Hock C.et al.Neuron 38，547-554，2003

【非特許文献4】临床和研究82(3)：439-444，2005

[发明的公开]

0008

鉴于上述情况完成了本发明。本发明的目的为针对阿尔茨海默病提供更加安全有效的疫苗疗法。

0009

为此，本发明者们经过不懈努力，尝试开发了针对阿尔茨海默病的新型疫苗疗法。本发明者们具有利用仙台病毒进行既可以用于基因导入，又可以用于基因治疗的载体的开发经验。仙台病毒是负链RNA病毒。该病毒只在宿主细胞的细胞质内增殖，因其生活周期中不具有DNA期，所以不会整合入染色体内。因此，在作为基因导入载体使用时，可确保高度的遗传安全性。本发明者们在开发以仙台病毒为基础的基因导入载体时，从仙台病毒基因组中敲除了其基因，以提高安全性，提供更适合靶疾患的载体。通过从基因组中敲除与侵入宿主细胞有关的膜融合蛋白(F蛋白质)的基因，来提高其安全性，在既可以成功地改良使其不会引发二次感染的同时，也可以有效的重构病毒载体(WO 00/70070)。进而，利用仙台病毒载体的流感疫苗(特开2000-253876)及AIDS疫苗的开发也获得成功。

0010

IL-10等TH2细胞因子，在与活体内免疫应答密切相关的TH1/TH2平衡中，发挥着重要的作用。TH1细胞产生IFN-γ，使细胞免疫亢进。由TH1细胞产生的IFN-γ，可抑制TH2细胞的IL-10产生。同时，TH2细胞产生IL-10，使体液免疫亢进。由TH2细胞产生的IL-10，可抑制TH1细胞产生IFN-γ等。本发明者们尝试了将编码Aβ和TH2细胞因子的基因同时导入上述仙台病毒载体，来开发可抑制细胞免疫引起的脑脊髓膜炎等副作用的针对阿尔茨海默病的疫苗。于是本发明者们构筑了编码Aβ1-43和IL-10的仙台病毒载体，并检测了它的效果。首先，将该载体对24-25个月龄的APP转基因小鼠进行鼻腔内给药，并测定了给药4周及8周后的血清中抗Aβ42抗体的水平。对照组的小鼠中只测出了较低水平的抗Aβ抗体，并且随着时间的推移，其抗体量也逐渐升高。反之，在施用本发明载体的小鼠血中，则测到了较高水平的抗Aβ抗体，8周后的抗体水平比4周后的抗体水平稍有下降。病理组织学检查显示施用本发明载体后，在前脑叶，头顶叶及海马中的老年斑明显减少。进而，对脑组织中的Aβ量通过ELISA法也进行了测定。其结果显示，脑组织中的Aβ量明显减少。同时使用CD3和Iba-1作为指标进一步探讨了施用本发明载体是否会引起中枢神经系统内的淋巴细胞浸润。结果表明，均未产生淋巴细胞浸润及小神经胶质细胞的病理性(极端)活化。

0011

在上述研究中，我们已经证明了表达Aβ肽的负链RNA病毒载体具有极为优秀的特性。第一，该载体在极为高龄的阿尔茨海默病小鼠模型中，具有使Aβ明显减少的效果。在上述试验中使用的是接近寿终的24-25个月龄的Tg2576小鼠。而以往阿尔茨海默病疗法研究中所使用的小鼠的最大月龄为18个月。像在这样高龄的小鼠模型中取得治疗效果实为首创。这些高龄小鼠的脑内沉淀有大量的Aβ。因此，本发明的载体对阿尔茨海默病病情进展较多的患者也可能发挥较高的治疗效果。第二，本发明的载体与以往的疫苗疗法相比，在较低的使用量和较少次数的给药情况下，也具有治疗效果。例如，在使用以往的Aβ肽和佐剂并用的给药方法时，一般需要多次给药才可确立其免疫效果。如AN-1792临床试验中，实际的给药次数为数次到十几次。与之相比，本发明的载体一次给药后就表现出显著的有效性。进而，在腺相关病毒载体的疫苗疗法(WO2004/11125099)中，疫苗接种如本说明书实施例所述方法施行了一次给药，给药量为5×10¹¹基因组/个体。反之，本说明书所记载的实施例的施用量为5×10⁶CIU(Cell Infectious Unit)/个体(换算为基因组复制数则约5×10⁷基因组/个体)。这两个载体的给用量约差10⁴。第三，实施例中载体的给药并未引起小鼠的脑脊髓膜炎。有报告表明，AN-1792的临床试验中所观察到的脑脊髓膜炎在小鼠模型中也被观察过(M.Shoji，et al.44th Annual Meeting of Japanese Society of Neurology，May 15-17，2003)。也有对正常的非模型小鼠(C57B6鼠)施用Aβ肽和佐剂免疫后也出现过脑脊髓膜炎的报道。(Furlan R，et al.Vaccination with amyloid-betapeptide induces autoimmune encephalomyelitis in C57/BL6 mice，Brain 126：285-291，2003)。本说明书所述结果显示本发明的载体对人体给药时也具有安全性。

0012

如上所述，本发明的载体在用量少给药次数少的条件下具有较高的Aβ清除效果。在基于仙台病毒载体的AIDS病疫苗中，确认了其效果部分由于细胞免疫所致(WO 2001/072340)。实施例中使用的载体，为了防止产生副作用，与细胞免疫相比，刻意的做了依赖于体液免疫的设计，本说明书所描述的优异的疫苗效果在阿尔茨海默病治疗疫苗中也显示出体液免疫的重要性。通过使用Th2细胞因子或Th2佐剂来使体液免疫占优势，可以减低副作用。顾本发明提供编码Aβ的负链RNA病毒载体及其应用，特别是提供如下发明

0013

(1)一种负链RNA病毒载体，该载体含有编码β淀粉样蛋白的核酸。

(2)(1)的负链RNA病毒载体，还包含编码Th2细胞因子或其部分肽的核酸。

(3)(2)的负链RNA病毒载体，其中所述Th2细胞因子或其部分肽是IL-10或其部分肽。

(4)(1)-(3)中的任一载体，其中所述负链RNA病毒是副粘病毒载体。

(5)(4)中的载体，其中所述副粘病毒载体是仙台病毒载体。

(6)(1)-(5)中的任一载体，其中所述β淀粉样蛋白是Aβ43或其部分肽。

(7)(1)-(6)中的任一载体，其中所述β淀粉样蛋白来源于人。

(8)(3)-(7)中的任一载体，其中所述IL-10源于小鼠或人。

(9)(1)-(8)中的任一载体，其中所述β淀粉样蛋白是序列号为1的核苷酸序列所编码的多肽或其一部分。

(10)(3)-(9)中的任一载体，其中所述IL-10是序列号为2或3的核苷酸序列所编码的多肽。

(11)(1)-(10)中的任一负链RNA病毒载体，包含序列号为5的核酸。

(12)一种组合物，所述组合物包含(1)-(11)中任一项所述的载体及药理学上可容许的承运体。

(13)(12)中的组合物，包含(i)以可表达样式编码Th2细胞因子或其部分肽的核酸，(ii)Th2细胞因子或其部分肽，或(iii)Th2佐剂。

(14)(13)中的组合物，包含Th2细胞因子、其部分肽或Th2佐剂。

(15)(13)中的组合物，包含以可表达样式编码Th2细胞因子或其部分肽的核酸。

(16)(15)中的组合物，其中所述Th2细胞因子是由含有编码β淀粉样蛋白的核酸的负链RNA病毒载体所编码的。

(17)(15)中的组合物，其中所述Th2细胞因子是由含有编码β淀粉样蛋白的核酸的负链RNA病毒载体以外的载体所编码的。

(18)(12)-(17)中的任一组合物，该组合物是药学组合物。

(19)用于治疗和预防阿尔茨海默病的药学组合物，包含(1)-(18)中的任一项所述的载体。

(20)(19)中的组合物，还包含(i)以可表达样式编码Th2细胞因子或其部分肽的核酸，(ii)Th2细胞因子或其部分肽，或(iii)Th2佐剂。

(21)(18)或(20)中的药学组合物，是用于鼻腔内给药的药学组合物。

(22)是一种使β淀粉样蛋白沉淀减退的方法。所述方法包含给药(1)-(11)中任一项所述的载体，或者包含该载体的组合物的步骤。

(23)一种阿尔茨海默病的治疗或预防方法，包括给药(1)-(11)中任一项所述的载体或者包含该载体的组合物的步骤。

(24)(22)或(23)的方法，所述给药为鼻腔内给药。

(25)(22)或(23)的方法，所述给药为肌肉内给药。

(26)(22)-(25)中的任一方法，还包含给药Th2细胞因子、其部分肽、Th2佐剂或编码Th2细胞因子及其部分肽的载体的步骤。

(27)(26)的方法，为施用Th2细胞因子、其部分肽、或Th2佐剂的方法。

(28)(26)的组合物，其中给药编码Th2细胞因子或其部分肽的载体。

0014

本发明提供了在给药量少及给药次数少的情况下，可以有效降低β淀粉样蛋白沉淀的一种新型负链RNA病毒载体。本实施例所述载体不会诱导中枢神经系统的炎症，且与以往疫苗给药相比引起脑脊髓膜炎的可能性低。本发明的载体是治疗阿尔茨海默病的极为有效的手段。

0015

本发明涉及到负链RNA病毒载体。该载体包含编码β淀粉样蛋白的核酸。

0016

本发明中的基因，是指编码遗传物质或转录单位的核酸。基因可以是RNA或DNA。本发明中，编码蛋白的核酸叫做该蛋白质的基因。基因也可以不编码蛋白质。例如，基因也可以编码核酶或反义RNA等功能性RNA。基因可以是天然产生或是人工设计的序列。本说明书中的“DNA”包括单链DNA和双链DNA。术语“编码蛋白”是指为便于在适当的条件下表达蛋白，多核苷酸以正义或反义方向包含编码蛋白质氨基酸序列的ORF。

0017

负链RNA病毒是以负链RNA(与编码病毒蛋白的有义链互补的反义链)为基因组的病毒。负链RNA病毒也可称为负链。本发明中所使用的负链RNA病毒优选单链负链RNA病毒(也可称非分节型(non-segmented)负链RNA病毒)。所谓单链负链RNA病毒指的是以一条负链RNA为基因组的病毒。包括以下病毒科的病毒：副粘病毒科(Paramyxoviridae)(包含副粘病毒属(Paramyxovirus)、麻疹病毒属(Morbillivirus)、腮腺炎病毒属(Rubulavirus)、及肺炎病毒属(Pneumovirus)等属)、弹状病毒(Rhabdoviridae)科(包含水泡性病毒属(Vesiculovirus)、狂犬病毒属(Lyssavirus)、及热病毒属(Ephemerovirus)等)、纤丝病毒科(Filoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(流感病毒属(Influenza virus)A、B、C、及索戈托样病毒属(Thogoto-like virus)等包括在内)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)(包含布尼亚病毒属(Bunyavirus)、汉坦病毒属(Hantavirus)、内罗病毒属(Nairovirus)、及白蛉病毒属(Phlebovirus)等)、以及沙粒病毒科(Arenaviridae)等。

0018

本发明中尤其优选的负链RNA病毒的具体例子为，包括例如属于副粘病毒科的仙台病毒(Sendai virus)，新城疫病毒(Newcastle disease virus)，腮腺炎病毒(Mumps virus)，麻疹病毒(Measles virus)，RS病毒(呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial viruS))，牛瘟病毒(rinderpest virus)，瘟热病毒(distempervirus)，猴副流感病毒(SV5)(Monkey parainfluenza virus(SV5))，人副流感病毒1，2，3型(human parainfluenza type 1，2，and 3 viruse)，属于副粘病毒科(Paramyxoviridae family)；属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae family)的流感病毒(Influenza virus)；属于弹状病毒科(Rhabdoviridae family)的水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)及狂犬病毒(Rabies virus)。

0019

本发明优选使用副粘病毒。副粘病毒是指属于副粘病毒科的病毒，或其衍生物。副粘病毒是一组以非分节的负链RNA为其基因组的病毒，包括副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)(包括呼吸道病毒属(Respirovirus)(也称为副粘病毒属(Paramyxovirus)，，腮腺炎病毒属(Rubulavirus)，和麻疹病毒属(Morbillivirus)，以及肺病毒亚科(Pneumovirinae)(包括肺病毒属(Pneumovirus)和间质性肺病毒属(Metapneumovirus))。适用于本发明的副粘病毒的具体实例有，仙台病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒(RS病毒)，牛瘟病毒，瘟热病毒，猴副流感病毒(SV5)，和人副流感病毒1，2，和3型，等等。更具体地例如，仙台病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟热病毒(phocine distemper virus，PDV)，犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)，海豚麻疹病毒(dolphinmolbillivirus)(DMV)，小反刍兽疫病毒(peste-des-petits-ruminants virus，PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，立百病毒(Nipah)，人副流感病毒-2(HPIV-2)，猴副流感病毒5(SV5)，人副流感病毒-4a(HPIV-4a)，人副流感病毒-4b(HPIV-4b)，腮腺炎病毒(Mumps)，和新城疫病毒(NDV)。更优选的实例包括选自以下组的病毒：仙台病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟热病毒(PDV)，犬瘟热病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(DMV)，小反刍兽疫病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，和立百病毒(Nipah Virus)。本发明的病毒优选属于副粘病毒亚科(包括呼吸道病毒属，腮腺炎病毒属和麻疹病毒属)，更优选属于呼吸道病毒属(也称副粘病毒属)的病毒或其衍生物。本发明可利用的呼吸道病毒属的病毒包括，人副流感病毒1型(HPIV-1)，人副流感病毒3型(HPIV-3)，牛副流感病毒3型(BPIV-3)，仙台病毒(也称鼠副流感病毒1型)，猴副流感病毒10型(Simian parainfluenza virus-10，SPIV-10)等。在本发明中，最优选仙台病毒。这些病毒可源自天然株，野生型株，突变株，实验室传代株，人工构建株等。

0020

本发明中，“载体”是用于将核酸导入细胞的承运体。负链RNA病毒载体是源自负链RNA病毒的用于将核酸导入细胞的承运体。SeV等的负链RNA病毒载体作为基因导入用载体，具有十分优异的特性。由于负链RNA病毒没有DNA期，仅在宿主细胞的细胞质中进行转录和复制，故它们不发生染色体整合。因此，不会造成由染色体异常所导致的癌症或永生化等安全问题。负链RNA病毒的这种特征在作为载体使用时对其安全性有很大贡献。当用于表达外来基因时，即使在连续多次传代后，SeV也几乎不表现任何碱基突变。这表明其基因组具有高度稳定性，并且能长期稳定表达所插入的外来基因(Yu，D.et al.Genes Cells 2，457-466(1997))。进而，使SeV衣壳结构蛋白缺失时，在插入基因的大小及包装上具有一定灵活性等性质方面具有优势。传播型SeV载体，可以导入至少5.5kb的外来基因，并且可以通过添加转录单位来同时表达两种或两种以上的基因。

0021

已知仙台病毒对啮齿类动物具有致病性，可以引起肺炎。但对人类不具有病原性。该观点可由鼻内施用野生型仙台病毒不会对非人类灵长类以及人造成严重的有害作用的报道中得到支持(Hurwitz，J.L.et al.Vaccine 15：533-540，1997、Slobod，K.S.et al.Vaccine 22：3182-3186，2004)。更引人注目的优点还可例举以下2点。即“高感染性”和“高表达水平”。SeV载体通过与细胞膜糖脂及糖蛋白的唾液酸结合来进行感染，由于唾液酸在几乎所有的哺乳动物及鸟类细胞中均有表达，因此具有广谱感染性，即高感染性。当基于SeV复制子的传播型载体释放病毒粒子时，这些病毒粒子可以再度感染周围细胞。大多数RNP，在被感染细胞的细胞质中被复制，并随着细胞分裂而被扩散到子代细胞，从而可以期待持续表达。SeV载体具有非常广的组织适用范围。更进一步地，由于具有只在细胞质内转录和复制的特征性表达机制，可使其插入的基因的表达量非常高(Moriya，C.et al.FEBS Lett.425(1)：105-111，1998；WO 00/70070)此外，通过缺失包膜基因而获得的非传播型SeV载体也已经回收成功(WO00/70070；Li，HO.et al.J.Virol.74(14)：6564-6569，2000)。因此可以对SeV载体进行改良，使其在维持“高感染性”和“高表达量”的同时，提高其“安全性”。

0022

本发明的负链RNA病毒载体，包含负链RNA病毒的基因组RNA。术语‘基因组RNA’是指具有形成包含负链RNA病毒特定病毒蛋白质的RNP的功能的RNA，是具有表达基因组中的基因的功能的RNA。随着核酸的复制，形成子代RNP。负链RNA病毒的RNA以反义序列编码其基因。通常，负链RNA病毒的RNA基因组，在3’前导区和5’尾随区之间含有的病毒基因以反义序列并列存在。各基因的开放阅读框(ORF)之间存在一组序列：转录终止序列(E序列)，间插序列(I序列)和转录起始序列(S序列)，编码各基因ORF的RNA可以被转录成单独的顺反子。本发明载体的基因组RNA，包含该RNA所编码的基因群的表达，以及编码RNA自身的自主性复制所必需的病毒蛋白N(核衣壳，又称核蛋白(NP))，P(磷)和L(大蛋白)的反义RNA序列。所述RNA还可以编码形成病毒粒子所必需的M(基质)蛋白。进而，该RNA还可以编码病毒粒子感染所必需的包膜蛋白。负链RNA病毒的包膜蛋白包含，引起细胞膜融合的F(融合)蛋白，以及病毒粘附于细胞所必需的HN(血凝素-神经氨酸酶)蛋白或H(血凝素)蛋白。但是，某些特定类型的细胞的感染并不需要HN蛋白(Markwell，M.A.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(4)：978-982(1985))，只要有F蛋白便可以实现感染。RNA也可以编码除了F蛋白和/或HN蛋白以外的包膜蛋白。

0023

本发明的负链RNA病毒载体可以是，例如，负链RNA病毒的基因组RNA和病毒蛋白形成的复合体，即核糖核蛋白体(RNP)。RNP，例如可以与所需转染试剂一起导入细胞。这种RNP，更具体地，可以是包含负链RNA病毒的基因组RNA，N蛋白，P蛋白，和L蛋白的复合体。RNP导入细胞后，在病毒蛋白的作用下，从基因组RNA中编码病毒蛋白的顺反子进行转录的同时，基因组也进行自我复制，形成子代RNP。基因组RNA的复制，可以通过RT-PCR，Northern杂交等检测来确认RNA拷贝数的增加。

0024

本发明的负链RNA病毒载体优选负链RNA病毒的病毒粒子。术语“病毒粒子”指含有核酸的微小粒子，在病毒蛋白的作用下由细胞内释放出。负链RNA病毒的病毒粒子具有这样的构造，其中，具有由上述基因组RNA和病毒蛋白形成的上述RNP，该RNP被包裹在细胞膜由来的脂质膜(也称包膜)中。病毒粒子可以具有传染性。传染性是指根据负链RNA病毒载体的细胞粘附能力和膜融合能力，将所含有的核酸导入附着的细胞内的病毒粒子的能力。本发明的负链RNA病毒载体可以是具有传播性或非传播性的载体。“传播性”是指，病毒载体感染宿主细胞时，在该细胞内病毒可以进行自我复制，并产生感染性病毒粒子。

0025

例如，分类于副粘病毒亚科的病毒的基因通常概述如下。通常N基因也可表示为[NP]。

呼吸道病毒(Respirovirus)NP P/C/V M F HN-L

腮腺炎病毒(Rubulavirus)NP P/V M F HN(SH)L

麻疹病毒(Morbillivirus)NP P/C/V M F H-L

0026

例如仙台病毒的每个基因的碱基序列的数据库登录号分别为：N基因为M29343、M30202、M30203、M30204、M51331、M55565、M69046、和X17218；P基因为M30202、M30203、M30204、M55565、M69046、X00583、X17007、及X17008；M基因为D11446、K02742、M30202、M30203、M30204、M69046、U31956、X00584、及X53056；F基因为D00152、D11446、D17334、D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、X00152、及X02131；HN基因为D26475、M12397、M30202、M30203、M30204、M69046、X00586、X02808、及X56131；L基因为D00053、M30202、M30203、M30204、M69040、X00587、X58886。其他病毒编码的病毒基因有：N基因、如CDV、AF014953；DMV、X75961；HPIV1、D01070；HPIV-2、M55320；HPIV-3、D10025；Mapuera、X85128；Mumps、D86172；MV、K01711；NDV、AF064091；PDPR、X74443；PDV、X75717；RPV、X68311；SeV、X00087；SV5、M81442；及Tupaia、AF079780；P基因、如CDV、X51869；DMV、Z47758；HPIV-1、M74081；HPIV-3、X04721；HPIV-4a、M55975；HPIV-4b、M55976；Mumps、D86173；MV、M89920；NDV、M20302；PDV、X75960；RPV、X68311；SeV、M30202；SV5、AF052755；及Tupaia、AF079780；C基因、如CDV、AF014953；DMV、Z47758；HPIV-1、M74081；HPIV-3、D00047；MV、ABO16162；RPV、X68311；SeV、AB005796；及Tupaia、AF079780；M基因、如CDV、M12669；DMV、Z30087；HPIV-1、S38067；HPIV-2、M62734；HPIV-3、D00130；HPIV-4a、D10241；HPIV-4b、D10242；Mumps、D86171；MV、AB012948；NDV、AF089819；PDPR、Z47977；PDV、X75717；RPV、M34018；SeV、U31956；及SV5、M32248；F基因、如CDV、M21849；DMV、AJ224704；HPN-1、M22347；HPIV-2、M60182；HPIV-3、X05303、HPIV-4a、D49821；HPIV-4b、D49822；Mumps、D86169；MV、AB003178；NDV、AF048763；PDPR、Z37017；PDV、AJ224706；RPV、M21514；SeV、D17334；及SV5、AB021962；HN(H或G)基因、如CDV、AF112189；DMV、AJ224705；HPIV-1、U709498；HPIV-2、D000865；HPIV-3、AB012132；HPIV-4A、M34033；HPIV-4B、AB006954；Mumps、X99040；MV、K01711；NDV、AF204872；PDPR、Z81358；PDV、Z36979；RPV、AF132934；SeV、U06433；及SV-5、S76876。但是，已知每种病毒有多种毒株，并由于毒株之间的差异，所以除上述序列以外还存在着包括其他序列的基因。

0027

这些病毒蛋白的ORF可以在基因组RNA中借助上述E-I-S序列而排列成为反义序列。离基因组RNA 3’端最近的ORF仅需要位于3’前导区和该ORF之间的S序列，而不需要E序列或I序列。离基因组RNA 5’端最近的ORF只需要位于5’尾随区和该ORF之间的E序列，不需要I序列和S序列。而且，两个ORF可以作为单个顺反子例如使用内部核糖体进入位点(IRES)序列进行转录。此时，这两个ORF之间则不需要E-I-S序列。例如在野生型副粘病毒中，典型的RNA基因组以反义顺序依次包含3’前导区和编码N、P、M、F、HN、和L蛋白的ORF，及5’尾随区。本发明的基因组RNA中，基因的排列并不限于此。但优选与野生型病毒一样，在3’前导区之后的依次编码：N、P、M、F、HN、和L蛋白的ORF，其后是5’尾随区。但有些负链RNA病毒并不包含所有6种病毒基因，即便如此也优选将这些病毒基因如上述野生型病毒同样排列。通常持有N、P、和L基因的载体，可以在细胞内从RNA基因组自主表达基因，还可由此复制基因组RNA。进而，在编码F基因和HN(或H)基因以及M基因等包膜构成蛋白的基因的作用下，形成感染性病毒粒子，并将它们释放到细胞外。因此，称该载体为传播型病毒载体。可以将编码包括Aβ或IL-10在内的多肽的基因如后所述插入到该基因组中的非蛋白编码区域。

0028

此外本发明的负链RNA病毒载体可以缺损野生型负链RNA病毒中的一个或多个基因。病毒基因组RNA，只要编码RNP重构时所必须的病毒蛋白(N，L及P)，即使不编码包膜构成蛋白也可在细胞内进行复制，并表达基因。例如根据病毒种类不同，可例举至少可以缺失下列至少一种编码F、H、HN、G、M、及M1等的包膜构成蛋白基因的载体(WO 00/70055及WO00/70070；Li，H.-O.et al.J.Virol.74(14)：6564-6569，2000)。具体地，不含M、F、HN基因或它们的任意组合的病毒载体，也是本发明优选使用的载体。这种病毒载体可以通过，例如外源性提供缺陷基因产物来重构。如此制备的病毒载体和野生型病毒一样，粘附于宿主细胞后，引起细胞融合。但由于导入细胞中的载体基因组中缺失有病毒原本具有的某一基因，它们不会形成与原来的病毒一样具有感染力的子代病毒粒子。因此，这种病毒是一种一次性基因导入的安全实用型病毒载体。基因组中缺失的基因，例如可以是F基因和/或HN基因。例如，通过将表达F基因缺失型重组负链RNA病毒基因组的质粒载体，与F蛋白表达载体和NP、P、L蛋白表达载体一起转染宿主细胞，可以重构病毒载体(WO00/70055和WO00/70070；Li，H.-O.et al.J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。也可以通过，例如，利用已经在其染色体中整合了F基因的宿主细胞来制备病毒。以外源性方式供应这些蛋白时，这些蛋白的氨基酸序列不必与病毒序列相同，可以使用突变基因或者其他病毒来源的同源基因作为代用品，只要它们的核酸导入活性与天然型相同或更高即可。

0029

此外，本发明的病毒载体可以制成包含下述包膜蛋白的载体，所述包膜蛋白可与衍生该载体基因组的病毒的包膜蛋白不同。例如，在重构病毒时，可以通过在包装细胞中表达除了载体来源病毒的包膜蛋白以外的其它包膜蛋白来制备包含所需包膜蛋白的病毒载体。对这类蛋白无特殊限制，可以包括其它病毒的包膜蛋白，例如，水泡性口炎病毒(VSV-G)的G蛋白(J.Virology 39：519-528，1981)。本发明的病毒载体，包括含有VSV-G等包膜蛋白的假型病毒载体，所述包膜蛋白来自与衍生该基因组的病毒不同的病毒。通过设计使上述包膜蛋白不被病毒RNA基因组编码时，病毒粒子感染细胞后不会表达这些蛋白。

0030

本发明的病毒载体可以是，例如，在其包膜表面含有如下蛋白的载体，所述蛋白例如为粘附因子，配体，受体等可以附着于特定细胞的蛋白质，抗体或其片段；或者是，嵌合蛋白，其中所述蛋白位于细胞外区域，而源自病毒包膜的多肽位于细胞内区域。由此，还可以制备靶向特定组织的载体。所述蛋白可以由病毒基因组编码，或者也可以通过在重构病毒时，通过表达病毒基因组以外的基因(例如，其他的表达载体或宿主染色体上的基因)来供给。

0031

本发明的载体所含的任一病毒基因可以通过修饰野生型基因而获得，例如为了降低病毒蛋白的免疫原性，或者提高RNA转录效率或复制效率。具体而言，例如，在负链RNA病毒载体中，可通过修饰至少一种复制因子：N基因，P基因和L基因来增强转录或复制功能。包膜蛋白之一的HN蛋白具有血凝素和神经氨酸酶两种活性；但是，当使前一种活性降低时，可以提高病毒在血液中的稳定性；当改变后一种活性时，可以调控其感染能力。通过修饰F蛋白，可以调控膜融合能力。例如，通过分析可成为细胞表面抗原分子的F蛋白或HN蛋白的表位，以此来制备一种使上述蛋白抗原性减弱了的病毒载体。并且，为抑制二次放出粒子或VLP(病毒样粒子)的放出，也可在病毒基因中导入温度敏感性突变(WO 2003/025570)。例如、在M基因中导入G69E、T116A、及A183S；在HN基因中导入A262T、G264、及K461G；在P基因中导入L511F；在L基因中导入N1197S及K1795E等突变。当然，可导入的温度敏感性突变并不限于此。(参照WO 2003/025570)。

0032

本发明的载体可以缺失辅助基因。例如，通过敲除V基因(一种SeV辅助基因)，可以在不影响培养细胞中的基因表达和复制的情况下，使SeV对宿主如小鼠的致病性显著降低(Kato，A.et al.1997，J.Virol.71：7266-7272，1997；Kato，A.et al.EMBO J.16：578-587，1997；Curran，J.et al.WO 01/04272，EP1067179)。这种减毒载体特别优选作为体内或回体(exvivo)基因导入用无毒性病毒载体来使用。

0033

本发明的载体，在上述负链RNA病毒载体的基因组中可以包含编码外来基因Aβ的核酸。编码Aβ的氨基酸数不受制限。例如可以是Aβ1-40、Aβ1-42、及Aβ1-43等。具有天然全长Aβ的抗原性的片断或包含該片断的任何多肽都可以用作Aβ。所述多肽必须包含来自天然Aβ(例如Aβ43)的氨基酸序列的连续6个或6个以上氨基酸、优选连续7个或7个以上氨基酸、或连续8个或8个以上氨基酸(Harlow，Antibodies：A laboratory Manual，1998；Chapter 5 page 76)，以使其显示对Aβ的抗原性。例如，针对Aβ42(序列号：27的1～42)的B细胞表位大半集中在N末端的第1～第15氨基酸序列区域内(Cribbs，D.H.et al.Int.Immunol.15(4)：505-14，2003)。所以，作为从载体表达的Aβ肽，可以优选使用包含Aβ42的第1～第15的氨基酸的多肽。此外还可使其表达包含Aβ42的第1～第21或第4～第10的氨基酸的多肽(特開2005-21149)。进而，已知可以阻止淀粉样蛋白纤维形成，具有保护神经能力的抗Aβ单克隆抗体10D5及6C6，可以识别相当于Aβ42的第3～第6位的4个氨基酸表位(EFRH；序列号：27的3～6)(Frenkel，D.et al.J.Neuroimmunol.88：85-90，1998；Frenkel，D.et al.J.Neuroimmunol.95：136-142，1999)。识别该同一表位的单克隆抗体508F，也可抑制由Aβ导致的神经毒性(Frenkel，D.et al.J.Neuroimmunol.106：23-31，2000)。因此，可以优选使用包含该序列的Aβ序列中的6～8个氨基酸或以上的多肽。细胞免疫表位集中在Aβ的C末端区域。表达包含Aβ1-21等的N末端片断，不包含Aβ22～43的C末端附近的序列(序列号：27的22～43)的片断，相对而言可以使体液免疫胜过细胞免疫。本发明的载体，也可优选使用编码包含天然Aβ肽(Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42及Aβ43，分别对应于序列号：27的1～39、1～40、1～41、1～42及1～43)序列的载体。较短的Aβ肽片断，可以适当地与载体蛋白融合制成多肽来提高免疫原性后使用。载体蛋白包含钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、兔血清白蛋白(RSA)、人血清白蛋白(HSA)、鸡卵白蛋白(OVA)、血小板球蛋白(TG)等。短肽可由约1～5个间隔氨基酸介导与载体蛋白融合。抗原多肽(分泌型时为成熟多肽)的长度范围(不含载体蛋白部分的氨基酸长)优选10～200个氨基酸、更优选15～100个氨基酸、更优选20～80个氨基酸。

0034

本载体编码的Aβ多肽优选包含确保可从细胞中分泌出来的分泌信号。分泌信号序列可使用白细胞介素(IL)-2及组织纤溶酶原激活物(tPA)等所需分泌蛋白的信号序列，优选使用Aβ前体蛋白(APP)的N末端信号序列。具体地，包含例如序列登录号NP-958817的分泌信号序列(碱基序列参照，例如序列登录号NM-201414)。即适合本发明的载体为编码附加有分泌信号的Aβ肽。

0035

本发明的载体还可包含编码作为外源性基因的Th2细胞因子和/或抗炎性细胞因子的核酸。Th2细胞因子指的是与1型辅助T细胞(Th1细胞)比较，优先产生2型辅助T细胞(Th2细胞)的细胞因子。具体地，包含IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、及IL-13。本发明中，载体所编码的细胞因子优选IL-4、IL-10、及IL-13，更优选IL-10。各细胞因子基因的碱基序列及氨基酸序列是已知的(IL-4：NM_000589、NP_000580、AAH66277、AAH67515、NP_758858、NP_067258、NP_958427；IL-5：NM_000879、NP_000870、CAA31210、NP_034688、NP_068606；IL-6：NM_000600、NP_000591、XP_518992、AAB30962、NP_112445；IL-9：NM_000590、NP_000581、AAH66284、AAH66287、NP_032399、XP_341488；IL-10：NM_000572、NP_000563、CAG46825、NP_034678、NP_036986；IL-13：NM_002188、NP_002179、AAB01681、NP_032381、NP_446280)。

0036

由载体所编码的IL-10等TH2细胞因子，可以是全长(即野生型)，也可以是部分肽(即活性片段)，只要其保留有所述活性。例如，N末端的信号序列可以适当地被其他信号序列置换。或细胞因子作为和其他肽的融合蛋白来表达。

0037

对载体所编码的Aβ以及IL-10等细胞因子的来源没有限制，也可使用包含小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猪、牛、马、驴、羊、狗、黑猩猩、猴以及人类等在内的所有哺乳动物。Aβ及细胞因子的来源可以是同种的来源，也可以是异种来源。但最好使用与给药对象相同的同种来源。编码这些细胞因子的核酸的核苷酸序列可从上述数据中得到。对于小鼠IL-10，还可从如Genbank序列登录号AY410237及NM_010548获得；人IL-10可从Genbank序列登录号AY029171及NM_000572获得。本发明载体适用的「编码Aβ的核酸」为人AβcDNA(序列号：1)。适用的「编码IL-10的核酸」为小鼠IL-10cDNA序列(序列号：2)及人IL-10cDNA序列(序列号：3)。由于密码子的简并性，具有与上述序列号：1～3的碱基序列不同序列的核酸，，只要具有与上述碱基序列相同的氨基酸序列，就可以与序列号：1～3一样适用于本发明的载体。上述外源性基因的插入区域，可选择例如基因组的蛋白非编码区内的适当部位。例如，3’-前导区和最靠近3’末端的病毒蛋白ORF之间；各种病毒蛋白ORF之间；和/或最靠近5′末端的病毒蛋白ORF和5’-尾随区之间。而且缺欠F或HN基因等的基因组中，外源基因可插入到该缺陷区域。将外来基因导入副粘病毒时，优选插入基因组的多核苷酸的链长为6的倍数(J.Virology，67(8)：4822-4830，1993)。插入的外来基因和病毒ORF之间，应配有整套的E-I-S序列。借助E-I-S序列串连插入2个或多个外来基因。或借助IRES插入所需外来基因。

0038

载体所携带的外来基因的表达水平，可通过添加在该基因上游(负链3’侧)的转录起始序列的类型来调节(WO 01/18223)。也可以通过外来基因插入基因组内的位置加以控制。插入位置越靠近负链3’末端则表达水平越高；反之越靠近5’末端则表达水平越低。因此，为获得所需的基因表达量，或者为了使外来基因与编码靠近其的病毒蛋白的基因保持最佳组合，可以适当调整外来基因的插入位置。一般来说，获得Aβ的高表达水平是有利的，顾优选将编码Aβ的外来基因与高效转录起始序列相连，并将其插入负链基因组3’末端附近。具体地，将外来基因插入3’-前导区和最靠近3’末端的病毒蛋白ORF之间；或者插入最靠近3’-末端的病毒基因ORF和第2靠近基因的ORF之间。野生型副粘病毒中最靠近基因组的3’末端的病毒蛋白基因是N基因，第2号靠近的是P基因。另外，在不需要导入基因的高表达水平的情况下，为获得最佳期望效果，可以，例如将外来基因插入载体中尽可能靠近负链基因组5’端的位置或选择低效转录起始序列来抑制病毒载体的基因表达水平。

0039

为使载体表达2个多肽(含有Aβ的多肽及含有Th2细胞因子的多肽)时，可以将所述编码各多肽的核酸插入载体的基因组中。该2个核酸也可分别插入各自不同的位置，或由E-I-S序列介导串联排列插入到一个位置。此时优选使用转录起始效率高的S序列。例如3’-UCCCACUUU-5’(负链RNA；序列号：6)、3’-UCCCAGUUU-5’(负链RNA；序列号：7)、或3’-UCCCACUUA-5’(负链RNA；序列号：8)。

0040

本发明的载体，在插入编码Aβ及Th2细胞因子的基因的位置之外还可持有其他外来基因。对这样的外来基因没有特殊限制。例如，可以是监控载体感染的标记基因或是细胞因子及激素等免疫系统调节基因。本发明的载体可以持有编码信号传递调节因子、细胞因子、激素、受体、抗体、及它们的片段的一个或多个基因。本发明的载体，可以直接给药于活体靶位，或间接给药，即将本发明的载体感染到患者自身来源的细胞或其他细胞，再将该感染细胞注入靶位(回体)给药，如此导入基因。

0041

本发明的载体对于治疗阿尔茨海默病，防止或阻止其病情发展提供了极为先进的方法。将本发明的载体施用于Aβ大量沉淀的24-25个月龄的APP Tg小鼠时，显示出了非常显著的Aβ沉淀去除效果。该效果仅通过一次鼻腔内给药就得到了确认。本发明的载体可作为对患者侵袭性较低的治疗手段来使用。由于未在中枢神经系统观察到炎症反应，可进一步证明本载体具有更高的安全性。

0042

为制备本发明的载体，可以在哺乳动物细胞中，在有包含负链RNA病毒基因组RNA(或其互补链)的RNP重构时所必需的病毒蛋白(即N，P，和L蛋白)存在的条件下，转录本发明的编码负链RNA病毒基因组RNA的cDNA。病毒RNP可以通过产生负链基因组(即与病毒基因组反义链相同)或正链(编码病毒蛋白的有义链)来重构。优选通过转录产生正链来提高载体重构的效率。RNA末端，优选尽可能正确反映天然病毒基因组3’-前导区和5’-尾随区序列的末端。例如，为了正确调节转录产物的5’-末端，可以利用T7RNA聚合酶的识别位点作为转录起始点，也可以在细胞中表达该RNA聚合酶。例如，为了调节转录产物的3’-末端，可以在转录产物的3’-末端编码自我切割型核酶，以便用该核酶正确切割3’-末端(Hasan，M.K.et al.J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997；Kato，A.et al.1997，EMBO J.16：578-587，1997；Yu，D.et al.Genes Cells 2：457-466，1997)。

0043

可以按照例如：Hasan，M.K.et al.J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997；Kato，A.et al.EMBO J.16：578-587，1997；和Yu，D.et al.Genes Cells 2：457-466中记载的方法构建携带有外来基因的重组仙台病毒载体。

0044

首先，制备包含目的外来基因的cDNA碱基序列的DNA样品。优选此DNA样品在25ng/μl或更高的浓度，可以通过电泳确认为单一质粒。下面是一个利用NotI位点将外来基因插入到编码病毒基因组RNA的DNA中的实例。当目的cDNA碱基序列中包含NotI识别位点时，优选事先用定点诱变法等来改变该碱基序列以除去该位点，但不改变所编码的氨基酸序列。目标基因片段通过PCR从所述DNA样品扩增并回收。通过在一对引物对的5’区添加NotI位点，使扩增片段的两个末端都为NotI位点。引物中包括E-I-S序列或其片段，使外来基因插入病毒基因组之后，在外来基因的ORF和其两侧病毒基因ORF之间各有一个E-I-S序列。

0045

例如，正向的合成的DNA序列在5’-末端包含任意两个或多个核苷酸(优选4个核苷酸，更优选ACTT，不包括GCG和GCC等来自NotI识别位点的序列)，以确保被NotI切断。在该序列的3’-末端添加NotI识别序列gcggccgc。另外，在3’-侧还添加任意9个核苷酸或9加6的倍数个核苷酸作为间隔序列。进一步地，还在3’-末端添加所需cDNA的ORF的约25个核苷酸的序列，它从起始密码子ATG开始并包括ATG。优选地，从所需cDNA选取约25个核苷酸以使正向的合成的寡DNA的3’-末端的最后一个核苷酸为G或C。

0046

反向的合成的DNA序列在5’末端包含任意两个或多个核苷酸(优选4个核苷酸，更优选ACTT，不包括GCG和GCC等来自NotI识别位点的序列)。在该序列的3’-末端添加NotI识别序列‘gcggccgc’。另外，在3’-末端还添加寡DNA片段以调整长度。该寡DNA的长度如下设计：最终PCR扩增产物的NotI片段，包括添加的E-I-S序列，总链长为6的倍数个核苷酸(所谓“6的法则”；Kolakofski，D.et al.J.Virol.72：891-899，1998；Calain，P.andRoux，L.J.Virol.67：4822-4830，1993)。当在插入该引物中的寡DNA片段3’-末端添加E-I-S序列时，仙台病毒S序列的互补序列优选5’-TTTCACCCT-3’(SEQ ID NO：9)，5’-TTTGACCCT-3’(SEQ ID NO：10)或者5’-ATTCACCCT-3’(SEQ ID NO：11)；I序列的互补序列优选5’-AAG-3’；E序列的互补序列优选5’-TTTTTCTTACTACGG-3’(SEQ ID NO：12)；进一步在该3’-末端添加自所需cDNA序列终止密码子起反向计数的约25个核苷酸的互补序列，使其最后一个核苷酸为G或C，制得反向的合成的DNA的3’末端。

0047

PCR可以利用Taq聚合酶或其它DNA聚合酶，按照常规方法进行。扩增的目的片段用NotI消化，然后插入pBluescript(商标)(Stratagene)等质粒载体的NotI位点。所得PCR产物的碱基序列用测序仪确认，选出具有正确序列的质粒。质粒中的插入片段用NotI切出，克隆到包含基因组cDNA的质粒的NotI位点。也可以不利用质粒载体，直接将所述片段插入NotI位点，获得重组仙台病毒cDNA。

0048

例如，重组仙台病毒基因组cDNA可以根据文献记载的方法构建(Yu，D.et al.Genes Cells 2：457-466，1997；Hasan，M.K.et al.J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997)。例如，首先将含有NotI识别位点的18bp间隔序列(5′-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3′；SEQ ID NO：13)克隆到仙台病毒基因组cDNA(pSeV(+))中前导序列与N蛋白ORF之间，得到带有源自δ肝炎病毒反基因组链的自我切割型核酶位点的质粒pSeV18⁺b(+)(Hasan，M.K.etal.1997，J.General Virology 78：2813-2820)。将外来基因片段插入pSeV18⁺b(+)的NotI位点，能获得含有所需外来基因的重组仙台病毒cDNA。

0049

如上制备的编码重组病毒基因组RNA的DNA，在上述病毒蛋白(L、P和N)存在的情况下，在细胞内被转录，以重构本发明的载体。本发明提供，用于制备本发明载体的、编码本发明载体中病毒基因组RNA的DNA。本发明还涉及将编码载体基因组RNA的DNA用于制备本发明载体的用途。重组病毒可以按照公知的方法重构(WO 97/16539；WO 97/16538；WO00/70055；WO 00/70070；WO 01/18223；WO 03/025570；Durbin，A.P.et al.Virology 235：323-332，1997；Whelan，S.P.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8388-8392，1995；Schnell.M.J.et al.EMBO J.13：4195-4203，1994；Radecke，F.et al.EMBO J.14：5773-5784，1995；Lawson，N.D.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481，1995；Garcin，D.et al.EMBO J.14：6087-6094，1995；Kato，A.et al.Genes Cells 1：569-579，1996；Baron，M.D.and Barrett，T.J.Virol.71：1265-1271，1997；Bridgen，A.and Elliott，R.M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15400-15404，1996；Hasan，M.K.et al.J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997；Kato，A.et al.EMBO J.16：578-587，1997；Yu，D.et al.Genes Cells 2：457-466，1997；Tokusumi，T.et al.Virus Res.86：33-38，2002；Li，H.-O.et al.J.Virol.74：6564-6569，2000)。使用这些方法能从DNA重构负链RNA病毒，包括副流感病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒和仙台病毒。本发明载体可以用这些方法重构。当病毒载体DNA中缺失F、HN和/或M基因时，无法形成感染性病毒粒子，但可以将这些缺失了的基因和/或编码其它病毒包膜蛋白的基因导入宿主细胞并表达，从而能产生感染性病毒粒子。

0050

具体地，所述病毒可以如下步骤制备：(a)在表达N、P和L蛋白的细胞中转录编码负链RNA病毒基因组RNA(负链RNA)或其互补链(正链)的cDNA，(b)从这些细胞或其培养上清中回收包含基因组RNA的RNP复合体。为了进行转录，将编码基因组RNA的DNA连接到适当的启动子的下游。如此转录的基因组RNA，在有N，L和P蛋白存在的情况下复制形成RNP复合体。然后，在有M、HN和F蛋白存在的情况下，形成包裹在包膜中的病毒粒子。例如，可以将编码基因组RNA的DNA连接到T7启动子的下游，然后通过T7 RNA聚合酶转录成RNA。除了包含T7聚合酶识别序列的启动子以外，可以利用其它任何所需的启动子。或者，也可以用体外转录的RNA转染细胞。N、L及P蛋白质也可通过质粒等适当的表达载体在细胞内表达。启动子的具体实例，包含CMV及CAG启动子(Niwa，H.et al.Gene.108：193-199，1991；专利公开1995，3-168087)。

0051

从DNA开始的基因组RNA的转录所必需的T7 RNA聚合酶等酶类，可以通过例如，转导能表达它们的质粒载体或病毒载体，或者将其基因整合入细胞染色体以便能诱导它们的转录，然后在病毒重构时诱导表达来提供。基因组RNA以及病毒重构所必需的病毒蛋白，可以例如通过转导能表达它们的质粒来提供。在供给这些病毒蛋白时，可以使用辅助病毒，例如野生型负链RNA病毒或一些变异的负链RNA病毒，但这有可能导致这些病毒的混入，因此并不优选这种方法。

0052

将表达基因组RNA的DNA导入细胞的方法包括，例如：(i)制备能被目的细胞摄入的DNA沉淀的方法，(ii)制备包含DNA的带正电的复合体的方法，所述复合体具有较低细胞毒性且适于目的细胞的摄入，和(iii)利用电脉冲在目的细胞膜上瞬时开孔的方法，孔的大小仅足以让目的DNA分子通过。

0053

方法(ii)中可以使用各种转染试剂，例如DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche#1811169)等。方法(i)中，可以用磷酸钙进行转染，用这种方法导入细胞的DNA被吞噬体摄入，但已知足量的DNA也能被摄入细胞核中(Graham，F.L.and Van Der Eb，J.1973，Virology 52：456；Wigler，M.and Silverstein，S.1977，Cell 11：223)。Chen和Okayama研究了导入技术的最佳条件，他们报道说：(1)细胞和共沉淀物的温育条件为：2～4％CO₂，35℃，15～24hr，(2)环状DNA比线性DNA活性更高，和(3)当沉淀混合液中DNA浓度为20～30μg/ml时，可形成最佳沉淀(Chen，C.and Okayama，H.1987，Mol.Cell.Biol.7：2745)。方法(ii)适于瞬时转染。已知更早的方法是配制具有所需DNA浓度比的DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885M.W.5×10⁵)混合液进行转染。由于大多数复合体在内体中降解，可以加入氯喹来提高转染效力(Calos，M.P.1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3015)。方法(iii)被称为电穿孔方法，由于没有细胞选择性，它比方法(i)和(ii)应用更广。可通过优化脉冲电流的持续时间、脉冲形式、电场强度(电极间空隙，电压)、缓冲液的导电率、DNA浓度和细胞密度使转染效力最大化。

0054

在上述三种方法中，方法(ii)操作简单，并且能用大量的细胞检测大量样品，因此转染试剂适用于在重构载体时将DNA导入细胞中，转染试剂优选但不限于Superfect Transfection Reagent(QIAGEN，目录号301305)或DOSPER Liposomal Transfection Reagent(Roche，目录号1811169)。

0055

具体地，可以按下述方法从cDNA重构病毒：

0056

在6-24孔塑料板或100mm Petri培养皿中，用极限必需培养基(MEM)将猴肾细胞LLC-MK2培养至100％铺满，所述培养基含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素(100U/ml青霉素G和100μg/ml链霉素)。将表达T7聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3在1μg/ml补骨脂素存在的情况下于UV中暴露20分钟灭活，然后以2PFU/细胞的量感染细胞(Fuerst，T.R.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8122-8126，1986；Kato，A.et al.Genes Cells 1：569-579，1996)。可以适当调整补骨脂素的添加量和暴露于UV的时间长短。感染1小时后，将2-60μg(更优选3-20μg)编码重组仙台病毒基因组RNA的DNA和表达病毒RNP生成所必需的反式作用病毒蛋白的质粒(0.5-24μgpGEM-N、0.25-12μg pGEM-P和0.5-24μg pGEM-L)(Kato，A.et al.GenesCells 1：569-579，1996)，采用Superfect(QIAGEN)的脂转染方法等进行转染。表达N、P和L蛋白的载体的量优选比例为2∶1∶2；质粒的量优选调整为，例如，1-4μg pGEM-N、0.5-2μg pGEM-P、1-4μg pGEM-L。

0057

转染的细胞在不含血清的MEM中培养，所述MEM根据需要，可以含有100μg/ml利福平(Sigma)和阿糖胞苷(AraC)，优选浓度为40μg/ml的阿糖胞苷(AraC)(Sigma)，以便将药物浓度调整至最佳，从而使痘苗病毒的细胞毒性最小而病毒的回收率最高(Kato，A.et al.1996，Genes Cells 1：569-579)。转染后将细胞培养48-72hr，然后回收细胞，冻融三次使细胞破碎。用含RNP的细胞裂解物再度感染LLC-MK2细胞并培养。或者，回收培养上清，将其添加到LLC-MK2细胞的培养液中，使其感染细胞并进行培养。转染可以如下进行：例如，与脂转染胺，聚阳离子脂质体等形成复合体，然后导入细胞。具体地，可以使用各种转染试剂。例如，DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE和DOSPER(Roche#1811169)。为了防止在内体中降解，还可加入氯喹(Calos，M.P.1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：3015)。在导入了RNP的细胞中，进行从RNP表达病毒基因和RNP复制的过程，使载体扩增。将所得病毒液(上清)稀释(例如，10⁶-倍)，再使用新的细胞反复进行扩增，可以完全除去痘苗病毒vTF7-3。将扩增重复例如3次或3次以上。所得载体可以在-80℃贮存。为了重构缺陷了包膜蛋白编码基因、不具有传播能力的病毒载体，可以用表达该包膜蛋白的LLC-MK2细胞进行感染，或者可以与表达该包膜蛋白的质粒一起转染。另一种方法是，将转染的细胞覆盖在表达该包膜蛋白的LLK-MK2细胞上层并进行覆层培养，使缺陷型病毒载体扩增(见WO 00/70055和WO 00/70070)。

0058

回收的病毒的滴度可通过测定CIU(细胞感染单位)或血凝素活性(HA)来确定(WO 00/70070；Kato，A.et al.1996，Genes Cells 1：569-579；Yonemitsu，Y.&Kaneda，Y.Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated genedelivery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of VascularDiseases.Method in Molecular Medicine：Humana Press：pp.295-306，1999)。携带GFP(绿色荧光蛋白)等标记基因的载体，可以利用所述标记作为指标，直接计数受感染的细胞来定量(例如，GFP-CIU)。如此测定的滴度可与CIU做等同处理(WO 00/70070)。

0059

只要能重构病毒载体，对重构所用的宿主细胞无特殊限制。例如，在仙台病毒载体等的重构中，可以使用来自猴肾的LLC-MK2细胞(ATCCCCL-7)和CV-1细胞(例如，ATCC CCL-70)、来自仓鼠肾的BHK细胞(例如，ATCC CCL-10)等的培养细胞、及人体细胞等。通过在这些细胞中表达适当的包膜蛋白，可以获得包膜中包含这些蛋白的感染性病毒粒子。此外，为了获得大量的仙台病毒载体，可以用从上述宿主中获得的病毒载体感染受精鸡卵，从而扩增该载体。已经开发了使用鸡卵制备病毒载体的方法(Nakanishi M，et al.ed.(1993)，“State-of-the-Art Technology Protocol inNeuroscience Research III，Molecular Neuron Physiology”，Koseisha，Osaka，pp.153-172)。具体地，例如将受精卵在孵化器中在37-38℃下培养9-12天使其形成胚。将病毒载体接种到尿囊腔，进一步将该受精卵培养数日(例如3日)使病毒载体繁殖。可根据所要增殖的重组仙台病毒的不同而改变培养时间等条件。然后，回收含有病毒的尿囊液。可以用常规方法从尿囊液中分离和纯化仙台病毒载体(Tashiro，M.“Virus Experiment Protocol，”Nagai，Ishihama，ed.Medical View Co.Ltd.pp.68-73，(1995)。

0060

例如，可以如下重构和制备F基因缺失型仙台病毒载体(见WO 00/70055和WO 00/70070)。

0061

<1>构建F基因缺失型仙台病毒基因组cDNA和F基因表达质粒

仙台病毒(SeV)的全长基因组cDNA，pSeV18⁺b(+)(Hasan，M.K.et al.1997，J.General Virology 78：2813-2820)(“pSeV18⁺b(+)”也称“pSeV18⁺”)的cDNA用SphI/KpnI消化，回收消化片段(14673bp)，将该片段克隆到pUC18，得到质粒pUC18/KS。在pUC18/KS上构建F基因缺失位点。F基因的缺失，通过联合应用PCR以及连接反应来构建，结果F基因的ORF被去除(ATG-TGA＝1698bp)，与例如atgcatgccggcagatga(SEQ ID NO：14)连接，由此构建F基因缺失型SeV基因组cDNA(pSeV18⁺/ΔF)。用F基因上游引物对[正向：5′-gttgagtactgcaagagc/序列号：15、反向：5′-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/序列号：16]及F基因下游引物对[正向：5′-atgcatgccggcagatga/序列号：17、反向：5′-tgggtgaatgagagaatcagc/序列号：18]进行PCR，所得PCR产物通过EcoT22I限制酶位点连接。按上述方法获得的质粒用SacI和SalI消化，回收含有F基因缺失部位的片段(4931bp)，将其克隆到pUC18，得到pUC18/dFSS。用DraIII消化该pUC18/dFSS，回收片段，将其与pSeV18⁺中包含的F基因区域的DraIII片段置换，连接后得到质粒pSeV18⁺/ΔF。

0062

将外来基因插入到，例如pUC18/dFSS中F基因缺失部位的NsiI和NgoMIV限制酶位点。为此，例如，可以用尾部为NsiI(NsiI-tailed)和尾部为NgoMIV(NgoMIV-tailed)的引物扩增外来基因片段。

0063

<2>制备表达SeV-F蛋白的辅助细胞

为了构建表达仙台病毒F基因(SeV-F)的Cre/loxP诱导型表达质粒，通过PCR扩增SeV-F基因，将扩增产物插入到可由Cre DNA重组酶诱导基因产物表达而设计的质粒pCALNdLw(Arai，T.et al.J.Virology 72，1998，p1115-1121)的唯一SwaI位点，由此构建质粒pCALNdLw/F。

0064

为了从F基因缺失型基因组回收感染性病毒颗粒，建立表达SeV-F蛋白的辅助细胞株。可以使用例如SeV增殖中常用的猴肾细胞株LLC-MK2细胞。在37℃和5％CO₂中用含有下列成分的MEM培养LLC-MK2细胞：10％热灭活胎牛血清(FBS)、青霉素G钠(50U/ml)和链霉素(50μg/ml)。由于SeV-F基因产物具有细胞毒性，用磷酸钙法(利用哺乳动物转染试剂盒(Stratagene))将为了能通过Cre DNA重组酶表达F基因产物而设计的上述质粒pCALNdLw/F按已知的方案转染LLC-MK2细胞。

0065

将质粒pCALNdLw/F(10μg)导入已在10cm培养皿中培养至40％铺满底的LLC-MK2细胞中，然后用含10％FBS的MEM培养基(10ml)在37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时。24小时后将细胞剥离，悬浮于培养基(10ml)后，接种到5个10ml培养皿中，其中一皿为5ml、两皿为2ml、两皿为0.2ml，用含G418(Gibco-BRL)(1,200μg/ml)和10％FBS的MEM培养基(10ml)培养14天，每两天更换一次培养基，选出稳定的基因导入细胞株。用克隆环回收上述培养基中生长的G418抗性细胞。回收的各细胞克隆均在10cm培养皿中扩增到铺满底。

0066

F蛋白的表达可以通过齐藤等人(Saito et al.Nucl.Acids Res.23：3816-3821(1995)；Arai，T.et al.J.Virol 72，1115-1121(1998))的方法，即在6cm培养皿中将细胞培养到铺满底后，例如用MOI＝3的腺病毒AxCANCre来感染细胞。

0067

<3>F基因缺失型SeV/ΔF病毒的重构和扩增

将上述导入了外来基因的质粒pSeV18⁺/ΔF用以下方法转染LLC-MK2细胞。将LLC-MK2细胞以5×10⁶个细胞/皿接种到100mm的Petri培养皿中。在用T7RNA聚合酶进行基因组RNA的转录时，将细胞培养24小时后，用经补骨脂素和长波长紫外线(365nm)处理20分钟的表达T7RNA聚合酶的重组痘苗病毒(PLWUV-VacT7：Fuerst，T.R.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA83，8122-8126(1986))，以MOI约为2的水平，在室温下感染1小时。用例如装有5只15瓦灯泡的UV Stratalinker 2400(商品目录号400676(100V)，Stratagene，La Jolla，CA，USA)对痘苗病毒进行紫外线照射。将细胞用无血清MEM洗涤后，将表达基因组RNA的质粒和分别表达副粘病毒N、P、L、和F+HN蛋白的质粒用适当的脂转染试剂转染细胞。这些质粒的用量比优选按照上述顺序为6∶2∶1∶2∶2，但不限于此。例如，表达基因组RNA的质粒以及表达N、P、L和F+HN蛋白的质粒(pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L和pGEM/F-HN；WO00/70070，Kato，A.et al.Genes Cells 1，569-579(1996))分别以12μg、4μg、2μg、4μg和4μg/皿的量进行转染。培养数小时后，将细胞用无血清MEM洗两次，在含40μg/ml胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC：S igma，St.Louis，MO)和7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco-BRL，Rockville，MD)的MEM中培养。回收这些细胞，将细胞沉淀悬浮于Opti-MEM(10⁷个细胞/ml)。将悬浮液反复冻融三次，与脂转染试剂DOSPER(Boehlinger Mannheim)(10⁶个细胞/25μl DOSPER)混合，在室温下放置15分钟后，转染上述克隆了的表达F基因的辅助细胞(10⁶个细胞/孔，12孔板)，用不含血清的MEM(含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)培养，回收上清。缺失了除F以外的基因，例如HN基因和/或M基因的病毒可以用同样的方法制备。

0068

在制备病毒基因缺失型载体时，例如，将在其载体基因组中缺失了不同的病毒基因的两种或更多种的载体导入同一细胞时，每种载体中缺失的病毒蛋白可以通过另一种载体的表达来提供。因此，这些载体可以互补缺失的蛋白，构筑具有感染性的病毒颗粒，其结果通过复制循环可以扩增这些病毒载体。换而言之，能以较低成本大量产生各种病毒基因缺失型病毒载体的混合物。由于这些缺失有病毒基因的病毒与未缺失有病毒基因的病毒相比具有较小的基因组，它们可以携带较长的外来基因。此外，由于缺失有病毒基因而缺乏增殖能力的病毒，被释放到细胞外以后也只是单纯的被稀释，而很难维持感染能力，因此它们不会产生后代，在环境释放的管理方面较有利。例如，可以想到分别构建能彼此互补的编码Aβ的载体和编码Th2细胞因子的载体，用它们进行共感染。本发明提供一种组合物，该组合物包含编码包括Aβ在内的多肽的负链RNA病毒载体，还包含编码Th2细胞因子的负链RNA病毒载体。本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包含编码包括Aβ在内的多肽的负链RNA病毒载体，还包含编码Th2细胞因子的负链RNA病毒载体。这些组合物和试剂盒可用于减少Aβ沉淀。

0069

当将传播型负链RNA病毒载体施用于个体或细胞后，由于在治疗结束时必须限制该病毒载体的增殖，顾也可以通过给药RNA-依赖性RNA聚合酶抑制剂，仅仅特异性的抑制该病毒载体的增殖，而对宿主不造成损害。

0070

根据本发明的方法，本发明的病毒载体可以以，例如，1×10⁵CIU/ml或以上，优选1×10⁶CIU/ml或以上，更优选5×10⁶CIU/ml或以上，更优选1×10⁷CIU/ml或以上，更优选5×10⁷CIU/ml或以上，更优选1×10⁸CIU/m或以上，更优选5×10⁸CIU/ml或以上的滴度，被释放到病毒生产细胞的培养基中。病毒滴度可以用本说明书及其他记载方法测定(Kiyotani，K.et al.Virology 177(1)，65-74(1990)；WO00/70070)。

0071

可以将回收的病毒载体纯化使其达到基本纯。纯化方法包括过滤、离心分离和柱纯化等公认的纯化分离方法或上述方法的组合。“基本纯”是指病毒载体在其样品中占主要成分。一般来说，当样品中所含的全部蛋白(作为承运体和稳定剂加入的蛋白除外)中，来自病毒载体的蛋白比例为10％或以上，优选20％或以上，更优选50％或以上，优选70％或以上，更优选80％或以上，进一步优选90％或以上时，可以确定为基本纯的病毒载体。病毒的具体纯化方法包括，采用纤维素硫酸酯或交联多糖硫酸酯的方法(特公昭JP62-30752、特公昭JP62-33879和特公昭JP62-30753)，以及吸附于含有硫酸岩藻糖的多糖和/或其分解产物上的方法(WO 97/32010)。

0072

在制备包含载体的组合物时，该载体可以根据需要与可药用承运体或赋形剂混合。“可药用承运体或赋形剂”是指可以与本发明载体一起给药，不明显抑制该载体的基因导入活性的材料。例如，该载体可以用生理盐水或磷酸盐缓冲液(PBS)等适当稀释，制成组合物。当载体在鸡卵中增殖时，“可药用承运体或赋形剂”可以包含尿囊液。另外，包含载体的组合物还可以含有去离子水和5％葡萄糖水溶液等承运体或赋形剂。进一步地，还可以含有上述以外的植物油、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂和杀菌剂等。另外，可以添加防腐剂或其它添加剂。包含本发明载体的组合物可以用作试剂或药物。本发明涉及抗淀粉状蛋白沉淀药物的制作方法。所述抗淀粉样蛋白沉淀药物包含编码Aβ肽的负链RNA病毒载体或该载体所导入的细胞以及含有可药用承运体或赋形剂在内的组合物的制造步骤。本发明还涉及在抗淀粉样蛋白沉淀药物的制造过程中，负链RNA病毒载体及产生该载体的细胞，或该载体导入细胞的使用。

0073

含有本发明载体的组成物可以包含生物聚合体等有机物，羟基磷灰石(hydroxyapatite)等无机物。具体地，包含胶原基质，聚乳酸聚合物或共聚物，聚乙二醇聚合物或共聚物和它们的化学衍生物，它们的组合，作为承运体。

0074

本发明的组合物还可以包含Th2细胞因子和/或以可表达样式编码Th2细胞因子的核酸。所述Th2细胞因子可以是全长(野生型)多肽，或保持活性的部分肽。例如N端和/或C末端氨基酸(例如1-30氨基酸，具体为1、2、3、4、5、10、15、20、25氨基酸)的缺失，不会影响细胞因子活性。并且，N末端的信号序列可被其他信号序列适当置换。另外，细胞因子也可作为与其他的肽的融合蛋白来表达。编码Th2细胞因子的核酸或插入表达载体，或接续到肌动蛋白启动子(actin promotor)、EF1启动子、CMV启动子、CAG启动子等适合的启动子。核酸，可包含在负链RNA病毒载体或任何其他的表达载体内。Th2细胞因子被负链RNA病毒载体编码时，Th2细胞因子也可与Aβ在同一载体内被编码，或者Th2细胞因子也可在其它负链RNA病毒载体内被编码。具体地，编码Aβ的本发明负链RNA病毒载体在不编码Th2细胞因子的情况下，对于Th1/Th2的平衡，将Th2细胞因子或Th2细胞因子载体与编码Aβ的本发明载体组合并共同施用时，移位到Th2。例如，可使用的Th2细胞因子可从如下组中加以选择。IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、及IL-13、或它们的组合。Th2细胞因子，还可从IL-4、IL-10、及IL-13等中优选。

0075

本发明的组合物还可包含佐剂。具体为，本发明载体即使不编码Th2细胞因子，也可使用含有Th2佐剂的组合物，使Th1/Th2平衡转位到Th2。Th2佐剂指的是相对1型辅助T细胞(Th1细胞)，使2型辅助T细胞(Th2细胞)更具活性化的佐剂。具体地，所述佐剂包含氢氧化铝(alum)、霍乱毒素(B亚单位)、曼森血吸虫卵(Schistosoma mansoni egg)提取蛋白(例如Lacto-N-fucopentaose III)等(Grun，J.L.and P.H.Maurer，Cellular Immunol.121：134-145，1989；Holmgren，J.et al.Vaccine 11：1179-1184，1993；Wilson，A.D.et al.Vaccine 11：113-118，1993；Lindsay，D.S.et al，Int.Arch.AllergyImmunol.105：281-288，1994；Xu-Amano，J.et al.J.Exp.Med.178：1309-1320，1993；Okano，M.et al.J.Immunol.167(1)：442-50，2001)。本发明的组合物还可包含任意的其它成分。例如，作为给药后监测用的标记，或免疫系统调节因子、信号转导调节因子、细胞因子、激素、受体、抗体、及它们的片段等的一种或多种化合物。本发明的组合物，还可包含编码信号转导调节因子、细胞因子、激素、受体、抗体、及它们的片段等的一种或多种肽的一种或多种载体。

0076

通过将生产的负链RNA病毒或包含该病毒的组合物给药于个体，可诱导对Aβ的免疫应答，从而减少Aβ的沉淀。载体可与Th2细胞因子，Th2细胞因子表达载体，以及Th2佐剂组合给药。载体的给药，可以是体内给药，也可由细胞介导进行间接(回体)给药。所接种的负链RNA病毒载体，只要持有可从基因组RNA对所携带的抗原多肽基因的表达能力，则无需是感染性病毒粒子，也可以是非感染性病毒粒子及病毒核(包含基因组及与基因组结合的病毒蛋白质的RNA复合体)。本说明书中，负链RNA病毒载体指的是一种复合体，其在被感染细胞中可复制自身的基因组RNA，同时具有表达所携带基因的能力。该复合体包含核蛋白(RNP)，所述核蛋白(RNP)含有来自负链RNA病毒载体的基因组和基因组RNA的复制及病毒在表达携带的基因时所必须的病毒蛋白。RNP是包含例如负链RNA病毒的基因组RNA以及N、L、及P蛋白的复合体。具体来说，本发明的负链RNA病毒载体包括含有基因组RNA及结合基因组RNA的病毒蛋白(如负链RNA病毒的核衣壳)的感染性病毒粒子、非感染性病毒粒子(也称病毒样粒子(VLP))及RNP。即使从病毒粒子中去除包膜的RNP(病毒核)，一旦导入到细胞中，便可在细胞内复制病毒基因组RNA。(WO 97/16538；WO 00/70055)。也可将RNP或VLP与所望的例如转染剂组合进行接种(WO00/70055；WO 00/70070)。

0077

通过细胞接种载体时，将负链RNA病毒载体导入适当的培养细胞或从被接种动物体内采集的细胞中。在体外(试管或培养皿)，使负链RNA病毒感染细胞时，感染要在例如培养液或生理盐水等所需的生理水溶液中，在体外(或回体)进行。MOI(感染复数(multiple of infection)：即每个细胞的感染病毒数)优选1-1000的范围，更优选2-500，更优选3-300，进而优选5-100。负链RNA病毒与细胞短时间接触即可。例如1分钟或以上，优选3分钟或以上，5分钟或以上，10分钟或以上。也可接触20分钟或以上。例如，1-60分钟，更优选约5-30分钟。也可以接触较长时间，例如几天或几天以上。

0078

包含病毒基因组RNA在内的RNP以及非感染性病毒粒子(病毒样粒子(VLP)可用已知的转染剂法导入细胞。具体如磷酸钙法(Chen，C.&Okayama，H.BioTechniques 6：632-638，1988；Chen，C.and Okayama，H.Mol.Cell.Biol.7：2745，1987)、DEAE-葡聚糖法(Rosenthal，N.Methods Enzymol.152：704-709，1987)、各种核糖体转染剂(Sambrook，J.et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989)、以及电穿孔法(Ausubel，F.et al.In Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，NY，Vol.1，Ch.5and 9，1994)等本行业公认的多种技术转染细胞。转染剂中可添加氯喹以防止在内体中的降解。(Calos，M.P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3015，1983)。转染剂包括DOTMA(Roche)、Superfect Transfection Reagent(QIAGEN，Cat No.301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Roche#1811169)、TransIT-LT1(Mirus，Product No.MIR 2300)、CalPhos(商标)Mammalian Transfection Kit(Clontech#K2051-1)、CLONfectin(商品目录号)(Clontech#8020-1)等。已知包膜病毒在形成病毒粒子时，将会摄取源于宿主细胞的蛋白，该些蛋白在导入细胞时，会具有某种抗原性，可能是导致细胞毒性的原因。(J.Biol.Chem.272：16578-16584，1997)。因此，使用去除包膜的RNP是有利的(WO 00/70055)。

0079

通过将编码病毒基因组RNA的表达载体，及编码复制基因组RNA时所需的病毒蛋白(N、P和L蛋白)的表达载体导入细胞，可在细胞内直接形成病毒RNP。如此制备导入了病毒载体的细胞。

0080

调制负链RNA病毒载体导入了的细胞后，可进行12小时-5天的细胞培养(优选1-3天)，使其表达Aβ肽。所得细胞可直接或作为细胞提取液对动物进行接种。但优选使用表达Aβ肽的细胞来进行接种。也可将具有信号肽的Aβ肽通过载体加以表达后，并使其被分泌到细胞外。导入了载体的细胞提取液，可用表面活性液溶解细胞膜的手法或反复冻结-融化等方法制备。Triton X-100及Nonidet P-40等非离子表面活性剂所适用的浓度范围为0.1～1％。例如，用PBS清洗后，通过离心回收细胞块，在TNE缓冲液[25mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、lmM EDTA、1％Nonidet P-40]内再度悬浮后，置于冰中10-30分钟，然后通过孵育悬浮液而得。用做抗原的蛋白质可在细胞质内溶解时，将制备而得的细胞提取液离心(10,000×g、10分钟)处理，沉淀滤出不要的不溶成分。所得上清可用于免疫。在不希望使用表面活性剂的部位，制备细胞提取液时，清洗后将细胞悬浮于PBS中，经5-6次反复冻结-溶解，细胞被破坏后也可制备细胞提取液。细胞提取液可与转染剂一起给药。

0081

将产生编码Aβ肽的负链RNA病毒载体的核酸施用于动物，并通过在动物体内生成由负链RNA病毒载体所表达的Aβ肽，可诱导免疫。产生负链RNA病毒载体的核酸，指的是表达生成重组负链RNA病毒载体时所需的RNA及蛋白群的核酸组。具体地，所述核酸指包含编码Aβ的负链RNA病毒载体基因组RNA及其互补链(反基因组RNA，即正链)的核酸，以及编码包含负链RNA病毒基因组RNA在内的RNP构成蛋白质群的核酸的核酸组。这些核酸都含有可以表达所编码的RNA及蛋白质所需的启动子。例如CMV启动子(Foecking，M.K，and Hofstetter H.Gene 45：101-105，1986)、逆转录病毒LTR(Shinnik，T.M.et al.Nature，293：543-548，1981)、EF1启动子、及CAG启动子(Niwa，H.et al.Gene.108：193-199，1991、特开平3-168087)。作为核酸，优选使用质粒载体。负链RNA病毒的基因组中优选携带有编码构成包含基因组RNA的RNP的病毒蛋白群(典型为N、L、P)的基因，以及亲代野生型病毒具有的所有包膜构成蛋白的基因。负链RNA病毒基因组，在缺失有包膜构成蛋白的任何一种基因时，编码与感染性病毒粒子的形成相关的包膜蛋白(例如基因组缺失的包膜蛋白或VSV-G等其他包膜蛋白)的核酸，可以包含在上述核酸组内。通过将这些核酸给药于动物，可在动物体内生成重组负链RNA病毒。构成含有负链RNA病毒基因组RNA的RNP的病毒蛋白群，指的是与病毒基因组RNA共同形成RNP，并构成核衣壳(nucleocapsid)的蛋白质。这些蛋白是基因组复制和基因表达时所必需的蛋白群，典型的包含N、P、L蛋白。具体地，本发明涉及包含以下步骤的方法：对动物接种(i)编码Aβ的负链RNA病毒的基因组RNA或其互补链的核酸；和(ii)编码N、P、L蛋白质的核酸。在这些被接种的动物中，形成含有基因组RNA的RNP，并表达Aβ肽。该基因组也可以编码Th2细胞因子。

0082

此外，也可接种预先其中导入了编码基因组RNA或其互补链的核酸和编码构成上述RNP的病毒蛋白群的核酸的细胞，或该细胞的提取液。生成负链RNA病毒载体的核酸的详细情况可参考以下文献：WO 97/16539；WO97/16538；WO 00/70055；WO 00/70070；WO 01/18223；WO 03/025570；Durbin，A.P.et al.Virology 235：323-332，1997；Whelan，S.P.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8388-8392，1995；Schnell.M.J.et al.EMBO J.13：4195-4203，1994；Radecke，F.et al.EMBO J.14：5773-5784，1995；Lawson，N.D.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481，1995；Garcin，D.et al.EMBO J.14：6087-6094，1995；Kato，A.et al.Genes Cells 1：569-579，1996；Baron，M.D.and Barrett，T.J.Virol.71：1265-1271，1997；Bridgen，A.and Elliott，R.M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15400-15404，1996；Hasan，M.K.et al.J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997；Kato，A.et al.EMBO J.16：578-587，1997；Yu，D.et al.Genes Cells 2：457-466，1997；Tokusumi，T.et al.Virus Res.2002：86；33-38，1997；Li，H.-O.et al.J.Virol.74：6564-6569，2000。

0083

将生成负链RNA病毒载体的核酸接种于动物时，编码Aβ的负链RNA病毒的基因组RNA或编码其互补链的核酸，与编码N、P、L蛋白的核酸可按5∶0.5∶0.5∶2的重量比导入动物体内。核酸的比例可适当调整。例如使用表达质粒时，可用编码含有编码Aβ的病毒基因组RNA(正链或负链)的质粒5μg～1000μg，以及N表达质粒0.5μg～200μg，P表达质粒0.5μg～200μg，L表达质粒2μg～500μg进行给药。核酸的给药，例如可将裸DNA直接或与转染剂混合后注入实施。转染剂中含有例如阳离子脂质体(lipofectamine)及聚阳离子脂质体。具体可利用如下试剂：DOTMA(Roche)、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Roche#1811169)、TransIT-LT1(Mirus，Product No.MIR 230)。

0084

本发明载体的给药量视疾病种类、患者的体重、年龄、性别、症状、给药目的、给药组合物的剂型、给药方法和导入基因类型等而异。给药途径可以适当选择，例如，经皮、鼻腔内、经支气管、肌肉内、腹腔内、静脉内、及皮下给药，但不限于此。尤其优选肌肉(例如腓肠肌)或皮下给药、点鼻或喷雾给药、手掌或足背皮内、脾脏内直接给药、腹腔内给药等。接种部位可为一到多处，如2-15处均可。接种量可根据被接种动物，接种部位及接种次数等适当调整。载体可约10⁵-约10¹¹CIU/ml，优选约10⁷-约10⁹CIU/ml，更优选约1×10⁸-约5×10⁸CIU/ml的范围内的给药量，也可与可药用承运体组合给药。对人的一次给药量换算成病毒滴度为1×10⁴CIU-5×10¹¹CIU(细胞感染单位)，优选2×10⁵CIU-2×10¹⁰CIU。给药次数可视其临床上可容许范围内的副作用，可为一次或多次给药。1日给药次数也可依此调整。尽管一次给药也可收到明显的效果，但给药本载体1次以上，其效果会更加显著。

0085

多次给药时可在例如首次给药约1年后再次给药。优选给药途径，例如为鼻腔内或肌肉内给药。为了增强疗效可反复给药。多次给药时优选使用上述携带编码Aβ核酸的负链RNA病毒载体，生成病毒载体的核酸，病毒载体或生成载体的核酸所导入的细胞，以及细胞提取液进行接种。

0086

在通过细胞(例如人细胞)进行接种载体(回体给药)时，优选对自身细胞感染负链RNA病毒载体，并使用10⁴-10⁹个细胞，或优选10⁵-10⁸个细胞或其细胞提取液。该载体可用于对人类以外的其它动物的接种，给药量可以根据目的动物和人的体重比或给药部位体积比(例如，平均值)换算药量。含有本发明载体的组合物的给药对象，包括拥有免疫系统的所望的脊椎动物(人或非人脊椎动物)，优选鸟类及哺乳动物，更优选哺乳动物(包括人或非人哺乳动物)。具体地，哺乳动物包括人以及猴等非人灵长类，小鼠、大鼠等啮齿类，兔、绵羊、山羊、猪、牛及狗等其他所有的哺乳动物。作为给药对象的动物，例如患有阿尔茨海默病的个体，Aβ水平亢进的个体，Aβ沉淀亢进的个体，具有阿尔茨海默病型变异基因的个体等。

0087

通过本发明的方法可以诱导对Aβ的免疫应答。所述对Aβ的免疫应答，可以通过抗Aβ抗体的产生，脑组织内Aβ量的减少以及Aβ沉淀的减少等确认。抗Aβ抗体的产生，可通过检测血液中的抗Aβ抗体来测定。抗体水平可根据ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)或乌赫特朗尼法测定。ELISA法是将抗原吸着在多孔板上，制备抗血清。将制备的抗血清阶段性2倍稀释(开始溶液：1∶1000)，然后加到多孔板中完成抗原抗体反应。为了进行发色反应，将免疫动物的抗体与作为2次抗体的由过氧化物酶标记的异种抗体发生反应。吸光度在最大发色吸光度的1/2时，根据抗体的稀释倍数可算出抗体效价。另外，乌赫特朗尼法是在琼脂内使抗原及抗体扩散，其免疫沉降反应结果呈现白色沉降线。沉降线可以用于测定发生免疫沉降反应时抗血清的稀释倍数的抗体效价。脑组织中的Aβ量，可以用例如脑组织的提取物及Biosource ELISA kit测定。

0088

Aβ沉淀(老年斑)的减少效果，可以通过以下方法测定：将脑组织切片用70％蚁酸处理，用5％H₂O₂使内源性过氧化物酶失活后，使抗Aβ抗体和切片发生反应，然后用过氧化物酶标2次抗体进行DNA染色。染色后，在显微镜下观察并测定Aβ蓄积部分的面积。与未施用本载体时相比，如果测出蓄积部分面积减少时，则可判断Aβ的沉积量减少。此外，将1-Fluoro-2，5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene(FSB)等与Aβ具有亲和性的化合物静注给药后、利用MRI观察在活体内的老年斑(Higuchi Met al.Nat.Neurosci.8(4)：527-33，2005；Sato，K.et al.Eur.J.Med.Chem.39：573，2004；Klunk，W.E.et al.Ann.Neurol.55(3)：306-19，2004)。如上通过非侵袭性沉淀图像技术可确认本发明载体的效果。

0089

本发明包含关于测定Aβ免疫反应方法的如下步骤。即将本发明的载体或包含载体的组合物导入含有Aβ沉淀的对象的步骤，以及检出该对象体内抗Aβ抗体的步骤。本发明还包含关于测定Aβ沉淀方法的以下步骤。如将本发明的载体或包含载体的组合物施用于含有Aβ沉淀的对象的步骤，以及对该对象体内沉淀的Aβ量的检出步骤。根据上述方法，可以监控对Aβ的免疫反应和/或Aβ沉淀的减少效果。

附图说明

【图1】Litmus SalI/NheIfrg-MtsHNtsPLmut-dF mIL 10(以下简称LitmusTS-dF mIL10)的构建过程示意图。在Litmus TS-dF的F基因缺失部位导入突变使其含有NotI位点，在此插入用NotI切出的mIL-10基因。

【图2】pSeV 18+Aβ/MtsHNtsP511Lmut-dF(以下简称pSeV 18+Aβ/TS-dF)的构建过程示意图。将插入到pBluescript(商标)中NotI部位的Aβ基因切出、插入到pSeV18+NotI/TS-dF的NotI部位。

【图3】pSeV18+Aβ/MtsHNtsP511Lmut-dF mIL10(以下简称pSeV18+Aβ/TS-dF mIL10)的构建过程示意图。将pSeV18+Aβ/TS-dF和Litmus TS-dF mIL10用SalI和NheI切出所需片段进行置换。

【图4】SeV-Aβ1-43/mIL-10或对照载体鼻腔内给药4和8周后的APP转基因小鼠血清中的抗Aβ抗体水平示意图。

【图5】SeV-Aβ1-43/mIL-10或对照载体鼻腔内给药8周后的APP转基因小鼠前脑叶中的老年斑示意图。

【图6】SeV-Aβ1-43/mIL-10或对照载体鼻腔内给药8周后的APP转基因小鼠头顶叶中的老年斑示意图。

【图7】SeV-Aβ1-43/mIL-10或对照载体鼻腔内给药8周后的APP转基因小鼠海马中的老年斑示意图。

【图8】SeV-Aβ1-43/mIL-10或对照载体鼻腔内给药8周后的APP转基因小鼠老年斑(前脑叶、头顶叶、及海马)的定量结果示意图。

【图9】SeV-Aβ1-43/mIL-10或对照载体鼻腔内给药8周后的APP转基因小鼠中枢神经系统淋巴细胞浸润探讨结果示意图。前脑叶中的T细胞浸润以CD3为指示剂进行了检测。海马中的神经小胶质细胞的变化以Iba-1为指示剂进行了检测。

【图10】SeV-Aβ1-43/mIL-10或对照载体鼻腔内给药8周后的APP转基因小鼠脑组织中的Aβ量示意组图。

【图11】SeV-Aβ1-43/mIL-10b或对照载体肌肉内给药4和8周后的APP转基因小鼠血清中的Aβ抗体水平示意图。

【图12】SeV-Aβ1-43/mIL-10或对照载体肌肉内给药8周后的APP转基因小鼠前脑叶中的老年斑照片。

【图13】SeV-Aβ1-43/mIL-10或对照载体肌肉内给药8周后的APP转基因小鼠头顶叶中的老年斑照片。

【图14】SeV-Aβ1-43/mIL-10或对照载体肌肉内给药8周后的APP转基因小鼠海马中的老年斑照片。

【图15】SeV-Aβ1-43/mIL-10或对照载体肌肉内给药8周后的APP转基因小鼠的老年斑(前脑叶、头顶叶及海马)的定量结果示意图。

【图16】SeV-Aβ1-43/mIL-10或对照载体肌肉内给药8周后的在前脑叶中的淋巴细胞浸润探讨结果的照片。

【图17】SeV-Aβ1-43/mIL-10或对照载体的肌肉内给药8周后的脑组织中Aβ量的示意组图。

【图18】SeV-Aβ1-43/mIL-10鼻腔给药后的正常小鼠的血清抗Aβ抗体水平图。

【图19】编码细胞因子的仙台病毒治疗用载体的鼻腔内给药后的正常小鼠的血清抗Aβ抗体水平示意图。

0090

实施本发明的最佳形态

通过以下实施例具体说明本发明，但并不限于此。本说明书中引用的文献可供参照。

0091

[实施例1]构建携带Aβ基因的负链RNA病毒基因组cDNA。

(1-1)NotI片段的构建(负链RNA病毒载体的转录信号的附加)

作为模版，通过在人Aβ肽1～43(序列号：27)中加入淀粉样蛋白前体蛋白(APP：序列登记号AF282245)的分泌信号(1～18氨基酸)，作为编码分泌型Aβ肽(序列号：28)的基因(特開2005-21149；序列号：1)，用phAbeta-NnotI(序列号：19)和phAbeta-CnotI(序列号：20)的2种引物进行PCR，将所得PCR产物用NotI消化，然后在pBluescript(商标)II KS(Stratagene)中克隆，构建了包含仙台病毒转录信号的Aβ肽基因的NotI片段(序列号：21)。小鼠IL-10(mIL10)也同样，以mIL10 cDNA为模板(序列登记号NM_010548；序列号：2)，用pmIL10-N(序列号：22)及pmIL10-C(序列号：23)2种引物进行PCR。所得PCR产物用NotI消化后、在pBluescript(商标)IIKS(Stratagene)中克隆，构建了包含仙台病毒转录信号的IL10基因的NotI片段(序列号：24)。

0092

序列号：1

ATGCTGCCCGGTTTGGCACTGCTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCT

CGGGCGCTTGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATC

ATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTG

CAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACTTAA

序列号：19

ATTGCGGCCGCCAAGGTTCACTTATGCTGCCCGGTTTGGCACTGCT

CCTG

序列号：20

ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTT

AAGTCGCTATGACAACACCGCCCACCATGAGTCC

序列号：21

gcggccgccaaggttcacttATGCTGCCCGGTTTGGCACTGCTCCTGCTGGCC

GCCTGGACGGCTCGGGCGCTTGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGA

TATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTT

CAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAG

CGACTTAAccgtagtaagaaaaacttagggtgaaagttcatcgcggccgc

序列号：2

ATGCCTGGCTCAGCACTGCTATGCTGCCTGCTCTTACTGACTGGCA

TGAGGATCAGCAGGGGCCAGTACAGCCGGGAAGACAATAACTGCACC

CACTTCCCAGTCGGCCAGAGCCACATGCTCCTAGAGCTGCGGACTGCC

TTCAGCCAGGTGAAGACTTTCTTTCAAACAAAGGACCAGCTGGACAA

CATACTGCTAACCGACTCCTTAATGCAGGACTTTAAGGGTTACTTGGGT

TGCCAAGCCTTATCGGAAATGATCCAGTTTTACCTGGTAGAAGTGATGC

CCCAGGCAGAGAAGCATGGCCCAGAAATCAAGGAGCATTTGAATTCCC

TGGGTGAGAAGCTGAAGACCCTCAGGATGCGGCTGAGGCGCTGTCATC

GATTTCTCCCCTGTGAAAATAAGAGCAAGGCAGTGGAGCAGGTGAAG

AGTGATTTTAATAAGCTCCAAGACCAAGGTGTCTACAAGGCCATGAATG

AATTTGACATCTTCATCAACTGCATAGAAGCATACATGATGATCAAAAT

GAAAAGCTAA

序列号：22

ACTTGCGGCCGCCAAAGTTCAATGCCTGGCTCAGCACTGCTATGC

TGCCTG

序列号：23

ATCCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGG

TTAGCTTTTCATTTTGATCATCATGTATGCTTC

序列号：24

gcggccgccaaagttcaATGCCTGGCTCAGCACTGCTATGCTGCCTGCTCTT

ACTGACTGGCATGAGGATCAGCAGGGGCCAGTACAGCCGGGAAGACA

ATAACTGCACCCACTTCCCAGTCGGCCAGAGCCACATGCTCCTAGAGC

TGCGGACTGCCTTCAGCCAGGTGAAGACTTTCTTTCAAACAAAGGACC

AGCTGGACAACATACTGCTAACCGACTCCTTAATGCAGGACTTTAAGG

GTTACTTGGGTTGCCAAGCCTTATCGGAAATGATCCAGTTTTACCTGGT

AGAAGTGATGCCCCAGGCAGAGAAGCATGGCCCAGAAATCAAGGAGC

ATTTGAATTCCCTGGGTGAGAAGCTGAAGACCCTCAGGATGCGGCTGA

GGCGCTGTCATCGATTTCTCCCCTGTGAAAATAAGAGCAAGGCAGTGG

AGCAGGTGAAGAGTGATTTTAATAAGCTCCAAGACCAAGGTGTCTACA

AGGCCATGAATGAATTTGACATCTTCATCAACTGCATAGAAGCATACAT

GATGATCAAAATGAAAAGCTAAccgtagtaagaaaaacttagggtgaaagttcatcgcggccg

c

0093

(1-2)在F基因缺失部位插入mIL10NotI片断

将在9个位点导入了氨基酸突变(M蛋白：G69E、T116A及A183S；HN蛋白：A262T、G264R及K461G；P蛋白质：L511F；L蛋白：N1197S及K1795E)的F基因缺失型SeV载体(WO 2003/025570)的cDNA(pSeV18+NotI/TSΔF)通过SalI及NheI消化后、亚克隆到了Litmus38(New England Biolabs)中。接着在所获得的含有M及HN基因的Litmus TSΔF质粒的F基因缺失部位，导入NotI切割位点的突变。模板使用Litmus TSΔF，然后利用F_lit3008_NotI(序列号：25)及R_lit3020_NotI(序列号：26)2种引物进行PCR、由此来导入NotI切割位点(图1上)。将此LitmusTSΔF NotI用NotI消化后，插入mIL10基因的NotI片段(图1下)。

序列号25：AAGCGGCCGCCTCAAACAAGCACAGATCATGGATG

序列号26：AGGCGGCCGCTTAATTAACCAAGCACTCACAAGG

0094

(1-3)构建携带Aβ基因的F基因缺失型SeV cDNA

在被NotI消化了的pSeV18+NotI/TSΔF上的NotI部位插入Aβ肽基因的NotI片段，构建了携带有Aβ基因的F基因缺失型SeVcDNA(pSeV18+Aβ/TSΔF)(图2)。

0095

(1-4)构建同时携带有Aβ基因和IL-10基因的F基因缺失型SeV基因组cDNA。

使用SalI和NheI消化pSeV18+Aβ/TSΔF后，回收了不含有M及HN基因的片段。同时，用SalI和NheI消化Litmus TSΔF-mIL10，并制备了包含M及HN基因的片段。将该2个片段连接后，构建了携带有Aβ基因和IL-10基因的F基因缺失型SeV基因组cDNA(pSeV18+Aβ/TSΔF-mIL10)(图3)。

0096

[实施例2]仙台病毒载体的重构和扩增

病毒的重构及扩增，按照Li等报告的方法(Li，H.-O.et al.J.Virology 74：6564-6569，2000；WO 00/70070)，及改良法(PCT/JP2005/00705)进行。由于病毒载体是F基因缺失型，所以使用了提供F蛋白的辅助细胞。该辅助细胞是使用Cre/loxP诱导表达系统制备的。该系统利用了通过Cre DNA重组酶诱导表达基因产物而设计的质粒pCALNdLw(Arai，T.et al.J.Virol.72：1115-1121，1988)，按照Saito等方法(Saito，I.et al.Nucl.Acid Res.23：3816-3821，1995；Arai，T.et al.J.Virol.72：1115-1121，1998)，在由pCALNdLw质粒转化了的细胞中感染表达Cre DNA重组酶的重组腺病毒(AxCANCre)

0097

通过上述方法制备了携带有Aβ基因的F基因缺失型SeV载体(SeV18+Aβ/TSΔF)，和同时携带有Aβ基因和IL-10基因的F基因缺失型SeV载体(SeV18+Aβ/TSΔF-mIL10)。编码SeV18+Aβ/TSΔF-mIL10的正链DNA序列号为：4，编码基因组RNA(负链)的核苷酸序列号为：5。作为对照，取代Aβ基因和IL-10基因，在F基因缺失部位制备了携带LacZ基因的SeV载体(SeV18+LacZ/TSΔF；也称为「SeV LacZ」)。

0098

[实施例3]对阿尔茨海默病试验动物模型进行SeV-Aβ1-43/mIL10鼻腔内给药及其效果

(3-1)试验动物及给药方法

使用24～25个月龄的APP转基因鼠(Tg2576)(Hsiao，K.et al.Science274：99-102，1996)，探讨了本发明的SeV18+Aβ/TSΔF-mIL10(以下称为「SeV-Aβ1-43/mIL-10」)的效果。将小鼠分为治疗组和对照组，每组各4只小鼠。对治疗组小鼠进行了SeV-Aβ1-43/mIL-10(每只5×10⁶CIU)鼻腔内给药，对对照组小鼠进行了SeV LacZ(每只5×10⁶CIU)鼻腔内给药。

0099

(3-2)测定血清中的抗Aβ抗体

在上述处置4-8周后，对小鼠进行了采血，并测定其血清中的抗Aβ42抗体量。将Aβ1-42肽(5μg/mL)吸附在96孔试验平板(Nunc，MaxiSorp)上。用5％脱脂乳/TBS-T缓冲液阻断后，加入小鼠血清(500倍稀释)，用过氧化物酶标记的抗鼠IgG抗体进行了检测。抗体效价根据ELISA的吸光度来测定评价(O.D.450)。

0100

结果如图4所示。与对照组相比，治疗组的每只小鼠的抗体效价均有明显增加。

0101

(3-3)SeV-Aβ1-43/mIL-10的老人斑去除效果

对上述仙台病毒载体鼻腔内给药8周后的小鼠(27或28月龄)进行了解剖，并制备了前脑叶皮质，头顶叶及海马皮质的脑组织切片。为了测定Aβ蛋白或老年斑，对上述组织的冷冻切片做了如下处理。将组织切片用70％的蚁酸处理后，用5％H₂O₂使内源性过氧化物酶灭活。然后，将组织切片与兔抗pan-Aβ抗体(1000倍稀释)发生反应，加入过氧化物酶标二次抗体，进行DAB染色。将染色了的切片在连接有显微镜的3CCD照相机下观察，并测定各区域的Aβ蓄积面积，并计算其面积率。

0102

切片的染色结果如图5(前脑叶)，图6(头顶叶)，图7(海马)所示。Aβ沉积面积率如图8所示。前脑叶，头顶叶，海马的老年斑经SeV-Aβ1-43/mIL-10给药后，比对照组明显减少了10％-20％。

0103

(3-4)SeV-Aβ1-43/mIL给药的安全性探讨

用上述(3-3)同样的方法制备了给药后8周期间(26～27个月龄)的治疗组及对照组小鼠的前脑叶及海马组织的冷冻切片。使用抗CD3抗体(T细胞)、抗Iba-1抗体(小胶质细胞)，对冷冻切片进行ABC法染色，确认是否有中枢神经系统的淋巴细胞浸润及神经小胶质细胞的变化。如图9所示，在治疗组及对照组的前脑叶和海马中均未观察到所述T淋巴细胞(作为panT细胞标记的CD3阳性的细胞)的浸润。该结果表明，使用本载体进行治疗时，可引起中枢神经系统炎症的可能性极低。作为神经小胶质细胞标记的IBA-1阳性细胞的量，在对照组和治疗组之间显示为同等程度，以此确认了在治疗组中未出现极端活化(蓄积)。

0104

(3-5)测定脑组织中Aβ沉淀

将小鼠的大脑及小脑沿正中裂切开，一半在-80℃下迅速冷冻后保存。将脑半球置于1ml的TBS溶液中使其均一化后、用桌型超离心机在100,000g下，离心1小时。保存可溶性级分(TBS级分)。将不溶级分在2％SDS中溶解并均一化后，再在100,000g下离心1小时。保存所得的可溶性级分(2％SDS级分)。将不溶级分在70％蚁酸中溶解并均一化后再进行100,000g下的1小时离心。保存所得可溶性级分(蚁酸级分)。脑组织中的Aβ40及42，使用Biosource ELISA kit进行测定。将TBS级分4倍稀释；2％SDS级分进行400～2000倍稀释；蚁酸级分用1M Tris溶液稀释1000倍。为便于测定，将稀释了的级分用ELISA稀释液再进行(2～10倍)稀释。

0105

如图10所示，在SDS级分，蚁酸级分，以及TBS级分中均能确认到，SeV-Aβ1-43/mIL-10投药后脑组织中的Aβ水平明显降低。

0106

[实施例4]对阿尔茨海默病实验动物模型进行SeV-Aβ1-43/mIL10的肌肉内给药的效果

(4-1)动物及给药方法

除给药途径以外，与上述鼻腔内给药完全相同，将5×10⁶CIU给药量的SeV-Aβ1-43/mIL-10载体注入后肢大腿肌肉内。

0107

(4-2)测定血清中抗Aβ抗体

通过使用与上述鼻腔内给药的相同手法，测定了SeV-Aβ1-43/mIL10肌肉内给药后的小鼠血清中的抗Aβ抗体量。其结果如图11。

0108

(4-3)SeV-Aβ1-43/mIL10的老年斑消失效果

通过使用与上述鼻腔内给药的相同方法，将SeV-Aβ1-43/mIL10载体肌肉内给药后，探讨了脑前叶，头顶叶，及海马中的老年斑消失效果。其结果如图12(前脑叶)，图13(头顶叶)，图14(海马)所示。Aβ沉积面积率如图15所示，显示了各处的Aβ沉淀的减少。

0109

(4-4)SeV-Aβ1-43/mIL10给药安全性的探讨

与上述鼻腔内给药的方法相同，将SeV-Aβ1-43/mIL10载体肌肉内给药后确认了中枢神经系统内的淋巴细胞浸润情况。如图16所示，在对照组和治疗组中均未观察到前脑叶中的淋巴细胞浸润。

0110

(4-5)测定脑组织中的Aβ

与上述鼻腔内给药的方法相同，将SeV-Aβ1-43/mIL10载体肌肉内给药后测定了脑组织中的Aβ40及Aβ42。结果如图17所示。在数个可溶性级分中，都确认到Aβ水平的减少。

0111

[实施例5]对正常小鼠进行SeV-Aβ1-43/hIL10鼻腔内给药后出现抗体效价的上升

(5-1)动物及给药方法

使用6周龄的C57BL/6N 小鼠检验了本发明SeV18+Aβ1-43/TSΔF-hIL10(以下也称「SeV-Aβ1-43/hIL-10」)的效果。将小鼠分为3组，每组各6只。按组分别对每只小鼠进行了SeV-Aβ1-43/hIL-10鼻腔内给药(组1：5×10⁵CIU/只、组2：5×10⁶CIU/只、组3：5×10⁷CIU/只)。

0112

(5-2)测定血浆中的抗Aβ抗体

给药前及给药2，4，及8周后分别对小鼠进行了采血，并测定了小鼠血浆中存在的抗Aβ42抗体量。将Aβ1-42肽(4μg/mL)吸附在96孔的试验平板上(Nunc，MaxiSorp)。用1％BSA/2％山羊血清/TBS-T缓冲液阻断后，加入小鼠血浆(300倍稀释)，用过氧化物酶标抗鼠IgG抗体检测。抗体效价根据ELISA的吸光度的测定来评价(O.D.450)。

0113

结果如图18所示，抗Aβ抗体量在3个组中随着时间的推移逐渐增加。通过载体给药，随着给药量的增加抗体量也增加，但在组2(5×10⁶CIU/只)及组3(5×10⁷CIU/只)中未观察到抗体量的明显差异。该结果表明，由于给药本发明的试剂(SeV-Aβ1-43/hIL-10)所产生的对抗Aβ抗体的诱导，不是特异的只存在于阿尔茨海默病实验小鼠模型(APP Tg小鼠)中，在正常小鼠中也获得了充分的效果。

0114

[实施例6]在对正常小鼠鼻腔内给药过程中编码对阿尔茨海默病治疗载体的细胞因子的效果

(6-1)动物及给药方法

将编码有数个细胞因子的基因插入到上述阿尔茨海默病治疗载体中。使用6周龄的C57BL/6N小鼠检验了这些仙台病毒载体的效果。将小鼠分为3组，每组各6只。将仙台病毒载体(携带有编码Aβ肽基因、以及携带有编码鼠IL-4、IL-5、或IL-6基因的载体；分别称为SeV-Aβ1-42/mIL-4、SeV-Aβ1-42/mIL-5、或SeV-Aβ1-42/mIL-6)，对每只小鼠进行鼻腔内给药(5×10⁶CIU/10μl)。

0115

(6-2)测定血浆中的抗Aβ抗体

给药前及给药1及2周后，对小鼠进行采血，并测定小鼠血浆中的抗Aβ抗体量。将Aβ1-42肽(4μg/mL)吸附在96孔试验平板上(Nunc，MaxiSorp)。用1％BSA/2％山羊血清/TBS-T缓冲液阻断后，加入小鼠血浆(300倍稀释)，用过氧化物酶标抗鼠IgG抗体检测。抗体效价根据ELISA的吸光度的测定来评价(O.D.450)。

0116

结果如图19所示。抗Aβ抗体量在3个组中都随着给药后时间的推移逐渐增加。结果表明IL-4、IL-5、及IL-6具有有效诱导抗Aβ抗体的效果，由此优选含有同时携带编码Aβ抗原的核酸、和IL-4、IL-5、IL-6中之一或数个细胞因子的核酸的仙台病毒载体的制剂，该制剂在阿尔茨海默病的治疗中可诱导抗Aβ抗体。

0117

产业实用性

本发明提供了可以有效减少Aβ沉积的一种新型负链RNA病毒载体。本发明的载体可有效地治疗阿尔茨海默病。

序列表

<110>生物载体株式会社(DNAVEC CORPORATION)

国立长寿医疗中心总长代表的日本(JAPAN AS REPRESENTED BY PRESIDENT OF NATIONAL

CENTER FOR GERIATRICS AND GERONTOLOGY)

<120>用于治疗阿尔茨海默病的具有较高安全性的经鼻腔内给药基因疫苗

<130>D4-A0503P

<150>JP 2005-123015

<151>2005-04-20

<150>US 60/727,690

<151>2005-10-18

<160>30

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>186

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga cggctcgggc gcttgatgca 60

gaattccgac atgactcagg atatgaagtt catcatcaaa aattggtgtt ctttgcagaa 120

gatgtgggtt caaacaaagg tgcaatcatt ggactcatgg tgggcggtgt tgtcatagcg 180

acttaa 186

<210>2

<211>537

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>2

atgcctggct cagcactgct atgctgcctg ctcttactga ctggcatgag gatcagcagg 60

ggccagtaca gccgggaaga caataactgc acccacttcc cagtcggcca gagccacatg 120

ctcctagagc tgcggactgc cttcagccag gtgaagactt tctttcaaac aaaggaccag 180

ctggacaaca tactgctaac cgactcctta atgcaggact ttaagggtta cttgggttgc 240

caagccttat cggaaatgat ccagttttac ctggtagaag tgatgcccca ggcagagaag 300

catggcccag aaatcaagga gcatttgaat tccctgggtg agaagctgaa gaccctcagg 360

atgcggctga ggcgctgtca tcgatttctc ccctgtgaaa ataagagcaa ggcagtggag 420

caggtgaaga gtgattttaa taagctccaa gaccaaggtg tctacaaggc catgaatgaa 480

tttgacatct tcatcaactg catagaagca tacatgatga tcaaaatgaa aagctaa 537

<210>3

<211>537

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>3

atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccagccca 60

ggccagggca cccagtctga gaacagctgc acccacttcc caggcaacct gcctaacatg 120

cttcgagatc tccgagatgc cttcagcaga gtgaagactt tctttcaaat gaaggatcag 180

ctggacaact tgttgttaaa ggagtccttg ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc 240

caagccttgt ctgagatgat ccagttttac ctggaggagg tgatgcccca agctgagaac 300

caagacccag acatcaaggc gcatgtgaac tccctggggg agaacctgaa gaccctcagg 360

ctgaggctac ggcgctgtca tcgatttctt ccctgtgaaa acaagagcaa ggccgtggag 420

caggtgaaga atgcctttaa taagctccaa gagaaaggca tctacaaagc catgagtgag 480

tttgacatct tcatcaacta catagaagcc tacatgacaa tgaagatacg aaactga 537

<210>4

<211>14412

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>编码仙台病毒反基因组RNA的DNA

<400>4

accaaacaag agaaaaaaca tgtatgggat atgtaatgaa gttatacagg attttagggt 60

caaagtatcc accctgagga gcaggttcca gaccctttgc tttgctgcca aagttcacgc 120

ggccgccaag gttcacttat gctgcccggt ttggcactgc tcctgctggc cgcctggacg 180

gctcgggcgc ttgatgcaga attccgacat gactcaggat atgaagttca tcatcaaaaa 240

ttggtgttct ttgcagaaga tgtgggttca aacaaaggtg caatcattgg actcatggtg 300

ggcggtgttg tcatagcgac ttaaccgtag taagaaaaac ttagggtgaa agttcatcgc 360

ggccgcagat cttcacgatg gccgggttgt tgagcacctt cgatacattt agctctagga 420

ggagcgaaag tattaataag tcgggaggag gtgctgttat ccccggccag aggagcacag 480

tctcagtgtt cgtactaggc ccaagtgtga ctgatgatgc agacaagtta ttcattgcaa 540

ctaccttcct agctcactca ttggacacag ataagcagca ctctcagaga ggggggttcc 600

tcgtctctct gcttgccatg gcttacagta gtccagaatt gtacttgaca acaaacggag 660

taaacgccga tgtcaaatat gtgatctaca acatagagaa agaccctaag aggacgaaga 720

cagacggatt cattgtgaag acgagagata tggaatatga gaggaccaca gaatggctgt 780

ttggacctat ggtcaacaag agcccactct tccagggtca acgggatgct gcagaccctg 840

acacactcct tcaaatctat gggtatcctg catgcctagg agcaataatt gtccaagtct 900

ggattgtgct ggtgaaggcc atcacaagca gcgccggctt aaggaaaggg ttcttcaaca 960

ggttagaggc gttcagacaa gacggcaccg tgaaaggtgc cttagttttc actggggaga 1020

cagttgaggg gataggctcg gttatgagat ctcagcaaag ccttgtatct ctcatggttg 1080

agacccttgt gactatgaat actgcaagat ctgatctcac cacattagag aagaacatcc 1140

agatcgttgg gaactacatc cgagatgcag ggctggcttc cttcatgaac actattaaat 1200

atggggtgga aacaaagatg gcagctctaa cgttgtcaaa cctgaggccc gatattaata 1260

agcttagaag cctcatagac acctacctgt caaaaggccc cagagctccc tttatctgta 1320

tcctcaagga ccctgttcat ggtgaatttg ctccaggcaa ttatcctgca ctatggagtt 1380

acgccatggg agtcgccgtc gtacagaaca aggcaatgca gcagtacgtc acagggagga 1440

cataccttga tatggaaatg ttcttactag gacaagccgt ggcaaaggat gctgaatcga 1500

agatcagcag tgccttggaa gatgagttag gagtgacgga tacagccaag gggaggctca 1560

gacatcatct ggcaaacttg tccggtgggg atggtgctta ccacaaacca acaggcggtg 1620

gtgcaattga ggtagctcta gacaatgccg acatcgacct agaaacaaaa gcccatgcgg 1680

accaggacgc taggggttgg ggtggagata gtggtgaaag atgggcacgt caggtgagtg 1740

gtggccactt tgtcacacta catggggctg aacggttaga ggaggaaacc aatgatgagg 1800

atgtatcaga catagagaga agaatagcca tgagactcgc agagagacgg caagaggatt 1860

ctgcaaccca tggagatgaa ggccgcaata acggtgtcga tcatgacgaa gatgacgatg 1920

ccgcagcagt agctgggata ggaggaatct aggatcatac gaggcttcaa ggtacttgat 1980

ccgtagtaag aaaaacttag ggtgaaagtt catccaccga tcggctcagg caaggccaca 2040

cccaacccca ccgaccacac ccagcagtcg agacagccac ggcttcggct acacttaccg 2100

catggatcaa gatgccttca ttcttaaaga agattctgaa gttgagaggg aggcgccagg 2160

aggacgagag tcgctctcgg atgttatcgg attcctcgat gctgtcctgt cgagtgaacc 2220

aactgacatc ggaggggaca gaagctggct ccacaacacc atcaacactc cccaaggacc 2280

aggctctgct catagagcca aaagtgaggg cgaaggagaa gtctcaacac cgtcgaccca 2340

agataatcga tcaggtgagg agagtagagt ctctgggaga acaagcaagc cagaggcaga 2400

agcacatgct ggaaaccttg ataaacaaaa tatacaccgg gcctttgggg gaagaactgg 2460

tacaaactct gtatctcagg atctgggcga tggaggagac tccggaatcc ttgaaaatcc 2520

tccaaatgag agaggatatc cgagatcagg tattgaagat gaaaacagag agatggctgc 2580

gcaccctgat aagaggggag aagaccaagc tgaaggactt ccagaagagg tacgaggaag 2640

tacatcccta cctgatgaag gagaaggtgg agcaagtaat aatggaagaa gcatggagcc 2700

tggcagctca catagtgcaa gagtaactgg ggtcctggtg attcctagcc ccgaacttga 2760

agaggctgtg ctacggagga acaaaagaag acctaccaac agtgggtcca aacctcttac 2820

tccagcaacc gtgcctggca cccggtcccc accgctgaat cgttacaaca gcacagggtc 2880

accaccagga aaacccccat ctacacagga tgagcacatc aactctgggg acacccccgc 2940

cgtcagggtc aaagaccgga aaccaccaat agggacccgc tctgtctcag attgtccagc 3000

caacggccgc ccaatccacc cgggtctaga gaccgactca acaaaaaagg gcataggaga 3060

gaacacatca tctatgaaag agatggctac attgttgacg agtcttggtg taatccagtc 3120

tgctcaagaa ttcgaatcat cccgagacgc gagttatgtg tttgcaagac gtgccctaaa 3180

gtctgcaaac tatgcagaga tgacattcaa tgtatgcggc ctgatccttt ctgccgagaa 3240

atcttccgct cgtaaggtag atgagaacaa acaactgctc aaacagatcc aagagagcgt 3300

ggaatcattc cgggatattt acaagagatt ctctgagtat cagaaagaac agaactcatt 3360

gctgatgtcc aacctatcta cacttcatat catcacagat agaggtggca agactgacaa 3420

cacagactcc cttacaaggt ccccctccgt ttttgcaaaa tcaaaagaga acaagactaa 3480

ggctaccagg tttgacccat ctatggagac cctagaagat atgaagtaca aaccggacct 3540

aatccgagag gatgaattta gagatgagat ccgcaacccg gtgtaccaag agagggacac 3600

agaacccagg gcctcaaacg catcacgtct ctttccctcc aaagagaagc ccacaatgca 3660

ctctctcagg ctcgtcatag agagcagtcc cctaagcaga gctgagaaag tagcatatgt 3720

gaaatcatta tccaagtgca agacagacca agaggttaag gcagtcatgg aactcgtaga 3780

agaggacata gagtcactga ccaactagat cccgggtgag gcatcctacc atcctcagtc 3840

atagagagat ccaatctacc atcagcatca gccagtaaag attaagaaaa acttagggtg 3900

aaagaaattt cacctaacac ggcgcaatgg cagatatcta tagattccct aagttctcat 3960

atgaggataa cggtactgtg gagcccctgc ctctgagaac tggtccggat aagaaagcca 4020

tcccccacat caggattgtc aaggtaggag accctcctaa acatggagtg agatacctag 4080

atttattgct cttgggtttc tttgagacac cgaaacaaac aaccaatcta gagagcgtat 4140

ctgacttgac agagccgacc agctactcaa tatgcggctc cgggtcgtta cccataggtg 4200

tggccaaata ctacgggact gatcaggaac tcttaaaggc ctgcaccgat ctcagaatta 4260

cggtgaggag ggctgttcga gcaggagaga tgatcgtata catggtggat tcgattggtg 4320

ctccactcct accatggtca ggcaggctga gacagggaat gatatttaat gcaaacaagg 4380

tcgcactagc tccccaatgc ctccctgtgg acaaggacat aagactcaga gtggtgtttg 4440

tcaatgggac atctctaggg gcaatcacca tatccaagat cccaaagacc cttgcagacc 4500

ttgcattgcc caactctata tctgttaatt tactggtgac actcaagacc gggatctcca 4560

cagaacaaaa gggggtactc ccagtacttg atgatcaagg ggagaaaaag ctcaatttta 4620

tggtgcacct cgggttgatc aggagaaagg tcgggaagat atactctgtt gagtactgca 4680

agagcaagat tgagagaatg cggctgattt tctcacttgg gttaatcggc ggtataagct 4740

tccatgttca ggttaatggg acactatcta agacattcat gagtcagctc gcatggaaga 4800

gggcagtctg cttcccatta atggatgtga atccccatat gaacatggtg atttgggcgg 4860

catctgtaga aatcacaggc gtcgatgcgg tgttccaacc ggccatccct cgtgatttcc 4920

gctactaccc taatgttgtg gctaagaaca tcggaaggat cagaaagctg taaatgtgca 4980

cccatcagag acctgcgaca atgccccaag cagacaccac ctggcagtcg gagccaccgg 5040

gtcactcctt gtcttaaata agaaaaactt agggataaag tcccttgtga gtgcttggtt 5100

aattaagcgg ccgccaaagt tcaatgcctg gctcagcact gctatgctgc ctgctcttac 5160

tgactggcat gaggatcagc aggggccagt acagccggga agacaataac tgcacccact 5220

tcccagtcgg ccagagccac atgctcctag agctgcggac tgccttcagc caggtgaaga 5280

ctttctttca aacaaaggac cagctggaca acatactgct aaccgactcc ttaatgcagg 5340

actttaaggg ttacttgggt tgccaagcct tatcggaaat gatccagttt tacctggtag 5400

aagtgatgcc ccaggcagag aagcatggcc cagaaatcaa ggagcatttg aattccctgg 5460

gtgagaagct gaagaccctc aggatgcggc tgaggcgctg tcatcgattt ctcccctgtg 5520

aaaataagag caaggcagtg gagcaggtga agagtgattt taataagctc caagaccaag 5580

gtgtctacaa ggccatgaat gaatttgaca tcttcatcaa ctgcatagaa gcatacatga 5640

tgatcaaaat gaaaagctaa ccgtagtaag aaaaacttag ggtgaaagtt catcgcggcc 5700

gcctcaaaca agcacagatc atggatggtg ataggggcaa acgtgactcg tactggtcta 5760

cttctcctag tggtagcacc acaaaaccag catcaggttg ggagaggtca agtaaagccg 5820

acacatggtt gctgattctc tcattcaccc agtgggcttt gtcaattgcc acagtgatca 5880

tctgtatcat aatttctgct agacaagggt atagtatgaa agagtactca atgactgtag 5940

aggcattgaa catgagcagc agggaggtga aagagtcact taccagtcta ataaggcaag 6000

aggttatagc aagggctgtc aacattcaga gctctgtgca aaccggaatc ccagtcttgt 6060

tgaacaaaaa cagcagggat gtcatccaga tgattgataa gtcgtgcagc agacaagagc 6120

tcactcagca ctgtgagagt acgatcgcag tccaccatgc cgatggaatt gccccacttg 6180

agccacatag tttctggaga tgccctgtcg gagaaccgta tcttagctca gatcctgaaa 6240

tctcattgct gcctggtccg agcttgttat ctggttctac aacgatctct ggatgtgtta 6300

ggctcccttc actctcaatt ggcgaggcaa tctatgccta ttcatcaaat ctcattacac 6360

aaggttgtgc tgacataggg aaatcatatc aggtcctgca gctagggtac atatcactca 6420

attcagatat gttccctgat cttaaccccg tagtgtccca cacttatgac atcaacgaca 6480

atcggaaatc atgctctgtg gtgacaaccc ggactagggg ttatcagctt tgctccatgc 6540

cgactgtaga cgaaagaacc gactactcta gtgatggtat tgaggatctg gtccttgatg 6600

tcctggatct caaagggaga actaagtctc accggtatcg caacagcgag gtagatcttg 6660

atcacccgtt ctctgcacta taccccagtg taggcaacgg cattgcaaca gaaggctcat 6720

tgatatttct tgggtatggt ggactaacca cccctctgca gggtgataca aaatgtagga 6780

cccaaggatg ccaacaggtg tcgcaagaca catgcaatga ggctctgaaa attacatggc 6840

taggagggaa acaggtggtc agcgtgatca tccaggtcaa tgactatctc tcagagaggc 6900

caaagataag agtcacaacc attccaatca ctcaaaacta tctcggggcg gaaggtagat 6960

tattaaaatt gggtgatcgg gtgtacatct atacaagatc atcaggctgg cactctcaac 7020

tgcagatagg agtacttgat gtcagccacc ctttgactat caactggaca cctcatgaag 7080

ccttgtctag accaggaaat gaagagtgca attggtacaa taagtgtccg aaggaatgca 7140

tatcaggcgt atacactgat gcttatccat tgtcccctga tgcagctaac gtcgctaccg 7200

tcacgctata tgccaataca tcgcgtgtca acccaacaat catgtattct aacactacta 7260

acattataaa tatgttaagg ataaaggatg ttcaattaga ggctgcatat accacgacat 7320

cgtgtatcac gcattttggt aaaggctact gctttcacat catcgagatc aatcagaaga 7380

gcctgaatac cttacagccg atgctcttta agactagcat ccctaaatta tgcaaggccg 7440

agtcttaaat ttaactgact agcaggcttg tcggccttgc tgacactaga gtcatctccg 7500

aacatccaca atatctctca gtctcttacg tctctcacag tattaagaaa aacccagggt 7560

gaatgggaag cttgccatag gtcatggatg ggcaggagtc ctcccaaaac ccttctgaca 7620

tactctatcc agaatgccac ctgaactctc ccatagtcag ggggaagata gcacagttgc 7680

acgtcttgtt agatgtgaac cagccctaca gactgaagga cgacagcata ataaatatta 7740

caaagcacaa aattaggaac ggaggattgt ccccccgtca aattaagatc aggtctctgg 7800

gtaaggctct tcaacgcaca ataaaggatt tagaccgata cacgtttgaa ccgtacccaa 7860

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tcttcgcggt ctcggatcgg ctgaccaggg agttatctag tgggttccag gatctttggt 7980

tgaatatctt caagcaacta ggcaatatag aaggaagaga ggggtacgat ccgttgcagg 8040

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tcctaacttg gttcagcatc aaatatgaca tgcggtggat gcagaagacc agaccggggg 8160

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catacggaga tcttgtcatg atactgaaca agttgacatt gacagggtat atcctaaccc 8280

ctgagctggt cttgatgtat tgtgatgttg tagaaggaag gtggaatatg tctgctgcag 8340

ggcatctaga taagaagtcc attgggataa caagcaaagg tgaggaatta tgggaactag 8400

tggattccct cttctcaagt cttggagagg aaatatacaa tgtcatcgca ctattggagc 8460

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tattcgcaaa aatgacttat aagatgcgag ccgtacaggt gctggcagag acactactgg 9300

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atgaaacgtt aagttgcttc ctcacaacag acctcaagaa atactgctta aactggagat 9600

ttgagagtac tgcattgttt ggtcagagat gcaacgagat atttggcttc aagaccttct 9660

ttaactggat gcatccagtc cttgaaaggt gtacaatata tgttggagat ccttactgtc 9720

cagtcgccga ccggatgcat cgacaactcc aggatcatgc agactctggc attttcatac 9780

ataatcctag ggggggcata gaaggttact gccagaagct gtggacctta atctcaatca 9840

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catccatagc aaaagctatc gaaaatgggt attctcctat actaggctac tgcattgcgt 10260

tgtataagac ctgtcagcag gtgtgcatat cactagggat gactataaat ccaactatca 10320

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attgggcttc agacccttat tcgtgtaacc tcccgcattc tcagagtata actacgatta 10620

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gttcagaggt gtgcaagctt tgcaggtctg aaggagcaga ccccatctat acatggttct 11160

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tgcttataag caagattgct cccaggctgg gcacggattg gaccaggcag ctcagcctat 13440

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catcagggat gcttagacct taccatcaag cactgcagac gtttggcttt gaaccaaact 13740

tgtataaatt gagcagagat ttcttgtcca ccatgaacat agctgataca cacaactgca 13800

tgatagcttt caacagggtt ttgaaggata caatcttcga atgggctaga ataactgagt 13860

cagataaaag gcttaaacta actggtaagt atgacctgta tcctgtgaga gattcaggca 13920

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gattggtaac tgggtcattc cctgaccaga agtttgaagc aagacttcaa ttgggaatag 14040

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tgattgatga tggatcacta ggtgatatcg agccatatga cagctcgtaa taattagtcc 14280

ctatcgtgca gaacgatcga agctccgcgg tacctggaag tcttggactt gtccatatga 14340

caatagtaag aaaaacttac aagaagacaa gaaaatttaa aaggatacat atctcttaaa 14400

ctcttgtctg gt 14412

<210>5

<211>14412

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>仙台病毒基因组RNA

<400>5

accagacaag aguuuaagag auauguaucc uuuuaaauuu ucuugucuuc uuguaaguuu 60

uucuuacuau ugucauaugg acaaguccaa gacuuccagg uaccgcggag cuucgaucgu 120

ucugcacgau agggacuaau uauuacgagc ugucauaugg cucgauauca ccuagugauc 180

caucaucaau cacggucgug uauucauuuu gccuggcccc gaacaucuug acugccccua 240

aaaucuucau caaaaucuuu auuucuuugg ugaggaaucu auacguuaua cuauguauaa 300

uauccucaaa ccugucuaau aaaguuuuug ugauaacccu cagguuccug auuucacggg 360

augauaauga aacuauuccc aauugaaguc uugcuucaaa cuucugguca gggaaugacc 420

caguuaccaa ucuuguggac auagauaaag auauccaaga uagcacaagu cuucuagaaa 480

uugucuucaa cuugccugaa ucucucacag gauacagguc auacuuacca guuaguuuaa 540

gccuuuuauc ugacucaguu auucuagccc auucgaagau uguauccuuc aaaacccugu 600

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ucaauuuaua caaguuuggu ucaaagccaa acgucugcag ugcuugaugg uaaggucuaa 720

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ccuucucuau uaagauccac uuuucuaucu ugaugcuauc uucuuuugac aaagggagga 840

gacuagcuaa cacugucuug cuguccucua uaaugucaga uuuggggugc cucgauagga 900

gauacaucuc uguggaagca ggguuagaug uuuuaagcac uauuagguua accucguccc 960

aguaucucag auauaggcug agcugccugg uccaauccgu gcccagccug ggagcaaucu 1020

ugcuuauaag cacaacgucu cgauccccca ccagauacgc gauccggauu acacuguaau 1080

gcucaugcag uacaacuuga ucauccuuau gaucuccucc cuccauguca caguggacua 1140

ggccuaucga gcuauucugu aauucauucc aaaucaaagc cucacacuca ucauucccaa 1200

uccaugucga gccaggauuc ccguugaaua acacuuuaac ucuuugaccc agacuaguaa 1260

cauuguuuaa uuucuuuccc acuagugcca ccucagcagg auauauauuu aacucucucu 1320

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uagcgucaua acaggaaagc auggccccag cuccuucccc uaaauauagc cuaucuuuau 1440

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gaccaacacc ugaucugccu aucucaccuc uugugaucuc cuuguacccc cggagacgca 1620

guaccuguga cuuggauacu cucaaccccc aaaaaggggc ucuagucuga ugucccaaag 1680

gaauauucug uuguauuucu gccgcgauac caucuaacag ugcauuaucu gccucgggau 1740

cccaaucuuc uaagacuuca gggacuccua uaccucuugu ccuuaacacu uuuauagaug 1800

acuuccggau auaggucaaa guagauggga auacuuugau gacuaggcca gucaacugac 1860

uguaccucag uaccggguca ucaagaaaug ugaguuccag guaacucuuu agugacucga 1920

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ugcauaggua ugcaagaugu cuugccaaga aagaggaccu ccucaugucg gccacaucug 2040

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gauccacaga auauucacag acagagaggg ccaagaguau cuuauccuga uuugagaggu 2160

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gagauagagc auuagauaag acuuuuaaaa cugcguggga gguaucuuua agaauccgga 2280

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ugucucuauc uaauugagac auuguaucag cuaucgucau ugcaguacag auacugguug 2520

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uugauauugu uaugaaccga cuugcacgga cuaguguugc acuagagaac uucaucuggg 2940

uugccguauc uuucaaccua ugagauagau uaguggaggu ugaaacagga gucagcagcu 3000

uuagauucuc uaagcucaga uuagcucuug uuugggcuau aagagcggcu uccauccacg 3060

auaucucauc agucccguag gcccacguau acaccauagc uauccggaug gccgccuuug 3120

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auccaaaaua ggggauucuu auagccggac auccguuugu aagcgugucc aggucuauag 3240

agucaggaag auagaaccau guauagaugg ggucugcucc uucagaccug caaagcuugc 3300

acaccucuga accuucgaua aauauucccc ucaagagcuc uaaagggucu gguguuucua 3360

gcccauguau gggucucccg uaagucaggu ggauccacau uuucugccuu agaccgacag 3420

cuagcucaac ugaacacaua uacucauauu cgauguuguc uuucaccggu uuccugagag 3480

uucuagucag ugucucguac ugcaauagau cauaauugac aagccuccuc aauaucccau 3540

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ugauauucuu uauaaucgua guuauacucu gagaaugcgg gagguuacac gaauaagggu 3840

cugaagccca aucuagaaaa cuagagucac cggguucuug auucaugacc cuguauaaua 3900

ccugcuuguc uaacagaucc gcucugauga aucuuuugag aucagcuagg gcugcuacug 3960

cggggucucc aauauuucua acaaagcauc uagauguaga cauguaguug aauccuccaa 4020

cauuugcugg aaucaacacu gcacaucuca gccaauucuu acccuuaaag uauugaucuc 4080

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uugcuaugga uguugagaug uucgaacaag cagaucuguu uucaucuacc agugucucgg 4260

accagaauac acacuugguc aaggcuuuca ggcacugugg uaaaaucuuc ccaucauagu 4320

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agacaugauu uuucuucugc uuguaagucu gagcuacagg uacucuugau gucacggcua 4500

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ugaacuccuc gucuuucaac caaucuccug acuccacaua auugauaauu ucuucugggu 5280

ugaaauucuc aucauuuaug aacacuucaa uaagccgccg ggucucuuca gacucugggg 5340

cuuuauagua cagauuacua uccggguaua cagaguccca ugccuccuuc cugggggaua 5400

gugcuuuguc uuucauauau auugugagau cuucaucuag uugugguucu auaaacuucc 5460

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gccacugucc gccaugccuc ucucuauacc cauuuaugau gauagugcaa aaaacugcau 5640

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ugucggcggc agugacagcc ucuaagcugg gguggccaaa uguccuaaag aaggaaaaga 5760

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cuggauagag uaugucagaa ggguuuuggg aggacuccug cccauccaug accuauggca 6840

agcuucccau ucacccuggg uuuuucuuaa uacugugaga gacguaagag acugagagau 6900

auuguggaug uucggagaug acucuagugu cagcaaggcc gacaagccug cuagucaguu 6960

aaauuuaaga cucggccuug cauaauuuag ggaugcuagu cuuaaagagc aucggcugua 7020

agguauucag gcucuucuga uugaucucga ugaugugaaa gcaguagccu uuaccaaaau 7080

gcgugauaca cgaugucgug guauaugcag ccucuaauug aacauccuuu auccuuaaca 7140

uauuuauaau guuaguagug uuagaauaca ugauuguugg guugacacgc gauguauugg 7200

cauauagcgu gacgguagcg acguuagcug caucagggga caauggauaa gcaucagugu 7260

auacgccuga uaugcauucc uucggacacu uauuguacca auugcacucu ucauuuccug 7320

gucuagacaa ggcuucauga gguguccagu ugauagucaa aggguggcug acaucaagua 7380

cuccuaucug caguugagag ugccagccug augaucuugu auagauguac acccgaucac 7440

ccaauuuuaa uaaucuaccu uccgccccga gauaguuuug agugauugga augguuguga 7500

cucuuaucuu uggccucucu gagagauagu cauugaccug gaugaucacg cugaccaccu 7560

guuucccucc uagccaugua auuuucagag ccucauugca ugugucuugc gacaccuguu 7620

ggcauccuug gguccuacau uuuguaucac ccugcagagg ggugguuagu ccaccauacc 7680

caagaaauau caaugagccu ucuguugcaa ugccguugcc uacacugggg uauagugcag 7740

agaacgggug aucaagaucu accucgcugu ugcgauaccg gugagacuua guucucccuu 7800

ugagauccag gacaucaagg accagauccu caauaccauc acuagaguag ucgguucuuu 7860

cgucuacagu cggcauggag caaagcugau aaccccuagu ccggguuguc accacagagc 7920

augauuuccg auugucguug augucauaag ugugggacac uacgggguua agaucaggga 7980

acauaucuga auugagugau auguacccua gcugcaggac cugauaugau uucccuaugu 8040

cagcacaacc uuguguaaug agauuugaug aauaggcaua gauugccucg ccaauugaga 8100

gugaagggag ccuaacacau ccagagaucg uuguagaacc agauaacaag cucggaccag 8160

gcagcaauga gauuucagga ucugagcuaa gauacgguuc uccgacaggg caucuccaga 8220

aacuaugugg cucaaguggg gcaauuccau cggcauggug gacugcgauc guacucucac 8280

agugcugagu gagcucuugu cugcugcacg acuuaucaau caucuggaug acaucccugc 8340

uguuuuuguu caacaagacu gggauuccgg uuugcacaga gcucugaaug uugacagccc 8400

uugcuauaac cucuugccuu auuagacugg uaagugacuc uuucaccucc cugcugcuca 8460

uguucaaugc cucuacaguc auugaguacu cuuucauacu auacccuugu cuagcagaaa 8520

uuaugauaca gaugaucacu guggcaauug acaaagccca cugggugaau gagagaauca 8580

gcaaccaugu gucggcuuua cuugaccucu cccaaccuga ugcugguuuu guggugcuac 8640

cacuaggaga aguagaccag uacgagucac guuugccccu aucaccaucc augaucugug 8700

cuuguuugag gcggccgcga ugaacuuuca cccuaaguuu uucuuacuac gguuagcuuu 8760

ucauuuugau caucauguau gcuucuaugc aguugaugaa gaugucaaau ucauucaugg 8820

ccuuguagac accuuggucu uggagcuuau uaaaaucacu cuucaccugc uccacugccu 8880

ugcucuuauu uucacagggg agaaaucgau gacagcgccu cagccgcauc cugagggucu 8940

ucagcuucuc acccagggaa uucaaaugcu ccuugauuuc ugggccaugc uucucugccu 9000

ggggcaucac uucuaccagg uaaaacugga ucauuuccga uaaggcuugg caacccaagu 9060

aacccuuaaa guccugcauu aaggagucgg uuagcaguau guuguccagc ugguccuuug 9120

uuugaaagaa agucuucacc uggcugaagg caguccgcag cucuaggagc auguggcucu 9180

ggccgacugg gaagugggug caguuauugu cuucccggcu guacuggccc cugcugaucc 9240

ucaugccagu caguaagagc aggcagcaua gcagugcuga gccaggcauu gaacuuuggc 9300

ggccgcuuaa uuaaccaagc acucacaagg gacuuuaucc cuaaguuuuu cuuauuuaag 9360

acaaggagug acccgguggc uccgacugcc aggugguguc ugcuuggggc auugucgcag 9420

gucucugaug ggugcacauu uacagcuuuc ugauccuucc gauguucuua gccacaacau 9480

uaggguagua gcggaaauca cgagggaugg ccgguuggaa caccgcaucg acgccuguga 9540

uuucuacaga ugccgcccaa aucaccaugu ucauaugggg auucacaucc auuaauggga 9600

agcagacugc ccucuuccau gcgagcugac ucaugaaugu cuuagauagu gucccauuaa 9660

ccugaacaug gaagcuuaua ccgccgauua acccaaguga gaaaaucagc cgcauucucu 9720

caaucuugcu cuugcaguac ucaacagagu auaucuuccc gaccuuucuc cugaucaacc 9780

cgaggugcac cauaaaauug agcuuuuucu ccccuugauc aucaaguacu gggaguaccc 9840

ccuuuuguuc uguggagauc ccggucuuga gugucaccag uaaauuaaca gauauagagu 9900

ugggcaaugc aaggucugca agggucuuug ggaucuugga uauggugauu gccccuagag 9960

augucccauu gacaaacacc acucugaguc uuauguccuu guccacaggg aggcauuggg 10020

gagcuagugc gaccuuguuu gcauuaaaua ucauucccug ucucagccug ccugaccaug 10080

guaggagugg agcaccaauc gaauccacca uguauacgau caucucuccu gcucgaacag 10140

cccuccucac cguaauucug agaucggugc aggccuuuaa gaguuccuga ucagucccgu 10200

aguauuuggc cacaccuaug gguaacgacc cggagccgca uauugaguag cuggucggcu 10260

cugucaaguc agauacgcuc ucuagauugg uuguuuguuu cggugucuca aagaaaccca 10320

agagcaauaa aucuagguau cucacuccau guuuaggagg gucuccuacc uugacaaucc 10380

ugaugugggg gauggcuuuc uuauccggac caguucucag aggcaggggc uccacaguac 10440

cguuauccuc auaugagaac uuagggaauc uauagauauc ugccauugcg ccguguuagg 10500

ugaaauuucu uucacccuaa guuuuucuua aucuuuacug gcugaugcug augguagauu 10560

ggaucucucu augacugagg augguaggau gccucacccg ggaucuaguu ggucagugac 10620

ucuauguccu cuucuacgag uuccaugacu gccuuaaccu cuuggucugu cuugcacuug 10680

gauaaugauu ucacauaugc uacuuucuca gcucugcuua ggggacugcu cucuaugacg 10740

agccugagag agugcauugu gggcuucucu uuggagggaa agagacguga ugcguuugag 10800

gcccuggguu cugugucccu cucuugguac accggguugc ggaucucauc ucuaaauuca 10860

uccucucgga uuagguccgg uuuguacuuc auaucuucua gggucuccau agauggguca 10920

aaccugguag ccuuagucuu guucucuuuu gauuuugcaa aaacggaggg ggaccuugua 10980

agggagucug uguugucagu cuugccaccu cuaucuguga ugauaugaag uguagauagg 11040

uuggacauca gcaaugaguu cuguucuuuc ugauacucag agaaucucuu guaaauaucc 11100

cggaaugauu ccacgcucuc uuggaucugu uugagcaguu guuuguucuc aucuaccuua 11160

cgagcggaag auuucucggc agaaaggauc aggccgcaua cauugaaugu caucucugca 11220

uaguuugcag acuuuagggc acgucuugca aacacauaac ucgcgucucg ggaugauucg 11280

aauucuugag cagacuggau uacaccaaga cucgucaaca auguagccau cucuuucaua 11340

gaugaugugu ucucuccuau gcccuuuuuu guugagucgg ucucuagacc cggguggauu 11400

gggcggccgu uggcuggaca aucugagaca gagcgggucc cuauuggugg uuuccggucu 11460

uugacccuga cggcgggggu guccccagag uugaugugcu cauccugugu agaugggggu 11520

uuuccuggug gugacccugu gcuguuguaa cgauucagcg guggggaccg ggugccaggc 11580

acgguugcug gaguaagagg uuuggaccca cuguugguag gucuucuuuu guuccuccgu 11640

agcacagccu cuucaaguuc ggggcuagga aucaccagga ccccaguuac ucuugcacua 11700

ugugagcugc caggcuccau gcuucuucca uuauuacuug cuccaccuuc uccuucauca 11760

gguagggaug uacuuccucg uaccucuucu ggaaguccuu cagcuugguc uucuccccuc 11820

uuaucagggu gcgcagccau cucucuguuu ucaucuucaa uaccugaucu cggauauccu 11880

cucucauuug gaggauuuuc aaggauuccg gagucuccuc caucgcccag auccugagau 11940

acagaguuug uaccaguucu ucccccaaag gcccggugua uauuuuguuu aucaagguuu 12000

ccagcaugug cuucugccuc uggcuugcuu guucucccag agacucuacu cuccucaccu 12060

gaucgauuau cuugggucga cgguguugag acuucuccuu cgcccucacu uuuggcucua 12120

ugagcagagc cugguccuug gggaguguug augguguugu ggagccagcu ucuguccccu 12180

ccgaugucag uugguucacu cgacaggaca gcaucgagga auccgauaac auccgagagc 12240

gacucucguc cuccuggcgc cucccucuca acuucagaau cuucuuuaag aaugaaggca 12300

ucuugaucca ugcgguaagu guagccgaag ccguggcugu cucgacugcu gggugugguc 12360

ggugggguug gguguggccu ugccugagcc gaucggugga ugaacuuuca cccuaaguuu 12420

uucuuacuac ggaucaagua ccuugaagcc ucguaugauc cuagauuccu ccuaucccag 12480

cuacugcugc ggcaucguca ucuucgucau gaucgacacc guuauugcgg ccuucaucuc 12540

cauggguugc agaauccucu ugccgucucu cugcgagucu cauggcuauu cuucucucua 12600

ugucugauac auccucauca uugguuuccu ccucuaaccg uucagcccca uguaguguga 12660

caaaguggcc accacucacc ugacgugccc aucuuucacc acuaucucca ccccaacccc 12720

uagcguccug guccgcaugg gcuuuuguuu cuaggucgau gucggcauug ucuagagcua 12780

ccucaauugc accaccgccu guugguuugu gguaagcacc auccccaccg gacaaguuug 12840

ccagaugaug ucugagccuc cccuuggcug uauccgucac uccuaacuca ucuuccaagg 12900

cacugcugau cuucgauuca gcauccuuug ccacggcuug uccuaguaag aacauuucca 12960

uaucaaggua uguccucccu gugacguacu gcugcauugc cuuguucugu acgacggcga 13020

cucccauggc guaacuccau agugcaggau aauugccugg agcaaauuca ccaugaacag 13080

gguccuugag gauacagaua aagggagcuc uggggccuuu ugacagguag gugucuauga 13140

ggcuucuaag cuuauuaaua ucgggccuca gguuugacaa cguuagagcu gccaucuuug 13200

uuuccacccc auauuuaaua guguucauga aggaagccag cccugcaucu cggauguagu 13260

ucccaacgau cuggauguuc uucucuaaug uggugagauc agaucuugca guauucauag 13320

ucacaagggu cucaaccaug agagauacaa ggcuuugcug agaucucaua accgagccua 13380

uccccucaac ugucucccca gugaaaacua aggcaccuuu cacggugccg ucuugucuga 13440

acgccucuaa ccuguugaag aacccuuucc uuaagccggc gcugcuugug auggccuuca 13500

ccagcacaau ccagacuugg acaauuauug cuccuaggca ugcaggauac ccauagauuu 13560

gaaggagugu gucagggucu gcagcauccc guugacccug gaagaguggg cucuuguuga 13620

ccauaggucc aaacagccau ucuguggucc ucucauauuc cauaucucuc gucuucacaa 13680

ugaauccguc ugucuucguc cucuuagggu cuuucucuau guuguagauc acauauuuga 13740

caucggcguu uacuccguuu guugucaagu acaauucugg acuacuguaa gccauggcaa 13800

gcagagagac gaggaacccc ccucucugag agugcugcuu aucugugucc aaugagugag 13860

cuaggaaggu aguugcaaug aauaacuugu cugcaucauc agucacacuu gggccuagua 13920

cgaacacuga gacugugcuc cucuggccgg ggauaacagc accuccuccc gacuuauuaa 13980

uacuuucgcu ccuccuagag cuaaauguau cgaaggugcu caacaacccg gccaucguga 14040

agaucugcgg ccgcgaugaa cuuucacccu aaguuuuucu uacuacgguu aagucgcuau 14100

gacaacaccg cccaccauga guccaaugau ugcaccuuug uuugaaccca caucuucugc 14160

aaagaacacc aauuuuugau gaugaacuuc auauccugag ucaugucgga auucugcauc 14220

aagcgcccga gccguccagg cggccagcag gagcagugcc aaaccgggca gcauaaguga 14280

accuuggcgg ccgcgugaac uuuggcagca aagcaaaggg ucuggaaccu gcuccucagg 14340

guggauacuu ugacccuaaa auccuguaua acuucauuac auaucccaua cauguuuuuu 14400

cucuuguuug gu 14412

<210>6

<211>9

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>负链RNA病毒的起始(S)序列

<400>6

uuucacccu 9

<210>7

<211>9

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>负链RNA病毒的起始(S)序列

<400>7

uuugacccu 9

<210>8

<211>9

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>负链RNA病毒的起始(S)序列

<400>8

9

auucacccu

<210>9

<211>9

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>负链RNA病毒的起始(S)序列

<400>9

tttcaccct 9

<210>10

<211>9

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>负链RNA病毒的起始(S)序列

<400>10

tttgaccct 9

<210>11

<211>9

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>负链RNA病毒的起始(S)序列

<400>11

attcaccct 9

<210>12

<211>15

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>负链RNA病毒的终止(E)序列

<400>12

tttttcttac tacgg 15

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>间隔序列

<400>13

cggccgcaga tcttcacg 18

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>间隔序列

<400>14

atgcatgccg gcagatga 18

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于扩增仙台病毒基因组片段的引物

<400>15

gttgagtact gcaagagc 18

<210>16

<211>42

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于扩增仙台病毒基因组片段的引物

<400>16

tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc 42

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于扩增仙台病毒基因组片段的引物

<400>17

atgcatgccg gcagatga 18

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于扩增仙台病毒基因组片段的引物

<400>18

tgggtgaatg agagaatcag c 21

<210>19

<211>50

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>19

attgcggccg ccaaggttca cttatgctgc ccggtttggc actgctcctg 50

<210>20

<211>81

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>20

attgcggccg cgatgaactt tcaccctaag tttttcttac tacggttaag tcgctatgac 60

aacaccgccc accatgagtc c 81

<210>21

<211>248

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的序列

<400>21

gcggccgcca aggttcactt atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga 60

cggctcgggc gcttgatgca gaattccgac atgactcagg atatgaagtt catcatcaaa 120

aattggtgtt ctttgcagaa gatgtgggtt caaacaaagg tgcaatcatt ggactcatgg 180

tgggcggtgt tgtcatagcg acttaaccgt agtaagaaaa acttagggtg aaagttcatc 240

gcggccgc 248

<210>22

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>22

acttgcggcc gccaaagttc aatgcctggc tcagcactgc tatgctgcct g 51

<210>23

<211>79

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>23

atccgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggttag cttttcattt 60

tgatcatcat gtatgcttc 79

<210>24

<211>596

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的序列

<400>24

gcggccgcca aagttcaatg cctggctcag cactgctatg ctgcctgctc ttactgactg 60

gcatgaggat cagcaggggc cagtacagcc gggaagacaa taactgcacc cacttcccag 120

tcggccagag ccacatgctc ctagagctgc ggactgcctt cagccaggtg aagactttct 180

ttcaaacaaa ggaccagctg gacaacatac tgctaaccga ctccttaatg caggacttta 240

agggttactt gggttgccaa gccttatcgg aaatgatcca gttttacctg gtagaagtga 300

tgccccaggc agagaagcat ggcccagaaa tcaaggagca tttgaattcc ctgggtgaga 360

agctgaagac cctcaggatg cggctgaggc gctgtcatcg atttctcccc tgtgaaaata 420

agagcaaggc agtggagcag gtgaagagtg attttaataa gctccaagac caaggtgtct 480

acaaggccat gaatgaattt gacatcttca tcaactgcat agaagcatac atgatgatca 540

aaatgaaaag ctaaccgtag taagaaaaac ttagggtgaa agttcatcgc ggccgc 596

<210>25

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>25

aagcggccgc ctcaaacaag cacagatcat ggatg 35

<210>26

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>26

aggcggccgc ttaattaacc aagcactcac aagg 34

<210>27

<211>43

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>27

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu ValHis His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

35 40

<210>28

<211>61

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>包含A-β片段的多肽

<400>28

Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg

15 10 15

Ala Leu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His

20 25 30

Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala

35 40 45

Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr

50 55 60

<210>29

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>29

tgcttggtta attaagcttt cacctcaaac aagca 35

<210>30

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>30

tgcttggtta attaagcggc cgcctcaaac aagca 35

Claims

1.一种负链RNA病毒载体，该载体含有编码β淀粉样蛋白的核酸。

2.权利要求1的负链RNA病毒载体，其中所述载体还包含编码Th2细胞因子或其部分肽的核酸。

3.权利要求2的负链RNA病毒载体，其中所述Th2细胞因子或其部分肽是IL-10或其部分肽。

4.权利要求1的载体，其中所述负链RNA病毒载体是副粘病毒载体。

5.权利要求4的载体，其中所述副粘病毒载体是仙台病毒载体。

6.权利要求1的载体，其中所述β淀粉样蛋白是Aβ43或其部分肽。

7.权利要求1的载体，其中所述β淀粉样蛋白来源于人。

8.权利要求3的载体，其中所述IL-10源于小鼠或人。

9.权利要求1的载体，其中所述β淀粉样蛋白是序列号为1的核苷酸序列所编码的多肽或其一部分。

10.权利要求3的载体，其中所述IL-10是序列号为2或3的核苷酸序列所编码的多肽。

11.权利要求1的负链RNA病毒载体，其中所述载体包含序列号为5的核酸。

12.包含权利要求1-11中任一项所述的载体及药理学上可容许的承运体的组合物。

13.权利要求12的组合物，其中还包括(i)以可表达样式编码Th2细胞因子或其部分肽的核酸，(ii)Th2细胞因子或其部分肽，或(iii)Th2佐剂。

14.权利要求13的组合物，其中包含Th2细胞因子、其部分肽或Th2佐剂。

15.权利要求13的组合物，其中包含以可表达样式编码Th2细胞因子或其部分肽的核酸。

16.权利要求15的组合物，其中所述Th2细胞因子是由包含有编码β淀粉样蛋白的核酸的负链RNA病毒载体所编码的。

17.权利要求15的组合物，其中所述Th2细胞因子是由包含编码β淀粉样蛋白的核酸的负链RNA病毒载体以外的载体所编码的。

18.权利要求12的组合物，该组合物是药学组合物。

19.用于治疗和预防阿尔茨海默病的药学组合物，包含权利要求1-11中任一项所述的载体。

20.权利要求19的组合物，还包含(i)以可表达样式编码Th2细胞因子或其部分肽的核酸，(ii)Th2细胞因子或其部分肽，或(iii)Th2佐剂。

21.权利要求18或19的药学组合物，是用于鼻腔内给药的药学组合物。

22.一种使β淀粉样蛋白沉淀减少的方法，其中包含给药权利要求1-11中任一项所述的载体，或者包含该载体的组合物的步骤。

23.一种阿尔茨海默病的治疗或预防方法，其中包含给药权利要求1-11中任一项所述的载体或者包含该载体的组合物的步骤。

24.权利要求22或23中所述的方法，所述给药为鼻腔内给药。

25.权利要求22或23中所述的方法，所述给药为肌肉内给药。

26.权利要求22或23的方法，其中还包含给药Th2细胞因子、其部分肽、Th2佐剂或编码Th2细胞因子及其部分肽载体的步骤。

27.权利要求26的方法，其中所述方法为给药Th2细胞因子、其部分肽、或Th2佐剂的方法。

28.权利要求26中所述的组合物，其中给药编码Th2细胞因子或其部分肽的载体。