KR20020013565A - 개변된 전사개시서열을 갖는 파라믹소바이러스 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 전사개시서열의 개변에 의해 그 하류 유전자군의 발현이 개변된 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터 및 그들의 제조 및 용도를 제공한다. 센다이 바이러스가 갖는 각 유전자 전사개시서열의 전사개시효율을 측정한 바, F 유전자의 전사개시서열은, 다른 3개의 전사개시서열에 비해, 전사를 촉진하는 능력이 유의하게 낮은 것이 판명되었다. 또한, 야생형 센다이 바이러스의 F 유전자 전사개시서열을, 효율이 높은 P/M/HN 유전자형 전사개시서열로 치환한 바, 이 변이형 센다이 바이러스의 F 유전자 및 그 하류의 유전자 발현량은 증가하고, 야생형에 비해 빨리 증식하는 것이 판명되었다. 본 발명의 벡터는, 외래유전자의 고발현을 위해, 또한, 의약품조성물 및 백신의 제조를 위해 유용하다.

Description

개변된 전사개시서열을 갖는 파라믹소바이러스{Paramyxoviruses having modified transcription initiation sequence}

기술분야

본 발명은, 전사개시서열이 개변된 재조합 파라믹소바이러스과 바이러스에 관한 것이다.

배경기술

파라믹소바이러스는 비분절형 음성가닥(negative strand) RNA를 게놈으로서 갖는다. 게놈에는 6개의 유전자가 코드되어 있고, 각 유전자에는 짧은 서열(E-IG-S 시그날)이 공통적으로 연결되어 있다. 이들 시그날서열의 보존성은, 속(genus) 및 과(family)내에서 특히 높고, 동일한 종(species)에 속하는 바이러스의 유전자 내에서는 지극히 높다(Feldmann, H. E. et al., 1992, Virus Res. 24:1-19).

센다이 바이러스(Sendai virus; SeV)는 파라믹소바이러스과 (Paramyxoviridae)의 레스피로바이러스(Respirovirus)로 분류되어 있는, 엔벨로프(envelope)를 가지는 비분절형 음성가닥 RNA 바이러스로, 파라믹소바이러스아과(Paramyxovirinae)의 원형이라고 생각되고 있다. SeV의 게놈사이즈는 15,384염기이고, 3'의 짧은 리더영역에 이어, N(뉴클레오캡시드), P(포스포), M(매트릭스), F(퓨젼), HN(헤마글루티닌-뉴라미니다아제) 및 L(라지)단백질을 코드하는 6개의 유전자가 늘어서 있고, 짧은 5'트레일러영역을 다른 말단에 갖는다. P 단백질에 더하여, 주형에 없는 G 잔기가 삽입되는 co-transcriptional editing(전사에 공역한 RNA 편집)(Park, K.H. and M.Krystal, 1992, J. Virol. 66:7033-7039; Paterson, R.G., and R.A. Lamb, 1990, J. Virol. 64:4137-4145; Thomas, S.M. et al., 1988, Cell, 54:891-902; Vidal, S. et al., 1990, J. Virol. 64:239-246) 및 선택적 번역개시기구(Gupta, K.C., and E. Ono, 1997, J. 321:811-818; Kuronati, A. et al., 1998, Genes Cells 3:111-124)에 의해, 제2 유전자가 각각 액세사리단백질(accessory protein) V 및 C를 발현한다. 게놈은 N 단백질과 강하게 결합하고 있어, 나선형(helical) 리보핵단백질(RNP)복합체를 형성하고 있다. 나출 RNA(naked RNA)가 아니라, 이 RNP가 전사 및 복제를 위한 주형으로 된다(Lamb, R.A., and D. Kolakofsky, 1996,Paramyxoviridae: The viruses and their replication. pp.1177-1204.InFields Virology, 3rd edn. Fields, B. N., D. M. Knipe, and P. M. Howley et al.(ed.), Raven Press, New York, N.Y.). P 단백질과 L 단백질을 포함하는 바이러스의 RNA 폴리머라아제(polymerase)에 대한 프로모터는, 3'말단의 하나 밖에 존재하지 않는다(Hamaguchi, M. et al., 1983, Virology 128:105-117). 각 유전자의 경계부에 있는 짧은 보존된 전사종결서열(E 시그날) 및 전사개시서열(S 시그날)을 인식함으로써, 이 폴리머라아제는 리더 RNA와 각 mRNA를 생성한다(Glazier, K. et al., 1997, J. Virol. 21:863-871). 전사종결서열과 전사개시서열 사이에는, 전사되지 않는 3염기의 개재(IG)서열이 존재한다(Gupta, K.C., and D. W. Kingsbury, 1984, Nucleic Acids Res. 12:3829-3841; Luk, D. et al., 1987, Virology 160:88-94). 각 유전자의 경계로부터의 전사의 재개시효율은 높지만 완전하지는 않기 때문에, 상류의 유전자 보다도 하류 유전자의 전사량은 감소한다. 따라서, 감염세포에 있어서 각 mRNA는 등몰로는 합성되지 않고, 5'말단으로 갈수록 전사량이 감소하는 극성 효과가 보인다(Glazier, K. et al., 1997, J. Virol. 21:863-871; Homann, H. E. et al., 1990, Virology 177:131-140; Lamb, R.A., and D. Kolakofsky, 1996,Paramyxoviridae: The viruses and their replication. pp.1177-1204.InFields Virology, 3rd edn. Fields, B. N., D. M. Knipe, and P. M. Howley et al.(ed.), Raven Press, New York, N. Y.).

mRNA가 번역되어 번역산물이 축적되면, 게놈의 복제가 시작된다. 이 때, 동일한 바이러스 RNA 폴리머라아제는, 동일한 RNP를 주형으로 하여 복제를 행하지만, 각 mRNA의 전사종결서열 및 전사개시서열은 무슨 이유에선지 무시되어, 전장 안티게놈의 포지티브 센스(+)RNP를 생성한다(Lamb, R.A., and D. Kolakofsky, 1996,Paramyxoviridae: The viruses and their replication. pp.1177-1204.InFields Virology, 3rd edn. Fields, B. N., D. M. Knipe, and P. M. Howley et al.(ed.), Raven Press, New York, N. Y.). 폴리머라아제는 (+)RNP의 3'말단에 있는 프로모터에 들어가 게놈(-)RNP를 생성한다. 이것이 다음의 전사 및 복제의 주형으로서 작용한다.

전사종결서열(E 시그날)(게놈의 네거티브 센스에서는, 3'-AUUCUUUUUU-5')은, SeV 게놈의 6개의 유전자에서 완전히 보존되어 있다. 전사종결서열의 후반부 5개의U 잔기는 폴리머라아제의 슬립을 일으켜, 폴리(A)를 생기게 하는 것으로 생각되고 있다. 이에 대해, 전사개시서열은 약간이긴 하지만 다양성이 있어, 일반적으로는 3'-UCCCWVUUWC-5'(Gupta, K. C., and D. W. Kingsbury, 1984, Nucleic Acids Res. 12:3829-3841)로 나타내어진다. 구체적으로는, P, M 및 HN 유전자에서는, UCCCACUUUC, N 유전자에서는 UCCCAgUUUC, F 유전자에서는 UCCCuaUUUC, 그리고 L 유전자에서는 UCCCACUUaC이다. 이 차이는, 이제까지 서열이 결정되어 있는 모든 SeV의 주에서 공통적으로, 바이러스의 단리경로나 패시지(passage)의 이력 및 마우스 등의 천연숙주에 대한 병원성 정도와 상관 없었다. 이 사실로부터, 이 변이는 위치특이적인 것이 시사된다. 이들 상이함은, 전사개시서열중에서, 변이하더라도 기능에 영향을 받지 않는 부분에 염기치환이 축적된 결과일 가능성도 있지만, 다른 가능성으로서는, 바이러스의 진화과정에서 시그날의 중요한 부분에 염기치환이 들어가, 각 유전자의 발현을 조절하는 능력을 획득한 것이 선택된 결과라고도 생각할 수 있다.

지금까지, 모델 주형계를 사용한 여러 비분절형 음성가닥 RNA 바이러스의 연구에 의해, 전사개시서열은 실제 전사개시에는 필수이지만, 그 서열중의 변이는 어느 정도 허용되는 것이 나타나 있다(Barr, J. N. et al., 1997, J. Virol. 71:1794-1801; Barr, J. N. et al., 1997, J. Virol. 71:8718-8725; Hwang, L. N. et al., 1998, J. Virol. 72:1805-13; Kuo, L. et al., 1996, J. Virol. 70:6143-6150; Rassa, J. C., and G. D. Parks, 1998, Virology, 247:274-286; Stillman E. A., and M. A. Whitt, 1998, J. Vriol. 72: 5565-5572). 그들 전사개시서열의 어느한 종의 염기변이는, 전사의 개시효율을 저하시키는 것으로부터, 천연적으로 일어나는 변이(variation)에 의해서도 바이러스의 라이프사이클에 있어서 유전자발현이 개변된 것이 시사되어 있다(Kuo, L. et al., 1996, J. Virol. 70:6892-6901; Kuo, L. et al., 1997, J. Virol. 71:4944-4953; Stillman E. A., and M. A. Whitt, 1997, J. Virol. 71:2127-2137). 그러나 모델 주형계에서는, 트랜스로 작용하는 단백질이 계속적으로 공급되기 때문에, 초기전사와 같이 자연의 라이프사이클 초기에 요구되는 사상(事象)은 모두 바이패스(bypass)되어 버린다(Nagai, Y. Paramyxovirus replication and pathogenesis. Reverse genetics transforms understanding. Rev. Medical. Virol. 9(2):83-99(1999)). 또한, 이들 계에서는, 미니게놈의 전사와 복제는 커플하지 않았다. 더욱이, 트랜스로 작용하는 단백질을 공급하기 위해 자주 사용되는 T7 폴리머라아제발현 백시니아바이러스(vaccinia virus)는, 예를 들면 백시니아바이러스가 코드하는 캡핑(capping)효소에 의한 전사후 수식 등에 의해, 변이에 의한 약간의 영향을 덮어 숨겨버린다. 그것에 더하여, 트랜스펙션의 효율은 전체 실험을 통해 동일하지 않을 지도 모른다(Bukreyev, A. et al., 1996, J. Virol. 70:6634-6641; He, B. et al., 1997, Virology 237:249-260). 즉 모델 주형계에서는, 전사개시에 미치는 전사개시서열의 염기치환의 효과를 정확하게 검증하는 것은 불가능하다고 생각된다. 따라서, 전사개시서열 및 전사종결서열의 역할을 포괄적으로 조사하기 위해서는, 전장 바이러스 게놈에 변이를 도입할 필요가 있었다.

발명의 개시

본 발명은, 전사개시서열의 개변에 의해 그 하류 유전자군의 발현이 개변된 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터 및 그들의 제조 및 용도를 제공하는 것을 과제로 하고 있다.

본 발명자 등은 이미, 재조합 DNA 기술을 사용하여 게놈을 조작하고, 감염성 센다이 바이러스(SeV)를 작출하는 계를 구축하는 것에 성공했다. 이 계를 사용하면, DNA를 베이스로 하여 음성가닥 RNA 바이러스를 재생시킬 수 있어, 감염성 바이러스의 여러 유전자조작을 통한 센다이 바이러스의 리버스 제네틱스(reverse genetics)를 행하는 것이 가능해진다(Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16:578-587; Kato, A. et al., 1997, J. Virol. 71:7266-7272; Kuo, L. et al., 1996, J. Virol. 70:6892-6901; Nagai, Y., 1999, Rev. Medical. Virol. 9: 83-99; Sakaguchi, T. et al., 1997, Virology 235: 360-366). 본 발명자 등은, 이 계를 사용하여 SeV의 전사개시서열에 발견된 이질성의 의미를 명확하게 하는 것을 시도했다.

신규하게 합성한 전사종결서열 및 전사개시서열을 반디 루시페라아제유전자의 상류에 연결하여, N 유전자 비코드영역의 하류에 삽입했다. 이 전사개시서열은 천연적으로 생긴 상기 4개의 변이와 동일해지도록 설계했다. 구축한 재조합 바이러스에서는, N mRNA의 전사는 자신의 전사개시서열부터 시작되어, 리포터(루시페라아제)유전자와 함께 도입된 합성 전사종결서열에서 종결한다. 그리고, 각각 다른 전사개시서열로부터 전사되는 리포터유전자의 발현을 정량하여, 비교했다.

그 결과, 천연 F 유전자의 전사개시서열은, 다른 3종의 전사개시서열에 비해 재개시활성이 유의하게 낮은 것이 판명되었다. 신규한 단백질합성을 블록하여, 게놈복제를 저해하면 전사 만이 일어나고, 복제는 일어나지 않는다. 이 조건에서 실험함으로써, 루시페라아제 유전자발현의 감소가, 실제, F 유전자의 전사개시서열에 의해 전사레벨에서 감소하는 것이 주된 요인으로, 복제의 결과에 따른 2차적인 것은 아닌 것이 확인되었다(도4). 또한 이 실험으로부터, F 유전자의 전사개시서열에 의한 재개시활성은, 다른 3개의 전사개시서열에 의한 재개시활성에 비해 약 1/4인 것이 판명되었다.

더욱이, F 유전자가 천연에 가지는 전사개시서열을, 재개시효율이 보다 높은 P/M/HN 유전자의 전사개시서열로 치환하여, 회수한 바이러스(SeV/mSf)의 배양세포, 알 및 마우스에서의 복제능을 조사함으로써, 다른 전사개시서열의 재개시능을 검토했다. 그 결과, 본 발명자 등은 교환된 전사개시서열이 F 유전자 뿐 아니라, 그 하류 유전자군의 발현도 증강시키는 것을 발견했다. 이 증강은, 역시 전사레벨이었다(도7, 9).

즉, 본 발명자 등은, 파라믹소바이러스과 바이러스의 각 유전자 전사개시서열의 재개시활성이 전사개시서열에 따라 다른 것을 발견하는 동시에, 특정 유전자의 전사개시서열을 재개시활성이 다른 그 밖의 전사개시서열로 치환함으로써 상기 서열 바로아래의 유전자 뿐 아니라 더욱이 하류 유전자군의 발현도 전사레벨로 개변할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은, 전사개시서열의 개변에 의해 그 하류 유전자군의 발현이 개변된파라믹소바이러스과 바이러스 벡터 및 그들의 제조 및 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는,

(1) 파라믹소바이러스과 바이러스 게놈상의 적어도 하나의 유전자 전사개시서열이 개변됨으로써, 숙주내에 있어서의 상기 유전자 및 그 하류 유전자의 발현량이 개변된, 바이러스 벡터 DNA,

(2) (1)에 있어서, 전사개시서열의 개변이 파라믹소바이러스과 바이러스의 다른 유전자 전사개시서열로의 치환인 바이러스 벡터 DNA,

(3) (1)에 있어서, 전사개시서열의 개변이 F 유전자 전사개시서열의 다른 유전자 전사개시서열로의 치환인 바이러스 벡터 DNA,

(4) (3)에 있어서, 다른 유전자 전사개시서열이 P/M/HN 유전자형 전사개시서열인 바이러스 벡터 DNA,

(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, F 유전자 및/또는 HN 유전자가 결손되어 있는 바이러스 벡터 DNA,

(6) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 외래유전자가 삽입되어 있는 바이러스 벡터 DNA,

(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 바이러스 벡터 DNA로부터의 전사산물을 바이러스입자 내부에 포함하는 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터,

(8) (7)에 있어서, 센다이 바이러스 벡터인 벡터,

(9) (7) 또는 (8)에 있어서, 천연형 바이러스와 비교하여 숙주에 있어서의 증식능력이 높아져 있는 벡터,

(10) (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 바이러스 벡터 DNA를 숙주에 도입하여, 상기 숙주내에서 바이러스단백질을 발현시키는 공정을 포함하는, 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터의 제조방법,

(11) (10)에 있어서, 파라믹소바이러스과 바이러스가 센다이 바이러스인 방법을 제공한다.

또한, 본 발명에 있어서 「파라믹소바이러스과 바이러스 벡터」란, 파라믹소바이러스과 바이러스에 유래하여, 유전자를 숙주세포에 도입할 수 있는 벡터(담체)를 가리킨다. 본 발명의 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터는 리보핵단백질(RNP)이더라도 좋고, 또한, 감염력을 갖는 바이러스입자이더라도 좋다. 「감염력」이란, 바이러스 벡터가 세포로의 접착능 및 막융합능을 보유하고 있음으로써, 세포내에 바이러스입자내부의 바이러스 게놈을 도입하여 발현시킬 수 있는 능력을 가리킨다.

본 발명의 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터는, 복제능을 가지고 있더라도 좋고, 복제능을 갖지 않는 결손형 벡터이더라도 좋다. 「복제능을 갖는다」란, 바이러스 벡터가 숙주세포에 감염된 경우, 상기 세포에 있어서 바이러스가 복제되어 감염성 바이러스입자가 생산되는 것을 가리킨다.

또한, 본 발명의 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터는, 외래유전자를 발현할 수 있도록 유지할 수 있다. 이러한 바이러스 벡터는 재조합 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터로서 제작할 수 있다. 「재조합」파라믹소바이러스과 바이러스 벡터란, 유전자조작에 의해 구축된 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터 또는 그것을 증식하여 얻어지는 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터를 말한다. 재조합 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터는, 예를 들면 재조합 파라믹소바이러스과 바이러스 cDNA를 재구성하여 생성할 수 있다.

본 발명에 있어서 파라믹소바이러스과 바이러스란 파라믹소바이러스과에 속하는 바이러스 또는 그의 유도체를 가리킨다. 본 발명을 적용 가능한 파라믹소바이러스과 바이러스로서는, 예를 들면 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)의 센다이 바이러스(Sendai virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 유행성이하선염 바이러스(Mumps virus), 홍역 바이러스(Measles virus), RS 바이러스(Respiratory syncytial virus), 우역 바이러스(rinderpest virus), 디스템퍼 바이러스(distemper virus), 원숭이 파라인플루엔자바이러스(SV5), 인간 파라인플루엔자바이러스 1,2,3형 등을 들 수 있다. 본 발명의 바이러스 벡터 및 벡터 DNA가 유래하는 바이러스는, 바람직하게는 파라믹소바이러스속(Paramyxovirus)에 속하는 바이러스 또는 그의 유도체이다. 본 발명을 적용 가능한 파라믹소바이러스속 바이러스로서는, 예를 들면 센다이 바이러스(Sendai virus) 및 인간 HA2 등을 포함하는 파라인플루엔자바이러스 1형, 원숭이 SV5 및 SV41 및 인간 CA 등을 포함하는 파라인플루엔자바이러스 2형, 소 SF 및 인간 HA1 등을 포함하는 파라인플루엔자 3형, 파라인플루엔자 4형(A아형 및 B아형을 포함한다), 유행성이하선염 바이러스, 뉴캐슬바이러스 및 그 밖의 많은 파라믹소바이러스속 바이러스가 포함된다. 본 발명의 바이러스 벡터 및 벡터 DNA가 유래하는 파라믹소바이러스과 바이러스는, 가장 바람직하게는 센다이 바이러스이다. 이들 바이러스는, 천연주, 변이주, 라보계대주 및 인위적으로 구축된 주 등일 수 있다. DI입자(J. Virol. 68, 8413-8417(1994)) 등의 불완전 바이러스나, 합성한 올리고뉴클레오티드 등도, 본 발명의 바이러스 벡터를 제조하기 위한 재료로서 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 「바이러스 벡터 DNA」란, 바이러스 벡터의 게놈을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA를 가리킨다. 또한, 본 발명에 있어서 「DNA」란, 단일가닥 DNA 및 이중가닥 DNA를 포함한다.

또한, 파라믹소바이러스과 바이러스의 「N, P, M, F, HN 및 L 유전자」란, 각각 뉴클레오캡시드, 포스포, 매트릭스, 퓨젼, 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 및 라지단백질을 코드하는 유전자를 가리킨다. 예를 들면 파라믹소바이러스아과에 속하는 각 바이러스에 있어서의 각 유전자는, 일반적으로 다음과 같이 표기된다. 일반적으로, N 유전자는 「NP 유전자」라고 표기되는 경우도 있다.

레스피로바이러스속 N P/C/V M F HN - L

루브라바이러스속 N P/V M F HN (SH) L

모빌리바이러스속 N P/C/V M F H - L

예를 들면 센다이 바이러스 각 유전자의 염기서열 데이터베이스의 승인번호(accession number)는, N 유전자에 대해서는 M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218, P 유전자에 대해서는 M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008, M 유전자에 대해서는 D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056, F 유전자에 대해서는 D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131, HN 유전자에 대해서는 D26475, M12397, M30202, M30203, M30204,M69046, X00586, X02808, X56131, L 유전자에 대해서는 D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886을 참조할 것.

본 발명은, 파라믹소바이러스과 바이러스 게놈상의 적어도 하나의 유전자 전사개시서열이 개변됨으로써, 숙주내에 있어서의 상기 유전자 및 그 하류 유전자의 발현량이 개변된, 바이러스 벡터 DNA를 제공한다. 본 발명의 바이러스 벡터 DNA는, 전사개시서열의 개변에 의해, 그 바로아래의 유전자 뿐 아니라, 더 하류에 있는 유전자의 전사도 개변할 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서의 「전사개시서열의 개변」이란, 파라믹소바이러스과 바이러스 게놈상의 유전자 전사개시서열에 있어서 1 또는 수개의 염기를 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입하는 것, 또는 다른 유전자 전사개시서열로의 치환을 행하는 것을 가리킨다.

전사개시서열을 개변하여, 목적으로 하는 재개시활성을 갖는 서열을 얻기 위해서는, 여러 전사개시서열을 디자인하여, 실시예 1에 기재의 루시페라아제 해석 등을 이용하여, 그들 재개시활성을 검출하여, 목적으로 하는 활성을 갖는 서열을 선택하면 좋다. 전사개시서열의 개변은, 공지의 유전자 재조합기술을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들면, 실시예 3에 기재와 같이 부위특이적 변이삽입법에 의해, 파라믹소바이러스과 바이러스 게놈 F 유전자의 전사개시서열에 임의의 변이를 도입할 수 있다.

본 발명의 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터는, 전사개시서열의 개변에 의해, 예를 들면 F 유전자의 발현량이, 야생형에 비해 유의하게 상승되어 있는 바이러스 벡터가 포함된다. 유의한 상승이란, 예를 들면 야생형 F 유전자의 발현에 비해 20% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 2배 이상, 더욱 바람직하게는 3배 이상의 상승이다. 이러한 벡터는, 예를 들면 F 유전자의 전사개시서열을, P, M, HN, N 또는 L 유전자의 전사개시서열로 치환함으로써 제조할 수 있다. 또한 본 발명의 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터에는, P, M, HN, N 및 L 유전자 중 어느 하나, 또는 그 조합이, 야생형의 발현에 비해 유의하게 저하되어 있는 바이러스 벡터가 포함된다. 유의한 저하란, 예를 들면 야생형 발현에 비해 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 40% 이상, 특히 바람직하게는 60% 이상 저하되어 있는 벡터가 포함된다. 이러한 벡터는, 예를 들면 M, HN, N 및/또는 L 유전자의 전사개시서열을, F 유전자의 전사개시서열로 치환함으로써 제조할 수 있다. 유전자 발현량의 측정은, 예를 들면 mRNA(전사산물) 또는 단백질(번역산물)의 검출을 통해 측정될 수 있다. 발현량의 측정은, 바람직하게는 바이러스의 복제속도의 영향을 최소한으로 머물게 하는 조건하에서 행해진다. 예를 들면, 실시예 1의 도3에서 실시된 것과 같은, 복제사이클이 1회 도는 조건하에서 측정하거나, 또는 도4에 나타낸 바와 같이, RNA 또는 단백질의 검출에 의해 초기전사를 특이적으로 측정함으로써 유전자의 발현을 측정할 수 있다. 이들 측정은, 예를 들면 실시예 1 또는 2에 기재의 방법 등에 의해 행할 수 있다.

본 발명자 등은, 파라믹소바이러스과 바이러스(센다이 바이러스)에 보여지는 4종류의 전사개시서열의 재개시활성을 검출한 바, 각각 활성이 달라, L 유전자의 전사개시서열(AGGGTGAAT), P/M/HN 유전자의 전사개시서열(AGGGTGAAA) 및 N 유전자의 전사개시서열(AGGGTCAAA)의 전사개시활성이 높은 값을 나타낸 것에 대해, F 유전자의 전사개시서열(AGGGATAAA)의 전사개시활성이 낮은 값을 나타내는 것을 발견했다. 따라서, 높은 재개시활성을 요망하는 경우에는, L 유전자, P/M/HN 유전자, 또는 N 유전자의 전사개시서열을 사용하면 좋고, 낮은 재개시활성을 요망하는 경우에는, F 유전자의 전사개시서열을 사용하면 좋다. 예를 들면, F 유전자의 전사개시서열을, 재개시활성이 높은 P/M/HN 유전자의 전사개시서열로 치환함으로써, F 유전자 및 그 하류 유전자군의 전사레벨을 상승시킬 수 있다.

파라믹소바이러스과 바이러스유전자의 전사레벨을 개변하는 것에는, 여러 가지 잇점이 존재한다. 예를 들면, F 유전자의 전사개시서열을 재개시활성이 보다 높은 전사개시서열로 치환한 바이러스는, 증식력의 상승을 기대할 수 있다. 또한, 예를 들면 F 유전자의 전사개시서열과 L 유전자의 전사개시서열을 교환하면, 바이러스의 증식력은 그대로 두고, F 유전자 및 HN 유전자의 발현량만을 올리는 것을 기대할 수 있다. 또한, 너무 높은 발현이 바람직하지 않은 단백질의 경우에는, F 유전자의 전사개시서열과 같은 재개시활성이 낮은 전사개시서열의 하류에 연결함으로써 발현량을 제한하는 것도 가능하다.

전사개시서열이, 전사의 재개시활성이 높은 것으로 개변된 유전자를 가지는 바이러스 게놈에서는, 종래의 야생형 게놈과 비교하여, 그 하류에 코드되어 있는 mRNA의 발현량이 증대된다. 하류에 목적으로 하는 외래유전자가 존재하는 경우, 얻어지는 생산물량도 증대될 것으로 예상된다. 따라서, 이러한 게놈을 가지는 바이러스 벡터는, 산물의 생산효율이 향상된다고 하는 잇점을 갖는다. 또한, 의약품조성물이나 백신으로서, 재조합 바이러스입자 또는 바이러스양(virus-like)입자를 회수하는 경우, 이러한 게놈을 가지는 바이러스에서는, 단시간에 다량의 바이러스를 회수하는 것이 가능하다고 하는 잇점을 가지고 있다. 예를 들면, 37℃에서 2일간 인큐베이트된 바이러스입자는, 바이러스입자 사이에서 복합체를 만들어, 원래의 형태로부터 변형되는 aging(노화)현상을 일으키는 것이 알려져 있다(Kim, J. et al. Virology 95: 523-535 (1979)). 그들의 전자현미경관찰에 의하면, 젊은 입자는 뉴클레오캡시드의 구조가 타이트하게 접혀 있지만, aging에 동반하여 루스한 구조로 변화된다. 바이러스입자 또는 바이러스양입자를 의약품조성물이나 백신으로서 이용하는 경우에는, 균일한 재료를 얻는 것이 중요하다. 따라서, 가능한 한 단시간의 배양으로 바이러스를 회수하는 것이 필요하다. 실시예에 나타내어지는 바와 같이, 본 발명에 의해, 개변바이러스를 야생형에 비해 100배의 역가로 조제하는 것도 가능해진다(도5).

본 발명의 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터로서는, 예를 들면, 복제능을 가져, 자립적으로 증식하는 벡터를 들 수 있다. 예를 들면, 일반적으로 천연형 파라믹소바이러스의 게놈은 3'의 짧은 리더영역에 이어, N(뉴클레오캡시드), P(포스포), M(매트릭스), F(퓨젼), HN(헤마글루티닌-뉴라미니다아제) 및 L(라지)단백질을 코드하는 6개의 유전자가 늘어서 있고, 짧은 5'트레일러영역을 다른 말단에 갖는다. 이와 동일한 구조를 갖는 게놈을 설계함으로써, 자율복제 가능한 벡터를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터에 있어서는, 바이러스유전자의 배치는 야생형 바이러스로부터 개변되어 있더라도 좋다.

또한, 본 발명의 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터로서는, 야생형 파라믹소바이러스과 바이러스가 가지는 유전자 중 하나를 결손한 것이더라도 좋다. 예를 들면, 센다이 바이러스과 바이러스 벡터를 재구성시키는 경우, N, P/C 및 L 유전자로부터 만들어지는 단백질군이 트랜스로 필요하다고 생각되어지고 있지만, 상기 단백질군을 코드하는 유전자 자체는, 본 발명의 바이러스 벡터에 반드시 포함되어 있을 필요는 없다. 예를 들면, 상기 단백질군을 코드하는 유전자를 갖는 발현벡터를, 벡터게놈을 코드하는 발현벡터와 함께 숙주세포에 트랜스펙션함으로써, 재구성을 행할 수 있다. 또한, 상기 단백질군을 코드하는 유전자를 갖는 숙주세포에 벡터게놈을 코드하는 발현벡터를 도입하여, 상기 숙주세포로부터 상기 단백질군을 공급하여 재구성을 행하더라도 좋다. 이들 단백질군의 아미노산서열은, 바이러스 유래의 서열 그대로가 아니더라도, 핵산의 도입에 있어서의 활성이 천연형의 그것과 동등하거나 그 이상이라면, 변이를 도입하거나 또는 다른 바이러스의 상동유전자로 대용하더라도 좋다.

또한, 파라믹소바이러스과 바이러스가 세포에 전파되어 가기 위해서는, M, F 및 HN 유전자로부터 만들어지는 단백질군이 필요하다고 생각되어지고 있지만, 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터를 RNP로서 조제하는 경우는, 이들 단백질은 필요 없다. RNP에 포함되는 게놈에, M, F 및 HN 유전자가 포함되어 있으면, 숙주에 도입되었을 때에, 이들 유전자산물이 생산되어, 감염성이 있는 바이러스입자가 형성된다.

RNP를 세포에 도입하기 위해서는, 예를 들면 리포펙트아민이나 폴리카티오닉리포솜(polycationic liposome) 등과 함께 복합체를 형성시켜 도입하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 여러 가지 트랜스펙션시약을 이용할 수 있다. 예를 들면, DOTMA(Boehringer), Superfect(QIAGEN # 301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(Boehringer # 1811169) 등을 들 수 있다. 엔도솜(endosome)중에서의 분해를 막기 위해, 클로로퀸(chloroquine)을 가하는 것도 가능하다(Calos, M.P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015). 복제형 바이러스의 경우, 생산된 바이러스는 배양세포, 계란, 개체(예를 들면 마우스 등의 포유동물) 등에 재감염시켜 증폭 또는 계대할 수 있다.

반대로, M, F 및/또는 HN 유전자가 포함되어 있지 않은 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터도, 본 발명의 바이러스 벡터로서 사용할 수 있다. 이와 같은 바이러스 벡터의 재구성은, 예를 들면, 결손되어 있는 유전자산물을 외래적으로 공급함으로써 행할 수 있다. 이렇게 하여 제조된 바이러스 벡터는, 야생형 바이러스와 동일하게 숙주세포에 접착하여 세포융합을 일으키지만, 세포에 도입된 벡터게놈은 이들 중 어느 하나의 유전자를 결손하고 있기 때문에, 최초와 동일한 감염력을 가지는 딸 바이러스(daughter virus)입자는 형성되지 않는다. 이 때문에, 단 1회의 유전자도입력을 가지는 안전한 바이러스 벡터로서 유용하다. 게놈으로부터 결손시키는 유전자로서는, 예를 들면 F 유전자 및/또는 HN 유전자를 들 수 있다. 예를 들면, F 유전자가 결손된 재조합 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터게놈을 발현하는 플라스미드(바이러스 벡터 DNA를 포함하고 있다)를, F 단백질의 발현벡터 및 N, P/C 및 L 단백질의 발현벡터와 함께 숙주세포에 트랜스펙션함으로써, F 유전자를 결손한 바이러스 벡터의 재구성을 행할 수 있다(국제출원번호 PCT/JP00/03194 및PCT/JP00/03195). 또한, 예를 들면, F 유전자가 염색체에 함입된 숙주세포를 사용하여 제조하는 것도 가능하다. 이들 단백질군을 밖으로부터 공급하는 경우, 그 아미노산서열은 바이러스 유래의 서열 그대로가 아니더라도, 핵산의 도입에 있어서의 활성이 천연형의 그것과 동등하거나 그 이상이라면, 변이를 도입하거나 또는 다른 바이러스의 상동유전자로 대용하더라도 좋다.

또한, 벡터게놈이 유래하는 바이러스의 엔벨로프단백질과는 다른 단백질을 벡터의 엔벨로프에 포함하는 벡터를 제작하는 것도 가능하다. 이러한 단백질에 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 다른 바이러스의 엔벨로프단백질, 예를 들면 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 G 단백질(VSV-G)을 들 수 있다. 본 발명의 바이러스 벡터는, VSV-G 단백질 등과 같이, 게놈이 유래하는 바이러스 이외의 바이러스에 유래하는 엔벨로프단백질을 포함하는 슈도타입 바이러스 벡터가 포함된다.

본 발명의 바이러스 벡터 DNA에는, 목적으로 하는 외래유전자를 도입할 수 있다. 외래유전자는 단백질을 코드하더라도 좋고, 또한 단백질을 코드하고 있지 않더라도 좋다. 예를 들면, 외래유전자는 리보자임(ribozyme) 또는 안티센스 RNA 등의 기능적 RNA를 코드하는 것이더라도 좋다. 외래유전자는 천연 유래 또는 인위적으로 설계된 서열일 수 있다. 예를 들면, 유전자치료 등을 목적으로 하는 경우에는, 상기 바이러스 벡터 DNA에 대상이 되는 질환의 치료용 유전자를 삽입한다. 본 발명의 바이러스 벡터 DNA를 유전자 치료벡터의 제조목적으로 사용하는 경우에는, 숙주내에서의 독성을 억제하기 위해, F 유전자, HN 유전자 및/또는 M 유전자를 결실시켜 두는 것이 바람직하다. 바이러스 벡터 DNA에 외래유전자를 도입하는 경우는, 예를 들면, 센다이 바이러스 벡터 DNA에 있어서는, 전사종결서열과 전사개시서열 사이 등에, 6의 배수의 염기수를 갖는 서열을 삽입하는 것이 바람직하다(Journal of Virology, Vol.67, No.8, 1993, p.4822-4830). 외래유전자는, 바이러스의 각 유전자(N, P, M, F, HN, 또는 L 유전자)의 앞 및/또는 뒤에 삽입할 수 있다. 전후 유전자의 발현을 방해하지 않도록 하기 위해, 외래유전자의 앞 또는 뒤에 적절히 E-I-S 서열(전사개시서열-개재서열-전사종결서열) 또는 그 부분을 삽입한다. 삽입한 외래성 유전자의 발현량은, 외래유전자의 5'측(선두)에 부가하는 전사개시서열의 종류에 따라 조절할 수 있다. 또는, 유전자의 삽입위치, 또한 유전자의 전후 염기서열에 따라 조절할 수 있다. 예를 들면, 센다이 바이러스에 있어서는, 삽입위치가 N 유전자에 가까울 수록, 삽입된 유전자의 발현량이 많은 것이 알려져 있다.

일반적으로, 삽입위치는 바이러스 게놈의 음성 가닥 RNA의 3'말단에 가까울 수록(야생형 바이러스 게놈상의 유전자배치에 있어서는, N 유전자에게 가까울 수록), 삽입된 유전자의 발현량이 높다. 외래유전자의 높은 발현을 얻기 위해서는, 외래유전자를 N 유전자의 상류(음성가닥에 있어서는 3'측) 또는 N 유전자와 P 유전자 사이 등, 음성 가닥 게놈에 있어서 3'말단에 가까운 영역에 삽입하는 것이 바람직하다. 반대로, 삽입위치가 음성 가닥 RNA의 5'말단에 가까울 수록(야생형 바이러스 게놈상의 유전자배치에 있어서는, L 유전자에게 가까울 수록), 삽입된 유전자의 발현량이 낮아진다. 외래유전자의 발현을 낮게 억제하기 위해서는, 예를 들면 음성 가닥의 가장 5'측, 즉 야생형 바이러스 게놈에 있어서는 L 유전자의 하류(음성 가닥에 있어서는 L 유전자의 5'인접부위), 또는 L 유전자의 상류(음성 가닥에 있어서는 L 유전자의 3'인접부위)에 외래유전자를 삽입한다. 이와 같이, 외래유전자의 삽입위치는, 상기 유전자의 목적으로 하는 발현량을 얻기 위해, 또한 전후의 바이러스단백질을 코드하는 유전자와의 조합이 최적이 되도록 적절히 조절할 수 있다. 외래유전자를 용이하게 삽입할 수 있도록 하기 위해, 삽입부위에 클로닝사이트를 설계할 수 있다. 클로닝사이트는, 예를 들면 제한효소의 인식서열로 할 수 있다. 게놈을 코드하는 벡터 DNA 중의 해당 제한효소부위에 외래유전자단편을 삽입할 수 있다. 클로닝사이트는, 복수의 제한효소인식서열을 갖는, 소위 멀티클로닝사이트로 하더라도 좋다. 또한, 본 발명의 벡터 DNA는, 이와 같이 삽입한 이외의 위치에 다른 외래유전자를 보유하고 있더라도 좋다.

외래유전자를 갖는 재조합 센다이 바이러스 벡터는, 예를 들면, Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 및 Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466의 기재에 준하여, 다음과 같이 하여 구축할 수 있다.

먼저, 목적으로 하는 외래유전자의 cDNA 염기서열을 포함하는 DNA 시료를 준비한다. DNA 시료는, 25 ng/㎕ 이상의 농도에서 전기영동적으로 단일 플라스미드임을 확인할 수 있는 것이 바람직하다. 이하, 외래유전자를 NotI 부위를 이용하여 바이러스 게놈을 코드하는 DNA에 삽입하는 경우를 예로 들어 설명한다. 목적으로 하는 cDNA 염기서열 속에 NotI 인식부위가 포함되는 경우는, 부위특이적 변이삽입법 등을 사용하여, 코드하는 아미노산서열을 변화시키지 않도록 염기서열을 개변하여, NotI 부위를 미리 제거해 두는 것이 바람직하다. 이 시료로부터 목적으로 하는 유전자단편을 PCR에 의해 증폭회수한다. 증폭된 단편의 양단을 NotI 부위로 하고, 더욱이 한쪽 끝에 센다이 바이러스의 전사종결서열(E), 개재서열(I) 및 전사개시서열(S)(EIS서열)의 카피를 부가하기 위해, NotI 제한효소 절단부위서열 및 전사종결서열(E), 개재서열(I) 및 전사개시서열(S)과 목적유전자의 일부 서열을 포함하는 프라이머대로서, 포워드측 합성 DNA 서열 및 리버스측 합성 DNA 서열(안티센스 가닥)을 작성한다.

예를 들면, 포워드측 합성 DNA 서열은, NotI에 의한 절단을 보증하기 위해 5'측에 임의의 2 이상의 뉴클레오티드(바람직하게는 GCG 및 GCC 등의 NotI 인식부위 유래의 서열이 포함되지 않는 4염기, 더욱 바람직하게는 ACTT)를 선택하여, 그 3'측에 NotI 인식부위 gcggccgc를 부가하고, 더욱이 그 3'측에 스페이서서열로서 임의의 9염기 또는 9에 6의 배수를 더한 수의 염기를 부가하여, 더욱이 그 3'측에 목적으로 하는 cDNA의 개시코돈 ATG에서 이것을 포함하여 ORF의 약 25염기 상당의 서열을 부가한 형태로 한다. 마지막 염기는 G 또는 C가 되도록 상기 목적으로 하는 cDNA로부터 약 25염기를 선택하여 포워드측 합성 올리고 DNA의 3'의 말단으로 하는 것이 바람직하다.

리버스측 합성 DNA 서열은 5'측에서 임의의 2 이상의 뉴클레오티드(바람직하게는 GCG 및 GCC 등의 NotI 인식부위 유래의 서열이 포함되지 않는 4염기, 더욱 바람직하게는 ACTT)를 선택하여, 그 3'측에 NotI 인식부위 gcggccgc를 부가하고, 더욱이 그 3'측에 길이를 조절하기 위한 삽입단편인 올리고 DNA를 부가한다. 이 올리고 DNA의 길이는, NotI 인식부위 gcggccgc를 포함하여, cDNA의 상보가닥 염기서열과 후술하는 센다이 바이러스에 유래하는 센다이 바이러스 게놈의 EIS 염기서열의 합계가 6의 배수가 되도록 염기수를 설계한다(소위「6의 룰(rule of six)」; Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72:891-899, 1998). 더욱이 삽입단편의 3'측에 센다이 바이러스 S 서열의 상보가닥서열, 바람직하게는 5'-CTTTCACCCT-3', I서열, 바람직하게는 5'-AAG-3', E 서열의 상보가닥서열, 바람직하게는 5'-TTTTTCTTACTACGG-3', 더욱이 그 3'측에 목적으로 하는 cDNA 서열의 시종코돈으로부터 반대로 세어서 약 25염기 상당의 상보가닥의 마지막 염기가 G 또는 C가 되도록 길이를 선택하여 서열을 부가하여, 리버스측 합성 올리고 DNA의 3'의 말단으로 한다.

PCR은, 예를 들면, ExTaq 폴리머라아제(다까라주조)를 사용하는 통상의 방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 Vent 폴리머라아제(NEB)를 사용하여 행하고, 증폭한 목적단편은 NotI로 소화한 후, 플라스미드벡터 pBluescript의 NotI 부위에 삽입한다. 얻어진 PCR 산물의 염기서열을 시퀀서로 확인하여, 바른 서열의 플라스미드를 선택한다. 이 플라스미드로부터 삽입단편을 NotI로 잘라내고, 게놈 cDNA를 포함하는 플라스미드의 NotI 부위에 클로닝한다. 또한 플라스미드 벡터 pBluescript를 매개로 하지 않고 NotI 부위에 직접 삽입하여, 재조합 센다이 바이러스 cDNA를 얻는 것도 가능하다.

본 발명의 바이러스 벡터 DNA는, 이것을 숙주세포에 도입하여 발현시킴으로써, 상기 바이러스 벡터 DNA로부터의 전사산물을 바이러스입자내부에 포함하는 바이러스 벡터를 조제할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 본 발명의 바이러스 벡터DNA를 숙주에 도입하여, 상기 숙주내에서 바이러스단백질을 발현시키면 좋다. 바이러스 벡터 DNA의 숙주로의 도입 및 상기 숙주내에서의 바이러스단백질의 발현은, 어느 쪽을 먼저 행하더라도 좋고, 또한 동시에 행하더라도 좋다. 바이러스단백질은, 예를 들면 바이러스단백질을 코드하는 발현벡터의 도입에 의해 숙주내에서 발현시킬 수 있다. 바이러스 벡터 DNA에 있어서, F 유전자, HN 유전자 및/또는 M 유전자를 결실시킨 경우에는, 그대로는 감염성 바이러스입자를 형성하지 않지만, 숙주세포에 이들 결실시킨 유전자 및/또는 다른 바이러스의 엔벨로프단백질을 코드하는 유전자 등을 별도로 도입하여 발현시킴으로써, 감염성 바이러스입자를 형성시키는 것이 가능하다.

예를 들면, 바이러스 벡터 DNA를 세포내에 도입하는 방법에는, 다음과 같은 방법, ① 목적세포가 함입할 수 있는 DNA 침전물을 만드는 방법, ② 목적세포에 의한 함입에 적합하고, 또한 세포독성이 적은 양전하특성을 가지는 DNA를 포함하는 복합체를 만드는 방법, ③ 목적세포막에, DNA 분자가 빠져 나갈 수 있을 만큼 충분한 구멍을 전기펄스에 의해 순간적으로 뚫는 방법 등이 있다.

②로서는, 여러 가지 트랜스펙션시약을 이용할 수 있다. 예를 들면, DOTMA(Boehringer), Superfect(QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(Boehringer #1811169) 등을 들 수 있다. ①로서는 예를 들면 인산칼슘을 사용한 트랜스펙션법을 들 수 있고, 이 방법에 의해 세포내에 들어간 DNA는 빈식소포(phagosome)에 함입되지만, 핵내에도 충분한 양의 DNA가 들어 가는 것이 알려져 있다(Graham, F.L. and Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silverstein, S.,1977, Cell 11: 223). Chen 및 Okayama는 트랜스퍼기술의 최적화를 검토하여, 1) 세포 공침전물의 인큐베이션조건을 2~4% CO₂, 35℃, 15~24시간, 2) DNA는 직쇄상 보다 고리상인 것이 활성이 높고, 3) 침전혼액중의 DNA 농도가 20~30 ㎍/ml일 때 최적의 침전을 얻을 수 있다고 보고하고 있다(Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745). ②의 방법은, 일과적인 트랜스펙션에 적합하다. 옛날에는 DEAE-덱스트란(Sigma #D-9885 M.W. 5×10⁵)혼액을 목적으로 하는 DNA 농도비로 조제하여, 트랜스펙션을 행하는 방법이 알려져 있다. 복합체의 대부분은 엔도솜 속에서 분해되어 버리기 때문에, 효과를 높이기 위해 클로로퀸을 가하는 것도 가능하다(Calos, M.P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015). ③의 방법은 전기천공법이라고 불리는 방법으로, 세포선택성이 없다는 점에서 ①이나 ②의 방법에 비해 범용성이 높다. 효율은 펄스전류의 지속시간, 펄스의 형태, 전계(전극간의 갭, 전압)의 강도, 완충액의 도전률, DNA 농도, 세포밀도의 최적조건하에서 좋은 것으로 되어 있다.

이상, 3개의 카테고리 속에서 ②의 방법은 조작이 간편하고 다량의 세포를 사용하여 다수의 검체를 검토할 수 있기 때문에, 본 발명에 있어서는, 트랜스펙션시약이 적합하다. 바람직하게는 Superfect Transfection Reagent(QIAGEN, Cat No. 301305), 또는 DOSPER Liposomal Transfection Reagent(Boehringer Mannheim, Cat No. 1811169)가 사용된다.

cDNA로부터의 바이러스의 재구성은, 공지의 방법을 사용하여 행할수 있다(국제공개97/16539호; 국제공개97/16538호; Durbin, A.P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S.P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M.J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M.D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R.M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404). 이들 방법에 의해, 파라인플루엔자, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스, 홍역 바이러스, 우역 바이러스, 센다이 바이러스 등을 포함하는 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터를 벡터 DNA로부터 재구성시킬 수 있다.

일례를 나타내면, 24웰~6웰 정도의 플라스틱플레이트 또는 100 mm 페트리접시 위에서, 10% 소태아혈청(FCS) 및 항생물질(100 units/ml 페니실린 G 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신)을 포함하는 최소필수배지(MEM)를 사용하여 원숭이신장 유래 세포주 LLCMK2를 70~80% 컨플루언트(confluent)가 될 때까지 배양하고, 예를 들면 1 ㎍/ml psoralen(소랄렌)존재하 20분간 UV 조사처리를 하여 불활화한, T7 폴리머라제를 발현하는 재조합 백시니아바이러스 vTF7-3(Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126, 1986, Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)을 2 PFU/세포로 감염시킨다. 소랄렌의 첨가량 및 UV 조사시간은 적절히 조정할 수 있다. 감염 1시간 후, 2~60 ㎍, 보다 바람직하게는 3~5 ㎍의 상기의 재조합 센다이 바이러스 cDNA를, 전장 센다이 바이러스 게놈의 생성에 필수인 트랜스로 작용하는 바이러스단백질을 발현하는 플라스미드(24-0.5 ㎍의 pGEM-N, 12-0.25 ㎍의 pGEM-P 및 24-0.5 ㎍의 pGEM-L, 보다 바람직하게는 예를 들면 1 ㎍의 pGEM-N, 0.5 ㎍의 pGEM-P 및 1 ㎍의 pGEM-L)(Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579,1996)와 함께 Superfect(QIAGEN사)를 사용한 리포펙션법 등에 의해 트랜스펙션한다. 트랜스펙션을 행한 세포는, 목적에 따라 100 ㎍/ml의 리팜피신(rifampicin)(Sigma) 및 시토신아라비노시드(cytosine arabinoside)(AraC), 보다 바람직하게는 40 ㎍/ml의 시토신아라비노시드(AraC)(Sigma) 만을 포함하는 혈청 불함유의 MEM로 배양하여, 백시니어바이러스에 의한 세포독성을 최소로 머물게 하여, 바이러스의 회수율을 최대가 되도록 약제의 최적농도를 설정한다(Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579). 트랜스펙션을 한 뒤 48~72시간 정도 배양 후 세포를 회수하여, 동결융해를 3회 반복하여 세포를 파쇄한 후, LLCMK2 세포에 트랜스펙션하여 배양한다. 배양 3~7일 후에 배양액을 회수한다. 엔벨로프단백질을 코드하는 유전자를 결손한 복제능을 가지지 않는 바이러스 벡터를 재구성시키기 위해서는, 엔벨로프단백질을 발현하는 LLCMK2 세포를 트랜스펙션에 사용하던가, 또는 엔벨로프 발현 플라스미드를 함께 트랜스펙션하면 좋다. 또한, 트랜스펙션을 행한 세포에 엔벨로프단백질을 발현하는 LLCMK2 세포에 중층하여 배양함으로써 결손형 바이러스 벡터를 증폭하는 것도 가능하다(국제출원번호 PCT/JP00/03194 및 PCT/JP00/03195 참조). 배양상청에 포함되는 바이러스 역가는 적혈구응집활성(HA)을 측정함으로써 결정할 수 있다. HA는 「endo-point 희석법」(Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579)에 의해 결정할 수 있다. 얻어진 바이러스스톡은 -80℃에서 보존할 수 있다.

바이러스 벡터가 재구성하는 한, 재구성에 사용하는 숙주세포는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 센다이 바이러스 벡터 등의 재구성에 있어서는, 원숭이신장 유래의 CVI 세포나 LLCMK2 세포, 햄스터신장 유래의 BHK 세포, 인간 유래 세포 등의 배양세포를 사용할 수 있다. 또한, 대량으로 센다이 바이러스 벡터를 얻기 위해서, 상기의 숙주로부터 얻어진 바이러스 벡터를 발육계란에 감염시켜, 상기 벡터를 증폭할 수 있다. 계란을 사용한 벡터의 제조방법은 이미 개발되어 있다(나까니시 등 편(1993) 「신경과학연구의 첨단기술 프로토콜 III, 분자신경세포생리학」, 고세이샤, 오오사카, pp.153-172). 구체적으로는, 예를 들면, 수정란을 배양기에 넣고 9~12일간 37~38℃에서 배양하여, 배를 성장시킨다. 바이러스 벡터를 장뇨막강(奬尿膜腔)으로 접종하고, 수일간 알을 배양하여 바이러스 벡터를 증식시킨다. 배양기간 등의 조건은, 사용하는 재조합 바이러스에 의해 바뀔 수 있다. 그 후, 바이러스를 포함한 장뇨액을 회수한다. 또한, 장뇨액으로부터의 센다이 바이러스의 분리 ·정제는 일반적인 방법에 따라 행할 수 있다(다치요마비토, 「바이러스 실험 프로토콜」, 나가이, 이시하마감수, 메디컬뷰사, pp.68-73,(1995)).

본 발명의 바이러스 벡터에는, 그 엔벨로프표면이 특정 세포에 접착할 수 있도록, 접착인자, 리간드, 수용체 등, 또는 그들의 단편이 포함되어 있더라도 상관 없다. 예를 들면, 이들 단백질을 세포외 영역에 가져, 바이러스엔벨로프 유래의 폴리펩티드를 세포내 영역에 갖는 키메라단백질 등을 포함하는 벡터를 제작하면, 특정 조직을 표적으로 하는 벡터를 만들어내는 것도 가능하다. 이들은 바이러스 게놈에 코드되어 있더라도 좋고, 바이러스 벡터의 재구성시에, 게놈 이외의 유전자(예를 들면 별도의 발현벡터 또는 숙주염색체 등의 유전자)의 발현에 의해 공급되더라도 좋다.

또한, 재조합체 바이러스 벡터는, 예를 들면 면역원성을 저하시키기 위해, 또한, RNA의 전사효율이나 복제효율을 높이기 위해, 그 내부에 포함되는 바이러스유전자가 개변된 것이더라도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면 복제인자인 N 유전자, P/C 유전자 및 L 유전자의 적어도 하나를 개변하여, 전사 또는 복제의 기능을 높이는 것을 생각할 수 있다. 또한, 구조체 단백질의 하나인 HN 단백질은, 적혈구응집소인 헤마글루티닌(hemagglutinin)활성과 뉴라미니다아제(neuraminidase)활성의 양자의 활성을 갖지만, 예를 들면 전자의 활성을 약하게 할 수 있으면, 혈액중에서의 바이러스의 안정성을 향상시키는 것이 가능할 것이고, 예를 들면 후자의 활성을 개변함으로써, 감염능을 조절하는 것도 가능하다. 또한, 막융합에 관계하는 F 단백질을 개변함으로써, 막융합 리포솜의 융합능을 조절하는 것도 가능하다. 또한, 예를 들면, 세포표면의 항원분자가 될 수 있는 F 단백질이나 HN 단백질의 항원제시 에피토프 등을 해석하고, 이것을 이용하여 항원제시능을 약하게 한 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터를 제작하는 것도 가능하다.

결손형 바이러스 벡터를 조제하는 경우, 예를 들면, 게놈상에서 결손하고 있는 엔벨로프유전자가 다른 2종의 벡터를 동일한 세포에 도입하면, 각각에서 결손하는 엔벨로프단백질이, 다른 한 쪽 복합체로부터의 발현에 의해 공급되기 때문에,서로 상보하여 감염력이 있는 바이러스입자가 형성되고, 복제사이클이 돌아 바이러스 벡터가 증폭된다. 즉, 2종 또는 그 이상의 본 발명의 벡터를, 엔벨로프단백질을 상보하는 조합으로 접종하면, 각각의 엔벨로프유전자 결손형 바이러스 벡터의 혼합물을 대량으로 또한 저비용으로 생산할 수 있다. 이들 바이러스는, 엔벨로프유전자가 결손되어 있기 때문에, 엔벨로프유전자를 결손하고 있지 않는 바이러스에 비해 게놈사이즈가 작아져 긴 외래유전자를 유지할 수 있다. 또한, 원래 감염성이 없는 이들 바이러스는 세포밖에서 희석되어 공감염의 유지가 곤란하게 되어, 멸균화되기 때문에, 환경방출 관리상의 잇점이 있다.

이렇게 하여 얻어진 바이러스 벡터의 유전자치료로의 응용으로서는, 직접투여에 의한 유전자발현, 간접(ex vivo)투여에 의한 유전자발현 중 어느 쪽 방법에 의해서도, 치료효과를 기대할 수 있는 외래유전자 또는 환자의 체내에서 공급이 부족한 내재유전자를 발현시키는 것이 가능하다. 외래유전자로서는 특별히 제한은 없고, 단백질을 코드하는 핵산에 더하여, 예를 들면, 안티센스 또는 리보자임 등의 단백질을 코드하지 않는 핵산이더라도 좋다. 단백질을 코드하는 외래유전자로서는, 특별히 제한은 없지만, 천연 단백질로서는, 예를 들면 호르몬, 사이토카인, 증식인자, 수용체, 효소, 펩티드 등을 들 수 있다. 단백질은 분비단백질, 막단백질, 세포질단백질, 핵단백질 등일 수 있다. 인공적인 단백질로서는, 예를 들면, 키메라독소 등의 융합단백질, 도미넌트 네거티브 단백질(dominant negative protein)(수용체의 가용성 분자 또는 막결합형 도미난트 네거티브 수용체를 포함한다), 결실형 세포접착분자 및 세포표면분자 등을 들 수 있다. 또한, 분비 시그날이나 막국재화 시그날, 핵이행 시그날 등을 부가한 단백질이더라도 좋다. 또한, 안티센스 RNA 분자 또는 RNA 절단형 리보자임 등을 발현시켜 신장세포에서 발현하는 바람직하지 않은 유전자의 기능을 억제하는 것도 가능하다. 투여 가능한 본 발명의 벡터를 응용할 수 있는 유전자치료의 대상으로서는, 세포를 사멸시키는, 예를 들면 자살유전자라고 불리는, 감염세포에 독성을 나타내는 유전자(HSV tk 등)를 발현시키는 것에 의한 암치료, 동맥경화에 의한 관상동맥재협착 예방치료 등을 생각할 수 있다. 또한, 세포의 생존을 지속시키는 방향으로서는, 단일유전자병 등에서, 결실 또는 결손이 알려져 있는 유전자, 예를 들면 ADA, CFTR 등의 유전자산물을 보충한다고 하는 응용을 생각할 수 있다.

어느 쪽 방향에 있어서도, 본 발명의 벡터는 RNA를 게놈으로 하여, 그 전사 및 자기복제 프로세스중에 DNA로 변환되지 않고, 생식세포 등의 염색체에 함입되어 차세대 유전자에 영향을 미칠 우려가 없기 때문에, 광범위한 질환에 응용할 수 있다. 즉, 다수의 유전자가 원인이 되는 병, 고혈압, 당뇨병, 천식, 허혈성 심질환 등의 질환에도 응용할 수 있고, 또한, 백신 등의 다수의 건강한 사람들을 대상으로 한 치료법이나 예방법, 여러 가지 감염증, AIDS, 말라리아, 인플루엔자 등의 백신예방에도 응용할 수 있다.

본 발명의 바이러스 벡터는, 약학적으로 허용되는 목적으로 하는 매체와 함께 조성물로 할 수 있다. 「약학적으로 허용되는 담체」란, 벡터와 함께 투여하는 것이 가능하고, 벡터에 의한 유전자도입을 저해하지 않는 재료이다. 예를 들면 본 발명의 바이러스 벡터를 생리식염수나 인산완충생리식염수(PBS) 등으로 적절히 희석하여 조성물로 할 수 있다. 본 발명의 바이러스 벡터를 계란에서 증식시킨 경우 등에 있어서는 장뇨액을 포함하더라도 좋다. 또한 본 발명의 바이러스 벡터를 포함하는 조성물은, 탈이온수, 5% 덱스토로오스(dextrose)수용액 등의 매체를 포함하고 있더라도 좋다. 더욱이, 그 밖에도 안정제, 살생물제 등이 함유되어 있더라도 좋다. 본 발명의 바이러스 벡터 함유 조성물의 투여대상으로서는, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개 등 모든 포유동물이 포함된다.

도면의 간단한 설명

도1은, pSeV18c(+)의 구축과 N ORF의 하류역으로의 루시페라아제유전자 삽입의 개요를 나타내는 도이다. NotI 부위를 포함하도록 설계한 18염기의 단편을, 부위특이적 변이에 의해, pSeV(+)중의 SeV 게놈의 3'말단으로부터 1698번 위치~1699번 위치 사이에 삽입했다(Shioda, T. et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:7317-7330). 이 결과 얻어진, 18염기로 된 단편을 부가한 SeV 안티게놈을 코드하는 플라스미드를 pSeV18c(+)라고 명명했다. 루시페라아제유전자의 ORF는, pHvLuc-RT4 플라스미드(Kato, A. et al., 1996, Genes to Cells 1: 569-579)를 주형으로서, NotI 태그를 붙인 4조의 프라이머(ESn/NotLr, ESp/NotLr, ESf/NotLr 및 ESl/NotLr)를 사용하여 PCR에 의해 증폭했다. 이렇게 하여, 루시페라아제유전자의 선두에 각각 다른 천연의 전사개시서열을 부가한 단편을 생성했다. 이들 증폭단편은 NotI로 절단하여, pSeV18c(+)의 NotI 부위에 삽입했다. 제작된 플라스미드 pSeV(+)SnLuc, pSeV(+)SpLuc, pSeV(+)SfLuc 및 pSeV(+)SlLuc를 사용하여, 각각의 재조합체SeV/SnLuc, SeV/SpLuc, SeV/SfLuc 및 SeV/SlLuc를 재구축시켰다.

도2는, SeV의 유전자구축을 나타내는 도이다.

도3은, SeV/SpLuc, SeV/SnLuc, SeV/SfLuc 및 SeV/SlLuc로부터의 루시페라아제의 발현을 나타내는 도이다. 재조합 바이러스를 moi 10(pfu/cell)으로 CV1 세포에 접종하여, 도시된 시간(hr)에 루시페라아제활성을 측정했다.

도4는, 재조합 SeV로부터의 루시페라아제의 발현을 나타내는 사진 및 도이다. 재조합 바이러스를 moi 100(pfu/cell)으로 CV1 세포에 접종하여, 시클로헥시미드(cycloheximide)존재하에서 12시간 배양했다. 세포의 일부를 회수하여 RNA를 조제 후, 루시페라아제 프로브로 해석했다(상단). 나머지 세포는, 더욱이 시클로헥시미드 비존재하에서 0, 2 및 4시간 배양하고 단백질을 합성시켜, 루시페라아제활성을 측정했다(하단).

도5는, SeV/mSf의 증식속도(kinetics)를 나타내는 도이다. 1단 증식사이클 조건하에 두고, 야생형 SeV 및 변이형 SeV/mSf의 역가를 도시된 시간에 측정했다. 백과 흑의 막대는, 각각 야생형 및 SeV/mSf의 HAU를 나타낸다. 백 및 흑의 동그라미를 잇는 선은, 각각 야생형 및 SeV/mSf의 pfu/ml를 나타낸다.

도6은, SeV/mSf의 세포독성을 나타내는 사진이다. 트립신 존재하(+) 또는 비존재하(-)에서, 야생형 또는 SeV/mSf를 moi 20(pfu/cell)으로 CV1 세포에 감염시켰다. 감염 48시간 후에 사진을 촬영했다.

도7은, 바이러스유전자의 세포내 발현을 나타내는 사진이다. 야생형 SeV 또는 SeV/mSf를 감염시킨 CV1 세포를, 감염 후 여러 시간(hr)에, 바이러스의 N, P,F, 또는 L 유전자를 프로브로 하여 노던 하이브리다이제이션(northern hybridization)에 의해 해석했다. mRNA의 위치와 게놈/안티게놈 RNA(vRNA)의 위치를 도에 나타냈다.

도8은, 바이러스유전자의 세포내 발현을 나타내는 사진이다. 각 레인의 위에 나타낸 시간(hr)에 있어서의 CV1 세포에서의 바이러스유전자의 세포내 발현을, 항 SeV 항체를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 해석했다.

도9는, 바이러스유전자의 세포내 발현을 나타내는 사진이다. 시클로헥시미드 존재하, 야생형 SeV 또는 SeV/mSf를 moi 100 pfu으로 CV1 세포에 감염시켰다. 접종 후 12시간에 RNA를 추출하여, 노던 하이브리다이제이션에 의해 해석했다. 검출된 특이적 밴드는, BAS 2000 이미지 애널라이저를 사용하여 해석했다.

도10은, 다단증식 연속공계대에 있어서의 야생형 SeV 및 SeV/mSf의 경합 어세이의 결과를 나타내는 사진이다. (A) 특이적 프라이머대(좌)와 검출되는 어느 하나의 바이러스 RNA(우)를 나타낸다. (B) 초기 농도를, 10⁴(SeV/mSf) 및 10⁴(야생형 SeV) pfu/알, 또는 10⁴(SeV/mSf) 및 10²(야생형 SeV) pfu/알으로 접종하여, 계대를 행했다. 접종 후 3일 마다 장뇨액을 회수하여 10^-6으로 희석한 후, 새로운 알에 공접종하는 것을 반복하여, 10회 계대를 행했다. 바이러스 RNA를 추출하여, 특이적 프라이머 세트를 사용한 1스텝 PCR법으로 해석했다. 계대횟수를 도 위에 나타낸다. 「야생형 SeV」및「SeV/mSf」는 각각의 서열을 증폭할 수 있는 특이적 프라이머대를 사용하여 증폭된 DNA 단편을 나타내고 있다.

도11은, 야생형 SeV 및 SeV/mSf를 감염시킨 정상 BALB/c 마우스 및 흉선을 결손하는 BALB/c(nu/nu) 마우스의 체중증가를 나타내는 도이다. 5마리의 마우스에 경비접종(intranasally inoculation)으로 다양한 양의 바이러스(10⁴~10⁷pfu/마우스)를 감염시켰다. 마우스의 체중증가를 감염 14일 후까지 매일 그램단위로 측정했다. 사망한 마우스는 「†」으로 나타냈다.

도12는, BALB/c 마우스 및 BALB/c(nu/nu) 마우스의 폐병변과 폐내 바이러스량을 나타내는 도이다. 각각의 마우스에 10⁴pfu의 바이러스를 경비접종했다. 이들 마우스는 감염 후 0, 1, 2, 3, 5, 7 및 9일 후에 죽이고, 폐의 병변스코어(상) 및 폐내 바이러스타이터(하)를 측정했다. 이들 값은 각 마우스 개체마다 나타냈다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 재조합 바이러스의 구축과 루시페라아제 어세이

SeV의 전사종결서열(E 시그날)의 9 뉴클레오티드는, 모든 유전자상에서 정확히 보존되어 있다. 한편, 전사개시서열(S 시그날)의 9 뉴클레오티드에는, 약간의 상이함이 있다. 6개의 유전자 중, 3개(P, M 및 HN)의 전사개시서열은 3'-UCCCACUUU-5'이지만, N, F 및 L 유전자는, 각각 3'-UCCCAgUUU-5', 3'-UCCCuaUUU-5' 및 3'-UCCCACUUa-5'이다(도2). 이들의 약간의 상이함은, 계대의 경위, 독성, 단리방법에 상관 없이, 모든 SeV주에 있어서 완전히 보존되어 있다. 전사개시서열의 이들의 약간의 상이함이 가지는 역할을 해석하기 위해, 합성 전사개시서열의 조절하에 루시페라아제를 발현하는 SeV/SpLuc, SeV/SnLuc, SeV/SfLuc, SeV/SlLuc라고 명명한 4개의 재조합 SeV를 아래와 같이 하여 작성했다.

1-1. N ORF 하류의 삽입부위의 작성

SeV의 안티게놈 전장 cDNA 카피를 포함하는 플라스미드 pSeV(+)(Kato, A. et al., 1996, Genes to Cells 1: 569-579)를 출발재료로서, 플라스미드구축을 행했다. 먼저, 합성된 전사종결서열 및 전사개시서열을 가지는 루시페라아제 유전자를 삽입하기 위해, N 유전자내의 N ORF의 하류에 유니크한 NotI 부위를 만들어냈다. NotI 제한효소 인식부위를 포함하는 18 뉴클레오티드(5'-gagggcccgcggccgcga-3'/서열번호: 1)를, N 유전자의 5' 비코드영역(네거티브 센스)에 있는 게놈의 3'말단으로부터 1698 뉴클레오티드 및 1699 뉴클레오티드 사이에 삽입했다(Shioda, T. et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:7317-7330)(도1). 삽입은, PCR을 매개로 한 중복 프라이머 신장법(Ho, S. N. et al., 1989, Gene 77:51-59)에 의한 부위특이적 변이도입법을 사용하여, 본질적으로는 문헌(Hasan, M. K. et al., 1997, J. Gen. Virol. 78:2813-2820)에 따라 행했다. 간결하게 기술하면, 중복하고 있는 18 뉴클레오티드의 말단을 갖는 2개의 프라이머(NmF; 5'-gagggcccgcggccgcga¹⁶⁹⁹TACGAGGCTTCAAGGTACTT¹⁷¹⁸-3'/서열번호: 2 및 NmR; 5'-tcgcggccgcgggccctc¹⁶⁹⁸TGATCCTAGATTCCTCCTAC¹⁶⁷⁰-3'/서열번호: 3), 거기에 2개의 바깥쪽 프라이머(OP1, 5'-⁶¹CAAAGTATCCACCACCCTGAGGAGCAGGTTCCAGACCCTTTGCTTTGC¹⁰⁵-3'/서열번호: 4 및 OP2, 5'-²⁴⁶⁷TTAAGTTGGTVAGTGACTC²⁴⁴⁹-3'/서열번호: 5)를 합성했다. 주형에 pSeV(+)를 사용하여, 먼저 OP1/NmF 프라이머대 및 OP2/NmF 프라이머대로 PCR을 행하고, 각각 1.6 Kb 및 0.8 Kb의 단편을 얻었다. 정제한 1.6 Kb 및 0.8 Kb의 단편을 주형으로, OP1/OP2 프라이머대를 사용하여 제2의 PCR을 행하여, 앞의 18 뉴클레오티드를 포함하는 2.4 Kb의 단일밴드를 얻었다. 2.4 Kb의 단편을 정제하여, SphI와 SalI로 절단했다. pSeV(+)플라스미드를 이들 효소에 의해, 각각, SeV 게놈의 610번 위치와 2070번 위치에 대응하는 위치에서 절단했다. 얻어진 1.47 Kb의 단편서열을, 자동 DNA 시퀀서 AFLII(Pharmacia, Uppsala)를 사용하여 확인하고, 원래의 pSeV(+)의 대응하는 단편과 치환했다. 이렇게 하여, N ORF의 하류에 유니크한 (유일한) 제한효소부위를 포함하는 pSeV18c(+)를 구축했다.

이것에 의해 얻어진 NotI 부위를 포함하는 18 뉴클레오티드의 삽입을 가지는 플라스미드로부터는, 부모 플라스미드(parental plasmid) pSeV(+)와 동일하게 재조합 바이러스의 재구축이 가능하고, 생성한 바이러스의 감염성이나 복제능도 pSeV(+)와 동일했다.

1-2. 여러 가지 전사개시서열로 제어되는 루시페라아제유전자의 벡터로의 삽입

pHVlucRT4(-)(Kato, A. et al., 1996, Genes to Cells 1: 569-579)에 포함되는 반디(Photinus pyralis) 유래의 루시페라아제유전자를, 4종의 다른 전사개시서열을 포함하는 아래의 4개의 프라이머대를 사용한 PCR로 증폭했다. 즉, 4개의 순방향 프라이머(ESp; 5'-TTgcggccgcGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCACTTCACGATGGAAGACGGCAAAAACAT-3'/서열번호: 6, ESn; 5'-TTgcggccgcGTAAGAAAAACTTAGGGTcAAAGTTCACTTCACGATGGAAGACGGCAAAAACAT-3'/서열번호: 7, ESf; 5'-TTgcggccgcGTAAGAAAAACTTAGGGatAAAGTTCACTTCACGATGGAAGACGGCAAAAACAT-3'/서열번호: 8, 및 ESl; 5'-TTgcggccgcGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAtGTTCACTTCACGATGGAAGACGGCAAAAACAT-3'/서열번호: 9), 거기에 하나의 공통의 역방향 프라이머(NotLr; 5'-TCgcggccgcTATTACAATTTGGACTTTCCG-3'/서열번호: 10)를 증폭에 사용했다. 밑줄친 영역은, 각각, SeV의 새로운 전사종결서열과 전사개시서열의 세트로, 보존된 개재(intergenic)트리뉴클레오티드를 사이에 가진다. 밑줄이 없는 소문자는 NotI 제한효소 인식부위를 나타낸다. 밑줄친 부분의 소문자는 각각의 프라이머에 유니크한 뉴클레오티드를 나타낸다. ESp/NotLr, ESn/NotLr, ESf/NotLr 및 ESl/NotLr 프라이머대로 증폭한 1.7 Kb의 단편을 정제하고 NotI로 절단하여, pSeV18c(+)의 NotI 부위에 직접 도입했다(도1). 최종구축물은 사용한 전사개시서열에 따라, 각각 pSeV(+)SpLuc, pSeV(+)SnLuc, pSeV(+)SfLuc 및 pSev(+)SlLuc라고 명명했다.

1-3. cDNA로부터의 바이러스의 재구축

cDNA로부터의 바이러스의 재구축은, 본질적으로는 문헌(Kato, A. et al., 1996, Genes to Cells 1: 569-579)에 기재의 방법에 따랐다. 간단히 말하면, 직경 6 cm의 플레이트에 LLCMK2 세포를 2×10⁶로 뿌리고, 2 PFU/cell의 moi으로 백시니아바이러스(vaccinia virus; VV) vTF7-3(B. Moss 박사로부터 공여(Fuerst, T. R. et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8122-8126))을 감염시켰다. 그 후, 친주(parental) 또는 변이를 도입한 pSeV(+) 10 ㎍과, 트랜스로 작용하는 단백질군을 코드하는 플라스미드, pGEM-N(4 ㎍), pGEM-P(2 ㎍) 및 pGEM-L(4 ㎍)(Kato, A. et al., 1996, Genes to Cells 1: 569-579)를, 리포펙션시약 DOTAP(Boehringer-Mannheim, Mannheim)를 사용하여 동시에 트랜스펙션했다. VV의 세포독성이 최소가 되고, 재구축의 비율이 최대가 되도록, 세포는 40 ㎍/ml의 araC(1-β-D-arabinofuranosylcytosine)와 100 ㎍/ml의 리팜피신을 포함하는, 혈청 불함유의 MEM에서 유지했다. 트랜스펙션 40시간 후에 세포를 회수하고, 냉동과 해동을 3회 반복하여 세포를 파쇄하여, 10일째의 발육계란에 접종했다. 접종 3일 후, 장뇨액을 회수했다. 회수한 바이러스의 역가는, 문헌(Kato, A. et al., 1996, Genes to Cells 1: 569-579)에 따라 측정하여, 적혈구응집가(HAU)와 PFU/ml로 나타냈다. 10⁸~10⁹pfu/ml의 회수한 SeV를 포함하는 알의 장뇨액중에 포함되는 헬퍼 VV는, 장뇨액을 10^-7로 희석하고, 알에서 2회째의 계대를 행하여 제거했다. 이 2회째의 계대를 행한 용액을 -80℃로 저장하고, 모든 실험에 있어서, 종바이러스로서 사용했다.

1-4. 세포배양과 바이러스의 감염

원숭이신장 유래의 세포주 LLCMK2 및 CV1은, 10%의 소태아혈청을 포함하는 최소필수배지(MEM)로 37℃에서 배양했다. 이들 세포의 단층배양에, cDNA로부터 재구축시킨 변이형 바이러스를 moi 10 PFU/cell으로 감염시켜, 혈청을 포함하지 않는 MEM으로 배양했다. cDNA로부터 재구축시킨 야생형 SeV(Z주)(Kato, A. et al., 1996, Genes to Cells 1: 569-579)도 대조로서 사용했다.

CV1 세포에 있어서의 복제를 측정한 바, 4종의 재조합 바이러스는, 야생형에 비해 복제속도가 느린 것이 판명되었다. 이것은, 아마도 추가된 1,728염기의 유전자에 의한 것이라고 생각된다(Hasan, M. K. et al., 1997, J. Gen. Virol. 78:2813-2820). 4종의 재조합 바이러스 중에서, SeV/SfLuc의 복제가 가장 느린 것이 판명되었다.

1-5. 루시페라아제 해석

각각의 재조합 SeV로부터 발현되는 루시페라아제의 활성을 비교했다. 6웰 플레이트중의 5×10⁵cells/웰의 CV1 세포에 여러 가지 감염가로 바이러스(1~300 pfu/세포)를 감염시켜, SeV의 루시페라아제활성의 발현을 측정했다. 1회의 증식사이클이 도는 조건에서는, 감염 후 0, 6, 14, 20 및 26시간에 세포를 회수했다. 회수한 세포의 루시페라아제활성은, 루시페라아제 어세이 키트(Promega, Madison)를 사용하여, 루미노미터(Luminometer)(Luminos CT-9000D, Dia-Iatron, Tokyo)에 의해 문헌(Hasan, M. K. et al., 1997, J. Gen. Virol. 78:2813-2820; Kato, A. et al., 1996, Genes to Cells 1: 569-579)에 기재된 방법에 따라서 계측했다.

그 결과, 어느 재조합체에 있어서도, 감염시간과 감염량에 비례하여, SeV로부터 발현되는 루시페라아제활성의 상승이 관찰되었다. 감염가(moi)10으로 CV1 세포에 감염시킨 경우의 루시페라아제활성의 변화를 도3에 나타낸다.

이들 세포를 회수하여, 루시페라아제 cDNA를 프로브로 하여 노던 하이브리다이제이션을 행했다. 노던 하이브리다이제이션은 아래와 같이 행했다. 세포로부터 TRIzol(Gibco BRL, N.Y.)을 사용하여 RNA를 추출했다. RNA를 에탄올로 침전시켜, 포름아미드/포름알데히드용액중에 용해시켰다. 이것을 0.9% 아가로우즈포름아미드/MOPS 겔로 전기영동하여, Hibond-N 필터(Amersham, Buckighamshire)로 캐필라리 ·트랜스퍼(capillary transfer)를 행했다. 필터는, multi-prime labeling kit(Amersham, Buckighamshire)로³²P 라벨한 프로브를 사용하여 하이브리다이제이션을 행했다. 루시페라아제 프로브로서는, NarI/HincII(1270 bp)단편을, pHvlucRT4(Kato, A. et al., 1996, Genes to Cells 1: 569-579)로부터 정제하여 사용했다. 그 결과, 루시페라아제 mRNA는 단일시스트론 mRNA(mono cistronic mRNA)로서 합성되는 것이 확인되었다.

이들 사실로부터, 루시페라아제 ORF의 직전에 삽입한 합성된 전사종결서열 및 전사개시서열은, 바이러스의 RNA 폴리머라아제에 의해 정확하게 인식되는 것이 실증되었다. 그러나, 이들 4종의 바이러스를 감염시킨 세포에 있어서의 루시페라아제활성값은, 동일한 조건에도 불구하고 달랐다. 감염 26시간 후에 있어서는, SeV/SlLuc에 감염된 세포가 가장 높은 활성을 나타내고, SeV/SfLuc에 감염된 세포가 가장 낮은 활성을 나타냈다(도3). SeV/SpLuc와 SeV/SnLuc는 SeV/SlLuc 보다도 감염 26시간 후에 있어서 약간 낮은 활성을 나타냈다. 그러나, 이 차이는 감염 14시간 후 및 감염 20시간 후에서는 보이지 않았다. 이 사실로부터, Sp, Sn 및 Sl의 재개시능은 동등하다고 생각할 수 있다.

[실시예 2] 재조합 바이러스로부터의 초기 전사량의 비교

실시예 1에서 관찰된 4종의 재조합 SeV 사이의 발현량의 상이함이 주로 전사레벨의 차이에 의한 것인지, 그렇지 않으면 복제과정에 의한 것인지를 조사하기 위해, CV1 세포에 재조합 바이러스를 감염시켜, 시클로헥시미드를 첨가하는 실험을 행했다. 시클로헥시미드는 단백질합성을 저해하기 때문에, 신규한 바이러스단백질의 합성이 필요한 바이러스복제는 저해된다. 이러한 조건하에서는, 바이러스입자에 내재하는 RNA 폴리머라아제에 의해 바이러스의 초기(primary)전사 만이 행해진다.

실시예 1과 동일하게 CV1 세포에 재조합 바이러스를 moi= 100으로 감염시키고, 감염세포를 100 ㎍/ml의 시클로헥시미드(Sigma, St. Louis) 존재하에서 12시간 인큐베이트했다. 세포를 회수 후, 상기와 같이 바이러스 RNA를 조제하고, 루시페라아제 cDNA를 프로브로 하여 노던 하이브리다이제이션을 행했다(도4 위). 다른 세포에서는, 더욱이 시클로헥시미드 비존재하에서 0, 2 및 4시간 인큐베이트하여 단백질을 합성시켜, 루시페라아제활성을 측정했다.

그 결과, 재조합 바이러스를 감염시킨 모든 세포에서, 시클로헥시미드를 제거한 후의 인큐베이션시간이 길어질 수록, 루시페라아제활성의 증가가 보였다. 그러나 여기에서도, SeV/SfLuc가 다른 3개에 비해 루시페라아제의 발현이 유의하게 낮았다(도4 아래). 각 바이러스를 감염시킨 세포에서의 루시페라아제 mRNA 량은, 루시페라아제활성과 잘 상관되어 있었다. 4시간 후의 루시페라아제활성을, 6개의 유전자 중 3개에서 공통하고 있는 SeV/SpLuc형 전사개시서열에서의 값으로 표준화했다. 그 결과, SeV/SnLuc 및 SeV/SlLuc 감염세포의 루시페라아제활성은, 각각 0.86 및 1.19로, SeV/SpLuc와 거의 동등했다. 그에 대해, SeV/SfLuc에 감염된 세포에서의 값은 대조의 겨우 0.24였다.

이들 결과로부터, F 유전자의 발현에 사용되고 있는 시그날은, 다른 전사개시서열에 비해 재개시능이 낮은 것이 강하게 시사된다.

[실시예 3] F 유전자의 전사개시서열이 개변된 SeV 변이체

상기의 결과는, 천연 SeV 게놈에서는 F 유전자의 전사가 억제적으로 조절되고 있는 것을 시사하고 있다. 이것을 더욱 조사하기 위해, F 유전자의 전사개시서열을 P/M/HN 유전자형으로 개변한 변이체 SeV(SeV/mSf)를 아래와 같이 하여 작성하여, 그 복제를 야생형과 비교했다.

3-1. F 유전자의 전사개시서열이 개변된 전장 SeV cDNA 변이체의 제작

아래와 같이 F 유전자의 전사개시서열상에 변이를 도입하여, 2개의 뉴클레오티드를 치환했다. 먼저, pSeV(+)를, BanIII를 사용하여 SeV 게놈상의 2088번 위치와 5333번 위치를 절단하고, 3.4 Kb의 단편을 pBluescript KS(+)(Stratagene, LaJolla)의 동일한 제한효소 인식부위에 재클론화하여, pB/BanIII를 제작했다. 그 후, PCR-mediated 중복프라이머 신장법(Ho, S. N. et al., 1989, Gene 77:51-59)을 사용하여, 상기한 것과 동일하게 부위특이적 변이를 도입했다. 간단하게 기술하자면, 2개의 프라이머(mGS1F; 5'-⁴⁸¹⁰CTTAGGGTGAAAGTCCCTTGT⁴⁸³⁰-3'/서열번호: 11 및 mGS1R; 5'-⁴⁸³⁰ACAAGGGACTTTCACCCTAAG⁴⁸¹⁰-3'/서열번호: 12)와 2개의 바깥쪽 프라이머(M1F; 5'-³⁹³¹TACCCATAGGTGTGGCCAAAT³⁹⁵¹-3'/서열번호: 13 및 T7; 5'-TAATACGACTCACTATAGGGC-3'/서열번호: 14)를 합성했다. 밑줄친 문자는, 변이를 도입한 부위를 나타낸다. 최초의 PCR은, 주형으로서 pB/BanIII를 사용하고, M1F/mGS1R 프라이머대 및 T7/mGS1F 프라이머대에서 행하여, 각각 0.9 Kb 및 0.6 Kb의 단편을 얻었다. 이들 2개의 단편을 정제하고 주형으로서 사용하여, 2회째의 PCR을 M1F/T7 프라이머대에서 행하여, 2개의 뉴클레오티드의 변이를 갖는, 1.5 Kb의 단일 단편을 얻었다. 이 단편을 정제하여 BanIII로 절단하고, pSeV(+)의 동일한 제한효소 인식부위에 재클론화 하여, pSeV(+)mSf를 제작했다. 클론화한 서열은, 염기서열을 결정하여 확인했다. cDNA로부터의 바이러스의 재구축은, 실시예 1과 동일하게 하여 행했다.

이 바이러스의 증식을 CV1 세포를 사용하여 조사한 바, SeV/mSf는 야생형 SeV 보다도 빠르게 증식하는 것이 판명되었다(도5). 트립신 비존재하에서는 둥근 세포나 떨어져나간 세포가 관찰되고, 또한 단백질분해(proteolysis)에 의해 F 당단백질을 활성화하는 외래의 트립신 존재하에서는, 융합한 세포가 변이형에 있어서유의하게 많이 관찰되었다. 이들 사실로부터, SeV/mSf에 있어서는 세포상해성이 증가하고 있는 것이 명백해졌다(도6).

3-2. SeV/mSf 유전자군의 발현

야생형 SeV 및 변이 SeV(SeV/mSf)를 moi=10으로 감염시킨 CV1 세포의, 감염후 여러 시간에 있어서의 mRNA 레벨을, 실시예 1과 동일한 노던 블로팅(northern blotting)에 의해 조사했다. 단, 센다이 바이러스의 N 프로브에 대해서는, PstI/PvuI(1189 bp)단편을 pGEM-N으로부터 정제하여 사용했다. P 프로브에 관해서는, SmaI/SmaI 단편의 792 bp를 pGEM-P로부터 정제하여 사용했다. M, F, HN 및 L 프로브에 관해서는, 각각 NdeI/NdeI(878 bp), BamHI/BamHI(902 bp), ScaI/ScaI(1108 bp) 및 BamHI/BamHI (1654 bp) 단편을, pSeV(+)로부터 정제하여 사용했다.

도7에 나타내는 바와 같이, SeV/mSf의 F 및 L 전사산물은, 야생형을 감염시킨 경우와 비교하여 일찍 검출되어, 명확하게 높은 레벨에 달했다. P 및 N 전사산물도, SeV/mSf 감염 쪽이 일찍 검출되었지만, 피크의 레벨은 야생형과 동일한 정도였다.

감염세포에 있어서의 바이러스단백질의 발현을 확인하기 위해, 항 SeV 항체를 사용한 웨스턴 블로팅(western blotting)에 의해 해석했다. 즉, 6웰의 플레이트에서 증식시킨 CV1 세포(2×10⁵)에, 야생형 또는 SeV/mSf를 10 moi로 감염시키고, 감염후, 여러 시간에 세포를 회수했다. 원심분리에 의해 세포를 침전시키고, 세포의 펠렛을 용해후에 12.5%의 SDS-PAGE(Laemmli, U.K., 1970, Nature 227:680-685)로 해석하고, 항 SeV 토끼혈청을 사용하여, 문헌(Kato, A. et al., 1995, Virology 209:480-488; Kato, A. et al., 1996, Genes to Cells 1: 569-579)에 기재의 방법에 따라 웨스턴 블로팅을 행했다. 그 결과, SeV/mSf 감염세포에서의 F₀단백질의 레벨은, 감염 후의 어느 시점에 있어서도 야생형 보다도 유의하게 높았다(도8). 하류의 유전자산물인 HN 및 L은 이 실험에서는 충분히 분리할 수 없었다.

전사 레벨을 직접 비교하기 위해, 야생형 SeV 또는 SeV/mSf 중 어느 하나에 감염시킨 세포를 시클로헥시미드처리에 의해 신규한 단백질합성을 블록한 후에 RNA를 추출하여, 상기의 노던 하이브리다이제이션에 의해 해석했다. 하이브리다이즈한 밴드에 포함되는 바이러스 게놈 RNA의 방사성 활성을, BAS2000 이미지 애널라이저(Fujifilm, Tokyo)를 사용하여 해석했다. 그 결과, 변이 SeV에 있어서 F 및 L 유전자의 발현이 증강되고, N 및 P 유전자는 증강되지 않는다고 하는 현상이 관찰되었다(도9). 이들 결과로부터, 천연 F 유전자 전사개시서열의 재개시활성은 낮아, F 유전자나 그 하류 유전자군의 발현이 억제적으로 조절되어 있는 것이 증명되었다. 그리고, F 유전자의 전사개시서열을 높은 효율의 전사개시서열로 치환함으로써, F 유전자 뿐 아니라, 그 하류 유전자군의 전사 레벨도 상승시킬 수 있는 것이 나타내어졌다. SeV/mSf에 있어서는, 아마도 L 유전자의 발현이 증강되었기 때문에, 감염의 전과정에서, 변이형에서는 야생형에 비해 빌리온(v) RNA의 레벨이 상승되었다고 생각할 수 있다(도7). 도7로부터 알 수 있는 바와 같이, 변이형 SeV의 감염에서 mRNA가 보다 일찍 검출되었지만, 이것은 L 유전자의 발현이 증가했기 때문인 것으로 생각된다.

[실시예 4] 발육계란에서의 야생형 SeV와 SeV/mSf의 연속공계대

CV1 세포에서는, 도5에 나타내는 바와 같이, 1단 증식시험의 경우에는 SeV/mSf에 비해 야생형 쪽이 복제속도가 느렸지만, 천천히 다단증식하는 경우에는, 천연에 보여지는 바와 같이 F 유전자나 그 하류 유전자군의 전사가 억제적으로 조절되고 있는 쪽이, 인공적으로 윗쪽으로 조절하도록 작출한 것 보다도 유리한 것도 생각할 수 있다. 따라서, 야생형 SeV 및 SeV/mSf의 2개의 바이러스를 알에서 연속공계대(successive co-passage)하여 다단증식시키는 조건에서, 한쪽이 다른 쪽을 구수(compete out)하는지를 조사했다.

먼저 2개의 발육계란에, SeV/mSf 및 야생형 SeV를, 각각 10⁴pfu/egg 및 10⁴pfu/egg으로 동시에 접종했다(10⁴:10⁴접종). 별도의 실험에서는 SeV/mSf 및 야생형 SeV를, 각각 10⁴pfu/egg 및 10²pfu/egg으로 동시에 접종했다(10⁴:10²접종). 접종후 3일 마다 장뇨액을 회수하고, 10^-6으로 희석후, 0.1 ml를 새로운 알에 재접종했다. 이들 재접종은 10회까지 계속했다. 각 장뇨액으로부터 TRIzol/LS(Gibco BRL, N.Y.)를 사용하여, 실시예 1과 동일하게 바이러스 RNA를 추출하여, 2조의 특이적인 프라이머대를 사용한 1스텝 RT-PCR법에 의해 증폭하여, 장뇨액중의 증식한 바이러스를, 특이적인 프라이머대를 사용한 RT-PCR에 의해 반정량적으로 측정했다. 하나의 프라이머대는, F 유전자에 야생형 전사개시서열(AGGGatAAAG)을 가지는 단편 만을 증폭할 수 있고, 다른 쪽 프라이머대는 변이형 전사개시서열(AGGGtgAAAG)을 가지는 단편 만을 증폭하도록 했다(도10A). 구체적으로는, 장뇨액 25 ㎕로부터 추출한 RNA를, SuperscriptII(Gibco BRL, N.Y.)를 사용하여 50℃에서 30분간, HvM 프라이머(5'-⁴⁴⁴⁸TTTTCTCACTTGGGTTAATC⁴⁴⁶⁷-3'/서열번호: 15)로 역전사시켜, 2분간 94℃에서 열변성시켰다. SeV/mSf의 검출에 대해서는 프라이머 HvM 및 GS2WR(5'-⁴⁸³⁶GCACTCACAAGGGACTTTca⁴⁸¹⁷-3'/서열번호: 16)을 사용하고, 또한 야생형 SeV의 검출에 대해서는 프라이머 HvM과 GS2MR(5'-⁴⁸³⁶GCACTCACAAGGGACTTTat⁴⁸¹⁷-3'/서열번호: 17)을 사용하여, 문헌(Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16:578-587; Kuronati, A. et al., 1998, Genes Cells 3:111-124)에 기재의 방법에 따라, cDNA를 PCR에 의해 증폭시켰다. 소문자는 변이시킨 2 뉴클레오티드를 나타낸다. 각각 특이적인 산물은, 아가로우즈겔에서의 전기영동에 의해 상기에 기재된 대로 해석했다.

도10B에 나타내는 바와 같이, 10⁴:10⁴의 접종에 있어서는, 야생형 게놈은 8회째의 계대에서 소실되고, 10⁴:10²의 접종에 있어서는, 5회째에서 소실되는 것이 판명되었다. 대조실험에서는, 각 바이러스를 개별적으로 계대하여, 게놈서열을 결정했다. 그 결과, 이들 2종의 게놈은 안정하여, 10회의 계대 사이, 서열을 결정한 영역에 염기의 변이는 보이지 않았다. 이들 데이터는, 천연 F 유전자의 전사개시서열은, 적어도 알(in ovo)을 사용한 다단증식시험에 있어서는 SeV의 복제에 유리하지않은 것을 나타내고 있다.

[실시예 5] 마우스에 있어서의 SeV/mSf의 병원성

자연 숙주인 마우스에서의 SeV의 감염에 의한 개체 레벨의 병원성 발휘에는, 배양세포나 알에 비해 훨씬 복잡한 조건이 필요하다. 따라서 마우스에 있어서 변이 SeV/mSf가 야생형 보다도 빨리 복제하여, 보다 높은 병원성을 나타내는지를 조사했다.

SPF(specific pathogen-free)의 3주령 BALB/c 마우스 및 4주령 누드 마우스 BALB/c(nu/nu)를 일본 Charles-River로부터 구입하여, 바이러스 감염실험에 사용했다. 마우스를 에테르로 가볍게 마취하여, 야생형 또는 SeV/mSf를 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷또는 10⁸pfu/마우스로 비강내에 감염시켰다(Kiyotani, K. et al., 1990, Virology 177:65-74). 마우스의 체중은 14일째까지 1개체 마다 매일 계측했다. 10⁴pfu를 접종한 BALB/c 및 누드 마우스에 대해서는, 감염후 0, 1, 3, 5, 7 및 9일째에, 각각의 그룹으로부터 3마리의 마우스를 꺼내, 도살하여 폐내 바이러스의 역가를 측정했다. 폐의 병변 스코어도 동시에 결정했다(Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16:578-587). 그 결과를 도11에 나타낸다.

10⁷pfu의 바이러스를 접종한 경우, 어느 바이러스의 접종도 마우스의 체중증가를 강하게 저해했다. 어느 바이러스의 경우도, 감염후 비슷한 일수에서 모든 마우스가 사망했다. 10⁶pfu의 접종에서는 2종의 바이러스에 유의한 차이가 발견되었다. SeV/mSf의 감염은 야생형 감염에 비해, 체중증가에 대해 보다 강한 영향을 나타냈다. SeV/mSf의 접종에서는 모든 마우스가 사망했지만, 야생형의 접종에서는 사망한 것은 1개체 뿐으로 나머지는 다시 체중이 증가했다. 10⁵pfu의 접종에서는, 야생형을 접종한 모든 마우스에서 비접종 마우스와 동등한 체중증가를 나타내고 생존했지만, SeV/mSf의 접종에서는 여전히 체중증가가 저해되어, 반수 이상의 마우스가 사망했다. 따라서, SeV/mSf는 야생형 보다도 병원성이 높은 것이 명백해졌다. 병원성의 차이를 50% 치사가 되는 용량(LD₅₀)으로 정량화한 바, 야생형에서는 1.78×10⁶pfu이고, SeV/mSf에서는 7.94×10⁴pfu였다(표1). 따라서, BALB/c 계통에 있어서는, 변이 SeV는 야생형 보다도 22배 병원성이 높은 것이 판명되었다.

세포상해성 T 림프구(CTL)는 SeV의 병원성을 2개의 방법으로 개변한다. 즉 CTL은, 한쪽으로는 신체로부터 바이러스를 소멸 또는 소실시키도록 작용하고, 다른쪽으로는 면역 병리학적과정에 의한 병상의 진행을 가속하도록 작용한다. 즉, BALB/c마우스에서의 실험결과는, 변이 SeV가 마우스 개체내에서 높은 증식성을 나타낸 것에 의한 직접적 효과 보다도, 결과적으로 보다 강한 면역을 유도했기 때문에 간접적으로 병상이 악화되었을 가능성을 생각할 수 있다. 따라서, 흉선결손 누드 마우스에 있어서의 야생형 바이러스와 변이 바이러스의 병원성을 조사하여, 면역유도에 의한 병원성 악화 가능성의 부정을 시도했다(도11). 그 결과, 각 바이러스의 LD₅₀은 누드 마우스와 부모 정상 마우스(parental normal mouse) 사이에 차이가 인정되지 않고, 누드 마우스에 있어서도 2개의 바이러스에서 동일한 정도(~40배)의 차이가 인정되었다(표1). 이들 결과로부터, 적어도 LD₅₀에 기인하는 한, 관찰기간(14일)동안에는, 야생형 바이러스 및 변이 바이러스 양자의 병원성에 CTL은 주요한 역활을 다하고 있지 않은 것이 시사된다. 그러나, 야생형 바이러스 및 변이 바이러스 양자 모두, 부모 마우스(parental mouse)에서는 바이러스가 소실된 후에도, 누드 마우스에서는 전과정에서 폐내에 바이러스가 존속하고 있었다(도12). 이들 결과는, CTL 및 다른 흉선 의존적인 응답이, 바이러스의 병리에 있어서 적어도 부분적인 역할을 다하고 있는 것을 시사한다.

이상의 결과로부터, 천연 F 유전자 전사개시서열은 SeV의 복제를 어느 정도 억제함으로써 감염된 마우스를 보다 장기간 생존할 수 있도록 하고 있는 것이 시사된다.

산업상이용가능성

본 발명에 의해 전사개시서열이 개변된 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터가 제공되었다. 본 발명의 바이러스 벡터는, 전사개시서열의 개변에 의해, 야생형 바이러스와 비교하여, 게놈상의 유전자 전사 레벨이 개변되어 있다. 이들 바이러스는, 증식력을 상승시키기 위해, 또한 목적으로 하는 외래유전자의 발현을 상승시키기 위해 유용하다. 이러한 바이러스 벡터는, 산물의 생산효율이 향상된다고 하는 잇점을 갖는다. 반대로, 너무 높은 발현이 바람직하지 못한 단백질의 경우에는, F 유전자 전사개시서열과 같은 재개시활성이 낮은 전사개시서열의 하류에 상기 단백질을 코드하는 유전자를 연결함으로써 발현량을 제한하는 것이 가능하다. 또한, 의약품조성물이나 백신으로서, 재조합 바이러스입자 또는 바이러스양 입자를 회수하는 경우, 증식력이 상승하도록 전사개시서열이 개변된 게놈을 가지는 바이러스에서는, 짧은 기간에 다량의 바이러스를 회수하는 것이 가능하다고 하는 잇점을 갖고 있다.

Claims (11)

1. 파라믹소바이러스과 바이러스 게놈상의 적어도 하나의 유전자 전사개시서열이 개변됨으로써, 숙주내에 있어서의 상기 유전자 및 그 하류의 유전자 발현량이 개변된, 바이러스 벡터 DNA.
2. 제1항에 있어서, 전사개시서열의 개변이 파라믹소바이러스과 바이러스의 다른 유전자 전사개시서열로의 치환인 바이러스 벡터 DNA.
3. 제1항에 있어서, 전사개시서열의 개변이 F 유전자 전사개시서열의 다른 유전자 전사개시서열로의 치환인 바이러스 벡터 DNA.
4. 제3항에 있어서, 다른 유전자 전사개시서열이 P/M/HN 유전자형 전사개시서열인 바이러스 벡터 DNA.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, F 유전자 및/또는 HN 유전자가 결손되어 있는 바이러스 벡터 DNA.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 외래유전자가 삽입되어 있는 바이러스 벡터 DNA.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 DNA로부터의 전사산물을 바이러스입자 내부에 포함하는 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터.
8. 제7항에 있어서, 센다이 바이러스 벡터인 벡터.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 천연형 바이러스와 비교하여 숙주에 있어서의 증식능력이 높아져 있는 벡터.
10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 DNA를 숙주에 도입하고, 상기 숙주내에서 바이러스단백질을 발현시키는 공정을 포함하는, 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터의 제조방법.
11. 제10항에 있어서, 파라믹소바이러스과 바이러스가 센다이 바이러스인 방법.