CN1526014A - 用于将外源基因导入骨骼肌的副粘病毒载体 - Google Patents

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Abstract

利用LacZ报告基因和胰岛素样生长因子基因，研究能否利用重组仙台病毒(SeV)载体将外源基因导入骨骼肌。结果发现，转基因表达在注射后最多持续一个月。导入编码胰岛素样生长因子的基因作为比较对照，结果显示，再生肌纤维和作为肥大指标的分裂肌纤维明显增加，肌纤维总数也因此增加。以上表明，携带仙台病毒的副粘病毒载体在骨骼肌中实现高水平的转基因表达，还表明利用副粘病毒载体导入编码胰岛素样生长因子的基因，有可能高效治疗神经肌障碍。

Description

用于将外源基因导入骨骼肌的副粘病毒载体
技术领域
本发明涉及用于将外源基因导入骨骼肌的副粘病毒载体。
背景技术
副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)包括棒状病毒(Rhabdoviridae)、副粘病毒(Paramyxoviridae)和线状病毒(Filoviridae)三个属的包膜病毒，这些病毒具有非分节型(-)链RNA基因组，该基因组有作为mRNA和反链基因组合成模板的功能。仙台病毒(SeV)属于副粘病毒属，从病毒学的初期研究开始，就认为它对人不具有致病性(病毒实验报告书，永井美之、石滨明，1995.4)。SeV在哺乳动物细胞中具有严格的胞浆生活周期，导入的RNA与宿主细胞染色体不发生相互作用，保持在细胞质中，因此，SeV能安全地用于人体基因治疗。此处所用SeVZ株的全长基因组核苷酸序列在1986年由Shibuta等确定。并且，通过转化SeV cDNA而成功回收到感染性病毒，这使得有可能进行基因操作(Conzelmann，K.K.Annu.Genet.，1998，32，123-162；Y.Nagai，A.KatoMicrobiol.Immunol.，1999，43，613-624)。进一步地，具有附加转录单元的多种外源基因被插入基因组中的适当位置后，在SeV中表达水平很高(Yu，D.，T.Shioda，A.Kato，M.K.Hasan，Y，Sakai和Y.Nagai，Genes Cells.，1997，2，457-466)。
胰岛素样生长因子(IGF-I)在骨骼肌的发育、维持和再生中起着重要的作用。IGF-I对肌原细胞的作用包括促进成肌细胞复制、肌原分化和导致肌管肥大(Annu.Rev.Physiol.，1991，53，201-216；Endocr.Rev.，1996，17，481-516；Cell.，1993，75，59-72；Genes Dev.，1993，7，2609-2617)。肌肉再生包括肌肉前驱细胞的增殖、与肌管的融合和再神经支配。卫星细胞中产生的IGF-I作为肌肉前驱细胞增殖和分化的强有力刺激因子起作用(Acta Physiol Scand，1999，167，301-305)。骨骼肌中导入IGF-I基因已应用于下述方面：用非病毒技术治疗去神经骨骼肌萎缩和用AAV载体治疗与年龄增长相关的骨骼肌机能消退(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1998，95，15603-15607)。
发明公开
本发明的目的是提供一种能够高效地将外源基因导入骨骼肌细胞的副粘病毒载体及其用途。具体地，本发明提供了一种能将外源基因导入骨骼肌的副粘病毒载体，一种包含该载体的用于将外源基因导入骨骼肌的组合物，和一种利用该载体将外源基因导入骨骼肌的方法。本发明的优选实施方案中，提供一种插有编码胰岛素样生长因子的基因的副粘病毒载体及其在肌纤维形成中的用途。
编码治疗全身性疾病和神经肌障碍的治疗蛋白的外源性基因的理想输送和表达部位是骨骼肌。本发明人研究了能否用含有LacZ报告基因和人胰岛素样生长因子(hIGF-I)基因的重组仙台病毒(SeV)载体将外源基因导入骨骼肌。
肌内注射LacA/SeV七天后，用布帕卡因处理/未处理的动物中，发现许多X-gal标记的肌纤维，转基因表达在注射后持续多达一个月。L6细胞培养上清液中检出的主要蛋白质种类为来源于IGF-I/SeV的重组hIGF-I，因此，被诱导的L6细胞发生了多核重构和肥大等形态学变化。将IGF-I/SeV导入肌肉中，与用LacA/SeV处理的对照组比较，发现再生肌纤维和作为肥大指标的分裂肌纤维明显增加，肌纤维总数也增加。这些结果表明：携带仙台病毒的副粘病毒载体在骨骼肌中实现高水平的转基因表达，因此很可能在神经肌障碍的治疗中利用副粘病毒载体导入IGF-I基因是有效的。
本发明涉及：用于将外源基因导入骨骼肌的副粘病毒载体，利用该载体将外源基因导入骨骼肌的方法，插有胰岛素样生长因子作为外源基因的副粘病毒载体及其在肌纤维形成中的应用。具体地，本发明提供：
(1)一种将外源基因导入骨骼肌的方法，该方法包括将插有外源基因的副粘病毒载体给予骨骼肌。
(2)根据(1)项记载的方法，其中所述副粘病毒为仙台病毒。
(3)根据(1)或(2)项记载的方法，其中所述外源基因为治疗基因。
(4)根据(1)或(2)项记载的方法，其中所述外源基因为编码胰岛素样生长因子的基因。
(5)一种副粘病毒载体，该载体插有外源基因，用于将外源基因导入骨骼肌。
(6)根据(5)项记载的载体，其中所述副粘病毒为仙台病毒。
(7)根据(5)或(6)项记载的载体，其中所述外源基因为治疗基因。
(8)根据(5)或(6)项记载的载体，其中所述外源基因为编码胰岛素样生长因子的基因。
(9)一种将外源基因导入骨骼肌的组合物，该组合物含有插入外源基因的副粘病毒载体。
(10)根据(9)项记载的组合物，其中所述副粘病毒为仙台病毒。
(11)根据(9)或(10)项记载的载体，其中所述外源基因为治疗基因。
(12)根据(9)或(10)项记载的载体，其中所述外源基因为编码胰岛素样生长因子的基因。
(13)根据(12)项记载的组合物，该组合物用于增加哺乳动物的再生肌纤维和/或分裂肌纤维。
(14)根据(12)项记载的组合物，该组合物用于神经肌障碍的治疗。
本发明中，术语“副粘病毒载体”是指衍生自副粘病毒并可将基因导入宿主细胞的载体。本发明的副粘病毒载体可以是核糖核蛋白(RNP)或具有感染力的病毒颗粒。此处，“感染力”是指重组副粘病毒载体通过保持其细胞粘附和膜融合能力，将该载体内部的基因导入该载体所粘附的细胞的能力。优选实施方案中，本发明的副粘病毒载体通过基因工程手段整合能表达的外源基因。本发明的副粘病毒载体可以具有复制能力，也可以是不具有复制能力的缺陷载体。本文中，“复制能力”是指病毒在感染了该病毒载体的宿主细胞中复制并产生感染性病毒颗粒的能力。
本说明书中，“重组”副粘病毒载体是指通过基因操作构建的副粘病毒载体或其扩增产物。例如，重组副粘病毒载体可以通过重组副粘病毒cDNA的重建来制备(Y.Nagai，A.Kato，Microbiol.Immunol.，1999，43，613-624)。
本发明中，“副粘病毒”是指属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)的病毒或其衍生物。本发明适用的副粘病毒包括：属于副粘病毒科的仙台病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、牛瘟病毒、温热病毒(distemper virus)、猴副流感病毒(SV5)和人副流感病毒的I、II和III型等。本发明的病毒优选副粘病毒属的病毒或其衍生物。
本发明适用的副粘病毒属病毒包括：诸如仙台病毒和人HA2等I型副流感病毒，诸如猴SV5、SV41及人CA病毒等II型副流感病毒，诸如牛SF和人HAl等III型副流感病毒，IV型副流感病毒(包括A亚型和B亚型)，腮腺炎病毒，新城疫病毒和其它许多副粘病毒属病毒，本发明的副粘病毒最优选仙台病毒。这些病毒可以是天然株、突变株、实验室传代株和人工构建株等。DI颗粒(J.Virol.，1994，68，8413-8417)等不完整病毒、合成的寡核苷酸等也可以作为制备本发明病毒载体的材料。
编码副粘病毒蛋白的基因包括NP、P、M、F、HN和L基因。此处“NP、P、M、F、HN和L基因”分别指编码核衣壳蛋白、磷蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血凝素-神经氨酸酶蛋白和大分子蛋白的基因。副粘病毒亚科中每种病毒的基因通常表示如下，NP基因通常也描述为“N基因”。
副粘病毒属(Paramyxovirus)  NP P/C/V   M  F HN   -    L
风疹病毒属(Rublavirus)     NP P/V     M  F HN  (SH)  L
麻疹病毒属(Morbillivirus)  NP P/C/V   M  F H    -    L
例如，核苷酸序列数据库中，归类为副粘病毒科呼吸道病毒属的仙台病毒，其NP基因的录入号是M29343、M30202、M30203、M30204、M51331、M55565、M69046和X17218；P基因的是M30202、M30203、M30204、M55565、M69046、X00583、X17007和X17008；M基因的是D11446、K02742、M30202、M30203、M30204、M69046、U31956、X00584和X53056；F基因的是D00152、D11446、D17334、D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、X00152和X02131；HN基因的是D26475、M12397、M30202、M30203、M30204、M69046、X00586、X02808和X56131；L基因的是D00053、M30202、M30203、M30204、M69040、X00587和X58886。
本发明中，术语“基因”是指遗传物质，包括RNA和DNA等核酸。基因可以编码或不编码蛋白，可以编码核酶或反义RNA等功能性RNA。基因可以是天然序列或人工设计的序列。此外，本发明中，术语“DNA”包括单链DNA和双链DNA。
本发明中，术语“骨骼肌”是指呈横纹状的肌肉，本说明书中包括心肌。
本发明提供了副粘病毒载体在将基因导入骨骼肌中的用途。本发明人发现，副粘病毒属的仙台病毒能以高效率将基因导入骨骼肌，而骨骼肌是治疗全身性疾病和神经肌障碍的重要靶子。因此，本发明的载体适用于上述疾病的基因治疗。
此外，本发明人揭示，用重组仙台病毒载体导入骨骼肌中的基因可持续表达1个月。这表明，用重组仙台病毒载体进行靶向骨骼肌的基因治疗可以获得持续的疗效。
从安全性考虑，由于副粘病毒载体对人无致病性，这意味着它优选用于人类基因治疗的临床试验中。首先，质粒DNA引起的外源基因表达中，高效基因表达的主要障碍是导入的DNA必须转运至核内，或其核膜必须消失。但在仙台病毒等情况中，外源基因的表达由细胞质中的细胞微管蛋白及其本身所具有的RNA聚合酶(L蛋白)随着病毒基因组的复制而驱动。这表明仙台病毒不与宿主染色体相互作用，一般认为不会出现由染色体异常引起细胞癌化等安全性方面的问题。其次，已知仙台病毒对啮齿动物具有致病性，能引发肺炎，但它对人体没有致病性。证据之一是，将野生型仙台病毒鼻内给与非人灵长类不造成严重伤害(Hurwitz J.L.等，Vaccine，1997，15，533-540)。这些特征提示仙台病毒载体可以应用于人类治疗中，它还有望成为骨骼肌基因治疗的一种选择。
因此，本发明发现副粘病毒载体在将基因导入骨骼肌中有效，这一发现有可能给基因治疗等带来很大的进步，尤其是靶向骨骼肌的基因治疗。
本发明中，用于将基因导入骨骼肌的重组副粘病毒载体不限于任何特定的种类。例如，适当的副粘病毒载体包括能复制和自我繁殖的载体。通常，野生型副粘病毒的基因组包含短的3′前导区，后随6个基因，分别编码N(核衣壳)、P(磷)、M(基质)、F(融合)、HN(血凝素-神经氨酸酶)和L(大)蛋白，另一端有一段短的5′尾部区域。本发明能自我复制的载体可通过设计具有与上述相同结构的基因组而获得。此外，表达外源基因的载体可通过将外源基因插入上述载体的基因组而获得。本发明副粘病毒载体中，病毒基因的排列可以不同于野生型病毒。
本发明所用的副粘病毒载体可以缺失野生型病毒中含有的某些基因。例如，重建仙台病毒载体时，一般认为由NP、P/C和L基因编码的蛋白本身是必需的，但本发明的病毒载体不一定包含编码上述蛋白的基因作为其组成。例如，携带编码上述蛋白的基因的表达载体可以与编码该载体基因组的表达载体共转染至宿主细胞中，由此重建病毒载体。或者，将编码载体基因组的表达载体导入携带有编码上述蛋白的基因的宿主细胞中，由该宿主细胞提供给上述蛋白，由此重建病毒载体。这些蛋白的氨基酸序列可以与来自起始病毒的序列不同，只要它们在核酸导入过程中具有与天然型相比等效或更强的活性，它们可以突变或者被另一种病毒的同源基因取代。
一般认为，由M、F和HN基因编码的蛋白是副粘病毒载体的细胞-细胞繁殖所必需的。但是，当病毒载体为RNP形式时，不需要这些蛋白。如果RNP中的基因组包含M、F和HN基因，当其导入宿主细胞时，产生这些基因的产物，并产生具有感染力的病毒颗粒。
可将RNP与转染试剂如脂转染胺(lipofectamine)和聚阳离子脂质体一起形成复合体再导入细胞中。具体地，可使用各种转染试剂，例如，DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN #301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boehringer#1811169)等。可加入氯喹以防止在核内体中的降解(Calos，M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80，3015)。如果是复制型病毒，所产生的病毒可以通过再感染培养细胞、鸡卵或动物(例如小鼠等哺乳动物)等而扩增或传代。
相反，缺乏M、F和/或HN基因的副粘病毒载体也可以作为本发明的副粘病毒载体。这些载体可以通过例如外源提供缺失的基因产物而重建。这样制备的病毒载体仍然可以象野生型病毒一样粘附于宿主细胞并诱导细胞融合。但是子代病毒颗粒不具有与起始病毒相同的感染力，因为导入细胞的载体基因组缺乏上述基因中的一种。因此，这些载体可用作仅能进行一次基因导入的安全病毒载体。例如，基因组缺失的基因可以是F和/或HN基因。病毒载体可以按下述方法重建：将缺失F基因的重组副粘病毒载体基因组的表达质粒、编码F蛋白的表达载体、以及编码NP、P/C和L蛋白的表达载体共转染至宿主细胞中(国际申请号PCT/JP00/03194和PCT/JP00/03195)；或者，可以使用染色体中整合了F基因的宿主细胞。外源提供这些蛋白群时，其氨基酸序列可以与野生型病毒的序列不同；并且，只要在核酸导入中的活性与天然型的等效或较之更强，它们可以是发生突变，或者被另一种病毒的同源基因取代。
可以制备下述载体：其在包膜蛋白中，包含与载体基因组编码的病毒包膜蛋白不同的蛋白。对这种蛋白没有限制，可以包括其它病毒的包膜蛋白，如水疱性口炎病毒(VSV)的G蛋白(VSV-G)。本发明的副粘病毒载体包括VSV-G等假型病毒载体，所述假型病毒载体带有源自基因组编码病毒以外的病毒的包膜蛋白。
本发明的副粘病毒载体在病毒包膜表面还包含下述蛋白，例如：能粘附于特定细胞的粘附因子、配体和受体等蛋白，或者嵌合蛋白(其在病毒外表面包含上述蛋白，在病毒的内侧包含病毒包膜衍生的多肽)。这样就能产生靶向特定组织的载体。这些蛋白可以由病毒基因组自身编码，也可以在重建病毒载体时由病毒基因组以外的基因(例如，其它表达载体或宿主细胞染色体的基因)表达来提供。
可以改变本发明病毒载体中所含的病毒基因，例如，为了降低抗原性或提高RNA转录效率或复制效率。具体地，可以改变复制因子NP、P/C和L基因中的至少一种，以增强转录或复制功能。结构蛋白之一的HN蛋白具有血凝素活性和神经氨酸酶活性，如果能减弱前一种活性，则可能提高病毒在血液中的稳定性；改变后一种活性则可能调节感染力。通过改变F蛋白(它参与膜融合)可以调节膜融合脂质体的融合能力。例如，对可能成为细胞表面抗原分子的F蛋白或HN蛋白的抗原呈递表位进行分析，由此制备抗原呈递能力减弱的副粘病毒。
本发明的病毒载体可在基因组RNA中编码外源基因。可通过将外源基因插入副粘病毒载体基因组中来制备携带外源基因的重组副粘病毒载体。外源基因可以是需要在靶骨骼肌中表达的基因。外源基因可以是编码天然蛋白的基因，或者是编码通过缺失、取代或插入修饰天然蛋白所得的蛋白的基因，只要该修饰蛋白与天然蛋白有等效的功能。例如，为了进行基因治疗等目的，可以将目标疾病的治疗基因插入编码所述病毒载体的DNA中。在将外源基因导入仙台病毒载体DNA的例子中，优选在转录终止序列(E)和转录起始序列(S)之间插入包含6的倍数的核苷酸的序列(Journal of Virology，1993，67(8)，4822-4830)。可将外源基因插入病毒每种基因(NP、P、M、F、HN和L基因)的上游和/或下游。为了不干扰上游和下游基因的表达，可在外源基因上游或下游适当插入E-I-S序列(转录终止序列-间插序列-转录起始序列)或其一部分，或者，可借助IRES插入外源基因。
所插入的外源基因的表达水平可通过连接在所述基因上游的转录起始序列的类型来调节，也可通过插入点的位置和所述基因前后的碱基序列来调节。例如，在仙台病毒中，插入点越靠近病毒基因组负链RNA的3′-末端(野生型病毒基因组的基因排列中较靠近NP基因)，插入基因的表达水平越高。为了获得外源基因的高水平表达，优选将其插入负链基因组的上游区，如NP基因的上游(负链上的3′侧翼序列)，或NP与P基因之间。相反，插入点越靠近负链RNA的5′-末端(野生型病毒基因组的基因排列中较靠近L基因)，插入基因的表达水平越低。为了降低外源基因的表达水平，可将其插入负链上的5′最末端位置，即野生型病毒基因组的L基因下游(负链上L基因的5′侧翼区)或L基因的上游(负链上L基因的3′侧翼区)。这样，可以适当调整外源基因的插入位置，以便获得所需的基因表达水平，或者使插入子与其周边编码病毒蛋白的基因的组合最佳化。为了使外源基因易于插入，可以在插入位置设计克隆位点。例如，克隆位点可以是限制酶的识别序列。编码基因组的载体DNA中，限制性位点可以插入外源基因。所述克隆位点可以是包含限制酶的多个识别序列的多克隆位点。另外，本发明的载体还可以在上述插入位置以外的其它位置具有其它外源基因。
可以按照例如Kato A.等，EMBO J.，1997，16：578-587，和Yu D.等，GenesCells，1997，2：457-466所述方法，如下构建带有外源基因的重组仙台病毒载体。
首先，制备包含所需外源基因的cDNA核苷酸序列的DNA样品。优选此DNA样品在25ng/μl或更高浓度并且可以通过电泳确认为单个质粒。下面是将外源基因插入病毒基因组DNA的NotI位点的一个实例。如果目的cDNA核苷酸序列中包含NotI识别位点，优选事先用定点诱变法等改变核苷酸序列以除去该位点，但不改变所编码的氨基酸序列。从所述DNA样品通过PCR扩增回收所需的DNA片段。为了获得两个末端都带有NotI位点的扩增片段，并在其中一个末端添加仙台病毒转录终止序列(E)、间插序列(I)和转录起始序列(S)(EIS序列)的一个拷贝，制备了作为引物对的正向DNA序列和反向DNA序列(反义链)，该引物对包含NotI限制酶识别序列、转录终止序列(E)、间插序列(I)和转录起始序列(S)，以及目的基因的部分序列。
例如，正向合成性DNA序列在5′-末端包含任意两个或更多个的核苷酸(优选4个核苷酸，不包括GCG和GCC等来自NotI识别位点的序列，更优选ACTT)，以确保用NotI消化。在该序列的3′-末端添加NotI识别序列GCGGCCGC。另外，在3′-末端还添加任意9个核苷酸或9加6的倍数个核苷酸作为间隔序列。进一步地，还在3′-末端添加ORF的约25个核苷酸的序列，它从所需cDNA的起始密码子ATG开始并包括ATG。优选地，正向合成性寡DNA 3′-末端从所需cDNA选取约25个核苷酸，使得最后一个核苷酸为G或C。
反向合成性DNA序列在5′-末端包含任意两个或更多个核苷酸(优选4个核苷酸，不包括GCG和GCC等来自NotI识别位点的序列，更优选ACTT)。在该序列的3′-末端添加NotI识别序列GCGGCCGC。另外，在3′-末端还添加插入一段寡DNA间隔序列以调整引物的长度。寡DNA的长度按下述方法设计：包括NotI识别序列GCGGCCGC，cDNA的互补序列和后述源自仙台病毒基因组的EIS序列，核苷酸总数为6的倍数(所谓“6的法则”；Kolakofski D.等，J.Virol.，1998，72，891-899)。此外，在插入片段的3′-末端，进一步添加仙台病毒S序列的互补序列(优选5′-CTTTCACCCT-3′)、I序列(优选5′-AAG-3′)、E序列的互补序列(优选5′-TTTTTCTTACTACGG-3′)。进一步地，在该3′-末端添加所需cDNA的互补序列，使得最后一个核苷酸为G或C，此最后一个核苷酸位于该cDNA终止密码子上游约25个核苷酸处。以此作为反向合成性寡DNA的3′-末端。
可以利用E×Taq聚合酶(TaKaRa)通过常规方法进行PCR。优选使用Vent聚合酶(NEB)，扩增了的目的片段用NotI消化，然后插入质粒载体pBluescript的NotI位点。用自动DNA测序仪检测所得PCR产物的核苷酸序列，选出具有正确序列的质粒。通过NotI消化而将插入片段从该质粒上切下来，克隆至包含副粘病毒基因组cDNA的质粒的NotI位点。或者，不通过pBluescript载体而将PCR产物直接插入NotI位点，也可以获得重组仙台病毒cDNA。
将编码病毒基因组的DNA与适当的转录启动子连接，构建载体DNA。将所得载体DNA在体外或细胞中转录，在病毒L、P和NP蛋白存在的条件下重建RNP，从而可以生成包含该RNP的病毒载体。由病毒载体DNA重建病毒可按照已知方法进行(WO97/16539；WO97/16538；Durbin A.P.等，Virol.，1997，235，323-332；Whelan S.P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，8388-8392；Schnell M.J.等，EMBO J.，1994，13，4195-4203；Radecke F.等，EMBO J.，1995，14，5773-5784；Lawson N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，4477-4481；Garcin D.等，EMBO J.，1995，14，6087-6094；Kato A.等，Genes Cells，1996，1，569-579；Baron M.D.和Barrett T.，J.Virol.，1997，71，1265-1271；Bridgen A.和Elliott R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93，15400-15404)。用这些方法能从DNA重建副粘病毒载体，包括副流感病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒和仙台病毒载体。病毒载体DNA中缺失F、HN和/或M基因时，无法形成感染性病毒颗粒。但有可能将这些缺失基因和/或编码其它病毒包膜蛋白的基因从另一种病毒导入宿主细胞中并进行表达，从而能产生感染性病毒颗粒。
将载体DNA导入细胞的方法包括：(1)制备能掺入所需细胞的DNA沉淀，(2)制备包含带正电的DNA的复合体，它适于掺入所需细胞并且具有较低细胞毒活性，和(3)利用电脉冲在所需细胞胞浆膜上打开一个瞬时性小孔，其大小仅足以使DNA通过。
方法(2)中可以使用各种转染试剂，如DOTMA(Boehringer)，Superfect(QIAGEN #301305)，DOTAP，DOPE和DOSPER(Boehringer #1811169)等。方法(1)中，可使用磷酸钙进行转染。在这种方法中，DNA以吞噬泡的形式被细胞摄入，但已知足量的DNA也能被摄入细胞核中(Graham F.L.和VanDer Eb J.，Virology.，1973，52，456；Wigler M.和Silverstein S.，Cell，1977，11，223)。Chen和Okayama研究了导入技术的最佳条件，他们报道说：(1)细胞和共沉淀物的温育条件为：2～4％CO2，35℃，15～24hr时效力最高，(2)环状DNA比线性DNA活性更高，和(3)当沉淀混合溶液中DNA浓度为20～30μg/ml时，可形成最佳沉淀(Chen C.和Okayama H.，Mol.Cell.Biol.，1987，7，2745)。上述(2)的方法适于瞬时转染。已知更早的方法是：配制具有所需DNA浓度比的DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885 M.W.5×105)混合液，进行转染。由于大多数复合体在内体中降解，可以加入氯喹来提高转染效力(Calos，M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80，3015)。上述(3)的方法称为电穿孔，由于没有细胞选择性，它比方法(1)和(2)应用更广。可通过最优化脉冲电流的持续时间、脉冲形式、电场强度(电极间空隙，电压)、缓冲液的导电性、DNA浓度和细胞密度，从而使转染效力最大化。
在上述三种方法中，使用转染试剂进行的方法(2)操作简单，并且能用大量的细胞检测大量样品，因此适用于本发明，优选用Superfect TransfectionReagent(QIAGEN，#301305)和DOSPER Liposomal Transfection Reagent(Boehringer Mannheim #1811169)。
具体地，按下述方法从cDNA进行重建：
在24～6孔左右的塑料板或100mm Petri培养皿中，用极限必需培养基(MEM)将猴肾细胞LLC-MK2培养至70-80％铺满，所述培养基含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素(100U/ml青霉素G和100μg/ml链霉素)。表达T7聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3在1μg/ml补骨脂素存在下，于UV中暴露20分钟而灭活，然后以2PFU/细胞的量感染细胞(Fuerst T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，83，8122-8126；和Kato.A.等，Genes Cells，1996，1，569-579)。可以适当调整补骨脂素的加入量和暴露于UV的时间长短。感染1小时后对细胞进行转染，方法可以是用Superfect(QIAGEN公司)、2-60μg(更优选3-5μg)上述重组仙台病毒cDNA、以及表达病毒蛋白的质粒(24-0.5μg pGEM-N，12-0.25μg pGEM-P，和24-0.5μg pGEM-L，或更优选1μg pGEM-N，0.5μgpGEM-P，和1μg pGEM-L)(Kato.A.等，Genes Cells，1996，1，569-579)进行脂转染，所述表达病毒蛋白的质粒能用于产生全长仙台病毒基因组并且是必需的。在MEM中培养转染的细胞，所述MEM不含血清，但在需要时含有100μg/ml利福平(Sigma)和优选浓度为40μg/ml的阿糖胞苷(AraC)(Sigma)，以便将药物浓度调整至最佳，从而使痘苗病毒的细胞毒活性最小而病毒的回收率最高(Kato.A.等，Genes Cells，1996，1，569-579)。转染后将细胞培养48-72hr，然后收集并通过三次冻融而裂解。用细胞裂解物转染LLC-MK2细胞，培养3天-7天，收集培养基。为了重建缺乏编码包膜蛋白的基因并且不能复制的病毒载体，可用该载体转染能表达包膜蛋白的LLC-MK2细胞，或与该包膜蛋白的表达质粒一起转染。另一种方法是，将转染的细胞覆盖在表达该包膜蛋白的LLC-MK2细胞的上层并进行培养，使缺陷型病毒载体繁殖(参照PCT/JP00/03194和PCT/JP00/03195)。培养上清中所含病毒的滴度可通过测定血凝素活性(HA)来确定。HA可通过“内点稀释法”来测定(Kato.A.等，Genes Cells，1996，1，569-579)。所得病毒可以在-80℃保存。
对用于重建的宿主细胞类型无特殊限制，只要所述病毒载体能在这些细胞中重建。宿主细胞包括LLC-MK2细胞、来自猴肾的CV-1细胞、来自仓鼠肾的BHK细胞等培养的细胞和来自人的细胞等。此外，为了获得大量仙台病毒载体，可以用从上述宿主细胞获得的病毒载体感染受孕鸡卵，从而扩增该载体。已经开发了用鸡卵制备病毒载体的方法(Advanced protocols inneuroscience study III，Molecular physiology in neuroscience.，Ed.by Nakanishi等，Kouseisha，Osaka，1993，153-172)。具体地，例如，将受精卵在孵化器中37-38℃培养9-12天以形成胚。将病毒载体接种到尿囊腔，进一步将该受精卵培养数日使载体繁殖。可根据所用的重组仙台病毒类型的不同而改变培养时间等条件。然后，回收合有病毒的尿囊液。可以用常规方法从尿囊液样品中分离和纯化仙台病毒载体(Tashiro M.，Protocols in virus experiments.，Nagai和Ishihama编辑，MEDICAL VIEW，1995，68-73)。
在制备缺损病毒载体时，例如，如果将基因组中缺失不同包膜基因的两种载体转染至相同细胞中，每种缺失的包膜蛋白通过另一载体的表达来提供，这种互补导致产生感染性病毒颗粒，它们能复制并繁殖。即，如果将两种或多种彼此互补的本发明病毒载体同时混合接种，能以较低成本产生各种包膜基因缺陷型病毒载体的大量混合物。由于这些包膜基因缺陷的病毒具有较小的基因组，它们允许插入较长的外源基因。此外，这些本身没有感染能力的病毒在细胞外稀释后很难维持共感染状态，因此它们不会产生后代，对环境的损害也较小。
如果用治疗疾病的基因作为外源基因制备病毒载体，就能给与该载体以实施基因治疗。当本发明的病毒载体用于基因治疗时，通过直接给药或间接(回体(ex vivo))给药的方法都能表达具有所需治疗效果的外源基因或患者体内供应不足的内源基因等。对外源基因无特殊限制，不仅包括编码蛋白的核酸，还包括反义核酸或核酶等不编码蛋白的核酸。
本发明的副粘病毒载体可以与所需的可药用载体一起构成组合物。本文中，“可药用载体”是指能与载体一起给药但不抑制通过该载体进行的基因导入的物质。例如，本发明的副粘病毒载体可以用生理盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)等适当稀释，制成组合物。如果本发明的副粘病毒载体是在鸡卵中繁殖，组合物可含有尿囊液。组合物还可以包含介质，如去离子水或5％的葡萄糖水溶液。还可以包含稳定剂、抗生素等。
将按上述方法所得的副粘病毒载体或含有该载体的组合物导入骨骼肌，能使副粘病毒载体所携带的外源基因在骨骼肌中表达。
给与病毒载体之前还可以给与布帕卡因，已知布帕卡因通过诱导肌肉再生而增强转基因的表达。
利用本发明副粘病毒导入的基因的类型不限。这样的基因可编码天然蛋白或人工蛋白。天然蛋白包括激素、细胞因子、生长因子、受体、酶和肽等。这样的蛋白可以是分泌蛋白、跨膜蛋白、胞浆蛋白和核蛋白等。人工蛋白包括融合蛋白(如嵌合毒素)、显性阴性蛋白(包括受体的可溶性分子和膜结合型显性阴性受体)、缺陷型细胞粘附分子和细胞表面分子等。这样的蛋白还可包含分泌信号、膜定位信号或核转位信号等。所导入的基因可以是骨骼肌中原本不表达的基因。或者，可以导入骨骼肌中正常表达的基因，以便过度表达。也可以通过导入反义RNA分子或切割RNA的核酶，而抑制骨骼肌细胞表达的不想要的基因的功能。
人们期待本发明的载体可以应用于各种疾病的基因治疗。这种基因治疗可以补偿细胞中由于基因缺陷引起的表达缺陷，或者通过将外源基因导入细胞而赋予新功能，或者通过导入能抑制特定基因的活性的基因而抑制细胞中不想要的活性。
需要进行基因治疗的疾病包括肌萎缩症、肌炎、肌病及心肌梗塞后的肌病和心肌病等。其中，肌萎缩症治疗中有效的基因有肌营养不良蛋白、IGF-I，肌炎治疗中有IGF-I、FGF，肌病治疗中有IL-10、IL-12、IL-6。
利用本发明副粘病毒导入的基因的一个优选例为编码胰岛素样生长因子的基因。通过导入该基因有望使再生肌纤维和作为肥大指标的分裂肌纤维显著增加，肌纤维总数也增加。因此，导入了编码胰岛素样生长因子的基因的副粘病毒有望应用于神经肌障碍的治疗。神经肌障碍包括因外伤引起的神经纤维断裂、肌萎缩性侧索硬化症和脊髓性肌萎缩症等。
基因治疗通过下述方法实施：将含副粘病毒载体的组合物通过肌肉内或肌肉外方式体内给予，使外源基因在骨骼肌细胞内表达。另外，也可以用回体给药方式给与所述组合物。将载体导入骨骼肌的方法包括经皮导入法和切皮直接导入法。导入载体时必须注意采取措施保证肌外膜不破损。
为将有效量的载体导入骨骼肌细胞，骨骼肌必须给与足量的副粘病毒载体。术语“有效量”是指能确保通过本发明方法将基因导入骨骼肌，产生所需治疗或预防效应(至少部分)的量。将含有所需基因的本发明副粘病毒载体以有效量给药，诱导导入了该载体的细胞和/或其周围的表型发生变化。优选地，将含有所需基因的本发明副粘病毒载体以有效量给予骨骼肌，从而将基因导入骨骼肌中显著数量的细胞中，并诱导这些细胞的表型改变。术语“显著数量的细胞”是指给药部位的靶骨骼肌细胞中，至少有约0.1％的细胞内通过本发明的载体导入了基因，优选约大于或等于1％，更优选约大于或等于5％，进一步优选约大于或等于10％，最优选约大于或等于20％。
可以用本领域技术人员公知的方法检测基因是否成功导入细胞中。例如，基因的转录产物可以通过Northern杂交、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)或RNA保护试验等方法来检测。通过Northern杂交或RT-PCR进行的检测也可在原位进行。对翻译产物的检测可如下进行：应用抗体进行Western印迹、免疫沉淀、RIA、酶联免疫吸附试验(ELISA)，pull-down试验等。为了便于检测基因导入是否成功，可以使将要表达的蛋白带上标签，或者可以插入报告基因以确保它的表达。报告基因包括但不限于编码β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶和绿色荧光蛋白(GFP)的基因等。
载体的用量和给药途经可以根据疾病、患者的体重、年龄、性别、症状、给药目的和转基因种类等而改变，可以由本领域技术人员作出适当决定。优选载体(含有可药用载体)的用量约为105pfu/ml～1011pfu/ml，更优选约107pfu/ml～109pfu/ml，最优选约1×108pfu/ml～5×108pfu/ml。
本发明包含病毒的组合物可以给予包括所有哺乳动物在内的受试者，包括人、猴、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛和狗等。
附图简述
图1是hIGF-I体外表达的照片和图。(A)为被病毒感染的L6细胞的培养上清中hIGF-I的表达照片。在括号中记载的条件下，用Western印迹法分析取自培养上清的样品(1＝无病毒，2＝LacZ/SeV(moi＝0.1，3天)，3＝IGF-I/SeV(moi＝0.1，3天)，4＝IGF-I/SeV(moi＝0.1，4天))。(B)为hIGF-I的时间和moi依赖性表达坐标图，该hIGF-I来自感染hIGF-I/SeV的L6细胞。在不同时间点取不同moi感染的细胞的培养上清，用ELISA试剂盒检测hIGF-I量。
图2是以SeV为载体的hIGF-I加强L6细胞的肌原分化和肥大的照片。
对照细胞在无血清培养基(分化培养基)中培养4天。以moi 0.05或0.2的病毒感染的细胞在无血清培养基中培养4天。固定后，用针对肌球蛋白重链胚亚单位的单克隆抗体(MAb BF-45)处理肌管，其它细胞进行核染色。病毒感染的细胞当病毒感染量为moi＝0.05时表现出中等程度的肌管肥大，moi＝0.2时，与仅在去除血清的条件下培养的细胞相比，表现出更明显的肌管肥大。在被病毒感染的细胞中发现集合在肌纤维中央的核组织。
图3是在体内将SeV转导入骨骼肌的可能性的照片。
在用肌肉坏死剂(布帕卡因)进行/未进行预处理的条件下，成熟大鼠的前胫骨肌中注射200μl含LacZ报告基因的重组SeV(5×10e7pfu)(LacZ/SeV)。各组分别在如下的天数后切开肌肉、染色，研究β-半乳糖苷酶的活性：A和B：布帕卡因(7天)，C和D：布帕卡因(14天)，E和F：布帕卡因(30天)，G和H：无布帕卡因(7天)，I和J：无布帕卡因(14天)，K和L：无布帕卡因(30天)。
图4是用抗hIGF-I抗体进行蛋白印迹分析得出的，病毒注射7天后，hIGF-I在前胫骨肌中表达的照片。前胫骨肌注射LacZ/SeV(2×10e8 pfu)或hIGF-I/SeV(2×10e8 pfu)200μl。7天后，切取冷冻肌组织100μg，从中获得组织提取液300μl。将50μl提取液中的蛋白(相当于16.7μg组织)用冷丙酮沉淀，然后用抗hIGF-I抗体进行蛋白印迹分析(M：标记蛋白，1：未处理，2：LacZ/SeV(#1动物)，3：LacZ/SeV(#2动物)，4：hIGF-I/SeV(#3动物)，5：hIGF-I/SeV(#4动物))。
图5是病毒注射7天后，hIGF-I在前胫骨肌中表达的照片。前胫骨肌的再生。右前胫骨肌注射LacZ/SeV(2×10e8 pfu)200μl，左前胫骨肌注射hIGF-I/SeV(2×10e8 pfu)200μl。将切取的肌肉的横切片用苏木精伊红(HE)(a、d和g)、用检测巨噬细胞的酸性磷酸酶(b、e和h)以及用BF-45(c、f和i)处理。黑白箭头分别表示BF-45阳性细胞和巨噬细胞。
图6是病毒注射7天后，hIGF-I在前胫骨肌中表达的柱状图。表达胚MyHC的肌纤维的数量。计数胚MyHC阳性细胞的总数(n＝4)，结果以平均值±SD(n＝4)表示。单个星号表示成对比较的p＜0.01(Student t检验)。
图7是病毒注射14天后，前胫骨肌的再生照片。右前胫骨肌注射LacZ/SeV(2×10e8 pfu)200μl，左前胫骨肌注射hIGF-I/SeV(2×10e8 pfu)200μl。将切开的肌肉的横切片用苏木精伊红染色(A：仅尿囊液，B：IGF-I/SeV(左)，C：LacZ/SeV(右))。
图8是病毒注射30天后，前胫骨肌的再生照片。切片中几乎没有发现炎症反应。用IGF-I/SeV处理过的肌肉因肥大导致分裂(图8a和b)。分裂位置如箭头所示。用IGF-I/SeV处理过的再生肌纤维几乎恢复至正常(图8c)。
图9是病毒注射30天后，前胫骨肌的再生照片。hIGF-I表达对肌纤维数(空心柱)和分裂纤维数(实心柱)的影响。将第一组的每例动物经LacZ/SeV处理的前胫骨肌的纤维总数作为用hJGF-I/SeV处理的对照(该值定为1)(结果表示为与对照值的相对值)(空心柱)。用相对值的平均值(n＝4)绘图(±SD)。单星号表示成对比较的p＜0.03(Student t检验)。计数分裂纤维的总数，结果以平均值±SD(n＝4)表示。双星号表示成对比较的p＜0.01(Student t检验)。
图10是小鼠腿部肌肉导入基因的3天后的比较图。滴度为4×107CIU/只小鼠(100μl，给药两次)。
本发明的最佳实施形态
下面参照实施例进一步详细说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
[实施例1]构建仙台病毒载体
在登录号为X00173的DNA序列的基础上，用引物5′-ATCC GAATTCGCAATGGGAAAAATCAGCAGTC-3′(SEQ ID NO：1)和5′-ATCC GAATTCCTACATCCTGTAGTTCTTGTTTCCTGC-3′(SEQ ID NO：2)，通过PCR从人cDNA文库(Gibco BRL，Rockville，MD)扩增人IGF-I开放阅读框架(Nature，1983，306，609-611)。将所得的PCR产物克隆至pBluescripeII的EcoRI位点，然后测序。将具有hIGF-I基因正确序列的产物用含有SeV特异性转录控制信号序列的引物5′-ATCC GCGGCCGCCAAAGTTCAGCAATGGGAAAAATCAGCAGTCTTC-3′(SEQ ID NO：3)和5′-ATCC GCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCTACATCCTGTAGTTCTTGTTTCCTGC-3′(SEQ ID NO：4)再扩增，然后，将扩增产物克隆至为制备15402个核苷酸的正确SeV全长反基因组(+)有义RNA所构建的亲本pSeV18+b(+)的NotI位点，得pIGF-I/SeV。将所得的pIGF-I/SeV转化至LLCMK2细胞，该细胞已感染表达T7聚合酶的痘苗病毒vTF7-3。用共转化过的各质粒干燥所得的N蛋白、P蛋白和L蛋白将T7控制的全长重组IGF-I/SeV RNA基因组包裹。温育40小时后回收病毒，将已转化的细胞注射到带胚的鸡卵中，以扩增回收的病毒。
[实施例2]hIGF-I的体外表达
研究结果显示，IGF-I与大鼠细胞系(J.Biol.Chem.，1997，272，6653-6662和J.Biol.Chem.，1996，135，431-440)和小鼠细胞系(J.Biol.Chem.，1989，264，13810-13817)的增殖、分化和肥大密切相关。本发明人研究重组人IGF-I是否能通过SeV介导的基因转移面诱导L6细胞(新生大鼠成肌细胞系)的形态学变化。用新构建的携带人IGF-I(hIGF-I)基因的重组SeV(命名为hIGF-I/SeV)和编码β-半乳糖苷酶的SeV(LacZ/SeV)，研究以下事实：(1)上清液中IGF-I的表达(蛋白印迹分析)，(2)上清液中IGF-I的表达动力学(ELISA检测)和(3)L6细胞的形态学变化。
体外研究
用含20％FCS和青霉素/链霉素的DMEM培养基培养L6细胞，抑制其向肌管细胞的分化。细胞在无血清DMEM中培养，或者，在无血清中感染病毒，再将细胞在分化的条件下培养。为进行免疫印迹，用2倍体积量的冷丙酮将100μl上清液浓缩至10μl，用15～25％的分离胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。然后转移至聚偏二氟乙烯膜上(DAIICHIPURE CHEMICALS，东京)。用抗人IGF-I单克隆抗体(Diagnostic SystemsLaboratories，Webster，TX)进行一级抗体反应，用辣根过氧化物酶标记的抗体进行二级反应。用增强型化学发光观察复合体。进行ELISA试验测定上清液中的IGF-I水平。方法基本按厂家建议(R&D systems，Minneapolis，MN)。
其结果如下：
(1)L6细胞用感染复数为0.1的hIGF-I/SeV感染3天和4天后，在细胞培养上清液中检出分子量为12～13kDa的反应带(图1A，泳道3和4)。在被LacZ/SeV感染的细胞的上清中未发现这种蛋白。由此证明，hIGF-I是由重组SeV产生后再分泌到培养上清液中。
(2)图1B表示感染病毒后的L6细胞上清液中IGF-I的表达程度。当感染复数为0.05时，上清液中IGF-I浓度在感染48小时后增至203ng/ml，且不诱导致细胞病变效应(CPE)，感染96小时后增至435ng/ml。当感染复数为0.5时，感染48小时和96小时后，分别有566ng/ml和935ng/ml的IGF-I分泌到培养基中。当感染复数为2.5时，感染12小时和24小时后，所检到的IGF-I浓度分别为39ng/ml和463ng/ml。被LacZ/SeV感染的上清液中未发现IGF-I。由此证明基因产物通过SeV介导的基因转移而分泌到培养上清中。
(3)已知L6细胞不表达IGF-I而表达IGF-I的受体，因此它对外源IGF-I具有应答性，从而诱发肥大(J.Cell.Biol.1996，135，431-448)。检查重组IGF-I诱导L6细胞分化的能力。用含20％FCS的培养基培养L6细胞，使其增殖，80％融合时，病毒介导而导入基因，再改用无血清培养基或含有一定浓度hIGF-I蛋白的无血清培养基培养。为抑制激素对细胞表面的吸附，所有样品中都加入500μg/ml的牛血清白蛋白。4天后，观察到当病毒的感染复数不同时，有明显的细胞形态学差异(图2)。将生成的肌管用抗胚亚单位的肌球蛋白H链(MyHC)抗体(MAbBF45)进行处理。用Alexa Flour(登记商标)568山羊抗小鼠IgG(H+L)偶联物观察已结合的抗体。用碘化丙锭染色来观察细胞核。感染复数为0.05(图2A和E)和0.2(图2B和F)时，在含hIGF-I的培养基中培养的细胞，与在不含hIGF-I的无血清培养基中培养的细胞(图2D和H)相比，其肌管较大，肌纤维中央有多个核，肌管肥大，即其肌管的大小和宽度增大(图2A、B、E和F)。并且，病毒感染诱导的形态学变化与IGF-I蛋白诱导的肌管形态学变化一致(图2C和G)。上述结果表明，来自SeV的重组hIGF-I的效力与IGF-I蛋白相同，重组hIGF-I在体外也具有生物学功能，能诱导新生大鼠成肌细胞L6细胞的肌生成。
[实施例3]LacZ报告基因的体内表达
腹腔注射(50mg/kg)戊巴比妥钠麻醉Sprague-Dawley大鼠(雄性，6周龄，体重160-180g)。剃除后肢毛发，用乙醇擦拭后，将皮肤切开1.5cm，暴露前胫骨肌。左前胫骨肌筋腹内给与200μl的LacZ/SeV(5×10e7pfu)，以进行LacZ报告基因导入实验。导入基因的表达通过X-gal染色进行观察。给与载体前3天，前胫骨肌给与200μl 0.5％的布帕卡因溶液。
结果表明，给与LacZ/SeV一周后，与未处理的肌肉(图3G和H)相比，用布帕卡因进行过预处理的肌肉组织显示高水平的X-gal染色(图3A和B)。布帕卡因预处理的肌肉中，在围绕坏死纤维、浸润的嗜中性粒细胞和巨噬细胞的小肌纤维中观察到一些X-gal阳性纤维(图3B)。成熟大鼠前胫骨肌的布帕卡因肌内注射和/或病毒注射诱导产生这种小纤维，且其被视为再生纤维。Vitadello等(Hum.Gene Ther.，1994，5，11-18)发现，布帕卡因处理的3天后肌肉有被抗MyHC单克隆抗体(BF-45)染色的单核细胞和小肌管，损伤后第3天与损伤1天或7天后相比，导入裸露DNA表达的酶活性更高。能通过SeV导入LacZ基因的阳性小纤维被视为在骨骼肌成熟过程中具有细胞分裂活性的肌纤维或未成熟的肌管。未经布帕卡因处理的动物中，病毒感染诱导的肌纤维坏死的范围远远小于用布帕卡因和病毒处理过的动物。阳性纤维的数量也比布帕卡因处理的肌纤维中的少，但未经布帕卡因处理的肌纤维中也发现有X-gal标识的肌纤维(图3H)。转导肌纤维周围的细胞没有中心核，其大小比图3B所示的再生肌纤维大。这意味着这些细胞可能是成熟肌纤维。综合考虑以上事实，转导的肌纤维可能为成熟肌纤维。因此，SeV能将编码蛋白质的基因转导入大鼠成熟肌纤维中。给与病毒2周后也观察到X-gal表达。布帕卡因处理/未处理的动物中，阳性纤维的表现与用上述试剂处理7天后的动物相同，但其数量减少(图3C、D、I和J)。病毒注射30天后，仅在布帕卡因处理动物中发现X-gal标识的纤维(图3E和F)。未经布帕卡因处理的动物中，没有在肌纤维中发现X-gal标识的纤维，但在间质细胞观察到有(图3K和L)。由上述结果可知，除进行细胞分裂的成肌细胞和细胞分裂后的未成熟肌管之外，SeV还能感染成熟肌管。
[实施例4]体内导入IGF-I基因
hIGF-I在体外的表达程度高。在体内，通过SeV介导的基因转移将LacZ基因导入再生肌纤维和成熟肌纤维中。确认这些后，再研究通过SeV介导的基因转移而导入大鼠骨骼肌的hIGF-I能否促进骨骼肌的生长，如肌纤维数增加、肌管肥大。首先，通过蛋白印迹测定hIGF-I在前胫骨肌中的表达程度。成熟Sprague-Dawley大鼠前胫骨肌给与尿囊液、含2×10e8pfu(比以前实验中的高4倍)hIGF-I/SeV的病毒溶剂和含2×10e8pfu LacZ/SeV的病毒溶剂各200μl。
给药1周、2周和3周后，用致死量的戊巴比妥钠使动物安乐死。切开前胫骨，以备组织染色和蛋白印迹使用。通过蛋白印迹分析大鼠肌肉内的人IGF-I。将100μg的肌肉组织在液氮中冷冻，再用乳钵和乳棒研碎。各组织中加入500ml 1M冰醋酸，混匀，然后在冰上放置2小时，3000×g离心15分钟，回收上清液。离心后的沉淀中加入1M新鲜醋酸进行再提取。合并两次所得的上清液，-70℃下冷冻，再冻干，混悬于300μl 50mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.8)中。将溶液从50μl浓缩至10μl，进行蛋白印迹。
对再生肌纤维进行免疫组织染色时，使用液氮环境下的异戊烷中迅速冷冻的前胫骨肌样品。将所得样品切成10μm厚的切片，固定在用赖氨酸覆盖的载玻片上。再生肌纤维的免疫组织染色方法如下：切片用小鼠抗胚肌球蛋白H链单克隆抗体(BF-45)进行第一抗体处理后，室温下，将切片与第二抗体生物素化抗小鼠IgG(1∶100；Vector，Burlingame，CA)一起温育1小时，然后再与链抗生物素蛋白-生物素复合物(以1∶200的比例稀释，Vector，Burlingame，CA)一起温育1小时，使之显色。用含0.05％3，3-二氨基联苯胺四氢氯化物和0.01％过氧化氢的0.05M Tris盐酸缓冲液(pH7.6)观察链抗生物素蛋白-生物素复合物，然后用伊红对切片进行复染。单克隆抗体BF-45由Dr.D.Schiaffino(Hum.Gene Ther.，1994，5，11-18)，Padova，意大利开发，购自American Type Culture Collection(Manassas，VA)。为评估hIGF-I引起的再生效应，在给药7天后检查抗BF-45免疫阳性纤维数。进一步地，为评价hIGF-I的肥大效应，在给药30天后统计肌肉的分裂纤维数。
结果表明，给药一周后，用IGF-I/SeV处理的前胫骨肌样品利用抗hIGF-I抗体显示出分子量约为8～9kDa的带。该值(图4，泳道4和5)与在培养上清中所观察到的不一致(图1A)。体外实验中所观察到的hIGF-I前体物与体内实验中的不一样，因为它通过蛋白酶消化，变成成熟型hIGF-I(Bio Science，细胞因子增殖因子，羊土社pp.104-105)，报告其分子量为7.7kDa。
接下来研究了hIGF-I在正常成熟肌肉中的效果。成熟大鼠(6周龄)的左前胫骨肌给与hIGF-I/SeV(2×10e8 pfu)，右前胫骨肌给与LacZ/SeV(2×10e8pfu)，作为第1组；仅在左前胫骨肌给与hIGF-I/SeV(2×10e8 pfu)(n＝12)的作为第2组；仅在左前胫骨肌给与LacZ/SeV(2×10e8 pfu)(n＝12)的作为第3组；两前胫骨肌给与尿囊液的(n＝3)作为第4组。
第1组中，给与IGF/SeV和LacZ/SeV两种病毒7天后，给药部位的剩余切片的肌纤维中发现，大量坏死导致纤维分解，肌束膜浮肿，细胞外有许多单核吞噬性巨噬细胞、淋巴细胞和数个嗜中性粒细胞的浸润(图5d和g)。坏死区域内残存的大小正常的肌纤维被大量酸性磷酸酶阳性巨噬细胞侵袭(图5c和h)。但是，仅给与尿囊液的肌肉中未观察到损伤，发现极少量的巨噬细胞(图5a和b)。综合以上考虑，SeV的导入引起被感染的肌肉损伤，诱导其坏死，从而引起巨噬细胞和淋巴细胞等浸润，这能去除坏死肌肉。但是，如果坏死组织残存，则会妨碍再生，因此吞噬作用对肌肉再生极其重要。已知吞噬后肌前体细胞或卫星细胞活化，随后成肌细胞开始增殖(实验医学，羊土社，2000，3，444-448)。进一步地，有报告(Hum.Gene Ther.，1994，5，11-18)指出，布帕卡因处理3天后，再生肌纤维由抗MyHC单克隆抗体(BF-45)阳性的单核细胞和小肌管组成，这些细胞可指示再生肌纤维。浸润的巨噬细胞群中散布很小的肌纤维，该肌纤维具有中心核，研究这些细胞对BF-45的免疫反应。与给与LacZ/SeV的右前胫骨肌相比(图5i)，给与hIGF-I/SeV的左前胫骨肌中观察到大量BF-45阳性再生肌纤维(图5f)。如图6所示，第1组的动物中，BF-45免疫阳性纤维数量的平均值分别为：LacZ/SeV(右)为446(n＝4)，IGF-I(左)为1,722(n＝4)。用尿囊液处理的动物中不存在BF-45免疫阳性肌纤维(第4组，图5c)。
给与病毒载体14天后，用hIGF-I/SeV和LacZ/SeV处理的肌肉中，巨噬细胞的数量急剧减少(图7)(第1、2、3组)。用LacZ/SeV处理的肌肉中大小相同的中等程度的肌纤维(具有中心核)增加(图7C)。用IGF-I/SeV处理的肌肉中有巨噬细胞散布，还有极少量的坏死纤维残留(数据未显示)，且观察到各种大小的肌纤维包括小纤维(图7B)，这表明有连续的新生纤维形成。hIGF-I/SeV处理的肌肉和LacZ/SeV处理的肌肉中，都未观察到成纤维细胞浸润及由此引起的纤维化现象。病毒导入7天后发现，以巨噬细胞为主的间质细胞所占据的空间几乎完全被再生肌纤维所取代(图7B和C)。
给与病毒载体30天后，第1组动物中，经处理的肌肉的大小基本恢复正常且均匀(图8和9)，hIGF-I/SeV处理的肌肉中，中等大小的肌纤维束分散在正常大小的肌纤维中(数据未显示)，与LacZ/SeV处理的肌肉相比，hIGF-I/SeV处理的肌肉的肌纤维总数增加17％(p＜0.03，n＝4)(图9)。第3组和第4组中，左右肌肉的肌纤维数无明显统计学差异(数据未显示)，且发现肥大常常导致的分裂纤维的数量增加。第1组动物中，hIGF-I/SeV处理的肌肉的分裂纤维数量平均值为LacZ/SeV处理的肌肉的6.1倍(图9)。上述数据表明，该分裂现象可能引起经hIGF-I/SeV处理的肌肉中肌纤维总数的增加。
有数个报告指出IGF-I对成熟骨骼肌的效果，Adans和McCue(J.Appl.Physiol.，1998，84(5)，1716-1722)研究了给正常大鼠前胫骨肌局部注射IGF-I蛋白的效果，发现注入IGF-I的肌肉中，肌肉重量、总蛋白和总DNA明显增加。但没有报告肌纤维总数的增加。Barton-Davis等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，15603-15607)用AAV载体将IGF-I基因导入高龄大鼠，发现纤维再生和肌肉肥大，但再生肌纤维数不增加。本发明人在研究中发现，hIGF-I的过度表达导致正常成熟肌肉的再生纤维、肌肥大纤维和肌纤维总数明显增加。一般认为所观察到的新生肌纤维的形成是由通过SeV实现的IGF-I的高水平表达引起。
[实施例5]纯化的LacZ-SeV/dF和LacZ-SeV在小鼠腿部肌肉中基因表 达的比较
用BALB/c小鼠比较研究腿部肌肉给药中的基因表达，腿部肌内注射受孕鸡卵尿囊液来源的添加型仙台病毒载体(LacZ-SeV)和纯化的LLC/MK2/F/Ad细胞来源的F缺陷型LacZ仙台病毒载体(LacZ-SeV/dF)。给药量为4×107CIU/只小鼠。
实验采用18只BALB/c雄性小鼠(日本チヤ-ルス·リバ株式会社)。小鼠在6周龄时入组，驯化饲养2天，分3组，每组6只，分别为：(1)未处理组，(2)LacZ-SeV(4×107CIU/只)处理组，(3)LacZ-SeV/dF(4×107CIU/只小鼠)处理组。用乙醚麻醉小鼠，固定腿部，在每只小鼠前胫骨肌两侧用29G的注射器以2×108CIU/ml的量注射每一注射点100μl。给药后将肌肉搓揉约一分钟。
给药3天后，将小鼠用乙醚麻醉，解剖，取给药(右)侧的腿部肌肉用于LacZ检测。
LacZ的定量方法如下：取腿部肌肉(2.0ml小试管)，用液氮冷冻。加入500μl裂解液(约500mg肌肉)冰冷却下匀浆(MultiPro)。离心分离(15000rpm×15分钟)，取10μl上清液置于测定管中。然后加入70μl反应缓冲液A(Galacton-Plus 1μl+反应缓冲液99μl＝100μl试剂盒；Galacto-Light-Plus，TROPIX，#250065)，室温下避光放置30～60分钟。加入100μl加速剂，用发光仪测定。
比较给药3天后腿部肌肉中的基因表达(定量)，结果表明，LacZ-SeV/dF和LacZ-SeV处理组的基因表达程度明显比未处理组高(图10)。LacZ-SeV/dF处理组和LacZ-SeV处理组的结果稍有差别，但表达程度大致相同。一般认为这是由于肌肉内二次感染的影响较小。肌肉疾病的基因治疗中，预计使用F缺陷型和添加型病毒具有同等效果，因为它们在基因表达上不存在差异。
工业实用性
本发明利用副粘病毒载体能高效地将外源基因导入骨骼肌。因此本发明提供了一种靶向骨骼肌基因治疗，特别是用于治疗全身性疾病和神经肌障碍的靶向骨骼肌基因治疗的基本技术。另外，利用本发明的副粘病毒载体将编码胰岛素样生长因子的基因导入骨骼肌中，预计此技术可用于治疗肌纤维萎缩、减少和变性。由此可能强化神经肌障碍的现有疗法。
                 序列表
<110>株式会社载体研究所(DNAVEC Research Inc.)
<120>用于将外源基因导入骨骼肌的副粘病毒载体
<130>D3-A0007P
<140>
<141>
<150>JP 2000-308533
<151>2000-10-06
<160>4
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列
<400>1
atccgaattc gcaatgggaa aaatcagcag tc                                32
<210>2
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列
<400>2
atccgaattc ctacatcctg tagttcttgt ttcctgc                           37
<210>3
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列
<400>3
atccgcggcc gccaaagttc agcaatggga aaaatcagca gtcttc                46
<210>4
<211>73
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列.
<400>4
atccgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggctac atcctgtagt        60
tcttgtttcc tgc                                                 73

Claims (14)

1.一种将外源基因导入骨骼肌的方法，该方法包括将插入外源基因的副粘病毒载体给予骨骼肌。
2.权利要求1的方法，其中所述副粘病毒为仙台病毒。
3.权利要求1或2的方法，其中所述外源基因为治疗基因。
4.权利要求1或2的方法，其中所述外源基因为编码胰岛素样生长因子的基因。
5.一种副粘病毒载体，该载体插有外源基因，用于将外源基因导入骨骼肌。
6.权利要求5的载体，其中所述副粘病毒为仙台病毒。
7.权利要求5或6的载体，其中所述外源基因为治疗基因。
8.权利要求5或6的载体，其中所述外源基因为编码胰岛素样生长因子的基因。
9.一种将外源基因导入骨骼肌的组合物，该组合物含有插入外源基因的副粘病毒载体。
10.权利要求9的组合物，其中所述副粘病毒为仙台病毒。
11.权利要求9或10的组合物，其中所述外源基因为治疗基因。
12.权利要求9或10的组合物，其中所述外源基因为编码胰岛素样生长因子的基因。
13.权利要求12的组合物，该组合物用于增加哺乳动物的再生肌纤维和/或分裂肌纤维。
14.权利要求12的组合物，该组合物用于神经肌障碍的治疗。
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