JP4212357B2 - 血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターおよびその利用 - Google Patents
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Description
本発明は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターおよびその利用に関する。
背景技術
近年、血管新生を誘導する増殖因子を用いた虚血疾患の治療に関する研究が進められている。例えば、心筋梗塞や急性虚血肢に対して、線維芽細胞増殖因子2(FGF2)(Baffour,R.et al.,J.Vasc.Surg.16(2):181−91,1992)や内皮細胞増殖因子(endothelial cell growth factor;ECGF)(Pu,L.Q.et al.,J.Surg.Res.54(6):575−83,1993)の投与による治療効果が調べられている。より最近では、血管内皮増殖因子/血管透過性因子(vascular endothelial growth factor;VEGF/vascular permeability factor;VPF)が、心筋虚血および肢虚血の動物モデルにおいて、血管形成を促進することが示されている(Takeshita,S.et al.,Circulation 90(5 Pt 2):II228−34,1994;Takeshita,S.et al.,J.Clin.Invest.93(2):662−70,1994)。
また、最近、血管新生を誘導する増殖因子を用いたヒト遺伝子治療の臨床試験が開始され、これを重症の虚血肢の血管新生治療に対して臨床応用する研究も進められている。内皮細胞特異的な増殖因子である血管内皮増殖因子/血管透過性因子(VEGF/VPF)はこの目的にかなう治療遺伝子と見なされており、実際、プラスミドベクターを用いたヒトへの遺伝子導入において比較的良好な治療効果が報告されている(Baumgartner,I.,et al.,Circulation 97,1114−1123(1998);Isner,J.M.,et al.,J.Vasc.Surg.28,964−973(1998))。しかしながら、プラスミドを用いた筋肉への遺伝子導入および発現効率はさほど高くなく、VEGFの筋中遺伝子投与の有害な副作用や毒性レベルについては、現在のところほとんど報告がない。最近の報告によれば、トランスジェニック(Thurston,G.,et al.,Science 286,2511−2514(1999))またはアデノウイルス(Thurston,G.,et al.,Nature Med.6,460−463(2000))によるVEGFの過剰発現が、遺伝子を導入された動物において異常な血管形成を起すこと、さらにプラスミドによる筋中へのVEGF遺伝子導入が、ヒトの虚血肢において一過的な浮腫を起すことが示されているが(Baumgartner,I.,et al.,Circulation 97,1114−1123(1998);Isner,J.M.,et al.,J.Vasc.Surg.28,964−973(1998))、これらの詳細な機構は不明である。また、VEGFの過剰発現は血管新生シグナルのバランスを崩し、血管腫様の脆弱毛細管を形成する可能性が考えられる(Carmeliet,P.,Nature Med.6,1102−1103(2000))。また、VEGFをin vivoで血管壁へ遺伝子導入した場合、血管腫様の内皮増殖により新生内膜の顕著な肥厚をもたらし、赤血球の血管外遊出(extravasation)を引き起こし得る(Yonemitsu,Y.,et al.,Lab.Invest.75,313−323(1996))。またレトロウイルスを用いて心筋に恒常的にVEGFを過剰発現させた場合でも同様の病理所見が観察されている(Lee,R.J.,et al.,Circulation 102,898−901(2000))。また特に臨床適用を考えた場合、局所的に発現させたこれらの血管新生因子が全身の循環系に漏れ出すレベルは極めて重要な問題であり、予想外の血管新生の合併症による糖尿病性網膜症や腫瘍増殖が懸念される。
一方、主幹動脈が急性に閉塞することにより発症する急性重症虚血肢は主に血栓性閉塞に起因し、血管新生治療の対象となる重要な虚血疾患の一つである。急性重症虚血肢の後期治療の成績は極めて不良であり、多くの場合肢切断に至る。さらに肢切断に至った患者の生命予後も不良であり、1年生存率は50%と低い。プラスミドによる遺伝子発現レベルは低く、このようなより重篤な急性動脈閉塞などに対する有効性は未だ不明である。
発明の開示
本発明は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターおよびその用途を提供することを課題とする。より詳しくは、本発明は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクター、該ベクターを含む血管新生組成物、および該ベクターを利用して虚血組織の血管新生を促進する方法を提供する。
本発明者らの予備的な研究によれば、急性重症虚血肢のマウスモデルにおいて、プラスミドをベースにしたVEGF165の遺伝子導入では救肢に成功しなかった(データ省略)。導入遺伝子をより強く発現させることにより、より良好な結果が得られるかを確かめるため、本発明者らは、様々な器官で高い効率で遺伝子を導入できることが示唆されている組み換えセンダイウイルス(SeV)を介した遺伝子導入により治療遺伝子を導入する研究を行った。実施例において本発明者らは、虚血肢治療のためのツールとして2つの組み換えSeVベクター、すなわちヒトVEGF165を発現するSeVベクター、および、蛋白質として投与した時に血管新生作用を示す増殖因子であることが知られているFGF2(bFGFとも言う)(Baffour,R.et al.,J.Vase.Surg.16:181−191(1992))に着目し、マウスFGF−2を発現するSeVベクターを構築して用いた。これらのベクターを用いて、(1)SeVを介した筋中遺伝子導入における導入遺伝子の発現レベルとカイネティクス、(2)血管新生因子の高発現が急性重症虚血肢の肢壊死を防げるか、若しくは逆に有害に作用するか、そして(3)筋中において高発現させた血管新生蛋白質が全身の循環系へ漏れ出すか否かについて実験を行った。
虚血モデルには、外腸骨動静脈から膝上大腿動静脈まで全てを抜去(重症虚血モデル)して得られるBALB/c nu/nuマウス下肢脱落モデル(auto−amputationモデル)、同操作後の生理的血管新生により下肢脱落に至らないC57BL/6マウス救肢モデル(limb salvageモデル)を用いた。ヒトVEGF165、マウスFGF2、またはルシフェラーゼを発現するベクター(それぞれSeV−hVEGF165、SeV−mFGF2、またはSeV−luciferase)を構築し、虚血手術2日前に大腿筋、下腿筋に投与し、手術後10日まで下肢の状態を観察した。
ルシフェラーゼ遺伝子を用いたマウス下肢骨格筋への遺伝子導入では、100μgのプラスミド投与での発現レベル(ヒト60kgに対し200mg:臨床使用量の25〜50倍に相当)に比較して、SeVでは5〜120倍高い遺伝子発現が得られた。種々の培養細胞では、SeV−hVEGF165、SeV−mFGF2ともに50〜500ng/105cells/24 hoursと高い蛋白の分泌を認めた。SeV−mFGF2の筋肉内投与は、非投与対照(ベースライン)に比べFGF2レベルを5〜100倍に上昇させたのに対して、SeV−hVEGF165の投与では筋肉において限られた発現しか示さず(最大でもベースラインの2倍)、内因性VEGFの発現を顕著に増加させた。SeV−hVEGF165の投与においては、ベクター投与を受けた筋肉組織が投与後2日目には広汎な壊死に陥り、後肢の脱落を促進する結果となった。一方、SeV−mFGF2投与では内因性VEGFの発現を伴い、救肢において有意な治療効果が得られた。双方で血清中に有意なベクター由来蛋白の流出を認めなかった(<5pg/ml)。救肢モデルでは手術のみ、SeV−luciferase群、およびSeV−mFGF2群において全て救肢されたが、SeV−hVEGF群だけは1/3以上の個体の下肢が脱落した。下肢脱落モデルではFGF2群でのみ高い救肢効果が得られ、他の群ではほとんどの下肢が脱落した。
本発明において、組み換えセンダイウイルスベクターの筋中投与が、導入遺伝子の発現を顕著に増強させることが実証された。組み換えセンダイウイルスベクターはプラスミドベクターに比べ10〜100倍以上高い発現を示したが、VEGF165を発現する組み換えセンダイウイルスベクターのin vivo投与においては、マウスの急性重症虚血肢における肢脱落をかえって増悪化させることが明らかとなった。SeV−hVEGF165の投与は浮腫を誘起させ(実施例4、図8)、虚血手術後の血流の回復を妨げた(実施例5、図11および12)。そして、虚血による肢脱落の比率を有意に増悪化させた(実施例5、図9および10)。これはVEGFの強い血管透過性亢進作用が一因であると考えられる。これに対し、FGF2を発現するセンダイウイルスベクターの投与は一定して高い治療効果を示した。どちらのモデルにおいても、全身の循環系に分泌された組み換え蛋白質は検出されないことから、他臓器への影響が少なく安全域が高いことが示唆された。これらの結果は、ヒトへの臨床適用において、特定の肢状態におけるVEGFの望ましくない効果に注意を払う必要があることを示している。そして、より広いレンジで安全性と治療効果を示すFGF2の遺伝子治療が、安全な遺伝子治療系と成り得ることが示された。また本発明は、in vivoにおける治療遺伝子の導入における強力なツールであるSeVベクターの有効性を実証すると共に、急性重症虚血肢に対する臨床治療における利用を可能とする。
即ち、本発明は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターおよびその利用に関し、より具体的には、
(1)血管新生遺伝子を発現可能にコードするパラミクソウイルスベクター、
(2)血管新生遺伝子が線維芽細胞増殖因子2(FGF2)である、(1)に記載のパラミクソウイルスベクター、
(3)パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、(1)に記載のパラミクソウイルスベクター、
(4)F遺伝子を欠損している、(1)に記載のパラミクソウイルスベクター、
(5)(1)に記載のパラミクソウイルスベクターまたは該ベクターを含む細胞、並びに薬学的に許容できる担体を含む、血管新生組成物、
(6)虚血組織を処置するための、(5)に記載の組成物、
(7)筋中投与用である、(5)に記載の組成物、
(8)(5)から(7)のいずれかに記載の血管新生組成物を投与する工程を含む、血管新生を誘導する方法、に関する。
本発明により、(1)肢虚血が誘導する内因性VEGFは筋中に局在するよりむしろ全身循環系に拡散するのに対し、本発明のベクターを介したVEGF165の発現は全身循環系には有意に漏出しない、(2)内因性FGF2の発現に比べ5〜100倍高いレベルで外来性FGF2を発現させても全身循環系への有意な拡散は見られない、(3)FGF2のこのレベルの発現は内因性VEGFの発現を誘導し、肢の血流を顕著に増加させ有意な救肢効果を示す、そして(4)VEGF165の過剰発現はFGF2とは対照的に肢破壊を誘導する、ことが示された。これらの知見は、特にFGF2は臨床応用に適しており、急性重症肢虚血の処置における治療血管新生因子として広い安全域を持っていることを示唆している。また本発明は、肢虚血に対するVEGF165の遺伝子導入が深刻な有害効果をもたらし得ることを初めて明示するものである。
興味深いことに、肢虚血により誘導される内因性VEGFは筋中に濃縮されるのではなく、全身循環系に拡散した。虚血手術が筋肉および内皮細胞(EC)において内因性VEGFの発現を誘導することは知られていたが(Florkiewicz,R.Z.et al.,J.Cell.Physiol.162,388−399(1995))、本発明は、内因性VEGFが、局所的な血管新生ではなく全身的な血管新生反応を誘導する可能性を示す初めての実験データを開示する。AsaharaらはVEGFの全身投与は内皮前駆細胞(endothelial progenitor cells;EPCs)の移動性を上昇させることを示しており(Asahara,T,et al,EMBO J.18,3964−3972(1999))、肢虚血に対する生理的反応による側肢血管(collateral vessels)の形成は、既存の血管から放出される増殖性ECによる局所的血管新生(Isner J.M.,J.Clin.Invest.106,615−619(2000))よりも、EPCを介した「血管新生様」の新血管形成(”vasculogenesis−like” neovascularization)に、ある程度依存している可能性がある。虚血肢への遺伝子導入によるVEGFの誘導は有意な血流をもたらさず、肢脱落を起すことが判明したが、この場合、VEGFは「血管新生因子」ではなく、主に「血管透過因子」として作用しているのかも知れない。これは、筋肉の組織学的観察によりVEGF165群でより重篤な筋肉間浮腫が見られたことによっても支持される。
第二に、本発明によりFGF2の遺伝子治療はそれ自身のみで虚血肢の処置において効果を有しており、またin vivoにおける内因性VEGFの機能も関与していることが示された。FGF2の遺伝子導入による筋中のVEGFのトータルな蛋白質濃度はVEGF遺伝子導入における場合と同等であるが、FGF2遺伝子治療自体は、VEGF遺伝子治療とは異なり十分な効果を示した。これらの知見は、虚血肢の治療に必要な血液を灌流させ、しかも血管漏出を起さないような成熟血管が形成されるには、VEGFだけでなくFGF2も必要であることを示唆している。VEGFにより誘導される未成熟血管の血管漏出を抑制する作用を持つ血管新生因子であるangiopoietin−1がこれに貢献している可能性も考えられる。
SeV−VEGF165は、in vitroにおいてSeV−FGF2と同様のレベルで遺伝子産物を分泌させることが示されていることから、in vivoの筋中において、注入されたSeV−VEGF165が、なぜSeV−FGF2やSeV−luciferaseと同じような発現を示さないのかは完全には明らかではない。組織学的な解析と同様、レーザードップラー灌流像(LDPI)解析でも筋組織の強い破壊と血液の灌流の低下が示されたことから、VEGF165が誘導する浮腫などの組織破壊の結果として、例えばチューブリン(Moyer,S.A.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83,5405−5409(1986))やホスホグリセレートキナーゼ(Ogino,T.,et al.,J.Biol.Chem.274,35999−36008(1999))などのSeVが媒介する転写の細胞内機構が障害される可能性が考えられる。あるいは、比較的低いレベルの内因性VEGF165遺伝子の発現(約200pg/g muscle)が重症虚血筋では顕著に増加(1,400pg/g muscle)するために、肢脱落が促進される可能性も考えられる。これらの結果は、筋中のVEGF濃度の増加は、例えベースラインの2倍程度の低レベルであるとしても、重症の肢虚血をもたらす可能性を強く示唆している。
血管新生はよく調和された過程であり、多数の因子が関与していると考えられている。これらの因子の中でもVEGFの生物学的機能は、その用量に高度に依存しており、アレルが1つ欠失しただけでも致命的な欠損をもたらす(Carmeliet,P.et al.,Nature 380,435−439(1996))。血管の統合および成熟の全過程においてVEGFの持続的な発現が必要であり、一過的なVEGFの発現は短時間の血管新生反応しか誘導せず(Pettersson,A.et al.,Lab.Invest.80,99−115(2000))、さらにVEGFが誘導する毛細管様構造は既存の血管とはほとんど連結しない(Springer,M.L.,et al.,Mol.Cell 2,549−558(1998))。従って、本発明の結果からは、十分なFGF2が存在しない場合に、筋中のVEGF濃度が2倍を上回ると、非常に有毒となる可能性が示唆される。これらを考え合わせると、治療的血管新生においてVEGFは臨床的に非常に高い可能性を持つことに変りはないが、VEGFの使用には、従来以上に注意を払うべきであることが示唆される。そして急性重症肢虚血の救肢における筋肉内へのFGF2遺伝子の導入は、安全で顕著な治療的効果を発揮することが実証された。
本発明において「パラミクソウイルスベクター」とは、パラミクソウイルスに由来し遺伝子を宿主細胞に導入するベクター(担体)を指す。本発明のパラミクソウイルスベクターはリボ核タンパク質(RNP)であってもよく、また、感染力を持つウイルス粒子であってもよい。ここで「感染力」とは、組み換えパラミクソウイルスベクターが細胞への接着能および膜融合能を保持していることにより、接着した細胞の内部にベクター内部の遺伝子を導入することのできる能力を言う。本発明のパラミクソウイルスベクターは、複製能を有していてもよく、複製能を有さない欠損型ベクターであってもよい。「複製能を有する」とは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。複製能は、例えばサル腎臓由来細胞株LLC−MK2またはCV−1などを用いて調べることができる。
本明細書において、「組み換え」パラミクソウイルスベクターとは、遺伝子操作により構築されたパラミクソウイルスベクターまたはそれを増幅して得られるパラミクソウイルスベクターを言う。組み換えパラミクソウイルスベクターは、例えば、組み換えパラミクソウイルスcDNAを再構成して生成することができる。
本発明においてパラミクソウイルスとはパラミクソウイルス科に属するウイルスまたはその誘導体を指す。本発明を適用可能なパラミクソウイルスとしては、例えばパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)のセンダイウイルス(Sendai virus)、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)、おたふくかぜウイルス(Mumps virus)、麻疹ウイルス(Measles virus)、RSウイルス(Respiratory syncytial virus)、牛疫ウイルス(rinderpest virus)、ジステンパーウイルス(distemper virus)、サルパラインフルエンザウイルス(SV5)、ヒトパラインフルエンザウイルス1,2,3型等が挙げられる。本発明のウイルスは、好ましくはパラミクソウイルス属(Paramyxovirus)に属するウイルスまたはその誘導体である。本発明を適用可能なパラミクソウイルス属ウイルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス1型(HPIV−1)、ヒトパラインフルエンザウイルス3型(HPIV−3)、ウシパラインフルエンザウイルス3型(BPIV−3)、センダイウイルス(Sendai virus;マウスパラインフルエンザウイルス1型とも呼ばれる)、およびサルパラインフルエンザウイルス10型(SPIV−10)、並びにその他の多くのパラミクソウイルス属ウイルスが含まれる。本発明のパラミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウイルスである。これらのウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などであり得る。DI粒子(J.Virol.68,8413−8417(1994))等の不完全ウイルスや、合成したオリゴヌクレオチド等も、本発明のウイルスベクターを製造するための材料として使用することができる。
パラミクソウイルスのウイルスタンパク質をコードする遺伝子としては、NP、P、M、F、HN、およびL遺伝子が含まれる。「NP、P、M、F、HN、およびL遺伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のことを指す。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、NP遺伝子は「N遺伝子」と表記されることもある。
パラミクソウイルス属 NP P/C/V M F HN − L
ルブラウイルス属 NP P/V M F HN(SH)L
モービリウイルス属 NP P/C/V M F H − L
例えばパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)のレスピロウイルス(Respirovirus)に分類されるセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、NP遺伝子についてはM29343、M30202,M30203,M30204,M51331,M55565,M69046,X17218、P遺伝子についてはM30202,M30203,M30204,M55565,M69046,X00583,X17007,X17008、M遺伝子についてはD11446,K02742,M30202,M30203,M30204,M69046,U31956,X00584,X53056、F遺伝子についてはD00152,D11446,D17334,D17335,M30202,M30203,M30204,M69046,X00152,X02131、HN遺伝子についてはD26475,M12397,M30202,M30203,M30204,M69046,X00586,X02808,X56131、L遺伝子についてはD00053,M30202,M30203,M30204,M69040,X00587,X58886を参照のこと。
本発明において「遺伝子」とは遺伝物質を指し、RNAおよびDNA等の核酸が含まれる。一般に、遺伝子は蛋白質をコードしてもよく、また蛋白質をコードしていなくてもよい。遺伝子はリボザイムまたはアンチセンスRNAなどの機能的RNAをコードするものであってもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「DNA」とは、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAを含む。
本発明は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターおよびその用途を提供する。本発明者等は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターをin vivoで筋中に投与することにより、投与部位において導入遺伝子を高発現させることができることを実証した。本発明者等によるマウス虚血後肢の救肢実験では、血管新生遺伝子(FGF2)をコードする組み換えパラミクソウイルスベクターの投与により、虚血組織の壊死が防止され、後肢の脱落を予防できることが示された。これらのベクターは虚血組織において効果的に血管新生を誘導し壊死を防止するために有用であり、本発明のベクターは虚血疾患に対する遺伝子治療に好適に用いられ得る。
また、本発明者等により、組み換えパラミクソウイルスベクターを利用して筋中に投与された遺伝子が、1〜2週間にわたり持続的に発現することが示された。このことは、組み換えパラミクソウイルスベクターを利用して血管新生因子の遺伝子治療を行った場合に、持続的な治療効果を得ることができるという利点をもたらす。さらに、筋中投与された組み換えパラミクソウイルスベクターから発現された血管新生因子は、全身の循環系では検出されず、対象組織以外での望ましくない副作用を惹起しない点でも有用であることが示された。このようにパラミクソウイルスベクターが血管新生遺伝子の導入において様々な利点を有するという本発明により得られた知見は、特に、虚血組織を標的とした遺伝子治療などにおいて大きな進歩をもたらす可能性を示している。
また、安全性の面においても、ヒトへの病原性が否定されているため、パラミクソウイルスベクターはヒトへの遺伝子治療の臨床試験に好適に用いられうることが示唆される。第一に、プラスミドDNA等による外来遺伝子の発現は、多くの場合、導入したDNAの核局在化または核膜の消失が必要であることが、遺伝子発現の成功率を低下させる主要な障害になっている。しかし、例えばセンダイウイルスなどの場合、外来遺伝子の発現は、細胞質内において細胞性チューブリンおよび自身が持つRNAポリメラーゼ(L蛋白質)の両方によってウイルスの複製に伴って駆動される。これは、センダイウイルスが宿主の染色体と相互作用しないことを示しており、染色体異常による細胞の癌化および不死化などの安全面における問題が生じないと考えられる。第二に、センダイウイルスは齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られているが、人に対しては病原性がない。これはまた、野生型センダイウイルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている(Hurwitz,J.L.et al.,Vaccine 15:533−540,1997)。センダイウイルスのこれらの特徴は、センダイウイルスベクターが、ヒトの治療へ応用しうることを示唆し、センダイウイルスベクターが、血管新生遺伝子の遺伝子治療における有望な選択肢の一つとなることを支持するものである。
本発明において血管新生遺伝子とは、血管新生(angiogenesis)および/または血管形成(vasculogenesis)を直接または間接に促進する活性を有する因子をコードする遺伝子を指す。該因子は蛋白質またはペプチドであってもよく、また機能的RNA(リボザイムやアンチセンスRNA)などの核酸であってもよい。血管新生蛋白質としては、例えば、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic fibroblast growth factor;aFGF)、線維芽細胞増殖因子2(fibroblast growth factor 2;FGF2)(塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)とも言われる)、血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor;VEGF)、アンギオポイエチン(angiopoietins;Ang)(Ang−1およびAng−2を含む)、上皮増殖因子(epideramal growth factor;EGF)、トランスフォーミング増殖因子α(transforming growth factor−α;TGF−α)、TGF−β、血小板由来内皮増殖因子(platelet−derived endothelial cell growth factor;PD−ECGF)、血小板由来増殖因子(platelet−derived growth factor;PDGF)、腫瘍壊死因子α(tumor necrosis factor−α;TNF−α)、肝細胞増殖因子(hepatocyte growth factor;HGF)、インスリン様増殖因子(insulin−like growth factor;IGF)、エリスロポイエチン(erythropoietin;EPO)、コロニー刺激因子(colony−stimulating factor;CSF)、マクロファージ−CSF(macrophage colony−stimulating factor;M−CSF)、顆粒球/マクロファージCSF(granulocyte−macrophage colony−stimulating factor;GM−CSF)、インターロイキン(interleukin;IL)−8、および一酸化窒素合成酵素(nitric oxide synthase;NOS)が挙げられる(Klagsbrun,M.and D’Amore,P.,A.Annu.Rev.Physiol.53:217−39,1991;Folkman,J.and Shing,Y.,J.Biol.Chem.267(16):10931−4,1992;Symes,J.F.and Sniderman,A.D.,Curr.Opin.Lipidol.5(4):305−12,1994)。
本発明において好ましい血管新生蛋白質としては、例えば、aFGF、FGF2、Ang−1、Ang−2、EGF、TGF−α、TGF−β、PD−ECGF、PDGF、TNF−α、HGF、IGF、EPO、CSF、M−CSF、GM−CSF、IL−8、およびNOSなどが例示でき、これらから選択される蛋白質をコードする遺伝子を用いてベクターを作製することができる。
本発明に用いる血管新生蛋白質の中で特に好ましい蛋白質は、VEGFにより誘導される未熟な血管新生ではなく、新生した内皮細胞に間葉系細胞が接着し、壁細胞に分化して血管を取り囲む作用を有する蛋白質である。血管形成は3つのプロセス(脈管形成、血管新生、血管成熟)からなることが知られ、成熟した血管形成は種々の転写因子ノックアウト実験から複数の遺伝子の関与が知られている。特に転写因子SCL/tal−1は主として脈管形成に関与し、HIF−1、Id、ETS−1、HOXD3
actor)またはdHAND遺伝子をノックアウトすると壁細胞が発達できず胎生致死となることが知られている。
従って本発明に用いる血管新生遺伝子としては、LKLFおよびdHANDを含む、間葉系の未成熟な細胞において壁細胞の成熟に関与するところの転写因子を誘導する遺伝子であることがより好ましい。FGF2の刺激は、これらの転写因子の誘導に直接関与しているか、他の増殖因子であるアンギオポイエチンおよびHGF等を通じて間葉系の細胞の増殖分化を促していると考えられる。
血管新生蛋白質は、好ましくは、該蛋白質を分泌させる分泌シグナル配列を含む。但し、FGF2などは天然の典型的な分泌シグナルを持たなくても細胞外に分泌される(実施例参照)。このような蛋白質は、必ずしも分泌シグナルを持つ必要はない。これらの血管新生因子をコードする遺伝子は、例えば塩基配列情報を基にして設計したプライマーを用いたPCRなどの公知の方法により調製することができる。本発明において用いられる特に好ましい血管新生因子としては、広範囲の発現レベルにおいて安定した治療効果を発揮するFGF2が例示できる(Abraham,J.A.et al.,1986,EMBO J.5:2523−2528;Moscatelli,D.A,et al.,US4994559;Baird,A.et al.,US5155214;Isner,J.M,US6121246;WO97/14307)。
ベクターの搭載する血管新生遺伝子は、遺伝子導入の標的個体と同じ種に由来する遺伝子でなくとも効果を期待できるが、標的個体と同一種の遺伝子が好ましい。ベクターの搭載する血管新生遺伝子は、好ましくは哺乳動物の血管新生遺伝子であり、ヒトへの適用のためにはヒト遺伝子であることが好ましい。
本発明の血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターは、特に虚血組織の処置に有用である。すなわち、本発明のベクターを用いた血管新生遺伝子の遺伝子導入により、血管新生を促進し、虚血による壊死を防止することができる。本発明において虚血組織としては、虚血を起した組織および虚血を起しつつある組織であれは特に制限はない。このような組織には、例えば、筋肉、脳、腎臓、および肺が含まれる。本発明のベクター投与の対象となる虚血疾患には、例えば脳血管虚血、腎虚血、肺虚血、四肢の虚血、虚血性心筋症、および心筋虚血が挙げられる。本発明において、虚血組織の処置とは、虚血組織の治療または虚血障害の予防を指し、具体的には虚血組織の壊死の防止、虚血組織の生存、虚血組織における血管の新生の促進、組織再生、または虚血に起因する障害の防止・低減等を意味する。
本発明は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターを投与する工程を含む、血管新生を誘導する方法を提供する。また本発明は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターを投与することを特徴とする、虚血組織を処置する方法を提供する。投与対象となる個体に特に制限はなく、例えばヒトを含む所望の哺乳動物が挙げられる。また投与対象として、特に非ヒト哺乳動物が挙げられ、具体的には、例えばサル等を含む霊長類(原猿、真猿の広鼻猿、および狭鼻猿の類人猿などを含む)、マウス、ラット、モルモットを含むげっ歯類、およびウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウサギ等が含まれる。本発明のベクターを用いれば、これらの動物に対する虚血治療が可能であり、あるいはヒト虚血治療のモデルとして利用することもできる(Morinaga,K.et al.,1987,J.Vasc.Surg.5:719−730;Itoh,H.et al.,1994,Atherosclerosis 110:259−270)。
本発明の血管新生を誘導する方法は、具体的には以下を含む。〔1〕血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターまたは該ベクターを含む細胞を投与する工程を含む、血管新性を誘導する方法、〔2〕血管新生遺伝子が線維芽細胞増殖因子2(FGF2)である、〔1〕に記載の方法、〔3〕投与が筋中投与である、〔1〕または〔2〕に記載の方法、〔4〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔1〕から〔3〕のいずれかに記載の方法。また本発明の虚血組織を処置する方法は、具体的には以下を含む。〔1〕血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターまたは該ベクターを含む細胞を投与する工程を含む、虚血組織を処置する方法、〔2〕血管新生遺伝子が線維芽細胞増殖因子2(FGF2)である、〔1〕に記載の方法、〔3〕投与が筋中投与である、〔1〕または〔2〕に記載の方法、〔4〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔1〕から〔3〕のいずれかに記載の方法。
投与はインビボであってもエクスビボであってもよい。インビボ投与の場合は、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターを筋肉注射、皮下注射、カテーテル投与等の当業者に公知の投与経路により注入することができる。エクスビボ投与の場合は、予め体外で細胞にこのベクターを導入する。その後、ベクターを導入した細胞を筋肉注射、皮下注射、カテーテル投与等により個体内に注入する。エクスビボ投与においてベクターを導入する細胞は、投与個体と異種または同種であってよいが、好ましくは同種、より好ましくは投与個体から採取した細胞である。さらに最も好ましくは、血管内皮細胞を形成または血管内皮細胞に分化し得る細胞すなわち血管内皮前駆細胞を含む、骨髄または血液由来の細胞である。薬学的有効量の本発明のベクターを投与することにより、投与組織において血管新生を誘導することができる。これにより、例えば脳、心臓、腎臓、肺、および四肢等の虚血において、組織の壊死および脱落を防止する治療が可能である。
また、本発明は、虚血組織を処置するための、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターの用途および使用を提供する。具体的には、本発明は、
〔1〕虚血組織を処置するための、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクター、
〔2〕血管新生遺伝子が線維芽細胞増殖因子2〔FGF2〕である、〔1〕に記載のベクター、
〔3〕筋中投与用である、〔1〕または〔2〕に記載のベクター、
〔4〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔1〕から〔3〕のいずれかに記載のベクター、を提供する。また本発明は、上記パラミクソウイルスベクターを含む、虚血組織を処置するための組成物を提供する。この組成物は、上記パラミクソウイルスベクター以外に、薬学的に許容される所望の担体を含んでよい。例えば本発明のベクターを生理的溶液と組み合わせて注射剤として、あるいは固体または半固体(ゲル)と組み合わせて体内埋め込み型製剤として製剤化して用いることができる。
本発明において血管新生遺伝子の導入に用いるパラミクソウイルスベクターとしては、特に制限はない。好適なパラミクソウイルスベクターとして、例えば、複製能を有し、自立的に増殖するようなベクターが挙げられる。例えば、一般に天然型パラミクソウイルスのゲノムは、3’の短いリーダー領域に続き、N(ヌクレオキャプシド)、P(ホスホ)、M(マトリックス)、F(フュージョン)、HN(ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ)、およびL(ラージ)蛋白質をコードする6つの遺伝子が並んでおり、短い5’トレイラー領域を他端に有する。これと同様の構造を有するゲノムを設計することにより、自律複製可能な本発明のベクターを製造することができる。また、ゲノム内に外来遺伝子を挿入することにより、外来遺伝子を発現するベクターを製造することができる。なお、本発明のパラミクソウイルスベクターにおいては、ウイルス遺伝子の配置は野生型ウイルスから改変されていてもよい。
また、本発明に用いるパラミクソウイルスベクターとしては、野生型パラミクソウイルスが持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってもよい。例えば、センダイウイルスベクターを再構成させる場合、NP、P/CおよびL遺伝子から作られる蛋白質群がトランスに必要だと考えられているが、該蛋白質群をコードする遺伝子自体は、本発明のウイルスベクターに必ずしも含まれている必要なはい。例えば、該蛋白質群をコードする遺伝子を有する発現ベクターを、ベクターゲノムをコードする発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ベクターの再構成を行うことができる。また、該蛋白質群をコードする遺伝子を有する宿主細胞にベクターゲノムをコードする発現ベクターを導入し、該宿主細胞から該蛋白質群を供給して再構成を行ってもよい。これらの蛋白質群のアミノ酸配列は、ウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、パラミクソウイルスベクターが細胞に伝播してゆくためには、M、FおよびHN遺伝子から作られる蛋白質群が必要だと考えられているが、パラミクソウイルスベクターをRNPとして調製する場合は、これらの蛋白質は必要ない。RNPに含まれるゲノムに、M、FおよびHN遺伝子が含まれていれば、宿主に導入された時に、これらの遺伝子産物が生産され、感染性のあるウイルス粒子が形成される。感染性ウイルスを産生するRNPベクターとしては、例えばN、P、M、F、HN、およびL遺伝子をコードするウイルスゲノムRNAと、N蛋白質、P蛋白質、およびL蛋白質とを含むRNPが挙げられる。このようなRNPを細胞内に導入すると、N蛋白質、P蛋白質、およびL蛋白質の働きによりウイルスゲノムが発現、複製され、感染性ウイルスベクターが増幅する。
RNPを細胞に導入するには、例えばリポフェクトアミンやポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN #301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boehringer #1811169)などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる(Calos,M.P.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:3015)。複製型ウイルスの場合、産生されたウイルスは、培養細胞、鶏卵、個体(例えばマウスなどの哺乳動物)などに再感染させて増幅または継代することができる。
また、M、Fおよび/またはHN遺伝子が含まれていないパラミクソウイルスベクターも、本発明のパラミクソウイルスベクターとして好適に用いることができる。このようなウイルスベクターの再構成は、例えば、欠損している遺伝子産物を外来的に供給することにより行うことができる。このようにして製造されたウイルスベクターは、野生型ウイルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが、細胞に導入されたベクターゲノムはこれらのいずれかの遺伝子を欠損しているため、最初と同じような感染力を持つ娘ウイルス粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子導入力を持つ安全なウイルスベクターとして有用である。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、特にF遺伝子および/またはHN遺伝子が挙げられる。遺伝子の欠損とは、その遺伝子の機能が実質的に失われることをいい、その遺伝子が蛋白質をコードする場合においては、その野生型蛋白質と同等の機能を有する蛋白質が発現しないことを言う。例えば、その遺伝子が転写されないこと、loss−of−function変異体であること、または欠失していることなどであってよい。好ましくは、遺伝子の欠損とはその遺伝子のコード領域の少なくとも一部が、より好ましくは全部が欠失していることである。例えば、F遺伝子が欠損しているベクターは、好ましくはF蛋白質のコード領域の一部、より好ましくは全部を欠失しているベクターである。本発明のF遺伝子欠損ベクターは、より好ましくは、そのネガティブ鎖ゲノムにおいて欠損したF遺伝子の3’隣接部位のスタートシグナル配列をさらに欠損している。これにより、欠損部位からの必要のないポリペプチドの発現を抑制することができる。欠損部位に必要のないポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)が存在する場合には、部位特異的変異導入等によりそのORFを除去することが好ましい(後述)。
F遺伝子を欠損したベクターの製造においては、例えば、F遺伝子が欠損した組み換えパラミクソウイルスベクターゲノムを発現するプラスミドを、F蛋白質の発現ベクターならびにNP、P/CおよびL蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ウイルスベクターの再構成を行うことができる(国際公開番号WO00/70055およびWO00/70070)。また、例えば、F遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いて製造することもできる。これらの蛋白質群を外から供給する場合、そのアミノ酸配列はウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、ベクターゲノムが由来するウイルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をベクターのエンベロープに含むベクターを作製することもできる。このようなタンパク質に特に制限はない。例えば、他のウイルスのエンベロープタンパク質、例えば水疱性口内炎ウイルス(VSV)のGタンパク質(VSV−G)を挙げることができる。本発明のパラミクソウイルスベクターは、VSV−Gタンパク質などのように、ゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープタンパク質を含むシュードタイプウイルスベクターが含まれる。
また、本発明のパラミクソウイルスベクターは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウイルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラタンパク質などを含むものであってもよい。これにより、特定の組織を標的とするベクターを作り出すこともできる。これらはウイルスゲノムにコードされていてもよいし、ウイルスベクターの再構成時に、ウイルスゲノム以外の遺伝子(例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体などに含まれる遺伝子)の発現により供給されてもよい。
また、本発明のウイルスベクターは、例えば免疫原性を低下させるために、またはRNAの転写効率や複製効率を高めるために、ベクターに含まれるウイルス遺伝子が改変されたものであってもよい。具体的には、例えば複製因子であるNP遺伝子、P/C遺伝子およびL遺伝子の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、構造体蛋白質の1つであるHN蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン(hemagglutinin)活性とノイラミニダーゼ(neuraminidase)活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウイルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、膜融合に関わるF蛋白質を改変することにより、膜融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるF蛋白質やHN蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用して抗原提示能を弱めたパラミクソウイルスベクターを作製することもできる。
また本発明におけるパラミクソウイルスベクターとしては、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えばSeVのアクセサリー遺伝子の1つであるV遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現や複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するSeVの病原性が顕著に減少する(Kato,A.et al.,1997,J.Virol.71:7266−7272;Kato,A.et al.,1997,EMBO J.16:578−587;Curran,J.et al.,WO01/04272,EP1067179)。このような弱毒化ベクターは、in vivoまたはex vivoにおける遺伝子導入用ウイルスベクターとして特に好適である。
本発明のウイルスベクターは、ゲノムRNA中に血管新生遺伝子をコードする。外来遺伝子を含む組み換えパラミクソウイルスベクターは、上記のパラミクソウイルスベクターゲノムに外来遺伝子を挿入することによって得られる。外来遺伝子としては、ベクター導入の標的とする組織(虚血組織等)において発現させたい所望の血管新生遺伝子を用いることができる。外来遺伝子は天然型蛋白質をコードする遺伝子であってもよく、また天然型蛋白質と同等の機能を有する蛋白質をコードする限り、欠失、置換または挿入により天然型蛋白質を改変した蛋白質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、遺伝子治療などを目的とする場合には、該ウイルスベクターのゲノムをコードするDNA(ウイルスベクターDNA)に対象となる疾患の治療用遺伝子を挿入する。ウイルスベクターDNAに外来遺伝子を導入する場合は、例えば、センダイウイルスベクターDNAにおいては、転写終結(E)配列と転写開始(S)配列との間などに、6の倍数の塩基数を有する配列を挿入することが望ましい(Calain P.and Roux L.,1993,J.Virol.,67(8),4822−4830)。外来遺伝子は、ウイルスの各遺伝子(NP、P、M、F、HN、およびL遺伝子)の前および/または後ろに挿入することができる。前後の遺伝子の発現を妨げないようにするため、外来遺伝子の前または後ろに適宜E−I−S配列(転写開始配列−介在配列−転写終結配列)またはその部分を挿入し、各遺伝子の間にE−I−S配列を配置する。あるいは、IRESと共に外来遺伝子を挿入し得る。
挿入した外来遺伝子の発現量は、外来遺伝子の上流に付加する転写開始配列の種類により調節することができる(WO01/18223)。また、遺伝子挿入の位置、および遺伝子の前後の塩基配列により調節しうる。例えば、センダイウイルスにおいては、挿入位置がウイルスゲノムのネガティブ鎖RNAの3’端に近いほど(野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置においては、NP遺伝子に近いほど)、挿入された遺伝子の発現量が高い。外来遺伝子の高い発現を得るためには、外来遺伝子をNP遺伝子の上流(ネガティブ鎖においては3’側)またはNP遺伝子とP遺伝子の間など、ネガティブ鎖ゲノムにおいて上流領域に挿入することが好ましい。逆に、挿入位置がネガティブ鎖RNAの5’端に近いほど(野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置においては、L遺伝子に近いほど)、挿入された遺伝子の発現量が低くなる。外来遺伝子の発現を低く抑えるためには、例えばネガティブ鎖の最も5’側、すなわち野生型ウイルスゲノムにおいてはL遺伝子の下流(ネガティブ鎖においてはL遺伝子の5’隣接部位)、またはL遺伝子の上流(ネガティブ鎖においてはL遺伝子の3’隣接部位)に外来遺伝子を挿入する。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウイルスタンパク質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。例えば、高力価ウイルスベクターの投与による血管新生遺伝子の高発現が毒性を示す場合は、投与するウイルス力価を制限することができる他、例えばベクターにおける血管新生遺伝子の挿入位置をネガティブ鎖のなるべく5’側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、個々のウイルスベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な治療効果が得られるようにすることも可能である。
外来遺伝子を容易に挿入できるようにするために、挿入部位にクローニングサイトを設計することができる。クローニングサイトは、例えば制限酵素の認識配列とすることができる。ゲノムをコードするベクターDNA中の当該制限酵素部位に外来遺伝子断片を挿入することができる。クローニングサイトは、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチクローニングサイトとしてもよい。また、本発明のベクターは、このように挿入した以外に位置に他の外来遺伝子を保持していてもよい。このような外来遺伝子としては制限はなく、別の血管新生遺伝子であってもよく、また、その他の遺伝子であってもよい。
外来遺伝子を有する組み換えセンダイウイルスベクターは、例えば、Hasan,M.K.et al.,J.Gen.Virol.78:2813−2820,1997、Kato,A.et al.,1997,EMBO J.16:578−587及びYu,D.et al.,1997,Genes Cells 2:457−466の記載に準じて、次のようにして構築することができる。
まず、所望の外来遺伝子のcDNA塩基配列を含むDNA試料を用意する。DNA試料は、25ng/μl以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、外来遺伝子を、NotI部位を利用してウイルスゲノムをコードするDNAに挿入する場合を例にとって説明する。目的とするcDNA塩基配列の中にNotI認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異挿入法などを用いて、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、NotI部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から所望の遺伝子断片をPCRにより増幅回収する。増幅された断片の両端がNotI部位とし、さらに一端にセンダイウイルスの転写終結配列(E)、介在配列(I)及び転写開始配列(S)(EIS配列)のコピーを付加するために、NotI制限酵素切断部位配列及び転写終結配列(E)、介在配列(I)及び転写開始配列(S)と目的遺伝子の一部の配列を含むプライマー対として、フォワード側(センス鎖)合成DNA配列及びリバース側(アンチセンス鎖)合成DNA配列(プライマーセット)を作成する。
例えば、フォワード側合成DNA配列は、NotIによる切断を保証するために5’側に任意の2以上のヌクレオチド(好ましくはGCGおよびGCCなどのNotI認識部位由来の配列が含まれない4塩基、更に好ましくはACTT)を選択し、その3’側にNotI認識部位gcggccgcを付加し、さらにその3’側にスペーサー配列として任意の9塩基または9に6の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその3’側に所望のcDNAの開始コドンATGからこれを含めてORFの約25塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基はGまたはCとなるように該所望のcDNAから約25塩基を選択してフォワード側合成オリゴDNAの3’の末端とすることが好ましい。
リバース側合成DNA配列は5’側から任意の2以上のヌクレオチド(好ましくはGCGおよびGCCなどのNotI認識部位由来の配列が含まれない4塩基、更に好ましくはACTT)を選択し、その3’側にNotI認識部位gcggccgcを付加し、さらにその3’側に長さを調節するための挿入断片のオリゴDNAを付加する。このオリゴDNAの長さは、NotI認識部位gcggccgcを含め、cDNAの相補鎖塩基配列と後述するセンダイウイルスに由来するセンダイウイルスゲノムのEIS塩基配列の合計が6の倍数になるように塩基数を設計する(いわゆる「6のルール(rule of six)」;Kolakofski,D.et al.,J.Virol.72:891−899,1998;Calain,P.and Roux,L.,J.Virol.67:4822−4830,1993;Calain,P.and Roux,L.,J.Virol.67:4822−4830,1993)。さらに挿入断片の3’側にセンダイウイルスのS配列の相補鎖配列、好ましくは5’−CTTTCACCCT−3’(配列番号:1)、I配列、好ましくは5’−AAG−3’、E配列の相補鎖配列、好ましくは5’−TTTTTCTTACTACGG−3’(配列番号:2)、さらにその3’側に所望のcDNA配列の終止コドンから逆に数えて約25塩基相当の相補鎖の最後の塩基がGまたはCになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成オリゴDNAの3’の末端とする。
PCRは、例えば、ExTaqポリメラーゼ(宝酒造)を用いる通常の方法を用いることができる。好ましくはVentポリメラーゼ(NEB)を用いて行い、増幅した目的断片はNotIで消化した後、プラスミドベクターpBluescriptのNotI部位に挿入する。得られたPCR産物の塩基配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片をNotIで切り出し、ゲノムcDNAを含むプラスミドのNotI部位にクローニングする。またプラスミドベクターpBluescriptを介さずにNotI部位に直接挿入し、組み換えセンダイウイルスcDNAを得ることも可能である。
例えば、組み換えセンダイウイルスゲノムcDNAであれば、文献記載の方法に準じて構築することができる(Kato,A.et al.,EMBO J.16:578−598,1997,Hasan,M.K.et al.J.Gen.Virol.78:2813−2820,1997;Yu,D.et al.,Genes Cells 2:457−466,1997;Li,H.O.et al.,J.Virology 74,6564−6569,2000)。例えば、まずNotI制限部位を有する18bpのスペーサー配列(5’−(G)−CGGCCGCAGATCTTCACG−3’)(配列番号:3)を、クローニングされたセンダイウイルスゲノムcDNA(pSeV(+))のリーダー配列とN−タンパク質をコードする配列の5’末端との間の隣接遺伝子座に挿入し、デルタ肝炎ウイルスのアンチゲノム鎖(antigenomic strand)由来の自己開裂リボザイム部位を含むプラスミドpSeV18+b(+)を得る(Hasan,M.K.et al.,1997,J.General Virology 78:2813−2820)。pSeV18+b(+)のNotI部位に外来遺伝子断片を挿入し、所望の外来遺伝子が組み込まれた組み換えセンダイウイルスcDNAを得ることができる。
このようにして作製した組み換えパラミクソウイルスベクターDNAを試験管内または細胞内で転写させ、ウイルスのL、P、およびNPタンパク質の共存下でRNPを再構成させると、このRNPを含むウイルスベクターを生成させることができる。本発明は、血管新生遺伝子をコードする本発明のパラミクソウイルスベクターのゲノムを転写および複製する蛋白質の共存下、該ゲノムをコードするDNAを細胞内で転写させる工程、および生成したパラミクソウイルスベクターを回収する工程を含む、該ベクターの製造方法を提供する。パラミクソウイルスベクターのゲノムを転写および複製する蛋白質としては、例えばN、L、およびP蛋白質である。また本発明は、該DNAからなる、本発明のパラミクソウイルスベクター製造用DNAを提供する。また本発明は、本発明のパラミクソウイルスベクターを製造するための、該ベクターのゲノムをコードするDNAの使用に関する。ウイルスベクターDNAからのウイルスの再構成は公知の方法に従って行うことができる(国際公開97/16539号;国際公開97/16538号;Durbin,A.P.et al.,1997,Virology 235:323−332;Whelan,S.P.et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8388−8392;Schnell.M.J.et al.,1994,EMBO J.13:4195−4203;Radecke,F.et al.,1995,EMBO J.14:5773−5784;Lawson,N.D.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4477−4481;Garcin,D.et al.,1995,EMBO J.14:6087−6094;Kato,A.et al.,1996,Genes Cells 1:569−579;Baron,M.D.and Barrett,T.,1997,J.Virol.71:1265−1271;Bridgen,A.and Elliott,R.M.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:15400−15404)。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含む所望のパラミクソウイルスベクターをDNAから再構成させることができる。ウイルスベクターDNAにおいて、F遺伝子、HN遺伝子、および/またはM遺伝子を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウイルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および/または他のウイルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、導入し発現させることにより、感染性のウイルス粒子を形成させることが可能である。
例えば、ベクターDNAを細胞内に導入する方法には、次のような方法、▲1▼目的の細胞が取り込めるようなDNA沈殿物を作る方法、▲2▼目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つDNAを含む複合体を作る方法、▲3▼目的の細胞膜に、DNA分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。
▲2▼としては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN #301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boehringer #1811169)などが挙げられる。▲1▼としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったDNAは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のDNAが入ることが知られている(Graham,F.L.and Van Der Eb,J.,1973,Virology 52:456;Wigler,M.and Silverstein,S.,1977,Cell 11:223)。ChenおよびOkayamaはトランスファー技術の最適化を検討し、1)細胞を共沈殿物のインキュベーション条件を2〜4%CO2、35℃、15〜24時間、2)DNAは直鎖状より環状のものが活性が高く、3)沈殿混液中のDNA濃度が20〜30μg/mlのとき最適な沈殿が得られると報告している(Chen,C.and Okayama,H.,1987,Mol.Cell.Biol.7:2745)。▲2▼の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはDEAE−デキストラン(Sigma #D−9885 M.W.5×105)混液を所望のDNA濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる(Calos,M.P.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:3015)。▲3▼の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で▲1▼や▲2▼の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界(電極間のギャップ、電圧)の強さ、バッファーの導電率、DNA濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。
以上、3つのカテゴリーの中で▲2▼の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるので、本発明においては、トランスフェクション試薬が適している。好適にはSuperfect Transfection Reagent(QIAGEN,Cat No.301305)、またはDOSPER Liposomal Transfection Reagent(Boehringer Mannheim,Cat No.1811169)が用いられるが、これらに限定されない。
cDNAからの再構成は具体的には次のようにして行うことができる。
24穴から6穴程度のプラスチックプレートまたは100mmペトリ皿上で、10%ウシ胎児血清(FCS)および抗生物質(100units/mlペニシリンGおよび100μg/mlストレプトマイシン)を含む最少必須培地(MEM)を用いてサル腎臓由来細胞株LLC−MK2を70〜80%コンフルエントになるまで培養し、例えば1μg/ml psoralen(ソラレン)存在下UV照射処理を20分処理で不活化した、T7ポリメラーゼを発現する組み換えワクシニアウイルスvTF7−3(Fuerst,T.R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8122−8126,1986、Kato,A.et al.,Genes Cells 1:569−579,1996)を2PFU/細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびUV照射時間が適宜調整することができる。感染1時間後、2〜60μg、より好ましくは3〜5μgの上記の組み換えセンダイウイルスcDNAを、全長センダイウイルスゲノムの生成に必須なトランスに作用するウイルスタンパク質を発現するプラスミド(24−0.5μgのpGEM−N、12−0.25μgのpGEM−P、および24−0.5μgのpGEM−L、より好ましくは例えば1μgのpGEM−N、0.5μgのpGEM−P、および1μgのpGEM−L)(Kato,A.et al.,Genes Cells 1:569−579,1996)と共にSuperfect(QIAGEN社)を用いたリポフェクション法等によりトランスフェクションする。トランスフェクションを行った細胞は、所望により100μg/mlのリファンピシン(Sigma)及びシトシンアラビノシド(AraC)、より好ましくは40μg/mlのシトシンアラビノシド(AraC)(Sigma)のみを含む血清不含のMEMで培養し、ワクシニアウイルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウイルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する(Kato,A.et al.,1996,Genes Cells 1:569−579)。トランスフェクションから48〜72時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を3回繰り返して細胞を破砕した後、LLC−MK2細胞にトランスフェクションして培養する。培養3〜7日後に培養液を回収する。エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子を欠損した複製能を持たないウイルスベクターを再構成させるには、エンベロープタンパク質を発現するLLC−MK2細胞をトランスフェクションに使用するか、またはエンベロープ発現プラスミドを共にトランスフェクションすればよい。また、トランスフェクションを行った細胞にエンベロープタンパク質を発現するLLC−MK2細胞を重層して培養することによって欠損型ウイルスベクターを増幅することもできる(国際公開番号WO00/70055およびWO00/70070参照)。培養上清に含まれるウイルス力価は赤血球凝集活性(HA)を測定することにより決定することができる。HAは「endo−point希釈法」(Kato,A.et al.,1996,Genes Cells 1:569−579;Yonemitsu,Y.& Kaneda,Y.,Hemaggulutinating virus of Japan−liposome−mediated gene delivery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular Medicine:Humana Press:pp.295−306,1999)により決定することができる。混入し得るワクシニアウイルスvTF7−3を除去するために、得られた尿液試料を適宜希釈(例えば106倍)して、鶏卵で再増幅させることができる。再増幅は、例えば3回以上繰り返すことができる。得られたウイルスストックは−80℃で保存することができる。
ウイルスベクターが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、サル腎由来のLLCMK2細胞、CV−1細胞、ハムスター腎由来のBHK細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。また、大量にセンダイウイルスベクターを得るために、上記の宿主から得られたウイルスベクターを発育鶏卵に感染させ、該ベクターを増幅することができる。鶏卵を使ったウイルスベクターの製造方法は既に開発されている(中西ら編,(1993),「神経科学研究の先端技術プロトコールIII,分子神経細胞生理学」,厚生社,大阪,pp.153−172)。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ9〜12日間37〜38℃で培養し、胚を成長させる。ウイルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間卵を培養してウイルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み換えセンダイウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのセンダイウイルスベクターの分離・精製は常法に従って行うことができる(田代眞人,「ウイルス実験プロトコール」,永井、石浜監修,メジカルビュー社,pp.68−73,(1995))。また、次に述べるF欠失センダイウイルスの大量生産には、トリプシン耐性の細胞(例えばLLCMK2など)が好ましい。
F遺伝子を欠失したセンダイウイルスベクターの構築と調製は、例えば以下のように行うことができる(国際公開番号WO00/70055およびWO00/70070参照)。
1.外来遺伝子搭載用F欠失型センダイウイルスゲノムcDNAの構築
センダイウイルス(SeV)の全長ゲノムcDNA、pSeV18+b(+)(Hasan,M.K.et al.,J.Gen.Virol.78,2813−2820,1997)(「pSeV18+b(+)」は「pSeV18+」ともいう)をSphI/KpnIで消化してフラグメント(14673bp)を回収し、pUC18にクローニングしてプラスミドpUC18/KSとする。F欠損部位の構築はこのpUC18/KS上で行う。F遺伝子の欠損はPCR−ライゲーション方法の組み合わせで行ない、結果としてF遺伝子のORF(ATG−TGA=1698bp)を除いてatgcatgccggcagatga(配列番号:4)で連結し、F欠失型SeVゲノムcDNA(pSeV18+/ΔF)を構築する。PCR法としては、Fの上流にはforward:5’−gttgagtactgcaagagc(配列番号:5)、reverse:5’−tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc(配列番号:6)、F遺伝子の下流にはforward:5’−atgcatgccggcagatga(配列番号:7)、reverse:5’−tgggtgaatgagagaatcagc(配列番号:8)のプライマー対を用い、得られたPCR産物をEcoT22Iで連結する。このようにして得られたプラスミドをSacIとSalIで消化して、F欠損部位を含む領域の断片(4931bp)を回収してpUC18にクローニングし、pUC18/dFSSとする。このpUC18/dFSSをDraIIIで消化して断片を回収し、pSeV18+のF遺伝子を含む領域のDraIII断片と置き換え、ライゲーションしてプラスミドpSeV18+/ΔFを得る。
なお、この構造はF遺伝子のEIS配列(SeV特異的配列、E;end,I;intergenic,S;start)が残存し、下流のF遺伝子のORFは除かれているものの、この部位の連結に用いたプライマー由来の5アミノ酸ペプチドが発現する可能性のある構造になっている。
F遺伝子の欠損位置への外来遺伝子の挿入は、pUC18/dFSSのF欠失部位にある制限酵素NsiIおよびNgoMIV部位を利用して行う。このためには、例えば外来遺伝子断片をNsiI−taildプライマーおよびNgoMIV−tailedプライマーで増幅すればよい。
例えば実際にEGFP遺伝子を搭載したcDNA(pSeV18+/ΔF−GFP)を構築する場合には、まずEGFP遺伝子のPCRによる増幅を行なう。EGFP遺伝子断片の塩基数を6の倍数(Hausmann,S.et al.,RNA 2,1033−1045,1996)に合わせるため、5’末端はNsi−tailedプライマー(5’−atgcatatggtgatgcggttttggcagtac/配列番号:9)、3’末端はNgoMIV−tailedプライマー(5’−tgccggctattattacttgtacagctcgtc/配列番号:10)を用いてPCRを行う。PCR産物を制限酵素MsiIとNgoMIVで消化してゲルから断片を回収し、pUC18/dFSSのF欠失部位にあるNsiIとNgoMIVという制限酵素部位に連結し、シークエンスを確認する。ここからEGFP遺伝子を含むDraIII断片を回収し、pSeV18+のF遺伝子を含む領域のDraIII断片と置き換え、ライゲーションしてpSeV18+/ΔF−GFPを得る。
NP遺伝子の前の位置への外来遺伝子の挿入は、pSeV18+/ΔF或いはpSeV18+/ΔF−GFPの制限酵素NotIの認識部位を利用して行う。ただし、pSeV18+/ΔFの場合は、欠失したF遺伝子位置に連結に用いたプライマー由来の5アミノ酸ペプチドが発現する可能性のある構造になっており、またpSeV18+/ΔF−GFPの場合はGFPが共発現するので、必要であればそのペプチド及びGFPが共発現する可能性のない遺伝子の構築を行う。そのためには下記の様に行なう。
pSeV18+/ΔF−GFPをSalIとNheIで消化してF欠損部位を含む領域の断片(6288bp)を回収し、Litmus38(New England Biolabs,Beverly,MA)にクローニングし、LitmusSalINheIfrg/ΔF−GFPとする。欠損させたF遺伝子上流のEIS配列を含むEGFP遺伝子の欠損はInverse PCR法により行なう。すなわち、GFP遺伝子上流で制限酵素SexAIの認識配列をデザインしたreverseプライマー(5’−gtttaccaggtggagagttttgcaaccaagcac/配列番号:11)とGFP遺伝子下流で制限酵素SexAIの認識配列をデザインしたforwardプライマー(5’−ctttcacctggtacaagcacagatcatggatgg/配列番号:12)でPCRを行ない、目的の大きさの断片(10855bp)を切り出してそのままライゲーションを行ない、欠損させたF遺伝子上流のEIS配列を含むEGFP遺伝子を欠失させる。
ただし、この場合、プライマーデザイン上のSexA1に挟まれた配列15bpが余分に挿入されている。そこで、プラスミドを大腸菌SCS110株にトランスフォームして調製し(SexA1はメチル化の影響を受け切断出来なくなるのでdcm−/dam−のSCS110株を利用する)、制限酵素SexA1で消化後、1628bp及び9219bpの2つの遺伝子断片を回収してライゲーションを行ない、余分な15bpを欠失させ、6の倍数でF遺伝子上流のEIS配列を含むEGFP遺伝子を欠失させたLitmusSalINheIfrg/ΔF(Δ5aa)を調製する。このプラスミドをSalI及びNheIで消化して断片を回収し、pSeV18+のF遺伝子を含む領域のSalI/NheI断片と置き換え、ライゲーションしてプラスミドpSeV18+/ΔF(Δ5aa)を得る。
このプラスミドへの外来遺伝子挿入は、例えばNP遺伝子の前に位置する制限酵素NotIの認識配列を利用して行う。
2.hFGF2遺伝子搭載F欠失型センダイウイルスゲノムcDNAの構築
ヒトのFGF2(hFGF2)cDNAの取得には種々の方法があるが、例えば、患者本人の了承を得て採取したヒト大伏在静脈から分離した血管平滑筋細胞よりRT−PCRにてcDNAを分離し、pBluescriptSK+(Stratagene,La Jolla,CA)のHindIII(5’末端)、EcoRI(3’末端)にサブクローニングして調製することができる。その際、hFGF2 cDNAの遺伝子配列はAbrahamらの報告(Abraham,J.A.et al.,EMBO J.5(10),2523−2528,1986)を参照することができる。
NP遺伝子の前に位置する制限酵素NotIの位置にhFGF2遺伝子を挿入するためには、hFGF2遺伝子の3’端側にSeV特異的配列(EIS配列)を付加して両端にNotI認識配列を有するフラグメントを調製すればよい。具体的には、上記hFGF2 cDNAを鋳型にして、開始コドンを含むN末端側プライマー(5’−atccgcggccgccaaagttcacttatggcagccgggagcatcaccacgctgcccgccttgcccgaggatggcggcagcggcgcc/配列番号:13)および終止コドン領域とEIS配列とを含むC末端側プライマー(5’−atccgcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggtcagctcttagcagacattggaagaaaaagtatagc/配列番号:14)を用いてPCRを行ない、NotI消化後、pBluescriptSK+(Stratagene,La Jolla,CA)のNotI部位にサブクローニングしてpBS−hFGF2を調製する。塩基配列を確認し、得られた遺伝子に変異がある場合は、例えば、QuickChangeTM Site−Directed Mutagenesis Kit(Stratagene,La Jolla,CA)を利用してKitに記載の方法に従って目的の配列に修正する。pBS−hFGF2をNotIで消化後、hFGF2 cDNAを含む断片をpSeV18+/ΔF(Δ5aa)のNP遺伝子の前に位置するNotI部位に挿入し、hFGF2遺伝子搭載F欠失型センダイウイルスゲノムcDNA pSeV18+hFGF2/ΔF(Δ5aa)を構築する。pSeV18+hFGF2/ΔF(Δ5aa)は、以後pSeV18+hFGF2/ΔFとも表記する。
3.F発現プラスミドの構築
センダイウイルスのF遺伝子(SeV−F)の発現には、Cre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現されるように設計されたプラスミドpCALNdLw(Cre/loxP誘導型発現プラスミド;Arai,T.et al.,J.Virol.72(2),1115−1121,1998)を利用することができる。pUC18/KSをStyI及びBstUIで消化し、SeV−F遺伝子を含む断片(1783bp)を切り出し、平滑末端処理後、pCALNdLwのユニークサイトSwaI部位に挿入し、F発現プラスミドpCALNdLw/Fを構築する。
4.SeV−F蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
F欠損ゲノムから感染ウイルス粒子を回収するため、SeV−F蛋白を発現するヘルパー細胞株を樹立する。細胞は、例えばSeVの増殖によく用いられているサル腎臓由来細胞株LLC−MK2細胞を用いることができる。LLC−MK2細胞は、10%の熱処理した非動化ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリンGナトリウム50単位/mlおよびストレプトマイシン50μg/mlを添加したMEMで37℃、5%CO2で培養する。Cre DNAリコンビナーゼによりF遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミドpCALNdLw/Fをリン酸カルシウム法(Mammalian Transfection Kit;Stratagene,LaJolla,CA)により、周知のプロトコールに従ってLLC−MK2細胞に遺伝子導入する。
具体的には、例えば、10cmプレートを用い、40%コンフルエントまで生育したLLC−MK2細胞に10μgのプラスミドpCALNdLw/Fを導入後、10mlの10% FBSを含むMEM培地にて、37℃の5%CO2インキュベーター中で24時間培養する。24時間後に細胞をはがし、10ml培地に懸濁後、10cmシャーレ5枚を用い、例えば5ml 1枚、2ml2枚、0.2ml2枚に蒔き、G418(Gibco−BRL,Rockville,MD)を1200μg/ml含む10mlの10% FBSを含むMEM培地にて培養を行い、2日毎に培地交換しながら、14日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行う。該培地により生育してきたG418に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて例えば30株を回収する。各クローンは10cmプレートでコンフルエントになるまで拡大培養を続ける。
F遺伝子の安定導入株の選択は以下の方法で行う。すなわち、F蛋白質の発現量をウェスタンブロッティングで半定量的に解析することで行うことができる。各クローンのF蛋白質の発現誘導は、細胞を6cmシャーレにてコンフルエントまで生育させた後、アデノウイルスAxCANCreを斉藤らの方法(Saito et al.,Nucl.Acids Res.23,3816−3821,1995;Arai,T.et al.,J.Virol.72(2),1115−1121,1998)によりmoi=3で感染させて行う。感染3日後に、細胞の培養上清を取り除いた後、PBS緩衝液で2回洗浄し、スクレーパーで細胞を剥がし、1500×gで5分間遠心し細胞を回収する。該細胞は−80℃で保存し、解凍後150μLのPBS緩衝液に懸濁し、更に同量の2×Tris−SDS−BME sample loading buffer(0.625M Tris(pH 6.8),5% SDS,25% 2−ME,50% glycerol,0.025% BPB,Owl社製)を加え、98℃3分間加熱処理後、電気泳動用試料に供する。該試料(1レーンあたり1×105細胞)を周知のプロトコールに従ってSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウェスタンブロッティングを行う。ウェスタンブロッティングにおける一次抗体に抗SeV−F抗体(f236)を1/1000希釈で用い、各クローンのSeV−Fの発現を半定量的に解析する。
このような方法で、SeV−F遺伝子産物を誘導発現するLLC−MK2細胞の作出が確認される。以後、SeV−F遺伝子誘導発現前の該細胞をLLC−MK2/Fと表記し、誘導発現後の細胞をLLC−MK2/F/Adと表記する。
5.F欠失SeVウイルスの再構成及び増幅
血管新生遺伝子を含むF欠失型センダイウイルスゲノムcDNAを、F発現ヘルパー細胞にトランスフェクションして発現させることにより、ウイルスを再構成することができる。例えば、上記hFGF2遺伝子搭載F欠失型センダイウイルスゲノムcDNA(pSeV18+hFGF2/ΔF)を用いる場合は、このcDNAを以下のようにしてLLC−MK2細胞にトランスフェクションする。LLC−MK2細胞を5×106cells/dishで直径10cmのペトリ皿に蒔き、24時間培養後、ソラレンと長波長紫外線(365nm)で20分間処理したT7 RNAポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス(Fuerst,T.R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,8122−8126,1986)に室温で1時間感染させる(moi=2〜3、好適にはmoi=2が用いられる)。ワクシニアウイルスへの紫外線照射には、例えば15ワットバルブ5本が装備されたUV Stratalinker 2400(カタログ番号400676(100V),Stratagene,La Jolla,CA,USA)を用いる。細胞を2回洗浄して、プラスミドpSeV18+hFGF2/ΔF、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L(Kato,A.et al.,Genes Cells 1,569−579,1996)およびpGEM/F−HN(WO00/70070)をそれぞれ12μg、4μg、2μg、4μgおよび4μg/dishの量比でOptiMEM(GIBCO)に懸濁し、SuperFect transfection reagent(1μg DNA/5μlのSuperFect、QIAGEN)を入れて混合し、室温で15分間放置後、最終的に3%FBSを含むOptiMEM 3mlに入れ、細胞に添加して培養する。3〜5時間培養後、細胞を血清を含まないMEMで2回洗浄し、シトシンβ−D−アラビノフラノシド40μg/ml(AraC、Sigma)およびトリプシン7.5μg/ml(GIBCO)を含み、血清を含まないMEMで24時間培養する。
培養上清を除き、上記でクローニングしたF発現ヘルパー細胞LLC−MK2/F/Ad細胞を重層する。具体的には血清を含まないMEM(40μg/ml AraC、7.5μg/mlトリプシンを含む)に分散したLLC−MK2/F/Ad細胞を、培養上清を除いた細胞に重層し、48時間培養を継続する。スクレイパーにてこれらの細胞を回収し、ペレットをOptiMEMに懸濁し(107 cells/ml)、凍結融解を3回繰り返し行う。このライセートをLLC−MK2/F/Ad細胞(4×106 cells/well 12−well−plate)にかけ(200μl/well)、さらに300μl/wellの血清を含まないMEM(40μg/ml AraC、7.5μg/mlトリプシンを含む)を添加し、15〜24時間培養する。培養上清を除き、血清を含まないMEMで洗浄後、新たな血清を含まないMEM(40μg/ml AraC、7.5μg/mlトリプシンを含む)を添加し、5〜9日間培養を行い上清を回収する。回収した上清には再構成されたF欠失型SeV粒子が含まれており、LLC−MK2/F/Ad細胞へ感染し、同じように血清を含まないMEM(40μg/ml AraC、7.5μg/mlトリプシンを含む)で培養を行うことで(或いはそれを繰り返すことで)F欠失型SeVを増幅することができる。
その際、F欠失型SeV粒子が含まれている培養上清を、0.22μmのフィルターに繰り返し2回通すことで、再構成時のT7 RNAポリメラーゼの発現に利用したリコンビナントワクシニアウイルスの混入をほとんど回避することができる。具体的には、2回以上AraCを含み血清を含まないMEM(40μg/ml AraC、7.5μg/mlトリプシンを含む)で増幅した培養上清(P2以降のサンプル)について0.22μmのフィルターに2回通し、更に1回AraCを含み血清を含まないMEM(40μg/ml AraC、7.5μg/mlトリプシンを含む)で増幅した培養上清を、リコンビナントワクシニアウイルスの混入を回避して増幅したF欠失型SeVとして取り扱うことができる。
欠損型ウイルスベクターを調製する場合、例えば、ゲノム上で欠損しているエンベロープ遺伝子が異なる2種のベクターを同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するエンベロープタンパク質が、もう一方のベクターからの発現により供給されるため、互いに相補しあって感染力のあるウイルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウイルスベクターが増幅される。すなわち、2種またはそれ以上の本発明のベクターを、エンベロープタンパク質を相補する組み合わせで接種すれば、それぞれのエンベロープ遺伝子欠損型ウイルスベクターの混合物を大量かつ低コストで生産することができる。これらのウイルスは、エンベロープ遺伝子が欠損しているため、エンベロープ遺伝子を欠損していないウイルスに比べゲノムサイズが小さくなり長い外来遺伝子を保持することができる。また、元々感染性のないこれらのウイルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔化するため、環境放出管理上の利点がある。
外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いてウイルスベクターを調製すれば、このベクターを投与して遺伝子治療を行うことが可能となる。本発明のウイルスベクターの遺伝子治療への応用としては、直接投与による遺伝子発現、間接(ex vivo)投与による遺伝子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待できる外来遺伝子もしくは患者の体内で供給が不足している内在遺伝子等を発現させることが可能である。外来遺伝子としては血管新生遺伝子または血管新生を促進する遺伝子であれば特に制限はなく、蛋白質をコードする核酸に加え、例えば、血管新生を抑制する遺伝子のアンチセンスまたはリボザイムなどのタンパク質をコードしない核酸であってもよい。
回収したパラミクソウイルスは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション(濾過)、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウイルスベクターは、試料中に含まれる全蛋白質のうち、ウイルスベクター由来の蛋白質の割合が50%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上を占めることにより確認することができる。パラミクソウイルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法(特公昭62−30752号公報、特公昭62−33879号公報、および特公昭62−30753号公報)、およびフコース硫酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法(WO97/32010)等を例示することができる。
本発明のパラミクソウイルスベクターは、薬学的に許容される所望の担体または媒体と共に組成物とすることができる。「薬学的に許容される担体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。例えば本発明のパラミクソウイルスベクターを生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水(PBS)などで適宜希釈して組成物とすることができる。本発明のパラミクソウイルスベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。また本発明のパラミクソウイルスベクターを含む組成物は、脱イオン水、5%デキストロース水溶液等の媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。本発明は、本発明のベクターおよび薬学的に許容される担体を混合する工程を含む、本発明の血管新生組成物の製造方法を提供する。また本発明は、本発明の血管新生組成物の製造のための、本発明のベクターの使用に関する。本発明の組成物は医薬組成物としても有用である。本発明は、本発明のベクターおよび薬学的に許容される担体を含む、虚血治療製剤に関する。また本発明は、本発明のベクターまたは上記組成物の医薬としての使用にも関する。
上記のようにして得られたパラミクソウイルスベクターまたは該ベクターを含む組成物を投与することで、パラミクソウイルスベクターが持つ血管新生遺伝子を導入することができる。本発明は、本発明のパラミクソウイルスベクターまたは本発明の血管新生組成物を投与する工程を含む、血管新生を誘導する方法を提供する。この方法は、特に虚血組織を処置するための方法として有用である。投与部位に特に制限はないが、虚血の処置においては、導入遺伝子産物が虚血組織に集中し、全身の循環系に漏れ出さないように虚血組織またはその周辺に局所投与されるか、または適当な遺伝子送達系(ジーンデリバリーシステム)により目的の組織周辺に局所発現させることが好ましい。例えば、本発明のパラミクソウイルスベクター含有組成物を虚血組織内またはその外からin vivoで投与し、外来遺伝子を虚血組織で発現させることにより実施することができる。また、ex vivoによる投与を行ってもよい。例えば、血管新生遺伝子をコードするパラミクソウイルスベクターを感染させた細胞を虚血組織局所、あるいは虚血組織を還流する動脈内に注入してもよい。
例えば、カテーテルを用いた局所投与も選択され得る。例えば、2つのバルーンにより血管を隔離し、バルーンで隔離された血管の間隙にベクター組成物を注入するダブルバルーンカテーテル法や、多孔性バルーンを用いた投与法等により本発明のベクターを投与してもよい(Jorgensen,B.et al.,Lancet 1(8647):1106−8,1989;Wolinsky,H.and Thung,S.N.,J.Am.Coll.Cardiol.15(2):475−81,1990;WO93/00051;WO93/00052)。これらの投与においては、ヒドロゲルをコートしたバルーンを用いることもできる(Takeshita,S.et al.,Lab.Invest.75(4):487−501,1996)。
例えば心筋梗塞や狭心症、その他の虚血性心疾患における治療においては、例えばカテーテルを用いて心室内腔より心筋内に直接本発明のベクター組成物を注入することができる。また、本発明のベクターをカテーテルにより局所注入することにより、冠状動脈内の狭窄部分の血管新生や側副血行路の発達を促進することができる。
しかし、カテーテルによるベクター投与は、インキュベーションに比較的長時間が必要であるほか、バルーンによる血管損傷なども懸念される。また、虚血組織内の瀰漫性の血管にカテーテルを挿入することは困難である場合も多い。本発明の虚血組織における処置においては、特に筋肉内(intramuscular;IM)へのベクターの投与が好ましい。筋肉内への注入はカテーテルを介した投与よりも簡便であり、血管を損傷させる危険も低い。本発明のベクターは、例えば虚血組織またはその近傍の横紋筋に投与される。横紋筋は骨格筋および心筋を含む。ウイルスベクターの投与前に、筋肉の再生を誘発することにより導入遺伝子の発現を増強することが知られているブピバカイン(bupivacaine)を投与してもよい。また、皮下(intradermal;ID)投与も選択し得る。筋内へのベクターの導入は、例えば、経皮的に導入する方法や開皮して直接導入する方法が挙げられる。ベクターの導入の際には、筋上膜を破損しないように処置することに留意する必要がある。投与は、例えば針とシリンジを用いて行いうる他、針を使わないバイオインジェクターにより投与することも可能である。投与は一箇所または複数箇所に投与し得る。また、投与は1回または複数回行うことができる。
本発明のベクターをマトリックスの形で投与することも有用である。知られている方法としては、アテロコラーゲンマトリックスにウイルスベクターを分散させて、凍結乾燥により固形化しマトリックスが徐々に崩壊することを応用するもので、一時的遺伝子発現で知られているアデノウイルスベクターや裸のDNAの効果持続化に関する報告がある(Ochida,T.et al.,Nature Medicine 5,707−710,1999)。本発明のウイルスベクターは、このような助剤と共存させることが可能であり、凍結乾燥可能である。また発現効果を増強するためにカチオン脂質を共存させることもできる。
投与可能な小さなマトリックスであっても、18G程度の注射針により長期間に亘り成長因子等を徐放できることは知られている。例えば、蛋白質の製剤において、成長ホルモン等の持続時間は、成長ホルモン等を単独で投与した場合に比べて、血液中の持続時間が長く、例えば、7日以上である。通常、10日以上に亘る持続も達成できると報告されている(特開平10−001440)。そのため、製剤の投与回数、患者に与える苦痛を著しく低減できる。前記製剤は、例えば、皮下や筋肉内に投与される固形注射剤(植込み剤など)や、座剤などの粘膜吸収剤として利用できる。剤形は、注射剤として用いる場合には、注射針で投与可能な柱状又は粒状である場合が多い。好ましい製剤の形状には、角柱状、円柱状などの柱状および球状などの粒状が含まれる。
本発明の非経口製剤の大きさも、投与形態に応じて選択でき、患者に過度の苦痛を与えることのない大きさであればよい。注射剤としては、柱状マトリックスで構成されている場合、例えば、直径3mm以下(例えば、0.1〜3mm)、長さ30mm以下(例えば、0.5〜30mm)、好ましくは14G以下の注射針で投与可能な直径1.3mm以下(例えば、0.1〜1.2mm)、長さが20mm以下(例えば、0.5〜20mm)、さらに好ましくは直径0.1〜1mm、長さ1〜20mm程度であり、円柱が好ましい。また、粒状マトリックスで構成された注射剤の粒径は、最大直径1mm以下(例えば、0.1μm〜1mm程度)、好ましくは150μm以下(例えば、0.5〜100μm程度)、さらに好ましくは1〜100μm程度である。また、マトリックスの重量は、製剤の形態に応じて選択でき、注射剤においては、例えば、40mg以下、好ましくは1〜25mg程度である場合が多い。
本発明のパラミクソウイルスベクターにより導入する遺伝子としては、血管新生および/または血管形成を促進するものであれば特に制限はないが、例えば上記のように、aFGF、FGF2(bFGF)、VEGF、Ang(Ang−1およびAng−2を含む)、EGF、TGF−α、TGF−β、PD−ECGF、PDGF、TNF−α、HGF、IGF、EPO、CSF、M−CSF、GM−CSF、IL−8、NOSなどをコードする遺伝子が挙げられる。これらの蛋白質には、それぞれのファミリーに属する各メンバーやアイソフォームなどを含む。本発明のパラミクソウイルスにより導入する血管新生遺伝子の好適な一例として、特にFGF2をコードする遺伝子が挙げられる。FGF2は、例えば急性虚血の治療への応用が期待される。例えば、急性重症虚血肢の治療等において有意な治療効果が期待できる。また、FGF2は、心筋梗塞における治療効果も示されている(Yanagisawa−Miwa,A.et al.,Science 257(5075):1401−3,1992)。蛋白質は分泌蛋白質、膜蛋白質、細胞質蛋白質、核蛋白質などの形態であり得る。好ましくは分泌蛋白質である。また、人工的に構築した蛋白質であってもよい。人工的な蛋白質としては、例えば、他の蛋白質との融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質(受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む)、欠失型の細胞接着分子および細胞表面分子などの形態であり得る。また、分泌シグナルや膜局在化シグナル、核移行シグナル等を付加した蛋白質であってもよい。導入遺伝子は、虚血組織で内因的に発現が誘導される遺伝子であってもよく、また発現が誘導されない遺伝子を異所的に発現させてもよい。また、アンチセンスRNA分子またはRNA切断型リボザイムなどを発現させて虚血組織で発現する望ましくない遺伝子の機能を抑制することもできる。
本発明のベクターは、様々な虚血疾患および血管新生により治療可能な疾患に対する遺伝子治療に適用することが期待される。このような遺伝子治療には、例えば、血管切断や梗塞、血管解離等による血流遮断による虚血に対する治療が挙げられる。本発明のベクター投与の対象となる虚血疾患には、例えば脳血管虚血、腎虚血、肺虚血、四肢の虚血、虚血性心筋症、および心筋虚血が挙げられる。また、遺伝子治療の対象となる組織には特に制限はなく、例えば、筋肉、脳、腎臓、および肺が含まれる。また、移植における血管新生の促進にも有用である。また、様々な疾患モデルの作製や、疾患モデル等における治療方法の開発または評価においても有用である。
ベクターの投与により血管新生が促進されたかは、例えば剖検試料中の毛細管数や毛細管密度の計側や、血管造影による画像解析等により確認することができる。また、ドップラー灌流像解析による血流量の解析により測定することもできる。虚血組織の処置の効果は、組織の壊死または脱落を巨視的または組織切片の顕微鏡観察などにより確認することができる。
本発明のパラミクソウイルスベクターは、薬学的有効量のベクターを対象組織に投与され、これによりこのベクターが対象組織の細胞に導入される。「薬学的有効量」とは、所望の治療または予防効果を少なくとも部分的にもたらすように対象組織の細胞に遺伝子が導入される量を言う。所望の血管新生遺伝子を含む本発明のパラミクソウイルスベクターの有効量が投与されることにより、ベクターが導入された細胞から血管新生因子が産生される。好ましくは、所望の血管新生遺伝子を有する本発明のベクターの有効量が投与されることにより、投与された組織中で有意なレベルの血管新生因子が検出される。「有意なレベル」とは、本発明のベクターにより導入された遺伝子の発現量(転写産物または翻訳産物の量)が検出可能であることを指す。例えば、導入する遺伝子に対応する内因性遺伝子がある場合、導入した遺伝子の最大発現レベルが、内因的な発現レベルに対し有意に上昇していることを指す。好ましくは、投与部位における血管新生遺伝子の発現量が、内因的な発現量の約1.2倍以上、好ましくは約1.5倍以上、より好ましくは約2倍以上、より好ましくは約10倍以上、最も好ましくは約20倍以上の発現が得られることを言う。但し、導入遺伝子の発現量は、その有効発現量レベルおよび中毒レベルを考慮して決められるべきである。
細胞に導入された遺伝子の発現量は、当業者に公知の方法によりアッセイすることが可能である。遺伝子の転写産物は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR、RNAプロテクションアッセイ等により検出・定量することができる。ノーザンハイブリダイゼーションやRT−PCR等による検出はin situでも行い得る。また、翻訳産物を検出するには、抗体を用いたウェスタンブロット、免疫沈降、RIA、ELISA、プルダウンアッセイ等により行うことができる。また、導入遣伝子発現産物の検出を容易にするため、発現させる蛋白質にタグを付加したり、レポーター遺伝子を発現するように組み込んでおくことも可能である。レポーター遺伝子は、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光蛋白質(GFP)をコードする遺伝子等が挙げられるがこれらに制限されない。
ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。好ましくは、投与するベクター量は約105 cell−infectious units(CIU)/mlから約1011CIU/mlの範囲内であるとよい。より好ましくは、投与するベクタの量は約107CIU/mlから約109CIU/mlの範囲内であるとよい。最も好ましくは、約1×108CIU/mlから約5×108CIU/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。本発明のウイルス含有組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど全ての哺乳動物が含まれる。
ヒトにおける投与量は、通常、投与部位1箇所につき2×108CIU〜2×1010CIUの範囲であることが好ましく、より好ましくは2×109CIUを中心とした投与量、例えば5×108CIU〜1×1010CIUなどである。投与回数は、1回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、1日の投与回数についても同様である。ヒト以外の動物についても、例えば投与する動物とヒトとの体重比または投与標的部位(虚血組織など)の重量比もしくは容積比に応じて投与箇所を増減または投与量を換算して投与することができる。
発明を実施するための最良の形態
実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本明細書全体を通じて引用された文献はすべて、本明細書に組み込まれる。
組み換えSeVは以前の記載(Yu,D.et al,Genes Cells 2(7):457−66,1997;Yonemitsu,Y.,et al.,Nature Biotech.18,970−973(2000);Kato,A.,et al.,Genes Cells 1,569−579(1996);Hasan,M.K.,et al.,J.Gen.Virol.78,2813−2820(1997))に従って調製した。
ウイルスの力価は、ニワトリ赤血球を用いたヘマグルチネーションアッセイにより決定した。高力価のストック(109pfu/ml)は使用時まで−80℃で保存した。ヒトVEGF165 cDNAは以前に記載のようにRT−PCRで単離した(Yonemitsu,Y.,et al.,Lab.Invest.75,313−323(1996))。マウスFGF2 cDNAは今村博士(Natinal Institute of Bioscience and Human−Technology,Tsukuba,Japan)より供与されたcDNAの部分配列に基づき、PCRにより全長マウスFGF2 cDNAを調製した(Imamura,T.,et al.,Science 249,1567−1570(1990))。具体的には、開始コドン領域および終止コドン領域を欠失したマウスFGF2 cDNAの部分断片(Accession Number M30644の7〜435番目の断片)を鋳型に用いて、マウスFGF2 cDNAの開始コドンを含むN末端側プライマー(5’−ACGTGCGGCCGCCAAAGTTCATCCACCATGGCTGCCAGCGGCATCACCTCGCTTCCC−3’/配列番号:15)および終止コドン領域とSeV特異的配列とを含むC末端側プライマー(5’−ACGTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGCGGATCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAGAAACAGTATGGCCTTCTGTCCAGGTCCCGT−3’/配列番号:16)を用いて完全長cDNAを増幅した。このようにして調製したヒトVEGF165 cDNAおよびマウスFGF2 cDNAは、塩基配列が正しいことを確認した後、pSeV18+b(+)(Hasan,M.K.et al.,1997,J.General Virology 78:2813−2820)のNotI部位に挿入した。ヒトVEGF165またはマウスFGF2を発現するセンダイウイルスベクターは、それぞれSeV−VEGF165またはSeV−FGF2と名付けた。SeV−luciferase(Hasan,M.K.et al.,J.Gen,Virol.78(Pt 11):2813−2820,1997;Yonemitsu,Y.et al.,Nature Biotechnol.18:970−973,2000)およびpCMV−luciferase(Yonemitsu,Y.et al.,Nature Biotechnol.18:970−973,2000)は上記と同様に調製した。
統計解析において、本実施例の全てのデータは平均±S.D.として表した。救肢以外のデータはScheffeの修正を加えた一元配置分散分析により解析した。救肢データの解析は、救肢の割合を救肢スコア(limb salvage score;LSS)として表し、Kaplan−Mayer法により解析した。救肢実験の統計的有意差はlog−rank検定を用いて決定し、全ての解析において、p<0.05を統計的に有意とした。
[実施例1]虚血により誘導される内因性VEGFの発現は後肢筋中の局所的な蛋白質蓄積を起さない
血管新生因子の治療効果または有害効果を明らかにするため、本発明者らは、2つの異なる手術を用いた虚血肢の3つのモデルを構築した(図1)。すなわち、(1)C57BL/6マウスの全大腿動静脈および伏在動静脈切除による中度の虚血肢(図1左に示した中度虚血モデル)(Couffinhal,T.,et al.,Am.J.Pathol.152,1667−1679(1998);Kalka,C.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97,3422−3427(2000))、(2)C57BL/6マウスの全外腸骨動静脈、大腿動静脈、およびそれらの周囲の分枝血管を全て切除するモデル(図1右に示した重症虚血モデル)、(3)免疫不全BALB/c nu/nuマウスを用いて前記(2)と同じ手術を行うモデル(すなわち、BALB/c nu/nuマウスにおける重症虚血モデル)である。
成獣雄C57BL/6、BALB/c、BALB/c nu/nuマウス(6−8週齢、Charles River Grade)はKBT Oriental Co.Ltd.(Tosu,Saga,Japan)より購入した。動物実験は認可された手順を採用し、九州大学における動物、組み換えDNA、および病原性感染実験委員会による研究動物の飼育および使用の推奨手順および日本国政府の法律(No.105)および告知(No.6)に従った。また、米国国立衛生研究所の「Principles of Laboratory Animal Care」および「Guide for the Care and Use of laboratory Animals」(publication No.NIH 80−23,revised 1985)にも従った。
ペントバルビタールの腹腔内注射により十分麻酔した状態で皮膚を切開し、中度虚血モデルでは、表層の全大腿動静脈および伏在動静脈[大腿深動脈(deep femoral arteries)の直下から膝窩動静脈まで]を結紮し切除した(図1左)(Couffinhal,T.,et al.,Am.J.Pathol.152,1667−1679(1998);Kalka,C.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97,3422−3427(2000))。重症虚血モデルでは、さらに外腸骨動静脈から大腿深動脈までの切除を行った(図1右)。これらのモデルにおける肢の回復状態の再現性は、同一の術者(I.M.)による3〜5回の別々の実験により確認し、各手術では各モデルにつき10個体以上の動物を用いた。それぞれの救肢実験は、同一の実験者が同一条件の実験を4回繰り返して行った。
前記(1)のモデルでは決して肢は失われず、場合により指の壊死の徴候を見せるのみであった。上記(2)のモデル(すなわちC57BL/6マウスにおける重症虚血モデル)では肢の壊死は起こらず(これを「救肢モデル(limb salvage model)」とも呼ぶ)、上記(3)のモデル(BALB/c nu/nuマウスにおける重症虚血モデル)では全ての動物で手術10日以内にほぼ肢全体が脱落した(これを「下肢脱落モデル(limb amptation model)」とも呼ぶ)。免疫適合性BALB/cマウスの重症虚血モデルでは、BALB/c nu/nuマウスと同程度の肢の壊死が観察された(データ省略)。BALB/c系統のマウスはC57BL/6系統に比べ増殖因子に対する血管新生の感受性が高いことが報告(Rohan,M.R.et al.,FASEB J.14,871−876(2000))されていることを考え合わせると、これらの結果は、C57BL/6系統の救肢は血管新生に対する感受性よりもむしろ、側肢(collateral limb)の循環がより高いことによる可能性が示唆される。
上記の中度および重症虚血モデルを用いて、虚血筋および血清のVEGFおよびFGF2の内因的発現を調べた。手術2日後、C57BL/6マウスから各肢筋(全大腿筋および腓骨筋)および血清を採取し、組織をホモジェナイズまたは溶解後、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)に供した。組み換え蛋白質の合成は、ヒトVEGFまたはマウスFGF2用のQuantikine Immunoassay systems(R&D Systems Inc.Minneapolis,MN)を用いて説明書に従って定量した。全蛋白質濃度をprotein assay system(Bio−Rad Laboratories,Hertfordshire,UK)を用いて、Bradford法により決定し値を標準化した(Yonemitsu,Y.,et al.,Nature Biotech.18,970−973(2000))。
全大腿筋と腓骨筋との間に蛋白質濃度の有意な差は見られなかったことから、両者を各群に含めて解析を行った。興味深いことに、虚血手術は2つの虚血肢モデル(中度モデル:847.5±187.7pg/g muscle、重症モデル:895.4±209.5pg/g muscle、各n=12)において、未処理マウスのベースライン(489.7±108.6pg/g muscle、n=12)に比べ、FGF2蛋白質の濃度を有意に上昇させた(p<0.001)(図2)。一方、重症虚血群では虚血によるVEGF蛋白質の発現の上昇が見られたが、筋中において有意ではなかった(未処理:174.7±43.1、中度:119.2±53.4、および重症:242.5±244.3、n=12)。VEGFは組織の虚血でより強く発現が誘導される内皮増殖因子としてよく知られており(Shweiki,D.et al.,Nature 359,843−845(1992);Forsythe,J.A.,et al.,Mol.Cell.Biol.16,4604−4613(1996))、この結果はそれと一致しないように見える。そこで、VEGFが全身の循環系に放出される可能性を考え、血清中のVEGFレベルを測定した。すると予想通り、重症度に依存して血清中のVEGF蛋白質レベルの増加が観察されたが、血清中のFGF2は検出されなかった(図2右)。
本発明者らは、肢虚血は高分子または中分子量型のVEGFよりも、ヘパラン硫酸との相互作用能が低い低分子型のVEGFアイソフォーム(Cohen,T.,et al.,J.Biol.Chem.270,11322−11326(1995))を誘導すると予想した。これを確かめるため、VEGF188、164、144、および120を含むマウスVEGFのスプライシングフォーム(Burchardt,M.,et al.,Biol.Reproduct.60,398−404(1999))を識別できるプライマーセットを用いて、RT−PCRによりC57BL/6マウス雄(手術なし、中度虚血モデル、および重症虚血モデル)の手術1日後の大腿筋におけるVEGFアイソフォームの発現の解析を行った。プライマー対は以前記載(Burchardt,M.,et al.,Biol.Reproduct.60,398−404(1999))されたラットVEGFのエクソン1およびエクソン8用のものを利用し、マウスVEGFアイソフォームの配列に対応するフォワードプライマー(5’−TGC ACC CAC GAC AGA AGG GGA−3’/配列番号:17)およびリバースプライマー(5’−TCA CCG CCT TGG CTT GTC ACA T−3’/配列番号:18)を用いた。最も小さいマウスVEGFアイソフォーム(VEGF115)の検出には、上記と同様のフォワードプライマー、およびVEGF115特異的リバースプライマー(5’−CTA CCA AAA GTT TCC CAG GCA G−3’/配列番号:19)を用いた(Sugihara,T.et al.,J.Biol.Chem.273,3033−3038(1998))。RT−PCRの条件は文献と同様にして行った(Burchardt,M.,et al.,Biol.Reproduct.60,398−404(1999);Sugihara,T.et al.,J.Biol.Chem.273,3033−3038(1998))。
その結果、虚血に関連する内因性VEGFの発現は164アイソフォームのみ観察され、その他のアイソフォームの明確な発現は検出されなかった(図3)。さらに、既知のもっとも小さいアイソフォームであるVEGF115(Sugihara,T.et al.,J.Biol.Chem.273,3033−3038(1998))の発現をRT−PCRにより解析したが、検出することはできなかった。
[実施例2]マウス後肢への組み換えセンダイウイルスを介した筋中遺伝子導入のカイネティクス
カイネティクスの解析のため、まずホタルルシフェラーゼを用いて導入遺伝子の発現レベルと時間経過を調べた。ルシフェラーゼアッセイはルミノメーター(Model LB 9507,EG&G Berthold,Germany)を用いて文献に従って行った(Yonemitsu,Y.,et al.,Nature Biotech.18,970−973(2000))。データはrelativelight units(RLU)/mg proteinで表した。全蛋白質濃度をprotein assay system(Bio−Rad Laboratories,Hertfordshire,UK)を用いてBradford法により決定し、これによりルシフェラーゼアッセイの値を標準化した。重症虚血肢モデルでは明らかに肢筋が重度の破壊を受け、導入遺伝子の発現の低下が示唆されたため、中度虚血モデル(図1左)を用いて解析を行った。遺伝子の注入は、手術時に大腿筋および下腿筋、それぞれ2箇所に25μlずつ行った。以下の投与量はその合計を示す。マウス(C57BL/6マウス)(6〜8週齢,平均30g)に100μgのpCMV−luciferase(臨床用量のおよそ50倍の量)(Baumgartner,I.,et al.,Circulation 97,1114−1123(1998);Isner,J.M.,et al.,J.Vasc.Surg.28,964−973(1998))を投与したところ、遺伝子導入の2日後の測定では比較的高いルシフェラーゼ活性(平均±S.D.=5.1±3.9×106RLU/mg protein、n=6)を示したのに対し、107プラークフォーミングユニット(pfu)のSeV−luciferaseの投与ではその約5倍(2.4±3.8×107RLU/mg protein、n=12)、108pfuのSeVの投与では約120倍(7.3±4.7×108RLU/mg protein、n=6)の発現を示した(図4左)。
C57BL/6マウスの中度虚血モデルにルシフェラーゼ発現プラスミド(pCMV−luc)またはSeV−lucを上記と同様に投与し、導入遺伝子発現の時間経過を測定した。108pfuのSeV−luciferaseを筋中に投与したC57BL/6マウスの中度虚血モデルでも、時間経過と共に発現の低下が見られた(day 2:7.3±4.3×108RLU/mg protein、n=12、day 7:3.4±4.7×107RLU/mg protein、n=12、およびday 14:2.6±1.2×104RLU/mg protein、n=12)(図4右)。108pfuのSeV−luciferaseを筋中に投与したBALB/c nu/nu免疫不全マウスの中度虚血モデルにおけるルシフェラーゼ活性は、day 7まではC57BL/6マウスと同様の時間経過を示したが、後期においてもその発現が維持された(day 2:9.4±3.7×108RLU/mg protein、n=12、day 7:1.3±1.9×107RLU/mg protein、n=12、およびday 14:0.9±1.3×107RLU/mg protein、n=12)。
次に、in vitroにおける血管新生蛋白質の分泌を、筋肉系の初代ウシ血管平滑筋細胞(BSMCs)および心筋芽細胞(H9C2)に加え、初代ヒト臍帯血管内皮細胞(HUVECs)およびCOS7細胞を含む様々な培養細胞を用いて測定した。本実施例で用いたFGF2ベクター(SeV−FGF2)は蛋白質分泌のための古典的なシグナル配列を持たないが、本発明者らおよび他者の研究により、分泌配列を持たないFGF2でも細胞外に発現されることが報告されている(Piotrowicz,R.S.et al.,J.Biol.Chem.272,7042−7047(1997);Qu,Z.,et al.et al.,J.Histochem.Cytochem.46,1119−1128(1998);Florkiewicz,R.Z.et al.,J.Cell.Physiol.162,388−399(1995))。予想通り、用量依存的に培養上清中にFGF2蛋白質の効率的な分泌が検出され、そのレベルはVEGF165と同等であった[例えば、MOI=100では、VEGF165 vs FGF2=4,354±2,794 vs 3,682±1,063(HUVECの場合),275±58 vs 398±154(BSMCの場合);16,987±4,748 vs 5,976±381(H9C2の場合);38,648±4,913 vs 1,547,237±176,502(COS7の場合)、それぞれpg/105細胞/24時間、n=3](図5)。
[実施例3]in vivoにおけるSeVを介した血管新生因子の筋中発現のカイネティクス
C57BL/6マウスの中度虚血モデル(図1左)へのSeV−VEGF165、およびSeV−FGF2のin vivo筋中投与における血管新生因子の筋中発現を調べた。投与は大腿筋および腓骨筋のそれぞれ2箇所、25μlずつ26ゲージ注射針にて、手術時に一回のみ投与した。
血管新生因子のin vivo発現の結果は、in vitroの結果およびin vivoレポーター遺伝子の結果と比べ興味深いものであった。図6に示したように、SeV−FGF2を介した蛋白質合成は用量依存的に増加し、高力価のベクター導入では内因性遺伝子の発現の約100倍に達した(大腿筋:基底状態:429±79、虚血:974±150、106pfu:4,913±313、107pfu:13,469±12,611、および108pfu:46,703±12,092 pg/g muscle、各n=6、腓骨筋:基底状態:550±104、虚血:720±128、106pfu:1,376±158、107pfu:8,252±8,190、および108pfu:59,704±35,297pg/g muscle、各n=6)。SeV−FGF2投与群では、最も高い力価においても有意な血清FGF2は検出されなかった。これに対し、VEGF165の用量依存的な増加は、FGF2のそれに比べはるかに少なく、107pfuでも2倍に届かず、108pfuでは逆にSeV由来のヒトVEGF165蛋白質の発現はほとんど検出されなかった(大腿筋:基底状態:176±44、虚血:143±64、106pfu:159±67、107pfu:224±216、および108pfu:<5pg/g muscle、各n=6、腓骨筋:基底状態:173±45、虚血:95±28、106pfu:186±30、107pfu:172±101、および108pfu:<5pg/g muscle、各n=6)。内因性マウスVEGFの血清レベルは中度肢虚血では有意に増加したが(37.7±15.4pg/ml,n=6)、ベクター由来のヒトVEGF165は有意には検出されず、筋中で発現させたVEGF165は全身の循環系には拡散しないことが示唆される。
[実施例4]虚血により誘導される内因性VEGFの発現は血管新生遺伝子の導入により顕著に増強される
本発明者らは、VEGF165とFGF2の発現パターンの違いには、内因性VEGFの発現が関与しているのではないかと考えた。内因性VEGFの過剰な発現は、強すぎる透過性作用を介して組織の虚血を増悪させ、SeVからの転写を負に調節する可能性がある。またin vitroおよびin vivoにおいて、FGF2の血管新生作用は、部分的には内因性VEGFの発現の増強によりもたらされていることが示されている(Asahara,T.,et al.,Circulation 92,365−371(1995))。
そこで、外来的に導入した血管新生因子遺伝子により媒介される筋中での内因性マウスVEGF蛋白質合成の変化を、マウスVEGF特異的ELISA系を用いて調べた。図7に示したように、VEGF165ではなく、FGF2の遺伝子導入は、正常循環(手術なし)および中度虚血の両方の肢条件において筋中の内因性マウスVEGFレベルを顕著に上昇させた。重症肢虚血では、2つの血管新生因子の遺伝子導入の両者において、内因性マウスVEGFの発現を劇的に上昇させ、特にVEGFI65は虚血のみ(Mock)に比べ7倍程度まで上昇させた。
これをさらに詳細に調べるため、C57BL/6マウスの重症虚血モデルにおける血管新生因子の遺伝子導入による効果を組織学的に観察した(図8)。虚血手術後に偽導入を行った場合(mock)は、分散した密な筋線維(diffusely picnotic muscle fibers)は細胞内浮腫(intracellular edema)を伴い、2日後には炎症性の浸潤が見られた。これらの所見はVEGF165の遺伝子導入により顕著に増強された一方、FGF2の遺伝子導入では明らかに抑制された(図8)。
[実施例5]外来的に導入されたVEGF165は、急性重症虚血肢において救肢因子ではなく肢破壊因子として働く
上記の知見を基に、上記の中度および重症虚血肢モデルを用いて、in vivoにおける血管新生因子の遺伝子導入による治療効果を調べた。先に示したように、VEGF165では最も高い力価である108pfuの投与において導入遺伝子産物の産生が見られなかったことから、107pfuのウイルス投与によりin vivo治療効果を観察した。ここで、肢の壊死の程度を4段階の救肢スコアに分類した(Limb Salvage Score;LSS)。LSS=4:完全な救肢(complete limb salvage)、LSS=3:足蹠から先の壊死(limb necrosis below heel)、LSS=2:膝から先の壊死(limb necrosis below knee)、LSS=1:膝より上までの壊死(limb necrosis above knee)、およびLSS=0:鼠径靭帯周辺からの全下肢脱落(total auto amputation around the inguinal ligament)。この分類に基づき、まずSeVを介した血管新生因子の発現の毒性をC57BL/6マウスの重症虚血肢の救肢モデルを用いて調べた。血管新生遺伝子の導入は実施例2と同様に行った。
虚血術の2日前にベクターの注入を行った場合、全ての群で全ての肢が完全に維持された(データ省略)。手術時にベクターの注入を行った場合、VEGF165投与群以外は、FGF2投与群を含め、全ての群のマウスで完全に救肢された(%LLS=100%)。しかしながら、図9および10に示したように、VEGF165投与マウスでは肢が脱落する個体が観察された(5/10は肢脱落した。%LLS=52.2%,他の群と比べた場合p<0.0001)(図10A)。この結果から、VEGF165の遺伝子導入による肢破壊効果が示唆される。次に、BALB/c nu/nuマウスの重症虚血モデル(脱落肢モデル)を用いて、血管新生因子の遺伝子治療の効果を検証した。その結果、SeV−FGF2投与はnu/nuマウスの肢脱落を有意に抑制した(2/10が肢脱落,%LLS=77.5%)のに対し、SeV−VEGF165の投与(8/10が肢脱落,%LLS=15.0%)は、ルシフェラーゼ発現SeVの投与(5/6が肢脱落,%LLS=16.7%)と同様、後肢の予後を改善させなかった(図10B)。この結果は、FGF2の遺伝子導入が救肢効果を持つことを明確に示している。
次に、重症虚血手術を行った左足の血流の回復に対する筋肉内遺伝子導入処置による効果をレーザードップラー灌流像解析により測定した(Couffinhal,T.,et al.,Am.J.Pathol.152,1667−1679(1998);Murohara,T.,et al,J.Clin.Invest.105,1527−1536(2000))。遺伝子導入の条件は、前述の図10A(救肢モデル)と全く同じ条件とし、C57BL/6マウスの重症虚血モデル(救肢モデル)を用いた。虚血肢(左)/正常肢(右)の血流比の測定を、レーザードップラー灌流像(laser Doppler perfusion image;LDPI)解析機(Moor Instruments,Devon,UK)を用いて文献に従って行った(Couffinhal,T.,et al.,Am.J.Pathol.152,1667−1679(1998);Murohara,T.,et al,J.Clin.Invest.105,1527−1536(2000))。具体的には、体温によるデータの変動を最小限に抑えるため、レーザースキャニングを行う前に、マウスを37℃の恒温板に置いた。予め決めた時間(実験前および手術後2、4、7、および10日)に、それぞれの個体の目的の部位(肢および足)を2回連続してスキャニングを行った(図11)。2回のスキャニングで本質的な違いは見られなかった。レーザースキャニング後、保存した画像をコンピュータによる血流量の測定にかけ、虚血および非虚血足の平均血流量を算出した。周囲の光や温度の影響によるデータの変動を抑えるため、LDPIインデックスは右肢(非虚血)の血流値に対する左肢(虚血)の血流値の比として表した。
SeV−luciferase(Mock)およびSeV−FGF2の投与は、いずれも4日目において大腿上部周辺に明らかな血流が検出され、特にFGF2投与群では4、7、および10日目において腓骨筋への有意な血流が見られ、同時期のluciferase投与群では大腿筋に限られた血流が見られたのと差が見られた(図11)。代表的な結果では、luciferase投与群の肢は軽度の萎縮(mildly atrophic limb)を起すものがあった一方、FGF2投与群のほとんどの肢は障害を示さなかった。これらとは対照的に、VEGF165投与マウスは大腿筋にほとんど血流が見られず、下肢脱落を起した(図11)。SeV−VEGF165を投与された全てのマウスは、少なくとも膝レベルにおいて肢を失った。以下に、それぞれの投与群における肢血流の観察結果を詳述する。
1.SeV−luciferaseを投与した個体
手術直後は左下肢の血流はほとんど見られなかった。次第に血流が回復し、4日目頃には大腿部の中央付近まで血流の回復が見られた。しかし10日目までこの個体の下腿までの血流は回復しなかった。結果として、パネル右端に示したように下肢は腐らなかったが、やや萎縮していた。同様の個体は1/3程度で観察された。これよりも回復が進んだ例も認められた。
2.SeV−VEGF165を投与した個体
上記と同様に、手術直後はほとんど血流が消失した。以後、経時的に観察しても大腿部の血行の回復はほとんど認めず、結果としてパネル右端に示したように大腿の中程より下肢が脱落した。10個体の全例で全く同様の結果を得た。
3.SeV−FGF2投与個体
上記と同様に、手術直後の左下肢の血流ははほとんど消失した。血流の消失範囲はSeV−luciferaseを投与した個体と同程度であった。4日目頃から強い血流(赤いスポットで示される)が大腿部に現われ、7日目には既に弱いながら下腿の血行が認められた。10日目には、僅か(青で示される)ながら左下肢全体に有意な血行が認められ、結果として、パネル右端に示したように下肢は外見上全く正常のまま維持された。
各群において、ドップラー像に基づく大腿筋の血流を統計学的に比較した。図12に示したように、SeV−FGF2投与マウスは、SeV−luciferase投与マウスに比べ、肢血流の生理的回復時の血流は有意に高い値を示した。これに対し、SeV−VEGF165投与マウスの大腿筋の血流は低い値に留まり、手術後7日目以降は多くの動物で下肢中央部またはそれより上部から肢が脱落した。
[実施例6]複製能欠損型センダイウイルスベクターを用いた急性虚血肢治療
1.血管新生遺伝子搭載F欠失型センダイウイルスゲノムcDNAの構築
センダイウイルス(SeV)の全長ゲノムcDNAを含むpSeV18+b(+)(Hasan,M.K.et al.,J.Gen.Virol.78,2813−2820,1997)からF遺伝子を欠失させたプラスミドpSeV18+/ΔF(WO00/70055およびWO00/70070参照)のF遺伝子の欠損部位にEGFP遺伝子を搭載したプラスミド(pSeV18+/ΔF−GFP)を構築するため、まずEGFP遺伝子のPCRによる増幅を行なった。EGFP遺伝子断片の塩基数を6の倍数(Hausmann,S.et al.,RNA 2,1033−1045,1996)に合わせるため、5’末端はNsi−tailedプライマー(5’−atgcatatggtgatgcggttttggcagtac/配列番号:9)、3’末端はNgoMIV−tailedプライマー(5’−tgccggctattattacttgtacagctcgtc/配列番号:10)を用いてPCRを行った。PCR産物を制限酵素MsiIとNgoMIVで消化してゲルから断片を回収し、pUC18/dFSSのF欠失部位にあるNsiIとNgoMIVという制限酵素部位に連結し、シークエンスを確認した。ここからEGFP遺伝子を含むDraIII断片を回収し、pSeV18+のF遺伝子を含む領域のDraIII断片と置き換え、ライゲーションしてpSeV18+/ΔF−GFPを得た。ただし、pSeV18+/ΔFの場合は、F遺伝子のEIS配列(SeV特異的配列、E;end,I;intergenic,S;start)が残存し、下流のF遺伝子のORFは除かれているものの、この部位の連結に用いたプライマー由来の5アミノ酸ペプチドが発現する可能性のある構造になっている。またpSeV18+/ΔF−GFPの場合はGFPが共発現するので、そのペプチド及びGFPが共発現する可能性のないベクターの構築を行った。そのためには下記の様に組み換えを行なった。
pSeV18+/ΔF−GFPをSalIとNheIで消化してF欠損部位を含む領域の断片(6288bp)を回収し、Litmus38(New England Biolabs,Beverly,MA)にクローニングし、LitmusSalINheIfrg/ΔF−GFPとした。欠損させたF遺伝子上流のEIS配列を含むEGFP遺伝子の欠損はInverse PCR法により行なった。すなわち、GFP遺伝子上流で制限酵素SexAIの認識配列をデザインしたreverseプライマー(5’−gtttaccaggtggagagttttgcaaccaagcac/配列番号:11)とGFP遺伝子下流で制限酵素SexAIの認識配列をデザインしたforwardプライマー(5’−ctttcacctggtacaagcacagatcatggatgg/配列番号:12)でPCRを行ない、目的の大きさの断片(10855bp)を切り出してそのままライゲーションを行ない、欠損させたF遺伝子上流のEIS配列を含むEGFP遺伝子を欠失させた。
この場合、プライマーデザイン上のSexA1に挟まれた配列15bpが余分に挿入されている。そこで、プラスミドを大腸菌SCS110株にトランスフォームして調製し(SexA1はメチル化の影響を受け切断出来なくなるのでdcm−/dam−のSCS110株を利用した)、制限酵素SexA1で消化後、1628bp及び9219bpの2つの遺伝子断片を回収してライゲーションを行ない、余分な15bpを欠失させ、6の倍数でF遺伝子上流のEIS配列を含むEGFP遺伝子を欠失させたLitmusSalINheIfrg/ΔF(Δ5aa)を調製した。このプラスミドをSalI及びNheIで消化して断片を回収し、pSeV18+のF遺伝子を含む領域のSalI/NheI断片と置き換え、ライゲーションしてプラスミドpSeV18+/△F(Δ5aa)を得た。このプラスミドへの血管新生遺伝子(例としてヒトFGF2を用いた)挿入は、NP遺伝子の前に位置する制限酵素NotIの認識配列を利用して以下のように行った。
2.hFGF2遺伝子搭載F欠失型センダイウイルスゲノムcDNAの構築
ヒトのFGF2(hFGF2)cDNAは、患者本人の了承を得て採取したヒト大伏在静脈から分離した血管平滑筋細胞よりRT−PCRにて分離し、pBluescriptSK+(Stratagene,La Jolla,CA)のHindIII(5’末端)、EcoRI(3’末端)にサブクローニングして調製した。その際、hFGF2 cDNAの遺伝子配列はAbrahamらの報告(Abraham,J.A.et al.,EMBO J.5(10),2523−2528,1986)と同一であることを確認した。
pSeV18+/ΔF(Δ5aa)のNP遺伝子の前に位置する制限酵素NotIの位置にhFGF2遺伝子を挿入するために、まずhFGF2遺伝子の3’端側にSeV特異的配列(EIS配列)を付加して両端にNotI認識配列を有するフラグメントを調製した。具体的には、上記hFGF2 cDNAを鋳型にして、開始コドンを含むN末端側プライマー(5’−atccgcggccgccaaagttcacttatggcagccgggagcatcaccacgctgcccgccttgcccgaggatggcggcagcggcgcc/配列番号:13)および終止コドン領域とEIS配列とを含むC末端側プライマー(5’−atccgcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggtcagctcttagcagacattggaagaaaaagtatagc/配列番号:14)を用いてPCRを行ない、NotI消化後、pBluescriptSK+(Stratagene,La Jolla,CA)のNotI部位にサブクローニングしてpBS−hFGF2を調製し、塩基配列を確認した。pBS−hFGF2をNotIで消化後、hFGF2 cDNAを含む断片をpSeV18+/ΔF(Δ5aa)のNP遺伝子の前に位置するNotI部位に挿入し、hFGF2遺伝子搭載F欠失型センダイウイルスゲノムcDNA pSeV18+hFGF2/ΔF(Δ5aa)を構築した(pSeV18+hFGF2/ΔF(Δ5aa)は、pSeV18+hFGF2/ΔFとも表記する)。また、複製能を有するウイルスcDNAをコードするpSeV18+b(+)のNotI部位にもhFGF2 cDNAを含むNotI断片を挿入し、pSeV18+hFGF2を構築した。pSeV18+hFGF2からは、公知の方法(Hasan,M.K.et al.,J.Gen.Virol.78:2813−2820,1997;Kato,A.et al.,1997,EMBO J.16:578−587;Yu,D.et al.,1997,Genes Cells 2:457−466)によりヒトFGF2を発現する複製型SeVベクターを調製し、SeV−hFGF2とした。
3.F欠失SeVウイルスの再構成及び増幅
センダイウイルスのF遺伝子(SeV−F)をCre DNAリコンビナーゼにより誘導的に発現するF発現ヘルパー細胞(LLC−MK2/F;WO00/70055およびWO00/70070参照)を用いて、F欠損SeVベクターの再構築を行った(SeV−F遺伝子誘導発現前の該細胞をLLC−MK2/Fと表記し、誘導発現後の細胞をLLC−MK2/F/Adと表記する)。LLC−MK2細胞を5×106cells/dishで直径10cmのペトリ皿に蒔き、24時間培養後、ソラレンと長波長紫外線(365nm)で20分間処理したT7 RNAポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス(Fuerst,T.R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,8122−8126,1986)に室温で1時間感染させた(moi=2)。ワクシニアウイルスへの紫外線照射には、15ワットバルブ5本が装備されたUV Stratalinker2400(カタログ番号400676(100V),Stratagene,La Jolla,CA,USA)を用いた。細胞を2回洗浄して、プラスミドpSeV18+hFGF2/ΔF、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L(Kato,A.et al.,Genes Cells 1,569−579,1996)およびpGEM/F−HN(WO00/70070)をそれぞれ12μg、4μg、2μg、4μgおよび4μg/dishの量比でOptiMEM(GIBCO)に懸濁し、SuperFect transfection reagent(1μg DNA/5μlのSuperFect、QIAGEN)を入れて混合し、室温で15分間放置後、最終的に3%FBSを含むOptiMEM 3mlに入れ、細胞に添加して培養した。3〜5時間培養後、細胞を血清を含まないMEMで2回洗浄し、シトシンβ−D−アラビノフラノシド40μg/ml(AraC、Sigma)およびトリプシン7.5μg/ml(GIBCO)を含み、血清を含まないMEMで24時間培養した。
培養上清を除き、上記でクローニングしたF発現ヘルパー細胞LLC−MK2/F/Ad細胞を重層した。具体的には血清を含まないMEM(40μg/ml AraC、7.5μg/mlトリプシンを含む)に分散したLLC−MK2/F/Ad細胞を、培養上清を除いた細胞に重層し、48時間培養を継続した。スクレイパーにてこれらの細胞を回収し、ペレットをOptiMEMに懸濁し(107cells/ml)、凍結融解を3回繰り返し行った。このライセートをLLC−MK2/F/Ad細胞(4×106cells/well 12−well−plate)にかけ(200μl/well)、さらに300μl/wellの血清を含まないMEM(40μg/ml AraC、7.5μg/mlトリプシンを含む)を添加し、15〜24時間培養した。培養上清を除き、血清を含まないMEMで洗浄後、新たな血清を含まないMEM(40μg/ml AraC、7.5μg/mlトリプシンを含む)を添加し、5〜9日間培養を行い上清を回収した。回収した上清をLLC−MK2/F/Ad細胞へ感染し、同じように血清を含まないMEM(40μg/ml AraC、7.5μg/mlトリプシンを含む)で培養を行うことでF欠失型SeVを増幅した。
その際、F欠失型SeV粒子が含まれている培養上清を、0.22μmのフィルターに繰り返し2回通すことで、再構成時のT7 RNAポリメラーゼの発現に利用したリコンビナントワクシニアウイルスの混入を除去した。具体的には、2回以上AraCを含み血清を含まないMEM(40μg/ml AraC、7.5μg/mlトリプシンを含む)で増幅した培養上清(P2以降のサンプル)について0.22μmのフィルターに2回通し、更に1回AraCを含み血清を含まないMEM(40μg/ml AraC、7.5μg/mlトリプシンを含む)で増幅した培養上清を回収し、リコンビナントワクシニアウイルスの混入を回避して増幅したF欠失型SeV(SeV−hFGF2/ΔF)を得た。
4.複製型および複製能欠失型ヒトFGF2発現SeVベクターを用いた虚血肢遺伝子治療
実施例1に記載のBALB/c nu/nuマウス重症虚血モデル(脱落肢モデル)を用いて、複製型および複製能欠失型ヒトFGF2発現SeVベクターの投与による治療効果を検証した。血管新生遺伝子の導入は実施例2と同様に行った。ベクターの注入は手術時に行った。手術後の肢脱落を観察し、各時点における救肢率(肢が残っている個体の割合)を算出した(図13)。
対照のルシフェラーゼ発現SeV(SeV−luciferase)を投与したマウスでは、非投与マウスと同様に高い頻度で肢が脱落した。これに対し、ヒトFGF2発現ベクター(SeV−hFGF2およびSeV−hFGF2/ΔF)を投与した場合は肢脱落を有意に抑制した。本実施例により、ヒトFGF2を発現するパラミクソウイルスベクターが虚血治療のため血管新生遺伝子として高い効果を有することが示された。さらに、複製能欠失型パラミクソウイルスベクターが虚血治療に有効であることを実証した。
産業上の利用の可能性
本発明により、虚血組織を標的とした遺伝子治療のための基盤技術が提供された。これにより、虚血組織の血管新生を効果的に誘導し、壊死を防止することが可能となる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、中度(左)および重症(右)のマウス急性後肢虚血の手術手順の模式図である。分枝した線は後肢の動脈および静脈を示す。血管の切除部位を短い太い線で示した。
図2は、後肢虚血に伴う筋中(左)および血清(右)での内因性VEGF(黒)およびFGF2(白)の発現を示す図である。C57BL/6マウスの中度および重症虚血モデルを用いた。手術2日後に全大腿筋および腓骨筋(n=6)および血清(n=6)を採取し、ELISAに供した。値はそれぞれ筋の全抽出蛋白質または容量で標準化し、平均±S.D.で表した。筋の値は大腿筋および腓骨筋の両者のデータを含む(従って各群n=12)。平均の値を図に示した。*p<0.01、#p<0.05(一元配置分散分析による解析)。
図3は、虚血によるVEGFの発現の誘導をRT−PCRを用いて調べた結果を示す写真である。
図4は、SeVを介した筋中へのホタルルシフェラーゼ遺伝子の遺伝子導入における発現レベル(左)および時間経過(右)を示す図である。C57BL/6マウスの中度虚血モデルにおいて、未処理、pCMV−luc(100μg)投与、またはSeV−luc(107pfuまたは108pfu)投与によるルシフェラーゼ活性を調べた(左)。右パネルは中度虚血モデルへのルシフェラーゼ遺伝子の導入における発現レベルの時間経過を示す。白丸:C57BL/6マウスへのpCMV−luc(100μg)投与、濃い丸:C57BL/6マウスへのSeV−luc(108pfu)投与、薄い丸:BALB/c nu/nuマウスへのSeV−luc(108pfu)投与。太い線は導入遺伝子発現が有意となるカットオフ(cut−off)値を表す。各グラフとも、遺伝子発現のレベルは同じスケールを用いている。logスケールであることに注意。
図5は、in vitroにおける血管新生蛋白質の分泌を、ヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)、COS7細胞、ウシ血管平滑筋細胞(BSMC)、および心筋芽細胞(H9C2)を用いて測定した結果を示す図である。「ベーサルな放出(basal release)」は、ベクターなしにおける各因子の産生量を表す。導入遺伝子由来の発現が有意となるレベルをカットオフ(cut−off)値として示した。
図6は、C57BL/6マウスの中度の虚血肢に外来的に導入したFGF2(a)およびVEGF(b)遺伝子の筋中(左)および血清(右)でのin vivoの発現を示す図である。手術後直ぐにそれぞれのベクター溶液50μlを大腿筋および腓骨筋に注入した。手術2日後に全大腿筋および腓骨筋(n=6)および血清(n=6)を採取し、マウスFGF2(a)、ならびにマウスおよびヒトVEGF(b)のELISAに供した。値はそれぞれ筋の全抽出蛋白質または容量で標準化し、平均±S.D.で表した。平均の値を図に示した。logスケールであることに注意。
図7は、遺伝子導入による内因性マウスVEGFの発現増強を示す図である。手術なし(左)、中度虚血(中央)、および重症虚血(右)のC57BL/6マウスの肢筋中における内因性マウスVEGFの発現の遺伝子導入による増強を示す。手術の直後に、50μlの各ベクター溶液を大腿筋および腓骨筋に注入した。手術2日後に全大腿筋および腓骨筋および血清(各n=6、全部でn=12)を採取し、マウスVEGFのELISAに供した。値は筋の全抽出蛋白質で標準化し、平均±S.D.で表した。平均の値を図に示した。*p<0.01、#p<0.05(一元配置分散分析による解析)。
図8は、遺伝子導入によるマウス肢筋の組織像を示す写真である。C57BL/6マウスを重症虚血手術に供し、図7と同様に処理して、手術2日後に組織学的観察を行った。未処理動物(左上;非虚血(no ishemia))に比べ、明確な炎症性浸潤およびストローマ細胞の浮腫が偽投与(SeV−luciferase;mock)の大腿筋(右上)において認められた。重篤な筋線維の破壊、細胞内浮腫、および炎症性浸潤がVEGF165処理動物で観察された(左下;VEGF165)。これらの傷害は、FGF2遺伝子導入により抑制された(右下;FGF2)。各群とも6個体を用い、同様の結果を得た。ヘマトキシリン・エオシン染色。オリジナル倍率×200。
図9は、左後肢に手術して10日後における重症虚血マウスの筋中への血管新生因子遺伝子の外来導入の治療または増悪効果を示す写真である。各図に救肢スコア(limb salvage score;LSS)を示した。上段はC57BL/6マウスの重症虚血モデル[救肢モデル(limb salvage model)]における典型的な増悪効果を示す。VEGF165を導入したマウスは全肢が脱落(中央上パネル)したが、ルシフェラーゼの対照(左上パネル)およびFGF2処理マウス(右上パネル)は救肢された。下段はBALB/c nu/nuマウスの重症虚血モデル[下肢脱落モデル(auto−amputation model)]における典型的な治療効果を示す。FGF2処理したマウスは救肢され(右下パネル)たが、ルシフェラーゼの対照(左下パネル)およびVEGF165処理マウス(右下パネル)では後肢がほぼ全て脱落した。
図10は、救肢モデルおよび脱落肢モデルにおけるベクター投与後の後肢の予後曲線を示す図である。投与個体中で肢が残っている個体の割合(救肢率)を示した。血管新生遺伝子の筋中への遺伝子導入により、Aに示されたC57BL/6マウスの重症虚血モデル(救肢モデル)ではVEGF165の増悪効果が、Bに示されたBALB/c nu/nuマウスの重症虚血モデル(下肢脱落モデル)ではFGF2の治療効果が示されている。各群は3回の別々の実験を行った(n=10)。曲線はKaplan−Mayer法による。データはlog−rank検定により解析した。*p<0.0001。
図11は、C57BL/6マウスの重症虚血(救肢モデル)を用いて、in vivoにおける血管新生効果をレーザードップラー灌流像解析により測定した結果を示す写真である。SeV−luciferase、SeV−VEGF165、およびSeV−FGF2を107pfuで投与して、血液の灌流の回復を観察した。各群は同一個体の時間経過を示す。上段は、SeV−luciferase処理マウス(Mock transfection)の血流回復の時間経過の典型的な結果を示す。大腿筋の血液再灌流は手術4日後から認められ、7日目には明確に観察された。しかし、10日目でも下腿部の明確な灌流は検出されず、肢は萎縮し指の壊死の徴候が見られた(一番右のパネル)。中段はSeV−VEGF165処理マウスの典型的な時間経過を示す。大腿部および下腿部において、観察期間中、明確で有意な再灌流は認められず、肢は脱落した(一番右のパネル)。下段は、SeV−FGF2処理マウスの典型的な時間経過を示す。4日目までに大腿部で明確な再灌流を認め、10日目までには肢全体で有意な血流が見られ、完全に救肢された(一番右のパネル)。
図12は、C57BL/6マウスの重症虚血(救肢モデル)における血管新生遺伝子治療による血液灌流の回復を示す図である。図11と同様の実験における虚血肢および非虚血肢の平均血流量を算出し、右肢(非虚血)の血流値に対する左肢(虚血)の血流値の比として表した。*p<0.01(他の全ての群との比較において)、#p<0.05(他の全ての群との比較において)、##p<0.05[偽投与群(mock)との比較において]。
図13は、マウス重症虚血モデル(脱落肢モデル)におけるhFGF2遺伝子搭載複製型SeVベクターまたはhFGF2遺伝子搭載F欠失型SeVベクター投与による救肢率の経時的観察結果を示す図である。実験個体数(n)およびベクターの投与量は図中に示した。
Claims (5)
- 線維芽細胞増殖因子2(FGF2)遺伝子を含むセンダイウイルスベクター。
- F遺伝子を欠損している、請求項1に記載のセンダイウイルスベクター。
- 請求項1または2に記載のセンダイウイルスベクターまたは該ベクターを含む細胞、並びに薬学的に許容できる担体を含む、血管新生を促進するための組成物。
- 虚血組織を処置するための、請求項3に記載の組成物。
- 筋中投与用である、請求項3又は4に記載の組成物。
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