CN102272301A

CN102272301A - 用于治疗阿尔茨海默病的载体

Info

Publication number: CN102272301A
Application number: CN200980153253XA
Authority: CN
Inventors: 井上诚; 佐伯晃一; 游军; 田畑寿晃; 岩崎仁; 朱亚峰; 长谷川护
Original assignee: Dnavec Corp
Current assignee: Dnavec Corp
Priority date: 2008-10-31
Filing date: 2009-10-30
Publication date: 2011-12-07
Also published as: WO2010050585A1; US20120087940A1; JPWO2010050585A1

Abstract

本发明提供用于高效诱导抗Aβ抗体以及预防和治疗阿尔茨海默病的方法。通过施用表达AB5毒素B亚基与Aβ抗原肽的融合蛋白质的RNA病毒载体，成功地以非常高的效率诱导了抗Aβ抗体。通过该载体的施用，血浆中的抗Aβ抗体显著提高，脑组织中Aβ量和抗Aβ抗体阳性的占有面积降低。根据本发明，能够提供以阿尔茨海默病的预防和治疗为目的的有效率的基因疫苗疗法。

Description

用于治疗阿尔茨海默病的载体

技术领域

本发明涉及以高效率地诱导抗Aβ抗体以及预防和治疗阿尔茨海默病为目的的新的基因导入载体和包含该载体的主动免疫用疫苗等。

背景技术

伴随着进入所谓老龄化社会，神经变性疾病患者的人数逐渐增加，例如人数据称日本为100万人、美国为450万人。全世界阿尔茨海默病患者估计为1500万人以上，而且可以预想，今后20年间患者人数将达到上述的2倍以上。虽然存在数种治疗药物，但仍然希望开发可适用于病情进展阶段的治疗方法、或者能在早期有效阻断其进展的治疗方法、以及预防发病本身的方法等，对新的治疗方法的社会性需求非常高。

作为阿尔茨海默病的发病机制的一种主要假说是“淀粉样蛋白级联假说”，其将淀粉样蛋白β(Aβ)的聚集和沉积引起的老年斑形成作为原因。以该假说为基础，以Aβ为靶标的疫苗疗法作为针对阿尔茨海默病的新治疗方法受到了关注，并且人们认为为了其有效性，体液免疫(抗Aβ抗体)的诱导是重要的。实际上，有报导称，通过将经聚集的Aβ肽与佐剂一起施用时，模型小鼠中脑的淀粉样蛋白沉积减少(Schenk D，等，Nature 400：173-177，1999)。

以上述这些结果为基础，Elan公司和Wyeth公司进行了将合成Aβ肽(AN-1792：Aβ42)与佐剂(QS21)一起施用的临床试验，并确认约20％受试者中血清中的抗Aβ抗体水平提高(Hock C，等，Nat.Med.8：1270-1275，2002)，还报导了高级脑功能的改善(Hock C，等，Neuron 38：547-554，2003)，而且还有报导称，在长期观察中也能够确认有效性(Gilman S.等，Neurology 64，1553-1562，2005)。但是，有报导称，在将合成Aβ肽与佐剂组合的疫苗疗法中，有发生脑膜脑炎的情况(Orgogozo JM，等，Neurology 61：46-54，2003)，而根据具有脑膜脑炎的脑的病理学组织分析可见，在少数病例中，在新皮质中的老年斑后，观察到星形胶质细胞的增殖和变性轴索的消失。关于脑膜脑炎的发病原因，可以推测如下：在一部分患者中，疫苗疗法中所需的佐剂诱导了细胞免疫，结果与Aβ或APP反应的Th1型CD4阳性T细胞浸润至脑内，由此引起实验性变态反应性脑脊髓炎样的脑膜脑炎。疫苗疗法本身被认定是有效的。因此希望开发不导致脑膜脑炎的更安全的接种技术。

作为抑制脑膜脑炎(副作用)的方法之一，提出了仅利用预计不含T细胞表位的Aβ肽的N末端部分的方法，并进行了评价。已经开发出将Aβ1-7肽与Th2型的佐剂(CRM197：非毒性白喉毒素变体)一起使用的免疫方法，且验证了其有效性(Vaccine ACC-001，Wyeth公司)。此外，关于Aβ1-15肽的评价也有报导，显示Aβ1-15肽作为免疫原比Aβ42要弱(Leverone JF等，Vaccine.21，2197-206，2003)。但证明使用Aβ1-15的树状聚体能够提高抗Aβ抗体效价(Seabrook TJ等，J Neuroinflammation.3，14，2006、Seabrook TJ等，Neurobiol Aging.28，813-23，2007)。此外还显示Aβ1-15的2重串联型可稍微提高抗Aβ抗体效价，而且在模型小鼠中有效(Maier M等，J Neurosci.26，4717-4728，2006)。

如上所述，作为用于提高安全性的方法之一，可以认为仅利用Aβ肽的N末端部分是有效的。但其作为免疫原的功能弱。需要将对结构、佐剂、施用方法的改进结合起来加以利用。

此外，还实施了基于直接施用针对Aβ的抗体的被动免疫法(Bard F，Cannon C，Barbour R等，Nat.Med.6：916-919，2000)的临床试验(bapineuzumab＝AAB-001，Elan和Wyeth公司；RN-1219，Rinat/Pfizer公司；LY-2062430，Eli Lilly公司)。该方法中理论上不会诱导T细胞的反应。因此，不会像AN1792中观察到的那样导致脑膜脑炎。但是，在被动免疫中，因长时间施用大量抗体而引起的抗独特型抗体的出现、以及淀粉样蛋白沉积于血管而引起的出血倾向令人担心。

另一方面，还进行了基因免疫接种的研究。已经报导了利用质粒(Qu B，Boyer PJ，Johnston SA等，JNeurol Sci.244：151-158，2006、Okura Y，MiyakoshiA，Kohyama K等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：9619-9624，2006)、腺病毒载体(Kim HD，Cao Y，Kong FK等，Vaccine 23：2977-2986，2005、Kim HD，Tahara K，Maxwell JA等，J Gene Med.9：88-98，2007)、腺伴随病毒载体(ZhangJ，Wu X，Qin C等，Neurobiol Dis.14：365-379，2003、Hara H，Monsonego A，Yuasa K等，J Alzheimers Dis.6：483-488，2004)等的例子。但是，其在效果上尚有不足。

如上所述，虽然疫苗疗法本身被认定为是有效的，但未见能提供更安全有效的疫苗技术的例子，目前的状况是仍然强烈希望进行其开发。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Schenk D.等，Nature 400：173-177，1999

非专利文献2：Hock C.等，Nat.Med.8：1270-1275，2002

非专利文献3：Hock C.等，Neuron 38：547-554，2003

非专利文献4：Gilman S.等，Neurology 64，1553-1562，2005

非专利文献5：Orgogozo JM.等，Neurology 61：46-54，2003

非专利文献6：Leverone JF.等，Vaccine.21，2197-206，2003

非专利文献7：Seabrook TJ.等，J Neuroinflammation.3，14，2006

非专利文献8：Seabrook TJ.等，Neurobiol Aging.28，813-23，2007

非专利文献9：Maier M.等，JNeurosci.26，4717-4728，2006

非专利文献10：Bard F.等，Nat.Med.6：916-919，2000

非专利文献11：Qu B.等，JNeurol Sci.244：151-158，2006

非专利文献12：Okura Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：9619-9624，2006

非专利文献13：Kim HD.等，Vaccine 23：2977-2986，2005

非专利文献14：Kim HD.等，J Gene Med.9：88-98，2007

非专利文献15：Zhang J.等，Neurobiol Dis.14：365-379，2003

非专利文献16：Hara H.等，J Alzheimers Dis.6：483-488，2004

发明内容

发明所要解决的问题

本发明正是鉴于上述状况而提出的，本发明所要解决的问题提供高效率地诱导抗Aβ抗体的方法、以及以治疗或者预防阿尔茨海默病为目的的更安全有效的免疫疗法。

解决问题的方法

本发明人为解决上述问题进行了深入的努力，旨在开发使用表达Aβ的RNA病毒载体的疫苗疗法。在该过程中本发明人发现，通过组合使用表达AB5毒素B亚基与淀粉样蛋白β肽的融合蛋白质的核酸与RNA病毒载体的疫苗疗法，能够诱导显著高效价的针对Aβ的抗体。特别是，与传统的治疗方法相比，表达含淀粉样蛋白β肽Aβ1-15的融合蛋白质的RNA病毒载体显示出显著有效的治疗效果。与本发明人先前报导的淀粉样蛋白β表达载体相比(WO2006/112553)，该病毒载体能够实现Aβ表达水平的显著提高、并且保证作为有效性的指标之一的抗Aβ抗体的表达。此外，所开发的治疗方法未观察到采用传统的Aβ肽和佐剂的组合进行免疫时造成问题的脑膜脑炎。这提示该治疗方法能够保证安全性。

即，本发明涉及编码AB5毒素B亚基与淀粉样蛋白β抗原肽之间的融合蛋白质的RNA病毒载体、利用该载体进行抗Aβ抗体(体液免疫)的诱导、和使用该载体预防和治疗阿尔茨海默病等。更具体地，本发明涉及：

〔1〕编码AB5毒素B亚基与淀粉样蛋白β抗原肽之间的融合蛋白质的RNA病毒载体。

〔2〕〔1〕所述的载体，其中，AB5毒素B亚基是霍乱毒素B(CTB)。

〔3〕〔1〕或〔2〕所述的载体，其中，淀粉样蛋白β抗原肽包含1个或多个拷贝的Aβ1-15或其片段。

〔4〕〔3〕所述的载体，其中，淀粉样蛋白β抗原肽具有1～8个拷贝的Aβ1-15或其片段连接在一起的结构。

〔5〕〔4〕所述的载体，其中，淀粉样蛋白β抗原肽具有4～8个拷贝的Aβ1-15连接在一起的结构。

〔6〕〔1〕～〔5〕中任一项所述的载体，其中，RNA病毒载体是负链RNA病毒载体。

〔7〕〔6〕所述的载体，其中，负链RNA病毒载体是副粘病毒载体。

〔8〕〔7〕所述的载体，其中，副粘病毒载体是仙台病毒载体。

〔9〕包含〔1〕～〔8〕中任一项所述的载体和药学上可接受的担载体的组合物。

〔10〕用于抗Aβ抗体的诱导的〔9〕所述的组合物。

〔11〕用于预防或治疗阿尔茨海默病的〔9〕或〔10〕所述的组合物。

〔12〕用于预防或治疗阿尔茨海默病的药物，其包括〔1〕～〔8〕中任一项所述的载体。

〔13〕〔1〕～〔8〕中任一项所述的载体在制造用于诱导抗Aβ抗体的组合物中的用途。

〔14〕〔1〕～〔8〕中任一项所述的载体在制造用于预防或治疗阿尔茨海默病的组合物中的用途。

〔15〕〔13〕或〔14〕所述的用途，其中，利用包含淀粉样蛋白β抗原的蛋白质或编码该蛋白质的载体进行加强免疫。

〔16〕〔15〕所述的用途，其中，包含淀粉样蛋白β抗原的蛋白质是AB5毒素B亚基与淀粉样蛋白β抗原肽的融合蛋白质。

〔17〕诱导抗Aβ抗体的方法，其包括施用包含〔1〕～〔8〕中任一项所述的载体或包含该载体和药学上可接受的担载体的组合物的步骤。

〔18〕预防或治疗阿尔茨海默病的方法，其包括施用〔1〕～〔8〕中任一项所述的载体或包含该载体和药学上可接受的担载体的组合物的步骤。

〔19〕〔17〕或〔18〕所述的方法，其还包括施用包含淀粉样蛋白β抗原的蛋白质或编码该蛋白质的载体进行加强免疫的步骤。

〔20〕〔19〕所述的方法，其中，包含淀粉样蛋白β抗原的蛋白质是AB5毒素B亚基与淀粉样蛋白β抗原肽之间的融合蛋白质。

〔21〕一种提高针对抗原蛋白质的抗体效价的方法，包括施用编码抗原的RNA病毒载体2次以上的步骤。

〔22〕一种用于通过包括施用编码抗原的RNA病毒载体载体2次以上的步骤的方法来提高针对该抗原蛋白质的抗体的效价的组合物，其包含所述RNA病毒载体和药学上可接受的担载体。

〔23〕编码抗原蛋白质的RNA病毒载体在制造用于通过包括施用该载体2次以上的步骤的方法来提高针对该抗原的抗体效价的药物的中的用途。

〔24〕包含〔1〕～〔8〕中任一项所述的载体的病毒样粒子。

而且，将在上述各项中的引用同一项的各项所述的发明2个或2个以上任意组合而得到的发明，在它们所引用的上位项所述的发明中已经意图。此外，本说明书中记载的任意发明要素、技术要素及其任意组合，均是本说明书所意图的。此外，在这些发明中，除本说明书所述的任意要素或其任意组合以外的发明，也是本说明书所意图的。此外，对本说明书而言，在说明书中以优选的形式记载了某特定实施方式的情况下，不仅公开了其本身，还公开了本说明书中公开的包含该实施方式的更上位的发明中的除该实施方式以外的发明。

发明效果

实施使用本发明载体的阿尔茨海默病的疫苗疗法不但能够帮助目前还没有有效治疗方法的阿尔茨海默病型痴呆患者，还可望产生提高老年人生活品质、大幅改善护理问题、削减医疗费用等诸多社会贡献。而且，最近利用PET(正电子CT)或者MRI(核磁共振成像装置)进行阿尔茨海默病的早期诊断的技术开发盛行，还有的已经进入临床研究阶段。将本发明的高效疫苗疗法与早期诊断相组合来在发病初期提供根本性治疗，可以期待能够大幅减轻本人、家庭及社会的负担。

附图说明

[图1]Aβ42NotI片段结构示意图。

[图2]Aβ42NotI片段构建示意图。

[图3]CTB-Aβ42NotI片段结构示意图。

[图4]显示BHK21细胞的细胞裂解物和培养上清中Aβ42、IL-4-Aβ42、PEDI-Aβ42、CTB-Aβ42的表达量的图。

[图5]CTB-Aβ15NotI片段的构建的示意图。

[图6]CTB-Aβ15x2，CTB-Aβ15x4，CTB-Aβ15x8NotI片段构建图。

[图7]显示携带CTB-Aβ42、CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、或CTB-Aβ15x8基因的SeV载体感染的BHK细胞的细胞裂解物和培养上清中的Aβ抗原量的Western印迹照片。

[图8]显示携带CTB-Aβ42、CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、或CTB-Aβ15x8基因的SeV载体感染的BHK细胞的细胞裂解物和培养上清中的针对GM1的结合活性的图。

[图9]显示肌肉内施用了携带CTB-Aβ42、CTB-Aβ15x8、或GFP基因的SeV载体的C57BL/6N小鼠的抗Aβ抗体效价的图。

[图10]显示肌肉内、皮内、或鼻腔内施用了携带CTB-Aβ15x8基因的SeV载体的C57BL/6N小鼠的抗Aβ抗体效价的图。

[图11]显示鼻腔内施用了携带CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、或CTB-Aβ15x8基因的SeV载体的C57BL/6N小鼠的抗Aβ抗体效价的图。

[图12]显示肌肉内施用了携带CTB-Aβ42基因的SeV载体、并用从大肠杆菌中纯化的CTB-Aβ42蛋白进行了加强免疫的C57BL/6N小鼠的抗Aβ抗体效价的图。

[图13]显示肌肉内施用了携带CTB-Aβ15x8基因的SeV载体、并用同一SeV载体进行了加强免疫的C57BL/6N小鼠的抗Aβ抗体效价的图。

[图14]显示肌肉内施用了携带CTB-Aβ42或CTB-Aβ15x8基因的SeV载体、并用同一SeV载体进行了加强免疫的C57BL/6N小鼠的抗Aβ抗体效价的图。小图B中仅显示了小图A的携带CTB-Aβ42基因的SeV载体获得的结果。

[图15]显示鼻腔内施用了携带CTB-Aβ15x8基因的SeV载体、并用同一SeV载体进行了加强免疫的C57BL/6N小鼠的Aβ抗体抗效价的图。

[图16]显示肌肉内施用了携带CTB-Aβ15x8、CTB-Aβ42、或GFP基因的SeV载体、并用CTB-Aβ42蛋白进行了加强免疫的Tg2576小鼠的抗Aβ抗体效价的图。

[图17]显示肌肉内施用了携带CTB-Aβ15x8、CTB-Aβ42、或GFP基因的SeV载体、并用CTB-Aβ42蛋白进行了加强免疫的Tg2576小鼠的脑内Aβ量的图。

[图18]显示脑组织病理标本上的6E10免疫染色阳性部位的分布的照片。对于对照的SeV18+GFP/ΔF组(A)，在嗅球、海马、和大脑新皮质发现了散在的数量众多的6E10染色阳性的Aβ沉积(棕色)，与此相对，对于SeV18+CTB-Aβ15x8/ΔF施用组(B)，Aβ沉积数明显较少。

[图19]6E10免疫染色标本的图像分析图表。与对照的SeV18+GFP/ΔF组(左栏)相比，在SeV18+CTB-Aβ15x8/ΔF施用组(右栏)中，在脑的各部位中可见明显的面积百分比减少的倾向，特别是在海马中差异巨大。

[图20]使用蛋白质在正常小鼠中诱导抗Aβ抗体的图。组A(6只)肌肉注射施用5x10⁷CIU/200μl/只的SeV18+GFP/ΔF，8周后以相同方式施用相同载体。组B(6只)肌肉注射施用5x10⁷CIU/200μl/只的SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔF，8周后以相同方式施用相同载体。组C(6只)在肌肉注射施用5x10⁷CIU/200μl/只的SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔF后，皮下施用100μg/100μl/只的CTB-Aβ15x4KK蛋白，每两周一次共5次。组D(6只)在皮下施用100μg/100μl/只的CTB-Aβ15x4KK蛋白后，皮下施用100μg/100μl/只的CTB-Aβ15x4KK蛋白，每两周一次共5次。

[图21]使用蛋白质在PDGF-hAPPV717I小鼠中诱导抗Aβ抗体的图。组A是未处理组。组B中鼻腔内施用5x10⁷CIU/10μl/只的SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔF。8周后以相同方式施用同一载体。组C中鼻腔内施用5x10⁷CIU/10μl/只的SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔF后，每两周一次共7次鼻腔内施用100μg/15x2μl/只的CTB-Aβ15x4KK蛋白(由大肠杆菌生产)。在组D中，在鼻腔内施用100μg/15x2μl/只的CTB-Aβ15x4KK蛋白后，每两周一次共7次鼻腔内施用100μg/15x2μl/只的CTB-Aβ15x4KK蛋白。

[图22]通过组合使用SeV与蛋白质在Tg2576小鼠中诱导抗Aβ抗体的图。组A是未处理组。在组B中，鼻腔内施用5x10⁷CIU/200μl/只的SeV18+GFP/ΔF，12周后以相同方式施用相同载体。在组C中，鼻腔内施用5x10⁷CIU/10μl/只的SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔF，然后每一周一次共4次、然后每两周一次共5次皮下施用100μg/100μl/只的CTB-Aβ15x4KK蛋白。

[图23]通过组合使用SeV与蛋白质导致Tg2576小鼠中的脑内老年斑的减少的图。组A是未处理组。组B中鼻腔内施用5x10⁷CIU/200μl/只的SeV18+GFP/ΔF，12周后以相同方式施用相同载体。在组C中，鼻腔内施用5x10⁷CIU/10μl/只的SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔF，然后每一周一次共4次、然后每两周一次共5次皮下施用100μg/100μl/只的CTB-Aβ15x4KK蛋白。

[图24]通过组合使用SeV与蛋白质导致Tg2576小鼠中的脑内Aβ(不溶性Aβ42)量的减少。组A是未处理组。组B中鼻腔内施用5x10⁷CIU/200μl/只的SeV18+GFP/ΔF，12周后以相同方式施用相同载体。组C中在鼻腔内施用5x10⁷CIU/10μl/只的SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔF，然后每一周一次共4次、然后每两周一次共5次皮下施用100μg/100μl/只的CTB-Aβ15x4KK蛋白。

[图25]利用各种载体在PDGF-hAPPV717I小鼠中诱导抗Aβ抗体的图。组A中，在肌肉内施用5x10¹⁰粒子/200μl/只的AAV-GFP后第8周时以相同方式施用相同载体。在组B中，肌肉内施用5x10¹⁰粒子/200μl/只的AAV-CTBAβ42，8周后以相同方式施用相同载体。在组C中，肌肉内施用5x10⁷CIU/200μl/只的SeV18+GFP/ΔF，8周后以相同方式施用相同载体。在组D中，在肌肉内施用5x10⁷CIU/200μl/只的SeV18+(CTB-Aβ42)/ΔF，8周后以相同方式施用相同载体。在组E中，肌肉内施用5x10⁷CIU/200μl/只的SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔF，8周后以相同方式施用相同载体。在组F中，鼻腔内施用5x10⁷CIU/10μl/只的SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔF，8周后以相同方式施用相同载体。

[图26]利用非感染性粒子(VLP)在正常小鼠中诱导抗Aβ抗体的图。在组A(6只)中，肌肉内施用5x10⁷CIU/200μl/只的SeV18+GFP/ΔF后，每一周一次共4次、然后每两周一次以相同方式施用相同载体。组B(6只)是在肌肉注射施用150μg/200μl/只的作为非感染性粒子的SeV18+(NP-Aβ15x8)/ΔF-VLP后，每一周一次共4次、然后每两周一次以相同方式施用相同载体。

发明的具体实施方式

本发明涉及编码AB5毒素B亚基(AB5B)与淀粉样蛋白β(Aβ)来源的抗原肽之间的融合蛋白质的RNA病毒载体、包含该载体的抗Aβ抗体诱导剂、用于阿尔茨海默病预防或治疗的组合物、使用该载体抗诱导Aβ抗体的方法和预防或治疗阿尔茨海默病的方法等。本发明人发现，通过将编码AB5B与Aβ的融合蛋白质的核酸与RNA病毒载体组合使用，能够显著地提高针对阿尔茨海默病的接种效果。即，通过使用编码AB5B与Aβ肽的融合蛋白质的RNA病毒载体，能够大大提高抗Aβ抗体的产生。这样使得对阿尔茨海默病的有效预防和/或治疗成为可能。

本发明中，病毒载体是指具有来源于病毒的基因组核酸，用于表达插入该基因组核酸中的基因的载体(运载体)。此外，本发明的病毒载体还包括感染性病毒粒子、病毒核心、病毒基因组与蛋白质的复合体、以及非感染性病毒粒子(非感染性病毒粒子或病毒样粒子)等复合体，这些复合体具有在导入细胞中后表达其插入的基因的能力。例如，在RNA病毒中，由病毒基因组及与之结合的病毒蛋白质构成的核糖核蛋白(病毒核心)能够在被导入细胞中后在细胞内表达插入基因(WO00/70055)。本发明的病毒载体也包括这样的核糖核蛋白(RNP)。载体对细胞的导入可以使用适当的转染试剂等来进行。导入的RNP能够按照与本来的病毒相同的机制表达基因组RNA中插入的基因。

本发明中，RNA病毒是指具有RNA基因组、且在其生命周期中不具有DNA阶段的病毒。本发明的RNA病毒不具有逆转录酶(即，RNA病毒不包括逆转录病毒)。即，病毒的增殖通过病毒基因组的RNA依赖性RNA聚合酶复制来实现，而不通过DNA介导。RNA病毒包括单链RNA病毒(包含正链RNA病毒和负链RNA病毒)和双链RNA病毒。此外，包括具有包膜的病毒(有包膜病毒；enveloped viruses)和不具有包膜的病毒(无包膜病毒；non-enveloped viruses)，优选使用源自有包膜病毒的载体。本发明中，RNA病毒具体包括属于以下的科的病毒。

包括拉沙病毒等的沙粒病毒科(Arenaviridae)

包括流感病毒等的正粘病毒科(Orthomyxoviridae；包括甲型、乙型、丙型流感病毒和索戈托样病毒等)

包括SARS病毒等的冠状病毒科(Coronaviridae)

包括风疹病毒等的披膜病毒科(Togaviridae)

包括腮腺炎病毒、麻疹病毒、仙台病毒、RS病毒等的副粘病毒科(Paramyxoviridae)

包括小核糖核酸病毒、柯萨奇病毒、艾可病毒等的微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)

包括马尔堡病毒、埃博拉出血热病毒等的纤维病毒科(Filoviridae)

包括黄热病病毒、登革热病毒、丙型肝炎病毒、庚型肝炎病毒等的黄病毒科(Flaviviridae)

布尼亚病毒科(Bunyaviridae；包括布尼亚病毒属、汉坦病毒属、内罗病毒属和白蛉病毒属等)

包括狂犬病病毒等的弹状病毒科(Rhabdoviridae)

呼肠孤病毒科(Reoviridae)。

本发明优选的RNA病毒载体包括例如负链RNA病毒载体。负链RNA病毒载体是指来源于包含负链(编码病毒蛋白质的反义链)的RNA作为基因组的病毒的病毒载体。负链RNA也称作阴性链RNA。本发明的负链RNA病毒具体包括单链负链RNA病毒(也称非分节型(non-segmented)负链RNA病毒)。“单链阴性链RNA病毒”是指具有单链阴性链[即负链]RNA作为基因组的病毒。作为这样的病毒，包括属于副粘病毒科(Paramyxoviridae；包括副粘病毒属、麻疹病毒属、腮腺炎病毒属和肺病毒属等)、弹状病毒科(Rhabdoviridae；包括水疱病毒属、狂犬病毒属和短暂热病毒属等)、纤丝病毒科(Filoviridae)等科的病毒，其在分类学上属于单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)(Virus第57卷第1期pp29-36、2007；Annu.Rev.Genet.32，123-162，1998；Fields virology fourth edition，Philadelphia，Lippincott-Raven，1305-1340，2001；Microbiol.Immunol.43，613-624，1999；Field Virology，Thirdedition pp.1205-1241，1996)。

本发明中，作为负链RNA病毒载体，特别可以列举出副粘病毒载体。副粘病毒载体是来源于属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)的病毒的病毒载体。这样的病毒可以列举出例如属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒的仙台病毒(Sendai virus)。这样的病毒还包括例如新城疫病毒(Newcastle disease virus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、麻疹病毒(Measles virus)、呼吸道合胞(RS)病毒(Respiratory syncytial virus)、牛瘟病毒(rinderpest virus)、瘟热病毒(distempervirus)、猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒1，2，3型、属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒(Influenza virus)、和属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)的水疱性口腔炎病毒(Vesicular stomatitis virus)及狂犬病病毒(Rabies virus)等。

可在本发明中使用的病毒还包括例如仙台病毒(SeV)、人副流感病毒-1(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹瘟热病毒(PDV)、犬瘟热病毒(CDV)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、亨德拉病毒(Hendra)、尼帕病毒(Nipah)、人副流感病毒-2(HPIV-2)、猴副流感病毒5(SV5)、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)、人副流感病毒-4b(HPIV-4b)、腮腺炎病毒(Mumps)和新城疫病毒(NDV)等。更优选地，本发明的病毒包括选自仙台病毒(SeV)、人副流感病毒-1(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹瘟热病毒(PDV)、犬瘟热病毒(CDV)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、亨德拉病毒(Hendra)和尼帕病毒(Nipah)中的病毒。

本发明中使用的载体包括属于副粘病毒亚科(包括呼吸道病毒属、腮腺炎病毒属和麻疹病毒属)的病毒或其衍生物，例如属于呼吸道病毒属(genusRespirovirus)(也称副粘病毒属(genus paramyxovirus))的病毒或其衍生物。衍生物包括被遗传修饰或化学修饰的病毒，但这些修饰不损害病毒的基因转移能力。作为可适用于本发明的呼吸道病毒属病毒，包括例如人副流感病毒1型(HPIV-1)、人副流感病毒3型(HPIV-3)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、仙台病毒(仙台病毒；也称小鼠副流感病毒1型)和猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。

本发明的病毒载体可以来源于天然株、野生型株、突变株、实验室传代株和人工构建株等。此外，本发明的病毒载体可以具有传染性，也可以不具有传染性。这里，传染性是指当病毒载体感染宿主细胞时，在该细胞中复制病毒、产生感染性病毒粒子的能力。病毒载体可以是具有与从自然界分离的病毒相同的结构的病毒载体，也可以是通过基因重组进行人工修饰而得到的病毒载体。例如，这样的病毒载体可以是野生型病毒所具有的任何基因中存在突变、缺损的病毒。此外，还可以使用不完全病毒如DI粒子(J.Virol.68：8413-8417，1994)等。例如，优选使用编码病毒的包膜蛋白质或外壳蛋白质的基因中的至少1个中具有突变或缺损的病毒。这样的病毒载体能够复制其基因组，例如在感染细胞中，但不能形成感染性病毒粒子。这样的复制能力缺损型病毒载体没有将感染扩散的风险，因而安全性高。例如，可以使用缺失编码包膜蛋白质(如F、H、HN、G、M、或M1等)或突刺蛋白质的基因中的至少1个，或2个以上、3个以上或者4个以上的任意组合的负链RNA病毒载体(WO00/70055和WO00/70070；Li，H.-O.等，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。如果基因组RNA编码基因组复制所必需的蛋白质(例如N、P、和L蛋白质)，则基因组能够在感染细胞中扩增。为了制造缺损型病毒，例如可以将病毒基因组中的某些基因缺损，并外源性地对病毒产生细胞供给缺损的基因产物或能够补偿该基因产物的蛋白质(WO00/70055和WO00/70070；Li，H.-O.等，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。此外，不需完全补偿缺损的病毒蛋白质、而以非感染性病毒粒子(VLP)的形式回收病毒载体的方法也是已知的(WO00/70070)。此外，通过以RNP(例如由N、L、P蛋白质和基因组RNA构成的RNP)的形式回收病毒载体，能够制造载体而无需补偿包膜蛋白质。

此外，在制作包膜病毒来源的病毒载体的情况下，可以制作包膜中包含与病毒原有的包膜蛋白质不同的蛋白质的病毒载体。例如，通过在制造病毒时使病毒产生细胞表达希望的外源性包膜蛋白质，能够制造出含该外源性包膜蛋白质的病毒。对于这样的蛋白质没有特殊限制，可以使用对哺乳动物细胞赋予感染能力的希望的粘附因子、配体、受体等蛋白质。具体地，可以列举出例如水疱性口腔炎病毒(Vesicular stomatitis virus；VSV)的G蛋白(VSV-G)。VSV-G蛋白可以来源于任意的VSV株，例如可以使用Indiana血清型株(J.Virology 39：519-528(1981))来源的VSV-G蛋白，但不限于此。

本发明的病毒载体以与AB5毒素B亚基的融合蛋白质的形式编码Aβ抗原肽。这里，Aβ抗原肽是指来源于Aβ的抗原肽。该肽包含Aβ或其具有抗原性的片段。本发明的Aβ抗原肽包括但不限于天然的Aβ、其抗原性片段(具有6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸以上的片段)、在它们之上添加其它氨基酸序列或将它们任意连接组合而得到的合成肽等，但不限于此(Harlow，Antibodies：A laboratory Manual，1998；第5章第76页)。Aβ抗原肽优选是具有1个以上的Aβ的B细胞表位的肽。对于Aβ的来源没有特殊限制，优选使用人Aβ(Aβ40、Aβ42、Aβ43等)来源的Aβ肽(举例而言，Aβ43的序列如SEQ ID NO：69所示)。更具体地，Aβ肽包括Aβ1-39、Aβ1-40、Aβ1-41、Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ17-40、Aβ17-42、Aβ1-5、Aβ1-6、Aβ1-7、Aβ1-8、Aβ1-9、Aβ1-10、Aβ1-11、Aβ1-12、Aβ1-13、Aβ1-14、Aβ1-15、Aβ1-16、Aβ1-17、Aβ1-18、Aβ1-19、Aβ1-20、Aβ1-21、Aβ1-33、Aβ3-7、Aβ4-10，以及它们中的一种或多种的一个或多个拷贝任意组合如串联起来而得到的肽(各编号表示从Aβ的N末端起算的位置)(日本专利申请特开2005-21149)。此外，有报导称，公知具有抑制淀粉样蛋白纤维形成和保护神经元的能力的抗Aβ单克隆抗体10D5和6C6识别相当于Aβ42的3位～6位的氨基酸的4氨基酸表位(EFRH)(Frenkel，D.等，J.Neuroimmunol.88：85-90，1998；Frenkel，D.等，J.Neuroimmunol.95：136-142，1999)。识别相同表位的单克隆抗体508F也抑制Aβ引起的神经毒性(Frenkel，D.等，J.Neuroimmunol.106：23-31，2000)。因此，可以适宜使用包含该序列(EFRH)的、具有Aβ序列中的6～8氨基酸以上的多肽。细胞免疫的相应表位集中于Aβ的C末端区域。因此，通过表达包含N末端片段(如Aβ1-21等)、但不包含Aβ的C末端附近的序列(如Aβ22-43等)的片段，能够使体液免疫相对于细胞免疫处于优势地位。

特别优选的Aβ肽包括这样的肽，其包含1个或多个拷贝的天然Aβ的相对于N末端的1～3位起到10～20位止的片段(Aβ1-10～Aβ1-20、Aβ2-10～Aβ2-20或Aβ3-10～Aβ3-20)。具体地，可以列举出包含1个或多个拷贝的Aβ1-10、Aβ1-11、Aβ1-12、Aβ1-13、Aβ1-14、Aβ1-15、Aβ1-16、Aβ1-17、Aβ1-18、Aβ1-19、Aβ1-20、Aβ2-10、Aβ2-11、Aβ2-12、Aβ2-13、Aβ2-14、Aβ2-15、Aβ2-16、Aβ2-17、Aβ2-18、Aβ2-19、Aβ2-20、Aβ3-10、Aβ3-11、Aβ3-12、Aβ3-13、Aβ3-14、Aβ3-15、Aβ3-16、Aβ3-17、Aβ3-18、Aβ3-19或Aβ3-20的序列的肽。由于Aβ42的B细胞表位大部分集中在相对于N末端的1～15位的氨基酸的区域(Cribbs，D.H.等，Int.Immunol.15(4)：505-14，2003)，因此，举例而言，可以适宜地使用包含Aβ1-15(SEQ ID NO：：1的1～15)或其片段的多肽作为Aβ肽。对片段的长度没有特殊限制，只要该片段包含这样的表位即可。长度可以是例如6、7、8、9、10或更长。例如，包含Aβ3-6(EFRH)的片段是合适的。更优选地，可以使用包含1个或多个Aβ1-15或其片段的肽，例如可以使用包含1～12个拷贝、优选2～10个、更优选2～8个、3～8个、4～8个拷贝的肽。多个拷贝的Aβ1-15或其片段优选通过接头串联起来。对于接头的序列没有特殊限制，可以是例如1～15个氨基酸、优选1～8个氨基酸、例如1～6个氨基酸的序列。具体地，接头可以列举出例如K(赖氨酸)、KK或KKK、GP(甘氨酸-脯氨酸)、GPGP、GGS(甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)、GGGS、GGGGS、它们的重复、或者它们的各种组合等，但不限于此。

本发明中，AB5毒素是指一种许多病原性细菌共有的毒素，该毒素由1个拷贝的A亚基和5个拷贝的B亚基组成(Merritt E，and Hol W (1995)″AB5toxins″，Curr Opin Struct Biol 5(2)：165-71；Lencer W，and Saslowsky D (2005)″Raft trafficking of AB5 subunit bacterial toxins″，Biochim Biophys Acta 1746(3)：314-21)。所述AB5毒素包括例如：空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的肠毒素(enterotoxin)、霍乱毒素(霍乱弧菌)、不耐热肠毒素(heat-labileenterotoxins)(例如LT和LT-II)(大肠杆菌)、百日咳毒素(pertussis toxin)(百日咳博德特氏菌)、志贺毒素(shiga toxin)(痢疾志贺氏菌)以及其它的肠道出血性细菌产生的志贺样毒素或Vero毒素(verotoxin)。一般认为，这些毒素的毒性由A亚基承担，而B亚基形成五聚体，参与对细胞的粘附。

本发明中特别优选的AB5毒素包括霍乱毒素和大肠杆菌不耐热肠毒素，两者在结构上和功能上均极为类似(Hovey BT等，J Mol Biol.，1999，285(3)：1169-78；Ricci S.等，Infect Immun.2000，68(2)：760-766；Tinker J.K.等，Infect Immun.2005，73(6)：3627-3635)。作为霍乱毒素和大肠杆菌不耐热肠毒素的具体的B亚基，可以列举出包含登录号ZP_01954889.1，ZP_01976878.1，NP_231099.1，P13811.1，ABV01319.1，P32890以及SEQ ID NO：：14、或者它们的成熟型蛋白质(除去N末端的21个氨基酸的；例如22～124位氨基酸)的蛋白质等。作为编码这样的蛋白质的核苷酸序列，可以列举出包含核苷酸序列NZ_AAWE01000267.1、NC_002505.1、M17874.1、EU113246.1和M17873.1，或者它们的成熟型蛋白质的序列(例如除去最5′端的63个核苷酸而得到的)的序列等。作为本发明优选的AB5毒素B亚基，可以列举出包含如上所述的氨基酸序列或由如上所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列者，或者与上述的氨基酸序列具有高相似性者。

而且，AB5毒素B亚基不仅可以包括天然序列，还可以包括突变。可以使用例如添加、缺失、取代、和/或插入了1个或少数个氨基酸(例如数个、3个以内、5个以内、10个以内、15个以内、或20个以内的氨基酸)而得到的氨基酸序列的B亚基，只要与使用天然型的B亚基的情况相比，不会显著地降低融合蛋白质的表达量、抗Aβ抗体的诱导能力和/或阿尔茨海默病的至少一种症状的缓解效果。此外，也可以使用N末端和/或C末端具有1个～数个残基(例如2、3、4、5、6、10、15或20个残基)的氨基酸缺失或添加而得到的多肽、以及具有1个～数个残基(例如2、3、4、5、6、10、15或20个残基)的氨基酸取代而得到的多肽等。作为可以使用的变体，包括例如天然的蛋白质的片段、类似物、衍生物以及天然蛋白质与其它多肽(例如含有额外的异源信号肽或抗体片段的多肽)的融合蛋白质。具体地，包含在野生型B亚基的氨基酸序列中取代、缺失、以及/或添加1个或多个氨基酸而得到的序列，且与Aβ抗原肽单独表达的情况相比，具有与野生型B亚基相当的或较之更强的提高与Aβ抗原肽的融合蛋白质的表达水平、诱导抗Aβ抗体的和/或缓解阿尔茨海默病的至少一种症状的活性的多肽，可以作为本发明的AB5毒素B亚基使用。这样的修饰型AB5毒素B亚基的优选保持形成五聚体的活性。在使用野生型蛋白质的片段的情况下，通常包含野生型多肽(分泌蛋白质的情况下为成熟型的形式)的70％以上、优选80％以上、更优选90％以上(或95％以上)的连续区域。

氨基酸序列的变体例如可以通过在编码天然多肽的DNA中导入突变来制备(Walker and Gaastra，eds.Techniques in Molecular Biology(MacMillanPublishing Company，New York，1983)；Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492，1985；Kunkel等，Methods Enzymol.154：367-382，1987；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Plainview，N.Y.)，1989；U.S.Pat.No.4,873,192)。关于如何进行氨基酸取代而不影响生物学活性的指导，可以列举出Dayhoff等(Dayhoff等，in Atlasof Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)，1978)。作为AB5B，包括例如大肠杆菌肠毒素LT的R192G突变体(Lemere等，Neurobiol.Aging 2002，23：991-1000；Seabrook等，Neurobiol.Aging，2004，25：1141-1151；Seabrook等，Vaccine，2004，22：4075-7083)。

对于进行修饰的氨基酸的数目没有特殊限制，例如是天然多肽的成熟型的全部氨基酸的30％以内、优选25％以内、更优选20％以内、更优选15％以内、更优选10％以内、5％以内、3％以内或1％以内，例如15个氨基酸以内、优选10个氨基酸以内、更优选8个氨基酸以内、更优选5个氨基酸以内、更优选3个氨基酸以内。在对氨基酸氨基酸进行取代时，通过取代成侧链性质相似的氨基酸可以期待保持蛋白质的原活性。这样的取代在本发明中称作保守取代。保守取代包括例如下列各组内的氨基酸之间的取代：例如碱基性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)等。此外，保守性取代还可以包括例如，BLOSUM62取代矩阵(S.Henikoff and J.G.Henikoff，Proc.Acad.Natl.Sci.USA 89：10915-10919，1992)中给出正值(例如+1以上、+2以上、+3以上或+4以上)的氨基酸之间的取代。

经修饰的蛋白质与野生型蛋白质的氨基酸序列之间显示高同源性。高同源性的氨基酸序列包括具有例如70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、93％以上、95％以上或96％以上的同一性的氨基酸序列。氨基酸序列的同一性可以使用例如BLASTP程序(Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)来确定。例如，可以在NCBI(National Center for BiothchnologyInformation)的BLAST的网页上，使用默认参数来进行检索(Altschul S.F.等，Nature Genet.3：266-272，1993；Madden，T.L.等，Meth.Enzymol.266：131-141，1996；Altschul S.F.等，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997；Zhang J.&Madden T.L.，Genome Res.7：649-656，1997)。例如，通过blast2sequences程序(Tatiana A等，FEMS Microbiol Lett.174：247-250，1999)进行2个序列的比较，制作2个序列的比对，可以确定序列的同一性。空位按错配对待。例如，计算天然型蛋白质(分泌后的成熟型的形式)的比对区域内的整个氨基酸序列上的同一性的值。具体地，通过计算出野生型蛋白质(对分泌蛋白质而言为成熟型)的全部氨基酸数中的相同氨基酸数的比例来确定同一性。

此外，AB5毒素B亚基包括与编码野生型蛋白质的基因的编码区域的一部分或全部在严格条件下杂交的核酸所编码的、具有与野生型蛋白质相当的活性(与Aβ抗原肽的融合蛋白质的表达水平、抗Aβ抗体的诱导和/或阿尔茨海默病的至少一种症状的缓解)的蛋白质。该蛋白质优选形成五聚体。在杂交中，例如，可以从包含野生型蛋白质基因的编码序列或其互补序列的核酸、或作为杂交对象的核酸制备探针。可以通过检测探针是否与其他核酸杂交来进行鉴定。严格杂交的条件包括例如在含5xSSC、7％(W/V)SDS、100μg/ml变性鲑鱼精子DNA、5xDenhardt液(1xDenhardt溶液含0.2％聚乙烯基吡咯烷酮、0.2％牛血清白蛋白以及0.2％Ficoll)的溶液中，于50℃、优选60℃、更优选65℃进行杂交，然后在与杂交相同的温度下，于2xSSC中、优选1xSSC中、更优选0.5xSSC中、更优选0.1xSSC中振荡洗涤2小时的条件。

AB5毒素B亚基本来具有的信号肽(典型地是最初的21个氨基酸)可以完整地与重组蛋白质融合。或者也可以将其除去，例如在N末端添加真核细胞来源的蛋白质的信号肽，或者替换原有的信号肽(参照实施例)。具体地，可以使用免疫球蛋白kappa轻链、白细胞介素(IL)-2、组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)、或淀粉样蛋白前体蛋白质(APP)等希望的分泌蛋白质的信号序列，但所述信号肽序列不限于此(参照Accession NP 958817；NM 201414的信号序列)。

此外，融合蛋白质可以还包含标签、接头、和间隔序列。例如，Aβ抗原肽与AB5毒素B亚基可以直接结合，也可以通过接头(或间隔序列)结合。对接头/间隔序列的序列没有特殊限制，但所述序列可以由例如1～15个氨基酸、优选1～8个氨基酸、例如2～6个氨基酸、例如约4个氨基酸组成，具体地说，所述序列包括但不限于KK(赖氨酸-赖氨酸)、GP(甘氨酸-脯氨酸)、GPGP(甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸)、GGS(甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)、GGGS、GGGGS、它们的重复、或者它们的任意组合等。Aβ肽与AB5B的融合通常使得AB5B位于Aβ抗原肽的N末端侧，亦即Aβ抗原肽位于AB5B的C末端侧。

在从例如负链RNA病毒载体表达融合蛋白质的基因的情况下，例如，基因的表达水平可以基于添加在该基因的上游(负链的3′侧)的转录起始序列的种类来调节(WO 01/18223)。表达水平可以基于外源基因插入基因组内的位置加以控制，插入位置越靠近负链3’末端则表达水平越高；反之越靠近5’末端则表达水平越低。这样，编码融合蛋白质的基因的插入位置可以适当调节，以获得融合蛋白质的希望的表达水平，或者使得与插入的基因的附近的编码病毒蛋白质的基因的组合最为合适。一般来说，获得AB5B-Aβ抗原肽融合蛋白质的高表达水平是有利的，故优选将编码融合蛋白质的核酸与高效转录起始序列相连，并将其插入负链基因组的3’末端附近。具体来说，将编码融合蛋白质的基因插入3’-前导区和最靠近3’末端的病毒蛋白质ORF之间。或者，也可以将该基因插入最靠近3’-末端的病毒基因和下一个基因的ORF之间。在野生型副粘病毒中，最靠近基因组的3’末端的病毒蛋白质基因是N基因，第二靠近的基因是P基因。或者，在不希望导入基因的高表达水平时，为获得适当的效果，可以例如通过将外源基因插入载体中尽可能靠近负链基因组的5’侧的位置、或者通过选择效率低的转录起始序列来抑制病毒载体的基因表达水平。

此外，本发明的载体还可以在插入编码AB5B-Aβ抗原肽融合蛋白质的基因的插入位置以外的位置上携带其它外源基因。对于这样的外源基因没有限制。外源基因例如可以是用于监测载体的感染的标记基因，或者也可以是调节免疫系统的细胞因子、激素、受体、抗体、它们的片段、或其它基因。本发明的载体通过对生物体的靶标部位的直接(体内)施用，或者通过间接(回体)施用即将载体导入患者来源的细胞或其他细胞，再将该细胞注入靶标部位，来导入基因。本发明的载体可以用作有效诱导抗Aβ抗体，治疗阿尔茨海默病、或防止或抑制该疾病进行的极好手段。

重组RNA病毒载体可以利用公知方法来重构。具体地，载体可以通过下述步骤来制造：(a)在构成包含病毒基因组RNA的RNP的病毒蛋白质的存在下，将编码AB5毒素B亚基与Aβ抗原肽的之间的融合蛋白质的RNA病毒的基因组RNA或编码其互补链的RNA导入细胞或者使其在细胞中转录的步骤；和(b)回收生成的病毒或包含该基因组RNA的RNP的步骤。上述“构成RNP的病毒蛋白质”典型地是指与病毒基因组RNA一起形成RNP，并构成核壳的蛋白质。它们是基因组的复制和基因表达所必需的一组蛋白质，对负链RNA病毒而言，它们典型地是N(核壳，又称核蛋白(NP))、P(磷)和L(大)蛋白质。其表记因病毒种类而异，但相应的各组蛋白质是本领域技术人员所公知的(Anjeanette Robert等，Virology 247：1-6(1998))。

病毒载体的产生可以使用希望的哺乳动物细胞和鸟类细胞等，具体地可以列举出例如：猴肾来源的LLC-MK₂细胞(ATCC CCL-7)、CV-1细胞(例如ATCC CCL-70)、仓鼠肾来源的BHK细胞(例如ATCC CCL-10)等培养细胞、以及人来源细胞等。此外，在能够用鸡蛋扩增病毒的情况下，可以考虑用从上述宿主得到的病毒载体感染鸡胚胎蛋来大规模地制备病毒载体。使用鸡蛋制造病毒载体的方法已经建立起来(Nakanishi，et al.，ed.(1993)，“State-of-the-Art Technology Protocol in Neuroscience Research III，MolecularNeuron Physiology”，Koseisha，Osaka，pp.153-172)。具体来说，例如，将受精卵放入孵化器中，在37-38℃的条件下，培养9-12天，使胚胎成长。将病毒载体接种到尿囊腔中，进一步将鸡蛋培养数日(例如3天)使病毒载体繁殖，回收包含病毒的尿液。可用常规方法从尿液中分离、纯化病毒载体(Tashiro，M.，“Virus Experiment Protocol”，Nagai，Ishihama，ed.，Medical View Co.，Ltd.，pp.68-73(1995))。

粒子形成所必需的病毒蛋白质可以由转录后的病毒基因组RNA表达，也可以从基因组RNA以外的来源反式供给。例如，为了重构负链RNA病毒载体，可以通过将表达N、P和L蛋白质的质粒导入细胞等方法来供给N、P和L蛋白质。让转录出的基因组RNA在这些病毒蛋白质的存在下复制，形成功能性RNP或病毒粒子。为了在细胞内表达病毒蛋白质和RNA基因组，将在适当的启动子的下游连接编码该蛋白质或基因组的DNA而得到的载体导入宿主细胞。作为启动子，可以使用例如CMV启动子(Foecking，M.K，andHofstetter H.Gene 1986；45：101-105)、逆转录病毒LTR(Shinnik，T.M.，Lerner，R.A.& Sutcliffe(1981)Nature，293，543-548)、EF1-α启动子、CAG启动子(Niwa，H.et al.(1991)Gene.108：193-199、特开平3-168087)等。

在制造缺损包膜蛋白质等的基因的缺损型病毒的情况下，可以通过在病毒产生细胞中表达所缺损的蛋白质和/或其它能够补偿其功能的病毒蛋白质等，来补偿所产生的病毒的感染性(WO00/70055、WO00/70070、和WO03/025570；Li，H.-O.等，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。例如，也可以使用与病毒载体的基因组来源病毒不同的来源的病毒的包膜蛋白质来将病毒进行假型化。作为这样的包膜蛋白质，可以使用例如水泡性口腔炎病毒(Vesicular stomatitis virus；VSV)的G蛋白质(VSV-G)(J.Virology 39：519-528，1981)(Hirata，T.等，J.Virol.Methods，104：125-133，2002；Inoue，M.等，J.Virol.77：6419-6429，2003；Inoue M.等，J Gene Med.6：1069-1081，2004)。对于负链RNA病毒载体而言，要从基因组中缺损的基因包括例如F、HN、H、G等刺突蛋白质基因、M等包膜衬里蛋白质基因、或它们的任意组合。刺突蛋白质基因的缺失可有效使得负链RNA病毒载体成为非传染性，M蛋白等包膜衬里蛋白质基因的缺失则可有效地使感染细胞不能形成粒子。例如，优选使用F基因缺陷型负链RNA病毒载体(Li，H.-O.等，J.Virol.74，6564-6569(2000))、M基因缺陷型负链RNA病毒载体(Inoue，M.等，J.Virol.77，6419-6429(2003))等。此外，缺损F、HN(或H)以及M中的至少2个基因的任意组合的载体的安全性更能得到保障。例如，M和F基因双缺失型的载体没有传染性且病毒粒子形成缺陷，同时保持高水平的感染性及基因表达能力。

例如，作为F基因缺失型重组病毒的制造的一个例子，将表达F基因缺损的负链RNA病毒基因组或其互补链的质粒与表达F蛋白质的表达载体、以及N、P、和L蛋白质的表达载体一起转染到宿主细胞中。或者，使用F基因已经整合入其染色体的宿主细胞，能够更有效率地制造病毒(WO00/70070)。这种情况下，优选使用Cre/loxP、FLP/FRT等序列特异性重组酶及其靶标序列，以使得F基因能够被诱导表达(参照WO00/70055和WO00/70070；Hasan，M.K.等，1997，J.General Virology 78：2813-2820)。具体地，例如，将包膜蛋白质基因整合到具有重组酶靶标序列的载体，如Cre/loxP诱导型表达质粒pCALNdlw(Arai，T.等，J.Virology 72，1998，p1115-1121)中。通过例如以MOI 3～5感染腺病毒AxCANCre来诱导表达(Saito等，Nucl.Acids Res.23：3816-3821(1995)；Arai，T.等，J.Virol 72，1115-1121(1998))。

此外，对于本发明的载体而言，载体中包含的任意病毒基因均可以在野生型基因的基础上进行改变，例如为了降低病毒蛋白质的免疫原性、或者为了提高RNA的转录效率或复制效率。具体地，例如，可以通过对复制因子基因N、P和L中的至少一个进行修饰，来提高负链RNA病毒载体的转录或复制的功能。此外，作为包膜蛋白质之一的HN蛋白质具有血凝素(hemagglutinin)活性与神经氨酸酶(neuraminidase)活性。例如，减弱血凝素的活性能够提高血液中的病毒的稳定性，而通过对神经氨酸酶的活性进行修饰，则能够调节感染能力。此外，通过对F蛋白质进行改变，能够调节膜融合能力。此外，例如，对可以充当细胞表面抗原分子的F蛋白质或HN蛋白质的抗原呈递表位等进行解析，而该信息可以用来制作这些蛋白质的抗原性减弱的病毒载体。而且，可以在病毒基因中导入温度敏感性突变，以抑制二次释放粒子(或VLP，病毒样粒子)的释放(WO2003/025570)。

病毒蛋白质的突变的具体实例包括SeV P蛋白质的86位的Glu(E86)的突变、SeV P蛋白质的511位的Leu (L511)到其它氨基酸的取代、或其它负链RNA病毒的P蛋白的同源位点的取代。具体例子包括86位的Lys取代、511位的Phe取代等。此外，对于L蛋白，例子包括SeV L蛋白的1197位的Asn(N1197)和/或1795位的Lys(K1795)到其它氨基酸的取代、或其它负链RNA病毒的L蛋白中的同源位点的取代，具体的例子包括1197位的氨基酸到Ser的取代和1795位的氨基酸到Glu的取代等。P基因和L基因的突变能够显著地提高持续感染性、次级病毒粒子释放的抑制、或细胞毒性的抑制的效果。例如，可以导入下列突变：对M基因，可导入G69E、T116A、和A183S突变，对HN基因，可导入A262T、G264、K461G突变，但可导入的突变不限于此(具体情况参照WO2003/025570)。

负链RNA病毒的制造可以例如利用以下的公知方法来实施(WO97/16539；WO97/16538；WO00/70055；WO00/70070；WO01/18223；WO03/025570；WO2005/071092；WO2006/137517；WO2007/083644；WO2008/007581；Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997、Kato，A.等，1997，EMBO J.16：578-587以及Yu，D.等，1997，Genes Cells 2：457-466；Durbin，A.P.等，1997，Virology 235：323-332；Whelan，S.P.等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8388-8392；Schnell.M.J.等，1994，EMBO J.13：4195-4203；Radecke，F.等，1995，EMBO J.14：5773-5784；Lawson，N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481；Garcin，D.等，1995，EMBO J.14：6087-6094；Kato，A.等，1996，Genes Cells 1：569-579；Baron，M.D.and Barrett，T.，1997，J.Virol.71：1265-1271；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15400-15404；Tokusumi，T.et al.Virus Res.2002：86；33-38、Li，H.-O.等，J.Virol.2000：74；6564-6569)。通过这些方法，可以从DNA重构包括副流感病毒、水疱性口腔炎病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、仙台病毒等在内的负链RNA病毒。

作为正(+)链RNA病毒的制造方法，可以列举出以下的例子。

1)冠状病毒

Enjuanes L，Sola I，Alonso S，Escors D，Zuniga S.

Coronavirus reverse genetics and development of vectors for geneexpression.

Curr Top Microbiol Immunol.2005；287：161-97.综述.

2)披膜病毒

Yamanaka R，Zullo SA，Ramsey J，Onodera M，Tanaka R，Blaese M，Xanthopoulos KG.

Induction of therapeutic antitumor antiangiogenesis by intratumoralinjection of genetically engineered endostatin-producing Semliki Forest virus.

Cancer Gene Ther.2001 Oct；8(10)：796-802.

Datwyler DA，Eppenberger HM，Koller D，B ailey JE，Magyar JP.

Efficient gene delivery into adult cardiomyocytes by recombinant Sindbisvirus.

J Mol Med.1999Dec；77(12)：859-64.

3)微小核糖核酸病毒

Lee SG，Kim DY，Hyun BH，Bae YS.

Novel design architecture for genetic stability of recombinant poliovirus：themanipulation of G/C contents and their distribution patterns increases the geneticstability of inserts in a poliovirus-based RPS-Vax vector system.

J Virol.2002 Feb；76(4)：1649-62.

Mueller S，Wimmer E.

Expression of foreign proteins by poliovirus polyprotein fusion：analysis ofgenetic stability reveals rapid deletions and formation of cardioviruslike openreading frames.

J Virol.1998 Jan；72(1)：20-31.

4)黄病毒

Yun SI，Kim SY，Rice CM，Lee YM.

Development and application of a reverse genetics system for Japaneseencephalitis virus.

J Virol.2003 Jun；77(11)：6450-65.

Arroyo J，Guirakhoo F，Fenner S，Zhang ZX，Monath TP，Chambers TJ.

Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow feverVirus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine(ChimeriVax-JE).

J Virol.2001 Jan；75(2)：934-42.

5)呼肠孤病毒

Roner MR，Joklik WK.

Reovirus reverse genetics：Incorporation of the CAT gene into the reovirusgenome.

Proc Natl Acad Sci U S A.2001Jul 3；98(14)：8036-41.Epub 2001 Jun 26.

关于其它的RNA病毒的增殖方法和重组病毒的制造方法，可以参照Experimental Virology，Detailed Discussion，2^nd Edition(Ed.Students’Association of the National Institute of Health；Maruzen，1982)。

此外，本发明涉及包含本发明的载体的组合物。本发明的组合物包括药物(药物组合物)和试剂。该组合物也可以是包含导入了本发明的载体的细胞的组合物。在本发明的组合物的制造中，载体或细胞视需要可以与药理学可接受的希望的担载体(carrier)或介质组合。药学上可接受的担载体或介质包括能够悬浮载体或细胞的希望的溶液，例如磷酸缓冲生理食盐水(PBS)、氯化钠溶液、Ringer’s溶液、培养液等。在用鸡蛋增殖载体等情况下，可以包含尿囊液。此外，本发明的组合物可以包含去离子水、5％葡萄糖水溶液等载体或介质。而且，除此之外还可以含有植物油、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、杀生物剂等。此外，可以添加防腐剂或其它添加剂。

此外，本发明的组合物还可以组合生物聚合物等有机物、或羟基磷灰石等无机物作为载体，具体包括胶原基质、聚乳酸聚合物或共聚物、聚乙二醇聚合物或共聚物及其化学衍生物等。

本发明的载体、导入了该载体的细胞以及包含它们中的任何一个的组合物，可以用于高效表达Aβ抗原肽的和诱导抗Aβ抗体(针对Aβ的体液免疫)，此外，可用于阿尔茨海默病的预防和/或治疗。可以将本发明的载体或本发明的组合物直接或间接地(例如经由细胞)施用于生物个体，来诱导抗Aβ抗体(针对Aβ的体液免疫)，或者治疗和/或预防阿尔茨海默病。本发明涉及诱导抗Aβ抗体(针对Aβ的体液免疫)的方法，其包括直接或间接施用本发明的载体或本发明的组合物的步骤。此外，本发明涉及治疗和/或预防阿尔茨海默病的方法，其包含直接或间接施用本发明的载体或本发明的组合物的步骤。此外，本发明涉及包含本发明的载体、导入了该载体的细胞或本发明的组合物的抗Aβ抗体诱导剂、以及包含本发明的载体、导入了该载体的细胞或本发明的组合物的针对Aβ的体液免疫诱导剂。此外，本发明提供该载体、该细胞和该组合物用于诱导抗Aβ抗体的用途、和用于诱导针对Aβ的体液免疫的用途。此外，本发明提供本发明的载体、导入了该载体的细胞和本发明的组合物用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的用途。此外，本发明提供本发明的载体、导入了该载体的细胞和本发明的组合物在制造用于诱导抗Aβ抗体(针对Aβ的体液免疫)的药物中的用途。此外，本发明提供本发明的载体、导入了该载体的细胞和本发明的组合物在制造用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。此外，本发明涉及制造用于诱导抗Aβ抗体(针对Aβ的体液免疫)的药物的方法，包括制造包含本发明的载体或导入了该载体的细胞、以及与之组合的药学上可接受的担载体或介质的组合物的步骤。此外，本发明涉及制造阿尔茨海默病的治疗药物和/或预防药物的方法，包括制造包含本发明的载体或导入了该载体的细胞、以及与之组合的药学上可接受的担载体或介质的组合物的步骤。此外，本发明涉及用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物，其包含本发明的载体或导入了该载体的细胞。此外，本发明涉及用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物组合物，其包含本发明的组合物。此外，本发明涉及编码AB5毒素B亚基与Aβ肽的融合蛋白质的RNA病毒的基因组RNA、或其互补链(反义基因组RNA)、或者编码它们中的至少之一的DNA在制造用于抗Aβ抗体(针对Aβ的体液免疫)的诱导的药物中的用途。此外，本发明涉及编码AB5毒素B亚基和Aβ肽的融合蛋白质的RNA病毒的基因组RNA或其互补链(反义基因组RNA)、或者编码它们中的至少之一的DNA在制造用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。

这里，“治疗阿尔茨海默病”是指改善阿尔茨海默病的至少一种症状；“预防阿尔茨海默病”是指降低阿尔茨海默病的至少一种症状的发病率、和/或减轻已经发生的症状的程度。这样的效果并不是一定产生在每个个体身上，也可以是统计学上显著效果。这样的效果包括例如，减少血中的Aβ水平、脑组织等中的Aβ蓄积、或者老年斑的数量或脑组织内老年斑面积的比例等。本发明的载体和组合物作为Aβ的蓄积抑制剂，特别是作为与未施用本发明的组合物的情况相比、抑制脑组织或血中等的Aβ蓄积的药物是有用的。此外，本发明的载体和组合物作为老年斑抑制剂，特别是作为与未施用本发明的组合物的情况相比、减少老年斑的数量和/或面积的合计的药物是有用的。

如上述，本发明的载体可以通过体内(in vivo)施用和细胞介导的回体(exvivo)施用来使用。在藉由细胞施用载体的情况下，将载体导入适当的培养细胞或从接种对象动物采集的细胞等中。在体外(例如试管或平皿内)将载体导入细胞的情况下，在例如培养液、生理食盐水、血液、血浆、血清、体液等希望的生理性水溶液中体外(in vitro)(或回体(ex vivo))进行。此时，优选使MOI(感染复数；平均每个细胞的感染病毒数)在1～1000之间，更优选2～500、更优选3～300、更优选5～100。所得细胞可以直接接种或以细胞破碎物(溶胞产物)的形式接种。优选将从本发明的载体表达AB5B-Aβ抗原肽融合蛋白质的细胞用于接种。可以从载体表达具有信号肽的融合蛋白质，并将其分泌至细胞外。此外，细胞可以通过放射线照射、紫外线照射或药物处理等使其丧失增殖能力。导入了载体的细胞可以采用使用表面活性剂溶解细胞膜法、反复冻融法等来获得溶胞产物。表面活性剂可以使用例如非离子型的TritonX-100、Nonidet P-40等。更具体地，导入了载体的细胞可以通过用表面活性剂溶解细胞膜的操作、或者包含反复冻融循环的操作来制备溶胞产物。非离子型表面活性剂如Triton X-100和Nonidet P-40等可以在0.1～1％的浓度范围使用。例如，可以通过用PBS洗涤后、通过离心回收细胞块，重悬于TNE缓冲液[25mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、1％Nonidet P-40]中，并将悬浮液在冰上温育10～30分钟来获得。当作为抗原使用的蛋白质可溶于细胞质时，可对制备的溶胞产物进行离心(10,000×g、10分钟)、以沉淀的形式除去不需要的不溶性级分，所得上清液可以用于免疫。当在不希望有表面活性剂的部位施用溶胞产物时，可以通过洗涤后将细胞重悬于PBS，并重复进行5～6次的冻融循环来破坏细胞，来制备溶胞产物。或者，也可以从一开始就不使用表面活性剂，而是采用超声法(sonication)来制备。溶胞产物中可以包含本发明的RNA病毒载体和/或由其基因组和病毒蛋白质构成的RNP。

将细胞溶解物、包含病毒基因组RNA的RNP、或非感染性病毒粒子(病毒样粒子(VLP))等通过转染导入细胞、个体中的具体方法，包括例如：使用磷酸钙(Chen，C.& Okayama，H.(1988)BioTechniques 6：632-638；Chen，C.andOkayama，H.，1987，Mol.Cell.Biol.7：2745)、DEAE-葡聚糖(Rosenthal，N.(1987)Methods Enzymol.152：704-709)、脂质体或其它各种转染试剂(Sambrook，J.et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY))、电穿孔(Ausubel，F.et al.(1994)In Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons，NY)，Vol.1，Ch.5和9)等本领域技术人员知晓的各种方法。为了抑制在内体中的分解，可以在转染中加入氯喹(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：3015)。作为转染试剂中的几种，可以列举出DOTMA(Roche)、SuperfectTransfection Ragent(QIAGEN，Cat No.301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Roche #1811169)、TransIT-LT 1(Mirus，Product No.MIR 2300)、CalPhos^TMMammalian Transfection Kit(Clontech#K2051-1)、CLONfectin^TM(Clontech#8020-1)等。已知包膜病毒在形成病毒粒子时会摄入宿主细胞来源的蛋白质，这样的蛋白质在导入细胞时可能导致抗原性和细胞毒性(J.Biol.Chem.(1997)272，16578-16584)。因此，使用没有包膜的RNP是有优势的(WO00/70055)。

此外，也可以通过将转录编码AB5B-Aβ抗原肽融合蛋白质的病毒基因组RNA的表达载体、与编码该基因组RNA的复制所必需的病毒蛋白质(N、P和L蛋白质)的表达载体导入细胞，而在细胞内直接形成病毒RNP。导入了病毒载体的细胞也可以这样制作。

本发明的载体的剂量因疾病种类、患者体重、年龄、性别和症状、施用目的、导入的组合物的施用形式、施用方法、导入的基因等而异，本领域技术人员可以确定合适的施用量。施用途径可以适当选择，包括例如经皮、鼻内、经支气管、肌肉内、腹腔内和皮下这些途径，但施用途径不限于这些例子。特别地，优选肌肉内施用、皮下施用、鼻内施用(包括利用滴鼻、喷雾、导管进行的施用等)、手掌或足背皮内施用、脾脏直接施用、腹膜内施用等。接种部位可以是一处或多处、例如2～15处。接种剂量可以根据对象动物、接种部位和接种次数等适宜调整。载体优选以约10⁵～约10¹¹CIU/ml、更优选约10⁷～约10⁹CIU/ml、最优选约1×10⁸～约5×10⁸CIU/ml的范围内的量与药学上可接受的担载体组合施用。针对人的单个剂量换算成病毒效价为1×10⁴CIU～5×10¹¹CIU(细胞感染单位)、且优选2×10⁵CIU～2×10¹⁰CIU。在利用细胞进行接种(回体施用)的情况下，可以向例如人细胞、优选自身的细胞导入载体，可以使用10⁴～10⁹个细胞，优选10⁵～10⁸个细胞、或其溶胞产物。在给非人动物接种载体的情况下，剂量可以基于例如目的动物与人的体重比或施用靶标部位的体积比(例如平均值)从上述的剂量来换算。

施用次数可以是1次或者多次、只要副作用在临床上可接受的范围内。每天的施用频率也是如此。虽然单次施用也可以发挥显著效果，但导入载体2次以上能够获得更强的效果。此外，可以施用其它Aβ抗原或表达该抗原的载体。

在多次施用的情况下，可以适宜调整施用的间隔。可以以例如1周～数十个月的间隔进行接种。更具体地，可以以1～60周、2～60周、3～30周、4～20周、5～10周的间隔进行接种。此外，当进行多次接种时，例如可以将本发明的载体、希望的Aβ抗原肽或表达该肽的载体等任意组合，且可以通过例如肌肉注射、鼻内、皮内、或皮下施用等希望的接种途径进行加强免疫。在进行多次接种的情况下，本发明的载体可以在其中的任意次接种中施用至少1次。优选地，在初次免疫或第2次免疫中施用本发明的载体，但在第一次和第二次免疫以外的施用中也可以施用本发明的载体。此外，本发明的载体的施用可以与例如纯化或粗制Aβ肽、AB5B-Aβ抗原肽融合蛋白质、编码它们的希望的载体、或导入了该载体的细胞或其匀浆物等的施用任意组合。特别是，优选多次施用本发明的载体，或者将本发明的载体与AB5B-Aβ抗原肽融合蛋白质组合施用。融合蛋白质可以作为例如导入了本发明的载体的细胞的溶胞产物来施用。

例如，优选在初次免疫中接种本发明的载体，而第2次免疫中接种本发明的载体或Aβ抗原肽(Aβ或其片段、或包含其的融合蛋白质等)。此外，也可以在初次免疫中接种Aβ抗原肽(Aβ或其片段、或包含其的融合蛋白质等)，而在第2次免疫中接种本发明的载体。作为加强免疫中使用的Aβ抗原肽，可以使用例如利用本发明的载体产生的、使用大肠杆菌等细菌产生的、使用动物细胞产生的或者合成肽等(参照实施例)。

施用对象包括具有免疫系统的希望的脊椎动物(人和非人脊椎动物)；优选鸟类和哺乳动物，更优选哺乳动物(包括人和非人哺乳动物)。具体地，所述哺乳动物包括人、猴等非人灵长类、小鼠和大鼠等啮齿类、以及如兔、山羊、绵羊、猪、牛、猫、和犬等其它所有的哺乳动物。这些动物在例如抗Aβ抗体的高效率生产中是有用的。此外，阿尔茨海默病模型动物在评价本发明的载体的治疗效果方面也是有用的。在以阿尔茨海默病的治疗和/或预防作为目的时，施用对象包括例如：具有阿尔茨海默病的至少一种因素、阿尔茨海默病的至少一种症状、或高于健康个体的风险的动物或患者，或来源于它们的组织、细胞，包括例如罹患阿尔茨海默病的个体、Aβ水平增高的个体、Aβ沉积增强的个体、具有阿尔茨海默病型突变基因的个体、阿尔茨海默病模型动物、或者其来源的组织、细胞等。例如，可以适宜使用表达APP、PS-1和/或PS-2等阿尔茨海默病型突变体的动物。具体地，可以使用表达具有London型突变(V717I等)、Sweden型突变(K670N，M671L)等FAD突变的APP的转基因动物等(Hsiao K等，Science.1996；274：99-102；Irizarry M等，JNeuropath Exper Neurol.1997；56：965-973；Sturchler-Pierrat C等，Proc NatlAcad Sci USA.1997；94(24)：13287-13292；Proc Natl Acad Sci USA 92：2041-2045，1995)。

当施用本发明的载体时，包含Aβ抗原肽的融合蛋白质高水平表达，诱导针对Aβ的体液免疫(抗Aβ抗体)。由此，可以期待改善阿尔茨海默病的至少一种症状。阿尔茨海默病的症状包括例如：脑组织内或血中的Aβ蓄积和/或沉积、老年斑的数量或脑内占有面积的比例的增加、小胶质活性的亢进、小胶质对脑、特别是老年斑的浸润和/或蓄积、炎症时被活化的物质例如补体的脑内蓄积、学习和/或记忆障碍等。特别是，通过本发明的载体的施用，可以期待血中抗Aβ抗体水平的提高、和/或脑组织中的Aβ的减少。已知抗Aβ抗体本身对阿尔茨海默病具有治疗效果，因此，血中的抗Aβ抗体的提高可以作为治疗效果的指标。

针对Aβ的体液免疫的诱导可以通过血浆中的抗Aβ抗体的测定来进行确认。抗体水平可以采用ELISA(酶联免疫吸附测定)和奥脱洛尼(Ouchterlony)法来测定。ELISA法例如可以这样实施：抗原附接在微量滴定板上，制备抗血清，将制成的抗血清进行2倍梯度稀释(起始溶液1∶1000)，将稀释的抗血清加到平板上进行抗原抗体反应。然后，为了生色，使经免疫的动物的抗体与作为第二抗体的过氧化物酶酶标记的异种抗体反应。可以基于当吸光度为最大生色吸光度的1/2时抗体的稀释倍率计算出抗体效价。或者，在奥脱洛尼法中，抗原和抗体在琼脂凝胶内扩散，作为免疫沉降反应的结果，形成白色的沉降线。沉降线可以用于测定抗体效价，即发生免疫沉降反应时抗血清的稀释倍率。脑组织中的Aβ水平例如可以使用脑组织的抽提物，通过Biosource ELISA试剂盒等来测定。

此外，本发明涉及评估对阿尔茨海默病的预防或治疗效果的方法，所述方法包括下列步骤：将包含本发明的载体或导入了该载体的细胞的组合物施用于个体，并检测该个体中的阿尔茨海默病的至少一种症状。施用对象包括例如具有阿尔茨海默病的至少一种因子，或表现出阿尔茨海默病的至少一种症状，或其风险高于健康正常个体的个体，例如罹患阿尔茨海默病的个体、阿尔茨海默病模型动物、Aβ水平增加的个体、Aβ沉积增加的个体、具有阿尔茨海默病型突变基因的个体、还有已发生阿尔茨海默病的至少一种症状、或者虽尚未发病但阿尔茨海默病的至少一种症状的发生率高于正常个体的个体。比较的对照可以是未被施用本发明的载体或组合物的个体。当施用于阿尔茨海默病发病前的个体时，可以等待未施用的对照个体出现阿尔茨海默病的至少一种症状后，比较施用的有无导致的效果。

作为阿尔茨海默病的症状，可以测定脑内的Aβ量的提高、Aβ的蓄积和沉积、老年斑的形成、老年斑的数量、老年斑在脑组织内的面积百分比、学习和/或记忆力等。这些方法可以用于进行阿尔茨海默病的治疗和预防效果的监测。

Aβ沉积(老年斑)的减少效果可以按照例如以下规程来测定：将脑组织切片用70％甲酸进行处理，用5％H₂O₂使内源性的过氧化物酶失活后，使切片与抗Aβ抗体(例如6E10(Kim KS，et al.Neurosci.Res.Comm.7：113，1988))反应，使用过氧化物酶标记的第二抗体进行DAB生色。染色后，可以通过显微镜下观察，测定Aβ蓄积部分的面积。与未施用本发明的载体的情况相比，如果蓄积部分的面积的比例减少，则可以判断为Aβ沉积水平减少。或者，对于活体受试者体内的老年斑，可以在静注施用如1-氟-2，5-双(3-羟基羰基-4-羟基)苯乙烯基苯(FSB)等对淀粉样蛋白有亲和性的化合物后，利用MRI进行观察(Higuchi M等，Nat.Neurosci.8(4)：527-33，2005；Sato，K.等，Eur.J.Med.Chem.39：573，2004；Klunk，W.E.等，Ann.Neurol.55(3)：306-19，2004)。利用这样的非侵入性淀粉样蛋白影像技术，能够确认本发明的载体的效果。

此外，本发明还涉及测定针对Aβ的免疫反应的方法，其包含以下步骤：将本发明的载体、导入了该载体的细胞、或包含上述中的任何一个的组合物导入具有Aβ的蓄积和/或沉积或者具有发生Aβ的蓄积和/或沉积的倾向性的受试者，和检测受试者中的抗Aβ抗体。具有发生Aβ的蓄积和/或沉积的倾向性的受试者，是指Aβ的蓄积和/或沉积的发生率在统计学上显著地高于正常型个体的个体。这样的受试者包括例如阿尔茨海默病模型动物、和具有阿尔茨海默型突变基因的个体。此外，本发明还涉及测定Aβ的蓄积和/或沉积的方法，包括以下步骤：将本发明的载体、导入了该载体的细胞、或包含上述中的任何一个的组合物施用于具有Aβ蓄积和/或沉积或者具有发生Aβ蓄积和/或沉积的倾向性的受试者，和检测受试者中的Aβ蓄积和/或沉积的水平。如果需要，与非施用个体进行比较来确定载体施用的效果。通过这些方法，能够监测针对Aβ的免疫应答和/或减少Aβ蓄积/沉积的效果。

此外，本发明还涉及诱导、检测或制造抗Aβ抗体的方法，所述方法包括将本发明的载体、导入了该载体的细胞、或包含上述中的任何一个的组合物施用于个体的步骤。在进行抗Aβ抗体的检测时，所述方法还包括检测该动物产生的抗Aβ抗体的步骤。此外，抗Aβ抗体的制造方法包括回收该动物产生的抗Aβ抗体的步骤。要进行施用的个体包括具有免疫系统的的动物，并且不限于患有阿尔茨海默病及发病率提高的动物。例如，还可以通过对经修饰而产生人源化抗体的动物(小鼠)等施用本发明的载体，来制造针对Aβ的人抗体。本发明的载体能够强力地诱导抗Aβ抗体，因此能够有效率地生产抗Aβ抗体。制得的抗体可以用于Aβ的检测、分离、纯化、以及作为抑制Aβ的蓄积的治疗剂(被动免疫药)。

此外，本发明揭示，利用RNA病毒载体进行加强免疫能够显著地提高抗体效价(实施例11)。目前为止认为，多次施用RNA病毒载体难以实现导入基因的高表达。原因是这样的施用可引起宿主的免疫应答。但是，本发明人已经查明，在利用表达抗原蛋白质的RNA病毒载体进行初次免疫后，再次接种表达抗原蛋白质的RNA病毒载体时，抗体效价明显提高。这提示，与基于导入基因的表达效率预测的结果相反，多次(2次以上)施用编码抗原蛋白质的RNA病毒载体对提高针对抗原的抗体效价是极其有用的。即，本发明还涉及以下发明。

(1)提高针对抗原的抗体效价的方法，包括施用编码该抗原蛋白质的RNA病毒载体2次以上的步骤。

(2)(1)所述的方法，其中，抗原是与AB5毒素B亚基的融合蛋白质。

(3)(2)所述的方法，其中，AB5毒素B亚基是霍乱毒素B(CTB)。

(4)(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，抗原是感染性病毒或微生物的抗原、癌相关抗原、或阿尔茨海默病相关抗原。

(5)(4)所述的方法，其中，抗原包含淀粉样蛋白β抗原肽。

(6)(5)所述的方法，其中，淀粉样蛋白β抗原肽包含1个或多个拷贝的Aβ1-15或其片段。

(7)(5)所述的方法，其中淀粉样蛋白β抗原肽具有1～8个拷贝的Aβ1-15或其片段连接在一起而成的结构。

(8)(5)所述的方法，其中淀粉样蛋白β抗原肽具有4～8个拷贝的Aβ1-15连接在一起而成的结构、。

(9)(1)～(7)中任一项所述的方法，其中，RNA病毒载体为负链RNA病毒载体。

(10)(9)所述的方法，其中，负链RNA病毒载体为副粘病毒载体。

(11)(9)所述的方法，其中，负链RNA病毒载体为副粘病毒载体。

(12)(1)～(11)中任一项所述的方法，其中，至少1次施用为肌肉内施用。

(13)(1)～(12)中任一项所述的方法，其中，至少1次施用为鼻内施用。

(14)(1)～(13)中任一项所述的方法，其用于治疗疾病。

(15)(14)所述的方法，其中，疾病是感染、癌症或阿尔茨海默病。

(16)一种用于通过包括施用编码抗原蛋白质的RNA病毒载体2次以上的步骤的方法来提高针对该抗原的抗体效价的组合物，其包含所述RNA病毒载体和药学上可接受的担载体。

(17)(16)所述的组合物，其用于在上述(1)～(15)中任一项所述的方法中使用。

(18)(16)或(17)所述的组合物，其用于治疗感染、癌症或阿尔茨海默病。

(19)编码抗原蛋白质的RNA病毒载体在制造用于通过包括施用该载体2次以上的步骤的方法提高针对该抗原的抗体效价的药物中的用途。

(20)(19)所述的用途，其是在制造在上述(1)～(15)中任一项所述的方法中使用的药物中的用途。

(21)(19)或(20)所述的用途，其是在制造在感染、癌症或阿尔茨海默病的治疗中使用的药物中的用途。

载体的施用途径、剂量、施用间隔等可以适宜选择，例如如本说明书中的具体记载所述。对于抗原没有特殊限制，可以列举出感染性病原微生物或病毒等来源的抗原、癌症抗原、阿尔茨海默病抗原(Aβ、其片段)等。多次施用可以是2次、3次、4次或更多次。此外，只要至少一部分抗原是共有的，多次施用中可以施用编码并非完全相同的抗原的载体。例如，初次免疫中施用编码与AB5毒素B亚基融合的抗原蛋白质的载体，而在加强免疫时施用编码未与AB5毒素B亚基融合的单独的抗原蛋白质的载体，或者反之。此外，各次施用中使用的载体的种类是可变的，只要是RNA病毒载体即可。优选使用副粘病毒载体、更优选仙台病毒载体。对施用间隔没有特殊限制，可以在例如1周～6个月、2周～4个月、或者3周～3个月之间适宜调整。通过多次施用，抗体效价可以提高至例如1.2倍以上、1.3倍以上、1.4倍以上、1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上或2倍以上。抗体效价可以采用ELISA等公知方法进行测定。这样，本发明的载体可以用作阿尔茨海默病的预防或治疗用药物。

此外，本发明的载体也可以优选以病毒样粒子(VLP)的形式使用，或者也可以像通常所知的病毒粒子那样使用。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不受这些实施例的限制。而且，本说明书中引用的文献全部并入作为本说明书的一部分。

[实施例1]携带Aβ42基因的SeV载体的构建

(1)Aβ42基因的Not I片段的构建

对于Aβ42基因，使用覆盖人淀粉样蛋白β肽序列(1-42)(SEQ ID NO：1)全长的多个引物，利用PCR进行组装。Aβ42的核苷酸序列在考虑人密码子选择的基础上进行了最优化。所得的序列具有如下结构：在N端侧结合有Igκ分泌信号，在C端侧添加仙台病毒的转录信号(图1，SEQ ID NO：2)。

构建方法如图2所示。首先，将覆盖Igκ信号与Aβ42的全区域的6种长引物F1(SEQ ID NO：4)，F2(SEQ ID NO：5)，R1(SEQ ID NO：6)，R2(SEQ IDNO：7)，R3(SEQ ID NO：8)，R4(SEQ ID NO：9)混合。使用该引物化合物不加入模板而进行PCR。然后，以其PCR产物作为模板，使用导入了限制酶EcoRI的识别序列的2种引物F1-1(SEQ ID NO：10)和R4-1(SEQ ID NO：11)再进行PCR。然后，将所得的PCR产物用限制酶EcoRI切割，亚克隆至pCI表达质粒(Promega公司)的EcoRI位点，通过测序选择出正确序列的克隆。

以选择出的质粒作为模板，用添加了NotI识别序列的引物NotI-Aβ-F(SEQ ID NO：12)和添加了仙台病毒转录信号和NotI识别序列的引物NotI-polyA-R(SEQ ID NO：13)进行PCR，所得的PCR产物用限制酶NotI消化，构建了目的Aβ42NotI片段(图1，SEQ ID NO：2)。

(2)携带Aβ42基因的仙台病毒cDNA的构建

将F基因缺失型SeV载体(WO00/70070)的cDNA(pSeV18+NotI/ΔF)用NotI消化，在其NotI位点插入Aβ42NotI片段，构建了携带Aβ42基因的F基因缺失型SeV cDNA(pSeV18+Aβ42/ΔF)。

[实施例2]携带了Aβ42与CTB的融合基因(CTB-Aβ42)的SeV载体的构建

(1)CTB-Aβ42基因的NotI片段的构建

CTB-Aβ42的NotI片段具有下述结构：将人淀粉样蛋白β序列(1-42)的序列的N末端侧经由GPGP氨基酸接头与包含分泌信号的霍乱毒素B亚基序列(SEQ ID NO：14)连接，并在其C末端侧添加仙台病毒的转录信号(图3，SEQ ID NO：15)。而且，为了增加表达效率，按照人的密码子用法变更了CTB和Aβ的核苷酸序列，但氨基酸序列不变。

该基因的构建通过使用覆盖该基因全长的多个长引物进行PCR，来合成其全长。具体地，合成了8种覆盖CTB-Aβ区域的全长的长引物[CTB-AβF-1(SEQ ID NO：17)，F-2(SEQ ID NO：18)，F-3(SEQ ID NO：19)，F-4(SEQ IDNO：20)，R-1(SEQ ID NO：21)，R-2(SEQ ID NO：22)，R-3(SEQ ID NO：23)，R-4(SEQ ID NO：24)]，使用这8种引物的混合物进行PCR，从而得到了对应于从N端到Aβ42的片段。为了制备含仙台病毒转录信号的C端侧片段，以pCI质粒(Promega公司)为模板、用2种引物CTB-AβF1-2(SEQ ID NO：25)和CTB-AβR5-2(SEQ ID NO：26)进行PCR。PCR产生了覆盖CTB-Aβ全长的PCR片段。将该PCR片段通过TA克隆亚克隆至pGEM-T Easy质粒(Promega公司)中。确认碱基序列后，扩增质粒，将该质粒用限制酶NotI进行消化，构建了目的CTB-Aβ42NotI片段(SEQ ID NO：15)。

(2)携带CTB-Aβ42基因的仙台病毒cDNA的构建

将F基因缺失型SeV载体(WO00/70070)的cDNA(pSeV18+NotI/ΔF)用NotI消化，在其NotI位点插入CTB-Aβ42NotI片段，构建了携带CTB-Aβ42基因的F基因缺失型SeV cDNA(pSeV18+CTB-Aβ42/ΔF)。

[实施例3]携带了Aβ42与IL-4的融合基因的SeV载体的构建

(1)Aβ42与IL-4的融合基因的NotI片段的构建

Aβ42基因与小鼠IL-4的融合采用部分重叠并用PCR组装的方法进行。

Aβ42基因利用含有Aβ42EcoRI片段(实施例1：图2)的质粒制备。同时，小鼠IL-4基因(SEQ ID NO：27)是通过下列程序制备为cDNA。从小鼠(BALB/cA)的脾脏抽提mRNA，使用IL-4特异性引物进行逆转录，用PCR进行扩增，并亚克隆至克隆质粒。将所得的具有小鼠IL-4cDNA作为插入序列的质粒用于构建。

具体地，以小鼠IL-4质粒为模板，用2种引物NotI-IL4-F(SEQ ID NO：29)和IL4-R(SEQ ID NO：30)进行PCR。另一方面，以Aβ42质粒为模板，用引物Aβ42-F(SEQ ID NO：31)和NotI-Aβ42-R(SEQ ID NO：32)进行PCR，得到了IL-4与Aβ42的PCR片段。引物IL4-R和Aβ42-F被设计成一部分重叠。因而通过将IL-4与Aβ42的PCR片段混合作为模板，并用引物NotI-IL4-F和引物NotI-Aβ42-R进行PCR，使2个基因结合为一个融合基因。将该PCR片段亚克隆至克隆质粒中。确认核苷酸序列后，用限制酶NotI进行切割，从而构建了目的的含有Aβ42与IL-4的融合基因的NotI片段(SEQ IDNO：33)。

(2)Aβ42基因携带仙台病毒cDNA的构建

将F基因缺失型SeV载体(WO00/70070)的cDNA(pSeV18+NotI/ΔF)用NotI消化，在其NotI位点中插入如上述制备的mIL4-Aβ42NotI片段，构建了携带Aβ42基因的F基因缺失型SeV cDNA(pSeV18+mIL4-Aβ42/ΔF)。

[实施例4]仙台病毒载体的重建与扩增

重建的重构和扩增按照Li等的报道(Li，H.-O.等，J.Virology 74.6564-6569(2000)，WO00/70070)及其改进方法(WO2005/071092)进行。使用的载体为F基因缺失型，因此利用了F蛋白辅助细胞，其中通过Cre/loxP表达诱导系统表达F蛋白质。该系统利用了质粒pCALNdLw(Arai，T.等，J.Virol.72：1115-1121(1988))，该质粒设计为使得基因产物的表达被Cre DNA重组酶所诱导。按照Saito等的方法(Saito，I.等，Nucl.Acid Res.23，3816-3821(1995)，Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121(1998))，用表达Cre DNA重组酶的重组腺病毒(AxCANCre)感染带有该质粒的转化体，来表达插入基因。

采用上述方法，制备了分别携带CTB-mCRF、CTB-mET1、CTB-mPYY、CTB-mGLP2、mCRF、mET 1、mPYY、mGLP2、Aβ42、CTB-Aβ42、或mIL4-Aβ42基因的F基因缺失型SeV载体(分别为SeV18+CTB-mCRF/ΔF，SeV18+CTB-mET1/ΔF，SeV18+CTB-mPYY/ΔF，SeV18+CTB-mGLP2/ΔF，SeV18+mCRF/ΔF，SeV18+mET 1/ΔF，SeV18+mPYY/ΔF，SeV18+mGLP2/ΔF，SeV18+Aβ42/ΔF，SeV18+CTB-Aβ42/ΔF，SeV18+mIL4-Aβ42/ΔF)。

[实施例5]携带了Aβ42与PEDI的融合基因的SeV载体的构建

(1)携带Aβ42-PEDI融合基因的SeV载体cDNA的构建

通过使用10种引物：PEDI-1F(SEQ ID NO：35)、PEDI-2R(SEQ ID NO：36)、PEDI-3F(SEQ ID NO：37)、PEDI-4R(SEQ ID NO：38)、PEDI-5F(SEQ IDNO：39)、PEDI-6R(SEQ ID NO：40)、PEDI-7F(SEQ ID NO：41)、PEDI-8R(SEQID NO：42)、PEDI-9F(SEQ ID NO：43)和PEDI-10R(SEQ ID NO：44)进行PCR扩增了PEDI基因。按照下述程序将PEDI基因和Aβ42融合在一起并插入SeV载体。以携带Aβ42的SeV载体作为模板、使用引物SeVF6(SEQ IDNO：45)和S-PEDI-C(SEQ ID NO：46)进行PCR得到片段1，以同一模板使用引物PEDI-Ab-N(SEQ ID NO：47)和SEVR280(SEQ ID NO：48)进行PCR得到片段3。以PEDI基因为模板、使用引物PEDI-N(SEQ ID NO：49)和PEDI-C(SEQ ID NO：50)进行PCR得到片段2。使用这些片段作为模板进行重叠PCR，制备PEDI-Aβ42NotI片段(SEQ ID NO：51)。将获得的片段插入pSeV18+/ΔF的NotI位点，制备携带PEDI-Aβ42融合基因的F缺失型SeV载体的cDNA。

(2)携带PEDI-Aβ42的F缺失型SeV载体的重建

如实施例4所述那样，采用Li等的方法(Li，H.-O.等，J.Virology 74.6564-6569(2000)，WO00/70070)及其改进方法(WO2005/071092)重建了携带PEDI-Aβ42基因的SeV载体(SeV18+PEDI-Aβ42/ΔF)。

[实施例6]CTB融合、PEDI融合、和IL-4融合对Aβ42表达的效果的比较：用于CTB-Aβ42融合蛋白表达的SeV载体、用于PEDI-Aβ42融合蛋白表达的SeV载体、和用于IL-4-Aβ42融合蛋白表达的SeV载体的表达能力的比较

(1)将BHK21细胞用SeV18+Aβ42/ΔF、SeV18+IL-4-Aβ42/ΔF、SeV18+PEDI-Aβ42/ΔF、和SeV18+CTB-Aβ42/ΔF感染，以评价Aβ42抗原的水平。将BHK21细胞以1x10⁶个/孔播种于胶原包被的6孔板，以使用无血清培养基(VPSFM)稀释成MOI 10的各SeV载体进行感染。1小时后向板中加入含10％FBS的GMEM，24小时后更换为无血清培养基(VPSFM)，48小时后回收培养上清液和细胞，制备了细胞裂解液。

(2)利用ELISA进行定量

使用人Aβ42ELISA试剂盒(和光纯药工业)定量Aβ42。通过使用读板器进行吸光度测定(O.D.450)来评价表达量。

结果如图4所示。Aβ42表达水平可忽略，而IL-4-Aβ42、PEDI-Aβ42、CTB-Aβ42表达水平增加。细胞内的表达水平分别是kkAβ42的1395倍、171.5倍、12608倍。

[实施例7]CTB融合对Aβ42表达的效果：SeV载体单独表达Aβ42和SeV载体表达CTB-Aβ42融合蛋白的能力的比较

将汇合的前一天播种的BHK-21细胞(以3x10⁵个细胞/孔播种，12-孔板)用Aβ42单独携带SeV载体和CTB-Aβ42携带SeV载体以MOI 10进行感染，然后用VP-SFM培养基(1ml/孔)以37℃、5％CO₂进行培养，在第4天回收培养上清并制备细胞溶胞产物。通过丙酮沉淀将培养上清浓缩10倍，用1xSDS上样缓冲液制备了样品。细胞溶胞产物使用150μl/孔的1x SDS上样缓冲液进行了制备。将制备好的培养上清和细胞溶胞产物于98℃处理10分钟后，将Aβ42肽以1、0.5、0.25、0.125ng/泳道作为对照，进行SDS-PAGE(使用15％Wako凝胶)/Western印迹(使用6E10抗体)，进行蛋白定量。单独携带Aβ42的SeV载体的Aβ的表达水平在细胞溶胞产物中和上清中分别只有4.4ng/孔和7.2x10^-3ng/孔。另一方面，携带Aβ42-CTB融合基因的SeV载体的Aβ表达水平在细胞溶胞产物中是2500ng/孔、在上清中是200ng/孔。即在溶胞产物中和上清中分别大幅提高至568倍和27778倍。

[实施例8]携带Aβ15-CTB的融合基因(CTB-Aβ15)、或Aβ15的串联重复与CTB的融合基因(CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、或者CTB-Aβ15x8)的SeV载体的构建

(1)CTB-Aβ15基因的NotI片段的构建

以CTB-Aβ42基因为基础构建CTB-Aβ15基因的NotI片段(图5)。

以含有CTB-Aβ42基因NotI片段的质粒作为模板，使用添加了EcoRV限制位点的2种引物Aβ15-EcoR-R(SEQ ID NO：53)和Aβ15-EcoR-F(SEQ IDNO：54)进行反向PCR。将所得的PCR产物用限制酶EcoRV进行切割。然后，使产物自连接制备含有CTB-Aβ15片段的质粒。通过将该质粒用限制酶NotI进行切割，得到了感兴趣的CTB-Aβ15基因的NotI片段(SEQ ID NO：55)。

(2)CTB-Aβ15串联型(CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、或者CTB-Aβ15x8)基因的NotI片段的构建

利用2种基因构建CTB-串联Aβ15基因的NotI片段(图6)。

方法如下：除去含有CTB-Aβ42的质粒的Aβ42区域，并向质粒中导入限制酶位点。然后通过PCR在该位点中插入添加有限制酶位点的Aβ15串联的片段。

具体地，以含有CTB-Aβ42的NotI片段(实施例2：SEQ ID NO：15)的质粒作为模板，使用添加有限制酶SmaI位点的2种引物CTB-SmaI-R(SEQ IDNO：57)和CTB-SmaI-F(SEQ ID NO：58)进行反向PCR，将所得的PCR产物用SmaI进行切割，然后通过自连接得到Aβ42缺失的质粒。然后，在该质粒的SmaI位点中插入Aβ15串联片段。

以含有Aβ15的8串联NotI片段(SEQ ID NO：59)的质粒为基础，通过下述方法制备Aβ15串联片段。以该质粒为模板，使用添加限制酶位点的2种引物Aβ15-SmaI-F(SEQ ID NO：61)和Aβ15-EcoRV-R(SEQ ID NO：62)进行PCR。得到Aβ15的重复数不同的PCR产物。对这些产物进行TA克隆，确认核苷酸序列后，用2种限制酶SmaI和EcoRI进行切割，得到平末端的Aβ15串联片段。将这些片段分别插入Aβ42缺失质粒的SmaI位点。扩增得到的质粒，并用限制酶NotI进行切割，得到了目的片段：CTB-Aβ15x2NotI片段(SEQ ID NO：63)，CTB-Aβ15x4NotI片段(SEQ ID NO：65)和CTB-Aβ15x8NotI片段(SEQ ID NO：67)。

(3)携带CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、或CTB-Aβ15x8基因的仙台病毒cDNA的构建

将F基因缺失型SeV载体(WO00/70070)的cDNA(pSeV18+NotI/ΔF)用NotI消化，并在其NotI位点分别插入CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、CTB-Aβ15x8片段，构建了携带CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、CTB-Aβ15x8基因的F基因缺失型SeV cDNA(pSeV18+CTB-Aβ15/ΔF、pSeV18+CTB-Aβ15x2/ΔF、pSeV18+CTB-Aβ15x4/ΔF、和pSeV18+CTB-Aβ15x8/ΔF)。

[实施例9]Aβ肽表达能力的比较

(1)Western印迹

通过Western印迹法评价了构建的载体的感染力和表达。

将感染了SeV载体的细胞的匀浆液和培养上清与等体积的SDS-PAGE用样品缓冲液混合，于98℃加热热变性5分钟。用15％的丙烯酰胺凝胶对混合物进行SDS-PAGE，然后采用半干转印法转印到PVDF膜上。用5％牛乳/TBS-T封闭后，将膜与抗Aβ抗体(6E10)一起温育，然后与作为第二抗体的HRP标记抗小鼠IgG进行反应，使用化学发光底物SuperSignal West Femto通过CCD照相机进行检测。

结果显示CTB-Aβ42、CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、CTB-Aβ15x8在BHK细胞内表达，并被分泌到培养基中。还显示：CTB-Aβ15x8的表达水平比CTB-Aβ42的表达水平高，CTB-Aβ15x8向培养基中的分泌的量也明显大于CTB-Aβ42(图7)。

(2)GM1-ELISA

使用固定化有神经节苷脂GM1的平板评价了CTB对GM1的结合。

将神经节苷脂GM1(5μg/mL)固定化于96孔板(Nunc，MaxiSorp plate)的各孔，用20％BlockingOne(NACALAI TESQUE)封闭后，向孔中加入感染了SeV载体的细胞的培养上清(20倍～2,000,000倍稀释)。与HRP标记的6E10抗体温育后，使用TMB生色底物进行检测。结合量的评价通过使用读板器进行吸光度测定(O.D.450)来进行。

结果显示，向培养基中分泌的CTB-Aβ42、CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、CTB-Aβ15x8与GM1结合。CTB-Aβ15x8的结合量为CTB-Aβ42的10倍，CTB-Aβ15的结合量为CTB-Aβ15x8的100倍。这提示随着Aβ15的重复数目增加，对GM1的结合能力降低(图8)。

[实施例10]构建的各种SeV载体在正常小鼠中诱导抗Aβ抗体的能力的评价

(1)正常小鼠(肌肉内施用CTB-Aβ42与CTB-Aβ15x8的比较)

对于C57BL/6N小鼠以5x107CIU/只的滴度肌肉内施用(右后肢)携带了CTB-Aβ42基因、CTB-Aβ15x8基因、GFP基因的SeV载体，以评价抗体的效价。上述处置14天后，从小鼠采集血液，测定了血浆中的抗Aβ抗体水平。将Aβ1-42肽(5μg/mL)固定化于96孔板(Nunc，MaxiSorp plate)的各孔，用20％BlockingOne(NACALAI TESQUE)进行封闭后，向孔中加入小鼠血浆(300～300,000倍稀释)，与过氧化物酶标记的小鼠IgG抗体一起温育后，使用TMB生色底物进行检测。通过使用读板器进行吸光度测定(O.D.450)来评价抗Aβ抗体效价。使用了抗Aβ抗体作为标准抗体(6E10)。

结果显示，在CTB-Aβ42基因施用组(n＝6)和CTB-Aβ15x8基因施用组(n＝6)中抗Aβ抗体效价提高，而作为对照的GFP基因施用组(n＝6)中未见抗Aβ抗体效价的提高(图9)。CTB-Aβ15x8基因施用组的抗体效价为CTB-Aβ42基因施用组的12.23倍。

(2)正常小鼠(肌肉内、皮内、鼻内施用)

对于C57BL/6N小鼠，以5x10⁶CIU/只或5x10⁷CIU/只的滴度通过鼻内、皮内、和肌肉内(右后肢)施用携带了CTB-Aβ15x8基因的SeV载体；作为对照组，以5x10⁷CIU/只的滴度肌肉内施用(右后肢)携带了GFP基因的SeV载体，进行了抗体效价的评价。上述处置14天后，从小鼠采集血液，测定了血浆中的抗Aβ抗体水平。

其结果显示，除对照组外，全部的施用组中Aβ抗体效价均提高。皮内施用组与其它施用组相比，抗体效价较低，鼻内施用组与同滴度的肌肉内施用组相比，抗体效价更高(图10)。

(3)正常小鼠(鼻内施用)

对于C57BL/6N小鼠，以5x10⁷CIU/只的滴度鼻内施用携带了CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、CTB-Aβ15x8、GFP基因(作为对照组)的SeV载体，进行了抗体效价的评价。

结果显示，在所有施用组中，与对照组相比，抗体效价显著地提高。与CTB-Aβ15x8施用组相比，在CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x4施用组中获得了更高的抗Aβ抗体效价(图11)。

[实施例11]构建的各种SeV载体对正常小鼠的抗Aβ抗体诱导的增强效果的评价

(1)正常小鼠(肌肉注射)：利用纯化CTB-Aβ42蛋白进行加强免疫

对于C57BL/6N小鼠，以各5x10⁷CIU/只的滴度肌肉内施用(右后肢)携带了CTB-Aβ42基因的SeV载体，在14天和28天后，分别以20μg/PBS/只、100μg/PBS/只、或100μg/IFA(弗氏不完全佐剂)/只肌肉内施用(右后肢)大肠杆菌生产的CTB-Aβ42蛋白，以评价抗体效价。上述处置后每14天一次从小鼠采集血液，测定血浆中的抗Aβ抗体水平。

结果显示，在用CTB-Aβ42基因进行免疫、并用CTB-Aβ42蛋白加强免疫的组中获得了显著的抗Aβ抗体的提高(图12)。2次加强免疫后，Aβ抗体效价在20μg加强免疫组中为32μg/ml、在100μg加强免疫组中为107μg/ml、在100μg+IFA加强免疫组中为25.9μg/ml。

(2)正常小鼠(肌肉注射)：利用SeV载体进行的加强免疫[1]

对于C57BL/6N小鼠以5x10⁷CIU/只的滴度肌肉内施用(右后肢)携带了CTB-Aβ42基因和CTB-Aβ15x8基因的SeV载体，56天后以相同滴度肌肉内施用(右后肢)相同SeV载体，以评价抗体效价。

在上述处置14天和28天后，从小鼠采集血液，测定了血浆中的抗Aβ抗体水平。

结果显示，在CTB-Aβ15x8基因加强免疫组中得到了显著的抗Aβ抗体效价的提高(图13)。另一方面，在CTB-Aβ42基因加强免疫组中，抗Aβ抗体效价的提高较上述的CTB-Aβ15x8基因加强免疫组为少。

(3)正常小鼠(肌肉注射)：利用SeV载体进行加强免疫[2]

对于C57BL/6N小鼠以5x10⁶CIU/只或5x10⁷CIU/只的滴度肌肉内施用(右后肢)携带了CTB-Aβ15x8基因或CTB-Aβ42基因的SeV载体，56天后以相同滴度肌肉内施用(右后肢)相同SeV载体，进行了抗体效价的评价。

在上述处置14天和28天后，从小鼠采集血液，测定血浆中的抗Aβ抗体水平。

结果显示，两载体均明显显示了加强免疫的效果，特别是在CTB-Aβ15x8基因加强免疫组中抗Aβ抗体效价的提高更为显著(图14)。

(4)正常小鼠(鼻内施用)：利用SeV载体进行的加强免疫

对于C57BL/6N小鼠以5x10⁶CIU/只和5x10⁷CIU/只的滴度鼻内施用携带了CTB-Aβ15x8基因的SeV载体，56天后以相同滴度鼻内施用相同SeV载体，以评价抗体效价。

结果显示，在CTB-Aβ15x8基因加强免疫组中，以3/3的比例得到了抗Aβ抗体效价的显著提高(图15A)。

(5)正常小鼠(鼻内施用)：利用SeV载体进行的多次加强免疫和抗体效价的长期监测(1年间)

对于C57BL/6N小鼠以5x10⁶CIU/只和5x10⁷CIU/只的滴度鼻内施用携带了CTB-Aβ15x8基因的SeV载体，在84天后、168天后、和371天后以相同滴度鼻内施用相同的SeV载体，进行了抗体效价的评价。

在上述处置14天和28天后、从小鼠采集血液，测定了血浆中的抗Aβ抗体水平。

结果显示，在CTB-Aβ15x8基因加强免疫组中以3/3的比例抗Aβ抗体效价得到了显著的提高。抗体效价在试验开始1年后仍维持20μg/mL以上。通过在1年后进行加强免疫也得到了显著的Aβ抗体效价的提高(图15B)。

[实施例12]构建的各种SeV载体进行的在APP模型小鼠中的有效性评价：肌肉注射

(1)抗Aβ抗体效价

对于作为阿尔茨海默病模型小鼠的APP转基因小鼠(Tg2576)(13个月龄)，以5x10⁷CIU/只肌肉内施用(右后肢)SeV18+CTB-Aβ18x5/ΔF(也称为CTB-Aβ15x8)、或SeV18+CTB-Aβ42/ΔF(也称为CTB-Aβ42)、或作为对照的携带GFP基因的SeV载体(SeV18+GFP/ΔF；以下也称为“GFP”)。在14天和28天后，对于CTB-Aβ42基因施用组中的一半小鼠肌肉内施用(右后肢)大肠杆菌生产的CTB-Aβ42蛋白。在SeV载体施用后第14、28、42、56天，测定了血浆中的抗Aβ抗体效价。

结果显示，在CTB-Aβ15x8基因施用组中抗Aβ抗体效价显著提高。在CTB-Aβ42基因施用组中，一半的小鼠中抗Aβ抗体效价几乎没有提高。且抗Aβ抗体效价的提高也比CTB-Aβ15x8基因施用组少。在CTB-Aβ42蛋白加强免疫组中，加强免疫未提高抗Aβ抗体的效价(图16)。

(2)脑内Aβ量：ELISA

SeV载体施用开始56天后，从上述APP小鼠收集脑组织，通过ELISA测定左半球脑组织中的Aβ水平。将脑组织在TBS中进行超声波匀浆，35,000g离心1小时后，采集上清作为可溶性Aβ级分。将沉淀在10％甲酸中进行超声波匀浆，然后用1M Tris进行中和。将所得的样品保存作为不溶性Aβ级分。使用和光纯药工业的Aβ42ELISA试剂盒和Aβ40ELISA试剂盒，测定了脑内Aβ的水平。其结果显示，与GFP基因施用组中相比，在CTB-Aβ15x8基因施用组中，不溶性级分中的Aβ水平降低至80％左右。在CTB-Aβ42基因施用组中未见Aβ水平的降低。在CTB-Aβ42蛋白加强免疫组中Aβ水平仅稍稍降低。与GFP基因施用组相比，CTB-Aβ15x8基因施用组中可溶性级分中的Aβ水平降低至50％左右。CTB-Aβ42基因施用组中未见Aβ水平的降低。CTB-Aβ42蛋白加强免疫组中的Aβ水平降低至60～70％(图17)。

(3)SeV18+CTB-Aβ15x8/ΔF的消除老年斑的效果

将仙台病毒载体通过肌肉注射施用给小鼠。在施用后8周(15个月龄)时将各组解剖。为了进行病理组织检查，将右脑半球浸渍固定于10％中性缓冲福尔马林液中，石蜡包埋后，从距脑正中裂约2mm的部位的脑组织制备纵剖切片。为了检测上述切片组织中的Aβ蛋白和老年斑，用70％甲酸进行处理切片组织。用5％H₂O₂灭活内源性过氧化物酶活性。与抗Aβ抗体(6E10抗体、1000倍稀释)进行温育后，加入过氧化物酶标记的第二抗体，进行了DAB显色。此外，使用与显微镜相连接的3CCD照相机进行拍摄。对于每个样品，组合20-30个图像文件(图18)。使用图像解析软件NIH image，对于全部样品采用同一条件测定了在嗅球、大脑新皮质和海马各区域中Aβ蓄积部分所占的面积，以计算出Aβ蓄积部分在各测定区域中所占的面积的比例。此外，还对测定中使用的老年斑的个数进行了比较。其结果如图19所示，老年斑的面积百分比显示出减少的倾向，特别是在海马中。

(4)施用SeV18+CTB-Aβ15x8/ΔF的安全性评估

像上述(3)那样，对于施用后经过8周时(15个月龄)从治疗组和对照组获得的石蜡切片的HE染色标本和抗Iba-1抗体(小胶质)染色标本评价了中枢神经系统中炎症细胞浸润和小胶质活化的有无。结果显示，对于对照组和治疗组，在脑的任何部位均完全未检测到浸润的炎症细胞。这证实了本发明的载体不会诱发中枢神经系统的炎症。

此外，在两组动物的老年斑周围均观察到了小胶质的活化。但是在载体施用组的动物中，存在老年斑数目减少的倾向，与之平行地，也存在小胶质所占面积率减少的倾向。

[实施例13]携带NP-Aβ融合蛋白的SeV载体cDNA的构建

通过下述步骤，构建了编码N末端侧具有仙台病毒的NP蛋白质、C末端侧具有Aβ肽(由8个拷贝的Aβ15串联连接而成(Aβ15x8))的融合蛋白质的仙台病毒载体。以pSeV18+CTB-Aβ15x8/ΔF作为模板，使用引物SeVF6(SEQID NO：45)和NP/Aβ15-R(SEQ ID NO：72)进行PCR，得到了NP片段。使用引物NP/Aβ15-F(SEQ ID NO：71)和引物NotI-EIS-R(SEQ ID NO：70)进行PCR，得到了Aβ15x8片段。引物NP/Aβ15-F与NP/Aβ15-R被设计成彼此部分重叠。因此，将NP片段和Aβ15x8的PCR片段混合作为模板，使用引物SeVF6和引物NotI-EIS-R进行PCR，使这2个基因融合成一个融合基因。将所得的PCR片段亚克隆至克隆质粒中。确认了核苷酸序列后，用限制酶NotI切割该质粒。将切割得到含有NP-Aβ15x8的融合基因NotI片段插入pSeV18+/ΔF的NotI位点，得到了含有目的NP-Aβ融合蛋白的SeV载体cDNA(p SeV 18+(NP-Aβ15x8)/ΔF)。

NotI-EIS-R：5’-ACCTGCGGCCGCGAACTTTCACCCTAAGTTTTTC(34mer)(SEQ ID NO：70)

N P/Aβ15-F：5’-GAA T CGGCCCCGGCCCCGACGCCGAGTTCAGACAC(35mer)(SEQ ID NO：71)

NP/Aβ15-R：5’-GCGTCGGGGCCGGGGCCGATTCCTCCTATCCCAGC(35mer)(SEQ ID NO：72)

[实施例14]CTB-Aβ蛋白的使用效果(单独使用或与SeV载体组合使用)

(1)正常小鼠中抗Aβ抗体效价的诱导

使用C57BL/6N小鼠(8w、雌性)对CTB-Aβ蛋白引起的抗Aβ抗体效价的诱导进行了研究。将编码N末端侧具有CTB、C末端侧具有4个拷贝的Aβ15通过KK(赖氨酸-赖氨酸)接头串联而成的肽的融合蛋白质(CTB-Aβ15x4KK)的基因片段插入pSeV18+/ΔF的NotI位点，构建了SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔF。此外，在大肠杆菌中合成了CTB-Aβ15x4KK。使用该载体和融合蛋白质进行了实验。对于组A(6只)，以5x10⁷CIU/200μl/只肌肉内施用SeV18+GFP/ΔF，8周后以相同方式施用相同载体。对于组B(6只)，以5x10⁷CIU/200μl/只肌肉内施用SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔF，8周后以相同方式施用相同载体。对于组C(6只)，以5x10⁷CIU/200μl/只肌肉内施用SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔF后，每两周一次以100μg/100μl/只皮内施用CTB-Aβ15x4KK蛋白共5次。对于组D(6只)，以100μg/100μl/只皮内施用CTB-Aβ15x4KK蛋白后，每两周一次以100μg/100μl/只皮内施用了CTB-Aβ15x4KK蛋白共5次。在最初施用前(0W)和施用后每2周(2W-4W-6W-8W-10W-12W)从小鼠采血，使用采集的血样的血清测定了抗Aβ抗体效价。

如图20所示，其结果显示在将CTB-Aβ15x4kk蛋白与SeV组合使用(组C)的情况下，与单独的SeV(组B)相比，诱导了非常高的抗Aβ抗体效价。此外，单独使用蛋白(组D)也能够诱导高的抗Aβ抗体效价。

(2)PDGF-APPV717I模型小鼠中的抗Aβ抗体的诱导

使用阿尔茨海默病模型小鼠PDGF-hAPPV717I(中国医科学院实验动物研究所提供、雌性、12个月龄、7～9只/组)进行，组A的小鼠不做处置，对于组B，以5x10⁷CIU/10μl/只鼻内施用SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔF，8周后以相同方式施用相同载体。对于组C，以5x10⁷CIU/10μl/只鼻内施用SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔF后，每两周一次以100μg/15x2μl/只鼻内施用CTB-Aβ15x4KK蛋白(大肠杆菌生产的)共7次。对于组D，以100μg/15x2μl/只鼻内施用CTB-Aβ15x4KK蛋白后，每两周一次共7次以100μg/15x2μl/只鼻内施用CTB-Aβ15x4KK蛋白。在最初施用前(0W)和施用后(2W-8W-12W-16W)从小鼠采血，使用采集的血样的血清测定抗Aβ抗体的效价。

如图21所示，结果显示用CTB-Aβ15x4KK蛋白加强免疫(组C)引起了抗Aβ抗体的诱导。此外，单独使用蛋白(组D)也能够诱导抗Aβ抗体。

(3)使用Tg2576小鼠进行评价

使用阿尔茨海默病模型小鼠Tg2576(TACONIC公司提供、雌性、12个月龄、14～16只/组)进行，组A不进行处置，对于组B，以5x10⁷CIU/200μl/只鼻内施用SeV18+GFP/ΔF，12周后以相同方式施用相同载体。对于组C，以5x10⁷CIU/10μl/只鼻内施用SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔF，然后每一周一次以100μg/100μl/只皮内施用CTB-Aβ15x4KK蛋白共4次、然后每两周一次共5次。在最初施用前(0W)和施用后(4W-8W-12W-16W)从小鼠采血，使用采集的血样的血清测定了抗Aβ抗体效价。最后，解剖小鼠，将左脑用10％福尔马林固定液固定，将脑切片进行免疫染色(FSB染色和6E10染色)。此外，将右脑冷冻保存，然后抽提脑内Aβ，采用ELISA对脑内Aβ进行了定量。

如图22所示，结果显示与未处置组A和对照载体施用组B相比，在施用疫苗(SeV+蛋白)的组C中诱导了高效价的抗Aβ抗体。此外，如图23所示的免疫染色结果显示，与未处置组(组A)或对照载体施用组(组B)相比，在疫苗施用组C中老年斑面积显著减少。最后，如图24所示的脑内Aβ定量ELISA结果显示，与未处置组相比，疫苗施用组C中不溶性Aβ42级分显著减少。

[实施例15]各种载体引起的抗Aβ抗体的诱导

使用PDGF-hAPPV717I模型小鼠(中国医科学院实验动物研究所提供、雄性、12个月龄、8～9只/组)进行，对于组A，以5x10¹⁰个粒子/200μl/只肌肉内施用表达GFP的腺伴随病毒(AAV)载体AAV-GFP，8周后以相同方式施用相同载体。对于组B，以5x10¹⁰个粒子/200μl/只肌肉内施用表达CTB-Aβ融合蛋白质的AAV载体AAV-CTBAβ42，8周后以相同方式施用相同的载体。对于组C，以5x10⁷CIU/200μl/只肌肉内施用SeV18+GFP/ΔF，8周后以相同方式施用相同载体。对于组D，以5x10⁷CIU/200μl/只肌肉内施用SeV18+(CTB-Aβ42)/ΔF，8周后以相同方式施用相同载体。对于组E，以5x10⁷CIU/200μl/只肌肉内施用SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔF，8周后以相同方式施用相同载体。对于组F，以5x10⁷CIU/10μl/只鼻内施用SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔF，8周后以相同方式施用相同载体。在施用前(0W)和施用后(2W-8W-12W-16W)从小鼠采血，使用采集的血样的血清测定了抗Aβ抗体效价。

如图25所示，其结果显示CTB-Aβ42携带的SeV载体与携带了相同CTB-Aβ42的AAV载体相比，诱导了稍微更高的抗Aβ抗体效价，而对于携带CTB-Aβ15x4KK的SeV载体(组E和组F)，与前述两者(组B和组D)相比，能够诱导令人吃惊的高的抗Aβ抗体效价。

[实施例16]非感染性病毒载体(VLP)引起的抗Aβ抗体的诱导

使用C57BL/6N小鼠(8w、雌性)，对非感染性病毒载体(VLP)引起的抗Aβ抗体的诱导进行了研究。对于组A(6只)，以5x10⁷CIU/200μl/只肌肉内施用SeV18+GFP/ΔF，每一周一次共4次、然后每两周一次以相同方式施用相同载体。对于组B(6只)，以150μg/200μl/只肌肉内施用非感染性粒子SeV18+(NP-Aβ15x8)/ΔF-VLP，每一周一次共4次，然后每两周一次以相同方式施用相同载体。在施用前(0W)和施用后(2W-4W-6W-8W)从小鼠采血，使用采集的血样的血清测定了抗Aβ抗体效价。

如图26所示，结果显示施用VLP(组B)可以诱导抗Aβ抗体。

工业实用性

本发明为更有效地诱导抗Aβ抗体提供了可能。阿尔茨海默病的疫苗疗法不仅可望有助于对尚无有效治疗方法的阿尔茨海默病型痴呆患者，还可以期待提高老龄人生活品质、显著改善护理问题、削减医疗费用等诸多社会贡献。而且，通过将本发明高效的疫苗疗法与早期诊断结合起来，在发病初期提供根治，可以期待能够大幅减轻患者、患者家庭及社会的负担。