JP2011507514A - Gタンパク質を発現する安定な細胞系を用いた、繁殖欠損水疱性口内炎ウイルスベクターをパッケージングする方法 - Google Patents
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Abstract
【図1】
Description
配列番号1は、天然のVSV Gタンパク質のコード配列(インディアナ血清型)であり、
配列番号2は、天然のVSV Gタンパク質のコード配列(ニュージャージー血清型)であり、
配列番号3は、コドンを最適化したVSV Gタンパク質のコード配列(opt1、インディアナ血清型)であり、
配列番号4は、RNAを最適化したVSV Gタンパク質のコード配列(RNAopt、インディアナ血清型)であり、
配列番号5は、RNAを最適化したVSV Gタンパク質のコード配列(RNAopt、ニュージャージー血清型)であり、
配列番号6は、本発明の細胞で使用するための熱ショック誘導可能な転写制御配列の実施形態であり、
配列番号7は、本発明の細胞で使用するための適切な熱ショックエレメントの配列であり、
配列番号8は、本発明の細胞で使用するための熱ショックエレメントの一実施形態であり、
配列番号9は、本発明の細胞で使用するための熱ショックエレメントの別の実施形態であり、
配列番号10は、本発明の細胞で使用するための熱ショックエレメントのさらなる実施形態であり、
配列番号11は、本発明の細胞で使用するための熱ショックエレメントのさらなる実施形態であり、
配列番号12は、本発明の細胞で使用するための最小限のhCMVプロモーターの一実施形態であり、
配列番号13は、野生型VSV Gタンパク質の細胞質ドメインである。
明細書および特許請求の範囲で使用する単数形「a」、「an」および「the」には、内容により明らかにそうでないと指示される場合以外は、複数形の言及が含まれる。たとえば、用語「細胞」には、その混合物を含めた複数の細胞が含まれる。
本発明は、弱毒化したVSVのパッケージング手順を提供する。本発明の方法は、VSV−ΔGおよびVSV−Gstemなどの繁殖欠損組換えVSVのパッケージングに適用し得る。VSV−ΔGは、G遺伝子が完全に欠失しているベクターである一方で(Robertsら、J Virol、73:3723〜32、1999)、VSV−Gstemは、G遺伝子が切断されて細胞外ドメインのほとんどを欠くGタンパク質をコードしているベクターである(VSV−Gstem、RobisonおよびWhitt、J Virol、74:2239〜46、2000)。そのような事例では、失われたG機能を補償する手段として十分な量の機能的なGタンパク質を提供することに基づいたベクターのパッケージング手順は、いくつかの基準が満たされている限りは、VSVベクター候補のさらなる臨床開発を支援する。
本発明によるセグメント化されていないマイナス鎖RNAウイルスを回収するための一般手順は、以下のように要約することができる。所望のウイルスゲノムのクローニングしたDNA均等物(プラス鎖、メッセージセンスである)を、適切なDNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター(たとえば、T7、T3またはSP6 RNAポリメラーゼプロモーター)と自己切断リボザイム配列(たとえばデルタ型肝炎リボザイム)との間に配置し、これを適切な転写ベクター(たとえば繁殖可能な細菌プラスミド)内に挿入する。この転写ベクターは、容易に操作可能なDNA鋳型を提供し、これから、RNAポリメラーゼ(たとえばT7 RNAポリメラーゼ)が、正確またはほぼ正確な5’および3’末端を有するウイルスアンチゲノム(またはゲノム)の一本鎖RNAコピーを忠実に転写することができる。ゲノムのウイルスDNAコピーならびに隣接するプロモーターおよびリボザイム配列の配向により、アンチゲノムまたはゲノムのRNA均等物のどちらが転写されるかが決定される。
本発明の一部の実施形態では、ウイルスcDNA、RNAポリメラーゼベクターおよび支持タンパク質をコードしている1つまたは複数のベクターが導入された宿主細胞を、「プラーク拡大」ステップに供する。この手順は、典型的には、ウイルスcDNA発現ベクター、ならびにRNAポリメラーゼ、Nタンパク質、Pタンパク質、Lタンパク質、Mタンパク質およびGタンパク質をコードしており、その一過性発現を誘導する1つまたは複数の発現ベクターの発現を可能にするために十分な時間の後(たとえば形質移入後)に実施する。プラーク拡大を達成するために、多くの場合はさらなるウイルス拡大を支持するその能力が損なわれている宿主細胞を、同じまたは異なる細胞種のプラーク拡大細胞と同時培養する。同時培養ステップにより、ウイルスの活発な拡大をより受け入れやすいプラーク拡大細胞への救済されたウイルスの伝播が可能となる。典型的には、宿主細胞の培養物を、プラーク拡大細胞の1つまたは複数の層上に移す。たとえば、宿主細胞の培養物をプラーク拡大細胞の単層上に伝播させることができ、その後、弱毒化したVSVがプラーク拡大細胞に感染し、その中でさらに拡大される。一部の実施形態では、宿主細胞は、プラーク拡大細胞と同じまたは異なる細胞種である。
繁殖欠損ウイルスは、ヒトで使用するための明らかな安全性の利点を提供する。これらのベクターは1回のラウンドの複製に限定されており、一次感染細胞を越えて伝播することができない。以下に詳述する1つのそのようなベクターは、G遺伝子全体が欠失しており(ΔG)、したがって、感染性ウイルス粒子がin vitroで繁殖するためにGタンパク質トランス補完を必要とする。以下に詳述する別のベクターは、Gタンパク質外部ドメインのほとんどが欠失しており(Gstem)、細胞質尾部(CT)領域、膜貫通ドメイン、および膜近位外部ドメインの42個のアミノ酸を保持している。このベクターも繁殖欠損であり、in vitroでの感染性粒子の産生にトランスのGタンパク質を必要とする。
1.ウイルス救済細胞
ウイルス救済に使用する宿主細胞は、原核細胞または真核細胞から選択することができる。適切な細胞には、Sf9およびSf21などの昆虫細胞、大腸菌(E.coli)などの適切なプロモーターを有する細菌細胞、ならびに出芽酵母(S.cerevisiae)などの酵母細胞が含まれる。宿主細胞は、典型的には、脊椎動物、たとえば霊長類の細胞から選択される。典型的には、生存可能なウイルスの救済が容易に検出され得るように、検出可能な細胞変性効果をもたらす細胞系を用いる。多くの場合、宿主細胞は、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞などのヒト細胞に由来する。Vero細胞(アフリカミドリザル腎細胞)、および多くの他の種類の細胞も宿主細胞として使用することができる。一部の例示的な実施形態では、Vero細胞を宿主細胞として使用する。VSVの場合、ウイルスがVero細胞上で迅速に伝播し、容易に検出可能なプラークを作製するため、形質移入した細胞をVero細胞上で成長させる。さらに、Vero細胞は、ヒトに投与するための産生に適格である。他の適切な宿主細胞の例は以下のとおりである:(1)ヒト二倍体初代細胞系、たとえば、WI−38およびMRC−5細胞、(2)サル二倍体細胞系、たとえば、Cos、アカゲザル胎児肺(FRhL)細胞、(3)準初代連続継代細胞系、たとえば、AGMK−アフリカミドリザル腎細胞、(4)ヒト293細胞(適格)ならびに(5)げっ歯類(たとえば、CHO、BHK)、イヌ科動物、たとえば、マディンダービーイヌ科腎臓(MDCK)、および原発性ニワトリ胚線維芽細胞。本発明の方法および組成物内で有用な例示的な具体的な細胞系には、HEp−2、HeLa、HEK(たとえばHEK293)、BHK、FRhL−DBS2、LLC−MK2、MRC−5、およびVero細胞が含まれる。
本明細書中でさらに詳述するように、本発明による弱毒化したVSV粒子を産生する方法には、ウイルス粒子の救済に使用する宿主細胞をプラーク拡大細胞と成長させることが含まれ得る。プラーク拡大細胞への回収された弱毒化したVSV粒子の伝播が可能となる。一部の実施形態では、プラーク拡大細胞は、ウイルス救済に使用する宿主細胞と同じまたは異なる細胞種である。
1.切断されたG細胞質尾部(CT)領域
特定の実施形態では、本発明で使用するための弱毒化したVSVは、切断された細胞質尾部(CT)領域を有するGタンパク質を発現する。たとえば、細胞質ドメインのカルボキシ末端を切断するG遺伝子の突然変異が、VSVの出芽に影響を与え、ウイルス産生を弱毒化することは、当分野で知られている(Schnellら、The EMBO Journal、17(5):1289〜1296、1998、Robertsら、J Virol、73:3723〜3732、1999)。野生型VSV Gタンパク質の細胞質ドメインは、29個のアミノ酸を含む(RVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK−COOH、配列番号13)。
一部の実施形態では、弱毒化したVSVは、VSV Gタンパク質を欠く(VSV−ΔG)。たとえば、本発明の弱毒化したVSVは、VSV G遺伝子)がゲノムから欠失しているウイルスであり得る。この観点から、Robertsらは、Gタンパク質をコードしている遺伝子の全体が欠失しており(ΔG)、インフルエンザ赤血球凝集素(HA)タンパク質で置換されているVSVベクターを記載しており、VSVベクター(ΔG−HA)は弱毒化した病因を実証した(Robertsら、Journal of Virology、73:3723〜3732、1999)。
一部の他の実施形態では、弱毒化したVSVは、切断された細胞外ドメインを有するGタンパク質を発現する(VSV−Gstem)。たとえば、本発明の弱毒化したVSVには、G遺伝子中の突然変異が含まれていてもよく、コードされているGタンパク質は、Gタンパク質外部ドメインの膜近位の基部領域中に突然変異を有し、G−stemタンパク質と呼ばれる。G−stem領域は、Gタンパク質のアミノ酸残基421〜462を含む。以前の研究により、Gタンパク質のG−stem中の挿入および/または欠失(たとえば切断)の突然変異によってVSVの弱毒化が実証されている(RobisonおよびWhitt、J Virol、74(5):2239〜2246、2000、Jeetendraら、J Virol、76(23):12300〜11、2002、Jeetendraら、J Virol、77(23):12807〜18、2003)。
特定の実施形態では、本発明の弱毒化したVSVは、そのゲノム中に遺伝子シャフリング突然変異を含む。本明細書中で定義する用語「遺伝子シャフリング」、「シャフリングされた遺伝子」、「シャフリングされた」、「シャフリング」、「遺伝子再配置」および「遺伝子転座」は、互換性があるように使用してよく、野生型VSVゲノムの順序の変化(突然変異)をいう。本明細書中で定義する、野生型VSVゲノムは、図1に示す、3’−NPMGL−5’の遺伝子の順序を有する。
特定の他の実施形態では、本発明の弱毒化したVSVには、M遺伝子中に非細胞変性性突然変異(Mncp)が含まれる。VSV(インディアナ血清型)M遺伝子は、229個のアミノ酸のM(マトリックス)タンパク質をコードしている。
一部の実施形態では、弱毒化したVSVは、VSVがベクターとして役割を果たすように、異種抗原を発現する。たとえば、特定の実施形態では、弱毒化したVSVには、複製に必須でないゲノムの部位内に挿入されたまたはそれを置き換える、別個の転写単位としての外来RNA配列が含まれる場合があり、外来RNA配列(マイナスのセンスである)は、VSVに感染した宿主細胞中で発現させることができるタンパク質の産生を誘導する。この組換えゲノムは、タンパク質をコードしている外来DNAをVSV cDNA内に挿入することによって最初に産生する。特定の実施形態では、本発明の弱毒化したVSV中で融合または非融合タンパク質として発現させた場合に、単独でまたは同じもしくは異なるVSVによって発現された他の抗原と組み合わせて、疾患または障害に対する予防的または治療的免疫を生じる免疫原性抗原をコードしている任意のDNA配列を単離し、本発明の免疫原性組成物で使用するためのVSVベクター中に取り込ませる。
特定の実施形態では、本発明は、薬学的に許容できる担体中に、本発明の方法に従って産生した、免疫原性的に有効な量の弱毒化したVSV粒子を含む免疫原性組成物を対象とする。一部の実施形態では、少なくとも1つの外来RNA配列は、複製に必須でないVSVゲノムの領域内に挿入されている、またはそれを置き換える。
組換えDNAの調製
T7 RNAPをコードしているプラスミドベクター(pCMV−T7)は、ポリメラーゼオープンリーディングフレーム(ORF)を、pCI−neo(Promega)内の、hCMV前初期プロモーター/エンハンサー領域の3’側にクローニングすることによって調製した。T7 RNAPのORFを挿入する前に、pCI−neoを改変して複数クローニング部位の5’側に位置するT7プロモーターを除去して、ベクターpCI−neo−Bclを作製した。T7 RNAPコード配列を増幅するために使用したPCRプライマー内に取り込ませたEcoR IおよびXba I制限部位を用いて、T7 RNAP遺伝子をpCI−Neo−BCl内に挿入した。翻訳に最適な配列構成を提供するために、コザック(Kozak、J Cell Biol、108、229〜241、1989)コンセンサス配列を開始因子ATGの5’側に含めた。
繁殖欠損VSVのパッケージングに対する増加したVSV Gの存在量の効果の初期調査
プラスミドDNAからの最大のGタンパク質発現を支援する条件を同定するために、研究を実施した。以前に行った経験的研究により、電気穿孔が、プラスミドDNAのVero細胞内への、再現性のある効率的な導入を促進した方法として同定されており(Parksら、2006、Method for the recovery of non−segmented,negative−stranded RNA viruses from cDNA、公開米国特許出願第20060153870号、Witkoら、J Virol Methods、135:91〜101)、また、電気穿孔は拡張可能な技術であり(Fratantoniら、Cytotherapy、5:208〜10、2003)、Vero細胞は、生ロタウイルスワクチンの産生に用いられている十分に特徴づけられた細胞基質であるため(Merck、RotaTeq(Rotavirus Vaccine,Live,Oral,Pentavalent)FDA.Online、投函日2006年、Sheets,R.(History and characterization of the Vero cell line)FDA.Online、投函日2000年)、後の方法の洗練はこの発見に依存していた。
VSV Gタンパク質を発現する安定な細胞系の調製
本実施例は、繁殖欠損ウイルスベクターを開発するための遺伝子補完を供給するために使用した、安定な細胞系の調製を記載する。繁殖欠損ベクターを産生するための魅力的な手法ではあるが、安定な補完細胞系は、特にVSV Gのように補完遺伝子産物に毒性がある場合は、産生および維持が困難な可能性がある。テトラサイクリン応答性の系の制御下でGを発現するVero細胞を作製する以前の試み(CorbelおよびRossi、Curr Opin Biotechnol、13:448〜52、2002)は失敗し、さらなる手法の本調査が促された(データ示さず)。
VSV Gタンパク質を発現する安定な細胞系における水疱性口内炎ウイルスの救済
DNAの調製:
それぞれの電気穿孔について、以下のプラスミドDNAを微量遠心チューブ中で合わせた:25〜50μgの、T7(pCI−Neo−Bcl−T7)を発現するプラスミド「hCMV−T7発現プラスミド」、10μgのVSV完全長プラスミド、8μgのNプラスミド、4μgのPプラスミド、1μgのLプラスミド、1μgのMプラスミドおよび1μgのGプラスミド。バイオセーフティーフード内で作業しながら、DNAの体積を、無菌的なヌクレアーゼを含まない水で250μlに調節した。次に、50μlの3Mの酢酸ナトリウム(pH5)を加え、チューブの内容物を混合した。続いて、750μlの100%のエタノールを加え、チューブの内容物を混合した。これに続いて、−20℃で1時間〜終夜のチューブのインキュベーションを行った。その後、微量遠心器内で、14,000rpm、4℃で20分間、DNAをペレット化した。バイオセーフティーフード内で作業しながら、DNAペレットを乱さずに上清を廃棄した。残留エタノールをチューブから除去し、その後、DNAペレットをバイオセーフティーフード内で5〜10分間空気乾燥させた。乾燥したDNAペレットを、50μlの無菌的なヌクレアーゼを含まない水に再懸濁させた。
以下の溶液を細胞培養およびウイルス救済中に用いた:トリプシン/EDTA、ハンクス緩衝溶液、1mg/mlのPBS中で調製したダイズトリプシン阻害剤、および以下の表4に示す培地。
Vero細胞は、10%の熱失活ウシ胎児血清(Cellgro)、1%のピルビン酸ナトリウム(Invitrogen)、1%の非必須アミノ酸、220μMの2−メルカプトエタノール、50μg/mlのゲンタマイシン(Invitrogen)および1mg/mlのジェネティシンを添加したダルベッコ改変イーグル最小必須培地(DMEM、InvitrogenまたはCellgro)からなる、完全DMEM中で維持した。これは培地4に対応する。細胞は、電気穿孔を実施する前日に継代培養を行い、37℃、5%のCO2中でインキュベーションした。
最適化したVSV Gタンパク質を発現する安定な細胞系中で呼吸器系ウイルス抗原を発現する水疱性口内炎ウイルスの救済
本実施例で用いた救済手順は、図13に示すように、電気穿孔で用いたVSV完全長プラスミドが、ゲノムの位置1(Fa1)または位置3(Fa3)のどちらかのRSV−F遺伝子を含有すること以外は、実施例4に記載したものと同じであった。
rVSV−Gstem−RSVFa構築体の前臨床免疫原性
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、特に乳児および高齢者の集団において、重篤な下気道(LRT)疾患の顕著な原因である。現在、RSVに対して利用可能なワクチンは存在しない。VSV糖タンパク質(G)の付着および融合ドメインを欠失させ(rVSV−Gstem)、補完VSV Gがトランスで提供される細胞上で以外はウイルスを繁殖欠損にした、組換え水疱性口内炎ウイルス(rVSV)レプリコンを使用して、候補のRSVワクチンが作製された。この研究の目的は、実施例5の方法に従って救済したGstem−F1対F3ベクターの免疫応答を比較し、RSV誘発後のGstem−Fベクターの有効性を決定することであった。Gstem−F1の場合、RSV F遺伝子をVSVゲノムプロモーターに対してレプリコンゲノム中の位置1に挿入し、Gstem−F3では、RSV F遺伝子を位置3に挿入した。以下の表6に示すように、6つの動物グループをこれらの研究で用いた。グループ2〜6は0週間目に筋肉内注射を受け、グループ3〜6は4週間目にブーストを受け、すべてのグループ(グループ1〜6)が、8週間目に1.5×106pfuのRSV(A2株)のRSVを用いた誘発を受けた。動物は、誘発の4日後に評価した。さらに、ブースト用レプリコンは、相同的VSV Gまたはプライム用レプリコンと比較してVSVの異なる血清型に由来する異種Gのどちらかで補完して、プライム−ブーストレジメンを比較した。
Claims (63)
- 細胞培養物中で弱毒化した水疱性口内炎ウイルス(VSV)を産生する方法であって、
最適化したVSV G遺伝子からのVSV Gタンパク質の発現が誘導可能である前記最適化したVSV G遺伝子を含む細胞を提供することと、
前記最適化したVSV G遺伝子からVSV Gタンパク質が発現されるように、細胞を誘導することと、
誘導した細胞を弱毒化したVSVに感染させることと、
感染した細胞を培養で成長させることと、
弱毒化したVSVを培養物から回収することと
を含む方法。 - 弱毒化したVSVが繁殖欠損VSVである、請求項1に記載の方法。
- 細胞が、VSV Gタンパク質の発現を制御するための熱ショック誘導可能な転写制御配列を有する核酸を含む、請求項1または2のいずれか一項に記載の方法。
- 熱ショック誘導可能な転写制御配列が、最小限のhCMVプロモーターの5’側に位置する複数コピーの熱ショックエレメントを含むハイブリッドプロモーターを含有する、請求項3に記載の方法。
- 熱ショック誘導可能な転写制御配列が、RNAポリメラーゼIIによって認識され、熱誘導の際に機能的なmRNAを生じる転写単位を調節する、請求項4に記載の方法。
- 熱ショックエレメントが5’−GAAnnTTC−3’(配列番号7)である、請求項4に記載の方法。
- 熱ショックエレメントが、5’−GAACGTTC−3’(配列番号8)、5’−GAAGCTTC−3’(配列番号9)、5’−GAAATTTC−3’(配列番号10)、5’−GAATATTC−3’(配列番号11)およびその組合せからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 最小限のhCMVプロモーターが配列番号12によって表される、請求項4から7のいずれか一項に記載の方法。
- 熱ショック誘導可能な転写制御配列が配列番号6によって表される、請求項3から8のいずれか一項に記載の方法。
- 弱毒化したVSVが異種抗原をコードしている、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 異種抗原が病原体由来である、請求項10に記載の方法。
- 病原体が、麻疹ウイルス、サブグループAおよびサブグループBの呼吸器合胞体ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、1型または2型のヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エプスタインバーウイルス、フィロウイルス、ブンヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルスまたはインフルエンザウイルスから選択される、請求項11に記載の方法。
- 弱毒化したVSVが、サイトカイン、T−ヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、または哺乳動物宿主において免疫応答を誘発することができる微生物病原体もしくは寄生生物のタンパク質から選択される、非ウイルス分子をさらにコードしている、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が適格な産生細胞である、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がVero細胞である、請求項14に記載の方法。
- 前記最適化したVSV G遺伝子が、インディアナ血清型またはニュージャージー血清型に由来する、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記最適化したVSV G遺伝子が、配列番号3、配列番号4および配列番号5からなる群から選択される、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 弱毒化したVSVがVSV Gタンパク質を欠く(VSV−ΔG)、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 弱毒化したVSVの収量が、約1×106IU/培養物1mlを超える、請求項18に記載の方法。
- 弱毒化したVSVが、切断された細胞外ドメインを有するGタンパク質を発現する(VSV−Gstem)、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 弱毒化したVSVの収量が、約1×106IU/培養物1mlを超える、請求項20に記載の方法。
- 弱毒化したVSVが、切断された細胞質尾部(CT)領域を有するGタンパク質を発現する、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 弱毒化したVSVが、1個のアミノ酸に切断された細胞質尾部領域を有するGタンパク質(G−CT1)を発現する、請求項22に記載の方法。
- 弱毒化したVSVが、9個のアミノ酸に切断された細胞質尾部領域を有するGタンパク質(G−CT9)を発現する、請求項22に記載の方法。
- 弱毒化したVSVが、ウイルスゲノム中のその野生型の位置から下流に転座しているN遺伝子を含み、それによってNタンパク質発現が低下している、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
- 弱毒化したVSVが、非細胞変性性M遺伝子突然変異(Mncp)を含有し、前記突然変異は、内部AUGでタンパク質合成を開始すること、IFN誘導に影響を与えること、核輸送に影響を与えること、またはその組合せによって、Mタンパク質のmRNAから発現される2つの重複するインフレームのポリペプチドの発現を低下させる、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養物中で弱毒化した水疱性口内炎ウイルス(VSV)を産生する方法であって、
最適化したVSV G遺伝子からのVSV Gタンパク質の発現が誘導可能である前記最適化したVSV G遺伝子を含む細胞を提供することと、
最適化したVSV G遺伝子を含む細胞を、弱毒化したVSVのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドを含むウイルスcDNA発現ベクター、VSVのN、P、LおよびGタンパク質をコードしている1つまたは複数の支持プラスミド、ならびにDNA依存性RNAポリメラーゼをコードしているプラスミドで形質移入することと、
前記最適化したVSV G遺伝子からVSV Gタンパク質が発現されるように、形質移入した細胞を誘導することと、
誘導した細胞を培養で成長させることと、
弱毒化したVSVを培養物から回収することと
を含む方法。 - 細胞を、VSVのMタンパク質をコードしている支持プラスミドでさらに形質移入する、請求項27に記載の方法。
- 弱毒化したVSVが繁殖欠損VSVである、請求項27に記載の方法。
- DNA依存性RNAポリメラーゼがT7 RNAポリメラーゼであり、ウイルスcDNA発現ベクターおよび支持プラスミドがT7プロモーターの制御下にある、請求項27から29のいずれか一項に記載の方法。
- RNAが、弱毒化したVSVのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドから転写される、請求項27から30のいずれか一項に記載の方法。
- 支持プラスミドによってコードされているGタンパク質が、最適化されていないVSV G遺伝子によってコードされている、請求項27から31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記最適化したVSV G遺伝子からのVSV Gタンパク質の発現が、サイトメガロウイルスに由来するRNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下にある、請求項27から32のいずれか一項に記載の方法。
- 最適化したVSV G遺伝子が、インディアナ血清型またはニュージャージー血清型に由来する、請求項27から33のいずれか一項に記載の方法。
- 電気穿孔によって細胞を形質移入する、請求項27から34のいずれか一項に記載の方法。
- 弱毒化したVSVが異種抗原をコードしている、請求項27から35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記最適化したVSV G遺伝子が、配列番号3、配列番号4および配列番号5からなる群から選択される、請求項27から36のいずれか一項に記載の方法。
- 弱毒化したVSVがVSV Gタンパク質を欠く(VSV−ΔG)、請求項27から37のいずれか一項に記載の方法。
- 弱毒化したVSVの収量が、約1×106IU/培養物1mlを超える、請求項38に記載の方法。
- 弱毒化したVSVが、切断された細胞外ドメインを有するGタンパク質を発現する(VSV−Gstem)、請求項27から37のいずれか一項に記載の方法。
- 弱毒化したVSVの収量が、約1×106IU/培養物1mlを超える、請求項40に記載の方法。
- 細胞が、VSV Gタンパク質の発現を制御するための熱ショック誘導可能な転写制御配列を有する核酸を含む、請求項27から41のいずれか一項に記載の方法。
- 熱ショック誘導可能な転写制御配列が、最小限のhCMVプロモーターの5’側に位置する複数コピーの熱ショックエレメントを含むハイブリッドプロモーターを含有する、請求項42に記載の方法。
- 熱ショックエレメントが5’−GAAnnTTC−3’(配列番号7)である、請求項43に記載の方法。
- 熱ショックエレメントが、5’−GAACGTTC−3’(配列番号8)、5’−GAAGCTTC−3’(配列番号9)、5’−GAAATTTC−3’(配列番号10)、5’−GAATATTC−3’(配列番号11)およびその組合せからなる群から選択される、請求項44に記載の方法。
- 最小限のhCMVプロモーターが配列番号12によって表される、請求項43から45のいずれか一項に記載の方法。
- 熱ショック誘導可能な転写制御配列が配列番号6によって表される、請求項42から46のいずれか一項に記載の方法。
- 繁殖欠損水疱性口内炎ウイルス(VSV)のパッケージングを改善する方法であって、
a)最適化したVSV G遺伝子からのVSV Gタンパク質の発現が誘導可能である前記最適化したVSV G遺伝子を含む細胞を提供することと、
b)前記最適化したVSV G遺伝子からVSV Gタンパク質が発現されるように、細胞を誘導することと、
c)繁殖欠損VSVを細胞内に導入することと、
d)細胞を培養で成長させることと、
e)パッケージングされたVSVを培養物から回収することと
を含む方法。 - 薬学的に許容できる担体中に、請求項1から48のいずれか一項に記載の方法に従って産生した、免疫原性的に有効な量の弱毒化したVSVを含む免疫原性組成物。
- 弱毒化したVSVが異種抗原をコードしている、請求項49に記載の免疫原性組成物。
- 最適化したVSV G遺伝子を含む核酸
を含む単離した細胞。 - 最適化したVSV G遺伝子が、熱ショック誘導可能転写制御配列に作動可能に連結している、請求項51に記載の細胞。
- 温度の上昇に曝された場合にVSV Gタンパク質を発現する、請求項52に記載の細胞。
- 約39℃〜約45℃の温度に曝された場合にVSV Gタンパク質を発現する、請求項53に記載の細胞。
- 約30分間〜約6時間の間、前記温度上昇に曝された場合に、VSV Gタンパク質を発現する、請求項53に記載の細胞。
- 前記転写制御配列がハイブリッド熱ショックエレメント(HSE)/CMVプロモーターを含む、請求項52から55のいずれか一項に記載の細胞。
- ハイブリッドプロモーターが、最小限のhCMVプロモーターの5’側に位置する複数コピーの熱ショックエレメントを含む、請求項56に記載の細胞。
- 熱ショックエレメントが5’−GAAnnTTC−3’(配列番号7)である、請求項56または57のいずれかに記載の細胞。
- 熱ショックエレメントが、5’−GAACGTTC−3’(配列番号8)、5’−GAAGCTTC−3’(配列番号9)、5’−GAAATTTC−3’(配列番号10)、5’−GAATATTC−3’(配列番号11)およびその組合せからなる群から選択される、請求項57から58のいずれか一項に記載の細胞。
- 最小限のhCMVプロモーターが配列番号12によって表される、請求項57から59のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記転写制御配列が配列番号6によって表される、請求項52から60のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記最適化したVSV G遺伝子が、配列番号3、配列番号4および配列番号5からなる群から選択される、請求項51から61のいずれか一項に記載の細胞。
- 配列番号6によって表される転写制御配列。
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