CN101243179A - 制备抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗体和抗体产生细胞的制备方法。本发明涉及的抗体和抗体产生细胞的制备方法,包括将携带有编码抗原外来多肽的核酸的负链RNA病毒载体、生成该病毒载体的核酸、该载体或生成该载体的核酸所导入的细胞、或该细胞的裂解物接种到非人动物的步骤;以及从该动物回收抗体或抗体产生细胞的步骤。通过负链RNA病毒载体的免疫活化作用和对抗原多肽的高表达,可以有效的诱导抗体的产生。通过本发明方法制备的抗体,可应用于研究开发以及临床领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备抗体及抗体产生细胞的方法。
背景技术
蛋白质的表达水平与细胞功能或细胞状态的关联性,是后基因组需解决的重大课题之一。单凭对基因水平的表达解析很难将其与功能联系起来。还需要检测,鉴定蛋白或肽链。在分析蛋白质时发明了氨基酸序列及组成的解析,二级、三级构造的解析,分子量鉴定等多种方法。而使用抗体鉴定蛋白质的方法依然是目前的标准方法(Michael Steward,Chapter 27.Immunological Techniques,pp.417-434,in Immunology,6th edition(Ivan M.Roitt,Jonathan Brostoff,David K.Male,Editors),2001,C.V.Mosby)。当然,抗体不仅是通过免疫印迹法、免疫组织化学、流式细胞术、免疫沉淀法、免疫亲和层析柱法等多种方法来检测鉴定蛋白质,还可广泛应用于癌细胞的生物导弹疗法,载体的靶向,细胞功能障碍等实用医疗领域中。
抗体因具有结合特异性,且具有结合能力高的特性,随着单克隆抗体制备法的发明,抗体的利用价值被进一步的提高。然而,由于蛋白质的形状和性质不同,很难制备出对靶表位具有足够亲和力的抗体。抗体的制备,通常使用纯化蛋白、合成肽、分离的蛋白表达细胞、离体组织等对动物进行免疫,而在制备以特定基因信息为基础的蛋白质、肽链的抗体时,可采用以下2种方法,一种是将携带了该基因的表达质粒直接接种到动物组织的方法。还有一种是在培养细胞中获得表达后,使用粗纯化级分进行免疫的方法。但经常是由于表达量不足而很难获得所需的目的抗体。
非专利文献1Michael Steward,Chapter 27.Immunological Techniques,pp.417-434,in Immunology,6th edition(Ivan M.Roitt,Jonathan Brostoff,David K.Male,Editors),2001,C.V.Mosby
发明的公开
本发明要解决的课题
本发明提供一种制备抗体及抗体产生细胞的方法。本发明还提供制备抗体时使用的抗原组合物的制备方法。
课题的解决手段
负链RNA病毒是以负链RNA为基因组的病毒,感染细胞后,基因组RNA在细胞内扩增,并高水平地表达所携带的基因(Yonemitsu Y.et al.,NatBiotechnol,2000,18(9):970-3)。本发明者发挥了负链RNA病毒的这一优势,在制备抗体时使用了负链RNA病毒。此外,有报告表明感染负链RNA病毒后,其可促进分泌大量的细胞因子,从而提高了宿主的免疫活性(Strahleet al.J.Virol.77(14):7903-7913(2003),Tsutsumi et al.Pediatr.Infect.Dis.J.20(10):997-1001(2001)),这一特点在制备抗体中也可得到有效发挥。由此,本发明者们制备了表达抗原多肽的重组负链RNA病毒,并对动物进行免疫,制备了抗体。
将负链RNA病毒或感染该病毒的细胞裂解液(裂解物)直接通过点鼻、肌肉注射、脾脏内直接注射、腰部皮下、足垫(foot pad)等多种给药途径接种后检测抗体产生时,在以上各种给药途径中,均在血液中检测出了抗体。其中抗体效价的上升尤其以点鼻给药效果显著。此外,通过腹腔内给药进行加强免疫时,还可进一步提高抗体的产生水平。进而,从免疫小鼠的脾细胞制备了杂交瘤细胞,并成功的制备了单克隆抗体。负链RNA病毒载体所引起的免疫活化作用和对抗原多肽的高表达,有效地诱导了抗体的产生。
以往使用抗原多肽对动物进行免疫时,往往采取皮下、皮内、腹腔内、足垫等部位给药,而使用表达抗原多肽的质粒时,则采取肌肉注射的给药方法。而负链RNA病毒载体,尤其是其中的仙台病毒载体,除了上述给药途径之外,还可提供点鼻给药这一新型的免疫给药途径。另外,以往用抗原多肽表达质粒进行肌肉注射时很难确保可可靠的诱导免疫,即使诱导出来也多数达不到所望的足够强度。而仙台病毒载体可以有效地感染很多细胞,并高水平地表达外来基因,可确保并简单地诱导抗体的产生。再有,还可使用从感染细胞中不产生感染性病毒粒子等具有较高生物安全性(Biosafety)的改良载体,也是使用仙台病毒载体的抗体产生法的优点(WO00/70055及WO00/70070;Li,H.-O.et al.,J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。
如上所述,我们证明了通过接种表达抗原多肽的负链RNA病毒载体,能有效地产生针对该多肽的抗体。对载体的接种部位没有特殊限制,也可有效地使用加强免疫。免疫,除了直接接种负链RNA病毒载体,也可以使用感染了该载体的培养细胞,所制备的细胞除用于免疫外,还可以用于纯化所需抗原多肽、通过ELISA法及免疫印迹法进行抗体的检出,筛分产生单克隆抗体的杂交瘤细胞等。由本发明的方法所获得的抗体可望在生物分子的检测及分离、抗体治疗等广泛领域中得到应用。即本发明涉及一种使用负链RNA病毒制备抗体及抗体产生细胞的方法,更具体为涉及权利要求书各项中所述的发明。引用该权利要求书同一权利要求的所述发明的一个或多个组合的发明,也已被该权利要求所述的发明所包含。具体地,本发明提供:
[1]制备抗体或抗体产生细胞的方法,包含:
(a)将携带有编码抗原外来多肽的核酸的负链RNA病毒载体、生成该载体的核酸、该载体或生成该载体的核酸所导入的细胞、或该细胞的裂解物接种到非人动物的步骤。
(b)从该动物回收抗体或抗体产生细胞的步骤。
[2][1]中的方法,其中步骤(a)的接种通过选自肌肉注射、皮下给药、点鼻、手掌或足垫皮内给药、脾脏、腹腔内的给药途径进行。
[3][1]或[2]中所述的方法,还包含通过该负链RNA病毒载体、生成该病毒载体的核酸、该载体或生成该载体的核酸所导入的细胞、该细胞的裂解物或由该细胞的裂解物纯化的抗原的接种,进行加强免疫的步骤。
[4][1]-[3]中所述的任一方法,还包含通过该多肽或包含其片段的多肽进行加强免疫的步骤。
[5][1]-[4]中所述的任一方法,还包含使回收了的抗体和抗原相接触,并筛选结合于该抗原的抗体的步骤。
[6][1]-[4]中所述的任一方法,还包含用回收了的抗体产生细胞与骨髓瘤进行细胞融合制备杂交瘤细胞的步骤。
[7][6]中所述的方法,还包含用杂交瘤细胞产生的抗体与该抗原相接触,以筛选能产生结合于该抗原的抗体的杂交瘤细胞的步骤。
[8][6]或[7]中所述的方法,还包含回收杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的步骤。
[9][1]-[8]中所述的任一方法,其中所述负链RNA病毒为复制缺陷型。
[10][1]-[9]中所述的任一方法,其中所述负链RNA病毒为副粘病毒。
[11][10]中所述的方法,其中所述副粘病毒至少缺失F基因。
[12][10]或[11]中所述的方法,其中所述副粘病毒是仙台病毒。
[13][1]-[12]中所述的任一方法,还包含使含有回收了的抗体的溶液与不编码该外来多肽的该负链RNA病毒载体、该病毒载体所导入的细胞、该细胞的裂解物、或该病毒的病毒蛋白共存的步骤,以及筛选不结合于它们的抗体的步骤。
[14][1]-[12]中所述的任一方法,还包含使含有杂交瘤细胞产生的抗体的溶液与不编码该外来多肽的该负链RNA病毒载体、该病毒载体所导入的细胞、该细胞的裂解物、或与该病毒的病毒蛋白共存的步骤,以及产生不与它们相结合的抗体的杂交瘤细胞的筛选步骤。
[15][1]-[14]中所述的任一方法,其中所述方法还包含Th2细胞因子及其活性部分肽,及编码它们的载体的给药步骤。
[16][15]中所述的方法,其中所述细胞因子或其活性部分肽被编码了抗原外来多肽的负链RNA病毒载体所编码。
[17][15]或[16]中所述的方法,其中所述Th2细胞因子是从IL-4、IL-10、及IL-13中选择的。
发明的效果
本发明的方法,可以利用表达所需抗原多肽的负链RNA病毒来有效制备抗体,而不必纯化抗原肽。本发明所制备的抗体,不仅可用于通过免疫印迹法、免疫组织化学、流式细胞术、免疫沉淀法、免疫亲和层析柱法等多种方法来检测、鉴定蛋白,还可广泛应用于癌细胞的生物导弹疗法、载体的靶向、细胞功能障碍等临床领域中。
附图说明
[图1]给药携带有LacZ基因的负链RNA病毒载体后的LacZ抗体的产生示意图。利用市售的纯化LacZ,对由肌肉注射初次免疫后第5周的小鼠血浆进行了检测。按各泳道说明:1分子量标记;2接种SeV-LacZ的小鼠#1;3接种SeV-LacZ的小鼠#2;4接种SeV-LacZ的小鼠#3;5接种SeV-LacZ的小鼠#4;6接种SeV-LacZ的小鼠#5;7接种SeV-LacZ的小鼠#6;8非免疫小鼠;9市售的LacZ抗体(1/5000稀释)。
[图2]给药携带了GFP基因的负链RNA病毒载体后的抗GFP抗体的产生示意图。A:用病毒载体通过点鼻、肌肉注射、脾脏直接注射、或足垫内注射初次免疫2周后,使用该载体通过腹腔内注射进行加强免疫,用免疫印迹法检测了初次免疫4周后的小鼠血浆中的抗GFP抗体。按泳道说明:1分子量标记;2市售抗GFP抗体;3非免疫小鼠;4点鼻初次免疫/仙台病毒载体加强免疫;5点鼻初次免疫/PBS加强免疫(对照);
6肌肉注射初次免疫/仙台病毒载体加强免疫;
7肌肉注射初次免疫/PBS加强免疫(对照);8脾脏注射初次免疫/仙台病毒载体加强免疫;9脾脏注射初次免疫/PBS加强免疫(对照);10足垫注射初次免疫/仙台病毒载体加强免疫;11足垫注射初次免疫/PBS加强免疫(对照)B:使用仙台病毒载体皮内或腹腔内给药初次免疫16天后,用仙台病毒载体(1x107CIU/只)经腹腔内给药进行加强免疫。初次免疫19天后,用免疫印迹法检测了小鼠血浆中的抗GFP抗体。膜上固定有携带GFP基因的负链RNA病毒载体感染了的LLC-MK2细胞裂解液。按各泳道说明。1分子量标记;2皮下初次免疫;3腹腔内初次免疫。
[图3]将负链RNA病毒载体感染细胞裂解液进行腹腔内注射后的抗体产生示意图。用携带GFP基因的负链RNA病毒载体感染的细胞的裂解液通过腹腔内注射进行初次免疫4周后,用免疫印迹法测出了小鼠血浆中的抗GFP抗体。按各泳道说明。1分子量标记;2市售GFP抗体;3非免疫小鼠;4裂解液腹腔内初次免疫/仙台病毒载体加强免疫;5裂解液腹腔内初次免疫/PBS加强免疫(对照)
[图4]抗体产生中,由负链RNA病毒载体感染的细胞裂解液腹腔内注射加强免疫后的抗体产生示意图。将携带GFP基因的仙台病毒载体通过点鼻、肌肉注射、脾脏直接注射或足垫注射进行初次免疫、或用仙台病毒载体感染细胞裂解液腹腔内注射初次免疫2周后,用仙台病毒感染细胞裂解液腹腔内注射进行加强免疫,初次免疫4周后用免疫印迹法测出了小鼠血浆中的抗GFP抗体。对照组动物,在2周后用DPBS(-)进行了加强免疫。按各泳道说明如下。1分子量标记;2市售GFP抗体;3非免疫小鼠;4载体点鼻初次免疫/细胞裂解液加强免疫1;5载体点鼻初次免疫/细胞裂解液加强免疫2;6载体肌肉注射初次免疫/细胞裂解液加强免疫1;7载体肌肉注射初次免疫/细胞裂解液加强免疫2;8载体脾脏注射初次免疫/细胞裂解液加强免疫1;9载体脾脏注射初次免疫/细胞裂解液加强免疫2;
10载体足垫注射初次免疫/细胞裂解液加强免疫1;11载体足垫注射初次免疫/细胞裂解液加强免疫2;12载体腹腔内注射初次免疫/细胞裂解液加强免疫1;13载体腹腔内注射初次免疫/细胞裂解液加强免疫2;14载体点鼻初次免疫/PBS加强免疫(对照);
15载体肌肉注射初次免疫/PBS加强免疫(对照);
16载体脾脏注射初次免疫/PBS加强免疫(对照);
17载体足垫注射初次免疫/PBS加强免疫(对照);
18细胞裂解液腹腔内给药初次免疫/PBS加强免疫(对照)
[图5]负链RNA病毒载体给药的单克隆抗体产生示意图。使用所得的杂交瘤细胞上清,在固定有携带GFP基因的仙台病毒载体感染LLC-MK2细胞的可溶性蛋白质的免疫印迹膜上检测了GFP。按各泳道说明如下。
1分子量标记;2固定有携带GFP基因的仙台病毒载体感染LLC-MK2细胞的可溶性蛋白质,使用杂交瘤细胞上清做探针。
[图6]使用产生抗gp160单克隆抗体的杂交瘤细胞上清(#6-76)进行免疫印迹解析的示意图。从接种了携带HIV-1 gp160基因的负链RNA病毒载体的小鼠脾细胞制备杂交瘤细胞,并选择了产生抗gp160单克隆抗体的杂交瘤细胞。用此杂交瘤细胞上清,通过免疫印迹法测出了SeV18+GP160/ΔF载体感染LLC-MK2细胞裂解液中的gp160蛋白(A)。作为阳性对照,使用了市售的抗gp160(ICN)抗体同样做了免疫印迹(B)。按各泳道说明如下。1分子量标记;2非感染LLC-MK2细胞裂解液;
3.SeV18+GP160/ΔF感染LLC-MK2细胞裂解液;4非感染BHK-21细胞裂解液;5 SeV18+GP160/ΔF感染BHK-21细胞裂解液。
[图7]确定杂交瘤细胞#6-76产生的抗gp160抗体的亚型的示意图。使用市售的分型试剂盒(Mouse Immunoglobulin Screening/Isotyping Kit(Genzyme社))确定了杂交瘤细胞产生的抗gp160抗体的亚型。所使用的亚型特异性抗体如下所示。G1:IgG1,G2a:IgG2a,G2b:IgG2b,G3:IgG3,A:IgA,M:IgM,B:缓冲液空白,N:非免疫血清(阴性对照)。
[图8]通过用仙台病毒载体初次免疫后,使用合成肽进行加强免疫,可以制备产生识别HIV-1 gp160的单克隆抗体的杂交瘤细胞的示意图(如图)。使用通过ELISA法进行一次筛选的阳性杂交瘤细胞C1-182的培养上清,利用免疫印迹法测出了SeV18+GP160/ΔF载体感染BHK-21细胞膜级分(cell membrane fraction)中的gp160蛋白质。膜级分使用市售的试剂盒(Calbiochem公司,商品号539790),按照其说明书的要求制备。右侧箭头表示gp160和gp41的泳动位置。按各泳道说明如下。
1分子量标记;2非感染BHK-21细胞的膜级分;3.SeV18+GFP/ΔF感染BHK-21细胞的膜级分;4.SeV18+GP160/ΔF感染BHK-21细胞的膜级分。
[图9]将加强免疫时使用的肽与培养上清混合进行免疫印迹,测出了使用合成肽进行加强免疫时制备的产生抗gp160抗体的杂交瘤细胞C1-182所识别的gp160蛋白上的表位的示意图。在使用C1-182上清时,仅在混入了肽#495时出现了肽浓度依赖性的抗体反应抑制,因而证明了C1-182抗体所识别的表位是肽#495的序列。图中的数字0、0.1、1、10为肽的混合浓度。单位为μg/ml。右侧箭头表示gp160和gp41的泳动位置。各图说明如下:A.~C.使用杂交瘤细胞C1-182上清;D.~F.使用杂交瘤细胞#6-76上清;A.及D.肽#493的混合
B.及E.肽#494的混合
C.及F.肽#495的混合
按各泳道说明如下。
1分子量标记;2非感染BHK-21细胞膜级分;3.SeV18+GFP/ΔF感染BHK-21细胞膜级分;4.SeV18+GP160/ΔF感染BHK-21细胞膜级分。
[图10]对实施例6所得抗gp160抗体产生杂交瘤细胞#6-76及实施例7使用合成肽进行加强免疫所得的抗gp160抗体产生杂交瘤细胞C1-182进行细胞克隆纯化的示意图。将杂交瘤细胞#6-76一次克隆后所得#6-76-14和#6-76-17以及将C1-182一次克隆后所得C1-182-40和C1-182-48进行再次稀释接种,使用克隆所得的细胞集落上清进行的ELISA结果。对C1-182-40以外的克隆也取得了成功。作为阳性对照,使用了克隆前的#6-76上清和抗仙台病毒HN蛋白单克隆抗体IL4.1。各图的说明如下。A.使用了源自杂交瘤细胞#6-76的第2次克隆的细胞集落上清
B.使用了源自杂交瘤细胞C1-182的第2次克隆的细胞集落的上清。
[图11]对实施例6所得杂交瘤细胞#6-76及实施例7所得杂交瘤细胞C1-182的细胞克隆纯化的示意图。使用由杂交瘤细胞#6-76一次克隆后的#6-76-14再次进行二次克隆后所得#6-76-14-21和#6-76-14-29,以及杂交瘤细胞C1-182一次克隆后的C1-182-48再次克隆所得的C1-182-48-5和C1-182-48-35,与实施例7同样地进行了免疫印迹。结果显示,从2次克隆后的杂交瘤细胞中也产生了与克隆前同样的抗gp160抗体。各图的说明如下。A.使用杂交瘤细胞#6-76、第一次克隆后细胞集落#6-76-14、第二次克隆后化细胞集落#6-76-14-21及#6-76-14-29的上清;B.使用杂交瘤细胞C1-182、第一次克隆后细胞集落C1-182-48、第二次克隆后细胞集落C1-182-48-5及C1-182-48-35的上清。
[图12]使用固定了免疫球蛋白结合蛋白L的层析柱(Pierce社ImmunoPure Immobilized Protein L;商品号20510)纯化实施例6所得杂交瘤细胞#6-76二次克隆后的#6-76-14-29培养上清中的抗体蛋白的结果图。表明从二次克隆后的杂交瘤细胞中也产生与克隆前同样的抗gp160抗体。右侧箭头表示IgG H链和L链的泳动位置。
各图说明如下。A.SyproOrange染色
B.抗鼠IgG(H+L)抗体(HRP-conjugate)染色
各泳道的说明如下。
1.抗卵清蛋白小鼠单克隆抗体;2.纯化的#6-76-14-29上清;3.分子量标记;
4.未纯化的#6-76-14-29上清。
[图13]使用从二次克隆后的杂交瘤细胞#6-76-14-29的培养上清中纯化的抗体蛋白与实施例7同样进行的免疫印迹图。克隆前的#6-76及#6-76-14-29的未纯化培养上清和纯化抗体做了比较。表明纯化后的抗体具有与纯化前相同的特异性,可识别gp160、gp41。各泳道的说明如下。1分子量标记;2非感染BHK-21细胞膜级分;3.SeV18+GFP/ΔF感染BHK-21细胞膜级分;4.SeV18+GP160/ΔF感染BHK-21细胞膜级分。
[图14]使用了实施例10所得多个抗gp160抗体产生杂交瘤细胞培养上清的免疫印迹结果图。得到了识别gp160中的gp41和gp120两种成分的杂交瘤细胞。右侧箭头表示gp160、gp120、gp41的泳动位置。各泳道的说明如下。
1.分子量标记;2.非感染BHK-21细胞的膜级分;3.SeV18+GFP/ΔF感染BHK-21细胞的膜级分;4.SeV18+GP160/ΔF感染BHK-21细胞的膜级分。[图15]用同时携带鼠IL10基因和gp160基因的仙台病毒载体进行免疫,在小鼠血浆中诱导抗gp160抗体的示意图。共使用了7只小鼠。初次免疫后第56天抽取了小鼠眼窝的血液。作为阳性和阴性对照分别使用了杂交瘤细胞#6-76培养上清和免疫前的小鼠血浆(#1 pre)。右侧箭头和黑点表示了gp160的泳动位置。各泳道的说明如下。1分子量标记;2非感染BHK-21细胞的膜级分;3.SeV18+GFP/ΔF感染BHK-21细胞的膜级分;4.SeV18+GP160/ΔF感染BHK-21细胞的膜级分。
本发明的最佳实施形态
本发明涉及制备抗体或抗体产生细胞的方法,包括将携带有编码抗原外来多肽核酸的负链RNA病毒载体、生成该病毒载体的核酸(nucleicacids)、该载体或生成该载体的核酸所导入的细胞、或该细胞的裂解物接种到动物的步骤,以及从该动物回收抗体和抗体产生细胞的步骤。负链RNA病毒是以负链(与编码病毒蛋白的有义链互补的反义链)RNA为基因组的病毒。负链RNA病毒也可称为[-]链RNA病毒。本发明中所使用的负链RNA病毒尤其优选单链负链RNA病毒(也可称非分节型(non-segmented)负链RNA病毒)。所谓单链负链RNA病毒即以一条负链(即[-]链)RNA为基因组的病毒。包括属于副粘病毒科(含副粘病毒(Paramyxoviridae);副粘病毒属(Paramyxovirus)、麻疹病毒属(Morbillivirus)、腮腺炎病毒属(Rubulavirus)、及肺病毒属(Pneumovirus)属等)、弹状病毒科(含弹状病毒属(Rhabdoviridae);水泡病毒属(Vesiculovirus)、狂犬病病毒属(Lyssavirus)、及Ephemerovirus属等),纤丝病毒科(Filoviridae)等病毒科的病毒。本发明使用的负链RNA病毒载体,可以是具有传播性或非传播性的缺陷型载体。所谓“传播性”,是指病毒载体感染宿主细胞时,在该细胞内病毒可以进行自我复制,并产生感染性病毒粒子。所谓缺陷型载体,可以例举例如缺损了编码构成包膜蛋白的基因中至少一种的载体。具体地,虽因病毒种类而异,可以列举至少缺失了编码F、H、HN、G、M、M1等包膜蛋白的基因中一种的载体(WO00/70055及WO00/70070;Li,H.-O.etal.,J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。
本发明中尤其优选的负链RNA病毒,具体例为副粘病毒科(Paramyxoviridae)的仙台病毒(Sendai virus)、新城疫病毒(Newcastle diseasevirus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、麻疹病毒(measles virus)、RS病毒(respiratory syncytial virus)、牛瘟病毒(rinderpest virus)、瘟热病毒(distempervirus)、猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒1,2,3;属正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒(influenza virus);属弹状病毒科(Rhabdoviridae)的水泡性口内炎病毒(Vesicular stomatitis virus)及狂犬病病毒(rabies virus)等。本发明的副粘病毒优选属副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)(包括呼吸道病毒属、腮腺炎病毒属和麻疹病毒属),更优选呼吸道病毒(respirovirus)属(也称副粘病毒属(Paramyxoviridae))的病毒或其衍生物。衍生物中包含在不破坏病毒的基因导入功能的前提下,对病毒基因进行修饰的病毒,以及经化学修饰的病毒。适用于本发明的呼吸道病毒属的病毒包括:人副流感病毒1型(HPIV-1)、人副流感病毒3型(HPIV-3)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、仙台病毒(也称鼠副流感病毒1型)、猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。本发明的副粘病毒最优选仙台病毒。这些病毒可源自天然株、野生型株、突变株、实验室传代株、人工构建株等。
例如,属副粘病毒亚科的每一种病毒的基因通常概述如下。通常NP基因也可表示为[N]。HN在不具有神经氨酸酶活性时表示为H(hemagglutinin,血凝素)。
呼吸道病毒NP P/C/V M F HN-L
腮腺炎病毒NP P/V M F HN(SH)L
麻疹病毒 NP P/C/V M F H-L
负链RNA病毒载体可以在基因组RNA中编码所望的抗原外来多肽。该外来多肽只要是不携带有天然负链RNA病毒所不具有的多肽,则无特别限制,可以是天然蛋白质全长,或其部分片段(7个氨基酸以上,优选8、10或15个氨基酸以上),或它们和其他多肽的融合多肽。编码外来多肽的重组病毒载体,可通过将编码该多肽的基因以反义形式插入到负链RNA病毒载体的基因组中来获得。基因的插入位置,可以选择例如病毒蛋白非编码领域的所需部位。比如可以插入到基因组3’-前导区和最靠近3’末端的病毒蛋白ORF之间;各病毒蛋白ORF之间,和/或插入到最靠近5′末端的病毒蛋白ORF和5′尾随(trailer)区域之间。而且,如若对于缺失M、F或HN基因等包膜构成蛋白基因的基因组,也可插入到其缺陷区。将外来基因导入副粘病毒时,优选基因组的插入片段的多核苷酸的链长为6的倍数(Kolakofski,D.et al.,J.Virol.1998:72;891-899;Calain,P.and Roux,L.J.Virol.1993:67;4822-4830)。在插入的外来基因和病毒ORF之间形成E-I-S序列。借助E-I-S序列,可以串联地插入2个或多个外来基因。
外来基因的表达水平,可通过付加在该基因上游(负链3’侧)的转录起始序列的种类来调节(WO 01/18223)。另外,可以通过外来基因插入基因组内的位置加以控制。插入位置越靠近负链3’末端则表达水平越高;反之越靠近5′末端则表达水平越低。一般来说,为获得抗原多肽的高表达水平,优选将编码外来多肽的基因与高效转录起始序列连接,并将其插入到负链基因组3’末端附近。具体为,插入到3’-前导区和最靠近3’末端的病毒蛋白ORF之间;或者插入到最靠近3’-前导区的病毒蛋白基因和第2靠近的病毒蛋白基因的ORF之间;或插入到第二和第三靠近3’-前导区的病毒蛋白基因的ORF之间。野生型副粘病毒中,最靠近基因组3’末端的病毒蛋白基因是N基因,其次是P基因,其后是M基因。相反,在不需要抗原多肽的高表达水平的情况下,可以将外来基因的插入位置尽量靠近负链基因组的5’末端或选择低效转录起始序列来抑制病毒载体的基因表达水平,以获取所望的适宜效果。
将编码外来基因的核酸插入基因组时,作为附加的S序列,例如可使用负链RNA病毒所望的S序列,如果是仙台病毒,优选使用3′-UCCCWVUUWC-5′(W=A或C;V=A,C,或者G)(序列号:1)共有序列。尤其优选3′-UCCCAGUUUC-5′(序列号:2)、3′-UCCCACUUAC-5′(序列号:3)、及3′-UCCCACUUUC-5′(序列号:4)。如果将这些序列用编码正链的DNA序列表示,则分别是5′-AGGGTCAAAG-3′(序列号:5)、5′-AGGGTGAATG-3′(序列号:6)、及5′-AGGGTGAAAG-3′(序列号:7)。仙台病毒载体的E序列,优选例如3′-AUUCUUUUU-5′(序列号:8)(在编码正链的DNA中优选为5′-TAAGAAAAA-3′(序列号:9))。I序列,可以是例如任意的3个碱基,具体优选使用3′-GAA-5′(正链DNA中是5′-CTT-3′)。
重组RNA病毒载体的重构也可采用已知方法。具体为,(a)哺乳动物细胞中,在构成包含负链RNA病毒基因组RNA的RNP的病毒蛋白存在的情况下,使编码表达所望外来抗原多肽的负链RNA病毒基因组RNA或其互补链(基因组RNA的反义链、正链)的DNA进行转录的步骤;(b)回收所生成的负链RNA病毒或包含该基因组RNA的RNP的步骤。所述构成RNP的病毒蛋白(viral proteins)指的是与病毒基因组RNA一起形成RNP、构成核壳(nucleocapsid)的蛋白。这些蛋白是基因组复制及基因表达所必需的蛋白群,具体为N(核衣壳,又称核蛋白(NP))、P(phospho)、和L(large)蛋白。其表示有时因病毒种类而异,但相应的蛋白群是本领域技术人员已知的(Anjeanette Robert et al.,Virology 247:1-6(1998))。例如N有时也表示为NP。
病毒重构时,可如上所述生成负链RNA基因组(即与病毒基因组相同的反义链),或正链RNA(反义基因组,基因组RNA的互补链)。为提高载体重构效率,优选生成正链。病毒基因组RNA,只要编码重构RNP时所需的病毒蛋白,可以缺失编码包膜构成蛋白的基因。具体地,只要编码N、P以及L蛋白,可以不编码F、HN、M等病毒蛋白。这种缺陷型病毒,既可以在细胞内扩增基因组RNA,且又不释放感染性病毒粒子,可作为安全性高的基因导入载体使用(WO00/70055、WO00/70070、及WO03/025570;Li,H.-O.et al.,J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。制备病毒载体时,这些包膜构成蛋白可在病毒产生细胞内通过其它途径进行表达,以辅佐形成粒子。为使病毒蛋白及RNA基因组在细胞内得到表达,将编码该蛋白或基因组的DNA连接在适宜的启动子下游的载体导入宿主细胞。启动子可使用例如CMV启动子及CAG启动子等(Niwa,H.et al.(1991)Gene.108:193-199、特开平3-168087)。
RNA末端,应如天然病毒基因组那样,优选尽量正确地反映3’-前导区序列和5’-尾随区序列的末端。例如,在转录产物的5’-末端添加自我切割型核酶,由该核酶正确切割出负链RNA病毒基因组的末端(Inoue,K.et al.J.Virol.Methods 107,2003,229-236)。或者为了正确地控制转录产物的5’-末端,在转录起始位点利用噬菌体的RNA聚合酶识别位点,在细胞内表达该RNA聚合酶并使其诱导转录。噬菌体RNA聚合酶可使用例如,大肠菌T3噬菌体、T7噬菌体以及沙门氏菌SP6噬菌体等(Krieg,P.A.and Melton,D.A.1987,Methods Enzymol.155:397-15;Milligan,J.F.et al.,1987,Nucleic AcidsRes.15:8783-798;Pokrovskaya,I.D.and Gurevich,V.V.,1994,Anal.Biochem.220:420-23)。噬菌体RNA聚合酶,例如可以用表达该聚合酶的牛痘病毒(Fuerst,T.R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,8122-8126(1986))来供给,或者通过质粒等表达载体供给。为了调节转录产物的3’-末端,例如可以在转录产物的3’-末端编码自我切割型核酶,以便用该核酶正确切割3’-末端(Hasan,M.K.et al.,J.Gen.Virol.78:2813-2820,1997;Kato,A.et al.,1997,EMBO J.16:578-587,1997;Yu,D.et al.,Genes Cells 2:457-466,1997)。核酶可以使用来源于丁型肝炎病毒的反义基因组链(antigenomic strand)的自我切割型核酶。
重构缺失了包膜构成蛋白基因的病毒时,可以使用缺失的包膜构成蛋白来互补病毒的感染性。例如,也可以使用与缺失蛋白不同的其它包膜蛋白构成假型化。这样的包膜蛋白,可以使用例如水泡性口腔炎病毒(Vesicularstomatitis virus;VSV)的G蛋白质(VSV-G)(J.Virology 39:519-528(1981))(Hirata,T.et al.,2002,J.Virol.Methods,104:125-133;Inoue,M.et al.,2003,J.Virol.77:6419-6429;Inoue M.et al.,J Gene Med.2004;6:1069-1081)。基因组中所缺失的基因,可例举出例如F、HN、H、G等刺突蛋白基因、M等的包膜衬底蛋白(envelope-lining protein)基因或它们的任意组合。刺突蛋白基因的缺失,在使负链RNA病毒载体不具有传播性方面,或M蛋白等包膜衬底蛋白基因的缺失在抑制感染细胞中的粒子形成方面十分有效。例如,优选使用F基因缺陷型负链RNA病毒载体(Li,H.-O.et al.,J.Virol.74,6564-6569(2000))、M基因缺陷型负链RNA病毒载体(Inoue,M.et al.,J.Virol.77,6419-6429(2003))等。例如,通过使用缺失了F基因的载体,可抑制其对宿主小鼠的病原性,并可以实现良好的抗体产生效果(参照实施例)。另外,缺失了F、HN(或H)以及M中的至少2个基因的任意组合的缺陷型载体,其安全性更能得到保障。例如,同时缺损了M及F基因的缺陷型载体,在保持了较高水平的传染性及基因表达能力的同时,可成为非传播性且不形成病毒粒子的载体。
制备F基因缺陷型重组病毒,具体的,例如将表达缺失F基因的负链RNA病毒基因组或其互补链的质粒,与表达F蛋白的表达载体以及N、P、及L蛋白的表达载体一起转染宿主细胞。此外,使用将F基因整合到染色体上的宿主细胞时,可以更高效率制备病毒(WO00/70070)。此时,优选使用Cre/loxP及FLP/FRT等序列特异性重组酶和其靶的序列,将其配置成可对表达进行诱导的形式,以使F基因得以诱导表达(参照WO00/70055及WO00/70070;Hasan,M.K.et al.,1997,J.General Virology 78:813-2820)。
具体地,例如将包膜蛋白基因整合到持有Cre/loxP诱导型表达质粒pCALNdlw(Arai,T.et al.,J.Virology 72,1998,p1115-1121)等的重组酶靶的序列的载体中。诱导表达,例如可用腺病毒AxCANCre以moi=3~5进行感染(Saito et al.,Nucl.Acids Res.23:3816-3821(1995);Arai,T.et al.,J.Virol72,1115-1121(1998))。
本发明所使用的负链RNA病毒可以缺失辅助基因。例如,通过敲除仙台病毒(SeV)的一种辅助基因-V基因,可以在不影响培养细胞中的基因表达和复制的情况下,使SeV对小鼠等宿主的致病性明显减弱(Kato,A.et al.,1997,J.Virol.71:7266-7272,1997;Kato,A.et al.,EMBO J.16:578-587,1997;Curran,J.et al.,WO 01/04272,EP1067179)。
此外,为了提高负链RNA病毒感染的持续性,也可使用在P基因或L基因中含有突变的负链RNA病毒。该突变,具体可例举为SeV P蛋白的第86位的Glu(E86)突变,SeV P蛋白的第511号的Leu(L511)被其他氨基酸的置换,或其它负链RNA病毒P蛋白的同源位点的置换。具体还可例举,第86号氨基酸被Lys的置换,第511位氨基酸被Phe的置换取代等。在L蛋白中,SeV L蛋白的第1197位的Asn(N1197)和/或第1795位的Lys(K1795)被其它氨基酸的置换,或者被其它负链RNA病毒的L蛋白同源位点的置换。具体为,第1197位氨基酸被Ser、第1795位氨基酸被Glu等的置换。P基因及L基因的突变,可以显著提高感染的持续性,抑制次级粒子的释放及抑制对细胞的伤害。
负链RNA病毒载体,除抗原之外,还可以进一步编码Th2细胞因子和/或抗炎症细胞因子(实施例11)。本发明中,Th2细胞因子是指与1型辅助T细胞(Th1细胞)相比,优先产生于2型辅助T细胞(Th2细胞)中的细胞因子。具体地,包含IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13及TGF-β。另外,抗炎症细胞因子(也称抗炎症性细胞因子)是指具有抑制炎症作用的多肽的总称。包含促进抑制炎症的信号传递的信号传递分子及阻碍促进炎症的信号传递的信号传递分子(例如抗炎性细胞因子抑制剂)。本发明中的抗炎症细胞因子具体包含白细胞介素(IL)-4、IL-10、IL-11、IL-13、TGF-β、可溶性TNF-α受体及IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)。被载体编码的Th2细胞因子或抗炎症细胞因子可以是天然多肽的全长,也可以是部分肽,仅需维持有活性(即活性片段)。例如,N末端及/或C末端的氨基酸残基的缺失(例如1-30个氨基酸,较特定为1、2、3、4、5、10、15、20或25个氨基酸)不影响细胞因子的活性的可能性比较高。另外,还是结合于炎症性细胞因子受体的可溶性片断(包含配体结合领域)及炎症性细胞因子受体的配体结合领域的抗体或抗体片断,也可以是阻碍炎症性细胞因子的信号传递的多肽。此外,Th2细胞因子和/或抗炎症细胞因子可使用包含信号序列被去除的成熟多肽的所需片断。使其在细胞外分泌的N末端的信号序列可以使用适合的所需蛋白信号序列。分泌信号序列,例如可以使用白细胞介素(IL)-2、组织纤维蛋白溶酶原激活剂tPA)等所需分泌蛋白的信号序列,但不限于此。此外,也可以作为与其它肽融合的蛋白来表达。
本发明中,Th2细胞因子更优选选自IL-4、IL-10、IL-13及TGF-beta的细胞因子,最优选IL-10。各种细胞因子基因的碱基序列及氨基酸序列是已知的(IL-4:NM_000589、NP_000580、AAH66277、AAH67515、NP_758858、NP_067258、NP_958427;IL-10:NM_000572、NP_000563、CAG46825、NP_034678、NP_036986;IL-13:NM_002188、NP_002179、AAB01681、NP_032381、NP_446280;TGF-beta(转化生长因子β,transforming growth factor-beta):M_60316)。
各种Th2细胞因子或抗炎症细胞因子的活性,可以用已知的方法检测。例如,使用小鼠肥大细胞(mast cell)MC/9(ATCC CRL-8306),人红白血病(erythroleukemia)细胞株TF-1(ATCC CRL-2003)等,通过增生化验(proliferation assay)测定活性的方法是已知的(Thompson-Snipes,L.et al.,1991,J.Exp.Med.173:507-510;Kruse N et al.,EMBO J.1993;12:5121-5129;Oshima Y et al.,J Biol Chem 2001;276:15185-91;Oshima,Y.,et al.,J.Biol.Chem.275,14375-14380,2000;Leland,P.et al.,Oncol.Res.7,227-235,1995)。例如,可通过这种方法化验出采用了基因重组技术制备的各种Th2细胞因子或抗炎症细胞因子的缺陷突变体,并可以鉴定活性片段。计算半数有效量(50%effective dose)(ED50),以此为基础计算出的活性(例如ED50的反数)与野生型相比,50%或以上、优选60%或以上、70%或以上、80%或以上、90%或以上、或95%或以上的部分肽是可以使用的。
对载体所编码的Th2细胞因子和/或抗炎症细胞因子的来源没有特别限制,也可以使用包含小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猪、牛、马、驴、羊、狗、黑猩猩、猴以及人类等在内的任意哺乳动物。最好使用与给药对象相同的同种来源。编码这些细胞因子的核酸的碱基序列,可从上述数据库中获得,更具体为例如是小鼠IL-10,则为Genbank Accession No.AY410237、NM_010548;如果是人IL-10,则为Genbank Accession No.AY029171、NM_000572。
另外,本发明的负链RNA病毒可以不编码包含涉及所望疾患的蛋白或其部分肽(例如包含9、8、7、6、或5个氨基酸以上的部分肽)的多肽。所述疾患可以例举,如神经变性疾病,与神经变性疾病有关的蛋白可以例举β淀粉样蛋白。
重组病毒重构,更具体可参照如下文献。(WO97/16539;WO97/16538;WO00/70055;WO00/70070;WO01/18223;WO03/025570;WO2005/071092;Durbin,A.P.et al.,1997,Virology 235:323-332;Whelan,S.P.et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8388-8392;Schnell.M.J.et al.,1994,EMBO J.13:4195-4203;Radecke,F.et al.,1995,EMBO J.14:5773-5784;Lawson,N.D.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4477-4481;Garcin,D.et al.,1995,EMBOJ.14:6087-6094;Kato,A.et al.,1996,Genes Cells 1:569-579;Baron,M.D.and Barrett,T.,1997,J.Virol.71:1265-1271;Bridgen,A.and Elliott,R.M.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:15400-15404;Hasan,M.K.et al.,J.Gen.Virol.78:2813-2820,1997;Kato,A.et al.,1997,EMBO J.16:578-587;Yu,D.et al.,1997,Genes Cells 2:457-466;Tokusumi,T.et al.Virus Res.2002:86;33-38、Li,H.-O.et al.,J.Virol.2000:74;6564-6569)。使用这些方法,能由DNA重构负链RNA病毒,包括副流感病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒和仙台病毒。
可以使用所望的哺乳动物细胞进行病毒的生产,具体地可以使用来自猴肾的LLC-MK2细胞(ATCC CCL-7)和CV-1细胞(例如,ATCC CCL-70)、来自仓鼠肾的BHK细胞(例如,ATCC CCL-10)等的培养细胞、及人体细胞等。此外,为了获取大量的病毒载体,将上述宿主中得到的病毒载体在受精鸡卵中进行感染,从而扩增该载体。使用鸡卵制备病毒载体的方法已被开发(中西等人编著,1993)「神经科学研究的先进技术议定书III,分子神经细胞生理学」,厚生社,大阪,pp.153-172)。具体地,例如将受精卵放入培养器中,在37-38℃的温度下,培养9-12天,使胎胚成长。然后,将病毒载体接种到尿囊腔中,进一步将该受精卵培养数日(例如3天)使病毒载体繁殖。培养时间等条件,可根据所用重组仙台病毒的不同而改变。然后,回收含有病毒的尿囊液。可以用常规方法从尿囊液中分离和纯化仙台病毒载体(田代真人,「病毒实验议定书」,永井,石浜监修,Medical View Co.,Ltd.,pp.68-73,(1995)。
可以将回收的病毒载体纯化到基本纯。纯化方法包括过滤、离心分离,吸附以及层析柱纯化等众所周知的纯化分离方法或上述方法的任意组合方法进行。所谓“基本纯”是指在包含病毒载体的溶液中,该病毒为主要成分。例如基本纯病毒载体的组合物,在其所含溶液的全部蛋白(作为载体和稳定剂添加的蛋白除外)中,病毒载体蛋白的成分比例为10%或以上(重量/重量)、优选20%或以上、更优选50%或以上、优选70%或以上、更优选80%或以上、进一步优选90%或以上时,可以确定为基本纯。例如,如果是副粘病毒载体,其具体的纯化方法包括,采用纤维素硫酸酯或交联多糖硫酸酯的方法(特公昭JP62-30752号公报、特公昭JP62-33879号公报和特公昭JP62-30753号公报),以及用褐藻多糖硫酸脂和/或其分解产物吸附的方法(WO 97/32010),但不限于此。
负链RNA病毒载体、生成该病毒载体的核酸、该载体或生成该载体的核酸所导入的细胞或其细胞提取液与可药用载体或赋形剂混合构成抗体制备用组合物。“抗体制备用组合物”指的是专门用于制备抗体的组合物。“可药用载体或赋形剂”,是指悬浮病毒载体或细胞的所需溶液。例如磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、氯化钠溶液、培养基等。本发明涉及制备抗体用抗原载体组合物的制备方法。该方法包含携带编码抗原外来多肽核酸的负链RNA病毒载体、生成该病毒载体的核酸、该载体或生成该载体的核酸所导入的细胞或其细胞提取液和可药用载体或赋形剂的组合物的制备步骤。此外,本发明在抗体制备用组合物的制备中,还涉及到负链RNA病毒载体、生成该病毒载体的核酸、该载体或生成该载体的核酸所导入的细胞或其细胞提取液的使用。关于携带编码抗原外来多肽核酸的重组负链RNA病毒载体的制备,可参照本说明书中所述方法。为了提高免疫原性,可在抗体制备用组合物中添加细胞因子、霍乱毒素、沙门氏菌毒素等免疫活化剂。也可以混合明矾、完全弗氏(Freund′s)佐剂、不完全弗氏(Freund′s)佐剂、MF59(油乳化剂)、MTP-PE(来源于分支杆菌細胞壁的胞壁酰三肽(muramyl tripeptide))、或QS-21(来源于皂皮树(soapbark tree Quilaja saponaria))、Alum 1(水酸化铝、硫酸铝、磷酸铝等的铝化合物)等佐剂。
上述组合物优选包含Th2细胞因子或编码Th2细胞因子的核酸。或者,单独含有其他的抗炎症细胞因子或编码抗炎症细胞因子的核酸,也可与上述Th2细胞因子或编码Th2细胞因子的核酸组合。可使用本说明书所述的Th2细胞因子及抗炎症细胞因子或它们的组合。优选从IL-4、IL-10、及IL-13中选择。另外,上述组合物中还可包含Th2佐剂。例如,使用包含Th2佐剂的组合物,更加促进Th1/Th2的平衡向Th2移动。Th2佐剂,指的是相对1型辅助T细胞(Th1细胞),使2型辅助T细胞(Th2细胞)更具活性化的佐剂。具体可使用为氢氧化铝(aluminum hydroxide)(alum)、霍乱毒素(cholera toxin B subunit)、曼氏血吸虫卵(Schistosoma mansoni egg)提取蛋白(例如LNFIII,Lacto-N-fucopentaose III)(Grun,J.L.and P.H.Maurer,1989,Cellular Immunology 121:134-145;Holmgren J et al.,1993,Vaccine11:1179-1184;Wilson AD et al.,1993,Vaccine 11:113-118;Lindsay DS et al,1994,Int Arch Allergy Immunol 105:281-288;Xu-Amano J et al.,1993,J ExpMed 178:1309-1320;Okano M et al.,2001,J Immunol.167(1):442-50)。
可以包含生物聚合体等有机物、羟基磷灰石(hydroxyapatite)等无机物。具体地,包含以胶原基质、聚乳酸以及共聚物、聚乙二醇及共聚物和它们的化学衍生物为载体的组合物。
通过将制备的负链RNA病毒或包含该病毒的组合物给药于动物,使其得以表达抗原多肽,诱导抗体产生。载体的给药,可以是体内给药,也可以是由细胞介导的间接(回体)给药。所接种的负链RNA病毒载体,只要基因组RNA具有表达所携带抗原多肽基因的能力,则无需是感染性病毒粒子,也可以是非感染性病毒粒子及病毒核心(virus core)(包含基因组及基因组结合病毒蛋白的RNP复合体)。本说明书中,负链RNA病毒载体指的是一种复合体,该复合体包含核蛋白体(RNP),所述核蛋白体(RNP)又包含来自负链RNA病毒的基因组RNA及该RNA的复制及在表达携带基因时所必须的病毒蛋白,其在被感染细胞中可复制该基因组RNA,同时具有表达所携带基因的能力。RNP是包含例如负链RNA病毒的基因组RNA及其互补链(反义基因组RNA)和N、L、及P蛋白的复合体。即本发明的负链RNA病毒载体包含病毒感染粒子、非感染性粒子(也称病毒样粒子(VLP))、及负链RNA病毒的核壳等含有基因组RNA及结合基因组RNA的病毒蛋白的RNP。即使从病毒粒子中去除包膜的RNP(病毒核糖核蛋白体),一旦导入到细胞中,即可在细胞内复制病毒基因组RNA。(WO 97/16538;WO00/70055)。也可将RNP或VLP与所望的例如转染剂组合进行动物接种(WO00/70055;WO 00/70070)。
通过细胞进行接种时,将负链RNA病毒载体导入所需的培养细胞或从被接种动物体内采集的细胞中。在体外(例如,试管或培养皿)使负链RNA病毒感染细胞时,感染要在例如培养基或生理盐水等所需的生理水溶液中,在体外(或回体)进行。这时MOI(多重感染度:即每个细胞的感染病毒数)优选1-1000的范围、更优选2-500、更优选3-300、进而优选5-100。使负链RNA病毒与细胞短时间接触即可。例如1分钟或以上、优选3分钟或以上、5分钟或以上、10分钟或以上。也可结合20分钟或以上。例如,1-60分钟,比较特定为5-30分钟或更长时间。当然还可以更长,例如接触几天以上。
包含病毒基因组RNA在内的RNP以及非感染性病毒粒子(病毒样粒子(VLP)可用已知的转染剂法导入细胞。具体地,如磷酸钙法(Chen,C.&Okayama,H.,BioTechniques 6:632-638,1988;Chen,C.and Okayama,H.,Mol.Cell.Biol.7:2745,1987)、DEAE-葡聚糖法(Rosenthal,N.,Methods Enzymol.152:704-709,1987)、各种脂质体转染剂(Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,1989)、以及电穿孔法(Ausubel,F.et al.,In Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,NY,Vol.1,Ch.5 and 9,1994)等本行业公认的多种技术转染细胞。转染剂中可添加氯喹以防止在内体中的降解。(Calos,M.P.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:3015,1983)。转染剂可例举如下几种、DOTMA(Roche)、Superfect Transfection Ragent(QIAGEN,Cat No.301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Roche #1811169)、TransIT-LT1(Mirus,ProductNo.MIR 2300)、CalPhosTM Mammalian Transfection Kit(Clontech #K2051-1)、CLONfectinTM(Clontech #8020-1)等。已知包膜病毒在形成病毒粒子时,吞含来源于宿主细胞的蛋白,该蛋白在导入细胞时,可能是产生抗原性及导致细胞伤害性的原因。(J.Biol.Chem.,272:16578-16584,1997)。因此,应使用去除包膜的RNP(WO 00/70055)。
将表达病毒基因组RNA的表达载体,及编码复制该基因组RNA时所需的病毒蛋白(N、P、或L蛋白)的表达载体导入细胞,可在细胞内直接形成病毒RNP。也可如此制备导入了病毒载体的细胞。
将负链RNA病毒载体所导入的细胞,进行12小时-5天的细胞培养(优选1-3天),使其表达抗原多肽。所得细胞可直接或裂解为细胞提取液接种到动物。载体感染细胞的细胞提取液,可用表面活性剂溶解细胞膜的方法或反复冻-融等方法调制。Triton X-100及Nonidet P-40等非离子表面活性剂所适用的浓度范围为0.1~1%。例如,将用PBS清洗,离心回收的细胞,在TNE buffer[25mM Tris-HCl(pH7.5),150mM NaCl,1mM EDTA,1%Nonidet P-40]内再度悬浮后,置于冰中10-30分后而得。用于抗原的蛋白质可溶于细胞质时,将所得的细胞提取液离心(10,000×g、10分)处理,沉淀滤出不溶成分。所得上清可用于免疫。在不希望使用表面活性剂的部位给药细胞提取液时,将清洗后于PBS中再度悬浮的细胞,反复冻-融5-6次,破坏细胞,获得细胞提取液。本发明的抗体或抗体产生细胞的制备方法,包含在动物接种前,制备携带编码抗原外来多肽的核酸的负链RNA病毒载体、生成该病毒载体的核酸、该载体或生成该载体的核酸所导入的细胞、以及调制该细胞裂解物的步骤、及其任意组合。
通过将产生携带编码抗原外来多肽的负链RNA病毒载体的核酸给药到动物,并在动物体内生成表达抗原多肽的负链RNA病毒载体,来诱导抗体产生。所述产生负链RNA病毒载体的核酸,指的是表达生成该负链RNA病毒载体的重组体时所需的RNA及蛋白群的核酸组。具体地,编码所需外来多肽的负链RNA病毒基因组RNA及其互补链(基因组RNA反义链,即正链)的核酸,编码包含负链RNA病毒基因组RNA在内的RNP构成蛋白质群的核酸的核酸组。这些核酸都含有可以表达所编码的RNA及蛋白质所需的适宜的启动子。例如CMV启动子(Foecking,M.K,and Hofstetter H.,Gene1986;45:101-105)、逆转录病毒LTR(Shinnik,T.M.,Lerner,R.A.& Sutcliffe(1981)Nature,293,543-548)、EF1启动子、及CAG启动子(Niwa,H.et al.(1991)Gene.108:193-199,特开平3-168087)。核酸可以优选使用质粒载体。该负链RNA病毒的基因组,携带编码构成包含基因组RNA的RNP的病毒蛋白群(典型为N、L、P),且优选携带亲本株野生型病毒具有的所有包膜构成蛋白基因。该负链RNA病毒的基因组,在缺失包膜构成蛋白的基因时,所编码核酸,即编码与感染性病毒粒子的形成相关的包膜蛋白(例如基因组缺失的包膜蛋白以及VSV-G等其他包膜蛋白)的核酸,可以包含在上述核酸组内。通过将这些核酸给药于动物,可在动物体内生成重组负链RNA病毒。构成含有负链RNA病毒基因组RNA的RNP的病毒蛋白群,指的是与病毒基因组RNA共同形成RNP,并构成核壳的蛋白质。这些蛋白是基因组复制和基因表达时所必需的蛋白群,典型的包含N、P、L蛋白。具体地,本发明涉及到如下方法,(a)(i)编码外来多肽的负链RNA病毒的基因组RNA或编码其互补链的核酸及(ii)将编码N、P、L蛋白质的核酸分别接种于动物的步骤,以及(b)从该动物中回收抗体或抗体产生细胞的步骤。
关于(a),可以不直接接种于动物,或事先调制生成该病毒载体的核酸所导入的细胞后,也可接种调制的细胞或该细胞的裂解物,或由该细胞裂解物生成的抗原。关于生成负链RNA病毒载体的核酸的详细文献可参照如下(WO97/16539;WO97/16538;WO00/70055;WO00/70070;WO01/18223;WO03/025570;Durbin,A.P.et al.,1997,Virology 235:323-332;Whelan,S.P.et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8388-8392;Schnell.M.J.et al.,1994,EMBO J.13:4195-4203;Radecke,F.et al.,1995,EMBO J.14:5773-5784;Lawson,N.D.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4477-4481;Garcin,D.et al.,1995,EMBO J.14:6087-6094;Kato,A.et al.,1996,GenesCells 1:569-579;Baron,M.D.and Barrett,T.,1997,J.Virol.71:1265-1271;Bridgen,A.and Elliott,R.M.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:15400-15404;Hasan,M.K.et al.,J.Gen.Virol.78:2813-2820,1997;Kato,A.et al.,1997,EMBO J.16:578-587;Yu,D.et al.,1997,Genes Cells 2:457-466;Tokusumi,T.et al.Virus Res.2002:86;33-38、Li,H.-O.et al.,J.Virol.2000:74;6564-6569)。
接种的给药途径不受特别限制,例如优选肌肉注射(如腓肠肌)、皮下给药、点鼻、手掌或足垫皮内给药、脾脏内直接给药、腹腔内给药等。点鼻给药,是指包括从感染部位局限于鼻腔内的情况(鼻腔内给药),和延伸至气管、肺(经鼻肺给药)等部位的情况。
另外,也可以通过口服给药、肛门(直肠)给药、子宫(泌尿器或生殖器)给药。靶器官包含口腔、肠道、泌尿生殖器或上呼吸道粘膜等。口服给药时,为确保药物的运送不受酸度强的胃酸的影响,可加工成渐溶性微型胶囊载体,使其感染到靶器官。
接种部位可为一到多处(例如2-15处)。接种量可根据被接种动物,接种部位及接种次数等适当调整。例如一处给药量换算成病毒滴度为1x104CIU-5x1011CIU(cell infectious unit,细胞感染单位),优选1x106CIU-1x1010CIU。通过细胞接种(ex vivo给药)时,例如将负链RNA病毒载体感染到同种的培养细胞株(例如肉瘤细胞株),可在104~109细胞,优选105~108给药范围内将细胞或其细胞提取液接种到动物。首次接种便可诱导明显的抗体效价,如进行2次以上的加强免疫,更能提高抗体效价。
作为编码抗原的负链RNA病毒载体,优选还编码了Th2细胞因子和/或抗炎症细胞因子的负链RNA病毒载体。或者用编码了抗原的负链RNA病毒载体进行免疫时,和/或免疫前后(例如编码了抗原的负链RNA病毒载体给药前后1-72小时以内,优选1-48小时以内,再优选1-24小时以内)给药Th2细胞因子和/或抗炎症细胞因子或者编码了它们的载体。对给药部位没有特别限制,如与编码了抗原的负链RNA病毒载体给药的相同部位,或其周边(1mm-3cm以内、优选3mm-10mm以内)部位都可给药。
将生成负链RNA病毒载体的核酸接种于动物时,编码外来多肽的负链RNA病毒的基因组RNA或编码其互补链的核酸,与编码N、P、L蛋白的核酸可按5∶0.5∶0.5∶2的重量比导入动物体内。核酸的比例可适当调整。例如使用表达质粒时,可用编码病毒基因组RNA(正链或负链)的质粒5μg~1000μg,以及N表达质粒0.5μg~200μg,P表达质粒0.5μg~200μg,L表达质粒2μg~500μg进行给药。核酸的给药,例如可将裸DNA直接或与转染剂混合后注入。转染剂中含有例如阳离子脂质体及聚阳离子脂质体。具体可利用如下方法。DOTMA(Roche)、Superfect(QIAGEN #301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Roche #1811169)、TransIT-LT1(Mirus,Product No.MIR 230)。
加强免疫可在初次免疫1-数周后(例如1-3周,更具体为约2周后)进行,给药方法同上。加强免疫,例如更适合腹腔内给药和/或背部,足垫等皮内注射。为了进一步提高抗体效价可反复进行加强免疫。对动物进行加强免疫时,优选接种携带编码抗原外来多肽的核酸的上述负链RNA病毒载体、生成该病毒载体的核酸、该载体或生成该载体的核酸所导入的细胞、该细胞的裂解物、以及由该细胞裂解物纯化而得的抗原。加强免疫所用细胞裂解物,可按照上述方法制备。对纯化抗原的纯度没有特别限制,可适度纯化。例如可使用通过离心、过滤、透析、及各种色谱法等由裂解物纯化获得抗原。同时也适合接种抗原外来多肽或其部分肽。例如,可以合成部分肽,桥接钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、血小板球蛋白(THY)、鸡卵白蛋白(OVA)等载体蛋白后进行接种。部分肽的长度,例如8-25残基(9-20、10-18、或12-16残基)为好。加强免疫时,可给药Th2细胞因子和/或抗炎症细胞因子或编码了Th2细胞因子和/或抗炎症细胞因子的载体。
如果获得了足够的抗体效价,就可通过采血回收抗体(多克隆抗体时)。制备单克隆抗体时,从免疫动物的脾脏或淋巴结等处回收细胞,将骨髓瘤细胞和细胞融合制备杂交瘤细胞。由此使细胞无限增殖化后,选择能够产生目的抗体的细胞进行克隆(Harlow,E.,1988,Antibodies;A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor,New York;John E.Coligan et al.(Eds),CurrentProtocols in Immunology(Chapter 2);Peter J.Delves(Ed),Antibody Production:Essential Techniques,1997,John Wiley & Sons;R.Kontermann & S.Dubel(Ed),Antibody Engineering,2001,Springer Verlag,Heidelberg;Caponi,L.&Migliorini,P.(Eds),Antibody Usage In The Lab,Springer Lab Manual,1999,Springer-Verlag Berlin and Heidelberg GmbH & Co.;William C.Davis(Ed.),Monoclonal Antibody Protocols.,Methods in Molecular Biology,Vol 45,1995,Humana Press Inc.,Totowa,N.J.)。作为给药对象的动物,包括鱼类、两栖类、爬虫类、鸟类及哺乳类等拥有抗体的所需非人脊椎动物。优选鸟类及非人哺乳类,更优选非人哺乳动物。具体为鸡、兔、绵羊、山羊、猪、牛、小鼠、大鼠等啮齿类、猴等非人灵长类及其他的哺乳动物。
抗体水平可根据ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)或乌赫特朗尼法测定。ELISA法是将抗原吸附在多孔板上,将制备的抗血清从1∶1000开始以2倍的梯度进行稀释,然后加到多孔板中完成抗原抗体反应。进而作为2次抗体,使免疫动物的抗体与过氧化物酶标记的异种动物抗体发生反应,并使其发色。吸光度在最大发色吸光度的1/2时,以抗体的稀释倍率作为计算出的抗体效价。另外,乌赫特朗尼法是在琼脂内使抗原及抗体扩散,利用免疫沉降反应呈现白色沉降线的现象,以发生免疫沉降反应时的抗体的稀释倍率作为抗体效价,这样来测定抗体效价。
抗体,可以在血清及其稀释液中制备或纯化。例如可纯化IgG或IgM抗体等所需的分型。例如一般在制备其亲和力较高而最常使用的IgG抗体时,可以使用将Protein A或Protein G固定为载体的层析柱法和串珠法。如果是IgM抗体,可以通过以2-巯基烟酸为配体的层析柱法进行纯化。2-巯基吡啶(2-mercaptopyridine)也可用于IgY(鸡蛋黄抗体)的纯化(HiTrap IgYPurification HP,Amersham Biosciences K.K.)。或者通过DEAE阴离子交换色谱法纯化抗体。例如从绵羊,山羊大量纯化抗体时,首先用硫酸盐进行盐析获得粗IgG级分,在通过DEAE纤维层析柱时,IgG成分不被吸附,回收流出的级分。作为从抗血清中纯化抗体的特异纯化方法,可用亲和纯化法。将抗原固相化到载体凝脂中,制备亲和凝脂,将抗血清通过该凝脂,通过回收结合到抗原的IgG,可以特异地回收结合于抗原的抗体。可用HPLC(例如TOSO制TSK G3000 SWXL层析柱)等分析所回收的抗体的纯度(Howard,C.C.and Bathell,D.R.eds.,Basic Methods in Antibody Productionand Characterization,2001,CRC Press BocaRaton,London,New York.)。
选择或纯化由本发明的方法制备的抗体或抗体产生杂交瘤细胞时,可将不结合于目的抗原多肽的抗体通过阴性选择除去。例如可从制备的抗体中,去除结合于负链RNA病毒来源病毒蛋白的抗体。为此,可调制不编码目的抗原多肽的负链RNA病毒载体、该病毒载体所导入的细胞、该细胞的裂解物、或该病毒中的一个或多个病毒蛋白,除去结合于上述物质的抗体。具体为,将含有抗体的溶液混合于不编码目的抗原多肽的该负链RNA病毒载体、该病毒载体所导入的细胞、该细胞的裂解物、或固定有该病毒的病毒蛋白的载体凝脂,以此除去与它们结合的抗体。采用这种方法,将结合于负链RNA病毒载体的抗体除去后,通过回收残留溶液,可提高结合于目的抗原多肽的抗体的纯度。同样的操作也可使用于杂交瘤细胞等。例如,将杂交瘤细胞产生的抗体溶液混合到不编码目的抗原多肽的负链RNA病毒载体、该病毒载体所导入的细胞、该细胞的裂解物、或该病毒的病毒蛋白中,以测出结合。通过选择产生不与它们结合的抗体的杂交瘤细胞,可以清除产生结合于病毒载体自身的抗体的杂交瘤细胞。
所得抗体,可以溶液或冻干剂等形式保存。以溶液保存时,可添加叠氮钠作为防腐剂。也可添加含有牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂。例如,可将抗体放入含有2mg/mL的牛血清白蛋白和0.1%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液中稀释。抗体的用途,例如,通过流式细胞术解析细胞表面抗原,通过流式细胞术解析细胞内抗原、免疫组织染色、免疫印迹、免疫沉降、ELISA、ELISPOT,对小鼠及其它哺乳动物的体内试验、生物试验、阻断、中和试验、抗体治疗等。但不限于此。生物试验及体内使用,优选不含叠氮钠防腐剂的抗体。用于检测蛋白质时,可将抗体适当标记。如已知的酶标记、荧光素标记、放射性核素标记、生物素标记、胶体金标记等多种标记法(P.Cuatrecasas,et al.,Biochemistry,11,2291(1972);S.Yoshitake,et al.,Eur.J.Biochem.,101,395(1979);M.J.O′Sullivan,et al.,Anal.Biochem.,100,100(1979);S.Yoshitake,et al.,Anal.Lett.,15,147(1982);J.V.Staros,Biochemistry,21,3950(1982);E.Ishikawa,et al.,J.Immunoassay,4,209(1983);S.Yoshitake,et al.,Scand.J.Immunol.,10,81(1979);K.Fujiwara,et al.,J.Immunol.Methods,112,77(1988))。用荧光色素标记抗体时,荧光色素可使用例如FITC、PE、ECD(PE-TxRED)、PC5(PE-Cy5)、PC5.5(PE-Cy5.5)、PC7(PE-Cy7)、APC、APC5.5(APC-Cy5.5)、APC7(APC-Cy7)、Cy5、Alexa FluorTM等。另外,抗体可片段化,可处理成F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv等形态。抗体片段可用番木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等蛋白水解酶分解抗体而得。
实施例
通过以下实施例对本发明做进一步的详细阐述,但本发明并不限于这些实施例。且本说明书中所引用的文献全部作为本说明书的一部分被包括在内。
[实施例1]通过给药携带LacZ基因的负链RNA病毒载体产生抗LacZ抗体
1.免疫
将表达LacZ的F基因缺陷型仙台病毒载体SeV18+LacZ/ΔF(WO00/70070)用生理盐水调制成2x108CIU/ml后,给药到6只雄性BALB/cA小鼠(6周龄)的腓肠肌。单侧分两处肌肉注射,每处各接种了100μl。载体接种5周后,从小鼠的眼窝静脉网状组织(orbital venous plexus)采血,做了血浆分离。
2.抗体的检测
抗体检测,使用了市售的来源于大肠菌的β-半乳糖苷酶(Sigma G5635),使每泳道均为4μg,并进行了SDS电泳。泳动后的蛋白质用半干印迹仪转移到PVDF膜上,用5%脱脂牛奶阻断。免疫的小鼠血浆在含有4%牛血清白蛋白的PBS中200倍稀释后,作为一抗使用。阳性对照,使用将抗LacZ抗体(Promega Z378A)在含有4%牛血清白蛋白的PBS中500倍稀释后的制品。作为二抗,使用了用添加5%脱脂牛奶和0.1%Tween20的TBS溶液稀释了的HRP-标记小鼠Igs(Biosource AMI4704)。使用ECL plus(Amersham),通过LAS1000装置(FUJI FILM)检测化学发光信号。
[结果]
仅通过一次SeV18+LacZ/ΔF初次免疫,5周后便确认到了小鼠血中产生了抗LacZ抗体。
[实施例2]通过给药携带GFP基因的负链RNA病毒载体产生抗GFP抗体
1)免疫
A:将表达GFP的F基因缺陷型仙台病毒载体SeV18+GFP/ΔF(WO00/70070)用生理盐水稀释后,通过点鼻、肌肉注射、脾脏直接注射及足垫注射,给药到16只雌性BALB/cA小鼠(6周龄)(每种给药途径各接种4只小鼠)。每只小鼠均接种了5x106 CIU。点鼻给药是使小鼠在七氟烷(sevoflurane)的轻度麻醉下,通过自然呼吸一点儿一点儿地经鼻吸入100μl的载体悬浮液。肌肉注射在单腿腓肠肌内分两处给药,每处各注射了50μl。脾脏直接注射,将50μl的载体悬浮液直接注射到脾脏。足垫注射,每只脚各注射了25μl,两脚共注射了50μl。
B:对6周龄雌性BALB/cA小鼠(各两只),分别在腹腔和腰部皮下给药用生理盐水调制的1x108CIU/ml的病毒载体SeV18+GFP/ΔF。腹腔给药采取直接注射100μl的载体悬浮液,皮下给药在腰部分两处各注射了50μl。
(2)加强免疫
A:初次免疫2周后,在所有小鼠腹腔内给药100μl的经调制的5x107CIU/ml病毒载体SeV18+GFP/ΔF。以同样方法,在对照组的非加强免疫小鼠体内注入了100μl的生理盐水。
B:初次免疫16天后,在所有小鼠的腹腔内给药100μl的用生理盐水调制的1x108CIU/ml病毒载体SeV18+GFP/ΔF。
(3)采血
A:在初次免疫前(非免疫对照组)、初次免疫后第28天,用涂有肝素的毛细管从眼窝静脉采血约100μl,做了血浆分离。
B:初次免疫后第19天(加强免疫3天后),同样从眼窝静脉采血约100μl,做了血清分离。
(4)抗体的检测
A:利用对于经SDS-PAGE电泳后转移、固定到PVDF膜上的市售纯化GFP蛋白的Western印迹,检测了血浆中的抗GFP抗体效价。作为对照,使用了市售的抗GFP抗体以及非免疫小鼠血浆。
B:利用对于经SDS-PAGE电泳后转移、固定到PVDF膜上的携带GFP基因的仙台病毒载体感染LLC-MK2细胞裂解液中的蛋白的Western印迹,检测了血浆中的抗GFP抗体效价。
2.制备Western印迹用细胞裂解液
在10cm培养皿中,使SeV18+GFP/ΔF感染LLC-MK2细胞,使得moi为10,两天后在4℃的PBS中洗涤两次。加入5ml细胞裂解缓冲液(添加了10mM CHAPS、2mM EDTA、2mM PMSF的PBS),在4℃下静置20分钟后,用细胞刮板回收了可溶物。将该回收物在9000rpm下离心后,回收上清,置入透析管内(Slide-A-Lyzer 2000MW)(Piarce),对4℃的PBS进行透析,去除了CHAPS。采用bradford法(Bio-Rad,DC Protein Assay Kit)进行可溶蛋白的定量,每个泳道添加5μg,进行了SDS-PAGE。
3.Western印迹
用半干印迹仪(semi-dry blotter)将蛋白质转移到PVDF膜上,然后用5%脱脂牛奶或4%牛血清白蛋白进行阻断。用含有4%牛血清白蛋白的PBS将血浆200倍稀释后用于一抗反应。作为阳性对照,使用了在含有4%牛血清白蛋白的PBS中稀释5000倍的抗GFP抗体(Invitrogen)。使用了将二抗HRP标记抗小鼠Igs(Biosource AMI4704)用添加了5%脱脂牛奶或4%牛血清白蛋白、0.1%Tween20的TBS稀释后的制品。使用了ECL plus(Amersham),用LAS1000装置(FUJI FILM)进行了化学发光的检测。
[结果]
初次接种SeV18+GFP/ΔF4周后,在所有小鼠(与是否进行了加强免疫无关)的血中都确认到了抗GFP抗体的产生(图2)。抗体效价的上升尤以点鼻给药小鼠显著。
[实施例3]通过腹腔内给药负链RNA病毒载体感染细胞裂解液来产生抗体。
1.免疫
(1)初次免疫
对两只6周龄的雌性BALB/cA小鼠,分别在腹腔给药仙台病毒载体SeV18+GFP/ΔF感染的小鼠肉瘤细胞Meth-A(RIKEN RCB0464;Old,L.et al.(1962)Ann.N.Y.Acad.Sci.101,80-106)的裂解液,每只小鼠给药相当于5x106细胞的量。用仙台病毒载体SeV18+GFP/ΔF感染Meth-A细胞,moi=1,000。3天后将离心收集的细胞用DPBS(-)清洗,反复冻融5次后,离心去除细胞碎片,所得上清级分可作为裂解液使用。
(2)加强免疫
将100μl调制的5x107CIU/ml病毒载体SeV18+GFP/ΔF给药到初次免疫2周后的所有小鼠腹腔内。对非加强免疫的对照小鼠以同样方法给药100μl的生理盐水。
2.抗体的检测
(1)采血
在初次免疫前(非免疫对照组)、初次免疫后第14天(加强免疫前)和第28天用涂有肝素的毛细管从眼窝静脉采血约100μl,做了血浆分离。
(2)Western印迹
与实施例2同样,利用对于经SDS-PAGE电泳后转移、固定到PVDF膜上的市售纯化GFP蛋白(Wako chemicals)的Western印迹,检测了血浆中的抗GFP抗体效价。作为对照使用了市售抗GFP抗体(Invitrogen)以及非免疫小鼠血浆。
[结果]
初次接种SeV18+GFP/ΔF感染细胞提取液4周后,在所有小鼠(与有无加强免疫无关)的血中都确认到了抗GFP抗体的产生(图3)。
[实施例4]通过用病毒载体进行初次免疫和用该病毒载体感染的细胞裂解液进行加强免疫的组合来产生抗体
1.免疫
(1)初次免疫
将在生理盐水中稀释的仙台病毒载体SeV18+GFP/ΔF(WO00/70070),与实施例2同样的方法通过点鼻、肌肉注射、脾脏直接注射及足垫注射,给药到8只6周龄雌性BALB/cA小鼠(每种给药途径各接种2只小鼠)。每只小鼠均接种了5x106 CIU。
(2)加强免疫
将100μl的仙台病毒载体SeV18+GFP/ΔF感染的小鼠肉瘤细胞Meth-A(RIKEN RCB0464)的裂解液,给药到初次免疫2周后的所有小鼠的腹腔内。每只小鼠给药5x106细胞量。裂解液的制备方法同实施例3。
2.抗体的检测
(1)采血
在初次免疫前(非免疫对照组)、初次免疫后第14天(加强免疫前),和第28天用涂有肝素的毛细管从眼窝静脉采血约100μl,做了血浆分离。
(2)Western印迹
利用对于经SDS-PAGE电泳后转移、固定到PVDF膜上的市售纯化GFP蛋白(Wako chemicals)的Western印迹,检测了血浆中的抗GFP抗体效价。作为对照,使用了市售抗GFP抗体(Invitrogen)以及非免疫小鼠血浆(图4) 。
[结果]
初次接种SeV18+GFP/ΔF载体后,用该载体感染细胞进行加强免疫时,在小鼠的血中确认到了抗GFP抗体的产生增强(图4)。
[实施例5]抗GFP单克隆抗体的制备
1.免疫
(1)初次免疫
向一只6周龄雌性BALB/cA小鼠腹腔内,给药100μl的用生理盐水调制的1x108CIU/ml病毒载体SeV18+GFP/ΔF。
(2)加强免疫
初次免疫16天后,将100μl调制的1x108CIU/ml的病毒载体SeV18+GFP/ΔF给药到小鼠腹腔内。
2.制备杂交瘤细胞
将骨髓瘤细胞(P3-X63-Ag8.653)(RIKEN RCB0146)置于含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中培养,并使其在融合当天处于对数增殖期。加强免疫后的第3天,拉颈脱臼处死小鼠,取出脾脏。使用无菌不锈钢网在无血清RPMI1640培养基中过滤并剥离脾细胞。在无血清RPMI1640培养基中清洗脾细胞3次,骨髓瘤细胞2次,然后将脾细胞和骨髓瘤细胞以数量比1∶1混合,离心。去上清后,用50%的聚乙二醇PEG(Sigma Hybri-Max mw3000-3700)将脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合。重复在无血清培养基中清洗、离心融合细胞的步骤两次。然后,将其在添加了20%FBS/10mM HEPES/1mM丙酮酸钠的RPMI1640培养基40ml中悬浮,接种到96孔培养板中,每孔约105细胞。细胞融合的第二天,每孔添加100μl HAT选择培养基,从翌日起,将培养基上清去除一半后每孔再添加100μl的HAT培养基(添加20%FBS/1xHAT supplement Hybri-Max(SigmaH0262)的RPMI1640)。细胞融合后一周内,每天用HAT选择培养基更换一半的培养基,之后,用HT培养基(添加20%FBS/1xHT supplementHybri-Max(Sigma H0137)的RPMI1640)每两天进行一次更换或视活细胞密度进行更换。至用HAT选择培养基选择的融合细胞长满孔底的一半以上时,回收培养上清,进行Western印迹,在融合细胞中挑选产生抗GFP抗体的细胞。对于增殖了的融合细胞,使用以BALB/cA小鼠胸腺细胞为饲养细胞(Feeder cell)的96孔板,用极限稀释法进行克隆。所得克隆细胞进行增殖,在其约长满孔的一半时,回收培养上清,通过Western印迹回收了产生抗GFP抗体的克隆细胞。其结果是,用携带GFP的仙台病毒载体免疫了的小鼠脾细胞,成功地制备了可识别GFP的单克隆抗体(图5)。
[实施例6]制备识别人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)包膜蛋白gp160的单克隆抗体
1.免疫
(1)初次免疫
在七氟烷的麻醉下,对8只7周龄雌性BALB/cA小鼠点鼻给药用生理盐水调制的5x108 CIU/ml的携带人免疫缺陷性病毒1型(HIV-1)包膜蛋白gp160的F基因缺陷型仙台病毒载体SeV18+GP160/ΔF,每只小鼠给药100μl。
(2)加强免疫
初次免疫后的第14、28、42、56天,以采用冻融法制备的SeV18+GP160/ΔF感染7T1细胞裂解液(每5x106个细胞/100μl),每只小鼠腹腔给药100μl。
2.制备杂交瘤细胞
按照实施例5的方法准备了骨髓瘤细胞。末次加强免疫后的第4天,取4只末次加强免疫时采取的血浆中抗gp160抗体效价高的小鼠,将其拉颈脱臼处死,并摘除脾脏。然后在置于无血清RPMI1640培养基中的尼龙网上揉挤脾脏,并分离、回收脾细胞。脾细胞和骨髓瘤细胞的细胞融和以及融合细胞的培养依照实施例5的方法进行。
由HAT选择培养基筛选出的融合细胞长满孔底的一半以上时,回收培养上清,用固定有SeV18+GP160/ΔF载体感染LLC-MK2细胞裂解液的96孔培养皿以及固定有未携带基因的空白SeV18+/ΔF载体感染LLC-MK2细胞裂解液的96孔培养皿进行了ELISA实验。结果,仅在固定有SeV18+GP160/ΔF载体感染LLC-MK2细胞裂解液的96孔板中,检出了呈阳性的培养上清,并做了抗体产生细胞的鉴定。gp160特异性抗体,是通过以与实施例2相同的方法进行Western印迹来确认的(图6),所述Western印迹使用了对由冻融法制备的SeV18+GP160/ΔF载体感染LLC-MK2细胞裂解液进行SDS-PAGE后再进行转印而得的PVDF膜。如此获得的杂交瘤细胞产生的抗gp160抗体的亚型(subclass),使用市售试剂盒MouseImmunoglobulin Screening/Isotyping Kit(Genzyme、商品号97-6550))鉴定为IgG1(图7)。针对HIV及其他病毒的病毒蛋白质的抗体,可用于例如病毒感染的检查和诊断。
[实施例7]通过用肽进行加强来制备免疫识别人免疫缺陷性病毒1型(HIV-1)包膜蛋白gp160的单克隆抗体
1.免疫
(1)初次免疫
方法同实施例6。
(2)加强免疫
人工合成构成gp160蛋白质氨基酸序列的一部分的3种肽,使用常规方法结合到载体蛋白KLH(钥孔戚血蓝蛋白,keyhole limpet hemocyanin)中。合成的肽的氨基酸序列如下。括号内的编号为登录在Genbank(accessionnumber NP_057856)中的gp160氨基酸序列中相应部分的氨基酸编号。不过,#493和#495的N-末端的半胱氨酸及#494的C-末端的半胱氨酸,是为了与KLH结合而附加的,其不包含在gp160的序列中。
#493 CTRKRIRIQRGPGRAFV(303-318)(配列番号:10)
#494 SELYKYKVVKIEPLGVC(481-496)(配列番号:11)
#495 CPRGPDRPEGIEEEGGER(724-740)(配列番号:12)
在实施加强免疫前,制备由上述3种肽的等量混合(对于每只小鼠,3种肽各为50μg)溶液与不完全弗氏佐剂(Freund′s incomplete adjuvant)相混合的乳剂,给药到初次免疫后第14、28、42、56天的小鼠背部皮下,每只小鼠注射200μl。
2.杂交瘤细胞的制备、筛选,以及Western印迹
方法同实施例6,在由用肽加强免疫的小鼠制备的融合细胞中检测到了产生抗gp160抗体的杂交瘤细胞C1-182(图8)。C1-182的亚型与实施例6相同,使用市售试剂盒Mouse Immunoglobulin Screening/Isotyping Kit(Genzyme、商品号97-6550))鉴定为IgG1(图7)。由此表明,不仅是细胞裂解液,合成肽也可以在制备单体克隆抗体时有效地进行加强免疫。
3.通过抗体结合阻碍实验进行抗原表位的确认
通过结合阻碍试验确认了杂交瘤细胞C1-182所产生的抗体是否将用于加强免疫的任何一种肽识别为表位。Western印迹按上述方法进行,在与杂交瘤细胞C1-182的上清发生反应时,预先在反应液中混入了#493、#494、#495中的任何一种肽,使其含量为0.1、1.0或10μg/ml。上清中的抗体和膜上的gp160的反应,仅在混入肽#495时受到抑制,故得知C1-182产生的抗体将肽#495的氨基酸序列识别为表位。由此支持了下述事实:使用肽进行加强免疫是有效的(图9)。
[实施例8]生成识别gp160的单克隆抗体的杂交瘤细胞的克隆
为使制备的杂交瘤细胞稳定传代,对6-76和C1-182进行了细胞克隆。在96孔组织培养皿内接种稀释的细胞,使孔均接种0.3、1、3个细胞。约2周后,在显微镜下确认每孔只出现1个细胞集落的孔后,采集其上清,用ELISA法检测了抗gp160抗体的存在。克隆时使用的是在含有10%FBS的RPMI1640培养基中再加入10%的BM Condimed H1(Roche Diagnostics,商品号1088947)的制品。克隆进行了2次。第2次使用的是第1次克隆时呈阳性的杂交瘤细胞株6-76-14、6-76-17、C1-182-40,C1-182-48。第2次克隆的阳性率分别为35/36(97%)、26/26(100%)、20/29(69%)、29/29(100%),因此可以得出对#6-76、C1-182的克隆化均取得了成功的结论(图10)。
进而,将2次克隆呈阳性的细胞6-76-14-21、6-76-14-29、C1-182-48-5、C1-182-48-35的培养上清,如实施例6的方法进行了Western印迹,与克隆前的杂交瘤细胞以及第1次克隆后的阳性细胞同样检测出了gp160和gp41(图11)。
[实施例9]纯化杂交瘤细胞6-76-14-29产生的抗体
使用固定有免疫球蛋白结合蛋白L的层析柱(Pierce ImmunoPureImmobilized Protein L,商品号20510)对杂交瘤细胞6-76-14-29培养上清中的抗体蛋白进行纯化。纯化手法参考附件说明书。对于纯化所得的抗体进行Sypro Orange荧光染色(BioRad商品号170-3120)、利用抗小鼠IgG(L+H)抗体(MP Biomedicals商品号67428)进行Western印迹,在这两个实验中,其均显示与作为对照使用的市售抗Ovalbumin抗体(AntibodyShop商品番号HYB094-07)相同的一条H链和一条L链。这表明杂交瘤细胞6-76-14-29为克隆产物,且所产生的抗体蛋白为单一种类(single type)(图12)。进而,使用纯化的抗体进行了Western印迹,与纯化前的上清同样检测出了gp160,gp41(图13)。
[实施例10]获得识别gp120的杂交瘤细胞
免疫、制备杂交瘤细胞、筛选及Western印迹的方法与实施例6相同。不同的是:免疫部位采用了足垫给药,初次免疫时的载体给药量为2x109CIU/小鼠。成功地获得了不仅包括识别gp41的D1-518、A2-12、B2-39和B2-103,还包括识别gp120的D1-106、D1-137、D1-526和D2-26在内的多种抗gp160抗体产生杂交瘤细胞(图14)。
[实施例11]通过给药同时携带IL10的F基因缺陷型仙台病毒载体,诱导血浆中抗gp160抗体
在F基因缺陷型仙台病毒载体SeV18+LacZ/ΔF(WO00/70070)中插入编码细胞因子白细胞介素(IL)-10的核酸和编码gp160的核酸,制备了一种载体,已知细胞因子白细胞介素(IL)-10具有CTL抑制作用,同时还具有刺激抗体产生的效果。用该载体免疫小鼠,56天后研究了血浆中产生的抗体。免疫及Western印迹方法与实施例7相同。显示出同时携带IL-10的仙台病毒载体可有效诱导抗gp160抗体(图15)。
产业实用性
本发明提供了一种使用负链RNA病毒载体制备抗体的方法。通过本发明的方法制备的抗体可用于蛋白质的检测以及纯化、中和、临床检查、病理诊断,抗体治疗等领域。
序列表
<110>生物载体株式会社(DNAVEC CORPORATION)
<120>制备抗体的方法
<130>D4-A0402Y1P
<150>JP 2005-173851
<151>2005-06-14
<150>JP 2005-295451
<151>2005-10-07
<160>12
<170>
<210>1
<211>10
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>S序列(w=a和c中的任意一个;v=a,c和g中的任意一个)
<400>1
cwuuvwcccu 10
<210>2
<211>10
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>S序列
<400>2
cuuugacccu 10
<210>3
<211>10
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>S序列
<400>3
cauucacccu 10
<210>4
<211>10
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>S序列
<400>4
cuuucacccu 10
<210>5
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>S序列
<400>5
agggtcaaag 10
<210>6
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>S序列
<400>6
agggtgaatg 10
<210>7
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>S序列
<400>7
agggtgaaag 10
<210>8
<211>9
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>E序列
<400>8
uuuuucuua 9
<210>9
<211>9
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>E序列
<400>9
taagaaaaa 9
<210>10
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人类免疫缺陷病毒1型(gp160部分多肽)
<400>10
Thr Arg Lys Arg Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val
1 5 10 15
<210>11
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人类免疫缺陷病毒1型(gp160部分多肽)
<400>11
Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
<210>12
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人类免疫缺陷病毒1型(gp160部分多肽)
<400>12
Pro Arg Gly Pro Asp Arg Pro Glu Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Glu
1 5 10 15
Arg
Claims (17)
1. 一种抗体或抗体产生细胞的制备方法,包括:
a.将携带有编码抗原外来多肽的核酸的负链RNA病毒载体、生成该病毒载体的核酸、该载体或生成该载体的核酸所导入的细胞、或该细胞的裂解物接种到非人动物的步骤;
b.包含从该动物回收抗体或抗体产生细胞的步骤。
2. 权利要求1的方法,其中步骤(a)的接种通过选自肌肉注射、皮下给药、点鼻、手掌或足垫皮内、脾脏以及腹腔内等给药途径进行。
3. 权利要求1的方法,还包含使用该负链RNA病毒载体、生成该载体的核酸、该载体或生成该载体的核酸所导入的细胞、该细胞的裂解物或从该细胞裂解物中纯化所得的抗原进行加强免疫的步骤。
4. 权利要求1的方法,还包含使用包含所述多肽或其片断的多肽进行加强免疫的步骤。
5. 权利要求1的方法,还包含使回收了的抗体与该抗原相接触,并筛选结合于该抗原的抗体的步骤。
6. 权利要求1的方法,还包含使回收了的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,制备杂交瘤细胞的步骤。
7. 权利要求6的方法,还包含使杂交瘤细胞产生的抗体和该抗原相接触,筛选产生结合于该抗原的抗体的杂交瘤细胞的步骤。
8. 权利要求6的方法,还包含杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的回收步骤。
9. 权利要求1的方法,其中所述负链RNA病毒为复制缺陷型。
10. 权利要求1的方法,其中所述负链RNA病毒是副粘病毒。
11. 权利要求10的方法,其中所述副粘病毒至少缺失F基因。
12. 权利要求10的方法,其中所述副粘病毒是仙台病毒。
13. 权利要求1的方法,还包含使含有回收了的抗体的溶液与不编码该外来多肽的该负链RNA病毒载体、该病毒载体所导入的细胞、该细胞的裂解物、及该病毒的病毒蛋白共存的步骤,以及筛选不与它们相结合的抗体的步骤。
14. 权利要求6的方法,还包含使含有杂交瘤细胞产生的抗体的溶液与不编码该外来多肽的该负链RNA病毒载体、该病毒载体所导入的细胞、该细胞的裂解物及该病毒的病毒蛋白共存的步骤,以及筛选产生不与它们相结合的抗体的杂交瘤细胞的步骤。
15. 权利要求1的方法,还包含Th2细胞因子及其活性部分肽,或者编码它们的载体的给药步骤。
16. 权利要求15的方法,其中所述细胞因子及其活性部分肽被编码抗原外来多肽的该负链RNA病毒载体所编码。
17. 权利要求15的方法,其中所述Th2细胞因子是从IL-4、IL-10、及IL-13中选择的。
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Cited By (1)
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CN110672844A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-01-10 | 华中科技大学 | 一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用 |
-
2006
- 2006-06-13 CN CNA2006800296964A patent/CN101243179A/zh active Pending
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