WO2005067981A1

WO2005067981A1 - 免疫刺激性サイトカインをコードするマイナス鎖rnaウイルスベクターを用いる腫瘍の遺伝子治療

Info

Publication number: WO2005067981A1
Application number: PCT/JP2005/000238
Authority: WO
Inventors: Yasuo Iwadate; Akira Yamaura; Makoto Inoue; Mamoru Hasegawa
Original assignee: Dnavec Research Inc.
Priority date: 2004-01-13
Filing date: 2005-01-12
Publication date: 2005-07-28
Also published as: EP1712243A4; EP1712243A1; US7521043B2; CA2553377A1; JPWO2005067981A1; US20070248627A1; CN1929867A; KR20060129013A; AU2005205441A1

Abstract

　本発明は、免疫刺激性サイトカインをコードするマイナス鎖RNAウイルスベクターまたは該ベクターが導入された細胞を腫瘍部位に投与する工程を含む、腫瘍の処置方法を提供する。また本発明は、免疫刺激性サイトカインをコードするマイナス鎖RNAウイルスベクターまたは該ベクターが導入された細胞を有効成分として含む腫瘍処置組成物を提供する。また本発明は、免疫刺激性サイトカインをコードするマイナス鎖RNAウイルスベクター、および腫瘍抗原または該抗原を発現するベクター、を含む腫瘍の処置のためのキットを提供する。

Description

明細書

免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターを用いる腫瘍の遺伝子治療

技術分野

[0001] 本発明は、免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターを用いる腫瘍の遺伝子治療に関する。

背景技術

[0002] 近年、サイト力インを用いた癌に対する免疫療法が注目されている。例えば、外科手術、放射線治療、および化学療法を含む多様なアプローチにも関わらず治療不能と考えられている悪性脳腫瘍の 1つである膠芽細胞腫（Glioblastoma multiforme; GBM) (Shapiro, W.R., Arch. Neurol., 56: 429-432, 1999)の治療のために、遺伝子導入を用いた治療戦略が模索されている（Ram, Z. et al., Cancer Res., 53: 83-88, 1993; Sampson, J.H. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 93: 10399-10404, 1996;

Herrlinger, U. et al., Cancer Gene Ther., 4:345-352, 1997; Seleh, M. et al" J. Natl. Cancer Inst., 91: 438—445, 1999; uiezeman-Smits, K.M. et al., Cancer Res., 60: 2449-2457, 2000)。 In vivo動物モデルでの研究を基に、幾つかの遺伝子治療戦略が有望と見られているものの、その治療効果はほとんど全てのケースにおいて、遺伝子導入のレベルが低、ことが限界になって、る。遺伝子治療戦略の適用の成功にとつての主な障害は、組み換えウィルスベクターが腫瘍塊全体に広がらないこと、および in vivoでの導入効率が低いことである（Ram, Z. et al., Nat. Med., 3: 1354-1361, 1997)。遺伝子治療を進展させるためには、安全で効率的に遺伝子を標的細胞に導入する能力を持つ新しいベクター系を開発する必要がある。

非特許文献 1 : Shapiro, W.R., Arch. Neurol, 56: 429-432, 1999

非特許文献 2 : Ram, Z. et al., Cancer Res., 53: 83-88, 1993

非特許文献 3 : Sampson, J.H. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 93: 10399—10404, 1996

非特許文献 4 : Herrlinger, U. et al., Cancer Gene Ther., 4:345-352, 1997 非特許文献 5 : Seleh, M. et al, J. Natl. Cancer Inst., 91: 438-445, 1999 非特許文献 6 : Giezeman- Smits, K.M. et al., Cancer Res., 60: 2449-2457, 2000 非特許文献 7 : Ram, Z. et al., Nat. Med., 3: 1354-1361, 1997

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0003] 本発明は、免疫刺激性サイト力イン（immunostimulatory cytokines)をコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターを用いる腫瘍の処置方法を提供することを課題とする。また本発明は、免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターを含む腫瘍の処置のための組成物およびキット、ならびにそれらの製造方法を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

[0004] マイナス鎖 RNAウィルスは、マイナス鎖 RNA (ネガティブ鎖 RNAとも言う）をゲノムに持つエンベロープウィルスであり、高い感染性を持ち、細胞質においてウィルスが搭載する遺伝子を高発現させる能力を持つ。近年、マイナス鎖 RNAウィルスのゲノム操作の進展により非ウィルス遺伝子を付加的に挿入できるようになり、遺伝子導入のァプローチのための新しいクラスのウィルスベクターの開発が可能となってきた（Bitzer, M. et al., J. Gene Med,.5: 543—553, 2003)。

[0005] マイナス鎖 RNAウィルスの複製サイクルは、感染細胞のゲノム DNAにインテグレートすることなく細胞質で行われることから、遺伝子治療の臨床適用における安全性が確保され、細胞培養で組み換え治療蛋白質を製造するためのツールとして、あるいはサイト力インまたはケモカインを用いた免疫遺伝子治療への適用のために適した分泌蛋白質を生産するために有用と考えられる。マイナス鎖 RNAウィルスは、 (0複製サイタルは細胞質で排他的に起こるためゲノム DNAにインテグレートされるリスクがない、 (ii)導入効率は標的細胞の細胞周期に依存しない、 (iii)異なるウィルスゲノムまたは野生型ウィルスと相同組み換えが起こらない、 (iv)細胞の取り込みに極めて短い接触時間しか要さない、（V)広範囲の宿主細胞においてウィルスがコードする遺伝子を高強度でかつ調節可能に発現させることができる、などの利点がある。

[0006] 本発明者らは、マイナス鎖 RNAウィルスベクターを用いたサイト力イン遺伝子導入による腫瘍の遺伝子治療戦略の治療的可能性を検証するため、免疫刺激性サイトカイン遺伝子を搭載した SeVベクターを腫瘍に導入し、抗腫瘍効果を調べた。免疫刺激性サイト力インの 1つであるインターロイキン- 2 (IL-2)遺伝子を搭載する SeVを構築し、ラット脳腫瘍モデルにこの SeVベクターを脳内（I.C.)投与したところ、 SeV〖こよる腫瘍へのサイト力イン遺伝子導入は有意な腫瘍増殖の抑制をもたらすことが判明した。また、照射野生型 9L細胞を末梢にワクチン接種した後、 IL-2発現 SeVベクターを定着脳腫瘍にインジェクションすると、腫瘍増殖は劇的に減少し、調べた 10個体のラットのうち 3個体において脳腫瘍を消滅させることが明らかとなった。免疫組織化学的解析では、腫瘍を IL-2発現 SeVベクターで処理すると、 CD4+および CD8+ T細胞が脳腫瘍へ高レベルで浸潤した。このように、 SeVベクターを用いた腫瘍への遺伝子導入は、有意な治療効果をもたらすことが明らかとなった。免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターの腫瘍への導入は、腫瘍に対する新たな遺伝子治療戦略となることが期待される。

すなわち本発明は、免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスべクタ一を用いる腫瘍の処置方法、および免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターを含む腫瘍の処置のための組成物およびキット等に関し、より具体的には、請求項の各項に記載の発明に関する。なお本発明は、請求項の各項に記載の発明の 1つまたは複数 (または全部）の所望の組み合わせ力もなる発明、特に、同一の独立項 (他の項に記載の発明に包含されな!、発明に関する項)を引用する項 (従属項）に記載の発明の 1つまたは複数 (または全部）の所望の組み合わせ力もなる発明にも関する。各独立項に記載の発明には、その従属項の任意の組み合わせ力もなる発明も意図されている。すなわち本発明は、以下の発明を含む。

〔1〕免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターまたは該べクタ一が導入された細胞を腫瘍部位に投与する工程を含む、抗腫瘍処置方法、〔2〕腫瘍抗原または該抗原を発現するベクターで免疫する工程をさらに含む、〔1〕に記載の方法、

〔3〕該腫瘍抗原または該抗原を発現するベクターを皮下接種により免疫する、〔2〕に記載の方法、〔4〕該腫瘍抗原が増殖能を失わせた腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解物である、〔2〕または〔3〕に記載の方法、

[5]腫瘍が脳腫瘍である、〔1〕力も〔4〕の、ずれかに記載の方法、

〔6〕免疫刺激性サイト力インカ Sインターロイキン- 2である、〔1〕から〔5〕の、ずれかに記載の方法、

〔7〕免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターまたは該べクタ一が導入された細胞を有効成分として含む抗腫瘍組成物、

〔8〕免疫刺激性サイト力インカインターロイキン- 2である、〔7〕に記載の組成物、

〔9〕（a)免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクター、および

、（b)腫瘍抗原または該抗原を発現するベクター、を含む抗腫瘍処置のためのキット

〔10〕免疫刺激性サイト力インカインターロイキン- 2である、〔9〕に記載のキット。発明の効果

本発明により、マイナス鎖 RNAウィルスベクターは免疫刺激性サイト力イン遺伝子を効率的に脳内腫瘍に導入することが実証されると共に、免疫刺激性サイトカインをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターの i.e.投与は著しい抗神経膠腫効果を発揮することができ、特に、腫瘍抗原の免疫接種と組み合わせることにより定着脳腫瘍を完全に消滅させることが実証された。これまでに、神経膠腫組織での適当量の免疫刺激性サイト力イン分泌が、定着脳腫瘍を消滅させるのに十分な細胞傷害性 T細胞を動員できることが、照射した全腫瘍細胞ワクチンの s.c.投与で免疫を行った動物において報告されている (Iwadate, Y. et al.， Cancer Res., 61: 8769-8774, 2001)。例え免疫特権状態（immunologically privileged state)であっても、 IL- 2のようにケモタキシス作用のある分子の局所発現によりエフェクター細胞の腫瘍組織への移動が効果的に促進される場合には、脳腫瘍は全身性免疫に感受性（susceptible)となることができる。本発明において、マイナス鎖 RNAウィルスベクターは神経膠腫組織において IL-2蛋白質の実態的な発現をひき起こし、 IL-2蛋白質の局所的濃度は、免疫担当細胞を有意に誘導し、その結果脳腫瘍の増殖を抑制させるのに必要なレベルに達した。このように、本発明の方法は、特に免疫特権状態にある脳内の腫瘍に対する効果的な治療手段となる。

図面の簡単な説明

[図 1]センダイウィルスベクターの模式的なゲノム構造を示す図である。 lacZまたはヒト IL-2遺伝子を搭載する野生型 SeV、並びに Mおよび F遺伝子両欠失型 SeVベクターが示されている。 lacZまたはヒト IL-2遺伝子のオープンリーディングフレームを、 SeV特異的転写調節シグナル配列である endおよび startシグナルと共に、リーダー（W)および NP遺伝子の間に挿入した。

[図 2]lacZ- SeV/ A M A Fを in situで投与した、ラット脳組織（上パネル）および 7日間脳内で増殖させた 9L脳腫瘍（下パネル）の X-Gal染色を示す図である。ベクター投与の 4、 7、および 14日後に X-Gal染色を行った（x200倍)。脳組織および脳腫瘍共に、 beta-ガラクトシダーゼの最大発現または蓄積はベクター注入の 7日後に観察され、発現レベルは 14日まで持続した。

[図 3]hIL2- SeV/ Δ M Δ Fの i. 投与および照射 9L細胞による s. 免疫の治療を行った全 9L脳腫瘍の MRI像（Gd-DTPA注入後の前頭面の T1強調像)。 Gd-DTPAで強調された腫瘍は白い領域として可視化されている。組み合わせ治療により、試験した 10ラット中 3匹において、腫瘍細胞接種の接種後 3週目には認められた定着脳腫瘍が、 4 週目には完全に消滅した（Rat #3, Rat #5, Rat #10)。

[図 4]腫瘍細胞接種の接種後 3週目における Gd強調 MRIによる 9L脳腫瘍の平均体積の評価を示す図である。 s.c.免疫を組み合わせた hIL2- SeV/ A M A Fの i.e.投与（86.5 ±63.8 mm³, n=10)では、未処理（286±51.2 mm³, n=10)、 s. 免疫のみ（197±48.9 mm³, n=10)、 lacZ- SeV/ A M A Fの i.e.投与と s.c.免疫の組み合わせ（233 ±73.2 mm³, n=6)または hIL2-SeV/ A M A Fの i.e.投与のみ（256 ±53.2 mm³, n=6)の場合に比べ有意に縮小した。各バーは平均士 S.E.を表す。

[図 5]9L細胞を day 0で L 接種し、 day 3でベクター投与および/または照射腫瘍細胞による免疫を行ったラットの Kaplan-Meier生存曲線を示す図である。未処置コント口ール（白円)、 s.c.免疫のみの処置（黒円)、 lacZ- SeV/ A M A Fの i.e.投与と s.c.免疫（黒三角）、 hIL2-SeV/ Δ Μ Δ Fの i.e.投与のみ（白三角）、 hIL2- SeV/ Δ Μ Δ Fの i.e.投与と s. 免疫の組み合わせ（黒四角)。 log-rank testによる統計解析により、 hIL2-SeV/ A M A Fの i. 投与と s. 免疫の処置を行ったラットは、他の処置群に比べ有意に長く生存することが示された（pく 0.05)。

[図 6]9L脳腫瘍における IL-2発現の免疫組織ィ匕学解析を示す図である。 hIL2-SeV/ A M A Fを i.e.投与した 9L脳腫瘍。 A; xlOO倍、 B; x200倍。 IL-2蛋白質が拡散して発現している。

[図 7]lacZ- SeV/ A M A Fの i.e.投与および照射 9L細胞の s. 免疫（A)、 hIL2- SeV/ Δ M A Fの i.e.投与のみ（B)、および hIL2- SeV/ A M A Fの i.e.投与と s.c.免疫の組み合わせ（C)の処置を行ったラットの CD4、 CD8、および NK細胞抗原の発現の免疫組織ィ匕学解析を示す図である。（倍率 200倍)。 CD4+ T細胞および CD8+ T細胞の浸潤は、 SeV/IL-2ベクターの i.e.投与および s.c.免疫で処置した腫瘍にお!ヽて、他の処置を行った腫瘍に比べより有意に観察された。

発明を実施するための最良の形態

本発明は、免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターまたは該ベクターが導入された細胞を腫瘍部位に投与する工程を含む、抗腫瘍処置の方法に関する。免疫刺激性サイト力イン遺伝子を搭載するマイナス鎖 RNAウィルスベクターは、ベクターを導入した標的 (腫瘍）に対する免疫応答を誘導し、腫瘍増殖を有意に抑制することができる。ここで抗腫瘍処置とは、腫瘍の発生および/または増殖の抑制を意味する。すなわち、腫瘍組織、または腫瘍の発生が懸念される部位、あるいは腫瘍を除去した部位などの腫瘍部位に、免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターまたは該ベクターが導入された細胞を局所投与することにより、投与部位における抗腫瘍免疫応答を誘導し、腫瘍の発生 (再発を含む )または増殖 (転移を含む）を抑制することができる。ベクターの導入は、 in vivoまたは ex vivoで行うことができ、 in vivoにおいては該ベクターは直接腫瘍部位に注入され、 ex vivoにおいては該ベクターは体外で細胞に導入され、その細胞が腫瘍部位に注入される。腫瘍部位とは、腫瘍そのもの、腫瘍を除去した部位、またはその近傍を言う。ここで近傍とは、ベクターが導入された細胞カゝら分泌される免疫刺激性サイトカインが腫瘍またはその除去部位に到達する領域である。好ましくは腫瘍またはその除去部位から 5 mm以内、例えば 3 mm以内、 2 mm以内、または 1 mm以内である。ベクタ一またはベクター導入細胞は所望の担体 (例えば培養液、生理食塩水、血液、血漿、血清、体液など所望の生理的水溶液）中に溶解または懸濁し、これを腫瘍またはその近傍に直接注入することにより実施すればよい。本発明の方法により、腫瘍を効果的に治療および予防することが可能となる。

[0011] 単純な技術により高い効率で遺伝子送達が起こることは、マイナス鎖 RNAウィルスベクターを介した遺伝子送達の重要な優位性の 1つである。レトロウイルスベクターなどを介した遺伝子送達は一般に効率が低ぐ最適な遺伝子送達のためには遠心で濃縮する必要がある力遠心操作はしばしばウィルスの力価を低下させる。また、高 Vヽ効率で感染させるには毒性のある薬剤であるポリプレンを必要とする場合がある（ Bunnell, B.A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1995, 92: 7739-7743; Chuck, A.S., Hum. Gene Ther., 1996, 7: 743-750; Chinnasamy, D. et al., Blood 2000, 96: 1309-1316; Fehse, B. et al" Br. J. Haematol, 1998, 102: 566-574)。また、 ex vivo 投与においては、細胞に感染後に、遺伝子が導入された細胞を選択する工程が必要な場合がある。これに対して、マイナス鎖 RNAウィルスベクターは特別な薬剤を必要とすることなぐ単に細胞に接触させるだけでより優れた遺伝子送達を達成することができる。また感染効率は非常に高ぐ通常、ベクターの感染後に薬剤等で遺伝子導入細胞を選択する必要はない。さら〖こ、マイナス鎖 RNAウィルスベクターを介する遺伝子送達は、細胞への非常に短、暴露 (30分以下)で最適効率を達成することができる。臨床場面を考えると、これらの特徴は、 ex vivoおよび in vivoなどにおける投与操作を単純化し、操作に依存した細胞障害などの悪影響を最小化し得るものである。

[0012] Ex vivoによりベクターを感染を行う場合には、 MOI (多重感染度；細胞 1つあたりの感染ウィルス数）は 1一 500の間にすることが好ましぐより好ましくは 2— 300、さらに好ましくは 3— 200、さらに好ましくは 5— 100、さらに好ましくは 7— 70である。ベクターと標的細胞との接触は短い時間でも十分であり、例えば 1分以上、好ましくは 3分以上、 5 分以上、 10分以上、または 20分以上接触させればよぐ例えば 1一 60分程度、より特定すれば 5分一 30分程度であってよい。もちろん、それ以上の時間接触させてもよぐ例えば数日間またはそれ以上接触させてもよい。細胞としては、投与する患者由来の細胞を用いることができ、例えば患者由来の線維芽細胞の初代培養細胞を好適に用いることができる。あるいは、異種 (xenogeneic)細胞および同種異系（allogeneic) 細胞を用いることもできる（Iwadate, Y. et al.， Cancer Res., 61: 8769-8774, 2001)。これらの xenogeneicまたは allogeneicな細胞は、 ex vivo注入後、宿主の免疫反応により排除されることが期待される。細胞は、ベクターを導入する前または後に、 UV、 X線、または gamma線照射等により分裂能を欠損させ、その後、腫瘍に ex vivo投与してもよい。

ベクターに搭載する免疫刺激性サイト力インは、免疫細胞の分ィ匕および/または増殖を誘導するサイト力インであって、抗腫瘍作用を持つサイト力インを用いることができる。このようなサイト力インとしては、 T細胞、 NK細胞、単球、マクロファージ等カも産生されるサイト力インであって、 T細胞の分化および/または増殖を誘導するサイトカイン等が含まれる。免疫刺激性サイト力イン遺伝子は、例えば遺伝子配列を基に設計したプライマーを基に、 T細胞由来 cDNA等力も PCR増幅により単離することができる。抗腫瘍効果を示すサイト力インは当業者によく知られており、それらのサイト力イン遺伝子を本発明におヽて好適に用いることができる。本発明におヽて特に好適に用いられる免疫刺激性サイト力インとしては、具体的には、免疫系細胞の遊走及び接着を惹起することが示されている Interleukin- 2 (IL- 2)、 Interleukin- 4 (IL- 4)、

Interleukin- 12 (IL-12)、 granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

GM-CSF)、及び Interleukin- 23 (IL- 23)などが含まれる。また、 Fas ligand (Fas- L)も利用できる。 IL- 2 cDNAは、例えば Accession number NM.000586 (protein ID NP— 000577)、 IL- 4 cDNAは、例えば Accession number M13982 (protein ID

AAA59149),および M23442 (protein ID AAA59150)、 IL-12 (p35+p40)は、例えば AF180562 (protein ID AAD56385) (p35)および AF180563 (protein ID AAD56386) ( p40)、 GM- CSFは、例えば M11220 (protein ID AAA52578),および A14305 (protein ID CAA01150)、 IL-23 (pl9+p40)は、例えば AF301620 (protein ID AAG37232) ( pl9)および AF180563 (p40 : IL- 12の p40と同一）、 Fas- Lは、例えば D38122 (protein ID BAA07320)に記載されている。従って、上記に示した免疫刺激性サイト力インのアミノ酸配列をコードする所望の核酸をベクターに組み込み、本発明にお、て用いることができる。

[0014] 上記のサイト力インは免疫系細胞の遊走及び接着を惹起することが報告されており、特に、 IL-2, IL-4, GM- CSFについては、脳腫瘍動物モデルにおいてその有効性が示されている（IL-2: Iwadate, Y. et al, Cancer Res., 61: 8769-8774 (2001); IL-2, IL-4, GM— CSF: Sampson, J.H. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93, 10399—10404 (1996); GM— CSF: Herrlinger, U. et al., Cancer Gene Ther. 4, 345—352 (1997); IL-4: Seleh, M. et al., J. Natl. Cancer Inst. 91, 438—445, (1999); IL-4:

Giezeman— Smits, K.M. et al., Cancer Res. 60, 2449-2457 (2000))。 IL— 23については、脳の自己免疫疾患において免疫系細胞の遊走に強く関与していることが示された（Becher B. et al., J Clin Invest. 112(8), 1186-91 (2000))。また、 Fas- Lについても、 chemoattractantとしての効果があることが示されている（Silvestris F et al., Br J Haematol. 122(1) 39-52. (2003))。腫瘍に対する IL-2などによる免疫系賦活化については、以下の文献も参照のこと（Iwadate, Y. et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7, 1263-1269; Iwadate, Y. et al. (2001) Cancer Res. 61, 8769-8774; Iwadate, Y. et al. (2002) Int. J. Mol. Med. 10, 741-747; Iwadate, Y. et al. (1997) Oncology (Basel) 54, 329-334; Iwadate, Y. et al. (2003) Int. J. Oncol. 23, 483-488)。

[0015] 本発明において用いられるサイト力イン遺伝子は、ヒト由来であっても、その他の哺乳動物由来、例えはマウス、ラット、ゥサギ、ブタ、サルなどの霊長類由来であってもよい。また本発明においてサイト力インには、生物学的活性を維持している限り天然のサイト力インのノリアントが含まれる。例えば N末端または C末端の 1一数残基 (例えば 2、 3、 4、 5、または 6残基)のアミノ酸が欠失または付加されたポリペプチド、および 1一数残基 (例えば 2、 3、 4、 5、または 6残基)のアミノ酸が置換されたポリペプチドなどが挙げられる。サイト力インの生物学的活性は、公知のサイト力イン活性のアツセィ方法により測定することができる。あるいは、本明細書に記載の腫瘍抑制のアツセィ方法により測定することができる。天然のサイト力インと同等の生物学的活性を有するこれらのノリアントをコードする遺伝子は、本発明に方法に従ってマイナス鎖 RNAウィルスベクターを介して腫瘍に投与することにより、腫瘍増殖に対して天然のサイト力インと同等の抗腫瘍効果を示すことが期待される。天然のサイト力インのノリアントとしては、天然のサイト力インの断片、アナログ、派生体、および他のポリペプチドとの融合蛋白質 (例えば異種シグナルペプチドを持つサイト力イン、または抗体断片を融合させたポリペプチドなど）が含まれる。具体的には、本発明において用いられ得るサイト力インには、天然のサイト力インまたは断片のアミノ酸配列の 1またはそれ以上のァミノ酸を置換、欠失、および/または付加した配列を含み、天然のサイト力インと同等の生物学的活性を有するポリペプチドが含まれる。断片とは、天然のサイト力インポリぺプチドの一部を含むポリペプチドであり、例えば N末端欠失体あるいは C末端欠失体が含まれる。生物学的活性を持つサイト力インの断片は、通常、天然のポリペプチド (分泌後の成熟型の形態）の 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上の連続領域を含む。

[0016] アミノ酸配列のバリアントは、例えば天然のポリペプチドをコードする DNAに変異を導入することにより調製することができる（Walker and Gaastra, eds. (1983)

Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.); U.S. Pat. No. 4,873,192)。生物学的活性に影響を与えないようにアミノ酸を置換するためのガイダンスとしては、例えば Dayhoff¾ (Dayhoff et al. (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.し.ノ)力 S挙げられる。

[0017] 改変されるアミノ酸数に特に制限はな!/、が、例えば天然の成熟型ポリペプチドの全アミノ酸の 30%以内、好ましくは 25%以内、より好ましくは 20%以内、より好ましくは 15 %以内、より好ましくは 10%以内であり、例えば 15アミノ酸以内、好ましくは 10アミノ酸以内、より好ましくは 8アミノ酸以内、より好ましくは 5アミノ酸以内、より好ましくは 3アミノ酸以内である。アミノ酸を置換する場合は、側鎖の性質が似たアミノ酸に置換することにより蛋白質の活性を維持することが期待できる。このような置換は、本発明において保存的置換という。保存的置換は、例えば塩基性アミノ酸 (例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばァスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性ァミノ酸（例えばグリシン、ァスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システィン）、非極性アミノ酸（例えばァラニン、パリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェ-ルァラニン、メチォニン、トリプトファン）、 β分岐アミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フエ-ルァラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などの各グループ内のアミノ酸間の置換などが挙げられる。また、例えば、 BLOSUM62置換マトリックス（S. Henikoff and J.G. Henikoff, 1992, Proc. Acad. Natl. Sci. USA 89: 10915-10919)において、正の値の関係にあるアミノ酸間の置換が挙げられる。

[0018] また、サイト力インバリアントには、天然型ポリペプチドのアミノ酸配列と高いホモロジ一を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。高いホモロジ一としては、例えば 70%以上、より好ましくは 75%以上、より好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、より好ましくは 90%以上、より好ましくは 93%以上、より好ましくは 95%以上、より好ましくは 96%以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。アミノ酸配列の同一性は、例えば BLASTPプログラム（Altschul, S. F. et al.， 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410) を用いて決定することができる。例えば NCBI (National Center for Biothchnology Information)の BLASTのウェブページにおいて Low complexityを含むフィルタ一は全て OFFにして、デフォルトのパラメータを用いて検索を行う（Altschul, S.F. et al. (1993) Nature Genet. 3:266—272; Madden, T.L. et al. (1996) Meth. Enzymol.

266: 131-141; Altschul, S.F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389—3402; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) Genome Res. 7:649-656)。例えば 2つの配列の比較を行う blast2sequencesプログラム（Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett.

174:247-250)により、 2配列のァライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、例えば天然型サイト力イン (分泌後の成熟型の形態)のアミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算する。具体的には、天然型サイト力イン（成熟型の形態）の全アミノ酸数における一致するアミノ酸数の割合を計算する。

[0019] また、好適なノリアントとしては、天然のサイト力イン遺伝子のコード領域の一部または全部とストリンジェントな条件でノヽイブリダィズする核酸がコードするポリペプチドであって、天然型サイト力インと同等の生物活性を有するポリペプチドが挙げられる。ハイブリダィゼーシヨンにお、ては、例えば天然のサイト力イン遺伝子のコード領域の配列またはその相補配列を含む核酸、またはハイブリダィズの対象とする核酸のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にノ、イブリダィズするかを検出することにより同定することができる。ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨンの条件は、例えば 5xSSC、 7%(W/V) SDS、 100 micro- g/ml変性サケ精子 DNA、 5xデンハルト液（lx デンハルト溶液は 0.2%ポリビニールピロリドン、 0.2%牛血清アルブミン、および 0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、 60°C、好ましくは 65°C、より好ましくは 68°Cでノヽイブリダイゼーシヨンを行い、その後ハイブリダィゼーシヨンと同じ温度で 2xSSC中、好ましくは lxSSC中、より好ましくは 0.5xSSC中、より好ましくは O.lxSSC中で、振蘯しながら 2時間洗浄する条件である。

[0020] 本発明にお、て用いられるサイト力インは、最も好ましくはインターロイキン（IL)-2である。 IL- 2は、 IL- 2レセプター（IL- 2レセプター alpha、 beta,および gamma)のリガンドとして機能し、 T細胞の増殖および分ィ匕を調節するサイト力インである（Kuziel, W. A. and Gree, W.し. (1991), Interleukm- 2, in The Cytokine Handbook, A. Thompson (Ed.), San Diego, Calif., Academic Press, pages 83-102; Waldmann, T. A., 1993, Immunol. Today, 14:264)。 IL-2は主に CD4+ T細胞によって産生され、自己分泌型の増殖因子として機能する。 IL-2はまた、 CD4+および CD8+の両方の細胞を含む他の T リンパ球にも作用する。また IL-2は、 T細胞のヘルパーおよび細胞傷害性の両方のサブセットの活性ィ匕を導く局所炎症応答を誘導する。 IL-2はまた、ナチュラルキラー (NK)細胞の増殖および活性を刺激する。 IL-2を発現するように改変した腫瘍細胞は、腫瘍に対する免疫応答を刺激し、腫瘍の増殖を抑制する。ヒ HL-2 (成熟型） cDNA の塩基配列を配列番号： 1に、 IL-2のアミノ酸配列を配列番号： 2に例示する。本発明においては、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子を好適に用いることができる。

[0021] また、生物学的に活性を持つ IL-2のノリアントは、当業者に数多く知られている。本発明において使用できる IL-2のノリアントとしては、例えば欧州特許出願 136,489、 91,539、 88,195、 109,748、米国特許 4,518,584、 4,588,584、 4,752,585、 4,931,543、 5,206,344、国際特許出願 WO 99/60128、特開昭 61- 78799、 Wang, et al. Science (1984) 224:1431-1433等に記載されているものが含まれる。例えば、 N末端の Alaを欠失する IL-2断片、 4アミノ酸を欠失する断片（特開昭 60-126088)、カルボキシル末端を欠失する断片（特開昭 60-126088)、天然型の分泌後のポリペプチドの 125番目のシスティンがセリンまたはァラニン等の中性アミノ酸に置換されたポリペプチド (des-ala-1, ser— 125 IL-2または des— ala— 1, ala— 125 IL-2) (米国特許 4,518,584および 4,588,584)、 104位のメチォニンがァラニンなどの中性アミノ酸に置換されたポリペプチド（des-ala-1, ala-104)などが含まれる。また、これら以外にも、 IL_2の生物活性を保持する所望のノリアントを用いてもよい。 IL-2の生物学的活性は、例えば IL-2 依存性の細胞傷害性 T細胞またはヘルパー T細胞の増殖刺激能を、公知の方法で試験することにより知ることができる（Gillis et al., J. Immunol. (1978) 120:2027-2032; Watson, J" J. exp. Med. (1979) 1570: 1510—1519)。

[0022] 上記のサイト力インをコードする cDNAを用いて、該サイト力インを発現する組み換えマイナス鎖 RNAウィルスを構築する。ここでマイナス鎖 RNAウィルスとは、マイナス鎖（ウイノレス蛋白質をコードするセンス鎖に対するアンチセンス鎖）の RNAをゲノムとして含むウィルスのことである。マイナス鎖 RNAはネガティブ鎖 RNAとも呼ばれる。本発明にお、て用いられるマイナス鎖 RNAウィルスとしては、特に一本鎖マイナス鎖 RNAゥィルス（非分節型（non- segmented)マイナス鎖 RNAウィルスとも言う）が挙げられる。「一本鎖ネガティブ鎖 RNAウィルス」とは、一本鎖ネガティブ鎖 [すなわちマイナス鎖] RNAをゲノムに有するウィルスを言う。このようなウィルスとしては、パラミクソウィルス（ Paramyxovindae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus,および Pneumovirus禺等含む)、フブドウイノレス (Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus,および

Ephemerovirus属等を含む）、フイロウィルス (Filoviridae)、オルトミクソウィルス ( Orthomyxoviridae; Iniuluenza virus A, B, し,および Thogoto— like viruses等を含む) 、ブ-ャウィルス (Bunyavindae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairo virus,および

Phlebovirus属等を含む）、ァレナウィルス (Arenaviridae)などの科に属するウィルスが含まれる。

[0023] また、マイナス鎖 RNAウィルスベクターとは、マイナス鎖 RNAウィルスをベースとする、遺伝子を細胞に導入するための担体を言う。ここで「感染力」とは、マイナス鎖 RNA ウィルスベクターが細胞への接着能を保持しており、接着した細胞の内部にベクターに含まれる遺伝子を導入することのできる能力のことを言う。本発明のマイナス鎖 RNAウィルスベクターは、伝播能を有していてもよぐ伝播能を有さない欠損型べクタ一であってもよい。「伝播能を有する」とは、ウィルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウィルスが複製され、感染性ウィルス粒子が産生されることを指す。

[0024] 組み換えウィルスとは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成したウィルス、またはそのウィルスの増幅産物を言う。組み換えポリヌクレオチドとは、両端または片端が自然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを言う。具体的には、組み換えポリヌクレオチドは、人為的にポリヌクレオチド鎖の結合が改変 (切断および/または結合)されたポリヌクレオチドである。組み換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合成、ヌクレアーゼ処理、リガーゼ処理等を組み合わせて、公知の遺伝子組み換え方法により生成させることができる。組み換えウィルスは、遺伝子操作により構築されたウィルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ、ウィルスを再構築することによって生成することができる。例えば、ウィルスゲノムをコードする cDNAから、ウィルス再構成する方法が知られている（Y. Nagai, A. Kato, Microbiol. Immunol, 43, 613-624 (1999))。

[0025] 本発明におヽて遺伝子とは遺伝物質を指し、転写単位をコードする核酸を言う。遺伝子は RNAであっても DNAであってもよ!/、。本発明にお!/、て蛋白質をコードする核酸は、該蛋白質の遺伝子と呼ぶ。また一般に、遺伝子は蛋白質をコードしていなくてもよぐ例えば遺伝子はリボザィムまたはアンチセンス RNAなどの機能的 RNAをコードするものであってもよい。一般に、遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「DNA」とは、一本鎖 DNAおよび二本鎖 DNAを含む。また蛋白質をコードするとは、ポリヌクレオチドが該蛋白質を適当な条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードする ORFをセンスまたはアンチセンスに含むことを言う。

[0026] 本発明にお!/、て得に好適に用いられるマイナス鎖 RNAウィルスとしては、例えばパラミクソウィルス科 (Paramyxoviridae)ウィルスのセンダイウィルス (Sendai virus),ニューカツスノレ f丙ウイノレス (Newcastle disease virus入お 7こふく;^ぜ¹/イノレス (Mumps virus) ^ 淋诊ゥイノレス (Measles virus) ^ RSウイノレス (Respiratory syncytial virus) ^牛投ゥイノレス (rinderpest virus)ゝジステンノーウイノレス (distemper virus)ゝサノレノ《ラインフノレエンザゥィルス（SV5)、ヒトパラインフルエンザウイルス 1,2,3型、オルトミクソウィルス科

(Orthomyxoviridae)のインフノレエンザゥイノレス (Influenza virus),ラブドウイノレス科 (Rhabdoviridae)の水抱'性口内炎ウイノレス (Vesicular stomatitis virus),狂犬病ウイノレス (Rabies virus)等が挙げられる。

[0027] 本発明にお!/、て用いることができるウィルスをさらに例示すれば、例えば Sendai virus (SeV)、 human parainfluenza virus- 1 (HPIV- 1)、 human parainfluenza virus- 3 (HPIV- 3)、 phocine distemper virus (PDV)、 canine distemper virus (CDV)、 dolphin molbillivirus (DMV)、 peste—des—petits— ruminants virus (PDPR)、 measles virus (MV)、 rinderpest virus (RPV)、 Hendra virus (Hendra)、 Nipah virus (Nipah)、 human parainfluenza virus- 2 (HPIV- 2)、 simian parainfluenza virus 5 (SV5)、 human parainfluenza virus- 4a (HPIV- 4a)、 human parainfluenza virus- 4b (HPIV- 4b)、 mumps virus (Mumps),および Newcastle disease virus (NDV)などが含まれる。より好ましくは、 Sendai virus (SeV)、 human parainfluenza virus- 1 (HPIV- 1)、 human parainfluenza virus- 3 (HPIV- 3)、 phocine distemper virus (PDV)、 canine distemper virus (CDV)、 dolphin molbillivirus (DMV)、 peste—des—petits— ruminants virus (PDPR)、 measles virus (MV)、 rinderpest virus (RPV)、 Hendra virus (Hendra) ^および Nipah virus (Nipah)カゝらなる群より選択されるウィルスが挙げられる。

[0028] より好ましくは、パラミクソウィルス亜科（レスピロウィルス属、ルブラウィルス属、およびモルビリウィルス属を含む）に属するウィルスまたはその誘導体であり、より好ましくはレスピロウイノレス属 (genus Respirovirus) (パラミクソウイノレス属 (Paramyxovirus)とも言う）に属するウィルスまたはその誘導体である。誘導体には、ウィルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウィルス遺伝子が改変されたウィルス、および化学修飾されたウィルス等が含まれる。本発明を適用可能なレスピロウィルス属ウィルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス 1型（HPIV- 1)、ヒトパラインフルエンザウイルス 3型 (HPIV-3)、ゥシパラインフルエンザウイルス 3型（BPIV-3)、センダイウィルス (Sendai virus;マウスパラインフルエンザウイルス 1型とも呼ばれる)、およびサルパラインフルェンザウィルス 10型（SPIV-10)などが含まれる。本発明にお!/、てパラミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウィルスである。これらのウィルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。

[0029] マイナス鎖 RNAウィルスベクターはウィルスゲノム RNAに搭載遺伝子をアンチセンスにコードしている。ウィルスゲノム RNAとは、マイナス鎖 RNAウィルスのウィルス蛋白質と共にリボヌクレオプロテイン (RNP)を形成し、該蛋白質によりゲノム中の遺伝子が発現し、この RNAが複製されて娘 RNPが形成される機能を持つ RNAである。一般にマイナス鎖 RNAウィルスのゲノムは、 3'リーダー領域と 5'トレイラ一領域の間に、ウィルス遺伝子がアンチセンス配列として並んだ構成をしている。各遺伝子の ORFの間には、転写終結配列 (E配列） -介在配列 (I配列） -転写開始配列 (S配列）が存在し、これにより各遺伝子の ORFをコードする RNAが別々のシストロンとして転写される。本発明のゥィルスに含まれるゲノム RNAは、該 RNAにコードされる遺伝子群の発現および RNA自身の自律的な複製に必要なウィルス蛋白質である N (ヌクレオキヤプシド）、 P (ホスホ )、および L (ラージ）をアンチセンスにコードしている。また該ゲノム RNAは、ウィルス粒子の形成に必要な M (マトリックス）蛋白質をコードしていても、していなくてもよい。さらに該 RNAは、ウィルス粒子の感染に必要なエンベロープ蛋白質をコードしていても、していなくてもよい。マイナス鎖 RNAウィルスのエンベロープ蛋白質としては、細胞膜融合を起こす蛋白質である F (フュージョン)蛋白質および細胞への接着に必要な HN (へマダルチュン-ノイラミニダーゼ）蛋白質が挙げられる。但し、ある種の細胞では感染に HN蛋白質は必要なく（Markwell, M.A. et al.， Proc. Natil. Acad. Sci. USA 82(4):978-982 (1985))、 F蛋白質のみで感染が成立する。また、 F蛋白質および Zまたは HN蛋白質以外のウィルスエンベロープ蛋白質をコードさせてもよい。このように、ゲノム RNAは天然のウィルスゲノムから適宜改変されて!、るものであってよ!/ヽ（ WO00/70055, WO00/70070)。

[0030] 本発明のマイナス鎖 RNAウィルスは、例えばマイナス鎖 RNAウィルスのゲノム RNAとウィルス蛋白質力なる複合体、すなわちリボヌクレオプロテイン (RNP)であってょヽ。 RNPは、例えば所望のトランスフエクシヨン試薬と組み合わせて細胞に導入することができる。このような RNPは、具体的には例えばマイナス鎖 RNAウィルスのゲノム RNA 、 N蛋白質、 P蛋白質、および L蛋白質を含む複合体である。 RNPは細胞内に導入されると、ウィルス蛋白質の働きによりゲノム RNAからウィルス蛋白質をコードするシストロンが転写されると共に、ゲノム自身が複製され娘 RNPが形成される。ゲノム RNAの複製は、該 RNAのコピー数の増加を RT-PCRまたはノーザンハイブリダィゼーシヨン等により検出することにより確認することができる。

[0031] また本発明のマイナス鎖 RNAウィルスは、好ましくはマイナス鎖 RNAウィルスの感染性ウィルス粒子である。ウィルス粒子とは、ウィルス蛋白質の働きにより細胞力も放出される、核酸を含む微小粒子を言う。感染性とは、マイナス鎖 RNAウィルスが細胞への接着能および膜融合能を保持していることにより、接着した細胞の内部にウィルス内部の核酸を導入することのできる能力を言う。マイナス鎖 RNAウィルスのウィルス粒子は、ゲノム RNAとウィルス蛋白質を含む上記 RNPが細胞膜由来の脂質膜 (ェンベロープという）に含まれた構造をしている。本発明のマイナス鎖 RNAウィルスは、伝播能を有していてもよぐあるいは伝播能を有さない欠損型ウィルスであってもよい。「伝播能を有する」とは、ウィルスが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウィルスが複製され、感染性ウィルス粒子が産生されることを指す。

[0032] 例えばパラミクソウィルス亜科に属する各ウィルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、 NP遺伝子は〃 N〃とも表記される。

レスピロウィルス属 NP P/C/V M F HN - L

ルブラウィルス属 NP P/V M F HN (SH) L

モービリウィルス属 NP P/C/V M F H - L

[0033] 例えばセンダイウィルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのァクセッション番号は、 NP遺伝子については M29343、 M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218, P遺伝子については M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008, M遺伝子については D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056、 F遺伝子については D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131、 HN遺伝子については D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131、 L遺伝子については

D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886を参照のこと。またその他のウィルスがコードするウィルス遺伝子を例示すれば、 N遺伝子につ!、ては、 CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV— 1, D01070; HPIV— 2, M55320; HPIV— 3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091;

PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442;および Tupaia, AF079780, P遺伝子については、 CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV- 1, M74081; HPIV— 3, X04721; HPIV— 4a, M55975; HPIV— 4b, M55976; Mumps,

D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755;および Tupaia, AF079780, C遺伝子については CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV- 1. M74081; HPIV- 3, D00047; MV, AB016162; RPV, X68311;

SeV, AB005796;および Tupaia, AF079780, M遺伝子については CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV- 1, S38067; HPIV- 2, M62734; HPIV- 3, D00130; HPIV- 4a, D10241; HPIV- 4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956;および SV5, M32248, F遺伝子については CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN- 1. M22347; HPIV- 2, M60182; HPIV— 3. X05303, HPIV— 4a, D49821; HPIV— 4b, D49822; Mumps, D86169;

MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514;

SeV, D17334;および SV5, AB021962, HN (Hまたは G)遺伝子については CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV- 1, U709498; HPIV- 2. D000865; HPIV- 3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, Z81358; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433;および SV-5, S76876が例示できる。但し、各ウィルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列力もなる遺伝子も存在する。

これらのウィルス蛋白質をコードする ORFおよび外来遺伝子の ORFは、ゲノム RNA にお、て上記の E-I-S配列を介してアンチセンスに配置される。ゲノム RNAにお!/、て最も 3'に近い ORFは、 3'リーダー領域と該 ORFとの間に S配列のみが必要であり、 Eおよび I配列は必要ない。またゲノム RNAにおいて最も 5'に近い ORFは、 5'トレイラー領域と該 ORFとの間に E配列のみが必要であり、 Iおよび S配列は必要ない。また 2つの ORFは、例えば IRES等の配列を用いて同一シストロンとして転写させることも可能である。このような場合は、これら 2つの ORFの間には E-ト S配列は必要ない。例えば、野生型のパラミクソウィルスの場合、典型的な RNAゲノムは、 3'リーダー領域に続き、 N、 P、 M、 F、 HN、および L蛋白質をアンチセンスにコードする 6つの ORFが順に並んでおり、それに続いて 5'トレイラ一領域を他端に有する。本発明のゲノム RNAにおいては、ウィルス遺伝子の配置はこれに限定されるものではないが、好ましくは、野生型ウィルスと同様に、 3'リーダー領域に続き、 N、 P、 M、 F、 HN、および L蛋白質をコードする ORFが順に並び、それに続いて 5'トレイラ一領域が配置されることが好ましい。ある種のウィルスにおいては、ウィルス遺伝子が異なっている力そのような場合でも上記と同様に各ウィルス遺伝子を野生型と同様の配置とすることが好ましい。一般に N、 P、および L遺伝子を保持しているベクターは、細胞内で自律的に RNAゲノムから遺伝子が発現し、ゲノム RNAが複製される。さらに Fおよび HN遺伝子等のェンベロープ蛋白質をコードする遺伝子、および M遺伝子の働きにより、感染性のウィルス粒子が形成され、細胞外に放出される。従って、このようなベクターは伝播能を有するウイルスベクターとなる。ベクターに搭載させるサイト力イン遺伝子は、後述するように、このゲノム中の蛋白質非コード領域に挿入すればよい。

また、本発明のマイナス鎖 RNAウィルスは、野生型ウィルスが持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってよい。例えば、 M、 F、または HN遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが不活ィ匕または欠失したウィルスベクターも、本発明にお、て好適に用いることができる。このようなウィルスの再構成は、例えば、欠損している遺伝子産物を外来的に供給することにより行うことができる。このようにして製造されたウィルスは、野生型ウィルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こす力細胞に導入されたウィルスゲノムはウィルス遺伝子に欠損を有するため、最初と同じような感染力を持つ娘ウィルス粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子導入力を持つ安全なウィルスベクターとして有用である。ゲノム力も欠損させる遺伝子としては、例えば F遺伝子、 HN遺伝子、 M遺伝子、またはその任意の組み合わせが挙げられる。例えば、 F遺伝子が欠損した組み換えマイナス鎖 RNAウィルスゲノムを発現するプラスミドを、 F蛋白質の発現ベクターならびに NP、 P、および L蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフエクシヨンすることにより、組み換えウィルスの再構成を行うことができる（WO00/70055, WO00/70070, WO03/025570; Li, H.— 0. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000))。また、例えば、 F遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いてウィルスを製造することもできる。ウィルス生産細胞で発現させるこれらの蛋白質群は、そのアミノ酸配列はウィルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウィルスの相同遺伝子で代用してもょ、。

また、本発明において用いられるウィルスベクターとして、ウィルスゲノムが由来するウィルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含む組み換えゥィルスを作製することもできる。例えば、ウィルス再構成の際に、ベースとなるウィルスのゲノムが元来コードするエンベロープ蛋白質以外のエンベロープ蛋白質を細胞で発現させることにより、所望のエンベロープ蛋白質を有する組み換えウィルスを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はない。細胞への感染能を与える所望の蛋白質が用いられる。例えば、他のウィルスのエンベロープ蛋白質、例えば水疱性口内炎ウィルス (Vesicular stomatitis virus; VSV)の G蛋白質（VSV- G)を挙げることができる。 VSV-G蛋白質は、任意の VSV株に由来するものであってよい。例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528 (1981))由来の VSV- G蛋白を用いることができるが、これに限定されない。また本発明のベクターは、他のウィルス由来のェンベロープ蛋白質を任意に組み合わせて含むことができる。例えば、このような蛋白質として、ヒト細胞に感染するウィルスに由来するエンベロープ蛋白質が好適である。このような蛋白質としては、特に制限はないが、レトロウイルスのアンフォト口ピックェンベロープ蛋白質などが挙げられる。レトロウイルスのアンフォト口ピックエンベロープ蛋白質としては、例えばマウス白血病ウィルス (MuLV) 4070A株由来のエンベロープ蛋白質を用い得る。また、 MuMLV 10A1由来のエンベロープ蛋白質を用いることもできる（例えば pCL— 10Al(Imgenex) (Naviaux, R. K. et al" J. Virol. 70: 5701-5705 (1996) ) oまた、ヘルぺスウィルス科の蛋白質としては、例えば単純へルぺスウィルスの gB、 gD、 gH、 gp85蛋白質、 EBウィルスの gp350、 gp220蛋白質などが挙げられる。へパドナウィルス科の蛋白質としては、 B型肝炎ウィルスの S蛋白質などが挙げられる。これらの蛋白質は、細胞外ドメインを F蛋白質または HN蛋白質の細胞内ドメインと結合させた融合蛋白質として用いてもょ、。このように本発明にお、て用いられるウィルスベクターには、 VSV-G蛋白質などのように、ゲノムが由来するウィルス以外のウィルスに由来するエンベロープ蛋白質を含むシユードタイプウィルスベクターが含まれる。ゥィルスのゲノム RNAにはこれらのエンベロープ蛋白質をゲノムにコードされないように設計すれば、ウィルス粒子が細胞に感染した後は、ウィルスベクター力この蛋白質が発現されることはない。

[0037] また、本発明において用いられるウィルスベクターは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、抗体またはその断片、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウィルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラ蛋白質などを含むものであってもよい。これにより、ウィルスベクターの感染の特異性を制御し得る。これらはウィルスゲノムにコードされていてもよいし、ウィルスの再構成時に、ウィルスゲノム以外の遺伝子 (例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体上などにある遺伝子）の発現により供給されてもよい。

[0038] またウィルスベクターは、例えばウィルス蛋白質による免疫原性を低下させるために、または RNAの転写効率または複製効率を高めるために、ウィルスに含まれる任意のウィルス遺伝子が野生型遺伝子カゝら改変されていてよい。具体的には、例えば複製因子である N、 P、および L遺伝子の中の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、エンベロープ蛋白質の 1つである HN蛋白質は、赤血球凝集素であるへマダルチュン (hemagglutinin)活性とノイラミニダーゼ（ neuraminidase)活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウィルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、 F蛋白質を改変することにより膜融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうる F蛋白質および/または HN蛋白質の抗原提示ェピトープ等を解析し、これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めた組み換えウィルスべクタ一を作製することちできる。

[0039] またマイナス鎖 RNAウィルスベクターは、アクセサリー遺伝子が欠損したものであつてよい。例えば SeVのアクセサリー遺伝子の 1つである V遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現および複製は障害されることなぐマウス等の宿主に対する SeVの病原性が顕著に減少する（Kato, A. et al.， 1997, J. Virol.

71:7266-7272; Kato, A. et al, 1997, EMBO J. 16:578-587; Curran, J. et al.，

WO01/04272, EP1067179) _oこのような弱毒化ベクターは、 in vivoまたは ex vivoにおける低毒性の遺伝子導入用ウィルスベクターとして特に有用である。

[0040] マイナス鎖 RNAウィルスは遺伝子導入べクタ一として優れており、宿主細胞の細胞質でのみ転写 ·複製を行、、 DNAフェーズを持たな、ため染色体への組み込み（ integration) ί¾起こらなヽ (Lamb, R.A. and Kolakofsky, D., Paramyxoviriaae： Tne viruses and their replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, (eds). Fields of virology. Vol. 2. Lippincott - Raven Publishers: Philadelphia, 199b, pp. 11 / 7-1204) 。このため染色体異常による癌化および不死化などの安全面における問題が生じない。マイナス鎖 RNAウィルスのこの特徴は、ベクター化した時の安全性に大きく寄与している。異種遺伝子発現の結果では、例えばセンダイウィルス (SeV)を連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認められず、ゲノムの安定性が高ぐ挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事が示されている（Yu, D. et al., Genes Cells 2, 457-466 (1997)) oまた、力プシド構造蛋白質を持たないことによる導入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性 (flexibility)など性質上のメリットがある。このように、マイナス鎖 RNAウィルスベクターは、ヒトの抗腫瘍遺伝子治療のための高効率べクタ一の新しいクラスとなることが示唆される。伝播能を有する SeVベクターは、外来遺伝子を少なくとも 4kbまで導入可能であり、転写ユニットを付加することによって 2種類以上の遺伝子を同時に発現する事も可能である。

[0041] またセンダイウィルスは、齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られている力人に対しては病原性がない。これはまた、野生型センダイウィルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（Hurwitz, J.L. et al.， Vaccine 15: 533-540, 1997; Bitzer, M. et al.， J. Gene Med,.5: 543-553, 2003)。センダイウィルスのこれらの特徴は、センダィウィルスベクター力ヒトの治療へ応用できることを示唆し、センダイウィルスベクタ一が、ヒト癌を対象とした遺伝子治療の有望な選択肢の一つとなることを結論づけるものである。

[0042] ウィルスベクターは、ゲノム RNA中にサイト力イン遺伝子をコードする。サイト力イン遺伝子を含む糸且換えウィルスベクターは、上記のウィルスベクターのゲノムにサイト力イン遺伝子を挿入することによって得られる。サイト力イン遺伝子の挿入位置は、例えばウィルスゲノムの蛋白質非コード領域の所望の部位を選択することができ、例えばゲノム RNAの 3'リーダー領域と 3'端に最も近いウィルス蛋白質 ORFとの間、各ウィルス蛋白質 ORFの間、および/または 5'端に最も近いウィルス蛋白質 ORFと 5'トレイラー領域の間に挿入することができる。また、 Fまたは HN遺伝子などを欠失するゲノムでは、その欠失領域にサイト力イン遺伝子をコードする核酸を挿入することができる。ノラミクソウィルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が 6の倍数となるように挿入することが望ましい（Journal of Virology, Vol. 67, No. 8, 4822-4830, 1993)。挿入したサイト力イン遺伝子とウィルス ORFとの間には、 E-I-S配列が構成されるようにする。 E-I-S配列を介して 2またはそれ以上の外来遺伝子をタンデムに並べて挿入することができる。

[0043] ベクターに搭載する外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流 (マイナス鎖（ネガティブ鎖)の 3'側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（ WO01/18223) _oまた、ゲノム上の外来遺伝子の挿入位置によって制御することができ、マイナス鎖の 3'の近くに挿入するほど発現レベルが高ぐ 5'の近くに挿入するほど発現レベルが低くなる。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウィルス蛋白質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。一般に、外来遺伝子の高い発現が得られることが有利と考えられるため、外来遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、マイナス鎖ゲノムの 3'端近くに挿入することが好ましい。具体的には、 3'リーダー領域と 3'に最も近いウィルス蛋白質 ORFとの間に挿入される。あるいは、 3'に一番近いウイルス蛋白質遺伝子と 2番目のウィルス蛋白質遺伝子の ORFの間、または 3'から 2番目と 3番目のウィルス蛋白質遺伝子の間に挿入してもよい。野生型パラミクソウィルスにおいては、ゲノムの 3'に最も近いウィルス蛋白質遺伝子は N遺伝子であり、 2番目の遺伝子は P遺伝子、 3番目の遺伝子は M遺伝子である。逆に、導入遺伝子の高発現が望ましくな、場合は、例えば外来遺伝子の挿入位置をマイナス鎖ゲノムのなるべく 5'側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、ウィルスベクター力の発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるようにすることも可能である。

[0044] 外来遺伝子をコードする核酸をゲノムに挿入するときに付加する S配列としては、例えばマイナス鎖 RNAウィルスの所望の S配列を用いることができる力センダイウィルスであれば、 3'- UCCCWVUUWC- 5' (W= Aまたは C; V= A, C,または G) (配列番号 : 3)の配列を好適に用いることができる。特に 3'-UCCCAGUUUC-5' (配列番号: 4) 、 3'- UCCCACUUAC- 5' (配列番号： 5)、および 3'- UCCCACUUUC- 5' (配列番号： 6)が好ましい。これらの配列は、プラス鎖をコードする DNA配列で表すとそれぞれ 5 -AGGGTCAAAG-3' (配列番号： 7)、 5'- AGGGTGAATG- 3' (配列番号： 8)、および 5'-AGGGTGAAAG-3' (配列番号： 9)である。センダイウィルスベクターの E配列としては、例えば 3'-AUUCUUUUU-5' (配列番号： 10) (プラス鎖をコードする DNAでは 5'-TAAGAAAAA-3' (配列番号： 11) )が好ましい。 I配列は、例えば任意の 3塩基であってよく、具体的には 3'- GAA- 5' (プラス鎖 DNAでは 5'- CTT- 3，）を用いればよい

[0045] マイナス鎖ウィルスベクターを製造するには、哺乳動物細胞において、マイナス鎖 RNAウィルスのゲノム RNAを含む RNPの再構成に必要なウィルス蛋白質、すなわち N 、 P、および L蛋白質の存在下、マイナス鎖 RNAウィルスのゲノム RNAをコードする cDNAを転写させる。転写によりマイナス鎖ゲノム（すなわちウィルスゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させてもよぐあるいはプラス鎖（アンチゲノム。ゲノム RNAの相補鎖。）を生成させても、ウィルス RNPを再構成することができる。ベクターの再構成効率を高めるには、好ましくはプラス鎖を生成させる。 RNA末端は、天然のウィルスゲノムと同様に 3'リーダー配列と 5'トレイラ一配列の末端をなるベく正確に反映させることが好ましい。転写産物の 5'端を正確に制御するためには、例えば転写開始部位として T7 RNAポリメラーゼ認識配列を利用し、該 RNAポリメラーゼを細胞内で発現させればよい。転写産物の 3'端を制御するには、例えば転写産物の 3'端に自己切断型リボザィムをコードさせておき、このリボザィムにより正確に 3'端が切り出されるようにすることができる（Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813—2820, 1997、 Kato, A. et al" 1997, EMBO J. 16: 578-587及び Yu, D. et al" 1997, Genes Cells 2: 457-466) 。リボザィムとしては、デルタ肝炎ウィルスのアンチゲノム鎖（antigenomic strand)由来の自己開裂リボザィムが使用できる。

例えば組み換えセンダイウィルスは、 Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78:

2813-2820, 1997、 Kato, A. et al" 1997, EMBO J. 16: 578-587及び Yu, D. et al" 1997, Genes Cells 2: 457-466の記載等に準じて、次のようにして構築することができる。

まず、目的の外来遺伝子の cDNA塩基配列を含む DNA試料を用意する。 DNA試料は、 25ng/micro-l以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、 Notl部位を利用してウィルスゲノム RNAをコードする DNAに外来遺伝子を挿入する場合を例にとって説明する。目的とする cDNA塩基配列の中に Notl認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異導入法などを用いて、コードするアミノ酸配列を変化させな、ように塩基配列を改変し、 Notl部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から目的の遺伝子断片を PCRにより増幅し回収する。 2つのプライマ一の 5'部分に Notl部位を付加しておくことにより、増幅された断片の両端を Notl部位とする。ウィルスゲノム上に挿入された後の外来遺伝子の ORFとその両側のウィルス遺伝子の ORFとの間に E-卜 S配列が配置されるように、プライマー中に E-ト S配列を含めるようにする。合成 DNAの長さは、付加した E-ト S配列を含む最終的な挿入断片の鎖長が 6の倍数になるように塩基数を設計する（、わゆる「6のルール (rule of six)」； Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72:891—899, 1998; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67:4822-4830, 1993; Calain, P. and Roux, L.， J. Virol. 67: 4822-4830, 1993)。 E-ト S配列は、例えば挿入断片のオリゴ DNAの 3'側にセンダイウィルスのマイナス鎖の S配列、 I配列、および E配列、例えばそれぞれ 5'-CTTTCACCCT-3' (配列番号： 12)、 5'- AAG- 3'、および 5'- TTTTTCTTACTACGG- 3' (配列番号： 13)が用いられる

[0047] PCRは、 Taqポリメラーゼまたはその他の DNAポリメラーゼを用いる通常の方法を用いることができる。増幅した目的断片は Notlで消化した後、 pBluescript等のプラスミドベクターの Notl部位に挿入する。得られた PCR産物の塩基配列をシークェンサ一で確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片を Notlで切り出し、ゲノム cDNAを含むプラスミドの Notl部位にクローユングする。またプラスミドべクターを介さずにゲノム cDNAの Notl部位に直接挿入し、組み換えセンダイウィルス cDNAを得ることも可能である。

[0048] 例えば、組み換えセンダイウィルスゲノム cDNAであれば、文献記載の方法に準じて構築することができる（Yu, D. et al" Genes Cells 2: 457-466, 1997; Hasan, M. K. et al" J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997)。例えば、外来遺伝子のセンス鎖の 3'側に E-I-S配列が連結した 2本鎖 DNAを合成する。これをゲノムのプラス鎖をコードする cDNAの所望の S配列のすぐ 3'側に挿入する。例えばプラス鎖ゲノムをコードする cDNAにおいて、所望のウィルス蛋白質遺伝子のコード配列とこれを転写する S配列の間に予め制限酵素部位 (例えば Notl部位)を作っておき、ここに外来遺伝子 - E-I-S配列をコードする DNAを制限酵素部位を利用して挿入することができる（ Tokusumi, T. et al. (2002) Virus Res 86(1-2), 33-8)。

[0049] このようにして作製したウィルスゲノム RNAをコードする DNAを、上記のウィルス蛋白質 (L、 P、および N)存在下で細胞内で転写させることにより、ウィルスベクターを再構成することができる。組み換えウィルスの再構成は公知の方法を利用して行うことができる（W097/16539; W097/16538; WO03/025570; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323—332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al" 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al" 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404) oこれらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス、麻疹ウィルス、リンダ一ペストウィルス、センダイウィルスなどを含むマイナス鎖 RNAウィルスを DNAから再構成させることができる。これらの方法に準じて、本発明のウィルスを再構成させることができる。ウィルスゲノムをコードする DNAにおいて、 F遺伝子、 HN遺伝子、および/または M遺伝子を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウィルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および/または他のウィルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、細胞に導入し発現させることにより、感染性のウィルス粒子を形成させることが可能である（Hirata, T. et al., 2002, J. Virol. Methods, 104:125—133; Inoue, M. et al., 2003, J. Virol. 77:6419-6429) o本発明は、抗腫瘍剤の製造における、免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターの使用に関する。また本発明は、抗腫瘍剤の製造における、免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウイルスのウィルスのウィルスゲノム RNAまたはその相補 RNAをコードする DNAの使用に関する。本発明の抗腫瘍剤は、腫瘍の予防および/または治療のための医薬として利用される。

[0050] 具体的な手順は、（a)マイナス鎖 RNAウィルスゲノム RNA (マイナス鎖 RNA)またはその相補鎖 (プラス鎖)をコードする DNAを、 N、 P、および L蛋白質を発現する細胞で転写させる工程、 (b)該細胞またはその培養上清力ゝら該ゲノム RNAを含む複合体を回収する工程、により製造することができる。転写のために、ゲノム RNAをコードする DNAは適当なプロモーターの下流に連結される。転写されたゲノム RNAは N、 L、および P蛋白質の存在下で複製され、これらの蛋白質を含む RNP複合体を形成する。そして M、 HN、および F蛋白質の存在下でエンベロープに包まれたウィルス粒子が形成される。ゲノム RNAをコードする DNAは、例えば T7プロモーターの下流に連結させ、 T7 RNAポリメラーゼにより RNAに転写させる。プロモーターとしては、 T7ポリメラーゼの認識配列を含むもの以外にも所望のプロモーターを利用することができる。あるいは、インビトロで転写させた RNAを細胞にトランスフエタトしてもよい。

[0051] DNAからのゲノム RNAの最初の転写に必要な T7 RNAポリメラーゼ等の酵素は、これを発現するプラスミドまたはウィルスベクターの導入によって供給することができるし、または、例えばこの遺伝子を細胞の染色体に、発現を誘導できるように組み込んでおき、ウィルス再構成時に発現を誘導することにより供給することもできる。またゲノム RNA、およびウィルス再構成に必要なウィルス蛋白質は、例えばこれらを発現するプラスミドの導入によって供給する。

[0052] ゲノム RNAを発現する DNAを細胞内に導入するには、例えばリン酸カルシウム法（ Graham, F.し. and Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and

Silverstein, S.， 1977, Cell 11: 223)、種々のトランスフエクシヨン試薬を用いた方法、あるいは電気穿孔法等を用いることができる。リン酸カルシウム法については、例えば Chenおよび Okayama (Chen, C. and Okayama, H" 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745 )に従って、 2-4% CO、 35°C、 15— 24時間、沈殿混液中の DNA濃度 20— 30

2

micro-g/mlの条件で実施することができる。トランスフエクシヨン試薬については、 DEAE-デキストラン（Sigma #D- 9885 M.W. 5 X 10⁵ )、 DOTMA(Roche)ゝ Superfect™ ( QIAGEN #301305)、 DOTAP、 DOPE, DOSPER (Roche #1811169)などを用いること力 Sできる。トランスフエクシヨン試薬と DNAとの複合体がエンドソーム中で分解されてしまうのを防ぐため、クロ口キンをカ卩えることができる（Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015)。また、電気穿孔法は、細胞選択性がないという点で汎用性が高ぐパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、 DNA濃度、細胞密度を最適化して適用される。ベクター再構成のための DNAの細胞への導入には、操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができる点で、トランスフエクシヨン試薬を用いる方法が適している。好適には Superfect™ Transfection Ragent (QIAGEN, Cat No. 301305)、または DOSPER Liposomal Transfection Reagent (Roche, Cat No. 1811169)が用いられる力これらに制限されない。

[0053] cDNAからのウィルスの再構成は具体的には例えば以下のようにして行うことができる。

24穴から 6穴程度のプラスチックプレートまたは 100 mmペトリ皿等で、 10%ゥシ胎児血清 (FCS)および抗生物質（100 units/mlペニシリン Gおよび 100 micro-g/mlストレプトマイシン)を含む最少必須培地 (MEM)を用いてサル腎臓由来細胞株 LLC-MK2 ( ATCC CCL- 7)をほぼ 100%コンフルェントになるまで培養し、例えば 1 micro- g/ml psoralen (ソラレン)存在下、紫外線 (UV)照射処理を 20分処理で不活化した、 T7 RNAポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウィルス vTF7- 3 (Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122—8126,1986、 Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)を 2 PFU/細胞で感染させる。ソラレンの添加量および UV照射時間は適宜調整することができる。感染 1時間後、 2— 60 micro-g,より好ましくは 3— 20 micro- gの組換えセンダイウィルスのゲノム RNAをコードする DNAを、ウィルス RNPの生成に必須なトランスに作用するウィルス蛋白質を発現するプラスミド (0.5— 24 micro— gの pGEM— N、 0.25一 12 micro— gの pGEM— P、および 0.5一 24 micro— gの pGEM-L) (Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)と共に Superfect (QIAGEN 社）を用いたリポフエクシヨン法等によりトランスフエクシヨンする。 N、 P、および Lをコードする発現ベクターの量比は例えば 2 : 1 : 2とすることが好ましぐプラスミド量は、例えば 1一 4 micro— gの pGEM— N、 0.5一 2 micro— gの pGEM— P、および 1一 4 micro— gの pGEM-L程度で適宜調整する。

トランスフエクシヨンを行った細胞は、所望により 100 micro-g/mlのリファンピシン（ Sigma)及びシトシンァラビノシド (AraC)、より好ましくは 40 micro- g/mlのシトシンァラピノシド (AraC) (Sigma)のみを含む血清不含の MEMで培養し、ワクシニアウィルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウィルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579)。トランスフエクシヨンから 48— 72時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を 3回繰り返して細胞を破砕した後、 RNPを含む破砕物を LLC-MK2細胞に再度トランスフエクシヨンして培養する。または、培養上清を回収し、 LLC- MK2細胞の培養液に添加して感染させ培養する。トランスフエクシヨンは、例えばリボフヱクトァミンまたはポリカチォニックリボソームなどと共に複合体を形成させて細胞に導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフエクシヨン試薬が利用できる。例えば、 DOTMA (Roche)、 Superfect™(QIAGEN #301305)、 DOTAP、 DOPE, DOSPER (Roche #1811169)などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロ口キンを加えることもできる（Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015)。 RNPが導入された細胞では、 RNPからのウイルス遺伝子の発現および RNPの複製の過程が進行しウィルスが増幅する。得られたウィルス溶液 (培養上清)を希釈 (例えば 10⁶倍)して再増幅を繰り返すことにより、ワクシニアウィルス VTF7-3は完全に除去することができる。再増幅は、例えば 3回以上繰り返す。得られたベクターは- 80°Cで保存することができる。エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子を欠損した伝播能を持たなヽウィルスを再構成させるには、ェンベロープ蛋白質を発現する LLC-MK2細胞をトランスフエクシヨンに使用する力、またはェンべロープ発現プラスミドを共にトランスフエクシヨンすればよい。また、トランスフエクシヨンを行った細胞にエンベロープ蛋白質を発現する LLC- MK2細胞を重層して培養することによってエンベロープ遺伝子欠損型ウィルスを増幅することもできる（国際公開番号 WO00/70055および WO00/70070参照）。

[0055] 回収されたウィルスの力価は、例えば CIU (Cell-Infected Unit)測定または赤血球凝集活性 (HA)の測定することにより決定することができる (WOOO/70070; Kato, A. et al., 199り, Genes Cells 1: 569—579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan— liposome— mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999)。また、 GFP (緑色蛍光蛋白質）などのマーカー遺伝子を搭載したベクターについては、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例えば GFP-CIUとして)。このようにして測定した力価は、 CIUと同等に扱うことができる（WOOO/70070)。

[0056] ウィルスが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されな、。例えば、センダイウィルスベクター等の再構成においては、サル腎由来の LLC- MK2細胞および CV-1細胞、ハムスター腎由来の BHK細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。これらの細胞に適当なエンベロープ蛋白質を発現させることで、その蛋白質をエンベロープに含む感染性ウィルス粒子を得ることもできる。また、大量にセンダイウィルスベクターを得るために、上記の宿主力得られたウィルスベクターを発育鶏卵に感染させ、ベクターを増幅することができる。鶏卵を使ったウィルスベクタ一の製造方法は既に開発されている（中西ら編, (1993),「神経科学研究の先端技術プロトコール III,分子神経細胞生理学」，厚生社，大阪， ρρ.153-172)。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ 9一 12日間 37— 38°Cで培養し、胚を成長させる。ゥィルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間（例えば 3日間）卵を培養してウィルスべクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み換えセンダイウィルスにより変わり得る。その後、ウィルスを含んだ尿液を回収する。尿液力ゝらのセンダイウィルスベクターの分離 ·精製は常法に従って行うことができる（田代眞人,「ウィルス実験プロトコール」，永井、石浜監修，メジカルビユー社， pp.68-73,(1995))。

[0057] 例えば、 F遺伝子を欠失したセンダイウィルスベクターの構築と調製は、以下のように行うことができる（WO00/70055および WO00/70070参照）。

く 1〉 F遺伝子欠失型センダイウィルスゲノム cDNAおよび F発現プラスミドの構築センダイウィルス（SeV)全長ゲノム cDNA、 pSeV18+ b (+) (Hasan, M. K. et al.， 1997, J. General Virology 78: 2813—2820) (「pSeV18+ b(+)」は「pSeV18+」ともいう）の cDNAを Sphl/Kpnlで消化してフラグメント (14673bp)を回収し、 pUC18にクローユングしてプラスミド PUC18/KSとする。 F遺伝子欠損部位の構築はこの pUC18/KS上で行う。 F遺伝子の欠損は、 PCR-ライゲーシヨン方法の組み合わせで行い、結果として F遺伝子の ORF (ATG-TGA=1698bp)を除!、て例えば atgcatgccggcagatga (配列番号： 14)で連結し、 F遺伝子欠失型 SeVゲノム cDNA(pSeV18+/ A F)を構築する。 PCRは、 Fの上流【こ i [forward: 5— gttgagtactgcaagagc/酉歹 [J备号： 15, reverse:

5 - tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/酉 c列 ¾·号： 16]、 F遺 izs子のト流に ~ . [forward:

17, reverse:

5'-tgggtgaatgagagaatcagcZ配列番号： 18]のプライマー対を用いた PCRの産物を EcoT22Iで連結する。このように得られたプラスミドを Sadと Sailで消化して、 F遺伝子欠損部位を含む領域の断片 (493 lbp)を回収して pUC18にクローユングし、 pUC18/dFSSとする。この pUC18/dFSSを Dralllで消化して、断片を回収して pSeV18+ の F遺伝子を含む領域の Dralll断片と置き換え、ライゲーシヨンしてプラスミド pSeV18+ / A Fを得る。外来遺伝子は、例えば pUC18/dFSSの F遺伝子欠失部位にある制限酵素 Nsilおよび NgoMIV部位に挿入する。このためには、例えば外来遺伝子断片を、 Nsil- tailedプライマーおよび NgoMIV- tailedプライマーで増幅すればよ!ヽ。

[0058] <2> SeV-F蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製センダイウィルスの F遺伝子（SeV-F)を発現する Cre/loxP誘導型発現プラスミドの構築は SeV-F遺伝子を PCRで増幅し、 Cre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物が誘導発現されるように設計されたプラスミド pCALNdlw(Arai, T. et al.， J. Virology 72, 1998, plll5- 1121)のユニークサイト Swal部位に挿入し、プラスミド pCALNdLw/Fを構築する。

F遺伝子欠損ゲノムから感染ウィルス粒子を回収するため、 SeV-F蛋白を発現するヘルパー細胞株を榭立する。細胞は、例えば SeVの増殖によく用いられているサル腎臓由来細胞株 LLC- MK2細胞を用いることができる。 LLC- MK2細胞は、 10%の熱処理した不動化ゥシ胎児血清 (FBS)、ペニシリン Gナトリウム 50単位/ ml、およびストレプトマイシン 50 micro- g/mlを添カ卩した MEMで 37°C、 5% COで培養する。 SeV- F遺

2

伝子産物は細胞傷害性を有するため、 Cre DNAリコンビナーゼにより F遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミド pCALNdLw/Fを、リン酸カルシウム法 (.mammalian transfection kit (btratagene))【こより、周知のプロトコ ~~ノレ【こつて LLC-MK2細胞に遺伝子導入を行う。

10cmプレートを用い、 40%コンフルェントまで生育した LLC- MK2細胞に 10 micro-g のプラスミド pCALNdLw/Fを導入後、 10mlの 10% FBSを含む MEM培地にて、 37°Cの 5 %CO インキュベータ一中で 24時間培養する。 24時間後に細胞をはがし、 10ml培地

2

に懸濁後、 10cmシャーレ 5枚を用い、 5ml 1枚、 2ml 2枚、 0.2ml 2枚に蒔き、 G418 (GIBCO- BRL)を 1200 micro- g/mlを含む 10mlの 10%FBSを含む MEM培地にて培養を行い、 2日毎に培地交換しながら、 14日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行う。該培地により生育してきた G418に耐性を示す細胞はクローユングリングを用いて回収する。回収した各クローンは 10cmプレートでコンフルェントになるまで拡大培養を続ける。

F蛋白質の発現誘導は、細胞を 6cmシャーレにてコンフルェントまで生育させた後、アデノウイルス AxCANCreを斉藤らの方法（Saito et al.， Nucl. Acids Res. 23:

3816-3821 (1995); Arai, T.et al, J. Virol 72,1115-1121 (1998))により例えば moi=3 で感染させて行うことができる。

く 3〉 F遺伝子欠失 SeVウィルスの再構築及び増幅上記 pSeV18+/ A Fの外来遺伝子が挿入されたプラスミドを以下のようにして LLC- MK2細胞にトランスフエクシヨンする。 LLC- MK2細胞を 5 X 10⁶ cells/dishで 100mmのシャーレに播く。 T7 RNAポリメラーゼによりゲノム RNAの転写を行わせる場合には、細胞培養 24時間後、ソラレン (psoralen)と長波長紫外線 (365nm)で 20分間処理した T7 RNAポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウィルス (

PLWUV-VacT7 : Fuerst, T.R. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122—8126 (1986))を MOI 2程度で室温で 1時間感染させる。ワクシニアウィルスへの紫外線照射には、例えば 15ワットバルブを 5本が装備された UV Stratalinker 2400 (カタログ番号 400676 (100V),ストラタジーン社， La Jolla, CA, USA)を用いることができる。細胞を無血清の MEMで洗浄した後、ゲノム RNAを発現するプラスミド、およびマイナス鎖 RNAウィルスのそれぞれ N、 P、 L、 F、および HN蛋白質を発現する発現プラスミドを、適当なリポフエクシヨン試薬を用いてこの細胞にトランスフエタトする。プラスミドの量比は、これに限定されないが、好適には順に 6 : 2 : 1 : 2 : 2 : 2とすることができる。例えば、ゲノム RNAを発現するプラスミド、並びに N、 P、 L、および Fプラス HN蛋白質を発現する発現プラスミド（pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L及び pGEM/F-HN;

WO00/70070, Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569-579 (1996))を、それぞれ 12 micro- g, 4 micro- g, 2 micro- g, 4 micro- g及び 4 micro- gZ dishの量比トランスフエ外する。数時間培養後、血清を含まない MEMで細胞を 2回洗浄し、 40 micro-g/mLのし ytosine Deta-D-arabinoluranoside (Araし： Sigma, St. Louis, MO)及び 7.5 micro- g/mLの Trypsin (Gibco-BRL, Rockville, MD)を含む MEMで培養する。これらの細胞を回収し、ペレットを OptiMEMに懸濁する（10⁷ cells/ml) o凍結融解を 3回繰り返して lipofection reagent DOSPER (Roche #1811169)W L (10⁶cells/25 micro- 1

DOSPER)室温で 15分放置した後、上記でクローユングした F発現ヘルパー細胞にトランスフエクシヨン（10⁶cells /well 12- weU- plate)し、血清を含まない MEM (40 micro-g/ml AraC, 7.5 micro-g/mlトリプシンを含む)で培養し、上清を回収する。 F以外の遺伝子、例えば HNまたは M遺伝子を欠損したウィルスも、これと同様の方法で調製することができる。

F遺伝子欠失または HN遺伝子欠失は、 SeVベクターを非伝播性にするために、また、 M遺伝子欠失は感染細胞からの粒子形成を不能にするために有効である。また、 F 、 HN、および Mの少なくとも 2つの遺伝子の任意の組み合わせを欠損するベクターは、より安全性が保障される。例えば、 Mおよび F遺伝子両欠失 SeV (SeV/ A M A F)は、非伝播性でかつ粒子形成を欠くベクターとなる。 SeV/ A M A Fは in vitroおよび in vivoで高レベルの感染性および遺伝子発現能を保っており、そのレベルは野生型 SeVベクターのレベルと同様である。 SeV/ A M A Fのこれらの特徴は、抗腫瘍処置における SeVの安全性の向上にさらに寄与するものと考えられる。

[0061] ウィルス遺伝子欠損型ベクターを調製する場合、例えば、ベクターに含まれるウイルスゲノム上で欠損しているウィルス遺伝子が異なる 2種またはそれ以上のベクターを同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するウィルス蛋白質力他のベクターからの発現により供給されるため、互いに相補しあって感染力のあるウィルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウィルスベクターが増幅される。すなわち、 2種またはそれ以上の本発明のウィルスベクターを、ウィルス蛋白質を相補する組み合わせで接種すれば、それぞれのウィルス遺伝子欠損型ウィルスベクターの混合物を大量かつ低コストで生産することができる。これらのウィルスは、ウィルス遺伝子が欠損しているため、ウィルス遺伝子を欠損してヽなヽウィルスに比べゲノムサイズが小さくなりサイズの大きい外来遺伝子を保持することができる。また、ウィルス遺伝子の欠損により増殖性がないこれらのウィルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔ィ匕するため、環境放出管理上の利点がある。

[0062] 本明細書に記載したウィルス製造方法に従えば、本発明のウィルスベクターは、例えば 1 X 10⁵ CIU/mL以上、好ましくは 1 X 10⁶ CIU/mL以上、より好ましくは 5 X 10⁶ CIU/mL以上、より好ましくは 1 X 10⁷ CIU/mL以上、より好ましくは 5 X 10⁷ CIU/mL以上、より好ましくは 1 X 10⁸ CIU/mL以上、より好ましくは 5 X 10⁸ CIU/mL以上の力価でウィルス産生細胞の細胞外液中に放出させることが可能である。ウィルスの力価は、本明細書および他に記載の方法により測定することができる（Kiyotani, K. et al, Virology 177(1), 65-74 (1990); WO00/70070)。

[0063] 回収したウィルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーシヨン (濾過）、遠心分離、吸着、およびカラム精製等を含む公知の精製 ·分離方法またはその任意の組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウィルスベクターを含む溶液中で該ウィルスの成分が主要な割合を占めることを言う。例えば実質的に純粋なウィルスベクター組成物は、溶液中に含まれる全蛋白質 (但しキャリアーや安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウィルスベクターの成分として含まれる蛋白質の割合が 10% (重量/重量）以上、好ましくは 20%以上、より好ましくは 50%以上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上を占めることにより確認することができる。例えばパラミクソウィルスベクタ一であれば、具体的な精製方法としては、セルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法 (特公昭 62-30752号公報、特公昭 62-33879号公報、および特公昭 62-30753号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法 (WO97/32010)等を例示することができる力これらに制限されない。

本発明のウィルスベクターを含む組成物の製造においては、ベクターは必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。このような担体または媒体としては、例えば滅菌水、塩化ナトリウム溶液、デキストロース溶液、デキストロースおよび塩ィ匕ナトリウム、乳酸含有リンゲル溶液、培養液、血清、リン酸緩衝生理食塩水（PBS)などが挙げられ、これらとベクターを適宜組み合わせて製剤化することが考えられる。また本発明の組成物は、脱イオン水、デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。また、リボソームの膜安定化剤（例えばコレステロール等のステロール類）を含んでいてもよい。また、抗酸化剤（例えばトコフエロールまたはビタミン Eなど）を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤やその他の添加剤を添加することができる。本発明の組成物は、水溶液、カプセル、懸濁液、シロップなどの形態であり得る。また本発明の組成物は溶液、凍結乾燥物、またはエアロゾルの形態の組成物であってよい。凍結乾燥物の場合は安定化剤としてソルビトール、シユークロース、アミノ酸及び各種蛋白質等を含んでいてもよい。本発明は、免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターを含む抗腫瘍剤に関する。また本発明は、免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターが導入された細胞を含む抗腫瘍剤に関する。本発明のベクターを含む組成物、および本発明のベクターが導入された細胞は、抗腫瘍医薬として有用である。また本発明のベクター組成物および本発明のベクターが導入された細胞は、抗腫瘍ワクチンとして有用である。該ベクター組成物および細胞は、免疫原性を高めるために、サイト力イン、コレラ毒素、サルモネラ毒素等の免疫促進剤を添加することもできる。またワクチンには、ミヨウノくン、不完全 Freund'sアジュバント、 MF59 (オイルェマルジヨン)、 MTP-PE (マイコバクテリア細胞壁由来の muramyl tripeptide)、および QS- 21 (soapbark tree Ouilaia saponaria由来）などのアジュバントを組み合わせることもできる。

[0065] また、組成物または細胞の投与に際しては、アジュバント効果を高めるサイト力イン類を組み合わせることも有効である。このような遺伝子としては、例えば i)一本鎖 IL-12 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (15): 8591-8596, 1999)、 ii)インターフェロン -gamma (米国特許第 5,798,100号）、m)顆粒球コロ-ー刺激因子（GM-CSF)、iv) GM-CSFと IL- 4の組み合わせ (J. Neurosurgery 90 (6), 1115-1124 (1999))などが挙げられる。

[0066] マイナス鎖 RNAウィルスベクターのインビボでの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与組成物の形態、投与方法、導入サイト力イン遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができるが、例えば注射器またはカテーテル等により腫瘍に注入される。投与されるベクターは好ましくは約 10⁵ ClU/mlから約 10¹¹ CIU/mUより好ましくは約 10⁷ ClU/mlから約 10⁹ CIU/ml、最も好ましくは約 1 X 10⁸ CIU/mlから約 5 X 10⁸ CIU/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。ヒトにおいては 1回当たりの投与量は 2 X 10⁵ CIU— 2 X 10¹¹ CIUが好ましぐ投与回数は、 1回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、 1日の投与回数についても同様である。ヒト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比 (例えば平均値)で上記の投与量を換算した量を投与することができる。なお、伝播性のマイナス鎖 RNAウィルスベクターを個体または細胞に投与後、治療が完了するなどウィルスベクターの増殖を抑止する必要が生じた際には、 RNA 依存性 RNAポリメラーゼ阻害剤を投与すれば、宿主に障害を与えずにウィルスベクタ一の増殖だけを特異的に抑止することもできる。エタスビボ投与の場合は、体外 (例えば試験管またはシャーレ内）で標的細胞にベクターを接触させる。 MOIは 1一 500の間で投与することが好ましぐより好ましくは 2— 300、さらに好ましくは 3— 200、さらに好ましくは 5— 100、さらに好ましくは 7— 70である。

免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターまたは該べクターが導入された細胞の腫瘍部位への投与は、腫瘍抗原または該抗原を発現するベクターによる免疫と組み合わされることが好ましい。実施例で示すように、本発明のベクターの in vivo投与を、腫瘍抗原の免疫と組み合わせた治療は、ベクターの単独投与に比べ有意に高い抗腫瘍作用を発揮する。腫瘍抗原またはそれを発現するべクタ一の接種は、免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクタ一の投与と同時、あるいは前後に行えばよい。免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターの投与と腫瘍抗原またはそれを発現するベクターの接種との間隔は、例えば 7日以内、好ましくは 6日以内、 5日以内、 4日以内、 3日以内、または 2日以内、より好ましくは 24時間以内である。腫瘍抗原の免疫で用いられる抗原としては、例えば増殖能を失わせた腫瘍細胞、または腫瘍細胞溶解物などが挙げられる。腫瘍細胞は、加熱処理、放射線処理、あるいはマイトマイシン C処理などで処理し増殖性をなくすことが好ましい。例えば、 X線照射を利用する場合、総放射線量 700— 3300 Radで照射することができる。マイトマイシン C処理法は、例えば、細胞に 25— 50 micro- g/mlのマイトマイシン Cを添カ卩し、 37°C、 30— 60分間保温処理することができる。熱による細胞処理方法は、例えば、 50— 65°Cで 20分間加熱処理を行うことができる。また、腫瘍細胞を用いる代わりに、標的とする腫瘍細胞で発現する腫瘍抗原を用いてもよい。腫瘍抗原は、天然または組み換えポリペプチドであってよい。または、腫瘍抗原を発現するベクターを投与してもよい。腫瘍抗原を発現するベクターとしては、特に制限はなぐ例えばプラスミド、ウィルスベクター、 naked DNAなど、投与個体において腫瘍抗原を発現する能力を持つ所望の発現ベクターが用いられる、このようなベクターは、適当なプロモーター（例えば SV40プロモーター、 CAGプロモーター、 CMVプロモーター、 EF1プロモーター、 LTRプロモーター）の下流に腫瘍抗原をコードする核酸が連結された核酸を含むものであってよい。あるいは、ウィルスべクターを用いる場合は、各ウィルスベクターに適した発現調節配列の制御下に腫瘍抗原をコードする核酸が連結される。ベクターの投与は、 in vivoまたは ex vivoで行ってよい。腫瘍抗原は治療対象癌により適宜選択されるが、腫瘍抗原の例としては、卵巣癌等に関連する Muc-1または Muc-1様ムチンタンデムリピートペプチド (米国特許第 5,744, 144号）、子宮頸癌を引き起こすヒト乳頭腫ウィルス蛋白質 E6および E7、メラノ一マ抗原 MART-1、 MAGE-1、 -2、 -3、 gplOOおよびチロシナーゼ、前立腺癌抗原 PSA、その他にも、 CEA(Kim, C. et al.， Cancer Immunol. Immunother. 47 (1998) 90-96)、および Her2neu (HER2p63- 71、 p780- 788; Eur. J. Immunol. 2000; 30: 3338-3346)などが挙げられる。腫瘍抗原の接種部位は適宜選択されるが、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、または皮下等に行われうる。好ましくは皮下に接種される。腫瘍細胞またはその溶解物を接種する場合は、接種量は一般的には 10⁵— 10⁹細胞、好ましくは 10⁶— 10⁸細胞、より好ましくは約 10⁷細胞とすることができる。本発明は、免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAゥィルスべクタ一、および腫瘍抗原または該抗原を発現するベクター、を含む抗腫瘍処置のためのキットにも関する。該キットは、免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクター、および腫瘍抗原または該抗原を発現するベクターがまとまったパッケージである。該パッケージは、例えば該マイナス鎖 RNAウィルスベクターを含む容器と、腫瘍抗原または該抗原を発現するベクターを含む容器とを含む。このようなパッケージは、本明細書に記載した組み合わせ処置のために使用される。本発明の抗腫瘍処置方法は所望の固形腫瘍に適用できるが、特に中枢神経系組織 (脳実質内または実質外を含む)の腫瘍の処置に適しており、例えば神経膠腫、転移性脳腫瘍、髄芽腫、胚細胞腫、髄膜腫、下垂体腺腫、および神経鞘腫などの脳腫瘍への適用に適している。特に好ましくは神経膠腫 (ダリオ一マ）の処置に適用される。免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターは、脳腫瘍に対して高!ヽ効率でサイト力イン遺伝子を導入する能力を持ち、末梢で活性化された免疫担当細胞の脳腫瘍組織への有意な移動を誘導する。また、腫瘍抗原の免疫接種と組み合わせることにより、脳腫瘍増殖を抑制することができる。中枢神経系へのベクターの導入に関しては、以下の文献も参照のこと（Bitzer, M. et al. J. Gene Med. 5:543-553, 2003; Li, H.O. et al" J. Virol. 74: 6564-6569, 2000; Inoue, M. et al" Mol. Ther. 5:S174, 2002; Shirakura, M. et al., Exp. Animal 52: 119-127, 2003; Suzuki, S. et al., Eur. J. Neurosci. 13: 2299-2308, 2001)。

[0069] 本発明の抗腫瘍処置の対象生物としては特に制限はなぐヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む所望の哺乳動物が含まれ、具体的には、ヒト、マウス、ラット、ィヌ、ブタ、ネコ、ゥシ、ゥサギ、ヒッジ、ャギ、サルが挙げられる。

実施例

[0070] 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。

[0071] [細胞および動物]

ラット 9L神経膠肉腫（gliosarcoma)細胞は、 10% FCSを含む Dulbecco's modified Eagle medium中、 5% COを含む湿大気中で維持した。体重 200および 240 g (7-8週

2

齢）の雄 Fisher 344ラットを、以下に記載したように実験に用いた。これらの動物は Laboratory Animal Resources Commission Standards (実験動物資源委員会基準）に従い、 specific pathogen-free (SPC;特定病原体フリー）の環境下で維持した。

[0072] [脳腫瘍モデルおよび治療]

動物を麻酔し定位固定装置に固定した。穿頭孔（burr hole)を適切な位置に開けた（ブレダマ後方 4 mm、正中線より右 3 mm)。硬膜から腹側 (ventral) 3 mmの位置に 25ゲージ針を挿入し、マイクロインジェクター（Harvard Apparatus, South Natick, MA)を用い、 10 micro-1の培地中に含まれる 10⁵のシンジエニックな 9L腫瘍細胞を 5 分かけてゆっくりと注入した（day 0)。治療工程は 9L腫瘍細胞の脳内（i.e.)接種の 3 日後（day 3)に開始した。動物には SeV18+hIL2/ A M A Fまたは SeV18+lacZ/ Δ Μ Δ Fの脳内移入 (i.e. transplantation),および/または照射した野生型 9L腫瘍細胞の皮下免疫（s.c. immunization)を行った。脳内移入では、 10 micro- 1 PBS中の lxlO⁷ CIU の各 SeVを上記と同様の定位固定座標にて移入した。皮下免疫では、野生型 9L細胞を 30 Gyで照射し、 lxlO⁶の照射 9L細胞を含む 100 micro- 1の培地を下腹部（lower abdominal quadrant)に接種した (Iwaaate, Y. et al., し ancer Res., 61: 8769-8774, 2001)。

[0073] [MRIおよび生存検査]

腫瘍細胞を接種した全ての動物は 7日毎に MRI検査を行い、 i.e.腫瘍の体積を評価した。 50 mg/kgのペントバルビタールで麻酔したラットに 0.2 mlの Gd-DTPA (0.8-1.0 ml/kg)を注入し、 1.5テスラの MR装置（Sigma Advantage, General Electric,

Milwaukee, WI)を用いて冠状断面の Tl強調画像（TR 500 msec, TE 11 msec, 3 mm 厚， gapless)を得た。腫瘍の体積 (mm³)は、各 MR画像領域（mm²)に画像厚をかけたものの Gd-DTPA強調部位の和として算出した。 MRIで見積もった腫瘍体積は、画像解析の直後に得た実際の腫瘍重量とリニアな相関がある（Namba, H. et al, Human Gene Ther., 7: 1847-1852, 1996)。各群の腫瘍体積の解析を、単変量分散分析（一元配置分散分析 (One-factor ANOVA))により実施した。

フット ίま、度の麻 (paresis入運動失！^ (ataxia入 periophtalmic encrustations 周囲外皮形成)、または 20 %を超える体重減少が起こるまで毎日観察した。このような動物の平均余命は 1日未満であるから、犠牲死させた日を死亡日として扱った。生存解析は Kaplan- Meier法による log- rank testにより行った。

[0074] [免疫組織化学]

腫瘍担持ラットの上行大動脈に 4%パラホルムアルデヒドを還流させ、脳を取り出した。脳標本の 15 micro- m厚の凍結切片を抗 CD4細胞（W3/25, Serotec, Oxford, UK) 、抗 CD8細胞（OX— 8, Serotec),抗 NK細胞 (1.2.3, Serotec),および抗ヒ HL— 2 (DAKO, Tokyo, Japan)モノクローナル抗体と反応させ、その後西洋ヮサビペルォキシダーゼ結合ャギ抗マウス IgG (MBL, Nagoya, Japan)と反応後、 3,

3 ' -aiamino oenziaine tetrahydrochlonde (bigma, St. Louis, MI)で染色した。 X— Galの組織染色により beta-ガラクトシダーゼの発現を検出した。

[0075] [実施例 1] ヒ HL-2遺伝子を搭載する組み換えマイナス鎖 RNAウィルスベクターの構築センダイウィルス (SeV)全長ゲノムのゲノム順序は、 3'端にあるリーダー（W)に続き、ウイノレス遺伝子ヌクレオキヤプシド（NP),ホスホ（P),マトリックス（M),フュージョン (F),へマダルチュン-ノイラミニダーゼ（HN),およびラージ（L)、そして最後の 5'端に短いテーラー (_tr)が続く（図。 M遺伝子および F遺伝子の両方を欠失させた SeVベクタ一（SeV/AMAF)を実験に用いた。 F蛋白質はウィルス感染に必須であり M蛋白質はウィルスのアセンブリおよびバデイング（budding)に機能するため、 SeV/AMAF は非伝播性で感染細胞力の粒子形成が起こらなヽ。ヒ HL-2遺伝子を搭載する SeV/ ΔΜΔ Fベクター（hIL- 2- SeV/ Δ Μ Δ F)および lacZ遺伝子を搭載する SeV/ Δ MAFベクター (lacZ-SeV/AMAF)を、以前の記載の通りに構築した（Inoue, M. et al.， J. Virol, 77: 6419-6429, 2003; Inoue, M. et al., Mol. Ther., 5: S174, 2002)。具体的には、 SeV特異的転写調節シグナル配列を含む Notlタグ付きプライマー対

TC-3' (配列番号： 19)および

AAATG GCGCGCCA- 3' (配列番号： 20)を用いて、ヒト IL- 2 (Accession number: A14844) cDNAを増幅した。増幅断片を元の pSeV18+/AMAFの Notl部位に導入した。このようにして、 hIL- 2- SeV/ ΔΜΔ Fの cDNA (phIL2- SeV/ Δ M Δ F)を構築した。 lacZ-SeV/ ΔΜΔ Fの cDNA (placZ- SeV/ Δ M Δ F)は、 lacZ増幅断片を用いて同様に構築した (Li, H.O. et al" J. Virol, 74: 6564-6569, 2000)。 T7 RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウィルス vTF7-3 (Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8122-8126, 1986)を LLC- MK2細胞に感染させた後、 phIL2- SeV/ Δ Μ Δ Fおよび placZ-SeV/AMAFを細胞にトランスフエタトした。 T7 RNAポリメラーゼにより転写が駆動された hIL2-SeV/ ΔΜΔ Fと lacZ- SeV/ ΔΜΔ Fの RNAゲノムは、コトランスフエタトされた各プラスミドから発現が駆動された N、 P、および L蛋白質によりエンキャプシュレートさせた（Ikeda, Y. et al., Exp. Eye Res., 75: 39-48, 2002)。回収された SeVベクタ一を Mおよび F両蛋白質を発現するパッケージング細胞株を用いて増幅した (Inoue, M. et al" J. Virol, 77: 6419-6429, 2003; Inoue, M. et al" Mol. Ther., 5: SI 74, 2002)。ウィルスの力価を感染性を基に決定し、 cell infectious unit (CIU;細胞感染単位）として表記した。 SeVベクターは使用するまで- 80°Cで保存した。

[0076] [実施例 2] SeVベクターによる beta-ガラクトシダーゼ遺伝子の脳内導入

SeVベクターによる beta-ガラクトシダーゼ遺伝子の脳内導入の効率を、 lacZ- SeV/ A M A F (SeV/LacZとも略記）注入の 4、 7、および 14日後に取り出した正常脳組織または脳腫瘍において調べた。脳腫瘍組織に注入した場合、ベクターを注入した組織の外観は典型的には、 l_acZ-SeV/ Δ Μ Δ Fが注入された導入腫瘍細胞とそれらの細胞の子孫力もなる X-gal陽性細胞のコロニーが散在していた（図 2)。散在する X-gal染色コロニーの間に非導入腫瘍細胞が見られた。 beta-ガラクトシダーゼの発現または蓄積はベクターの注入の 7日後に最大となり、発現レベルは 14日目まで持続した（図 2)。腫瘍の周囲の正常脳への導入については、脈絡叢を除き、腫瘍周囲の組織ではほとんど見られなカゝつた。正常脳組織に注入した場合には、腫瘍内注入の場合と同様の効率で神経およびグリア細胞への導入が観察された。ベクターの実質内注入によっては、上衣細胞には導入されな力つた。

[0077] [実施例 3] hIL2- SeV/ A M A Fベクターの i.e.注入による抗腫瘍効果

9L神経膠肉腫を脳内に接種したナイーブラットでは増殖性 (progressive)の腫瘍が発生し、接種力も 25日後（day 25)までにすベてのラットが死亡した。照射した全腫瘍細胞ワクチンを用いた皮下（s.c.)免疫を組み合わせた hIL2- SeV/ A M A F

(SeV/IL-2と略記）の i.e.投与の治療効果を、連続 Gd強調 MRIによる腫瘍体積計測により調べた（図 3)。 9L腫瘍細胞の接種から 3週間目（day 21)に hIL2- SeV/ Δ M Δ Fの i.e.投与および s. 免疫治療を行ったラットの腫瘍体積（86.5 ±63.8 mm³, n=10, on day 21)は、未処理（286±51.2 mm³, n=10, on day 21)、 s.c.免疫のみ（197±48.9 mm³, n=10, on day 21)、 lacZ- SeV/ A M A Fの i.e.投与と s.c.免疫の組み合わせ（233 ± 73.2 mm³, n=6, on day 21)、または hIL2- SeV/ A M A Fの i.e.投与のみ（256±53.2 mm³, n=6, on day 21)のものに比べ、有意に縮小していることが判明した（図 4)。 hIL2- SeV/ A M A Fを利用した組み合わせ治療（combinatory treatment)により、定着脳腫瘍は day 21には 10匹中 3匹のラットで完全に消滅した（図 3)。対照的に、 hIL2- SeV/ A M A Fの i.e.投与単独または s. 免疫単独における腫瘍の平均体積は未処理のものより縮小したが、それらの治療効果は、組み合わせ治療に比べると低ぐ定着腫瘍の完全な消滅は観察されなかった（図 4)。また図 5に示すように、腫瘍担持ラットの寿命は、 hIL2- SeV/ Δ M Δ Fの i.e.投与単独または s.c.免疫単独の処置により未処理に比べ延長されたが、 hIL2-SeV/ Δ Μ Δ Fベクターの i.e.投与を s.c.免疫と組み合わせた治療を行ったラットの寿命は、未処理のコントロールまたはその他の処置を行ったラットのそれに比べても有意に延長された（p〈0.05, Logrank test) (図 5)。 hIL2-SeV/ Δ Μ Δ Fを定着腫瘍の反対側の半球に注入した場合は、腫瘍増殖は影響を受けな力つた（非提示データ)。この結果は、著しい治療効果を達成するには、 IL-2 の発現は標的腫瘍の近傍である必要があることを示唆している。

[0078] [実施例 4] 免疫組織化学解析

脳腫瘍における IL-2蛋白質の発現を免疫組織化学的に調べた。 IL-2蛋白質は、 hIL2-SeV/ Δ Μ Δ Fベクターを注入した腫瘍内で拡散して発現して、ることが確認された（図 6)。さらに、 CD4+T細胞、 CD8+ T細胞、および NK細胞の存在を調べた。 hIL2- SeV/ A M A Fベクターの i.e.投与および s.c.免疫で治療した腫瘍では、 CD4+ T 細胞、 CD8+ T細胞、および NK細胞の顕著な浸潤が観察された（図 7)。これらの細胞のマイグレーションは、 lacZ- SeV/ A M A Fベクターの i.e.注入および s.c.免疫による治療、または hIL2-SeV/ Δ Μ Δ Fベクターの i.e.投与単独による治療を行った腫瘍でも中程度に検出されたが、組み合わせ治療を行った場合は単独治療よりも顕著であった産業上の利用可能性

[0079] 本発明により、腫瘍に対する新たな治療方法が提供された。本発明の方法は、簡単な手法で効果的に腫瘍増殖を抑制できることから、癌治療へ広く適用されることが期待される。

Claims

請求の範囲

[1] 免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターまたは該べクターが導入された細胞を腫瘍部位に投与する工程を含む、抗腫瘍処置方法。

[2] 腫瘍抗原または該抗原を発現するベクターで免疫する工程をさらに含む、請求項 1 に記載の方法。

[3] 該腫瘍抗原または該抗原を発現するベクターを皮下接種により免疫する、請求項 2 に記載の方法。

[4] 該腫瘍抗原が増殖能を失わせた腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解物である、請求項 2 に記載の方法。

[5] 腫瘍が脳腫瘍である、請求項 1に記載の方法。

[6] 免疫刺激性サイト力インカインターロイキン- 2である、請求項 1に記載の方法。

[7] 免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクターまたは該べクターが導入された細胞を有効成分として含む抗腫瘍組成物。

[8] 免疫刺激性サイト力インカインターロイキン- 2である、請求項 7に記載の組成物。

[9] (a)免疫刺激性サイト力インをコードするマイナス鎖 RNAウィルスベクター、および、

(b)腫瘍抗原または該抗原を発現するベクター、を含む抗腫瘍処置のためのキット。

[10] 免疫刺激性サイト力インカインターロイキン- 2である、請求項 9に記載のキット。