WO2004022731A1 - シアル酸結合活性を有する膜蛋白質をエンベロープに含むウイルスベクターをグラム陽性菌由来ノイラミニダーゼを用いて製造する方法 - Google Patents

シアル酸結合活性を有する膜蛋白質をエンベロープに含むウイルスベクターをグラム陽性菌由来ノイラミニダーゼを用いて製造する方法 Download PDF

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protein
vector
cells
gram
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Masanori Kobayashi
Yasuji Ueda
Mamoru Hasegawa
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Dnavec Research Inc.
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    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a viral vector containing a membrane protein having sialic acid binding activity in an envelope using neuramidase derived from Gram-positive bacteria.
  • the present invention relates to a method for producing a viral vector containing a membrane protein having sialic acid binding activity in an envelope using neuraminidase derived from Gram-positive bacteria.
  • NA neuraminidase
  • HA pseudotypedani viruses with improved gene transfer ability by utilizing the properties of HA proteins.
  • only low titers of virus can be produced in the absence of neuraminidase (Hatziioannou, T., et al., 1). 998, J. Virol. 72: 5313-5317).
  • the incorporation of the HA protein into virions can be promoted and the titer can be increased (Dong, J., et al., 1992, J. Virol 66: 7374-7382; Negre, D., et al., 2000, Gene Ther.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a viral vector containing a membrane protein having sialic acid binding activity in an envelope, using neuraminidase derived from Gram-positive bacteria.
  • NA from Vibrio cholerae belonging to Gram-negative bacteria has often been used in the production of the HA pseudotyped dani virus and the like.
  • the titer of the vector produced using NA derived from Vibrio cholerae was low, and it was difficult to mass-produce the vector industrially in terms of cost.
  • the present inventors have developed a technique for producing a viral vector containing a membrane protein having a sialic acid binding activity in an envelope with a high titer and at a lower cost, and thus a new technique which can be used for virus production has been proposed.
  • a search for NA was performed.
  • NA derived from Dalham yang 1 live bacteria than NA derived from Vibrio cholerae.
  • NA derived from Gram-positive bacteria industrial mass production of pseudotyped vectors can be performed efficiently and economically.
  • the present invention relates to a method for producing a viral vector containing a membrane protein having sialic acid binding activity in an envelope using neuraminidase derived from Gram-positive bacteria. , More specifically,
  • a method for producing a virus vector containing a membrane protein having sialic acid binding activity comprising the steps of: culturing the virus vector-producing cell in the presence of gram-positive bacteria-derived neuraminidase; and collecting the produced virus.
  • the actinomycetes belonging to the family Micromonospora is Micromonospora pyridifashens (ficromoriospora viridifaciens).
  • virus vector is a retrovirus vector
  • the membrane protein having sialic acid binding activity is an envelope protein of a single-stranded negative-strand RNA virus.
  • the single-stranded negative-chain RNA virus is a virus belonging to the family Paramyxoviridae or the family Orthomyxoviridae.
  • the present invention provides a method for producing a virus vector containing a membrane protein having sialic acid binding activity in an envelope.
  • the term “viral vector” refers to a virus particle having an ability to introduce a nucleic acid molecule into a host, or a virus particle having the same effect. Refers to dyeable fine particles.
  • the method of the present invention is a method comprising the step of culturing a vinoless vector-producing cell in the presence of Gram-positive bacteria-derived neuraminidase, and collecting the produced virus. By using neuraminidase derived from Gram-positive bacteria, the amount of virus recovered from virus-producing cells can be significantly increased.
  • the neuraminidase from Gram-positive bacteria is preferably derived from actinomycetes.
  • the method of the present invention can be applied to the production of a desired viral vector having an envelope derived from a cell membrane.
  • the method of the invention is preferably applied in the production of, for example, negative-strand RNA viruses, retroviruses, box viruses, herpes viruses, etc., but in particular for the production of retroviruses including lentiviruses. Can be suitably applied.
  • the virus to be produced may be a replication competent virus or a replication deficient virus.
  • a replication-defective virus vector is produced by deleting a part or all of the virus gene that plays a role in the formation or release of infectious virus particles from the virus genome. That is, the desired gene is modified by modifying the viral genome so that the nucleic acid sequence necessary for incorporation of the viral genome into the virus particles and introduction of the nucleic acid into the target cells is deleted, and the envelope gene and the like are deleted.
  • a replication-defective recombinant virus vector suitable for introduction into cells can be produced.
  • a replication-defective retrovirus vector it is necessary to remove some or all of the viral protein genes such as gag, pol, and env from the viral genomic RNA, and to perform virus packaging and gene transfer to target cells.
  • the genome of the viral vector can be modified so that only the proper sequence (such as part of the LTR) remains.
  • genes required for virus particle formation among the deleted genes are expressed in virus-producing cells.
  • a virus particle containing a nucleic acid in which at least a part of the viral gene of the wild-type virus has been lost as a virus genome is also used in the present invention. include.
  • the present invention is particularly preferably used in the production of a recombinant virus.
  • “Recombinant virus” refers to a virus produced via a recombinant polynucleotide.
  • a recombinant polynucleotide is a polynucleotide in which one or both termini are not joined in the same way as in their natural state.
  • a recombinant polynucleotide is a polynucleotide in which the binding of a polynucleotide chain has been modified (cleaved or bound) by hand.
  • the recombination polynucleotide can be produced by a known gene recombination method by combining polynucleotide synthesis, nuclease treatment, ligase treatment and the like.
  • Recombinant protein refers to a protein produced via a recombinant polynucleotide or an artificially synthesized protein.
  • a recombinant protein can be produced by expressing a recombinant polynucleotide encoding the protein.
  • Recombinant viruses can be produced by expressing a polynucleotide encoding the viral genome constructed by genetic engineering and reconstructing the virus.
  • the virus vector produced by the method of the present invention has a protein having sialic acid binding activity in a virus envelope.
  • the virus vector to be produced may be a virus having a protein having sialic acid binding activity in nature, or a virus having no such protein in nature, and having the protein in the envelope artificially. Virus may be used.
  • a virus in which the envelope has a certain protein that is not or almost not contained in the envelope of a natural virus is called a virus that is pseudotyped by the protein.
  • a pseudotyped virus having a heterologous envelope protein can be produced, for example, by expressing the protein in a virus-producing cell.
  • the method of the present invention can be particularly suitably applied to the production of viruses pseudotyped with a membrane protein having sialic acid binding activity.
  • Membrane proteins having sialic acid binding activity include sialic acid in the extracellular region of the protein. Those having an acid binding region are used. Whether such a protein is a natural protein or an artificial protein is not particularly limited. Many membrane proteins having sialic acid binding activity in nature have been found, for example, in viral envelope proteins. Such a protein can be identified by, for example, hemagglutination (HA; hemagglutination) activity. The viral protein with HA activity is sometimes called hemagglutinin (hemagglutinin). The virus protein having this HA activity is particularly preferably used in producing the virus of the present invention.
  • HA hemagglutination
  • hemagglutinin hemagglutinin
  • HA activity has been detected in various viruses so far.
  • the proteins having HA activity of these viruses can be used as they are or modified by producing chimeric proteins with other proteins, etc., for use in the production of the virus of the present invention.
  • HA activity can be detected using erythrocytes of various organisms. The type of erythrocyte and the optimal temperature of the reaction, which are often used for detecting HA activity, are appropriately adjusted for each virus. It is said that rubella virus requires calcium ions for its reaction. For arbovirus, the optimal pH for the reaction is strict. Proteins with HA activity of the virus include virions themselves in enteroviruses and rubella viruses, and virions in arboviruses and adenoviruses as well as particles smaller than virions.
  • Box virus hemagglutinin exists as particles containing lipids separate from virions. Using such a protein having HA activity, a virus having HA activity can be produced.
  • Adenovirus III subgroup viruses cause incomplete agglutination, which partially agglutinates rat erythrocytes, and such proteins can also be used as membrane proteins with HA activity.
  • HA activity can be tested by a known method (National Institute for Preventive Health Research, edited by Alumni Association, 2nd revised edition, Introduction to Virus Experiments, pp. 214-225, Maruzen Co., Ltd.).
  • Red blood cells include, for example, chickens (including chicks and adult chickens), gachiyo, rats Erythrocytes such as, guinea pigs, rhesus monkeys, green lizards, or humans can be used.
  • the reaction is carried out under conditions more suitable for the protein, such as 0 ° C, 4 ° C, room temperature, or 37 ° C. Examples of reaction conditions for hemagglutination of each virus are shown below.
  • HA reaction of adenovirus is usually independent of the P H, it is carried out at a temperature of for example 3 7 ° C.
  • adenovirus subgroup I such as 3, 7, 11, 14, 16, 20, 21, 25, and type 28, rhesus monkey erythrocytes may be used, for example.
  • subgroup II for example, types 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 22, 23, 24, 26, and 27, rat erythrocytes may be used, for example.
  • subgroups III such as types 1, 2, 4, 5, and 6, rat erythrocytes may be used, for example, and incomplete aggregation occurs.
  • Enterovirus HA response is usually pH-independent .
  • erythrocytes are used and cause aggregation at room temperature.
  • human type 0 erythrocyte is used and causes agglutination at 4 ° C.
  • human type 0 erythrocytes are used and cause an agglutination reaction at 37 ° C.
  • Echoviruses for example, types 3, 6, 7, 11, 12, 13, 19, 20, 21, 24, 29, use, for example, human type 0 erythrocytes and cause agglutination at 4 ° C.
  • the reovirus HA reaction is usually pH-independent and occurs at room temperature.
  • types 1 and 2 use human type 0 erythrocytes
  • type 3 uses human erythrocytes.
  • the HA reaction of the minus-strand RNA virus is performed at a pH of about 7.2, for example, in the case of influenza virus.
  • red blood cells such as birds, humans, or guinea pigs are used, and the reaction occurs at room temperature.
  • type C for example, chicken erythrocytes are used, and the reaction is preferably at 4 ° C.
  • NDV Newcastle disease virus
  • HA reaction of parainfluenza virus is usually P H-independent type 1, etc.
  • Niwatori red blood cells in the case of type 2, for example Niwatori red blood cells, et al using The reaction is performed, for example, at 4 ° C.
  • parainfluenza virus type 3 human or guinea pig erythrocytes are used and reacted at 4 ° C to room temperature.
  • measles virus the reaction is carried out at 37 ° C using, for example, green erythrocytes.
  • the reaction is strict on the acidic side.
  • the reaction is carried out using, for example, red blood cells of Gachiyo.
  • the pH is preferably 6.4 and the temperature is, for example, 0 ° C.
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • the pH is preferably 5.8, and the temperature is, for example, 0 ° C. .
  • the reaction is usually pH-independent, and for example, the reaction is observed at room temperature to 37 ° C. using chicken erythrocytes.
  • guinea pig erythrocytes In the case of rubella virus, for example, chick or goose erythrocytes are used and reacted at 4 ° C. and pH of about 6.2 or 7.2.
  • poJJoma virus for example, guinea pig erythrocytes can be used under the conditions of 4 ° C and pH 7.2.
  • rat virus for example, guinea pig erythrocytes can be used at room temperature and pH 7.2.
  • a virus can be produced according to the method of the present invention using the above-described virus protein having HA activity or a modified protein thereof.
  • the modified protein is a protein in which one or more amino acids of a natural protein have been deleted, substituted, and / or inserted.
  • the modified protein preferably contains a partial amino acid sequence of the original protein, more preferably 8 or more amino acids, more preferably 9 or more amino acids, more preferably 10 or more amino acids, more preferably 15 or more amino acids of the original protein. including.
  • the modified protein preferably has an amino acid sequence identity of 70% or more, more preferably 80% or more, further preferably 85% or more, and still more preferably 90% or more, with the original protein.
  • the modified protein may be a protein in which another protein is added to the original protein or a partial protein thereof.
  • Membrane protein having sialic acid binding activity contained in the envelope of viral vector particularly preferred proteins for the application of the present invention include, specifically, HN protein of paramyxovirus, HA protein of onoresomyovirus, E1 protein of togavirus, A27 le H3L of vaccinia virus, D8L protein, Examples include the flavivirus M and E proteins, the coronavirus El and E2 proteins, and the Punyavirus G1 protein.
  • the envelope protein possessed by the single-chain negative tether virus is preferable, and the HA protein of the orthomyxovirus is particularly preferable.
  • Single-stranded negative-strand RNA virus refers to a virus having a single-stranded negative-strand [ie, ( ⁇ )-strand] RNA in its genome.
  • viruses include Paramyxoviridae (including Paramyxoviridae; genus Paramyxovirus, MorDiviruslivirus, Rubulavirus, and Pneumovirus), rapdovirus (including Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus, and Ephemerovirus ⁇ ), and fiiroinoire (Firoinoreae).
  • Onolemyxovirinoe including Orthomyxoviridae; Infuluenza virus A, B, C, and Thogoto—like viruses, etc.
  • Bunyavirenoe Bunyaviridae; three genus such as Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, and Phopbovirus.
  • Viruses belonging to the family such as navirus (Arenaviridae) are included.
  • HA protein of the Orthomyxoviridae virus particularly preferred is the HA protein of the influenza virus.
  • HN (or H) protein of Sendai virus, rabies virus, or measles virus is suitable.
  • These proteins may be used in combination of two or more. These proteins may be derived from natural, wild, mutant, laboratory passages, artificially constructed strains, etc. of the virus. These proteins may be proteins modified from natural proteins.
  • the membrane protein having sialic acid binding activity may have an activity other than binding to sialic acid.
  • the HN protein of paramyxovirus has a neuraminidase (NA) activity in addition to a sialic acid binding activity (HA activity).
  • NA neuraminidase
  • the neuramidase activity of the HN protein itself has the function of promoting virus production
  • two or more membrane proteins having sialic acid binding activity may be used.
  • the method of the present invention can be used in the production of a virus which has been pseudotyped with two proteins, an orthomyxovirus HA protein and a paramyxovirus HN protein.
  • the NA activity of the HN protein and NA from Gram-positive bacteria enable the virus to be released from cells with higher efficiency.
  • the production of the virus vector in the present invention is carried out by culturing the virus vector-producing cells in the presence of gram-positive bacteria-derived neuraminidase in the step of producing a virus vector having a membrane protein having sialic acid binding activity. That is, virus-producing cells are cultured in a culture solution containing neuraminidase derived from Gram-positive bacteria. Thereafter, the step of collecting the produced virus allows the virus produced from the cells to be obtained. Recovery of the virus may be, for example, a step of recovering the culture supernatant of the virus-producing cells. Further, the method may further include a step of recovering the virus from the culture supernatant. From the culture supernatant, the virus can be further purified or concentrated by centrifugation, adsorption, filtration or the like.
  • NA Neuraminidase
  • EC 3.2.1.18 refers to a protein that has the activity of cleaving glycoside bonds of sialic acid (this activity is called NA activity).
  • glycoproteins or glycolipids on cell membranes Is a protein having the activity of cleaving the daricoside bond of sialic acid in the medium (Schauer, R., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 40 (1982) 131-234; Cabezas, JA, Biochem. J. 278 (1991) ) 311-312).
  • the activity of neuraminidase is determined by using N-Acetylneuraminyl lactose (NANA- lactose) or bovine submaxillary mucin (Bovine submaxillary mucin) as a substrate, 1 ⁇ mol of N-Acetylneuraminic acid per minute at pH 5.0 and 37 ° C.
  • the amount of enzyme required to produce (NANA) is defined as 1 unit (U) (Cassidy, JT et al., J. Biol. Chem. 240: 3501 (1965)).
  • NA is sometimes called sialidase.
  • the gram-positive bacterium-derived NA refers to NA of gram-positive bacterium or a structural equivalent thereof, or a variant thereof.
  • NA derived from Gram-positive bacteria includes NA obtained from Gram-positive bacteria.
  • examples include NAs purified from gram-positive bacterial cultures and recombinants thereof.
  • Recombinants of Gram-positive bacteria-derived NA can be produced by expressing a gene encoding Gram-positive bacteria-derived NA in the same or different organisms.
  • NA obtained from Gram-positive bacteria is included in NA derived from Gram-positive bacteria as long as it is a protein equivalent to NA obtained from Gram-positive bacteria, even if obtained from other raw materials.
  • the NA derived from a gram-positive bacterium includes a protein having an activity that is modified by deleting, replacing, and / or inserting one or more amino acids of the wild-type gram-positive bacterium NA. It is.
  • the number of amino acids to be modified is not limited as long as it has NA activity, but is preferably within 70 amino acids, more preferably within 50 amino acids, more preferably within 30 amino acids, and more preferably within 20 amino acids. And more preferably within 10 amino acids, more preferably within 5 amino acids, and more preferably within 3 amino acids.
  • the modified NA is 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 85% or more, more preferably 50% or more of the amino acid sequence of Gram-positive wild-type NA. Have over 90% identity.
  • the amino acid sequence identity can be determined, for example, by the algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Karl in, S. and Altschul, SF, Proc. Natl. Acad.
  • Gap is mismatch
  • the identity value of the wild-type dullam-positive bacterium NA to the entire amino acid sequence may be calculated.
  • BNR bacterial neuraminidase repeat
  • the BNR repeats in multiple copies separated by at least 40 amino acid residues.
  • Amino acids at the N-terminus and / or C-terminus of wild-type NA may be modified with minimal effect on activity.
  • the NA derived from Gram-positive bacteria includes, for example, a protein having NA activity, which is a partial protein of wild-type Gram-positive bacteria NA.
  • the partial protein is preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more of the continuous amino acid sequence of the wild-type Gram-positive NA. And more preferably 90% or more.
  • the NA derived from a gram-positive bacterium includes a protein having NA activity, which is a protein obtained by adding another protein to the wild-type gram-positive bacterium NA or a partial protein thereof. A person skilled in the art usually produces a partial-length protein or a fusion protein with another protein while maintaining the activity.
  • Gram-positive bacteria are bacteria and other bacteria that are positive for Gram stain.
  • Gram staining generally involves staining with a basic staining solution (such as crystal violet), treating with Lugol's solution (12- II solution), and then briefly washing with a polar solvent (such as alcohol or acetone).
  • a basic staining solution such as crystal violet
  • Lugol's solution (12- II solution) treating with Lugol's solution (12- II solution)
  • a polar solvent such as alcohol or acetone
  • Gram-positive organisms generally have relatively thick (15-80nra) cell walls and many lack lipopolysaccharide in the outer layer. Many are highly sensitive to lysozyme. Specifically, Gram-positive organisms include staphylococci, streptococci, Bacillus subtilis, macrophages, and actinomycetes.
  • the NA derived from Gram-positive bacteria is preferably NA derived from actinomycetes. Actinomycetes refer to bacteria of the order Actinomysetales and other actinomycetes.
  • Actinomycetes belong to the group of Gram-positive bacteria. Examples of actinomycetes include Frankiaceae, Micromonos ⁇ , Micromonosporaceae, Propionibacteriaceae, Pseuodonocardiaceae, and Streptomyces; i4 (itreptomycetaceae). ⁇ ⁇ Str Str Actmomycetaceae), Micrococcaceae, Actmosynne mataceae, Nocardiopsaceae, and Glycomycetaceae.
  • Actinomyces NA see Accession Number L06898 (protein: AAA21932, A49227), X62276 (protein: CAA44166) ⁇ Actinomyces viscosus (DM).
  • X62276 protein: CAA44166
  • DM Actinomyces viscosus
  • NC-003450 protein: NP_600771
  • AP005278 protein BAB98949
  • DM Corynebacterium gluta icwn
  • Streptomyces NA see, for example, Accession Number NC-003155 (protein: NP-823018) (Streptomyces avermitilis) ⁇ NC-003888 (protein: NP-1 630638) (Streptomyces coelicolor).
  • the neuraminidase used in the present invention is preferably NA from actinomycetes, more preferably from Micromonospora, more preferably from Micromonospora.
  • micromonospora bacteria include aurantiaca, M. brunnea ⁇ M. orunnescens ⁇ M. carbonacea ⁇ M. cellulo ⁇ yticum, M. chalcea, M. chersinia M. citrea, M. coerulea M. echinoauran tiaca ⁇ M. echinobru nnea ⁇ M. echinospora ⁇ M. floridensis M. fulviviridis M. ful vopurpureus ⁇ M.
  • NAs include NAs derived from M.
  • viridifaciens ATCC 31146. ⁇ ⁇ The base sequence of the NA gene nedA) of Zo3 ⁇ 43 ⁇ 4ce7s is described in Accession Number D 01045 (SEQ ID NO: 1), and the amino acid sequence of the encoded protein is described in Q02834 (SEQ ID NO: 2) (Sakurada, K. et al., J. Bacteriol. 174 (21): 6896-9 03, 1992).
  • the NA gene of other micromonosbora can be isolated.
  • at least 30 nucleotides, more preferably at least 50 nucleotides, more preferably at least 100 nucleotides, more preferably at least 150 nucleotides, more preferably the full length of the sequence described in SEQ ID NO: 1 and / or its complementary sequence What kind of nucleic acid can be selected to hybridize under such conditions!
  • a probe is prepared from a nucleic acid containing the sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleic acid to be hybridized, and the probe is identified by detecting whether it hybridizes to the other nucleic acid.
  • Stringent hybridization conditions include, for example, 5xSSC (lxSSC contains 150mM sodium chloride and sodium 15 citrate), 7% (w / v) SDS (sodium dodecyl sulfate), 100 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA, 5x Denhardt's solution (1x Denhardt's solution contains 0.2% polyvinylpyrrolidone, 0.2% bovine serum albumin, and 0.2% ficoll) at 48 ° C, preferably 50 ° C Hybridization is performed at C, more preferably 55 ° C, more preferably 60 ° C, and then 2xSSC, 0.1 ° / at the same temperature as the hybridization.
  • (w / v) Conditions for washing in SDS for 2 hours with shaking. More preferably, the washing is in lxSSC, 0.1% (w / v) SDS, more preferably in 0.5xSSC, 0.1% (w / v) SDS, more preferably 0.1xSSC, 0 Perform for 2 hours with shaking in 1% (w / v) SDS.
  • virus-producing cells are cultured in the presence of NA derived from Gram-positive bacteria as described above, and the produced virus is recovered. Will Since virus is released from the cells into the culture solution, virus can be recovered by collecting the culture supernatant.
  • virus pseudotyped with a sialic acid-binding protein when producing a virus in a cell that expresses the protein, the cell is cultured in the presence of NA derived from a Gram-positive bacterium, and the produced virus is ligated. to recover.
  • NA derived from Gram-positive bacteria may be supplied by adding NA to the culture solution, or secreting the NA from virus-producing cells or cells co-cultured with virus-producing cells using a vector that expresses NA You may let it.
  • NA is present during at least part of the culture period of the virus-producing cells.
  • the time for culturing the virus-producing cells in the presence of NA is, for example, 1 hour or more, preferably 3 hours or more, more preferably 5 hours or more, more preferably 10 hours or more, and more preferably 20 hours or more.
  • virus-producing cells are cultured in the presence of NA derived from Gram-positive bacteria. During this time, the virus accumulates in the culture supernatant.
  • the amount of neuraminidase from Gram-positive bacteria can be appropriately adjusted so as to maximize virus production.
  • the concentration of NA derived from Gram-positive bacteria in the culture solution is, for example, 0.1 mil / ml to 1000 U / ml, preferably 0.2 mU / ml to 500 U / ml, and more preferably 0.1 mU / ml to 500 U / ml. It is 5 mU / ml to 100 U / ml, more preferably 1 mU / ml to 50 U / ml.
  • NA derived from Gram-positive bacteria is 10 U / ml or less, for example, 1 U / ml or less, 0.1 U / ml or less, 0.05 U / ml. It is excellent in that a high titer of virus can be released from virus-producing cells even at a low dose of 0.01 U / ral or less.
  • the virus vector produced by the method of the present invention may further contain, for example, another protein in the envelope in addition to the sialic acid-binding membrane protein described above.
  • another protein in the envelope in addition to the sialic acid-binding membrane protein described above.
  • HA (or HN) protein of negative-strand RNA virus and other envelope proteins having hemagglutining activity, F protein of negative-strand RNA virus, etc. May further comprise an envelope protein involved in membrane fusion.
  • it may further contain an envelope protein derived from a desired virus.
  • an envelope protein derived from a virus that infects human cells is preferably used.
  • Such proteins include, but are not particularly limited to, retrovirus amphopic pick envelope protein, vesicular stomatitis virus (VSV) G protein, and the like.
  • proteins of the Herpesvirus family include gB, gD, gH, and gp85 proteins of simple herpes virus, and gp350 and gp220 proteins of EB virus.
  • proteins of the hepadnavirus family include the S protein of hepatitis B virus.
  • a vector containing a retrovirus amphoteric pick envelope (amphototropic env) protein and a negative-strand RNA virus HA (or HN) protein can be produced according to the method of the present invention.
  • the virus produced by the method of the present invention can include, for example, VSV-G protein which is a surface glycoprotein of vesicular stomatitis virus (VSV).
  • VSV-G is considered to be a receptor for phospholipids present in most animal cells.By using a vector containing VSV-G protein and sialic acid binding protein, the number of cell types into which genes can be introduced is dramatically increased. However, introduction efficiency also increases (W001 / 92508).
  • a vector containing the HA (or HN) protein of the VSV-G protein and negative-strand RNA virus can be exemplified.
  • These vectors can further include the F protein of the negative strand RNA virus. That is, the present invention relates to the production of vectors containing retroviral amphotropic envelope protein, F protein, and HA (or HN) protein, and vectors containing VSV-G protein, F protein, and HA (or book) protein. Useful.
  • these vectors can contain the negative chain RNA virus M protein.
  • the present invention provides a vector containing a retrovirus amphotropic envelope protein, F protein, HA (or HN) protein, and M protein, and VSV-G protein, F protein, HA (or HN) protein, and And the production of vectors containing M protein.
  • Vectors such as those described above are also excellent in that they exhibit high gene transfer ability even in cells that have been conventionally difficult to transfer genes, such as cells having mucus and cell fractions containing hematopoietic stem cells.
  • VSV-G protein is a type of glycoprotein that forms a stable trimer and exists on the membrane, so that vector particles are less likely to be ruptured during the purification process, and high concentration is achieved by centrifugation. (Yang, Y. et al., Hum Gene Ther: Sep, 6 (9), 1203-13. 1995).
  • the HA (or HN), F, and M proteins of the negative-stranded RNA virus used for pseudotyping of the vector are not particularly limited.
  • proteins of the Orthomyxoviidae and Paramyxoviridae viruses are preferred.
  • envelope proteins of influenza virus and Sendai virus can be suitably used.
  • an HA pseudotyped virus produced by expressing an influenza virus HA protein in virus-producing cells can infect a wide range of mammalian cells, including human cells.
  • HN proteins derived from desired strains.
  • proteins derived from virulent or attenuated strains may be used. I'll do it.
  • proteins derived from the Z strain can be used.
  • proteins derived from the Z strain can be used.
  • influenza virus envelop protein a protein derived from a desired isolate can be used.
  • an envelope protein derived from mouse leukemia virus (MuLV) 4070A strain can be used as an amphoteric pick envelope protein of a retrovirus.
  • an envelope protein derived from MuLV 10A1 can be used (for example, pCL-10A1 (Imgenex) (Naviaux, RK et al., J. Virol. 70: 5701-5705 (1996))).
  • an envelope protein derived from the Moro-I mouse leukemia virus (MoMuLV) can be used, and vesicular stomatitis virus G protein (VSV-G) includes, for example, an Indiana serotype strain (J. Virology 39: 5). 19-528 (1981)).
  • proteins derived from the desired strain can be used.
  • envelope proteins such as the HA (or H), F, G, M, or retrovirus envelope proteins of the negative bandaging virus
  • HA or H
  • F, G, M or retrovirus envelope proteins of the negative bandaging virus
  • a viral vector using a viral envelope protein having a sialic acid binding activity such as an HA protein or an HN protein, or a protein in which the cytoplasmic region of another envelope protein has been modified by deletion, substitution, and / or addition.
  • a vector having higher gene transfer ability can be produced.
  • the present invention relates to a pseudotype comprising a protein in which a part or all of a cytoplasmic side region of a naturally occurring membrane protein having sialic acid binding activity has been modified by substitution, deletion, and / or addition.
  • the present invention relates to a method for producing a virus vector.
  • the cytoplasmic region of the HA (or HN) protein and / or F protein of a negative-strand RNA virus is deleted, or another membrane protein (for example, the envelope protein of a retrovirus including a lentivirus) is deleted.
  • the modified protein substituted or added in the cytoplasmic region is suitably used for producing a viral vector with high infection efficiency.
  • a pseudotyped viral vector having a higher infection efficiency is produced by using a protein that has been modified from the wild type by substitution, deletion, and / or addition of a cytoplasmic region of a virus envelope protein having sialic acid binding activity. be able to.
  • the cytoplasmic region of the HA (or HN) protein of negative-strand RNA virus was replaced with the cytoplasmic region of the lentivirus or retrovirus envelope protein such as SIV, and the HA (or HN) protein of the negative chain RA virus was replaced by the lentivirus or other retrovirus envelope protein.
  • a retrovirus with a protein to which a cytoplasmic region has been added, it becomes possible to introduce a foreign gene into a wide range of cells including human cells at a high rate.
  • the range of the cytoplasmic region to be deleted and the range of the cytoplasmic region of the retrovirus envelope protein to be added are not particularly limited, and part or all of the cytoplasmic region may be deleted, substituted, or deleted. 7 or can be added.
  • Such a viral vector may further comprise a modified F protein of the negative chain RA virus.
  • a plasmid is constructed that expresses a protein in which the amino acid in the cytoplasmic region of the F protein has been deleted. There is no particular limitation on the range to be deleted, and part or all of the cytoplasmic region can be deleted.
  • an F protein in which the cytoplasmic region has been deleted while leaving 0 to several amino acids is considered to be suitable for the production of pseudotyped dani retrovirus.
  • the cytoplasmic side region of the F protein can be added to other peptides.
  • the substituted protein can be used for virus production.
  • a protein obtained by adding 11 amino acids from the 5 'side of the cytoplasmic side region of the envelope protein of SIV can be exemplified.
  • the present invention relates to a protein of the F protein of a negative-chain RA virus, wherein a part or all of the native cytoplasmic region of the protein is modified by substitution, deletion, and / or addition.
  • the present invention also relates to a method for producing pseudotyped virgin viruses by further using the method.
  • the present invention relates to the present invention, wherein the cytoplasmic region of the F protein is a part of the cytoplasmic region of the envelope protein of a retrovirus including lentivirus.
  • the present invention relates to a method for producing a pseudotyped virus further comprising a protein that is completely replaced.
  • proteins can be used, such as chimeric proteins in which the extracellular region of the viral envelope protein is replaced with other membrane proteins having an activity of adhering to cells, proteins such as adhesion factors, ligands, receptors, and antibodies or fragments thereof. It can also create vectors that target new or specific tissues.
  • a retrovirus is a virus characterized by having a (+) sense strand RNA in the genome and having a reverse transcriptase. When a target cell is infected, it converts its own RA genome into DNA by the reverse transcriptase. Is a generic term for viruses that integrate this DNA into the chromosome of the target cell.
  • the retrovirus may be a modified version of a wild-type retrovirus, wherein the RNA contained in the virus particles contains at least a part of the sequence of the genomic RNA of the reticulovirus, and the RNA is a virus particle.
  • any infectious virus particles that can be incorporated into the virus particles depending on the sequence by the action of the virus protein of the retrovirus may be used. More specifically, the genomic RNA of a retrovirus contains a packaging signal sequence required for incorporation into virus particles. By transcribing an RA having an LTR at each end and containing this signal sequence, a virus particle having this thigh is formed in the presence of a retroviral viral protein.
  • retroviruses / resectors include those derived from oncovirus.
  • Oncovirus refers to a retrovirus belonging to the subfamily Oncovirus.
  • Oncoviruses include retroviruses associated with carcinogenesis, such as sarcoma virus, leukemia virus, and breast cancer virus.
  • MoMLV Moloney Murine Leukaemia Virus
  • MoMLV is one of the earliest developed retroviral vectors and has been widely used with many improvements to date.
  • MoMLV is converted to negative strand RNA virus HA ( Or H)
  • a virus vector pseudotyped with a sialic acid binding protein such as a protein can be suitably produced according to the present invention.
  • mouse stem cell virus (Murine Stem Cell Virus; MSCV) is also preferably used as a vector for gene transfer to blood cell / hematopoietic cells, fetal stem cells, and the like.
  • MSCV modified Stem Cell Virus
  • a negative-strand RNA virus by using MSCV that has been pseudotyped using an envelope protein having a hemagglutinin activity of a negative-strand RNA virus, efficient gene transfer to bone marrow CD34-positive cells including hematopoietic stem cells can be achieved. Can be.
  • the retrovirus vector includes a vector derived from a lentivirus.
  • Lentivirus refers to a retrovirus belonging to the subfamily Lentivirus.
  • Lentiviruses include human immunodeficiency virus (HIV) (eg, HIV1 or HIV2), simian immunodeficiency virus (simian immunodeficiency virus; SIV), feline immunodeficiency virus (FIV), maedi visnavirus, ⁇ Infectious anemia virus (EIAV), goat arthritis encephalitis virus (CAEV), etc.
  • Retroviral vectors can be derived from the desired strain and subtype.
  • HIV-1 includes all major (M) subtypes (including A through J), N and outlier (0) (Hu, D.
  • SIV isolates include SIVagm, SIVcpz, SIVmac SIVmnd, SIVsnm, SIVsyk and the like.
  • a gene can be introduced into non-dividing cells of in vivo tissues and cells that seldom divide, such as stem cells of various tissues, A vector that enables long-term gene expression can be efficiently produced.
  • the lentiviruses the earliest attempt at vectorization was the Human Immunodeficiency Virus (HIV), which can be suitably applied to the method of the present invention.
  • HIV Human Immunodeficiency Virus
  • SIV Feline Immunodeficiency Virus
  • FV Feline Immunodeficiency Virus
  • CAEV Caprine Arthritis Encephalitis Virus
  • EIAV Pest infectious anemia virus
  • BIV Pest immunodeficiency virus
  • Simole Immunodeficiency Virus was found as an HIV-like virus in Sanore and forms a Primates Lentivirus group with HIV (Eiji Well, Masanori Hayami, Genes and Infections and Diseases of Simian Immunodeficiency Virus) Protogenicity, protein nucleic acid enzyme: Vol. 39, No. 8, 1994). This group is further divided into four groups: 1) HIV-1 which causes acquired immune deficiency syndrome (AIDS) in humans and HIV-1 which contains SIVcpz isolated from chimpanzees.
  • AIDS acquired immune deficiency syndrome
  • SIVagm and SIVmnd have not been reported to be pathogenic in natural hosts (Ohta, Y. et al., Int. J. Cancer, 15, 41 (1), 115-22, 1988; Miura, T. et. al., J. Med. Primatol., 18 (3-4), 255-9, 1989; Masanori Hayami, Clinical Japan, 47, 1, 1989), especially TY0-, a kind of SIVagm used in this example.
  • One strain is a natural host, It has been reported that experimental infections against Zanore Macaca facicularis and Macaca mulatta do not show any pathogenicity (Ali, M.
  • a virus vector produced based on SlVagnu is considered to be higher in safety than vectors based on HIV-1 or other lentiviruses, and as a virus produced in the present invention, It is suitable.
  • the retrovirus vector includes a vector derived from a spumavirus.
  • Spumaviruses include, for example, Foamyvirus (DE4318387; W09607749; Virology (1995) 210, 1, 167-178; J. Virol. (1996) 70, 1, 217-22).
  • a vector derived from a foamy virus can be used for introduction of a foreign gene into human cells, particularly for gene therapy and administration of a recombinant vector.
  • the retroviral vector can also modify LTR (long terminal repeat).
  • LTR is a sequence characteristic of retroviruses and is located at both ends of the viral genome.
  • the 5 'LTR acts as a promoter and promotes transcription of mRNA from provirus. Therefore, by replacing the 5 ′ LTR promoter-active portion of a vector that expresses RNA to be incorporated into a viral vector (this is referred to as a gene transfer vector in the present invention) with another strong promoter, a gene transfer vector can be obtained. It can be expected that the amount of mRNA transcribed from DNA will increase, the packaging efficiency will increase, and the vector titer will increase.
  • tat can be deleted from a vector that expresses a viral gene necessary for virus packaging (this is referred to as a packaging vector in the present invention).
  • viral RNA that infects cells and invades the cells is reverse transcribed, and then forms a circular structure in which the LTRs at both ends are bound.
  • the binding site and viral integrase work together to be integrated into the chromosome of the cell.
  • the raRNA transcribed from the provirus is from the transcription start site in the 5 'LTR to the polyA sequence of the 3' LTR, and the promoter of the 5 'LTR is not packaged in the virus. Therefore, even if the promoter is replaced, the portion inserted into the chromosome of the target cell remains unchanged.
  • the 5 ′ LTR promoter leads to creation of a vector with higher titer and higher safety. Therefore, the 5 'j promoter of the gene transfer vector can be replaced to increase the titer of the packaged vector.
  • the 3 'LTR sequence was partially deleted to create a self-inactivating vector (SIN vector), which prevents the transfer of full-length vector mRNA from target cells. It is also possible to increase sex.
  • the lentivirus provirus that has invaded the chromosome of the target cell has a form in which the U3 portion of the LTR is linked to the 5 'end. Therefore, in the gene transfer vector, U3 is located at the 5 'end in the chromosome of the target cell, and the RNA of the entire gene transfer vector is transcribed therefrom. If a lentivirus or similar protein is present in the target cells, the gene transfer vector may be repackaged and reinfected other cells.
  • the LTR promoter may cause the expression of a host-derived gene located on the 3 'side of the viral genome (Rosenberg, N., Jolicoeur, P., Retoroviral Pathogenesis. Retroviruses s. Cold Spling Harbor Laboratory Press, 475-585, 1997). This phenomenon has already been a problem in retroviral vectors, and SIN vectors have been developed as a method of evasion (Yu, SF et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 (10), 3194-8, 1986).
  • a gene transfer vector DNA having a packaging signal is transcribed in a host cell, and virus particles are formed in the presence of a gag, pol protein and an envelope protein.
  • the gene transfer vector DNA may be a DNA vector such as a plasmid, or may be integrated into chromosomal DNA of a packaging cell. It is preferable that the packaging signal sequence encoded in the gene transfer vector DNA be incorporated as long as possible so as to maintain the structure formed by this sequence, while the packaging signal sequence on the vector DNA is integrated with the packaging signal sequence.
  • g ag is necessary to minimize duplication of sequences between these vectors FUN to suppress the frequency of wild-type virus by recombination occurs between the packaging base Kuta one supplying po 1 protein is there. Therefore, in the construction of the gene transferor DNA, it is preferable to use a sequence as short as possible including a sequence necessary for packaging in order to satisfy both packaging efficiency and safety.
  • the packaging signal is not limited as long as it is packaged by the cell into which the packaging vector has been introduced, and includes a signal sequence derived from a retrovirus, a lentivirus, or an immunodeficiency virus according to the type of the packaging vector. Used.
  • the source of the signal sequence used is limited to only SIV. It is considered to be.
  • the SIV-derived gene transfer vector is also packaged. It is thought that it is possible to form vector particles by combining vector and packaging vector. In this case, a combination between primate lentiviruses (eg, HIV and SIV) is preferred.
  • the gene transfer vector DNA is preferably modified so that the gag protein is not expressed.
  • the viral gag protein is recognized as a foreign substance by the living body, and may exhibit antigenicity. It may also affect cell function. In order to prevent the expression of the gag protein, it can be modified so as to shift the frame by adding or deleting a base downstream of the start codon of gag. Further, it is preferable to delete a part of the coding region of the gag protein. In general, packaging of the virus requires the 5th side of the coding region of the gag protein. Therefore, in the gene transfer vector, it is preferable that the C-terminal side of the gag protein coding region is deleted. It is preferable to delete the gag coding region as large as possible without significantly affecting the packaging efficiency.
  • ATG start codon
  • Codons to be replaced are appropriately selected so as to have little effect on packaging efficiency.
  • Gene transfer vector DNA having a packaging signal constructed in this way is introduced into an appropriate packaging cell to produce a virus vector in which a transcript of the gene transfer vector DNA has been incorporated. Can be.
  • the produced virus vector can be recovered from the culture supernatant of the packaging cells and the like.
  • the cell used for the packaging cell is not particularly limited as long as it is a cell line generally used for virus production. Considering the use for human gene therapy, humans or monkeys are considered to be appropriate as the origin of cells.
  • Package Human cell lines that can be used as cell lines include, for example, 293 cells, 293T cells, 293E BNA cells, SW480 cells, U87MG cells, H0S cells, C8166 cells, MT-4 cells, Molt-4 cells, HeLa cells, HT1080 Cells, TE671 cells and the like.
  • Monkey-derived cell lines include, for example, C0S1 cells, C0S7 cells, CV-1 cells, BMT10 cells and the like. It is also possible to use existing packaging cells. Examples of the packaging cells include Bosc23 cells and PE501 cells.
  • the foreign gene carried by the vector is not particularly limited, and may be a nucleic acid that encodes a protein, or may be, for example, a nucleic acid that does not encode a protein such as antisense or lipozyme.
  • CD34-positive cells have pluripotency in colony assays using a medium containing methylcellulose (Kirshenbaum, AS et al., J.
  • CD34-positive cells Transplantation of CD34-positive cells into NOD I SCID mice, which are immunodeficient strains, engraft the mouse bone marrow and reconstitute the hematopoietic system (Larochelle, A. et al., Nat. Med., 2 (12), 1329-37, 1996), and it is thought that at least CD34-positive cell fractions contain cells that are very immature and close to stem cells. In addition, hematopoietic stem cells in CD34-positive cells are in a non-dividing state.
  • the present invention relates to a method for producing a vector for gene transfer into hematopoietic or hematopoietic cells by the method for producing a virus of the present invention.
  • a method of introducing a gene into a hematopoietic or hematopoietic cell including a step of contacting the cell with a hematopoietic or hematopoietic cell, and a method of the present invention for introducing a gene into a hematopoietic or hematopoietic cell.
  • Evaluation of foreign gene transfer to hematopoietic and hematopoietic cells can be performed, for example, by flow cytometry using antibodies against various known surface antigens'. According analysis and colony Atsu Si, it is possible to verify the like hematopoietic reconstruction performed by transplanting hematopoietic cells such as mice that destroyed hematopoietic system.
  • Letoorchial virus vectors pseudotyped with a protein having cyanoleic acid-binding activity can transduce blood cells and hematopoietic cells at a high rate, so ADA deficiency (Blaese, RM, Pediatr. Res. , 33 (1 Suppl), S49-53, 199 3), hemophilia (Kay, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (18), 997 3-5, 1999), and It is useful in gene therapy for blood cells such as Fanconi anemia. Administration can be performed, for example, by an ex vivo method.
  • gene therapy for a hematopoietic cell line to which the vector produced by the method of the present invention can be applied for example, to protect stem cells when a tumor is treated with a chemical anticancer drug
  • drug resistance gene MDR1 Liu, T. et al., Gene Ther. (2000) 7, 4, 348-58
  • introduction of normal FANCC gene for Fanco-anemia Liu, JM et al.
  • Introduction of a combination of cytoforces thrombopoetin, interleukins 6 and 11, and Fit-3 ligand
  • IL-6 superagonist used for proliferation of hematopoietic progenitor cells (W096 / 18648), Factor used for treatment of blood diseases -X (J. Cell. Bioche. (1995) Suppl. 21A, 410), a stem cell factor used to expand human hematopoietic progenitor cells, IL-6, and a soluble IL-6 receptor complex (Gene Ther. (1995) 2, 9, 694), gene transfer such as ribozyme targeting RA virus and antisense and / or RNA decoy (W096 / 22368) useful for protection against HIV infection and intracellular immunity.
  • Can be The present invention relates to a method for producing a virus vector which encodes any one of these or a combination thereof and which comprises a sialic acid-binding membrane protein in an envelope.
  • the vector produced by the method of the present invention has a high ability to infect cells having mucus, such as nasal mucosal epithelial cells and lung bronchial mucosal epithelial cells.
  • Mucosal cells such as tracheal epithelium are difficult to transfect with conventional viral vectors, and have been treated to remove physical obstacles during transfection.
  • genes using VSV-G pseudo-type HIV vectors Sufficient transduction effects have not been observed unless they are damaged by sulfur dioxide (LG Johnson et al., Gene Therapy, 7, 568-574, 2000).
  • Vectors produced by the method of the present invention have conventionally been difficult to introduce genes. T JP2003 / 011299
  • the present invention relates to a method for producing a gene transfer vector into cells having mucus by the method for producing a virus of the present invention.
  • the present invention also provides a method for introducing a gene into a cell having mucus, the method including a step of contacting the vector produced by the method of the present invention with a cell having mucus, and a method for introducing a gene into a cell having mucus.
  • Cells having mucus include mucosal epithelial cells, specifically, for example, mucosal epithelial cells of the nasal cavity or bronchi of the lung.
  • the method for producing a recombinant retrovirus vector according to the present invention includes, for example, (a) a membrane protein that transcribes genomic RNA of a retrovirus and has a gag protein, a pol protein, and a sialic acid binding activity. And (b) culturing the cells in the presence of gram-positive bacteria-derived neuraminidase, and collecting the produced virus.
  • Retroviral genomic RA can be modified from the genome of a wild-type virus as long as it has the function of being packaged in virions and integrated into the chromosome of the target cell.For example, it has LTRs at both ends and is packaged internally. RA containing a signaling signal sequence.
  • the desired gene can be incorporated into the genomic RNA. Incorporation
  • the foreign gene obtained can be expressed by the LTR promoter activity, or may be expressed by incorporating another promoter inside the genome.
  • the gag and pol proteins and genomic RNA expressed in virus-producing cells may be derived from different viruses as long as they are assembled to form a virus.
  • SIV genomic RNA can be packaged using packaging cells that express HIV-derived viral proteins.
  • the packaging cell is caused to temporarily or continuously express a membrane protein having sialic acid binding activity.
  • a retrovirus having a membrane protein having sialic acid binding activity as an envelope is released into the culture solution.
  • the produced virus can be obtained.
  • a retroviral vector according to the present invention can be performed as follows.
  • the specific examples of the method for producing a virus vector described below are merely examples, and those skilled in the art can appropriately change them.
  • the gene encoding the protein is expressed in pCAGGS (Niwa, H. et al., Gene: 108, 193- 200, 1991) to construct an expression vector.
  • pCAGGS Niwa, H. et al., Gene: 108, 193- 200, 1991
  • a gene encoding the HA (or HN) protein, F protein, or M protein of a negative-strand RNA virus such as influenza virus or Sendai virus
  • H1N1 -derived hemagglutinin protein
  • plasmid pDREF HisD Microbiol.
  • Immunol., 44 (8), 677-685, 2000 may be used as a template. Amplify the 0RF of the protein by PCR using the appropriate primer pair. After the amplified fragment is digested with Notl, it is inserted into the Notl site of the vector obtained by adding an Xhol-Notl site to pCAGGS. This yields the HA protein expression plasmid pCAGGS-HA (W001 / 92508). .
  • a plasmid expressing the envelope protein of Sendai virus for example, a full-length genomic DNA of Sendai virus Z strain pSeV18 + b (+) (Hasan, MK et al., 1997, J.
  • human embryonic kidney cell-derived cell line 293T cells may be used as virus-producing cells. It can. 293T cells are cultured, for example, in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, GibcoBRL) containing 10% immobilized fetal calf serum. Transfection of a DNA vector can be performed using LIPOFECTAMINE PLUS (GibcoBRL) or the like according to the attached instructions.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • LIPOFECTAMINE PLUS GibcoBRL
  • 293T cells were plated at a cell density plastic plate to IX 10 6 cells per 1 Uweru 6 Uweru, (37, 10% carbon dioxide gas presence) carbon dioxide incubator beta in one to 48 hours at . 30 minutes before the transfection, replace the medium with D-MEM (GibcoBRL) containing 800 ⁇ l / ml of 1% serum albumin (GibcoBRL) and continue the culture.
  • D-MEM GibcoBRL
  • SibcoBRL serum albumin
  • the gene transfer vector is not particularly limited.
  • MSCV Murine Stem Cell Virus
  • CL0NTECH RG Hawley et al., Proc. Natl. Acad. Scad. USA 93: 10297-10302
  • a desired gene to be expressed is incorporated and used.
  • the amount of DNA to be used for transfection is, for example, 700 ng of gene transfer vector and 300 ng of packaging vector (pCL-Eco, pCL-Ampho (MuLV 4070A), IMGENE X) (Naviaux RK et al., J. Virol.
  • DNA 100 1 After dissolving in OptiMEM, add 6 ⁇ l of PLUS reagent (GibcoBRL), stir, and allow to stand at room temperature for 15 minutes. To a mixture of DNA and PLUS reagent (GibcoBRL), add 4 ⁇ l of LIPOFECTAMINE diluted with lOO ju 1 OptiMEM, stir and let stand at room temperature for another 15 minutes.
  • PLUS reagent GibcoBRL
  • LIPOFECTAMINE diluted with lOO ju 1 OptiMEM
  • the solution containing the complex of DNA and LIPOFECTAMINE prepared by the above method was dropped into 293T cells cultured in a 6-well plate, stirred gently, and then placed in a carbon dioxide incubator ( 37 ° C , ⁇ % carbon dioxide). (In the presence of gas) for 3 hours. After the culture, add 1 ml of 1% serum albumin (GibcoBRL) / DMEM (GibcoBRL) containing trypsin (GibcoBRL) at a concentration of 15 g / ml per 1 ml of culture, and place in a carbon dioxide incubator.
  • a carbon dioxide incubator 37 ° C , ⁇ % carbon dioxide
  • neuraminidase derived from Gram-positive bacteria for example, NA derived from actinomycetes, specifically, NA derived from M. viridifaciens can be used. The dose of NA can be adjusted appropriately.
  • retroviruses pseudotyped with the enbe mouth protein having the hemagglutinin activity of the negative-strand RNA virus have a high ability to infect cells having mucus such as lung bronchial mucosal epithelial cells.
  • the vector thus produced is useful for gene transfer into cells having mucus.
  • this viral vector is useful for gene transfer into hematopoietic cells, as it has the ability to introduce genes into both human bone marrow CD34 + cells and CD34- cells.
  • a pseudo-type retroviral vector based on Moloney murine sarcoma virus is also preferably produced in the present invention.
  • a vector further containing VSV-G as an envelope protein is prepared.
  • pMSCV EGFP as described above, or LTR derived from Moroni murine sarcoma virus (Moloney murine sarcoma virus) can be used as a gene transfer vector.
  • PLZRNL expressing lacZ under control (Yee, J.-K. et al., Methods In Cell Biology, vol. 43, pp. 99-112 (1994); Xu, L. et al., Virology 171, 331 -341 (1989)), it is possible to produce retrovirus vectors pseudotyped with various envelope proteins as shown below.
  • 293T cells human embryonic kidney-derived cell line
  • DMEM high glucose Gibco BRL
  • BIO WHITTAKER 10% inactivated pup serum
  • the D MEM added with 1 Ueru per Ri 1% ⁇ shea serum Arupumin and 15 mu g / ml of trypsin 1ml (Gibco BRL), 37 ° (:, in 10% C0 2, 24 hours of culture, then 1 Weru Change the medium to DMEM containing 2 ml of 1% serum albumin, 5; ug / ml trypsin (Gibco BRL) and 0.01 unit of neuraminidase from Gram-positive bacteria (for example, actinomycetes), and culture for 24 hours.
  • the culture supernatant is collected and filtered through a 0.45 m filter to obtain a vector solution, and the present invention is particularly preferably applied to the production of a lentiviral vector.
  • a method for producing a lentiviral vector will be described.
  • the SIVagm TY0-1 strain which is a clone of a non-pathogenic African green monkey immunodeficiency virus, can be used.
  • Plasmids incorporating SIVagm TY0-1 include, for example, pSA212 (J. Viol., Vol. 64, pp. 307-312, 199
  • the gene transfer vector that supplies the RNA packaged in the vector is constructed by incorporating the LTR sequences at both ends of the genome, SD, ⁇ , and RRE. Further, the 5 'LTR promoter region of the gene transfer vector may be replaced with a foreign promoter. In addition, a 3 ′ LTR sequence was partially deleted, a Self Inactivating Vector (SIN vector) was prepared to prevent the full-length vector mRNA from being transcribed from target cells, and a CMV promoter was inserted as a promoter, for example. The desired foreign gene is inserted downstream of the gene.
  • SI vector Self Inactivating Vector
  • a V SV-G expression vector can be used as a shell protein supply vector for forming pseudotype vector particles.
  • pVSV-G which has been proven in pseudotyped retroviral vectors and HIV vectors, may be used (Burns, JC (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037).
  • a DNA fragment corresponding to the region (5337-5770) containing the first exon of vif and tatI rev is obtained by PCR using an appropriate primer pair and PSA212 as a template.
  • an EcoRI site which is a restriction enzyme site
  • a fragment having an EcoRI site at the 3 'end of the DNA fragment is regulated.
  • the DNA fragment obtained as described above and the DNA fragment encoding the gag / pol region are ligated to the XhoI-EcoRI site of pBluescript KS + (Stratagene).
  • Rev responsive element (RRE) and the tat / region 9 6 4 including a second Ekuson of rev - a DNA fragment corresponding to 79 93) is amplified by PCR.
  • a Notl site is added to the 3 'end by PCR, followed by digestion with EcoRI and Notl, purification, and integration into the EcoRI-Notl site of pBluescript KS + incorporating gag-tatI rev.
  • the splicing donor (SD) site synthesizes a DNA fragment containing this sequence, adds an Xhol site at the 5 'end and a Sail site at the 3' end during synthesis, and combines the above gag-RRE-tat / rev. Incorporate into the Xhol site of the incorporated pBluescript KS +.
  • the obtained plasmid is digested with Xhol and Notl, and a fragment containing SD-gag-RRE-tatI rev is purified.
  • a plasmid was prepared in which the Xhol / Notl linker was incorporated at the EcoRI site of pCAGGS (Gene, vol. 108, pp.
  • the plasmid obtained by the above method is used as a packaging vector pCAGGS I SIVagm gag-tat I rev (W001 / 92508).
  • pCMV ⁇ (Clontech ) -Derived Notl fragment containing the ⁇ -galactosidase gene was inserted into the Notl site, cut with Kpnl-Sacl to cut out the DNA fragment containing the 5 'LTR to 3' LTR, and Kpnl-Sacl of the pGL3 Control vector (Promega). Integrate into the site, and use the gene transfer vector pGL3C / 5, LTR. U3G2 / RR Ec / s / CMVF] 3-galI WT3 'LTR.
  • appropriate primers include a CMV promoter region derived from pEGFPC2 (Clontech) and a region encoding EGFP (1-1330, a SacII site at the 5 'end, a Notl site, a BamHI site, and a translation stop codon at the 3' end). Amplify from paired PC using PEGFPC2 as template. The four PCR fragments were digested with restriction enzymes Kpnl and EcoRI, EcoRI and SacII, BamHI and Sacl, SacII and BamH, and purified, and 5 'LTR ⁇ RRE ⁇ CMV promoter between pBluescript KS + Kpnl-Sacl.
  • Ligation is performed in the order of EGFP ⁇ 3 ′ LTR and incorporated (pBS / 5 ′ LTR. U3G2 / RREc / s / CMVFEGFP / WT3 ′ LTR). Plasmid pBS / 5 'LTR. U3G2 / RREc / s / CMVFEGFP / WT3' LTR is cut with Kpnl-Sacl to prepare a DNA fragment containing 5 'LTR-3' LTR, and pGL 3 Control (Promega) vector Into the Kpnl-Sacl site of E. coli to construct a vector (pGL3C / 5 'LTR. U3G2 / RREc / s / CMVFEGFP / WT3' LTR).
  • a fragment containing the gag region (9039-9170 + 1-982) from the downstream of the TATA box of the 5 'LTR is amplified by PCR using PSA212 as a template with an appropriate primer pair.
  • the CMV L promoter derived from cytomegalovirus (1-721 from pCI (Promega)) is amplified by PCR.
  • a fragment containing the downstream of the TATA box of the 5 'LTR and a fragment containing the promoter were mixed, and using this as a template, PCR was performed using the 5' primer of the promoter and the 3 'primer of the LTR to perform PCR. 5, Chimera promoter with LTR Obtain one DNA fragment.
  • a DNA fragment containing the 3 'LTR U3 region 5'-side 27bp and the 3'-side 15bp and R region is amplified by PCR using PSA212 as a template with an appropriate primer pair.
  • This fragment is inserted into the SalI-Sacl site of the chimeric promoter-introduced gene transfer vector-pGL3C / CMV L.U3G2 / RREc / s / CMVF ⁇ -gal / WT3, LTR obtained in the previous section (pGL3C / CMVL. U3G 2 / RREc / s / CMVF j3 -gal / 3 'LTR ⁇ 3).
  • 293T cells were seeded at 5 X 10 5 cells per Uweru to plastic culture plates 6 Ueru and culture at 37 ° C, 10% C0 2 48 hours. Replace the culture medium with 800 ⁇ l per well of OptiMEM (1 ° / HA when HA is used, including BSA) and use it for transfection.
  • 293T cells were seeded at 5 X 10 5 cells per Ueru to 6 weblog ⁇ / plastic culture plates and culture at 37 ° C, 10% C0 2 48 hours.
  • the culture medium was removed from the culture, a material obtained by adding Poripuren (Sigma) to the vector solution at a final concentration of 8 mu ⁇ / ml and lml layer, and 3 hours culture at 37 ° C, 10% C0 2 , are infected vector . After 3 hours, add 1 ml of culture solution, and after 1 day, replace the culture solution.
  • Vector titration is calculated by the number of cells transfected with 1 ml of vector solution.
  • the 293T cells are spread on a 6-well culture plate with a 1 ⁇ 10 6 I plate and cultured for 48-72 hours.
  • a solid solution diluted stepwise by the same method as described above is infected, and X-gal staining is performed 48 hours after infection.
  • Microscope at 200x magnification with an optical microscope for example, counting the number of transfected cells in the field of view, obtaining the average of three fields, and multiplying by the coefficient 854.865 based on the area of the field and the area of the plate Is calculated.
  • the unit of the virus vector titer calculated by this is Transducing Unit P2003 / 011299
  • the SIVagm vector thus produced has high gene transfer ability to cultured cells and cells inside and outside the living body.
  • the probability of reconstitution of a wild-type virus in the packaging of a vector by cotransfection of multiple independent plasmids such as the gene transfer vector, packaging vector, and envelope expression vector as described above Is considered very low.
  • the base SIVagmTY0_l does not show pathogenicity in both natural and experimental infections (Ohta, Y. et al., Int. J. Cancer 41, 115- 22, 1988; Miura, T. et al., J. Med. Primatol. 18 (3-4), 255-9. 1989; Hon jo, S. et al., J. Med. Primatol.
  • lentiviruses generally have high species specificity and tend to have low pathogenicity in other species of animals (Novieri, FJ et al., J. Virol. 71 (5), 4086-91, 1997). Therefore, the safety of the vector is considered to be high.
  • the RNA encoding the viral protein is not packaged in the particle because the packaging signal sequence is deleted from the packaging vector during the construction process.
  • the rev protein binds to RRE, transports RNA to the cytoplasm, suppresses splicing, and expresses viral proteins and incorporates full-length RNA into the virus.
  • RRE binds to both the gene transfer gene and the gene transfer vector, it is considered that the raRNA splicing of the packaging vector is controlled, and all genes can be expressed.
  • the mRNA of the gene transfer vector may be transported to the cytoplasm and packaged in vector particles. V and vpr IX may have been removed by the HIV-1 vector (Dull, T. et al., J. Virol.
  • vpr is also thought to play a role in infecting non-dividing cells (Heinzinger, NK et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US A 91 (15), 7311-5, 1994), it has been reported that cells that can be transfected with HIV-1 vectors differ depending on the presence or absence of vpr (Kim, VN et al., J. Virol. 72 (1), 811-6. 1998). In the above, nef completely removed from the packaging vector was reported to be one of the causes of SIV-induced immunodeficiency in infection experiments using monkeys (von Gegerfelt, AS et al., J. Biol.
  • Lentivirus-based vectors are expected to have the ability to introduce genes into cultured cells and neurons that have undergone cell cycle arrest, since the base virus is infectious for non-dividing cells.
  • the infection tropism is not limited to CD4 and chemokine receptor-positive cells unlike the base SIV. It is known that the receptor for VSV-G is phosphatidylserine, a type of phospholipid, and this molecule is present on various cells (Schlegel, R.
  • the infection tropism of the SIVag m vector that has been pseudotyped with VSV-G is very broad. It is expected that the gene transfer to almost all animal cells will be possible with high efficiency by producing a virus pseudotyped with a membrane protein having sialic acid binding activity based on this vector.
  • the amount of transfection of the plasmid vector into cells during the production of the virus vector can be adjusted as appropriate. For example, if you are not restricted to this P2003 / 011299
  • 293T cells human embryonic kidney-derived cell line
  • DMEM high glucose Gibco BRL
  • BIO WHITTAK ER 10% inactivated fetal ⁇ Shi serum
  • 293T cells were seeded at 5 X 10 5 cells per Ueru to plastic culture plates 6 Ueru and culture at 37 ° C, 10% C0 2 48 hours. The culture solution is replaced with DMEM containing 1% serum albumin at 800 H1 per well and used for transfection.
  • Gene transfer vector per gel (pGL3C / CMVL.U3G2 / RREc / s / CMVF EGFP / 3LTR ⁇ U3 or pGL3C / CMVL.U3G2 / RREc / s / CMVF ⁇ -gal / 3LTR ⁇ U3) 1200 ng, No.
  • pCAGGS I SIVagm gag-tat I rev 120 ng of VSV-G expression plasmid pVSV-G (Clontech) expressing the envelope protein, 120 ng of negative strand RNA virus (or HN), F And 240mg each of M protein expression plasmid (in pCAGGS), dissolve in 100 il OptiMEM, add 6 / i 1 PLUS Reagent (Gibco BRL), stir, and leave at room temperature for 15 minutes .
  • the large-scale preparation and concentration of the vector are performed, for example, as follows. For example , 293T cells were seeded at 5 X 10 6 cells per one to a plastic petri dish of 15cm, for 48 hours culture at 37 ° C, 1 0% C0 2. Replace the culture solution with DMEM containing 10 ml per well of 1% serum albumin for use in transfection.
  • lentiviral vectors pseudotyped with the influenza virus HA protein can be enriched.
  • concentration can be performed, for example, as follows. 2 93T cells were seeded at 5 X 10 6 cells per one to a plastic petri dish of 15cm, for 48 hours culture at 37 ° C, 10% C 0 2. The culture solution was replaced with DMEM containing 10% of 1% serum albumin per petri dish and used for transfection.
  • Gene transfer vector per dish (pGL3C / CMVL.U3G2 / RREc / s / CMVF LacZ / 3LTR ⁇ U3) 8 ⁇ g, knocking vector (pCAGGS / SIVagm gag-tat / rev) 2.4 ⁇ g, Influenza HA protein expression plasmid pCAGGS-HA 1.6 g was dissolved in 1.5 ml of OptiMEM (Gibco BRL). After dissolution, add 401 PLUS Reagent (Gibco BRL), stir, and leave at room temperature for 15 minutes.Add 1.51 LIPOFECTAMINE (Gibco BRL) diluted with 1.5 ml of OptiMEM to this, and stir.
  • influenza virus After culturing for 24 hours, collect the culture supernatant, filter through a 0.45 wni filter, 16 000 X g (Beckraan J-251 JA-18), and centrifuge at 4 ° C for 1 hour. % FCS 2 / xg / ml polypropylene) and store at -80 ° C.
  • Use of influenza virus enables gene transfer without co-expression of other envelope proteins such as VSV-G HA side-type vectors can be highly concentrated by centrifugation.
  • 293T cells human fetal kidney-derived cell line
  • DMEM high glucose Gibco BRL
  • BIO WHITTAKER 10% non-active sera
  • knocking vector pCAGGS / SIVagm gag-tat / rev
  • DMEM was added containing 1% ⁇ shea serum Arupumin and lO ⁇ ig / ml trypsin per Ueru 1 ml (Gibco BRL), after 37 ° C, 10% C0 2 at 16 to 24 hours Cal Chiya one, 1 Uweru Change the medium to DMEM containing 2 ml of 1% serum albumin and 5 ⁇ / ⁇ 1 of trypsin (Gibco BRL), and culture for 24 hours.
  • the vector produced by the method of the present invention can be purified by a known virus purification method.
  • the purification can be performed by the above-described centrifugation, or a known purification / separation method including filtration, adsorption, and column purification, or a combination thereof.
  • a substantially pure virus vector containing a membrane protein having sialic acid binding activity can be obtained.
  • a substantially pure viral vector means that the viral vector is substantially free of other viral vectors capable of introducing a nucleic acid into a cell.
  • the substantially pure virus vector is free of cell debris and other impurities of virus producing cells.
  • the viral vector produced by the method of the present invention can be suitably combined with a pharmaceutically acceptable carrier or medium to give a fibrous composition.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or medium is a material that can be administered with a vector and does not significantly inhibit gene transfer by the vector.
  • it is conceivable to formulate a drug by appropriately combining sterilized water, physiological saline, culture solution, serum, phosphate buffered saline (PBS) and the like.
  • PBS phosphate buffered saline
  • a stabilizer, a biocide, and the like may be contained.
  • the compositions of the present invention may be in the form of aqueous solutions, capsules, suspensions, syrups and the like.
  • composition containing the viral vector produced by the method of the present invention is useful as a reagent or a medicament.
  • the composition is useful, for example, as an in vitro or in vivo gene transfer reagent for various cells, or as a drug for gene therapy in Etasbipo or in vivo.
  • Administration to patients is generally performed by a method known to those skilled in the art, such as, for example, intra-arterial injection, intravenous injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, enteral administration, oral administration, intranasal administration, etas vivo administration, and the like. Can do it.
  • administration to the nasal cavity or bronchial mucosa and ex vivo administration to hemocytes and hematopoietic cells are preferable.
  • the dose of the vector varies depending on the disease, patient weight, age, gender, symptom, administration purpose, form of administration composition, administration method, transgene, etc., but can be appropriately determined by those skilled in the art. is there.
  • the virus vector produced by the method of the present invention can be applied to gene therapy for various genetic diseases.
  • the target disease is not particularly limited.
  • the target diseases and their single causative genes include 3] -celebral ostidase (chromosome 20) in Gaucher disease, blood coagulation factor 8 (X chromosome) and hemophilia. ⁇ Blood coagulation factor 9 (X chromosome), adenosine deaminase in adenosine deaminase deficiency, phenoalanine hydroxylase (chromosome 12) in phenol ketonuria, Duchenne muscular dystrophy Dystrophin (X chromosome), LDL receptor (chromosome 19) in familial hypercholesterolemia, and integration of CFTR gene into chromosome in cystic fibrosis.
  • Target diseases in which a plurality of other genes are thought to be involved include neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease, ischemic encephalopathy, and dementia. Intractable infectious diseases such as baldness and AIDS are considered.
  • Hematopoietic stem cells of an AIDS patient are extracted extracellularly, and a vector produced by the SIV-based method of the present invention is introduced in vitro, and genomic transcription derived from SIV becomes dominant before HIV infection occurs, and the patient's There are potential treatments to return to the body and disable HIV transcription factors.
  • VEGF and FGF2 genes in ischemic heart disease and cell growth-related genes such as cell growth factors (PDGF, TGF-j8, etc.) and Cycl in- Application to suppression of expression of dependent kinase etc. becomes possible.
  • the BDNF gene may be a candidate.
  • this method can be used for replacement therapy that incorporates genes such as p53, a tumor suppressor gene whose mutation causes cancer, into a chromosome, and after introducing multidrug resistance genes into bone marrow-derived hematopoietic stem cells in vitro, By reverting to, treatment beyond the limits of cancer drug treatment is possible.
  • T cell receptor For gene therapy of autoimmune diseases such as multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, SLE, glomerulonephritis, etc., T cell receptor, various adhesion factors (eg, ICAM-1, LFA-1, VCAM-1, LFA- 4)), antisense expression of cytokines and cytokine receptors (eg, TNF, IL-8, IL-6, IL-1 etc.), cell growth factors (eg, PDGF, TGF- ⁇ , etc.), and agonists (eg, ⁇ , etc.) Can be applied to suppress expression.
  • cytokines and cytokine receptors eg, TNF, IL-8, IL-6, IL-1 etc.
  • cell growth factors eg, PDGF, TGF- ⁇ , etc.
  • agonists eg, ⁇ , etc.
  • a treatment can be considered in which a foreign gene is introduced into the chromosome of a human ES cell to compensate for a gene deficient at the embryonic stage, thereby replenishing the deficiency of systemic enzymes and growth factors.
  • IL-4 promotes the differentiation of helper T lymphocytes into Th2 lymphocytes.
  • Th2 lymphocytes secrete cytoin which mediates asthma inflammation, such as IL-4, IL-5, IL-9 and IL-13.
  • IL-4 is one of the molecules that induce mucus secretion from the pulmonary mucus membrane involved in respiratory disorders.
  • IL-4 is a cell adhesion molecule that interacts with the VLA4 molecule on the surface of eosinophils. Regulates the expression of VCAM-1. This interaction allows eosinophils to migrate from the blood to inflammatory sites in lung tissue.
  • IL-4 induces B cell expansion and the production of antigen-specific IgE required to trigger allergic reactions.
  • Antigen-specific IgE causes mast cells to release inflammatory mediators such as histamine and leukotriene, which cause bronchoconstriction. Because of the role of IL-4, vectors expressing soluble interleukin 4 (IL-4) receptor in asthma patients are also useful.
  • FIG. 1 is a photograph showing gene transfer by Inores produced using NA derived from Micromonospora viridifaciens (NA on the right).
  • NA Micromonospora viridifaciens
  • a virus was similarly produced using NA derived from Vibrio cholerae, and the gene was introduced using the same amount of culture supernatant of virus-producing cells (vcNA on the left).
  • FIG. 2 is a photograph showing the titer of virus when the NA from Vibrio a3 ⁇ 4a / erae was produced using different doses. Gene transfer was performed under the same conditions using the same amount of culture supernatant of virus-producing cells. The numbers above each panel indicate the amount of neuraminidase added (unit). BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Example 1 Preparation of influenza virus envelope-type SIV vector using NA derived from gram-positive bacteria
  • 293T cells human embryonic kidney-derived cell line (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, pp. 8392-8396, 1993) were cultured at 37 ° C., 10% 0) 2 using DMEM high glucose (Gibco BRL) containing 10% inactivated pup serum (BIO WHITTAKER).
  • 293T cells were seeded at 5 X 10 5 cells per Ueru to 6 weblog ⁇ / plastic force Norechiya first plate of at 37 ° C 10% C0 2 for 48 hours culture.
  • the culture solution was replaced with DMEM containing 800 1% serum albumin per well and used for transfection.
  • 293T cells that is targeted to the plastic culture plates 6 Ueru seeded at 1 X 10 6 cells per Ueru were cultured at 37 ° C, 10% C0 2 48 hours.
  • the culture solution was removed from the culture plate, and 1 ml of a vector solution supplemented with polyprene (Sigma) at a final concentration of 8 zg / ml was overlaid.
  • C 10% C0 incubated for 2 3 hours, were infected with the vector. After 3 hours, add 1 ml of culture containing 20% inactivated pup serum (BIO WHITTAKER). It was added and incubated at 37 ° C, 10% C0 2 48 ⁇ 72 hours.
  • Vector titration was calculated by the number of cells transfected with 1 ml of vector solution. Infect 1 ml of vector solution by the above method. 72 hours after infection, examine the cells with a fluorescent inverted microscope (DMIRB (SLR), Leica) at a magnification of 200 times, and see the transfected cells (GFP-positive cells) The number was measured, the average of the three visual fields was obtained, and the titer was calculated by multiplying by the coefficient 854.865 obtained from the area of the visual field and the area of the plate. The unit of the titer was expressed as Transducing Unit (TU) / ml.
  • TU Transducing Unit
  • a novel method for producing a viral vector containing a membrane protein having sialic acid binding activity in an envelope using neuraminidase derived from Gram-positive bacteria. Since the neuraminidase derived from Gram-positive bacteria is inexpensive and can produce a high titer of virus even at a low dose, the method of the present invention is excellent in cost performance in industrial mass production of virus.
  • the manufactured vector is suitably used in clinical settings such as gene therapy.

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Abstract

　本発明は、シアル酸結合活性を有する膜蛋白質をエンベロープに含むウイルスベクターをグラム陽性菌由来ノイラミニダーゼ(NA)を用いて製造する方法を提供する。この方法は、グラム陽性菌由来NAの存在下で該ウイルスベクター産生細胞を培養し、産生されたウイルスを回収する工程を含む。本発明の方法により、高いコストパフォーマンスで高力価のウイルスを製造することができる。製造されるウイルスベクターは、造血幹細胞を含む血球系・造血系細胞、および粘膜上皮細胞を含む粘液を有する細胞などの、従来では遺伝子導入が困難であった細胞に対して高率で遺伝子を導入する能力を持つことから、遺伝子治療用ベクターとして有用である。

Description

シアル酸結合活性を有する膜蛋白質をエンベロープに含むウィルスベクターを グラム陽性菌由来ノイラミュダーゼを用いて製造する方法 技術分野
本発明は、 グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼを用いて、 シアル酸結合活性を 有する膜蛋白質をエンベロープに含むウィルスベクターを製造する方法に関する
背景技術
ほとんどの細胞表面には、 シアル酸を含む糖蛋白質が存在している。 ある種の ウィルスは、 このシアル酸と結合する蛋白質をウィルスのエンベロープに有して おり、 ウィルス粒子の細胞への吸着に機能している。 例えば、 インフルエンザゥ ィルスは、 エンベロープ蛋白質の 1つであるへマグルチニン （hemagglutinin; HA ) を介して細胞の表面に存在するシアル酸に結合する。 しかしながら、 ウィルス 複製過程において出芽の際には宿主細胞表面のシアル酸との結合を切断する必要 があり、 そのためにィンフノレェンザゥイノレスのノイラミ -ダーゼ (neuraminidase ； NA) が大きな役割を果たしている。 また、 NAは自己凝集の阻止にも働いている ことが報告されている （Compans, R. W. et al.， 1969, J. Virol. 4： 528-534； Palese, P. et al. , 1974, Virology 61： 397 - 410; Griffin, J. A. et al.， 198 3， Virology 125： 324—334; Liu, C. et al.， 1995, J. Virol. 69： 1099-1106)
HA蛋白質の性質を利用して、 遺伝子導入能を改良した HAシユードタイプィ匕ウイ ルスの作製も試みられている。 この場合、 ノィラミニダーゼが存在しないと、 低 い力価のウィルスしか産生させることができない （Hatziioannou, T.， et al. , 1 998, J. Virol. 72 ： 5313-5317) 。 ベクターの生産系に外来的に NAを供給するこ とにより、 HA蛋白質のビリオンへの取り込みを促進し、 力価も上昇させることが できる （Dong, J. , et al. , 1992， J. Virol. 66 : 7374-7382 ; Negre, D.， et al . , 2000, Gene Ther. 7： 1613—1623 ; Morse, K. M.， et al. , 2002, The America n Society of Gene Therapy' s 5th Annual Meeting; 国際公開番号第 W001/92508 号） 。 しかしながら、 これまでに用いられている精製 NAで産生される HAシユード タイプィ匕ウィルスの力価は満足できるものではない。 発明の開示
本発明は、 グラム陽性菌由来ノィラミニダーゼを用いて、 シアル酸結合活性を 有する膜蛋白質をエンベロープに含むウィルスベクターを製造する方法を提供す ることを課題とする。 これまで HAシユードタイプィ匕ウィルスの産生などにおいては、 グラム陰性菌に 属するビブリオコレラ菌 （ Vibrio cholerae) 由来の NAがしばしば用いられてきた 。 し力 しながら、 ビブリオコレラ菌由来 NAを用いて産生されるベクターの力価は 低く、 また、 コストの面においてベクターを工業的に大量生産することは困難で あった。 本発明者らは、 シアル酸結合活性を有する膜蛋白質をエンベロープに含 むウィルスベクターを高力価で、 しかもより安価に製造する技術を開発するため 、 ウィルス生産に用いることができる新しレ、 NAの探索を行った。 その結果、 ダラ ム陽 1·生菌由来の NAを用いることにより、 ビブリオコレラ菌由来 NAに比べ有意に高 い力価のウィルスを産生させることに成功した。 グラム陽性菌由来の NAを用いる ことにより、 シユードタイプ化ベクターの工業的な大量生産が効率的かつ経済的 に実施可能となる。
すなわち本発明は、 グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼを用いて、 シアル酸結 合活 1·生を有する膜蛋白質をエンベロープに含むウィルスベクターを製造する方法 に関し、 より具体的には、
( 1 ) シアル酸結合活性を有する膜蛋白質を含むウィルスベクターの製造方法で あって、 グラム陽性菌由来ノィラミニダーゼの存在下で該ウィルスベクタ一産生 細胞を培養し、 産生されたウィルスを回収する工程を含む方法、
(2) グラム陽性菌が放線菌である、 （1) に記載の方法、
(3) 放線菌が、 ミクロモノスポラ科 (licro議 osporacea ) に属する放線菌で ある、 （2) に記載の方法、
(4) ミクロモノスポラ科に属する放線菌が、 ミクロモノスポラ ·ピリディファ シェンス (ficromoriospora viridifaciens) である、 (3) に el载の方 、
(5) ウィルスベクターが、 レトロウィルスベクターである、 (1) から (4) のいずれかに記載の方法、
(6) レトロウィルスベクターが、 レンチウィルスベクターである、 (5) に記 載の方法、
(7) シアル酸結合活性を有する膜蛋白質が、 一本鎖ネガティブ鎖 RNAウィル スのエンベロープ蛋白質である、 （1) から （6) のいずれかに記載の方法、
(8) 一本鎖ネガティブ鎖 RN Aウィルスが、 パラミクソウィルス科 Paramyxov iridae) またはオルトミクソウィルス科 （ Orthomyxoviridae) に属するウィルス である、 （7) に記載の方法、
(9) シアル酸結合活性を有する膜蛋白質が、 インフルエンザウイルスの H A蛋 白質である、 （1) から （6) のいずれかに記載の方法、
(10) (1) から （9) のいずれかに記載の方法により製造されたウィルス、 に関する。 本発明は、 シアル酸結合活性を有する膜蛋白質をェンベロープに含むゥィルス ベクターを製造する方法を提供する。 本発明において 「ウィルスベクタ一」 とは 、 宿主内に核酸分子を導入する能力を有するウィルス粒子またはそれと同等の感 染性微粒子を指す。 本発明の方法は、 ウイノレスベクター産生細胞をグラム陽†生菌 由来ノィラミニダーゼの存在下で培養し、 産生されたウィルスを回収する工程を 含む方法である。 グラム陽性菌由来ノィラミニダーゼを用いることにより、 ウイ ルス産生細胞から回収されるウィルス量を有意に増大させることが可能となる。 グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼは、 好ましくは放線菌由来である。 本発明の 方法は、 細胞膜由来のエンベロープを有する所望のウィルスベクターの製造にお いて適用することができる。 本発明の方法は、 好ましくは、 例えばネガティブ鎖 R NAウィルス、 レトロウイルス、 ボックスウィルス、 ヘルぺスウィルスなどの製造 において適用されるが、 特にレンチウィルスを含むレトロウイルスの生産に本発 明の方法を好適に適用することができる。
製造されるウィルスは、 複製能を持つウィルス （replication competent virus es) であっても、 複製欠損型ウィルス (replication deficient viruses) であつ てもよい。 例えば複製欠損型のウィルスベクターは、 ウィルスゲノムから、 感染 性ゥィルス粒子の形成または放出に役割を持つゥィルス遺伝子の一部または全部 を欠損させることにより作製される。 すなわち、 ウィルスゲノムのウィルス粒子 内への取り込み、 および標的細胞への核酸の導入に必要な核酸配列を残し、 ェン ベロープ遺伝子などを欠損させるようにウィルスゲノムを改変することにより、 所望の遺伝子を細胞に導入するために適した複製欠損型の組み換えウィルスべク ターを製造することができる。 例えば複製欠損型のレトロウイルスベクターであ れば、 ウィルスゲノム RNA中の gag、 pol、 envなどのウィルス蛋白質遺伝子の一部 または全部を取り除き、 ウィルスのパッケージングおよび標的細胞への遺伝子導 入に必要な配列 （LTRの一部など） のみを残すようにウィルスベクターのゲノムを 改変することができる。 ウィルス粒子の産生に際しては、 欠損させた遺伝子のう ち、 ウィルス粒子形成に必要な遺伝子をウィルス産生細胞内で発現させる。 この ように野生型ウィルスが持つウィルス遺伝子の少なくとも一部を失っている核酸 をウィルスゲノムとして含むウィルス粒子も、 本発明においてウィルスベクター に含まれる。
本発明は、 特に組み換えウィルスの製造において好適に用いられる。 「組み換 えウィルス」 とは、 組み換えポリヌクレオチドを介して生成したウィルスを言う 。 組み換えポリヌクレオチドとは、 片方または両方の末端が自然の状態と同じよ うには結合していないポリヌクレオチドを言う。 具体的には、 組み換えポリヌク レオチドは、 人の手によってポリヌクレオチド鎖の結合が改変 （切断または結合 ) されたポリヌクレオチドである。 糸且み換えポリヌクレオチドは、 ポリヌクレオ チド合成、 ヌクレアーゼ処理、 リガーゼ処理等'を組み合わせて、 公知の遺伝子組 み換え方法により生成させることができる。 組み換え蛋白質とは、 組み換えポリ ヌクレオチドを介して生成した蛋白質または人工的に合成された蛋白質を言う。 例えば、 蛋白質をコードする組み換えポリヌクレオチドを発現させることにより 、 組み換え蛋白質を生産することができる。 組み換えウィルスは、 遺伝子操作に より構築されたウィルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ、 ウイ ルスを再構築することによって生成することができる。
本発明の方法において製造されるウィルスベクターは、 ウィルスエンベロープ にシアル酸結合活性を有する蛋白質を有している。 製造されるウィルスベクター としては、 天然においてシアル酸結合活性を有する蛋白質を持つウィルスであつ てもよく、 天然においてはそのような蛋白質を持たないウィルスであって、 人為 的に該蛋白質をエンベロープに持たせたウィルスであってもよい。 このように、 天然型ウィルスのエンベロープには全くまたはほとんど含まれないある蛋白質を エンベロープに持たせたウィルスを、 その蛋白質によりシユードタイプィヒしたゥ ィルスという。 異種エンベロープ蛋白質を持つシユードタイプウィルスは、 例え ばウィルス産生細胞において、 その蛋白質を発現させることにより製造すること ができる。 本発明の方法においては、 シアル酸結合活性を有する膜蛋白質でシュ ードタイプィ匕されたウィルスの製造において特に好適に適用することができる。 シアル酸結合活性を有する膜蛋白質としては、 該蛋白質の細胞外領域にシアル 酸結合領域を持つものが使用される。 このような蛋白質としては、 天然の蛋白質 であるか人工的な蛋白質であるかは特に制限されなレ、。 天然においてシアル酸結 合活性を有する膜蛋白質は、 例えばウィルスのエンベロープ蛋白質などに多く見 いだされている。 このような蛋白質は、 例えばへマグルチネーシヨン （Hemagglut ination, HA; 赤血球凝集反応） を起す活性により同定することができる。 HA活性 を持つウィルス蛋白質は、 へマグルチニン （hamagglutinin; 赤血球凝集素） と呼 ばれることもある。 この HA活性を持つウィルス蛋白は、 本発明のウィルスの製造 において特に好適に用いられる。
これまでに様々なウィルスにお 、て HA活性が検出されている。 これらのウィル スが持つ HA活性を持つ蛋白質をそのまま、 あるいは他の蛋白質とのキメラ蛋白質 を作製することなどにより改変して、 本発明のウィルス製造に用いることができ る。 HA活性は、 種々の生物の赤血球を利用して検出することができる。 HA活性の 検出によく用いられる赤血球の種類および反応の至適温度は、 各ウィルスによつ て適宜調節される。 風疹ウィルスなどにおいては、 反応にカルシウムイオンが必 要であると言われている。 アルボウイルスにおいては、 反応の至適 pHは厳密であ る。 ウィルスの HA活性を持つ蛋白質としては、 ェンテロウィルス、 風疹ウィルス などではビリオンそのもの、 アルボウイルス、 アデノウィルスなどではビリオン 以外にもビリオンより小さい粒子としても存在する。 ボックスウィルスのへマグ ルチニンはビリオンとは別の脂質を含む粒子として存在する。 このような HA活性 を持つ蛋白質を用いて、 HA活性を持つウィルスを製造することができる。 アデノ ウィルス III亜群のウィルスなどは、 ラットの赤血球を部分凝集させる不完全凝集 を起すが、 このような蛋白質も HA活"生を持つ膜蛋白質として用いることができる
HA活性 （HA価） は公知の方法により試験することができる （国立予防衛生研究 所学友会編， 改訂二版 ウィルス実験学総論， pp. 214-225, 丸善株式会社） 。 赤 血球としては、 例えば-ヮトリ （ヒョコおよぴ成鶏を含む） 、 ガチヨゥ、 ラット 、 モルモッ ト、 ァカゲザル、 ミ ドリザノレ、 またはヒ トなどの赤血球が用いられ得 る。 反応温度は、 0°C、 4°C、 室温、 または 37°Cなど、 蛋白質により適した条件で 行う。 各ウィルスの赤血球凝集反応の反応条件の例を以下に示す。
例えばアデノウイルスの HA反応は、 通常、 PHに非依存的であり、 温度は例えば 3 7°Cで行う。 アデノウイルスの I亜群、 例えば 3， 7, 11, 14, 16， 20， 21, 25, お ょぴ 28型などにおいては、 例えばァカゲザル赤血球を用いるとよい。 II亜群、 例えば 8， 9, 10, 13, 15， 17, 19， 22， 23, 24, 26, および 27型などにおいて は、 例えばラット赤血球を用いるとよい。 III亜群、 例えば 1, 2, 4， 5, および 6型などにおいては、 例えばラット赤血球を用いるとよく、 不完全凝集が起こる ェンテロウィルスの HA反応は、 通常、 pHに非依存的である。 その中でも、 例え ば A7型などのコクサツキ一ウィルスの場合は、 例えばニヮトリ赤血球が用いられ 、 室温で凝集を起こす。 A20, A21, A24型などのコクサツキ一ウィルスの場合は、 例えばヒト 0型赤血球が用いられ、 4°Cで凝集反応を起こす。 コクサツキ一ウィル ス Bl, B3， B5型などの場合は、 例えばヒト 0型赤血球が用いられ、 37°Cで凝集反 応を起こす。 エコーウィルス、 例えば 3, 6, 7， 11, 12, 13, 19， 20, 21， 24, 2 9型などにおいては、 例えばヒト 0型赤血球が用いられ、 4°Cで凝集反応を起こす。 レオウィルスの HA反応は、 通常、 pHに非依存的であり、 室温で反応が起きる。 例えば 1型および 2型はヒト 0型赤血球が、 3型はゥシ赤血球が用いられる。
マイナス鎖 RNAウィルスの HA反応は、 例えばィンフルェンザウィルスにおいては 、 pHは約 7. 2で行う。 A型および B型の場合は-ヮトリ、 ヒ ト、 またはモルモットな どの赤血球が用いられ、 室温で反応が起きる。 C型の場合は例えばニヮトリ赤血球 が用いられ、 反応は 4°Cがよい。 おたふく力ぜウィルスおよびニューカッスル病ゥ ィルス （NDV) の場合は、 例えば-ヮトリ赤血球が用いられ、 室温、 11約7. 2で行 うとよレ、。 パラインフルエンザウイルスの HA反応は通常 PH非依存的であり、 1型な どではニヮトリまたはヒト赤血球が、 2型の場合は例えばニヮトリ赤血球が用いら れ、 反応は例えば 4°Cで行う。 パラインフルエンザウイルス 3型の場合は、 ヒトま たはモルモット赤血球が用いられ、 4°C〜室温で反応させる。 はしかウィルスの場 合は、 例えばミドリザノレ赤血球を用いて、 37°Cで反応させる。
アルボウイルスの場合は、 反応は酸性側に厳密であり、 例えばガチョウまたは ヒョコ赤血球を用いて 37°Cで反応させる。 ラブドウィルスの場合は、 例えばガチ ヨウ赤血球を用いて反応を行う。 狂犬病ウィルスの場合は pHは 6. 4が好ましく、 温 度は例えば 0°Cで、 水疱性口内炎ウィルス （VSV) の場合は、 pHは 5. 8が好ましく、 温度は例えば 0°Cで反応させる。 ヮクチ-ァウィルスおよぴ痘そうウィルスなどを 含むボックスウィルスの場合は、 通常、 反応は pHに非依存的であり、 例えばニヮ トリ赤血球を用いて室温〜 37°Cにおいて反応が見られる。 風疹ウィルスの場合は 、 例えばヒョコまたはガチョウ赤血球を用い、 4°C、 pH約 6. 2または 7. 2などで反応 させる。 ポ 1Jォーマウィルスの場合は、 例えばモルモッ ト赤血球を用い、 4°C、 pH 7. 2の条件を用いることができる。 ラットウィルス （RV) の場合は、 例えばモルモ ット赤血球で室温、 pH7. 2の条件が挙げられる。 以上に挙げたような HA活性を持つ ウィルス蛋白質またはその改変蛋白質を用いて、 本発明の方法に従いウィルスを 製造することが可能である。 ここで改変蛋白質とは、 天然の蛋白質の 1つまたは 複数のアミノ酸を欠失、 置換、 および/または挿入した蛋白質である。 このような 蛋白質であっても、 シアル酸結合活性を有する膜蛋白質であれば使用することが できる。 改変蛋白質は、 もとの蛋白質の部分アミノ酸配列を含むことが好ましく 、 より好ましくはもとの蛋白質の 8アミノ酸以上、 より好ましくは 9アミノ酸以上 、 より好ましくは 10アミノ酸以上、 より好ましくは 15アミノ酸以上を含む。 ある いは、 改変蛋白質は、 もとの蛋白質と好ましくは 70%以上、 より好ましくは 80% 以上、 さらに好ましくは 85%以上、 さらに好ましくは 90%以上のァミノ酸配列の 同一性を有する。 改変蛋白質は、 もとの蛋白質またはその部分蛋白質に、 他の蛋 白質が付加された蛋白質であってもよい。
ウィルスベクターのエンベロープに含まれるシアル酸結合活性を有する膜蛋白 質の中でも、 本発明の適用に特に好ましい蛋白質としては、 具体的には、 パラミ クソウィルスの HN蛋白質、 オノレソミクソウィルスの HA蛋白質、 トガウィルスの E1 蛋白質、 ワクシニアウィルスの A27レ H3L、 D8L蛋白質、 フラビウィルスの M、 E蛋 白質、 コロナウィルスの El、 E2蛋白質、 プンャウィルスの G1蛋白質などが挙げら れる。 特に、 一本鎖ネガティブ鎖腿ウィルスが有するエンベロープ蛋白質が好ま しく、 特にオルソミクソウィルスの HA蛋白質が好ましい。
「一本鎖ネガティブ鎖 RNAウィルス」 とは、 一本鎖ネガティブ鎖 [すなわち（-） 鎖] RNAをゲノムに有するウィルスを言う。 このようなウィルスとしは、 パラミク ソゥイノレス (Paramyxoviridae； Paramyxovirus, MorDi丄 livirus, Rubulavirus, および Pneumovirus属等を含む） 、 ラプドウィルス （Rhabdoviridae; Vesiculovi rus, Lyssavirus, および Ephemerovirus^ を含む) 、 フィロウイノレス (Firovi ridae) 、 オノレトミクソゥイノレス (Orthomyxoviridae; Infuluenza virus A, B, C ， および Thogoto— like viruses等を含む） 、 ブニヤウイノレス （Bunyaviridae ; B unyavirus, Hantavirus, Nairovirus, ぉょぴ Phlebovirus属等を 3む) 、 ァ ナ ウィルス （Arenaviridae) などの科に属するウィルスが含まれる。 特に好ましく は、 オルトミクソウィルス科ウィルスの HA蛋白質が挙げられ、 最も好ましくは、 インフルエンザウイルスの HA蛋白質が挙げられる。 また、 例えばセンダイウィル ス、 狂犬病ウィルス、 あるいは麻疹ウィルスの HN (または H) 蛋白質なども好適で ある。 これらの蛋白質は、 複数を組み合わせて使用してもよい。 これらの蛋白質 は、 ウィルスの天然株、 野生株、 変異株、 ラボ継代株、 および人為的に構築され た株などに由来してもよい。 これらの蛋白質は、 天然の蛋白質から改変された蛋 白質であってもよい。
シアル酸結合活性を有する膜蛋白質は、 シアル酸に結合する以外の活性を持つ ものであってもよい。 例えば、 パラミクソウィルスの HN蛋白質には、 シアル酸結 合活性 （HA活性） 以外にノイラニミダーゼ （NA) 活性も有している。 HN蛋白質が 持つノィラミュダーゼ活性は、 それ自体がウィルス産生を促進する働きを持ちう るが、 本発明の方法に従ってグラム陽性菌由来 NAを併用することにより、 より効 率的にウィルス産生を行うことが可能となる。 また、 本発明においてシアル酸結 合活性を有する膜蛋白質を 2種またはそれ以上用いてもよい。 例えば、 オルトミ クソウィルスの HA蛋白質とパラミクソウィルス HN蛋白質の 2種の蛋白質でシユー ドタイプィ匕したウィルスの製造において、 本発明の方法を用いることができる。 H N蛋白質がもつ NA活性とグラム陽性菌由来の NAにより、 さらに高い効率でウィルス を細胞から放出させることが可能となる。
本発明におけるウィルスベクターの製造は、 シアル酸結合活性を有する膜蛋白 質を持つウィルスベクターの製造工程において、 該ウィルスベクター産生細胞を グラム陽性菌由来ノィラミニダーゼの存在下で培養することにより行われる。 す なわち、 グラム陽性菌由来ノイラミニダーゼを含む培養液中でウィルス産生細胞 を培養する。 その後、 産生されたウィルスを回収する工程により、 細胞から産生 されたウィルスを得ることができる。 ウィルスの回収は、 例えばウィルス産生細 胞の培養上清を回収する工程であってよい。 また、 培養上清からさらにウィルス を回収する工程を含んでもよい。 培養上清から、 遠心、 吸着、 濾過等により、 さ らにウィルスを精製または濃縮することができる。
ノイラミニダーゼ (NA) (EC 3. 2. 1. 18) とはシアル酸のグリコシド結合を切断 する活性 （これを NA活性という） を有する蛋白質を言い、 具体的には細胞膜上の 糖蛋白質または糖脂質中のシアル酸のダリコシド結合を切断する活性を有する蛋 白質である （Schauer, R. , Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 40 (1982) 131 - 234 ； Cabezas, J. A. , Biochem. J. 278 (1991) 311 - 312) 。 ノィラミニダーゼの活性 は、 N-Acetylneuraminyl lactose (NANA- lactose) または牛顎下腺ムチン (Bovine submaxillary mucin) を基質として、 pH 5. 0、 37°Cにおいて 1分間に 1 μ molの N - A cetylneuraminic acid (NANA) を生成するに要する酵素量を 1 unit (U) として定 義される (Cassidy, J. T. et al.， J. Biol. Chem. 240： 3501 (1965) ) 。 NAは、 シァリダーゼ （sialidase) と呼ばれることもある。 グラム陽性菌由来 NAとは、 グラム陽性菌が持つ NAまたはその構造的同等物、 あ るいはそれらの改変体を言う。 例えばグラム陽性菌由来 NAには、 グラム陽性菌か ら得ることができる NAが含まれる。 例えば、 グラム陽性菌培養物から精製された N A、 およびその組み換え体が含まれる。 グラム陽性菌由来 NAの組み換え体は、 グラ ム陽性菌由来 NAをコードする遺伝子を同種あるいは異種の生物中で発現させるこ とにより製造することができる。 グラム陽性菌から得ることができる NAは、 他の 原料から得たものであっても、 グラム陽性菌から得られた NAと同等の蛋白質であ れば、 グラム陽性菌由来 NAに含まれる。 またグラム陽性菌由来 NAには、 野生型グ ラム陽性菌 NAの 1つまたは複数のァミノ酸を欠失、 置換、 および/または揷入する ことにより改変した蛋白質であって活性を持つ蛋白質が含まれる。 改変されるァ ミノ酸数は NA活性を持つ限り制限されないが、 好ましくは 70ァミノ酸以内であり 、 より好ましくは 50アミノ酸以内であり、 より好ましくは 30アミノ酸以内であり 、 より好ましくは 20アミノ酸以内であり、 より好ましくは 10アミノ酸以内であり 、 より好ましくは 5アミノ酸以内であり、 より好ましくは 3アミノ酸以内である。 改変された NAは、 グラム陽性菌野生型 NAのアミノ酸配列と 50%以上、 好ましくは 6 0%以上、 より好ましくは 70%以上、 より好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 85%以上、 さらに好ましくは 90%以上の同一性を有する。 ァミノ酸配列の同一性 は、 例えば、 Karlinおよび Altschulによるアルゴリズム BLAST (Karl in, S. and A ltschul, S. F. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 2264 - 2268, 1990、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877， 1993)によって決定することができる。 BLASTプ ログラムを用いる場合には、 デフォルトパラメーターを用いるとよい。 これらの 解析方法の具体的な手法は公知である（NCBI (National Center for Biotechnolog y Information) の BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) のウェブサイ トを参照）。 例えば 2つの配列の比較を行う blast2sequencesプログラム （Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) により、 2配列のァライ メントを作成し、 配列の同一性を決定することができる。 ギャップはミスマッチ と同様に极ぃ、 例えば野生型ダラム陽性菌 NAのァミノ酸配列全体に対する同一性 の値を計算すればよい。 アミノ酸の改変に当たっては、 NA活性に重要な BNR (bact erial neuraminidase repeat； Pfam Accession number PF02012 (Aspボックスと も呼ばれる） ） を破壌しないよう、 他の領域のアミノ酸を改変することが好まし レヽ （Roggentin P. et al. , Glycoconj. J. 6: 349—353， 1989; Copley, R. R. et a 1. , Protein Sci. 10 : 285-292， 2001) 。 BNRは複数コピーが互いに 40アミノ酸残 基以上離れて繰り返すことが好ましい。 野生型 NAの N末端および/または C末端のァ ミノ酸は、 改変しても活性に最小限の影響し力及ぼさないと考えられる。
グラム陽性菌由来 NAには、 例えば、 野生型グラム陽性菌 NAの部分蛋白質であつ て、 NA活性を有する蛋白質が含まれる。 部分蛋白質は、 好ましくは野生型グラム 陽性菌 NAの全ァミノ酸配列の連続した 60%以上、 より好ましくは 70%以上、 より 好ましくは 75%以上、 より好ましくは 80%以上、 より好ましくは 85%以上、 より 好ましくは 90%以上を含む。 またグラム陽性菌由来 NAには、 野生型グラム陽性菌 N Aまたはその部分蛋白質に、 他の蛋白質が付加された蛋白質であって、 NA活性を有 する蛋白質が含まれる。 活性を維持したまま、 部分長の蛋白質あるいは他の蛋白 質との融合蛋白質を作製することは、 当業者が通常行つている。
グラム陽性菌とは、 グラム染色 （Gram stain) に陽性の細菌おょぴその他の菌 類を言う。 グラム染色とは、 一般に、 塩基性染色液 （例えばクリスタルバイオレ ットなど） で染色し、 ついでルゴール液 （12 - Π液） で処理してから極性溶媒 （ァ ルコールまたはアセトンなど） で短時間洗浄した時に脱色抵抗性を示す菌を言う
。 洗浄後の対比染色 （例えばサフラニン液または希釈カルボールフクシン液） に より、 グラム陰†生菌は赤色に染まるがグラム陽性菌は紫色を呈する。 グラム陽个生 菌は、 一般に比較的厚い （15〜80nra) 細胞壁を持ち、 多くは外層にリポ多糖を欠 く。 またリソチームに感受性が高いものが多い。 具体的には、 グラム陽 1生菌には ブドウ球菌、 連鎖球菌、 枯草菌、 巨大菌、 および放線菌などが含まれる。 本発明 においてグラム陽性菌由来 NAは、 好ましくは放線菌由来 NAである。 放線菌とは、 放線菌目 （Actinomysetales) 細菌およびその他の放線細菌 （Acti nobacteria) を言う。 放線菌はグラム陽性細菌のグループに属する。 放線菌目に は、 フランキア科 (Frankiaceae) 、 ミクロモノス^;ラ禾斗 (Micromonosporaceae) 、 プロピオ二パクトリウム科 (Propionibacteriaceae) 、 シゥドノカルジァ科 （P seuodonocardiaceae) 、 ストレプト セス; i4 (itreptomycetaceae) 、 ストレフ ト スポラン:^ゥム禾斗 (Streptosporangiaceae) 、 テノレモモノスホラ科 (Thermomonos poraceae) 、 ジ パクテリゥム科 (Corynebacteriaceae) 、 マイ ノ クテリク ム科 (Mycobacteriuaceae) 、 ノカノレン 7 斗 (Nocardioidaceae) 、 fク^ r W ス禾斗 (Actmomycetaceae) 、 ミクロコッフス禾斗 (Micrococcaceae) 、 Actmosynne mataceae禾斗、 Nocardiopsaceae科、 お び Glycomycetaceae禾斗 など力 まれる。 例えば、 Actinomyces属 NAは、 Accession Number L06898 (protein: AAA21932, A4 9227)、 X62276 (protein: CAA44166) {Actinomyces viscosus(DM) を参照のこと 。 Corynebacterium属 NAは、 例えば Accession Number NC一 003450 (protein: NP_6 00771)、 AP005278 (protein BAB98949) {Corynebacterium gluta icwn(DM) を参 照のこと。 Streptomyces属 NAは、 例えば Accession Number NC— 003155 (protein: NP— 823018) (Streptomyces avermitilis) ^ NC一 003888 (protein: NP一 630638) (S treptomyces coelicolor) を参照、のこと。
本発明において用いられるノイラミニダーゼは、 好ましくは放線菌目細菌由来 、 より好ましくはミクロモノスポラ科細菌由来、 より好ましくは、 ミクロモノス ポラ属細菌由来の NAである。 ミクロモノスポラ属細菌としては、 aurantiaca、 M. brunnea^ M. orunnescens^ M. carbonacea^ M. cellulo丄 yticum、 M. chalcea 、 M. chersinia M. citrea、 M. coerulea M. echinoauran tiaca^ M. echinobru nnea^ M. echinospora^ M. floridensis M. fulviviridis M. ful vopurpureus ゝ M. fulvoviolaceus、 M. globosa M griseorubida M. halophytica M. inos itol3、 M. inyoensis M. lacustris M. megalomicea^ M. melanospora^ M. nar ashino、 M. oli vas terospora M. peucetica、 M. purpureaヽ M. purpureochromog e s、 M. rhodorangea^ M. rosaria^ M. rosea M. sagamiensis^ M. viridifaci ensヽ M. yulongensis^ M. zionensisなどが挙げられる力 これらに制限されな い。 特に好ましい NAとしては、 M. viridifaciens (ATCC 31146) 由来の NAが挙げ られる。 ¾ Z o¾¾c e 7sの NA遺伝子 nedA) の塩基配列は Accession Number D 01045 (配列番号: 1) に、 コードされる蛋白質のアミノ酸配列は Q02834 (配列番 号： 2) に記載されている （Sakurada, K. et al.， J. Bacteriol. 174 (21)： 6896-9 03, 1992) 。
また、 M. r a¾¾cie/7sの NA遺伝子をプローブに、 他のミクロモノスボラの NA 遺伝子を単離することができる。 例えば、 配列番号: 1に記載の配列および/または その相補配列の 30塩基以上、 より好ましくは 50塩基以上、 より好ましくは 100塩基 以上、 より好ましくは 150塩基以上、 より好ましくは全長と、 ストリンジ ントな 条件下でハイプリダイズする核酸を選択すればよ!/、。 ハイブリダイゼーションに おいては、 配列番号： 1の配列を含む核酸、 またはハイブリダィズの対象とする核 酸のどちらかからプローブを調製し、 それが他方の核酸にハイブリダィズするか を検出することにより同定することができる。 ストリンジヱントなハイブリダィ ゼーションの条件は、 例えば 5xSSC ( l xSSCは 150 mM塩化ナトリゥムおよび 15 ΙΒΜクェン酸ナトリウムを含む） 、 7% (w/v) SDS (ドデシル硫酸ナトリウム）、 100 μ g/ml変性サケ精子 DNA、 5xデンハルト液 （ 1 xデンハルト溶液は 0. 2%ポリビニー ルピロリ ドン、 0. 2%牛血清アルブミン、 および 0. 2%フイコールを含む） を含む溶 液中、 48°C、 好ましくは 50°C、 より好ましくは 55°C、 より好ましくは 60°Cでハイ ブリダイゼーションを行い、 その後ハイプリダイゼーシヨンと同じ温度で 2xSSC， 0. 1°/。 (w/v) SDS中、 振蘯しながら 2時間洗浄する条件である。 より好ましくは、 洗 浄は lxSSC, 0. 1% (w/v) SDS中で、 より好ましくは 0. 5xSSC, 0. 1% (w/v) SDS中で 、 より好ましくは 0. lxSSC, 0. 1% (w/v) SDS中で、 振蘯しながら 2時間行う。
本発明のウィルスの製造方法においては、 上記のようなグラム陽性菌由来 NAの 存在下でウィルスの産生細胞を培養し、 産生されたウィルスを回収する。 ウィル スは細胞から培養液中に放出されるので、 培養上清を回収することによりウィル スを回収することができる。 シアル酸結合蛋白質によりシユードタイプ化したゥ ィルスの製造であれば、 該蛋白質を発現する細胞においてウィルスの産生させる 際に、 該細胞をグラム陽性菌由来 NAの存在下で培養し、 産生されたウィルスを回 収する。 グラム陽性菌由来 NAは、 NAを培養液中に添加して供給してもよいし、 NA を発現するべクターを用いてウィルス産生細胞またはウイルス産生細胞と共培養 する細胞などから該 NAを分泌させてもよい。 NAは、 ウィルス産生細胞の培養期間 の少なくとも一部の期間存在している。 NAの存在下でウィルス産生細胞を培養す る時間は、 例えば 1時間以上、 好ましくは 3時間以上、 より好ましくは 5時間以上、 より好ましくは 10時間以上、 より好ましくは 20時間以上である。 好ましくは、 ゥ ィルス産生細胞の培養物から産生されたウィルスを回収する前に 1時間以上、 好ま しくは 3時間以上、 より好ましくは 5時間以上、 より好ましくは 10時間以上、 より 好ましくは 20時間以上、 グラム陽性菌由来 NAの存在下でウィルス産生細胞を培養 する。 この間に培養上清中にウィルスが蓄積する。
グラム陽性菌由来ノィラミニダーゼの存在量は、 ウィルス産生量を最大化させ るように適宜調整することができる。 培養液中のグラム陽性菌由来 NAの濃度は、 例えば、 0. 1 mil/ml 〜 1000 U/ml であり、 好ましくは 0. 2 mU/ml 〜 500 U/ml であり、 より好ましくは 0. 5 mU/ml 〜 100 U/ml であり、 より好ましくは 1 mU/ ml 〜 50 U/ml である。 特に、 グラム陽性菌由来 NAは 10 U/ml以下でも十分な力 価のウィルスを製造することが可能であり、 例えば 1 U/ml 以下、 0. 1 U/ml 以下 、 0. 05 U/ml以下、 あるいは 0. 01 U/ral以下といった低用量でも高い力価のウィル スをウィルス産生細胞から放出させることができる点で優れている。
本発明の方法を用いて製造されるウィルスべクターは、 例えば上記のシアル酸 結合膜蛋白質以外にさらに別の蛋白質をエンベロープに含んでいてもよい。 例え ば、 ネガティブ鎖 RNAウィルスの HA (または HN) 蛋白質などのへマグルチュン活性 を有するェンべロープ蛋白質に加えて、 ネガティブ鎖 RNAゥィルスの F蛋白質など の膜融合に関わるエンベロープ蛋白質をさらに含むことができる。 また、 所望の ウィルス由来のエンベロープ蛋白質をさらに含むことができる。 例えばヒト細胞 に感染するウィルスに由来するエンベロープ蛋白質が好適に用いられる。 このよ うな蛋白質としては、 特に制限はないが、 レトロウイルスのアンフォト口ピック エンベロープ蛋白質、 水疱性口内炎ウィルス （VSV) の G蛋白質などが挙げられる 。 また、 ヘルぺスウィルス科の蛋白質としては、 例えば単純へルぺスウィルスの g B、 gD、 gH、 gp85蛋白質、 EBウィルスの gp350、 gp220蛋白質などが挙げられる。 へ パドナウィルス科の蛋白質としては、 B型肝炎ウィルスの S蛋白質などが挙げられ る。
例えば、 レトロウイルスのアンフォト口ピックエンベロープ （アンフォトロピ ック env) 蛋白質、 およびネガティブ鎖 RNAウィルスの HA (または HN) 蛋白質を含 むベクターを、 本発明の方法に従って製造することができる。 また、 本努明の方 法により製造されるウィルスは、 例えば水疱性口内炎ウィルス （Vesicular stoma titis virus ; VSV) の表面糖蛋白質である VSV- G蛋白質を含むことができる。 VSV- Gはほとんどの動物細胞に存在するリン脂質をレセプターとしていると考えられて おり、 VSV-G蛋白質およびシアル酸結合蛋白質を含むベクターを用いることにより 、 遺伝子導入できる細胞種が飛躍的に増え、 導入効率も上昇する （W001/92508) 。 例えば、 VSV-G蛋白質おょぴネガティブ鎖 RNAウィルスの HA (または HN) 蛋白質 を含むベクターが例示できる。 これらのベクターは、 さらにネガティブ鎖 RNAウイ ルスの F蛋白質を含むことができる。 すなわち、 レトロウイルスのアンフォトロピ ックエンベロープ蛋白質、 F蛋白質、 および HA (または HN) 蛋白質を含むベクター 、 並びに VSV- G蛋白質、 F蛋白質、 および HA (または冊） 蛋白質を含むベクターの 製造において本発明は有用である。 さらに、 これらのベクターは、 ネガティブ鎖 R NAウィルスの M蛋白質を含むことができる。 本発明は、 レトロウィルスのアンフォ トロピックエンベロープ蛋白質、 F蛋白質、 HA (または HN) 蛋白質、 および M蛋白 質を含むベクター、 並びに VSV- G蛋白質、 F蛋白質、 HA (または HN) 蛋白質、 およ び M蛋白質を含むベクターの製造において好適に適用することができる。 上記のよ うなベクターは、 粘液を有する細胞や造血幹細胞を含む細胞分画など、 従来では 遺伝子の導入が困難であつた細胞に対しても高い遺伝子導入能を示す点でも優れ ている。 また、 VSV-G蛋白質は 1種類の糖蛋白が安定な 3量体を形成して膜上に存 在するため、 精製過程でのベクター粒子の破壌が起こりにくく、 遠心による高濃 度の濃縮が可能となる （Yang, Y. et al. , Hum Gene Ther: Sep, 6 (9)， 1203-13. 1995) 。
ベクターのシユードタイプィ匕のために用いるネガティブ鎖 RNAウィルスの HA (ま たは HN) 、 F、 および M蛋白質としては特に制限はない。 特に、 オルトミクソウイ ス科、 およびパラミクソウィルス科ウィルスの蛋白質は好適である。 具体的に は、 例えば、 インフルエンザウイルスおよびセンダイウィルスのエンベロープ蛋 白質は好適に用いられ得る。 例えば、 ウィルス産生細胞においてインフルエンザ ウィルスの HA蛋白質を発現させて製造された HAシユードタイプウィルスは、 ヒト 細胞を含めた広い哺乳動物細胞に感染可能である。 ネガティブ鎖 RNAウィルスの HA
(または HN) 、 F、 および M蛋白質等は、 所望の株由来の蛋白質を用いることがで き、 例えば病原性ウイ^^スの蛋白質においては、 強毒株または弱毒株由来の蛋白 質であってよレ、。 例えばセンダイウィルスの H、 F、 およひ 11蛋白質としては、 例 えば Z株由来の蛋白質を用いることができる。 インフルエンザウイルスェンベロー プ蛋白質としても、 所望の単離株由来のものが用いられ得る。
また、 レトロウイルスのアンフォト口ピックエンベロープ蛋白質としては、 例 えばマウス白血病ウィルス （MuLV) 4070A株由来のエンベロープ蛋白質を用い得る 。 また、 MuLV 10A1由来のエンベロープ蛋白質を用いることもできる （例えば pCL - 10A1 (Imgenex) (Naviaux, R. K. et al. , J. Virol. 70: 5701-5705 (1996) ) 。 ェコトロピックエンベロープ蛋白質としては、 例えばモロ-一マウス白血病ウイ ルス （MoMuLV) 由来のエンベロープ蛋白質を用いることができる。 水疱性口内炎 ウィルス G蛋白 （VSV- G) としては、 例えば Indiana血清型株 （J. Virology 39: 5 19-528 (1981) ) 由来の蛋白を用いることができる。 これら以外にも、 所望の株由 来の蛋白質を用いることができる。
ネガティブ鎖匪ウィルスの HA (または H ) 、 F、 G、 M、 あるいはレトロウィル スエンベロープ蛋白質など、 上記のエンベロープ蛋白質は、 野生型ウィルスが持 つインタクトな蛋白質であってもよいし、 天然または人為的に変異が導入されて いてもよい。 例えば、 細胞表面の抗原分子となりうるエンベロープ蛋白質の抗原 提示ェピトープ等を解析し、 これを利用して抗原提示能を弱めた蛋白質を用いて ウィルスを作成することも可能である。
例えば、 HA蛋白質または HN蛋白質などのシアル酸結合活性を有するウィルスェ ンべロープ蛋白質や、 他のエンベロープ蛋白質の細胞質側領域を欠失、 置換、 お よび/または付加により改変した蛋白質を用いてウィルスベクターをシユードタイ プ化することにより、 より高い遺伝子導入能を有するベクターを製造することが 可能である。 本発明は、 天然に存在するシアル酸結合活性を有する膜蛋白質の細 胞質側領域の一部または全部が、 置換、 欠失、 および/または付カ卩により改変され た蛋白質を含むシユードタイプウィルスベクターの製造方法に関する。 具体的に は、 例えばネガティブ鎖 RNAウィルスの HA (または HN) 蛋白質および/または F蛋白 質の細胞質側領域を欠失させたり、 他の膜蛋白質 （例えばレンチウィルスを含む レトロウイルスのェンベロープ蛋白質） の細胞質側領域で置換または付加した改 変蛋白質は、 感染効率の高いウィルスベクターを製造するために好適に用いられ る。 特にシアル酸結合活性を有するウィルスエンベロープ蛋白質の細胞質側領域 力 置換、 欠失、 および/または付加により野生型から改変されている蛋白質を用 いて、 より感染効率の高いシユードタイプウィルスベクターを製造することがで きる。 例えばレトロウイルスの製造であれば、 細胞質側領域をレトロウイルスの エンベロープ蛋白質のそれに置換したり、 あるいはレト口ウィルスのェンベロー プ蛋白質の細胞質側領域を付加することが好適である。
具体的には、 ネガティブ鎖 RNAウィルスの HA (または HN) 蛋白質の細胞質側領域 を、 SIV等のレンチウィルスまたはレトロウイルスのエンベロープ蛋白の細胞質側 領域に置換した蛋白質、 およびネガティブ鎖 R Aウィルスの HA (または HN) 蛋白質 にレンチウィルス等のレトロウィルスのェンべ口ープ蛋白の細胞質側領域を付加 した蛋白質などでレトロウイルスをシユードタイプ化することにより、 ヒ ト細胞 を含む広い細胞に高率で外来遺伝子を導入することが可能となる。 欠失させる細 胞質側領域の範囲、 および付加されるレトロウィルスのエンベロープ蛋白の細胞 質側領域の範囲は特に制限はなく、 細胞質側領域の一部または全部を欠失、 置換 、 およひ 7または付加させることができる。
このようなウィルスベクターは、 さらにネガティブ鎖 R Aウィルスの改変された F蛋白質を含むことができる。 例えば、 ネガティブ鎖画ウィルスの F蛋白質の細胞 質側領域を欠失させた蛋白質、 および、 このような欠失蛋白質に SIV等のレンチウ ィルスまたはレトロウィルスのェンべロープ蛋白の細胞質側領域を付加した蛋白 質などが用いられ得る。 具体的には、 例えば F蛋白細胞質側領域のァミノ酸を欠失 させた蛋白質を発現するプラスミ ドを構築する。 欠失させる範囲は特に制限はな く、 細胞質側領域の一部または全部を欠失させることができる。 例えば 0〜数個の アミノ酸を残して細胞質側領域を欠失させた F蛋白質は、 シユードタイプィ匕レトロ ウィルスの製造に好適と考えられる。 これらの欠失型 F蛋白質に、 他のウィルスェ ンべロープ蛋白質 （例えばレンチウィルスエンベロープ蛋白質） の細胞質側領域 の一部または全部を付加することにより、 F蛋白質の細胞質側領域を他のぺプチド に置換した蛋白質をウィルスの製造に用いることができる。 例えば、 SIVのェンべ ロープ蛋白質の細胞質側領域の 5'側より 11アミノ酸を付加した蛋白質などを例示 することができる。 このように本発明は、 ネガティブ鎖 R Aウィルスの F蛋白質で あって、 該蛋白質の天然型の細胞質側領域の一部または全部が、 置換、 欠失、 お よび/または付加により改変されている蛋白質をさらに用いてシユードタイプィ匕ゥ ィルスを製造する方法にも関する。 特に本発明は、 F蛋白質の細胞質側領域が、 レ ンチウィルスを含むレトロウイルスのエンベロープ蛋白質の細胞質側領域の一部 または全部と置換されている蛋白質をさらに有しているシユードタイプ化ウィル スを製造する方法にも関する。
また、 ウィルスエンベロープ蛋白質の細胞外領域を、 細胞に接着する活性を持 つ他の膜蛋白質、 接着因子、 リガンド、 受容体等の蛋白質、 抗体またはその断片 に置換したキメラ蛋白質などを用いて、 広範な組織または特定の組織を標的とし て感染するべクターを作り出すこともできる。
本発明のウィルスの製造方法は、 特にレトロウィルスべクターの製造に好適で ある。 レトロウイルスとは、 （+)センス鎖 RNAをゲノムに持ち、 逆転写酵素を有す ることを特徴とするウィルスで、 標的細胞に感染すると、 逆転写酵素により自身 の R Aゲノムを DNAに変換して標的細胞の染色体にこの DNAを組み込むウィルスの総 称である。 レトロウイルスは野生型レトロウイルスの改変体であってもよく、 ゥ ィルス粒子中に含まれている RNAがレト口ウィルスのゲノム RNAの少なくとも一部 の配列を含んでおり、 その RNAが、 ウィルス粒子形成の際に、 レトロウイルスのゥ ィルス蛋白質の働きにより、 その配列に依存してウィルス粒子中に取り込まれて できる感染性ウィルス粒子であればよい。 より具体的には、 レトロウィルスのゲ ノム RNAには、 ウィルス粒子への取り込みに必要なパッケージングシグナル配列が 含まれている。 両端に LTRを持ち、 このシグナル配列を含むような R Aを転写させ ることにより、 レトロウイルスのウィルス蛋白質の存在下、 この腿を持つウィル ス粒子が形成される。
本発明においてレトロウイ/レスべクターは、 オンコウィルスに由来するものが 含まれる。 「オンコウィルス」 とは、 オンコウィルス亜科 (Oncovirus) に属する レトロウイルスを指す。 オンコウィルスには、 肉腫ウィルス、 白血病ウィルス、 および乳癌ウィルスなど、 発癌に関連するレトロウイルスが含まれる。 例えば、 モロニ一マウス白血病ウィルス （Moloney Murine Leukaemia Virus; MoMLV) は、 もっとも初期に開発されたレトロウィルスベクターの 1つであり、 これまでに多 くの改良がなされ広く用いられている。 MoMLVをネガティブ鎖 RNAウィルスの HA ( または H ) 蛋白質などのシアル酸結合蛋白質でシユードタイプ化したウィルスべ クタ一は本発明により好適に製造することができる。 また、 マウス幹細胞ウィル ス （Murine Stem Cell Virus ; MSCV) も、 特に血球系 ·造血系細胞および胎児性 幹細胞などに対する遺伝子導入のためのベクターとして好適に用いられる。 例え ばネガティプ鎖 RNAゥィルスのへマグルチ二ン活性を持つェンべロープ蛋白質等を 用いてシユードタイプィ匕した MSCVを用いることにより、 造血幹細胞を含む骨髄 CD3 4陽性細胞に効率的に遺伝子を導入することができる。
また、 本発明においてレトロウイルスベクターは、 レンチウィルスに由来する ものが含まれる。 レンチウィルスとは、 レンチウィルス亜科 (Lentivirus) に属 するレトロウイルスを指す。 レンチウィルスには、 ヒト免疫不全ウィルス （human immunodeficiency virus; HIV) (例えば HIV1または HIV2) 、 サル免疫不全ウイ ルス (simian immunodeficiency virus ; SIV) 、 ネコ免疫不全ウイルス (FIV) 、 マエディ . ビスナウィルス、 ゥマ伝染性貧血ウィルス （EIAV) 、 ャギ関節炎脳炎 ウィルス （CAEV) などが含まれる。 レトロウイルスベクターは、 所望の株および サブタイプに由来するものであってよい。 例えば HIV - 1としては、 全てのメジャ 一 （M) サブタイプ （Aから Jを含む） 、 Nおよび outlier (0) が含まれる （Hu, D.
J. et al. , JAMA 1996； 275： 210-216； Zhu, T. et al. , Nature 1998, 5； 391 ( 6667)： 594-7； Simon, F. et al. , at. Med. 1998， 4 (9)： 1032-7) 。 SIV単離株 としては、 SIVagm、 SIVcpz、 SIVmac SIVmnd、 SIVsnm、 SIVsyk等が例示できる。 レンチウィルスの利点の 1つは、 非分裂細胞に対しても感染し、 宿主細胞の染 色体へウィルスゲノムを組み込む性質を持つことである。 これには gagおよび vpr にコードされている核移行シダナルゃィンテグラーゼが重要な働きをしているも のと考えられている。 この性質を利用し、 レンチウィルスをベースとしたウィル スベクターを本発明に従って製造すれば、 生体内組織の非分裂細胞、 種々の組織 の幹細胞のようにほとんど分裂しない細胞へも遺伝子を導入し、 長期間の遺伝子 発現が可能となるベクターを効率良く製造することができる。 レンチウィルスの中でもっとも早くべクタ一化の試みが行われたのはヒト免疫 不全ウィルス Human Immunodeficiency Virus (HIV) であり、 本発明の方法におい ても好適に適用することができる。 また、 他にも、 SIV、 ネコ免疫不全ウィルス Fe line Immunodeficiency Virus (FIV) (Poeschla, E. M. et al. , Nature Medici ne, 4 (3) , 354-7, 1998) ゃャギ関節炎脳炎ウィルス Caprine Arthritis Encephal itis Virus (CAEV) (Mselli- Lakhal, L. et al. , Arch. Virol. , 143 (4)， 681 - 9 5， 1998) 、 ゥマ伝染性貧血ウィルス （EIAV) 、 ゥシ免疫不全ウィルス （BIV) を ベースとしたベクターの開発が行われている。 これらのベクターの製造に、 本発 明の方法を適用することも可能である。
サノレ免疫不全ウイノレス （Simian Immunodeficiency Virus, SIV) はサノレにおけ る HIV類似ウィルスとして発見され、 HIVとともに Primates Lentivirusグループを 形成している （井戸栄治， 速水正憲， サル免疫不全ウィルスの遺伝子と感染 ·病 原性， 蛋白質核酸酵素： Vol. 39, No. 8， 1994) 。 このグループはさらに大きく 4つのグループに分類され、 1)ヒトにおいて後天性免疫不全症候群 （acquired im mune deficiency syndrome, AIDS) の原因となる HIV - 1とチンパンジーより分離さ れた SIVcpzを含む HIV— 1グループ、 2)スーティーマンガべィ Cercocebus atysよ り分離された SIVs讓とァ力ゲザル fecaca ^/ より分離された SIVmac、 およ びヒトに対し低頻度ではあるが病原性を示す HIV- 2 (Jaffar, S. et al. , J. Acqu ir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. , 16 (5) , 327-32, 1997) よりなる H IV - 2グループ、 3)アフリカミドリザル Cercopithecus aethiopsから分離された S IVagmに代表される SlVagmグループ、 4)マンドリル Papio sphinxから分離された SIVmndに代表される SIVmndグル一プからなっている。
このうち、 SIVagmおよび SIVmndでは自然宿主における病原性の報告はなく （Oht a, Y. et al. , Int. J. Cancer, 15, 41 (1)， 115—22， 1988; Miura, T. et al. , J. Med. Primatol. , 18 (3-4) , 255-9， 1989； 速水正憲， 日本臨床， 47, 1, 1989 ) 、 特に本実施例で用いた SIVagmの一種である TY0-1株は自然宿主でも、 力-クイ ザノレ Macaca facicularis、 ァカゲザノレ Macaca mulatta に対する実験感染でも病 原性を示さないことが報告されている (Ali, M. et al, Gene Therapy, 1 (6) , : 3 67-84, 1994; Hon jo, S et al. , J. Med. Primatol. , 19 (1) , 9—20, 1990) 。 SIV agmのヒ トに対する感染、 発症については報告がなく、 ヒトに対する病原性は知ら れていないが、 一般に霊長類におけるレンチウィルスは種特異性が高く、 自然宿 主から他種に感染、 発症した例は少なく、 その発症も低頻度あるいは進行が遅い という傾向がある (Novembre, F. J. et al. , J. Virol. , 71 (5) , 4086-91， 1997 ) 。 従って、 SlVagnu 特に SIVagm TY0- 1をベースとして作製したウィルスベクタ 一は、 HIV-1や他のレンチウィルスをベースとしたベクターと比べて安全性が高い と考えられ、 本発明において製造されるウィルスとして好適である。
また、 本発明においてレトロウイルスベクターは、 スプーマウィルス （Spumavi rus) に由来するものが含まれる。 スプーマウィルスには、 例えばフォーミーウイ ルス （Foamyvirus) が含まれる （DE4318387 ; W09607749; Virology (1995) 210, 1, 167-178； J. Virol. (1996) 70， 1， 217-22) 。 フォーミーウィルスに由来す るベクターは、 ヒ ト細胞への外来遺伝子導入、 特に遺伝子治療および組換えヮク チンの投与などに利用され得る。
本発明においてレトロウイルスベクターは、 LTR (long terminal repeat) に改 変を加えることもできる。 LTRはレトロウイルスに特徴的な配列であり、 ウィルス ゲノムの両端に存在している。 5' LTRはプロモーターとして働き、 プロウィルス からの mRNAの転写を促す。 したがって、 ウィルスベクターに取り込ませる RNAを発 現するベクター （本発明においてこれをジーントランスファーベクターと呼ぶ） の 5' LTRのプロモータ一活性をもつ部分を別の強力なプロモーターと置換すれば 、 ジーントランスファーベクターからの mRNA転写量が増大し、 パッケージング効 率が上昇、 ベクター力価を上昇させることが期待できる。 さらに、 例えばレンチ ウィルスの場合、 5， LTRはウィルス蛋白質 tatによる転写活性の増強を受けること が知られており、 5， LTRを tat蛋白質に依存しないプロモーターに置換することで P T/JP2003/011299
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、 ウィルスのパッケージングに必要なウィルス遺伝子を発現するベクター （本発 明においてこれをパッケージングベクターと呼ぶ） から tatを削除することが可能 となる。 また、 細胞に感染し細胞内に侵入したウィルス RNAは逆転写された後、 両 端の LTRを結合させた環状構造となり、 結合部位とウィルスのィンテグラーゼが共 役して細胞の染色体内にィンテグレートされる。 プロウィルスから転写される raRN Aは 5' LTR内の転写開始点より下流から 3' LTRの polyA配列までであり、 5' LTRの プロモーター部分はウィルス内にパッケージングされない。 したがって、 プロモ 一ターを置換したとしても標的細胞の染色体に揷入される部分には変化が無い。 以上のことから、 5' LTRのプロモーターの置換は、 より高力価で安全性の高いベ クターを作成することにつながると考えられる。 従って、 ジーントランスファー ベクターの 5' 個 jプロモーターの置換を行い、 パッケージングされるベクターの力 価を上昇させることができる。
また、 3' LTRの配列を部分的に削除し、 標的細胞から全長のベクター mRNAが転 写されることを防止する Self Inactivating Vector (SINベクター） （自己不活性 化型ベクター） の作成により、 安全性を上昇させることも可能である。 標的細胞 の染色体に侵入したレンチウィルスのプロウィルスは、 3， LTRの U3部分を 5' 端に 結合した形となる。 したがってジーントランスファーベクターは、 標的細胞の染 色体では 5' 端に U3が配置され、 そこからジーントランスファーベクター全体の RN Aが転写されることになる。 仮に、 標的細胞内にレンチウィルスあるいはその類似 の蛋白質が存在した場合、 ジーントランスファーベクターが再ぴパッケージング され、 他の細胞に再感染する可能性がある。 また 3， LTRのプロモーターにより、 ウィルスゲノムの 3' 側に位置する宿主由来の遺伝子が発現されてしまう可能性が ある (Rosenberg, N. , Jolicoeur, P. , Retoroviral Pathogenesis. Retroviruse s. Cold Spling Harbor Laboratory Press, 475-585, 1997) 。 この現象はレトロ ウィルスベクターにおいてすでに問題とされ、 回避の方法として SINベクターが開 発された（Yu, S. F. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 83 (10)， 3194-8， 1986)。 ジーントランスファーベクター上の 3' LTRの U3部分を欠失させることによ り、 標的細胞内では 5' LTRや 3' LTRのプロモーターが無くなるため、 全長の RNAや 宿主遺伝子の転写が起こらない。 そして、 内部プロモーターからの目的遺伝子の 転写のみが行われることになり、 安全性が高く、 高発現のベクターとなることが 期待される。 このようなベクターも、 本発明の方法に従って製造することが可能 である。 SINベクター製造のためのジーントランスファーベクターの構築は公知の 方法に従えばよい (W001/92508) 。
レトロウィルスの産生には、 宿主細胞でパッケージングシグナルを有するジー ントランスファーベクター DNAを転写させ、 gag， pol蛋白質おょぴエンベロープ蛋 白質の存在下でウィルス粒子を形成させる。 ジーントランスファ一べクタ一 DNAは 、 プラスミ ドのような DNAベクターであってもよく、 あるいはパッケージング細胞 の染色体 DNAに組み込まれていてもよい。 ジーントランスファーベクター DNAにコ 一ドされるパッケージングシグナル配列は、 この配列により形成される構造を保 持できるように可能な限り長く組み込むことが好ましい一方で、 該べクター DNA上 のパッケージングシグナルと、 gag， po 1蛋白質を供給するパッケージングべクタ一 との間で起こる組み換えによる野生型ウィルスの出現頻度を抑制するためにはこ れらベクター間の配列の重複を最小限にする必要がある。 従って、 ジーントラン スファ一べクタ一 DNAの構築においては、 パッケージング効率および安全性の両者 を満足させるために、 パッケージングに必要な配列を含むできる限り短レ、配列を 用いることが好ましい。
パッケージングシグナルとしては、 パッケージングベクターが導入された細胞 によりパッケージングされる限り制限はなく、 パッケージングベクターの種類に 合わせて、 レトロウイルス由来、 レンチウィルス由来、 免疫不全ウィルス由来の シグナル配列などが用いられる。
例えば、 SIVagm由来のパッケージングベクターの場合は、 HIVベクターはパッケ 一ジングされないため、 用いられるシグナル配列の由来としては SIVのみに制限さ れると考えられる。 伹し、 HIV由来のパッケージングベクターを用いた場合、 SIV 由来のジーントランスファーベクターもパッケージングされるので、 糸且換えウイ ルスの出現頻度を低下させるために、 異なるレンチウィルス由来のジーントラン スファ一べクタ一とパッケージングベクターとを組み合わせてべクタ一粒子を形 成させることが可能であると考えられる。 この場合、 霊長類のレンチウィルスの 間の組み合わせ （例えば、 HIVと SIV) であることが好ましい。
ジーントランスファ一ベクター DNAでは、 gagタンパク質が発現しないように改 変されていることが好ましい。 ウィルス gagタンパク質は、 生体にとって異物とし て認識され、 抗原性が現れる可能性がある。 また、 細胞の機能に影響を及ぼす可 能性もある。 gagタンパク質を発現しないようにするためには、 gagの開始コドン の下流に塩基の付加や欠失等によりフレームシフトするように改変することがで きる。 また、 gagタンパク質のコード領域の一部を欠失させることが好ましい。 一 般にウィルスのパッケージングには、 gagタンパク質のコード領域の 5，側が必要で あるとされている。 従って、 ジーントランスファーベクターにおいては、 gagタン パク質コード領域の C末側を欠失していることが好ましい。 パッケージング効率に 大きな影響を与えない範囲でできるだけ広い gagコード領域を欠失させることが好 ましい。 また、 gagタンパク質の開始コドン （ATG) を ATG以外のコドンに置換する ことも好ましい。 置換するコドンは、 パッケージング効率に対する影響が少ない ものを適宜選択する。 これにより構築されたパッケージングシグナルを有するジ ーントランスファーベクター DNAを、 適当なパッケージング細胞に導入することに より、 ジーントランスファーベクター DNAの転写産物が取りこまれたウィルスべク ターを生産させることができる。 生産させたウィルスベクターは、 パッケージン グ細胞の培養上清等から回収することができる。
パッケージング細胞に使われる細胞としては、 一般的にウィルスの産生に使用 される細胞株であれば制限はない。 ヒトの遺伝子治療用に用いることを考えると 、 細胞の由来としてはヒトまたはサルが適当であると考えられる。 パッケージン グ細胞として使用されうるヒ ト細胞株としては、 例えば 293細胞、 293T細胞、 293E BNA細胞、 SW480細胞、 U87MG細胞、 H0S細胞、 C8166細胞、 MT- 4細胞、 Molt- 4細胞、 HeLa細胞、 HT1080細胞、 TE671細胞などが挙げられる。 サル由来細胞株としては、 例えば、 C0S1細胞、 C0S7細胞、 CV-1細胞、 BMT10細胞などが挙げられる。 また、 既 存のパッケージング細胞を用レ、ることも可能である。 パッケージング細胞として は、 例えば Bosc23細胞、 PE501細胞などが挙げられる。
ベクターが保持する外来遺伝子としては特に制限はなく、 蛋白質をコードする 核酸であってもよく、 また、 例えば、 アンチセンスまたはリポザィムなどのタン パク質をコードしない核酸であってもよい。
近年、 遺伝子治療の標的として造血幹細胞をはじめとする各種の幹細胞が注目 されている （花園豊， Molecular Medicine, Vol, 36， No. 7, 1999) 。 ネガティブ 鎖 RNAウィルスのへマグルチ二ン活性を持つェンべ口一プ蛋白質を持つシユードタ ィプレトロウイルスベクターは、 ヒト骨髄由来 CD34陽性細胞に対し高い効率で遺 伝子を導入することができる （W001/92508) 、 この CD34陽性細胞は造血幹細胞 を含む分画として近年注目されている。 CD34陽性細胞は、 メチルセルロースを含 む培地を用いたコロニーアツセィにおいて多分化能を持つこと （Kirshenbaum, A. S. et al.， J. Immunol. , 148 (3) , 772-7, 1992) や、 複合免疫不全系統である N OD I SCIDマウスに CD34陽性細胞を移植するとマウス骨髄に生着し造血系の再建が 認められること (Larochelle, A. et al. , Nat. Med. , 2 (12) , 1329 - 37， 1996) が報告されており、 少なくとも CD34陽性細胞分画中に非常に未熟で幹細胞に近い 状態の細胞が存在すると考えられている。 また、 CD34陽性細胞中の造血幹細胞は 非分裂状態であり、 一般にレトロウィルスべクタ一では遺伝子導入効率が低いが
(Kiem, H. P. et al. , Curr. Opin. Oncol. , 7 (2) , 107—14， 1995) 、 ネガティ プ鎖 RNAゥィルスのへマグルチ-ン活性を持つェンべ口ープ蛋白質を持つシユード タイプ化ベクターにより感染効率を大幅に改善することが可能であると考えられ る。 特に、 HIVや SIVベクターなどのレンチウィルスベクターを用いれば、 非分裂 細胞に対する遺伝子導入効率はさらに上昇することが期待される。 本発明のシァ ル酸結合活 1"生を持つ蛋白質でシユードタイプィヒされたレトロウイルスベクターの 製造方法は、 血球系または造血系細胞への遺伝子導入のためのベクターの製造に おいて有用である。 本発明は、 本発明のウィルスの製造方法により、 血球系また は造血系細胞への遺伝子導入用ベクターを製造する方法に関する。 また本発明は 、 本発明の方法で製造されたベクターを血球系または造血系細胞に接触させるェ 程を含む、 血球系または造血系細胞へ遺伝子を導入する方法、 および血球系また は造血系細胞への遺伝子導入のための、 本発明の方法で製造されたベクターの使 用に関する。 血球系および造血系細胞に対する外来遺伝子導入の評価は、 例えば 既知の様々な表面抗原'に対する抗体を用いたフローサイトメ一ターによる解析や コロニーアツセィ、 造血系を破壊したマウスなどに造血細胞を移植して行う造血 系再構築などにより検証することが可能である。
シァノレ酸結合活性を持つ蛋白質によりシユードタイプ化されたレト口ウィルス ベクターは、 血球系細胞および造血系細胞に対する高率な遺伝子導入が可能であ るので、 ADA欠損症 (Blaese, R. M. , Pediatr. Res.， 33 (1 Suppl) , S49- 53, 199 3) 、 血友病 (Kay, M. A. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 96 (18)， 997 3-5, 1999) 、 および Fanconi貧血症などの血液細胞を対象とした遺伝子治療にお いて有用である。 投与は例えばェクスビボ法により行うことができる。
具体的には、 本発明の方法で製造されるべクターが適用可能な造血細胞系を対 象とした遺伝子治療としては、 例えは、 腫瘍を化学抗癌剤治療するときの幹細胞 の保護を目的とした薬剤耐性遺伝子 MDR1の利用 （Licht, T. et al. , Gene Ther. (2000) 7, 4， 348-58) 、 ファンコ一-貧血症のための正常 FANCC遺伝子の導入 （L iu， J. M. et al. , Hum. Gene Ther. (1999) 10, 14, 2337 - 46) 、 ェクスビボ幹 細胞増殖を補助するためのサイト力インの組み合わせ （トロンボポェチン、 イン ターロイキン 6および 11、 並びに Fit- 3リガンド） の導入 （W099/07831) 、 血球減 少症を治療するための Fit- 3ァゴニストなどのキメラ蛋白質の発現 （W098/46750 ) 、 i3セラミアを治療するためのヒト ]3グロビン遺伝子の導入 （W09741141) 、 I L- 6依存的な多発性骨髄腫治療のための IL-6アンタゴニストと自殺遺伝子の発現の 組み合わせ治療 （独国特許 DE19704979) 、 造血因子の組み合わせによる受容体ァ ゴニスト [インターロイキン （GM-CSF, G-CSF-Serl7, M- CSF， エリスロポエチン， IL-1, IL-14, IL-2, IL— 5, IL-6, IL一 7, IL— 8, IL— 9， IL-10, IL-ll, IL - 12， I L - 13， IL-15) 、 白血病抑制因子 （LIF)、 flt3/f lk2リガンド、 ヒ トソマト トロピ ン、 B細胞増殖因子、 B細胞分化因子、 赤血球分化因子 （EDF)、 または幹細胞因子 (SCF) ] (W097/12985) 、 幹細胞培養および造血疾患の遺伝子治療に用いられる c- mpl受容体ァゴニスト （TO97/12978) 、 ヒ ト造血始原細胞の増殖に用いられる IL- 6 および IL- 6可溶型受容体の融合蛋白質 （Nat. Biotechnol. (1997) 15, 2, 142 - 45 ) 、 造血始原細胞の増殖に用いられる IL- 6スーパーァゴニストおょぴスーパーァ ンタゴ二スト （W096/18648) 、 血液疾患の治療に用いられる Factor- X (J. Cell. Bioche. (1995) Suppl. 21A， 410) 、 ヒト造血始原細胞の増殖に用いられる幹細 胞因子、 IL- 6、 および可溶型 IL- 6受容体複合体 （Gene Ther. (1995) 2, 9, 694) 、 R Aウィルスを標的とするリボザィムおよび HIV感染防御および細胞内免疫に有 用なアンチセンスおよび/または RNAデコイ （W096/22368) などの遺伝子導入が挙 げられる。 本発明は、 これらのいずれかまたはその組み合わせをコードするウイ ルスベクターであって、 シアル酸結合膜蛋白質をエンベロープに含むウィルスべ クタ一の製造方法に関する。
また本発明の方法で製造されるベクターは、 鼻腔の粘膜上皮細胞および肺の気 管支粘膜上皮細胞など、 粘液を持つ細胞に対する感染能力が高い。 気管上皮など の粘膜細胞は、 従来のウィルスベクターでは遺伝子導入が困難であり、 導入に際 して物理的障害を取り除く処理がされており、 例えば VSV - Gシュードタイプ HIVベ クタ一を用いた遺伝子導入では二酸化硫黄などにより傷害しないと十分な導入効 果が認められていない （L. G. Johnson et al. , Gene Therapy, 7, 568-574, 200 0) 。 本発明の方法で製造されるベクターは、 従来では遺伝子導入が困難であった T JP2003/011299
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粘液を持つ細胞に対して、 細胞や組織を傷害することなく高い効率で遺伝子を導 入することが可能である （W001/92508) 。 本発明は、 本発明のウィルスの製造方 法により、 粘液を有する細胞への遺伝子導入べクターを製造する方法に関する。 また本発明は、 本発明の方法で製造されたべクターを粘液を有する細胞に接触さ せる工程を含む、 粘液を有する細胞へ遺伝子を導入する方法、 および粘液を有す る細胞への遺伝子導入のための、 本発明の方法で製造されたべクターの使用に関 する。 粘液を有する細胞としては、 特に粘膜上皮細胞、 具体的には、 例えば鼻腔 または肺の気管支の粘膜上皮細胞などが挙げられる。
具体的な適用例としては、 例えば、 抗原提示細胞 （APC) の濃度が高いことを利 点として応用した皮膚'粘膜への遺伝子 （IL - 2， IFN- y , TGF - )3等） 導入による 免疫誘導 （W095/05853) 、 遺伝子の経口的粘膜投与によるロタウィルスワクチン (J. Virol. (1998) 72, 7, 5757 - 61) 、 自己免疫疾患を治療するための粘膜投与 (W09746253) 、 感染予防のための粘膜投与 （W096/21356) 、 性病またはパピロー マウィルス感染による子宮頸癌を予防するための、 女性性器粘膜への遺伝子投与 (Infect. I画 n. (1998) 66, 1， 322-29) 、 粘膜投与による投与の容易性と安全 性の向上 （Proc. Am. Assoc. Cancer Res. (1995) 36， 86 Meet. , 418) などが挙 げられる。
本発明における組み換えレトロウィルスべクターの製造方法は、 具体的には、 例えば、 （a ) レトロウイルスのゲノム RNAを転写し、 かつ gag蛋白質、 pol蛋白質 、 およぴシアル酸結合活性を有する膜蛋白質を発現する細胞 （ウィルス産生細胞 ) を提供する工程、 および （b ) グラム陽性菌由来ノィラミニダーゼの存在下で 該細胞を培養し、 産生されたウィルスを回収する工程を含む方法である。 レトロ ウィルスのゲノム R Aは、 ウィルス粒子中にパッケージングされ、 標的細胞の染色 体に組み込まれる機能を有する限り、 野生型ウィルスのゲノムから改変されてい てよく、 例えば両端に LTRを持ち、 内部にパッケージングシグナル配列を含む R A であってよい。 ゲノム RNAには、 所望の遺伝子を組み込むことができる。 組み込ま れた外来遺伝子は、 LTRのプロモーター活性により発現させることもできるし、 ゲ ノムの内部に他のプロモーターを組み込んでそのプロモーターから発現させても よい。
ウィルス産生細胞で発現させる gagおよび pol蛋白質、 およびゲノム RNAは、 これ らがアセンブルされてウィルスが形成される限り、 異なるウィルスに由来するも のであってもよい。 例えば、 HIV由来のウィルス蛋白質を発現するパッケージング 細胞を用いて、 SIVのゲノム RNAをパッケージングすることができる。 このとき、 パッケージング細胞にシアル酸結合活性を持つ膜蛋白質を一時的あるいは持続的 に発現させる。 グラム陽性菌由来ノィラミニダーゼの存在下で上記のウイ ス産 生細胞を培養することにより、 シアル酸結合活性を持つ膜蛋白質をエンベロープ に持つレトロウイルスが培養液中に放出される。 この培養物あるいは培養上清を 回収することにより、 産生されたウィルスを得ることができる。
例えば本発明におけるレトロウイルスベクターの製造は、 次のように行うこと ができる。 但し、 以下に示すウィルスベクターの製造方法の具体例は一例であり 、 当業者であれば適宜変更することが可能である。
組み換えウィルスのシユードタイプィヒに用いるウィルスエンベロープ蛋白質を プラスミ ドベクターを用いて発現させる場合には、 例えば該蛋白質をコードする 遺伝子を pCAGGS (Niwa, H. et al.， Gene : 108, 193-200, 1991) 等に組み込んで 発現ベクターを構築する。 このベクターに、 例えばネガティブ鎖 RNAウィルス （ィ ンフルェンザウィルスまたはセンダイウィルスなど） の HA (または HN) 蛋白質、 F 蛋白質、 M蛋白質をコードする遺伝子を組み込む。 例えば、 インフルエンザウィル ス（H1N1)由来へマグルチニン蛋白（HA)発現プラスミドの構築であれば、 プラスミ ド pDREF HisD (Microbiol. Immunol. , 44 (8) , 677 - 685, 2000) をテンプレートと し、 適当なプライマー対を用いた PCRにより ΗΑ蛋白質の 0RFを増幅する。 増幅断片 を Notlにより切断後、 pCAGGSに Xhol- Notl部位を付加したべクタ一の Notl部位に組 み込む。 これにより、 HA蛋白発現プラスミ ド pCAGGS-HA (W001/92508) が得られる 。 また、 センダイウィルスのエンベロープ蛋白質発現プラスミド等であれば、 例 えばセンダイウィルス Z株の全長ゲノム DNA pSeV18+b (+) (Hasan, M. K. et al. , 1997, J. General Virology 78： 2813-2820) から切り出した F、 H、 およひ蛋 白遺伝子を pCAGGSの Xholサイトに導入することにより、 センダイウィルス由来 F、 HNおよび M蛋白発現ベクター (それぞれ pCAGGS F、 pCAGGS HN、 および pCAGGS M と称す） （W001/92508) を作製することができる。
レトロウイルス産生であれば、 ウィルス産生細胞としては、 例えばヒト胎児腎 細胞由来細胞株 293T細胞 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, pp. 8392-8396 ， 1993) を用いることができる。 293T細胞は、 例えば 10%非動化ゥシ胎児血清を 含むダルベッコ改変イーグル培地 （DMEM, GibcoBRL) で培養する。 DNAベクターの トランスフエクションは、 LIPOFECTAMINE PLUS (GibcoBRL) などを用いて添付説 明書に従って行うことができる。 一例を挙げれば、 293T細胞を 6ゥヱルのプラス チックプレートへ 1ゥヱルあたり I X 106個の細胞密度でまき、 炭酸ガスインキュ ベータ一中 （37で、 10%炭酸ガス存在下） で 48時間培養する。 トランスフエクショ ンの 30分前に培養液を 1ゥヱルあたり 800 μ 1の 1 %ゥシ血清アルプミン （GibcoBR L) を含む D-MEM (GibcoBRL) に培地交換し培養を続ける。
ジーントランスファーベクターとしては特に制限されないが、 例えばマウス幹 細胞ウィルス （Murine Stem Cell Virus ; MSCV) (CL0NTECH社製） (R. G. Hawle y et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 : 10297-10302 (1996)； R. G. Hawley et al. , Gene Thrapy 1： 136-138 (1994) ) を用いることができる。 ここに、 発 現させたい所望の遺伝子を組み込んで使用する。 トランスフエクションに使用す る DNA量は、 例えば 1ゥ工ルあたり 700ng のジーントランスファーベクターと、 3 00ngのパッケージングベクター （pCL- Eco, pCL-Ampho (MuLV 4070A)、 共に IMGENE X社） (Naviaux, R. K. et al. , J. Virol. 70： 5701-5705 (1996) ) とを使用し 、 それらに加えて 200ngの上記ネガティブ鎖 RNAウィルスのェンベロープ蛋白発現 ベクターを単独あるいは任意に組み合わせて使用することができる。 DNAを 100 1 の Opt iMEMに溶解後に 6 μ ΐの PLUS reagent (GibcoBRL) を加えて撹拌後 15分室温で 静置する。 DNAと PLUS reagent (GibcoBRL) との混合液に、 lOO ju 1の OptiMEMで希 釈した 4 μ 1の LIPOFECTAMINEを添加して撹拌後さらに 1 5分室温で静置する。 以上 の方法により調製した DNAと LIPOFECTAMINEとの複合体を含む溶液を 6ゥエルプレ 一トで培養している 293T細胞へ滴下してゆるやかに撹拌した後に炭酸ガスインキ ュベータ一中 （37°c, ιο%炭酸ガス存在下） で 3時間培養する。 培養後 1ゥヱル あたり 1mlの 1 %ゥシ血清アルブミン （GibcoBRL) と 15〃 g/mlの濃度のトリプシ ン （GibcoBRL) を含む DMEM (GibcoBRL) を添加し、 炭酸ガスインキュベータ一中
(37。C， 10%炭酸ガス存在下） で 24時間培養する。 その後 1ゥヱルあたり 2 ralの 1 %ゥシ血清アルブミン、 5 Ai g/mlのトリプシン （Gibco BRL) および 0. 01 unitのグ ラム陽性菌由来ノイラミエダーゼを含む DMEMに培地交換し、 24時間培養後に培養 上清を回収、 0. 45 μ ηιのポアサイズのフィルター （DISMIC- 25CS フィルター、 ADVA NTECなど） で濾過してベクター溶液を得ることができる。 グラム陽性菌由来ノィ ラミニダーゼは、 例えば放線菌由来 NA、 具体的には M. viridifaciens由来 NAを 用いることができる。 NAの用量は適宜調整することができる。 ネガティブ鎖 RNAゥ ィルスのへマグルチニン活性を持つェンべ口ープ蛋白質でシユードタイプ化した レトロウィルスは、 肺の気管支粘膜上皮細胞など粘液を持つ細胞に対して高い感 染能力を持つことから。 このようにして製造されるベクターは、 粘液を持つ細胞 への遺伝子導入に有用である。 また、 このウィルスベクターは、 ヒト骨髄 CD34+細 胞および CD34—細胞の両方に遺伝子導入能を持っていること力ゝら、 造血系細胞に対 する遺伝子導入に有用である。
モロ-一マウス肉 B重ゥ ノレス (Moloney murine sarcoma virus ベースにし たシユードタイプレトロウイルスベクターも、 本発明において好適に製造される 。 また、 エンベロープ蛋白質として VSV-Gをさらに含むベクターを作製することも できる。 例えば、 ジーントランスファーベクターとして、 上記の pMSCV EGFP、 ま たはモロニ一マウス肉腫ウィルス （Moloney murine sarcoma virus) 由来の LTRの 制御下に lacZを発現する pLZRNL (Yee, J. - K. et al. , Methods In Cell Biology, vol. 43, pp. 99-112 (1994)； Xu, L. et al. , Virology 171, 331-341 (1989) ) を用いて、 以下に示すように様々なエンベロープ蛋白質でシユードタイプ化した レトロウィルスべクターを作製することが可能である。
293T細胞 （ヒト胎児腎臓由来細胞株） は、 10%非働化仔ゥシ血清 (BIO WHITTAK ER) を含む DMEM高グルコース （Gibco BRL) を用いて、 37。C、 10%C02で培養する 。 この 293T細胞を 6ゥエルのプラスチックカルチャープレートへ 1ゥエルあたり 5 X 105個でまき、 37°C、 10% C02で 48時間カルチャーする。 培養液を 1ゥヱルあたり 800 の 1%ゥシ血清アルブミンを含む DMEMに置換してトランスフエクションに用 いる。 1ゥエルあたりジーントランスファーベクター （pMSCV EGFPまたは pLZRNL ) 700ngに加えて、 VSV- G発現プラスミド pVSV- G (Indiana血清型株由来） （Clont ech) 100ng、 ネガティブ鎖 RNAウィルスの HA (または HN) 、 F、 およひ1蛋白発現 プラスミド （pCAGGS中） をそれぞれ 200ng、 並びにマウスレトロウイルス外殻蛋白 発現プラスミド pCL-Eco、 および pCL- Ampho (Imgenex) (Naviaux, R. K. et al. , J . Virol. 70： 5701-5705 (1996) ) 300ngを任意に組み合わせて、 ΙΟΟ μ Ιの Opti M EMに溶解後、 6 の PLUS Reagent (Gibco BRL) を加えて攪拌、 15分間室温で静置 する。 これに、 100 1の Opti MEMで希釈した 4 /z 1の LIPOFECTAMINE Reagent (Gibe o BRL) を添カ卩して攪拌後さらに室温で 15分間静置し、 これを上記の 293T細胞に滴 下して緩やかに攪拌し、 37°C、 10% C02下で 3時間カルチャーする。 1ゥエルあた り 1mlの 1%ゥシ血清アルプミンおよび 15 μ g/mlのトリプシン （Gibco BRL) を含む D MEMを加え、 37° (：、 10% C02で、 24時間培養、 その後 1ゥェルあたり 2 mlの 1%ゥシ 血清アルブミン、 5 ;u g/mlのトリプシン （Gibco BRL) および 0. 01 unitのグラム陽 性菌 （例えば放線菌） 由来ノィラミニダーゼを含む DMEMに培地交換し、 24時間培 養後に培養上清を回収、 0. 45 mのフィルターで濾過してベクター溶液を得る。 また、 本発明は特にレンチウィルスベクターの製造に好適に適用される。 以下 に、 VSV- Gシユードタイプレンチウィルスベクターの製造方法の一例を示す。 ベクター系の構築には、 例えば非病原性のァフリ力ミ ドリザル免疫不全ウィル スのクローンである SIVagm TY0- 1株を用いることができる。 SIVagm TY0-1を組み 込んだプラスミドとしては、 例えば pSA212 (J. Viol. , vol. 64, pp. 307-312, 199
0) を材料にして構築することができる。 ジーントランスファーベクターおよびパ ッケージングベクターの構築は、 公知の文献を参照することができる （W001/9250
8) 。 具体的には、 ベクター粒子形成に必要な蛋白質を供給するため、 gag、 pol、 tat、 rev, vif, vpr I xの各配列をプロモーター下流に配置した発現プラスミ ド
(パッケージングベクター） を構築する。 野生型ウィルスの産生を回避するため パッケージングシグナル ψおよび envの大部分を除去することが好ましい。 gag上 流に SD配列、 tat I revの第一ェクソンの下流に RRE配列を揷入し、 パッケージン グベクター上のすべての遺伝子が発現しうるようにすることができる。 さらに、 ベクターのパッケージングに必須ではないと考えらる nefの全酉 S列を除外すること ができる。
ベクター内にパッケージングされる RNAを供給するジ一ントランスファ一べクタ 一には、 ゲノム両端の LTR配列、 SD、 Ψ、 RREが組み込まれたものを構築する。 さ らに、 ジーントランスファーベクターの 5' LTRプロモーター領域を外来のプロモ 一ターと置換してもよい。 また、 3' LTRの配列を部分的に削除し、 標的細胞から 全長のベクター mR Aが転写されることを防止する Self Inactivating Vector (SIN ベクター） を作製し、 プロモーターとして例えば CMVプロモーターを挿入し、 その 下流に所望の外来遺伝子を,組み込む。
シユードタイプベクター粒子を形成するための外殻蛋白質供給ベクターとして V SV - G発現ベクターを用いることができる。 例えば、 VSV - G供給ベクターとして、 こ れまでにレトロウイルスベクター、 HIVベクターのシユードタイプ化において実'績 のある pVSV - Gを使用してもよい （Burns, J. C. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90： 8033-8037) 。
以下にその詳細を記載する。 くパッケージングべクタ一の構築 >
vifと tat I revの第 1ェクソンを含む領域 (5337-5770) に相当する DNA断片を 適当なプライマー対を用いて PSA212をテンプレートとした PCRにより得る。 PCRプ ライマーに制限酵素部位である EcoRI部位を付加することで DNA断片の 3'端に EcoRI 部位を持つ断片を調節する。 PCR断片を Bginと EcoR こより切断した後、 ァガロー スゲル電気泳動と Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega) で精製 する。 以上のようにして得た DNA断片と、 gag / pol領域をコードする DNA断片 (Xh ol (356) 部位から Bglll (5338) 部位まで） を、 pBluescript KS+ (Stratagene ) の XhoI-EcoRI部位へライゲーシヨンする。 次に、 Rev responsive element (RRE ) と tat / revの第 2ェクソンを含む領域 964 - 7993) に相当する DNA断片を PCR で増幅する。 テンプレートとしては、 例えば pSA212を用い、 PCRにより 3'端に Notl 部位を付加し、 EcoRIと Notlで切断後に精製し、 gag - tat I revを組み込んだ pBlue script KS+の EcoRI- Notl部位へ組み込む。
スプライシングドナ一 (SD) 部位は、 この配列を含む DNA断片を合成し、 合成時 に 5'端に Xhol部位、 3'端に Sail部位を付加し、 上記の gag - RRE-tat / revを組み込 んだ pBluescript KS+の Xhol部位に組み込む。 得られたプラスミドを Xholと Notlに より切断し、 SD- gag-RRE-tat I revを含む断片を精製する。 pCAGGS (Gene, vol. 108， pp. 193-200, 1991) の EcoRI部位に Xhol / Notlリンカ一を組み込んだプラス ミドを作製し、 Xhol- Notl部位に上記の SD- gag-RRE-tat / rev断片を組み込む。 以上の方法により得られたプラスミドをパッケージングベクター pCAGGS I SIVagm gag-tat I revとして使用する （W001/92508)。
くジーントランスファーベクターの構築 >
SIVagmTYOl由来の 5' LTR領域 (8547-9053 + 1-982、 5， 端に Kpnl部位、 3， 端に EcoRI部位を付加） 、 3' LTRを含む領域 (8521-9170, 5' 端に Notl部位と BamHI部 位、 3， 端に Sacl部位を付加） 、 および RRE配列 （7380-7993、 5' 端に EcoRI部位、 3' 端に SaGlI部位を付加） を適当なプライマー対を用いて、 pSA212を トとした PCRでそれぞれ増幅する。 pEGFPN2 (Clontech) 由来の CMVプロモーター領 域 (1-600、 5' 端に SacII部位、 3' 端に Notl部位を付加） を適当なプライマー対 で増幅する。 これらの DNA断片の末端を切断、 精製後に pBluescript KS+ の Kpnl - S acl部位に 5' LTR→RRE→CMVプロモータ一" 3' LTRの順でライゲーシヨンし組み込 む。 レポーター遺伝子として例えば pCMV β (Clontech) 由来の βガラク トシダー ゼ遺伝子を含む Notl断片を Notl部位へ組み込み、 Kpnl - Saclで切断して 5' LTRから 3' LTRまでを含む DNA断片を切り出し、 pGL3 Controlベクター （Promega) の Kpnl- Sacl部位へ組み込み、 ジーントランスファーベクター pGL3C / 5， LTR. U3G2 / RR Ec / s / CMV F ]3 -gal I WT3' LTRとする。
また、 pEGFPC2 (Clontech) 由来の CMVプロモーター領域と EGFPをコードする镇 域 （1-1330、 5'端に SacII部位、 3'端に Notl部位と BamHI部位と翻訳ストップコド ンを付加）を適当なプライマー対を用いて PEGFPC2をテンプレートとした PC こより 増幅する。 4種の PCR断片をそれぞれ制限酵素 Kpnlと EcoRI、 EcoRIと SacII、 BamHI と Sacl、 SacIIと BamH切断した後に精製し、 pBluescript KS+の Kpnl - Saclの間に 5' LTR→RRE→CMVプ口モータ一 EGFP→3' LTRの順にラィゲーシヨンして組み込む （pBS /5' LTR. U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3' LTR) 。 プラスミ ド pBS/5' LTR. U3G2/RREc/s/CM VFEGFP/WT3' LTR を Kpnl - Saclで切断して 5' LTR-3' LTRを含む DNA断片を調製し、 pGL 3 Control (Promega) ベクターの Kpnl- Sacl部位へ糸且み込み、 ベクター（pGL3C/5' L TR. U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3' LTR)を構築する。
< 5' LTRの改変〉 .
5' LTRの TATAボックスの下流から gag領域 （9039-9170 + 1-982) を含む断片を 適当なプライマー対を用いて PSA212をテンプレートとした PCRで増幅する。 サイト メガロウィルス由来の CMV Lプロモーター （pCI (Promega) 由来、 1-721) を PCRに より増幅する。 5' LTRの TATAボックス下流を含む断片と、 プロモーターを含む断 片とを混合し、 これをテンプレートとして、 プロモーターの 5' 側プライマーと LT Rの 3， 側プライマーを用いて PCRを行い、 プロモーターと 5， LTRとのキメラプロモ 一ターの DNA断片を得る。 得られた DNA断片をジーントランスファーベクター （pGL 3C/5' LTR. U3G2/RREc/s/CMVF β -gal/WT3' LTR) の Kpnl- EcoRI部位に組み込む （pGL3 C/CMVL U3G2/RREc/s/CMVF j3 -gal/WT3' LTR) 。 同様に、 上記の PCRにより得られた D NA断片を、 ベクタ一 pGL3C/5， LTR. U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3' LTRの Kpnl- EcoRI部 位にも組み込む （pGL3C/CMVL. U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3' LTR)。
<3' LTRの改変； SIN (self inactivating vector) ベクターの作製〉
3' LTRの U3領域 5'側 27bp と 3'側 15bp および R領域を含む DNA断片を適当な プライマー対を用いて PSA212をテンプレートとした PCRで増幅する。 この断片を、 前節で得られたキメラプロモータ一導入ジーントランスファーベクタ一 pGL3C/CMV L. U3G2/RREc/s/CMVF β - gal/WT3， LTRの Sal I- Sacl部位に糸且み込む （pGL3C/CMVL. U3G 2/RREc/s/CMVF j3 -gal/3' LTR Δϋ3) 。 同様に、 この断片を pGL3C/CMVL. U3G2/RREc/ s/CMVFEGFP/WT3' LTRの Sail- Sacl部位へも組み込む （pGL3C/CMVL. U3G2/RREc/s/CMV FEGFP/3LTRAU3) (W001/92508) 。
構築したプラスミ ドは、 定法に従い DH5ひ （東洋紡） にトランスフォームし、 寒 天培地上で培養、 出現したコロエーをテンプレートとして、 PCR等により構造が正 しいことを確認する。 確認されたクローンについて、 100mlの LB培地で培養し、 QI AGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN) を用いてプラスミ ドを精製する。
<ウイノレスベタター回収 >
293T細胞を 6ゥエルのプラスチックカルチャープレートへ 1ゥヱルあたり 5 X 10 5個でまき、 37°C、 10% C02で 48時間カルチャーする。 培養液を 1ゥエルあたり 800 μ ΐの Opti MEM (HAを用いた場合は 1°/。BSAを含む） に置換してトランスフエクショ ンに用いる。 1ゥエルあたり上記のジーントランスファーベクター 600ngおよぴ 上記のパッケージングベクター 300ngに加え、 ネガティブ鎖 RNAウィルスの HA (ま たは HN) および F蛋白発現プラスミド （pCAGGS中） 100- 300ng、 VSV- G発現プラス ミド pVSV- G (Clontech) 100ng等のエンベロープ蛋白質発現プラスミドを任意に 組み合わせて、 lOO ju lの Opti MEMに溶解後 6 の PLUS Reagent (Gibco BRL) を加 T JP2003/011299
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えて攪拌、 15分間室温で静置する。 これに、 4 1の LIPOFECTAMINE reagent (Gibe o BRL) を加えた 100 μ ΐの Opti MEMを添加し攪拌後さらに室温で 15分間静置し、 こ れを上記の 293T細胞に滴下して緩やかに攪拌し、 37で、 10% C02で 3時間カルチヤ 一する。 1ゥエルあたり lmlの 20%非働化ゥシ血清 （HAを用いた場合はゥシ血清の 代わりに 1%BSAおよび 5 μ §/πι1のトリプシン） を含む D - MEMを加え、 37°C、 10% C02 で 12時間カルチャーした後に、 1ゥェルあたり 2mlの 10%非働化ゥシ血清を含む D - M EMに培地交換し、 （HAを用いた場合はゥシ血清の代わりに 1%BSAおよび 5 /Z g/mlのト リプシンを含む D-MEMにて M.
Figure imgf000040_0001
24時間培養後に 培養上清を回収、 0. 45 μ mのフィルターで濾過したものを使用する。
く SIVagmベクタ一による遺伝子導入 >
293T細胞を 6ウェ^/のプラスチックカルチャープレートへ 1ゥエルあたり 5 X 10 5個でまき、 37°C、 10% C02で 48時間カルチャーする。 カルチャーより培養液を除去 し、 ベクター液にポリプレン (Sigma) を最終濃度 8 μ § / mlで添加したものを lml 重層し、 37°C、 10% C02で 3時間カルチャーし、 ベクターを感染させる。 3時間後 に培養液を lml加え、 1日後に培養液を交換する。 さらに 1日後に、 J3 -Gal発現べク ターの場合は、 ]3 - Gal Staining Kit (Invitrogen) を用いて X- galを基質とした 染色を行い、 標的細胞での ]3ガラタトシダーゼの発現を光学顕微鏡による検鏡で 確認する。 EGFP発現ベクターの場合は、 蛍光顕微鏡により解析する。
<ベクターの力価測定〉
ベクターの力価測定は、 ベクター液 lmlによって遺伝子導入される細胞の数によ つて計算する。 293T細胞を 1 X 106 I plateで 6ゥエルカルチャープレートにまき 、 48-72時間カルチャーする。 ここに、 上記と同様の方法で段階的に希釈したベタ タ一液を感染、 感染後 48時間後に X- gal染色を行う。 光学顕微鏡で 200倍の倍率で 検鏡、 例えば視野内の遺伝子導入細胞数を測定し、 3視野の平均を求め、 視野の 面積とプレートの面積よりもとめた係数 854. 865をかけることにより力価の算出を 行う。 これにより算出されるウィルスベクターの力価の単位は Transducing Unit P2003/011299
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(T. U. ) I mlと定義される。
このようにして作製される SIVagmベクターは、 培養細胞および生体内外の細胞 に対して高い遺伝子導入能を持つ。 上記のような、 ジーントランスファーベクタ 一、パッケージングベクター、 およびエンベロープ発現ベクターという複数種類 の独立したプラスミ ドのコトランスフエクションによるべクタ一のパッケージン グにおいては、 野生型ウィルスの再構成の確率は極めて低いと考えられる。 また 、 ベースである SIVagmTY0_lは、 自然感染おょぴ実験的な感染の両方において病原 性を示さないことが確認されている （Ohta, Y. et al. , Int. J. Cancer 41, 11 5-22, 1988; Miura, T. et al. , J. Med. Primatol. 18 (3-4)， 255-9. 1989； Hon jo, S. et al. , J. Med. Primatol. 19 (1) , 9 - 20， 1990) 。 さらに、 一般にレン チウィルスは種特異性が強く、 他種の動物では病原性が低い傾向がある （Novembr e, F. J. et al. , J. Virol. 71 (5)， 4086-91, 1997) ことからもベクターの安全 性は高いものと考えられる。
このベクター産生系は、 構築過程においてパッケージングベクター上からはパ ッケージングシグナル配列が削除されているため、 ウィルス蛋白質をコードする R NAは粒子内にパッケージングされない。 また、 rev蛋白質は RREに結合し、 RNAの細 胞質への輸送ゃスプライシングの抑制などを行うことでウイルス蛋白質の発現、 全長 RNAのウィルス内への取り込みが行われるため、 パッケージングベクターおよ びジーントランスファ一べクターの双方に RREを組み込んだことにより、 パッケー ジングベクターの raRNAスプライシングが制御され、 すべての遺伝子の発現が可能 となると考えられる。 さらに、 ジーントランスファーベクターの mRNAが細胞質に 運搬され、 ベクター粒子.内にパッケージングされると考えられる。 V 、 vpr I X については、 HIV-1ベクターでは除去している場合もあり （Dull, T. et al. , J. Virol. 72 (11) , 8463-71， 1998) 、 ベクター粒子のパッケージングおよび機能に とって必須ではない可能性がある。 vprは非分裂細胞に対する感染性の一因である とも考えられており （Heinzinger, N. K. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 91 (15) , 7311-5, 1994) 、 HIV- 1ベクターでは vprの有無により遺伝子導入でき る細胞が異なるという報告がある (Kim, V. N. et al.， J. Virol. 72 (1)， 811-6 . 1998) 。 上記においてパッケージングベクターから完全に除去した nefは、 SIV による免疫不全症を引き起こす原因の一つであることがサルを用いた感染実験で 報告されている （von Gegerfelt, A. S. et al. , J. Virol. 73， 6159 - 65, 1999； Kestler, H. W. 3d. , Naidu, Y. N. , Kodama, T.， King, N. W. , Daniel, M. D. , Li, Y.， Desrosiers, R. C. Use of infectious molecular clones of simian immunodeficiency virus for pathogenesis studies. , J. Med. Primatol. 18 ー 4)： 305-9, 1989) 。 上記で構築した SIVagmベクターではこの配列を完全に除去し ているため、 仮にパッケージングベクター由来のウィルス遺伝子を含む再構成ゥ ィルス粒子ができたとしても、 病原性を持つ危険性がさらに低下していると考え られる。
レンチウィルスをベースとしたベクターは、 ベースのゥィルスが非分裂状態の 細胞に対し感染性を持つことから、 細胞周期を停止した培養細胞や神経細胞に対 して遺伝子導入能を持つことが期待される （Naldini, L. et al. , Science : 272 263-267, 1996; Sutton, R. E. et al.， J. Virol. , 73 (5) , 3649—60， 1999) 。 さらに、 VSV-Gによるシユードタイプ化を行うことにより、 感染指向性はベースで ある SIVのように CD4およぴケモカインレセプター陽性細胞に限定されない。 VSV-G のレセプターはリン脂質の一種であるホスファチジルセリンであることが知られ ており、 この分子はさまざまな細胞上に存在する （Schlegel, R. et al. , Cell, 32 (2) , 639-46, 1983) 。 このため VSV-Gによってシユードタイプィ匕を行った SIVag mベクターの感染指向性は非常に広い。 このベクターを基にシアル酸結合活性を有 する膜蛋白質によりシユードタイプィ匕されたウィルスを作製することにより、 ほ ぼすベての動物細胞に高い効率で遺伝子導入が可能となると予想される。
ウィルスベクター作製の際のプラスミドベクターの細胞へのトランスフエクシ ヨン量は、 適宜調整することが可能である。 例えば、 これに制限されるものでは P2003/011299
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ないが、 次のような方法も例示できる。
1 . 細胞培養
293T細胞 （ヒト胎児腎臓由来細胞株） は、 10%非働化仔ゥシ血清 （BIO WHITTAK ER) を含む DMEM高グルコース （Gibco BRL) を用いて、 37°C、 10%C02で培養する
2 . ベクターの作製
293T細胞を 6ゥエルのプラスチックカルチャープレートへ 1ゥエルあたり 5 X 10 5個でまき、 37°C、 10% C02で 48時間カルチャーする。 培養液を 1ゥエルあたり 800 H 1の 1%ゥシ血清アルブミンを含む DMEMに置換してトランスフエクシヨンに用いる 。 1ゥェルあたりジーントランスファ一べクタ一 （pGL3C/CMVL. U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTR Δ U3または pGL3C/CMVL. U3G2/RREc/s/CMVF β -gal/3LTR Δ U3) 1200ng、 ノヽ。ッケージングベクター （pCAGGS I SIVagm gag-tat I rev) 360ngに加え、 ェン ベロープ蛋白質を発現する VSV - G発現プラスミド pVSV- G (Clontech) 120ng、 ネガ ティブ鎖 RNAウィルスのお (または HN) 、 F、 および M蛋白発現プラスミド （pCAGGS 中） のそれぞれ 240ngを任意に組み合わせて 100 i lの Opti MEMに溶解後 6 /i 1の PLU S Reagent (Gibco BRL) を加えて攪拌、 15分間室温で静置する。 これに、 ΙΟΟ μ Ι の Opti MEMで希釈した 4 /i lの LIPOFECTAMINE Reagent (Gibco BRL) を添加して攪 拌後さらに室温で 15分間静置し、 これを上記の 293T細胞に滴下して緩やかに攪拌 し、 37。C、 10% C02下で 3時間カルチャーする。 1ゥエルあたり lmlの 1°/。ゥシ血清 アルブミン、 および IS ^ g/ml (HAの場合 10 /i g/ml) のトリプシン （Gibco BRL) を 含む DMEMを加え、 37°C、 10% C02で、 24時間培養する。 その後 1ゥエルあたり 2 ml の 1%ゥシ血清アルブミン、 7. 5 /i g/ml (HAの場合 5 /z g/ml) のトリプシン （Gibco B RL) および 0. 01 unitのグラム陽性菌 （例えば放線菌） 由来ノィラミニダーゼを含 む DMEMに培地交換し、 24時間培養後に培養上清を回収、 0. 45 μ πιのフィルターで濾 過してベクター溶液を得る。
ベクターの大量調製おょぴ濃縮は、 例えば以下のようにして行われる。 例えば 、 293T細胞を 15cmのプラスチックシャーレへ 1枚あたり 5 X 106個でまき、 37°C、 1 0% C02で 48時間カルチャーする。 培養液を 1ゥエルあたり 10mlの 1%ゥシ血清アル プミンを含む DMEMに置換してトランスフエクシヨンに用いる。 シャーレ 1枚あた りジーントランスファーべクター 8 g、 パッケージングベクター 2. 4 x g、 それ に VSV - G発現プラスミド pVSV- G (Clontech) 0. 8 μ g 、 ネガティプ鎖 RNAウィルス の HA (または HN) および F蛋白発現プラスミド （pCAGGS中） のそれぞれ 1. 6 /z gを 任意に組み合わせて、 1. 5mlの Opti MEMに溶解後、 40 1の PLUS Reagent (Gibco B RL) を加えて攪拌、 15分間室温で静置する。 これに、 60 1の LIPOFECTAMINE Reag ent (Gibco BRL) を添加した 1. 5mlの Opti MEMを加え攪拌後さらに室温で 15分間静 置し、 これを上記の 293T細胞に滴下して緩やかに攪拌し、 37°C、 10% C02下で 3時 間カルチャーする。 シャーレ 1枚あたり 10mlの 1%ゥシ血清アルブミン、 15 / g/ml のトリプシン （Gibco BRL) を含む DMEMを加え、 37°C、 10% C02で、 24時間培養す る。 シャーレ 1枚あたり 20mlの 1%ゥシ血清アルブミン、 7· 5 μ g/ml (HAの場合 5 μ g/ ml)のトリプシン （Gibco BRL) および 0. 05〜0. 5 U程度のグラム陽性菌 （例えば 放線菌） 由来 NAを含む D-MEMに培地交換し、 37°C、 10% C02で、 24時間培養した後 培養上清を回収、 0. 45 / mのフィルターで濾過し、 42, 490 X g (F/HNの場合 16, 000 X g) (T0MY SRX-201, TA21BH) , 4°C、 90分遠心する。 ペレットを PBS (5°/。 FCS， 2 μ g/ral polybrene) に溶解し、 使用まで- 80°Cに保存する。
例えば、 インフルェンザウィルス HA蛋白質でシユードタイプ化したレンチウイ ルスベクターは濃縮が可能である。 濃縮は、 例えば次のようにして実施できる。 2 93T細胞を 15cmのプラスチックシャーレへ 1枚あたり 5 X 106個でまき、 37°C、 10% C 02で 48時間カルチャーする。 培養液をシャーレ 1枚あたり 10mlの 1%ゥシ血清アルブ ミンを含む DMEMに置換してトランスフエクションに用いた。 シャーレ 1枚あたりジ ーントランスファ一べクタ一（pGL3C/CMVL. U3G2/RREc/s/CMVF LacZ/3LTR Δ U3) 8 μ g、 ノ ッケージングベクター（pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev) 2. 4 ^ g, インフルェン ザ HA蛋白発現プラスミド pCAGGS- HA 1. 6 gを 1. 5mlの Opti MEM (Gibco BRL) に溶 解後、 40 1の PLUS Reagent (Gibco BRL) を加えて攪拌、 15分間室温で静置する これに、 1. 5mlの Opti MEMで希釈した 60 1の LIPOFECTAMINE (Gibco BRL) を添 加して攪拌後さらに室温で 15分間静置し、 これを上記の 293T細胞に滴下して緩や 力に攪拌し、 37°C 10% C02で 3時間カルチャーする。 シャーレ 1枚あたり 10mlの 1 %ゥシ血清アルブミンおよび 10 g/mlのトリプシン （Gibco BRL) を含む DMEMを加 え、 37 (、 10% C02で 16 24時間カルチャーした後に、 シャーレ 1枚あたり 20mlの 1 %ゥシ血清アルブミン、 5 /x g/mlのトリプシン （Gibco BRL) およびおょぴ 0. 05 0. 5 U程度のグラム陽性菌 （例えば放線菌） 由来 NAを含む DMEMに培地交換し、 そ の 24時間培養後に培養上清を回収、 0. 45 w niのフィルターで濾過する。 16 000 X g ( Beckraan J- 251 JA - 18)、 4°C 1時間遠心する。 ペレツトを PBS ( 5 %FCS 2 /x g / mlポリプレンを含む） に溶解し、 - 80°Cで保存する。 インフルエンザウイルスお を用いることにより、 VSV - Gなど他のエンベロープ蛋白質を共発現させることなく 遺伝子導入が認められる。 HAシ ドタイプベクターは遠心により高度の濃縮が 可能である。
シアル酸結合活性を持つ 2種またはそれ以上の蛋白質を用いて、 シ ドタイプ レンチウィルスベクターを作製することも可能である。 例えば、 インフルエンザ クタ一の製造の例を示す。
<細胞培養 >
293T細胞 （ヒト胎児腎臓由来細胞株） は、 10%非働ィ匕仔ゥシ血清 （BIO WHITTAK ER) を含む DMEM高グルコース （Gibco BRL) を用いて、 37°C 10%C0。で培養する
<ベクターの作製〉
293T細胞を 6 プレートへ 1ウエノレあたり 5 X 10
5個でまき、 37°C 10% C02で 48時間カルチャーする。 培養液を 1ゥエルあたり 800 μ ΐの 1%ゥシ血清アルブミンを含む DMEMに置換してトランスフエクシヨンに用いる 。 1ゥエルあたりジーントランスファ一べクタ一（pGL3C/CMVL. U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTR AU3) 1200ng, ノ ッケージングベクター（pCAGGS/SIVagm gag- tat/rev) 36 0ng、 Sendai virus HN蛋白発現プラスミド pCAGGS - HNおよび HA蛋白発現プラスミド それぞれ 240ngを ΙΟΟ μ Ιの Opti MEM (Gibco BRL) に溶解後 6 μ 1の PLUS Reagent (G ibco BRL) を加えて攪拌、 15分間室温で静置する。 これに、 100 μ 1の Opti MEMで 希釈した 4 μ 1の LIPOFECTAMINE (Gibco BRL) を添加して攪拌後さらに室温で 15分 間静置し、 これを上記の 293T細胞に滴下して緩やかに攪拌し、 37°C、 10% C02で 3 時間カルチャーする。 1ゥエルあたり 1mlの 1%ゥシ血清アルプミンおよび lO ^i g/ml のトリプシン （Gibco BRL) を含む DMEMを加え、 37°C、 10% C02で 16〜24時間カル チヤ一した後に、 1ゥヱルあたり 2mlの 1%ゥシ血清アルブミン、 5 μ §/ιη1のトリプ シン （Gibco BRL) を含む DMEMに培地交換し、 その 24時間培養後する。 その後 1ゥ エルあたり 2 mlの 1%ゥシ血清アルブミン、 5 /z g/mlのトリプシン （Gibco BRL) お よぴ 0. 01 unitのグラム陽性菌 （例えば放線菌） 由来ノィラミニダーゼを含む DMEM に培地交換し、 24時間培養後に培養上清を回収、 0. 45 μ mのフィルタ一で濾過して ウイノレス溶液を得る。
本発明の方法で製造されたベクターは、 周知のウィルス精製方法により精製す ることができる。 精製方法は、 上記した遠心分離、 あるいはフィルトレーシヨン (濾過） 、 吸着、 およびカラム精製等を含む公知の精製 ·分離方法またはその組 み合わせにより行うことができる。 これにより、 シアル酸結合活性を有する膜蛋 白質を含む実質的に純粋なウィルスベクターを得ることができる。 実質的に純粋 ウィルスベクターとは、 該ウィルスベクターが、 核酸を細胞に導入する能力を持 つ他のウィルスベクターを実質的に有さないことを言う。 実質的に純粋なウィル スベクターは、 ウィルス産生細胞の細胞破碎物や他の不純物を含まないことが好 ましい。
本発明の方法で製造されたウィルスベクターは、 薬学的に許容される担体また は媒体と適宜組み合わせて糸且成物とすることができる。 「薬学的に許容される担 体または媒体」 とは、 ベクターと共に投与することが可能であり、 ベクターによ る遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。 具体的には、 例えば滅菌水、 生理 食塩水、 培養液、 血清、 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) などと適宜組み合わせて製 剤化することが考えられる。 さらに、 その他にも、 安定剤、 殺生物剤等が含有さ れていてもよい。 本発明の組成物は、 水溶液、 カプセル、 懸濁液、 シロップなど の形態であり得る。 本発明の方法で製造されたウィルスベクターを含む組成物は 試薬または医薬として有用である。 該組成物は、 例えば、 各種細胞に対するイン ビトロまたはインビボでの遺伝子導入試薬として、 または、 エタスビポまたはィ ンビボでの遺伝子治療のための医薬として有用である。 患者への投与は、 一般的 には、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 腹腔内注射、 皮下注射、 経腸投与、 経 口投与、 鼻腔内投与、 エタスビボ投与など当業者に公知の方法により行いうる。 特に鼻腔または気管支粘膜への投与、 および血球系 '造血系細胞へのェクスビポ 投与は好適である。 ベクターの投与量は、 疾患、 患者の体重、 年齢、 性別、 症状 、 投与目的、 投与組成物の形態、 投与方法、 導入遺伝子等により異なるが、 当業 者であれば適宜決定することが可能である。
本発明の方法で製造されたウィルスべクターは、 各種遺伝性疾患の遺伝子治療 にも応用が可能である。 対象となる疾患は特に制限されない。 例えば、 対象とな り得る疾患とその単一原因遺伝子としては、 ゴーシェ病においては ]3 -セレブ口 シダーゼ （第 2 0染色体） 、 血友病においては血液凝固第 8因子 （X染色体） およ ぴ血液凝固第 9因子 （X染色体） 、 アデノシンデァミナーゼ欠損症においてはアデ ノシンデァミナーゼ、 フエ-ルケトン尿症においてはフエ-ルァラニンヒドロキ シラーゼ （第 1 2染色体） 、 Duchenne型筋ジストロフィーにおいてはジストロフ イン （X染色体） 、家族性高コレステロ一ノレ血症においては LDLレセプター （第 1 9染色体） 、嚢ほう性繊維症においては CFTR遺伝子の染色体への組み込み等が挙 げられる。 それら以外の複数の遺伝子が関与していると思われている対象疾患と しては、 アルツハイマー、 パーキンソン病等の神経変性疾患、 虚血性脳障害、 痴 呆、 またエイズ等の難治性の感染症等が考えられる。 エイズ患者の造血幹細胞を 細胞外にとりだし in vitroで SIVベースの本発明の方法で製造されたベクターを導 入し、 HIVの感染が起こる前に SIVに由来するゲノム転写を優勢にして、 患者の体 に戻し、 HIVの転写因子を無効にする治療方法が考えられる。 さらには、 慢性疾患 への応用として、 虚血性心疾患においては VEGFならびに FGF2遺伝子、 動脈硬化の 遺伝子治療に関しては、 細胞増殖関連遺伝子、 例えば細胞増殖因子 （PDGF、 TGF- j8等） 、 Cycl in-dependent kinase等の発現抑制への応用が可能となる。 また糖尿 病においては BDNF遺伝子が候補となりうる。 またこの方法により、 遺伝子変異が 癌化を引き起こす癌抑制遺伝子 p53等の遺伝子を染色体に組み込む補充治療への応 用、 多剤耐性遺伝子を in vitroで骨髄由来造血幹細胞に導入した後、 患者の血液 に戻すことによって、 癌の薬物治療の限界を超えた治療が可能となる。 自己免疫 疾患、 例えば多発性硬化症、 慢性関節リウマチ、 SLE、 糸球体腎炎等の遺伝子治療 に関しては、 T細胞レセプター、 各種接着因子 （例えば ICAM- 1、 LFA- 1、 VCAM-1、 L FA- 4等) 、 サイトカインおよびサイトカインレセプター (例えば TNF、 IL- 8、 IL- 6 、 IL- 1等） 、 細胞増殖因子 （例えば PDGF、 TGF - β等) 、 作用因子 （例えば ΜΜΡ等） のアンチセンス発現による発現抑制への応用が可能となる。 ァレルギ一性疾患の 遺伝子治療に関しては、 IL-4、 FC £ R-I等のアンチセンス発現による発現抑制への 応用が可能となる。 臓器移植に関連する遺伝子治療に関しては、 ヒ ト以外の動物 ドナーの組織適合性抗原をヒト型に変えて異種移植の成功率を高める応用が可能 となる。 さらにはヒ ト ES細胞の染色体に外来遺伝子を導入し、 胚の段階で欠損す る遺伝子を補って、 体循環する酵素、 成長因子等の不足を補充する治療が考えら れる。
例えば、 IL- 4はヘルパー Tリンパ球の Th2リンパ球への分化を促す。 Th2リンパ球 は IL- 4、 IL- 5、 IL- 9、 IL-13といった喘息の炎症を媒介するサイト力インを分泌す る。 IL-4は呼吸障害に関与する肺粘液膜からの粘液分泌を誘導する分子の 1つで ある。 IL - 4は、 好酸球表面に存在する VLA 4分子と相互作用する細胞接着分子であ る VCAM- 1の発現を制御している。 この相互作用により、 好酸球は血液中から肺組 織の炎症部位へ移動することができる。 IL- 4は B細胞の増強と、 アレルギー反応を 引き起こすために必要な抗原特異的 IgEの産生を誘導する。 抗原特異的 IgEはマス ト細胞がヒスタミン、 ロイコトリェンといった炎症の媒介となる物質の放出を引 き起こし、 これらが、 気管支収縮を引き起こす。 このような IL - 4の役割から、 喘 息患者を対象とした可溶性ィンターロイキン 4 (IL-4) 受容体などを発現するべク ターも有用である。 図面の簡単な説明
図 1は、 Micromonospora viridifaciens由来 NA を用いて製造したゥイノレスに よる遺伝子導入を示す写真である （右側の NA) 。 対照として Vibrio cholerae由 来の NAを用いて同様にウィルスを製造し、 同量のウィルス産生細胞の培養上清を 用いて遺伝子を導入した （左側の vcNA) 。
図 2は、 Vibrio a¾a/erae由来 NA を用量を変えて用いて製造した場合のウィル スのカ価を示す写真である。 ウィルス産生細胞の培養上清を同量用い、 それぞれ 同じ条件下で遺伝子導入を行なった。 各パネルの上の数値はノィラミニダーゼ添 加量 （unit) を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。 なお、 本明細書中に引用された文献は、 本明細書の —部として糸且み込まれる。
[実施例 1 ] グラム陽性菌由来の NAを使用したィンフルェンザウィルスェンべ ロープシユードタイプ SIVベクターの調製
細胞培養
293T細胞 （ヒト胎児腎臓由来細胞株） (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, pp. 8392-8396, 1993) は、 10%非働化仔ゥシ血清 （BIO WHITTAKER) を含む DMEM 高グルコース （Gibco BRL) を用いて、 37°C、 10% 0)2で培養した。
ベクターの作製
293T細胞を 6ウェ^/のプラスチック力ノレチヤ一プレートへ 1ゥエルあたり 5 X 10 5個でまき、 37°C 10% C02で 48時間カルチャーした。 培養液を 1ゥエルあたり 800 の 1%ゥシ血清アルブミンを含む DMEMに置換してトランスフエクションに用いた 。 1ゥエルあたりジーントランスファ一べクタ一 PGL3C/CMVL. U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTR AU3 1200ng、 パッケージングベクター pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev 36 0 ng、 HA蛋白発現プラスミド pCAGGS- HA 240ngを 100 / 1の Opti MEM (Gibco BRL) に溶解後 6 /x lの PLUS Reagent (Gibco BRL) を加えて攪拌、 1δ分間室温で静置し た （W001/92508) 。 これに、 100 /i lの Opti MEMで希釈した 4 1の LIP0FECTAMINE ( Gibco BRL) を添加して攪拌後さらに室温で 15分間静置し、 これを上記の 293T細胞 に滴下して緩やかに攪拌し、 37°C 10% C02で 3時間カルチャーした。 1ゥェルあ たり 1 ml の 1 %ゥシ血清アルブミンおよび 10 /i g/mlのトリプシン （Gibco BRL) を含む DMEMを加え、 37°C 10% C02で 16〜24時間カルチャーした後に、 1ゥエルあ たり 2 mlの 1%ゥシ血清アルブミン、 5 μ §/ιη1のトリプシン （Gibco BRL) および 0. 0 1 unitの ^ riaW¾cims 製ノイラミニダーゼを含む DMEMに培地交換し、 その 24時間培養後に培養上清を回収、 0. 45 μ ηιのフィルターで濾過したものを使用した 。 対照として、 K c zo/eraeの精製ノィラミニダーゼ （Roche) 0. 05 unit を用い て同様にベクターを製造した。
SIVagmベクターによる遺伝子導入
標的となる 293T細胞を 6ゥエルのプラスチックカルチャープレートへ 1ゥエル あたり 1 X 106個でまき、 37°C、 10% C02 で 48時間培養した。 カルチャープレート より培養液を除去し、 ベクター液にポリプレン (Sigma) を最終濃度 8 z g / mlで 添カ卩したものを 1 ml重層し、 37。C、 10% C02で 3時間培養し、 ベクターを感染さ せた。 3時間後に 20%非働化仔ゥシ血清 （BIO WHITTAKER) を含む培養液を 1 ml 加え、 37°C、 10% C02で 48〜72時間培養した。
ベクターの力価測定
ベクターの力価測定は、 ベクター液 1 ml によって遺伝子導入される細胞の数 によって計算した。 上記の方法で 1 ml のベクター液を感染、 感染後 72時間後に 蛍光倒立型顕微鏡 (DMIRB (SLR) , ライカ） にて 200倍の倍率で検鏡、 視野内の遺伝 子導入細胞 （GFP陽性細胞） 数を測定し、 3視野の平均を求め、 視野の面積とプレ 一トの面積よりもとめた係数 854. 865をかけることにより力価の算出を行つた。 力 価の単位は Transducing Unit (TU) / mlで表記することとした。 その結果、 K ch Werae由来 NA (VcNA) を用いた場合の力価が 2. 8 X 104 (TU/ml) であったのに対 し、 M. i io¾¾cie /^由来 NA (MvNA) を用いた場合の力価は 1. 1 X 105 と有意に 高かった （図 1 ) 。
[実施例 2 ] HAシユードタイプ SIVベクターの製造における K rae由来 NA の添加量の効果
上記と同様の HAシユードタイプ SIVベクターの調製において、 V. o7erae由来 の NAを添加量を変えて用い、 その効果を検証した。 その結果、 NAの添加量が 0. 01 〜0. 1 U (0. 005〜0. 05 U/ml) の間で力価にほとんど変化はなかった。 この結果よ り、 K cAo7arae由来の NAを使用したベクターの力価が低いのは、 使用した NAの量 が少ないことによるものではないと考えられる （図 2 ) 。 産業上の利用の可能性
本発明により、 グラム陽性菌由来ノィラミニダーゼを用いて、 シアル酸結合活 性を有する膜蛋白質をエンベロープに含むウィルスベクターを製造する新規な方 法が提供された。 グラム陽性菌由来ノィラミニダーゼは安価であり、 低用量でも 高い力価のウィルス産生が可能であることから、 工業的なウィルスの大量生産に おいて、 本発明の方法はコストパフォーマンスに優れている。 製造されるべクタ 一は、 遺伝子治療などの臨床場面において好適に用いられる。

Claims

請求の範囲
1 . シアル酸結合活性を有する膜蛋白質を含むウィルスべクターの製造方法であ つて、 グラム陽性菌由来ノィラミニダーゼの存在下で該ウィルスベクタ一産生細 胞を培養し、 産生されたウィルスを回収する工程を含む方法。
2 . グラム陽性菌が放線菌である、 請求項 1に記載の方法。
3 . 放線菌が、 ミクロモノスポラ科 {Micromonosporaceae) に属する放線菌であ る、 請求項 2に記載の方法。
4 . ミクロモノスポラ科に属する放線菌が、 ミクロモノスポラ ' ピリディファシ エンス {Micromonospora viridifaciens) である、 g青求項 3 ίこ目己载の方、法。
5 . ウイノレスベタターが、 レトロウィルスベクターである、 請求項 1から 4のレ、 ずれかに記載の方法。
6 . レトロウイノレスベタターが、 レンチウイノレスベクターである、 請求項 5に記 載の方法。
7 . シアル酸結合活性を有する膜蛋白質が、 一本鎖ネガティブ鎖 R N Αウィルス のエンベロープ蛋白質である、 請求項 1カゝら 6のいずれかに記載の方法。
8 . 一本鎖ネガティブ鎖 R N Aウイルスが、 パラミクソウィルス科 {Paramyxovir idae) またはォノレトミクソウィルス科 {Orthomyxoviridae) に属するウィルスで ある、 請求項 7に記載の方法。
9 . シアル酸結合活性を有する膜蛋白質が、 インフルエンザウイルスの HA蛋白 質である、 請求項 1から 6のいずれかに記載の方法。
1 0 . 請求項 1から 9のいずれかに記載の方法により製造されたウィルス。
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