CN1694956A - 使用衍生自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶产生包含与唾液酸结合的膜蛋白作为包膜成分的病毒载体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供使用衍生自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶(NA)，产生含有与唾液酸结合的膜蛋白作为包膜成分的病毒载体的方法。该方法包括在衍生自革兰氏阳性菌的NA存在的情况下培养能产生病毒载体的细胞，并回收产生的病毒的步骤。本发明的方法能以高的性价比产生滴度高的病毒。这种病毒载体能高效地将基因导入用现有方法不易导入基因的细胞，包括造血干细胞在内的血细胞和造血细胞以及包括粘膜上皮细胞在内的含有粘液的细胞，并因此可用做基因疗法中的载体。

Description

使用衍生自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶产生包含 与唾液酸结合的膜蛋白作为包膜成分的病毒载体的方法
技术领域
本发明涉及使用衍生自革兰氏阳性菌(Gram-positive bacteria)的唾液酸苷酶(neuraminidase)产生包含与唾液酸结合的膜蛋白作为包膜成分的病毒载体的方法。
背景技术
含有唾液酸的糖蛋白存在于大多数细胞的表面。某些病毒类型具有能与这种唾液酸结合的蛋白作为包膜成分，这促进了病毒粒子粘着于细胞上。例如，流感病毒通过被称做血凝素(HA)的包膜蛋白与存在于细胞表面上的唾液酸结合。然而，在宿主细胞表面与唾液酸d结合需要在病毒复制步骤中在出芽后解离，在这一步骤中流感病毒的唾液酸苷酶蛋白(NA)起了重要作用。此外，NA被报道在自我聚集的抑制中起作用(Compans R.W.等，J.Virol.，4：528-534(1969)；Palese P.等，Virology 61：397-410(1974)；GriffinJ.A.等，Virology 125：324-334(1983)；Liu C等，J.Virol.69：1099-1106(1995))。
HA蛋白的结合活性已被确认，且在HA假型病毒的制备中适用于改善基因导入能力。然而，这些假型病毒以不具有唾液酸苷酶的低病毒效价为特征(Hatziioannou T等，J.Virol.72：5313-5317(1998))。通过外源提供NA给载体生成系统，可能促进HA蛋白掺入病毒粒子，并因此提高效价(DongJ等，J.Virol.66：7374-7382(1992)；Negre D.等，Gene Ther.7：1613-1623(2000)；Morse K.M.等，美国基因治疗协会第五次年会TheAmerican Society of Gene Therapy’s 5th Annual Meeting(2002)；WO01/92508)。然而，迄今为止，目前可获得的使用纯化的NA产生的HA假型病毒的效价不能令人满意。
发明的公开
本发明的目的是提供使用衍生自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶，产生含有作为包膜成分的与唾液酸结合的膜蛋白的病毒载体的方法。
常规的HA假型病毒产生方法常常使用来自被分类为革兰氏阴性菌的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的NA。但是，使用来自霍乱弧菌的NA产生的载体的效价很低。而且，大规模工业产生这种载体仍是一个难题。为了开发低成本产生包含与唾液酸结合的膜蛋白作为包膜成分的高效价病毒载体的技术，本发明人找到了能用于病毒产生的一种新的NA。本发明人公开了，通过使用衍生自革兰氏阳性菌的NA，他们能成功地产生具有明显高于用来自霍乱弧菌的NA产生的病毒的效价的病毒。因此使用来自革兰氏阳性菌的NA将能以有效而经济的方式大规模地工业产生假型载体。
因此，本发明涉及使用衍生自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶，产生含有作为包膜成分的与唾液酸结合的膜蛋白的病毒载体的方法。更具体地，本发明涉及：
(1)产生包含与唾液酸结合的膜蛋白的病毒载体的方法，所述方法包括在衍生自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶存在的情况下培养产生病毒载体的细胞，并回收产生的病毒的步骤；
(2)如(1)所述的方法，其中所述革兰氏阳性菌是放线菌(Actinomycete)；
(3)如(2)所述的方法，其中所述放线菌属于小单孢菌科(Micromonosporaceae)；
(4)如(3)所述的方法，其中所述属于小单孢菌科的放线菌是绿色小单孢菌(Micromonospora viridifaciens)；
(5)根据(1)-(4)中任何一项所述的方法，其中所述病毒载体是反转录病毒载体；
(6)如(5)所述的方法，其中所述反转录病毒载体是慢病毒载体(lentiviralvector)；
(7)根据(1)-(6)中任何一项所述的方法，其中所述与唾液酸结合的膜蛋白是单链负链RNA病毒的包膜蛋白；
(8)如(7)所述的方法，其中所述单链负链RNA病毒是属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)或正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的病毒；
(9)根据(1)-(6)中任何一项所述的方法，其中所述与唾液酸结合的膜蛋白是流感病毒HA蛋白；和
(10)使用根据(1)-(9)中的任何一项所述的方法产生的病毒载体。
本发明提供了产生含有与唾液酸结合的膜蛋白作为包膜成分的病毒载体的方法。本文中，“病毒载体”是指能将核酸分子导入宿主的病毒粒子或与之等同的感染性微粒。本发明的方法包括这样的步骤，即在衍生自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶存在的情况下培养产生病毒载体的细胞，并收集产生的病毒。来自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶的存在显著提高了从产生病毒的细胞中收集的病毒的量。衍生自放线菌的唾液酸苷酶是优选使用的。本发明的方法可应用于产生含有衍生自胞浆膜的包膜的所需病毒载体。例如，本发明的方法可优选用于产生负链RNA病毒、反转录病毒、痘病毒、疱疹病毒等。具体地，本发明的方法适用于反转录病毒等慢病毒的产生。
任何有复制能力的病毒或复制缺陷型病毒都可以制备。例如，复制缺陷型病毒可通过从病毒基因组中缺失参与感染性病毒粒子的形成或其释放的部分或全部病毒基因而制备。具体地，适于将所需基因导入细胞的复制缺陷型重组病毒载体可通过改变病毒基因组，使编码包膜等的基因缺失，但保持病毒基因组掺入病毒粒子和病毒核酸导入靶细胞所需的核苷酸序列完整而产生。例如，复制缺陷型反转录病毒可通过自病毒基因组RNA除去部分或全部编码病毒蛋白的基因，例如gag、pol和env，而仅保留病毒包装和基因导入靶细胞所必需的序列(例如LTR的一部分)而产生。为了产生病毒粒子，可以使缺失的基因中形成病毒粒子所需的基因在产病毒的细胞中表达。包含缺失了至少部分病毒基因的野生型病毒基因组的这种病毒粒子也包括在本发明的病毒载体中。
具体地，本发明适合于重组病毒的产生。“重组病毒”是指使用重组多核苷酸产生的病毒。重组多核苷酸是指多核苷酸，其中一或两个末端不是以与自然状态相同的方式连接。具体地，重组多核苷酸是改变(切断或组合)了多核苷酸链的连接的多核苷酸。重组多核苷酸可以联合使用多核苷酸合成、核酸酶处理、连接酶处理、以及重组DNA技术领域中通常已知的方法制备。重组蛋白是使用重组多核苷酸产生的蛋白，或者是人工合成的蛋白。例如，重组蛋白可通过表达编码它的重组多核苷酸而产生。重组病毒可通过使遗传工程构建的编码病毒基因组的多核苷酸表达和重建病毒来产生。
使用本发明方法产生的病毒载体在其病毒包膜中包含与唾液酸结合的蛋白。这种病毒载体可以是包含与唾液酸自然结合的蛋白的病毒，或者是一种自然情况下不包含这种蛋白，而是通过基因工程使蛋白包含于包膜中的病毒。经过基因改造在其包膜中包含天然病毒包膜中没有发现(根本没有或包含很少)的蛋白的病毒，被称做该蛋白的假型病毒。包含不同包膜蛋白的假型病毒可通过例如在产生病毒的细胞中表达所述蛋白来产生。这类方法特别适合于本发明，以产生包含与唾液酸结合的膜蛋白的假型病毒。
与唾液酸结合的膜蛋白包括胞外区含有唾液酸结合区域的蛋白。这样的蛋白不限于任何具体的一种；它可以是天然蛋白或人工蛋白。例如，在许多病毒包膜蛋白中发现与唾液酸自然结合的膜蛋白。具有这种能力的蛋白可通过诱导血细胞凝集(HA)的活性鉴别。具有HA活性的病毒蛋白常常被称做血凝素。这种具有HA活性的病毒蛋白特别适合于制备本发明的病毒。
HA活性可见于多种病毒。具有这些病毒的HA活性的蛋白可以以其本来的形式用于制备本发明的病毒，或通过制备具有其它蛋白的嵌合蛋白进行改变后用于制备本发明的病毒。HA活性可用各种生物的红细胞来检测。常用于检测HA活性的红细胞种类和最适温度根据病毒类型适当控制。例如，据报道钙离子是使用风疹病毒等进行反应所必需的。同样地，在虫媒病毒的情况下，反应的最佳pH有严格限制。在肠道病毒、风疹病毒等中，病毒粒子本身是含有HA活性的蛋白。在虫媒病毒和腺病毒等病毒中，含有HA活性的蛋白也以小于病毒粒子的颗粒存在。痘病毒血凝素以区别于病毒粒子的含脂类的颗粒存在。这些含有HA活性的蛋白可用于产生具有HA活性的病毒。腺病毒III亚群诱导大鼠红细胞的不完全凝集，即部分血细胞凝集。这种蛋白也可用做含有HA活性的膜蛋白。
具体的病毒蛋白的HA活性(HA效价)可使用通常已知的方法检测(国立预防卫生研究所学友会编，改订二版，病毒实验学总论，214-225，丸善株式会社)。红细胞可从例如鸡(包括幼体和成体)、鹅、大鼠、豚鼠、猕猴(rhesusmonkey)、绿猴或人制备。反应温度可以是0℃、4℃、室温或37℃，是适合于各种蛋白的条件。用不同病毒进行血细胞凝集反应时的反应条件的例子描述于下文中。
例如，与腺病毒有关的HA反应通常不受pH影响，在37℃进行。腺病毒I亚群，例如3、7、11、14、16、20、21、25和28型，例如可使用猕猴红细胞。腺病毒II亚群，例如8、9、10、13、15、17、19、22、23、24、26和27型，例如可使用大鼠红细胞。腺病毒III亚群，例如1、2、4、5和6型，可使用大鼠红细胞诱导不完全凝集。
与肠道病毒有关的HA反应通常不依赖于pH。其中柯萨奇病毒A7型可使用小鸡血细胞，并在室温诱导血细胞凝集。柯萨奇病毒A20、A21和A24型可使用O型人血细胞，在4℃诱导血细胞凝集。柯萨奇病毒B1、B3和B5型可使用O型人血细胞，在37℃诱导血细胞凝集。Echo病毒3、6、7、11、12、13、19、20、21、24和29型可使用O型人血细胞，在4℃诱导血细胞凝集。
与呼肠孤病毒病毒(reovirus)有关的HA反应通常不依赖于pH，在室温进行。例如，1型和2型可使用人O型血细胞，3型可使用牛血细胞。
与负链RNA病毒有关的HA反应，例如与流感病毒有关的HA反应在约pH 7.2进行。对于A型和B型流感病毒，血细胞可从小鸡、人或豚鼠制备，并在室温诱导血细胞凝集。对于C型流感病毒，可使用小鸡血细胞，反应在4℃进行。对于腮腺炎病毒和新城疫病毒(NDV)，例如可使用小鸡红细胞，且反应在室温、pH 7.2进行。对于副流感病毒，HA反应通常是不依赖pH的，小鸡或人红细胞可用于1型，小鸡红细胞可用于2型病毒。反应在例如4℃进行。对于副流感病毒3型，反应可在4℃-室温用人或豚鼠红细胞进行。对于麻疹病毒，反应可用例如来自绿猴的红细胞在37℃进行。
在虫媒病毒(arbovirus)的情况中，反应可以用鹅或小鸡的红细胞在37℃、严格酸性条件中进行。弹状病毒(rhabdovirus)可使用鹅的红细胞。狂犬病病毒优选在pH 6.4、0℃进行反应。水泡性口炎病毒(VSV)可优选在例如pH 5.8、0℃进行反应。对于痘苗病毒(vaccinia virus)和天花病毒等痘病毒，反应通常不依赖于pH，可使用小鸡红细胞在室温-37℃进行。风疹病毒可使用鸡或鹅的红细胞在4℃、pH约6.2或7.2进行反应。多瘤病毒可在4℃、pH 7.2使用豚鼠红细胞进行反应。大鼠病毒(RV)可在室温、pH 7.2使用豚鼠红细胞进行反应。上述任何含有HA活性的病毒蛋白，或其改变的蛋白可用于产生根据本发明方法产生的病毒。这里，改变的蛋白是指天然蛋白缺失、取代和/或插入一或多个氨基酸所得的蛋白。这种蛋白只要是与唾液酸结合的膜蛋白就可以利用。改变的蛋白可优选包含原始蛋白的部分氨基酸序列，更优选包含原始蛋白的8个或更多氨基酸，更优选9个或更多，更优选10个或更多，最优选15个或更多。换句话说，改变的蛋白在氨基酸序列水平上相对于原始蛋白的同一性可以是70％或更高，更优选80％或更高，更优选85％或更高，最优选90％或更高。改变的蛋白可以是原始蛋白或它的一部分结合有其它蛋白。
在包含于病毒载体包膜、并与唾液酸结合的多种膜蛋白中，特别适用于本发明的蛋白的具体例子包括副粘病毒HN蛋白、正粘病毒HA蛋白、披膜病毒(Togavirus)E1蛋白、痘苗病毒A27L、H3L和D8L蛋白、黄病毒M和E蛋白、冠状病毒E1和E2蛋白以及本杨病毒(Bunyavirus)G1蛋白。特别优选单链负链RNA病毒包膜蛋白；尤其优选正粘病毒HA蛋白。
“单链负链RNA病毒”是指具有单链负链((-)链)RNA作为其基因组的病毒。例子包括副粘病毒科病毒如副粘病毒属(Paramyxovirus)、麻疹病毒属(Morbillivirus)、腮腺炎病毒属(Rubulavirus)、及肺病毒属(Pneumovirus)，弹状病毒科病毒例如水泡性病毒属(Vesiculovirus)、狂犬病病毒属(Lyssavirus)和Ephemerovirus，丝状病毒科(Firoviridae)病毒，正粘病毒科病毒如流感病毒A、B、C和thogoto样病毒，本杨病毒科病毒如本杨病毒属、汉坦病毒属(Hantavirus)、纳伊罗病毒属(Nairovirus)和白蛉热病毒属(Phlebovirus)，和沙粒病毒科(Arenaviridae)病毒。具体地，优选使用正粘病毒科病毒HA蛋白；优选流感病毒HA蛋白。仙台病毒、狂犬病病毒或麻疹病毒的HN(或H)蛋白也适用。这些蛋白可与其它蛋白结合使用。所述蛋白可衍生自病毒的天然株、野生型病毒、病毒的突变株、实验室培养株、人工构建株等。所述蛋白可以是通过改变天然蛋白产生的蛋白。
与唾液酸结合的膜蛋白除具有唾液酸结合活性外还可具有另一种活性。例如，副粘病毒的HN蛋白除具有唾液酸结合活性(HA活性)外还具有唾液酸苷酶(NA)的活性。虽然HN蛋白的NA活性本身能促进病毒的产生，但有可能将这种蛋白与来自革兰氏阳性菌的NA一起按本发明方法更有效地产生病毒。而且，在本发明中与唾液酸结合的两种或更多种膜蛋白可结合使用。例如，在本发明方法中，正粘病毒HA蛋白和副粘病毒的HN蛋白可一起用于产生这两种蛋白的假型病毒。HN蛋白的NA活性以及衍生自革兰氏阳性菌的NA蛋白使细胞能以较高效率释放病毒。
本发明的方法通过在产生病毒载体的步骤中，在衍生自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶存在的情况下，培养产生病毒载体的细胞，导致产生含有与唾液酸结合的膜蛋白的病毒载体。即，产病毒的细胞在含有来自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶的培养基中培养。随后，所产生的病毒从细胞中回收。病毒可通过例如收集产病毒的细胞的培养上清回收。还可以包括从培养上清中回收病毒的步骤。可以进行离心、吸附、过滤等步骤，以便进一步提纯或浓缩培养上清中的病毒。
唾液酸苷酶(NA)(EC 3.2.1.18)是能切断唾液酸糖苷键(本文称NA活性)的蛋白。具体地，NA是能切断细胞膜糖蛋白或糖脂中唾液酸糖苷键的蛋白(Schauer R.Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.40：131-234(1982)；Cabezas J.A.Biochem.J.278：311-312(1991))。NA活性用单位(U)定义，1个单位是在37℃、pH 5.0、用N-乙酰神经氨酸乳糖(NANA-乳糖)或牛颌下粘蛋白作底物、在1分钟内产生1μmol N-乙酰神经氨酸(NANA)所需的酶量(Cassidy J.T.等，J.Biol.Chem.240：3501(1965))。NA也称唾液酸酶。
本文中，衍生自革兰氏阳性菌的NA是指革兰氏阳性菌所具有的NA，或与之结构相当的NA，或其变化形式。例如，衍生自革兰氏阳性菌的NA包括可以从革兰氏阳性菌获得的NA。例如，它包括从革兰氏阳性菌培养物中提纯的NA，或其重组形式。来自革兰氏阳性菌的NA的重组形式可通过表达编码同种或异种生物NA的基因来产生。衍生自革兰氏阳性菌的NA包括从其它原料获得的NA，只要它们与从革兰氏阳性菌获得的NA蛋白相同。另外，衍生自革兰氏阳性菌的NA包括在来自革兰氏阳性菌的野生型NA中缺失、取代和/或插入一或多个氨基酸而被修饰的蛋白，只要该蛋白保持NA活性。被改变的氨基酸没有数量限制，只要保留了NA活性，但优选是70个或更少氨基酸，更优选50个或更少，更优选30个或更少，更优选20个或更少，更优选10个或更少，更优选5个或更少，最优选3个或更少。改变的NA在氨基酸序列水平上相对于革兰氏阳性菌野生型NA的同一性为50％或更高，优选60％或更高，更优选70％或更高，更优选80％或更高，更优选85％或更高，最优选90％或更高。氨基酸序列同一性可通过例如BLAST测定，它是由Karlin和Altschul开发的算法(Karlin S.和Altschul S.F.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268(1990)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877(1993))。BLAST程序可使用缺省参数运行。通常这种分析的具体步骤是公知的(参见NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)的BLAST网站(Basic Local Alignment Search Tool))。例如，blast2sequence程序是用于比较两序列的程序，可用它产生两序列的对比，并确定它们的同一性(Tatiana A等.FEMS Microbiol.Lett.174：247-250(1999))。空隙(gap)可按错配处理，相对于革兰氏阳性菌野生型NA的完整氨基酸序列的同一性可计算得到。在改变氨基酸的过程中，希望改变除BNR(细菌唾液酸苷酶重复；Pfam登录号PF02012(也称“Asp盒”))外的区域的氨基酸，以免破坏对NA活性有重要作用的BNR(Roggentin P等，Glycoconj.J.6：349-353(1989)；Copley R.R.等Protein Sci.10：285-292(2001))。优选BNR多个拷贝反复出现，且每个重复彼此相距40个或更多氨基酸。预计改变野生型NA的N-和/或C-末端氨基酸，即使对活性有影响也极小。
本文中，衍生自革兰氏阳性菌的NA包括来自革兰氏阳性菌野生型NA的具有NA活性的部分蛋白。该部分蛋白优选包含革兰氏阳性菌野生型NA完整氨基酸序列的60％或更多连续氨基酸，更优选70％或更多，更优选75％或更多，更优选80％或更多，更优选85％或更多，更优选90％或更多。此外，来自革兰氏阳性菌的NA可包括具有NA活性的蛋白，其中，革兰氏阳性菌的野生型NA或其部分蛋白附加有其它蛋白。制备具有其它蛋白且保持活性的部分蛋白或融合蛋白是本领域常规操作。
革兰氏阳性菌是指革兰氏染色呈阳性的细菌或其它真菌。革兰氏染色呈阳性通常是指，在碱性染色液(例如结晶紫)中染色，接着用Lugol’s溶液(I2-KI溶液)处理，再用极性溶剂(乙醇、丙酮等)简单洗涤后，细菌不被脱色。洗涤后经过复染(例如用番红(safranin)溶液或稀释的石炭酸品红溶液)，革兰氏阴性菌变红，革兰氏阳性菌变紫。通常，革兰氏阳性菌具有相对厚的细胞壁(15-80nm)，它们中的许多在外层中缺乏脂多糖。另外，它们中的许多对溶菌酶高度敏感。革兰氏阳性菌的具体的例子包括葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和放线菌。本发明中，衍生自革兰氏阳性菌的NA优选是来自放线菌的NA。
放线菌是指放线菌目的细菌，以及其它放线细菌。放线菌属于革兰氏阳性菌类群。放线菌目包括弗兰克氏菌科(Frankiaceae)、小单孢菌科、丙酸菌科(Propionibacteriaceae)、假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、链霉菌科(Steptomycetaceae)、链孢囊菌科(Streptosporangiaceae)、高温单孢菌科(Thermomonosporaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、放线菌科、微球菌科(Micrococcaceae)、束丝放线菌科(Actinosynnemataceae)、拟诺卡氏菌科(Nocardiopsaceae)和糖霉菌科(Glycomycetaceae)。例如，放线菌NA见登录号L06898(蛋白：AAA21932、A49227)和X62276(蛋白：CAA44166)(粘放线菌(Actinomyces viscosus)NA)。棒状杆菌NA例如见登录号NC-003450(蛋白：NP-600771)和AP005278(蛋白：BAB98949)(谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)NA)。链霉菌NA例如是登录号NC-003155(蛋白：NP-823018)(除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis))和NC-003888(蛋白：NP-630638)(天蓝色链霉菌(Streptomyes coelicolor))。
本发明中使用的唾液酸苷酶优选衍生自放线菌科的细菌，更优选衍生自小单孢菌科，最优选衍生自小单孢菌属。小单孢菌属的细菌包括桔橙小单孢菌(M.aurantiaca)、棕褐小单孢菌(M.brunnea)、浅棕褐小单孢菌(M.brunnescens)、炭样小单孢菌(M.carbonacea)、M.cellulolyticum、青铜小单孢菌(M.chalcea)、切氏小单孢菌(M.chersinia)、柠檬小单孢菌(M.citrea)、青蓝小单孢菌(M.coerulea)、棘橙小单孢菌(M.echinoaurantiaca)、棘棕褐小单孢菌(M.echinobrunnea)、棘孢小单孢菌(M.echinospora)、佛州小单孢菌(M.floridensis)、暗黄绿小单孢菌(M.fulviviridis)，暗黄绛红小单孢菌(M.fulvopurpureus)、暗黄紫小单孢菌(M.fulvoviolaceus)、浑圆小单孢菌(M.globosa)、灰略红小单孢菌(M.griseorubida)、盐生植小单孢菌(M.halophytica)、肌醇小单孢菌(M.inositola)、伊纽小单孢菌(M.inyoensis)、M.lacustris、黑孢小单孢菌(M.megalomicea)、黑孢小单孢菌(M.melanospora)、M.narashino、橄榄星孢小单孢菌(M.olivasterospora)、波赛小单孢菌(M.peucetica)、绛红小单孢菌(M.purpurea)、绛红产色小单孢菌(M.purpureochromogenes)、红橙小单孢菌(M.rhodorangea)、蔷薇小单孢菌(M.Rosaria)、M.rosea、相模原小单孢菌(M.sagamiensis)、绿色小单孢菌(M.viridifaciens)、玉龙小单孢菌(M.yulongensis)、和兹昂小单孢菌(M.zionensis)，但不限于此。特别优选的NA衍生自绿色小单孢菌(ATCC 31146)。绿色小单孢菌NA基因(nedA)的核苷酸序列见登录号D01045(SEQ ID NO：1)，编码的蛋白的氨基酸序列描述于Q02834(SEQ ID NO：2)(Sakurada K.等.J.Bacteriol.174(21)：6896-6903(1992))。
此外，另一种小单孢菌属细菌的NA基因可使用绿色小单孢菌NA基因作为探针进行分离。例如，可以选出在严格条件下与下列序列杂交的核酸：核苷酸序列SEQ ID NO：1和/或其互补序列的30个或更多核苷酸，更优选为50个或更多，更优选100个或更多，更优选150个或更多，最优选全长序列。这种核酸可通过从包含核苷酸序列SEQ ID NO：1的核酸或杂交的靶核酸制备探针、并检测探针与其它核酸的杂交而鉴定。严格条件可以是：在含有5xSSC(1xSSC：150mM NaCl和15mM柠檬酸钠)、7％(w/v)SDS(十二烷基磺酸钠)、100μg/ml变性鲑精DNA和5x Denhardt′s溶液(1x Denhardt′s：0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％牛血清清蛋白和0.2％Ficoll)的溶液中，在48℃、优选50℃、更优选55℃、最优选60℃进行杂交，随后在2xSSC、0.1％(w/v)的SDS中采用与杂交相同的温度搅拌清洗2小时。更优选，清洗可以是：在1xSSC、0.1％(w/v)的SDS中，更优选在0.5xSSC、0.1％(w/v)的SDS中，最优选在0.1xSSC、0.1％(w/v)的SDS中搅拌2小时。
在本发明产生病毒的方法中，产病毒的细胞在上述衍生自革兰氏阳性菌的NA存在的情况下培养，产生的病毒从培养物中收集。当病毒从细胞释放到培养基中时，可通过收集培养上清回收病毒。在产生唾液酸结合蛋白的假型病毒时，表达该蛋白的细胞在衍生自革兰氏阳性菌的NA存在的情况下培养以便产生病毒，并且回收产生的病毒。来自革兰氏阳性菌的NA可通过添加到培养基中供给，或者可使用NA的表达载体从产病毒的细胞或者与产病毒的细胞共培养的其它细胞中分泌。在培养产病毒的细胞的整个过程中，至少部分时间里NA必须存在。在NA存在的情况下培养产病毒的细胞的持续时间可以是1小时或更长，例如，优选3小时或更长，更优选5小时或更长，更优选10小时或更长，最优选20小时或更长。在从培养物回收产生的病毒之前，优选产病毒的细胞在衍生自革兰氏阳性菌的NA存在的情况下培养1小时或更长，更佳地优选3小时或更长，更优选5小时或更长，更优选10小时或更长，最优选20小时或更长。在这段时间中，病毒在培养上清中积累。
可以适当调整培养物中来自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶的量以便使病毒产量最大。培养基中革兰氏阳性菌NA的浓度例如是0.1mU/ml-1000U/ml，优选0.2mU/ml-500U/ml，更优选0.5mU/ml-100U/ml，最优选1mU/ml-50U/ml。尤其，来自革兰氏阳性菌的NA是极好的，因为即使在10U/ml或更低浓度，它仍能产生具有足够效价的病毒。例如，在低浓度(例如1U/ml或更低，0.1U/ml或更低，0.05U/ml或更低，或0.01U/ml或更低)，它能从产病毒的细胞中释放高效价的病毒。
除上述唾液酸结合蛋白外，使用本发明方法产生的病毒载体在包膜中可含有另一种蛋白。例如，除具有HA活性的包膜蛋白外，还可包含例如负链RNA病毒HA(或HN)蛋白，参与膜融合的另一种包膜蛋白例如负链RNA病毒的F蛋白。此外，还可包含所需病毒的包膜蛋白。例如，可适当使用能感染人细胞的病毒的包膜蛋白。这样的蛋白不限于任何具体的一种；它包括反转录病毒的双嗜性包膜蛋白和水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白。另外，它包括疱疹病毒蛋白，例如单纯疱疹病毒的gB、gD、gH、和gp85蛋白，和例如EB病毒的gp350和gp220蛋白。它还包括嗜肝DNA病毒的蛋白，例如乙型肝炎病毒的S蛋白。
例如，包含反转录病毒双嗜性包膜蛋白(双嗜性env)和负链RNA病毒HA(或HN)蛋白的载体可根据本发明的方法产生。此外，本发明方法产生的病毒可包含例如VSV-G蛋白，这是水泡性口炎病毒(VSV)表面的糖蛋白。VSV-G被认为作为受体与存在于大多数动物细胞中的磷脂结合。因此，使用含有VSV-G蛋白和唾液酸结合蛋白的载体显著提高了基因导入的细胞类型，也提高了导入效率(WO01/92508)。这样的例子是包含VSV-G蛋白和负链RNA病毒HA(或HN)蛋白的载体。这种载体可进一步含有负链RNA病毒的F蛋白。因此，本发明可用于产生包含反转录病毒双嗜性包膜蛋白、F蛋白、和HA(或HN)蛋白的载体，以及包含VSV-G蛋白、F蛋白和HA(或HN)蛋白的载体。此外，这种载体可含有负链RNA病毒的M蛋白。因此，本发明适用于产生包含反转录病毒双嗜性包膜蛋白、F蛋白、HA(或HN)蛋白和M蛋白的载体，以及包含VSV-G蛋白、F蛋白、HA(或HN)蛋白和M蛋白的载体。上述这类载体在将基因高效导入常规方法难以导入基因的细胞(例如含有粘液的细胞、含有造血干细胞的细胞级分等)时是极好的。另外，由于VSV-G蛋白作为由单个糖蛋白形成的稳定三聚体存在于膜上，这种载体颗粒在纯化过程中不易破坏，因此，可通过离心将其高度浓缩(Yang Y.等，Hum.Gene Ther.6(9)：1203-1213(1995年9月))。
用于产生假型病毒的负链RNA病毒HA(或HN)、F、和M蛋白不限于任何特有的一种。特别是，可适当地使用正粘病毒科和副粘病毒科的病毒蛋白。具体地，例如，可适当地使用流感病毒和仙台病毒的包膜蛋白。例如，使用在产病毒的细胞中表达的流感病毒HA蛋白产生的假型病毒将能感染包括人类细胞在内的宽范围的哺乳动物细胞。负链RNA病毒HA(或HN)、F、和M蛋白等等可用所需病毒株制备。例如，致病性病毒的蛋白可衍生自减毒株或强化株。例如，仙台病毒的HN、F、和M蛋白可衍生自Z株。相似地，流感病毒的包膜蛋白可衍生自所需的分离株。
另外，反转录病毒双嗜性包膜蛋白可衍生自鼠白血病病毒(MuLV)4070A株。也可使用MuLV 10A1株的包膜蛋白(例如，Pcl-10A1(Imgenex))(Naviaux R.K.等J.Virol.70：5701-5705(1996))。亲嗜性包膜蛋白可衍生自莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MoMuLV)。VSV-G蛋白可衍生自例如Indiana血清型病毒株(J.Virol.39：519-528(1981))。此外，也可使用衍生自任何所需病毒株的蛋白。
上述包膜蛋白，例如负链RNA病毒HA(或HN)、F、G和M蛋白或反转录病毒包膜蛋白，可包含野生型病毒中表达的完整蛋白，或可含有自然发生的或人工诱导的突变。例如，可以分析包膜蛋白中可成为细胞表面抗原分子的表位。然后，可使用该信息选出具有减弱的抗原性的蛋白用于产生病毒。
例如，将HA或HN蛋白等与唾液酸结合的病毒包膜蛋白或其它包膜蛋白的胞质区通过缺失、取代和/或添加进行改变，用改变后的蛋白制备假型病毒载体，就有可能产生具有较高基因导入效率的载体。因此，本发明涉及产生假型病毒载体的方法，所述载体包含将唾液酸结合型天然膜蛋白胞质区的部分或完整区域通过缺失、取代和/或添加进行改变而得到的蛋白。具体地，可以将负链RNA病毒HA(或HN)和/或F蛋白的胞质区经过缺失或取代或被其它膜蛋白(例如，慢病毒包括反转录病毒的包膜蛋白)胞质区结合而改变后得到的蛋白，适当用于产生高导入效率的病毒载体。特别是，可以将与唾液酸结合的野生型病毒包膜蛋白的胞质区通过取代、缺失和/或添加而改变后得到的蛋白，用于产生具有提高的感染效率的假型病毒。例如，反转录病毒包膜蛋白胞质区的取代或结合可适合于产生反转录病毒载体。
具体地，用负链RNA病毒HA(或HN)蛋白胞质区被SIV等反转录病毒或慢病毒包膜蛋白胞质区取代所得到的蛋白，和负链RNA病毒HA(或HN)蛋白与慢病毒等反转录病毒包膜蛋白胞质区结合所得的蛋白，来制备假型反转录病毒，可以将外源基因高效导入人细胞等广泛多种细胞。缺失的胞质区长度，以及结合的反转录病毒包膜蛋白胞质区长度没有具体限制；全部或部分胞质区都可以缺失、取代和/或结合。
上述这类病毒载体可进一步包含改变的负链RNA病毒F蛋白。例如，可使用负链RNA病毒F蛋白胞质区缺失后的蛋白，以及上述缺失的F蛋白与SIV等反转录病毒或慢病毒包膜蛋白胞质区结合的蛋白。具体地，可构建质粒用于表达例如F蛋白胞质区氨基酸缺失的那些蛋白。缺失的长度没有具体限制；全部或部分胞质区都可缺失。例如，其中缺失胞质区、没有留下或仅留下数个氨基酸的F蛋白被认为适合于产生假型反转录病毒。这种缺失的F蛋白可与其它病毒包膜蛋白(例如慢病毒包膜蛋白)胞质区的全部或部分结合，并作为F蛋白胞质区为其它肽取代所得的蛋白用于产生病毒。这种蛋白的例子可以是与SIV包膜蛋白胞质区5’-侧11个氨基酸结合的蛋白。因此，本发明还涉及进一步使用负链RNA病毒F蛋白产生假型病毒的方法，其中蛋白的天然胞质区的全部或部分通过取代、缺失和/或结合被改变。具体地，本发明进一步涉及产生假型病毒的方法，其中F蛋白的胞质区为慢病毒等反转录病毒包膜蛋白的部分或全部胞质区取代。
此外，病毒包膜蛋白的胞外区可用具有细胞粘附活性的膜蛋白(例如粘附分子、配体、或受体、或抗体或其片段)取代以产生嵌合蛋白。这种嵌合蛋白可用于产生能感染广泛多种组织或特异性组织作为其靶的载体。
本发明的方法特别适用于产生反转录病毒。反转录病毒是具有(+)有义链RNA基因组的病毒，特征是包含反转录酶。它在感染靶细胞时用反转录酶将其RNA基因组转变为DNA，并整合进入靶细胞的染色体。这类病毒总称“反转录病毒”。本发明中，反转录病毒可以是野生型反转录病毒的改变形式。这种改变形式的病毒在病毒粒子所含RNA中含有至少部分的反转录病毒基因组RNA，并以感染性病毒粒子的形式存在，它是在病毒粒子形成过程中通过反转录病毒蛋白的作用以序列依赖性方式掺入RNA所产生的。更具体地，反转录病毒的基因组RNA优选包含掺入病毒粒子时所必需的包装信号序列。在反转录蛋白存在的情况下，对两端都具有LTR且包含这种信号序列的RNA进行转录，导致形成含有所述RNA的病毒粒子。
本文中，反转录病毒载体包括那些衍生自肿瘤病毒(oncovirus)的载体。术语“肿瘤病毒”是指属于肿瘤病毒亚科的反转录病毒。肿瘤病毒包括与肿瘤发生有关的反转录病毒，例如肉瘤病毒、白血病毒和乳腺肿瘤病毒。例如，莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)是最早开发的反转录病毒载体之一，它已通过许多改进措施被修饰，并被广泛使用。本发明的方法可适用于使用唾液酸结合蛋白例如负链RNA病毒HA(或HN)蛋白产生MoMLV的假型病毒载体。另外，特别地，鼠干细胞病毒(MSCV)适合用做载体将基因导入血细胞、造血细胞和胚胎干细胞的。例如，使用具有HA活性的，用负链RNA病毒包膜蛋白制备的假型MSCV，可高效地将基因导入来自骨髓的包含造血干细胞的CD34阳性细胞。
本文中，反转录病毒载体还包括那些衍生自慢病毒的载体。术语“慢病毒(Lentivirus)”是指属于慢病毒亚科的反转录病毒。慢病毒的例子包括人类免疫缺陷病毒(HIV)(例如HIV1或HIV2)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、Maedi-Visna病毒、马感染性贫血病毒(EIAV)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)等。反转录病毒可衍生自所需病毒株或亚型。例如，HIV-1包括各个主要(M)亚型(包括A到J)、N、和另外的(O)(Hu，D.J.等，JAMA1996；275：210-216；Zhu，H.等，Nature 1998，5；391(6667)：594-7；Simon，F.等，Nat.Med.1998，4(9)：1032-7)。分离的SIV病毒株包括，例如，SIVagm、SIVcpz、SIVmac、SIVmnd、SIVsnm、SIVsyk等。
慢病毒的优势是它们感染未分裂的细胞，并且病毒基因组可整合进入宿主细胞染色体。核转位信号以及由gag和vpr编码的整合酶被认为是造成整合的原因。当使用这一特征，根据本发明的方法基于慢病毒构建病毒载体时，可以将基因引入活组织中未分裂的细胞和几乎不分裂的细胞中，例如各种组织的干细胞中，这允许有效产生能进行长期基因表达的载体。
人类免疫缺陷病毒(HIV)先于任何其它慢病毒用于构建载体，它也可优选在本发明的方法中使用。此外，在猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)(Poeschla，E.M.等，Nature Medicine，4(3)，354-7，1998)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)(Mselli-Lakhal，L.等，Arch.Virol.，143(4)，684-95，1998)、马感染性贫血病毒(EIAV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)的基础上开发了载体。本发明的方法可用于产生这些载体。
猴免疫缺陷病毒(SIV)作为衍生自猴的HIV-样病毒被发现，它与HIV一起形成灵长类慢病毒类群(E.Ido和M.Hayamizu，“Gene，Infection and
Pathogenicity of Simian Immunodeficiency Virus”，Protein，Nucleic acid andEnzyme，Vol.39，No.8，1994)。这一类群进一步粗略地分成4个亚群：(1)HIV-1亚群，包括引起人获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的HIV-1和从黑猩猩分离出的SIVcpz；(2)HIV-2亚群，包括从Sooty Mangabey(Cercocebus atys)分离的SIVsmm、从猕猴(Macaca mulatta)分离的SIVmac、和对人致病性较小的HIV-2(Jaffar，S.等，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.Hum.Retrovirol.，16(5)，327-32，1997)；(3)SIVagm亚群，代表是非洲绿猴(Cercopithecusaethiops)分离的SIVagm；和(4)SIVmnd亚群，代表是从山魈(Papio sphinx)分离的SIVmnd。
目前尚无报道提示SIVagm和SIVmnd在天然宿主中的致病性(Ohta，Y.等，Int.J.Cancer，15：41(1)，115-22，1988；Miura，T.等，J.Med.Primatol.，18(3-4)，255-9，1989；M.Hayamizu，Nippon Rinsho，47，1，1989)。具体地，以前的报道描述，根据感染实验的结果，作为SIVagm亚群的一员、并在本发明实施例中使用的TYO-1株在食蟹猴(Macaca faciularis)、猕猴(Macaca mulatta)或其它天然宿主中没有致病性(Ali，M.等，(Gene Therapy，1(6)，367-84，1994；Honjo，S等，J.Med.Primatol，19(1)，9-20，1990)。没有关于SIVagm感染人及其发病的报道，因此人们认为SIVagm可能对人没有致病性。通常，灵长类中的慢病毒具有严格的种特异性，很少有关于用来自天然宿主的SIVagm进行种间交叉感染及发病的病例报道；即使有，通常发病频率很低且疾病进展缓慢(Novembre，F.J.等，J.Virol.，71(5)，4086-91，1997)。因此，基于SIVagm制备的病毒载体，尤其是SIVagm TYO-1，被认为比基于HIV-1或其它慢病毒制备的载体更安全，因此它是优选的在本发明中产生的病毒。
此外，本发明中，反转录病毒载体包括衍生自泡沫病毒(spumavirus)的载体。泡沫病毒(Spumavirus)包括，例如，泡沫病毒(foamyvirus)(DE4318387；9607749；Virology(1995)210，1，167-178；J.Virol.(1996)70，1，217-22)。衍生自泡沫病毒的载体可用于将外源基因进入导人细胞，特别是在基因治疗和重组疫苗给药中。
本发明中，反转录病毒载体可在LTR(长末端重复序列)中被修饰。LTR是存在于病毒基因组两端的反转录病毒特异性序列。5’LTR充当启动子，它促进mRNA从前病毒的转录。因此，在表达将被掺入病毒载体的RNA的载体(本文中称做基因导入载体)中，显示5’LTR启动子活性的部分被另一个具有更强启动子活性的启动子取代，可使基因导入载体的mRNA转录水平提高，这可提高包装效率并因此增加载体效价。而且，例如，在慢病毒的情况下，5’LTR的转录活性已知被病毒tat蛋白增强，并因此，用不依赖于tat蛋白的启动子替代5’LTR，允许从表达病毒包装所需的病毒基因的载体(本文中称做包装载体)中除去tat。感染细胞的病毒的细胞内RNA被反转录后，在两端的LTR结成形成封闭环状结构，然后通过结合部位和病毒整合酶之间的相互作用整合进入细胞的染色体。转录自前病毒的mRNA对应于从5’LTR中的转录起始位点到位于下游的3’LTR的多聚腺苷酸序列之间的区域；5’LTR启动子部分没有包装到病毒粒子中。因此，即使该启动子为另一个序列所代替，整合进入靶细胞染色体的部分也没有改变。基于上文描述的事实，5’LTR启动子的取代可提供具有更高效价的更安全的载体。所以，在基因导入载体中，5’末端的启动子的取代可提高可包装的载体的效价。
安全性可使用自我不活化载体(SIN载体)提高，该载体通过部分除去3’LTR序列而制备，以防止靶细胞中其全长载体mRNA的转录。被整合进入靶细胞染色体的慢病毒的前病毒具有与其5’末端结合的3’LTR的U3部分。因此，在靶细胞的染色体中，基因导入载体在5’末端包含U3，因而覆盖整个基因导入载体的RNA的转录从那里开始。如果在靶细胞中具有慢病毒或相关蛋白，基因导入载体将被重新包装并感染其它细胞。此外，位于病毒基因组3’末端邻近的宿主基因有被3’LTR启动子表达的可能(Rosenberg，N.，Jolicoeur，P.，Retroviral Pathogenesis。Retroviruses.Cold SpringHarbor Laboratory Press，475-585，1997)。这种现象被认为是反转录病毒载体有问题。因此，开发了溶液形式的SIN载体来克服这种问题(Yu，S.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83(10)，3194-8，1986)。当基因导入载体的3’LTR缺失U3部分时，5’LTR或3’LTR都不存在于靶细胞中。在这种情况下，全长病毒RNA或宿主基因都没有被转录，而感兴趣的基因用内部启动子进行转录；这种载体可以是具有更高安全性的过量表达载体。这种载体也可根据本发明的方法产生。用于产生SIN载体的基因导入载体可根据本领域已知的任何方法构建(WO01/92508)。
可通过在宿主细胞中转录含有包装信号的基因导入载体DNA，并在gag和pol蛋白以及包膜蛋白存在的情况下允许病毒粒子的形成，以产生反转录病毒。基因导入载体DNA可以是质粒等DNA载体，或者是被整合进入包装细胞的染色体的DNA。只要可以保持基于包装信号序列形成的结构，优选整合由基因导入载体DNA编码的该序列，但需要将载体DNA中包装信号与另一个提供gag和pol蛋白的包装载体之间的序列同源性减到最小，来减少由于载体类型之间的重组形成野生型病毒的频率。因此，优选使用尽可能短的含有包装所需序列的序列来构建基因导入载体DNA，以满足包装效率和安全性的双重标准。
对于包装信号的类型没有限制，只要在引入了包装载体的细胞中可以进行包装；可依据包装载体的类型使用衍生自反转录病毒、慢病毒、免疫缺陷病毒等的包装信号。
例如，就SIVagm-衍生的包装载体来说，提供所用信号序列的病毒类型仅限于SIV，因为HIV载体是未被包装。然而，当使用HIV-衍生的包装载体时，SIV-衍生的基因导入载体也可包装。因此，在将来自不同类型慢病毒的基因导入载体和包装载体联合用于形成载体颗粒时，重组病毒形成的频率可被降低。在这种情况下，优选使用灵长类慢病毒的组合(例如HIV和SIV)。
在优选的基因导入载体DNA中，gag蛋白因被修饰所以不被表达。病毒gag蛋白在活体中可被检测为外源物质，所以是潜在的抗原。换句话说，该蛋白可影响细胞功能。为了防止gag蛋白表达，可通过增加或缺失gag起始密码子下游的核苷酸而导入移码突变。缺失gag蛋白的部分编码区也是优选的。通常，已知gag蛋白编码区的5’部分是病毒包装必需的。因此，在基因导入载体中，优选缺失gag蛋白编码区的C末端。在不显著影响包装效率的前提下，优选缺失尽可能大的gag编码区部分。另外，优选gag蛋白的起始密码子(ATG)用除ATG外的密码子取代。可适当地选择这种用于取代的密码子，以不显著影响包装效率。含有基因导入载体DNA的转录产物的病毒载体可通过将所构建的含有包装信号的基因导入载体DNA导入适当的包装细胞来产生。产生的病毒载体颗粒可从包装细胞的培养上清等中回收。
对于所用的包装细胞类型没有限制，只要该细胞系通常用于产生病毒。当用于人的基因治疗目的时，衍生自人或猴的细胞是优选的。用做包装细胞的人细胞系包括，例如，293细胞、293T细胞、293EBNA细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。猴细胞系包括，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。此外，可使用以前确定的包装细胞。这种包装细胞包括，例如，Bosc23细胞、PE501细胞等。
对插入到载体中的外源基因类型没有限制，它包括，例如，不编码任何蛋白的核酸，例如反义或核酶序列，以及编码蛋白的核酸。
近几年，人们已开始注意各种干细胞，包括造血干细胞，作为基因治疗的目标(Y.Hanazomo，Molecular Medicine，36卷，7号，1999)。包含具有负链RNA病毒血凝素活性的包膜蛋白的假型反转录病毒载体可高效地将基因导入衍生自人骨髓的CD34-阳性细胞(WO01/92508)；近几年，这种含有CD-34阳性细胞的部分作为含有造血干细胞的细胞级分受到重视。以前的报道描述，在用包甲基纤维素的培养基进行的集落分析中，CD34-阳性细胞显示多潜能(Kirshenbaum，A.S.等，J.Immunol.，148(3)，772-7，1992)，并且将CD34-阳性细胞移植到联合免疫缺陷型NOD/SCID小鼠中，导致细胞定位在小鼠骨髓中并导致重建造血系统(Larochelle，A.等，Nat.Med.，2(12)，1329-37，1996)。所以认为干细胞样未成熟细胞至少存在于CD34-阳性细胞级分中。CD34-阳性细胞级分中的造血干细胞处于未分裂状态。通常，使用反转录病毒载体时将基因导入这类细胞的效率很低(Kiem，H.P.等，Curr.Opin.Oncol.，7(2)，107-14，1995)；然而，使用含负链RNA病毒血凝素活性的包膜蛋白的假型载体，可大大提高感染效率。具体地，通过使用慢病毒载体，例如HIV或SIV载体，预期基因导入非分裂细胞的效率进一步提高。本发明中，使用与唾液酸结合的蛋白产生假型反转录病毒载体的方法可用于产生将基因导入血细胞或造血细胞的载体。因此，本发明涉及使用本发明的病毒产生方法产生将基因导入血细胞或造血细胞时的载体的方法。它还涉及将基因导入血细胞或造血细胞的方法，包括使血细胞或造血细胞与使用本发明方法产生的载体接触，并用本方法产生的载体将基因导入血细胞或造血细胞。将外源基因导入血细胞或造血细胞的效率可通过，例如，使用抗各种已知细胞表面抗原的抗体进行流式细胞术分析、集落分析、以及通过将造血细胞移植到造血系统已遭破坏的小鼠中重建造血系统来评估。
用具有唾液酸结合活性的蛋白制备的假型反转录病毒载体可将基因高效导入血细胞和造血细胞，并因此可用于靶向血细胞的基因治疗，如腺苷酸脱氨酶(ADA)缺乏症(Blaese，R.M.，Pediatr，Res.，33(1Suppl)，S49-53，1993)、血友病(Kay，M.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(18)，9973-5，1999)和Fanconi贫血等。给药可通过回体(ex vivo)方法进行。
具体地，可以应用本发明方法产生的载体靶向造血细胞的基因疗法的例子包括，例如，使用药物抗性基因MDRI在抗癌化疗中保存干细胞(Licht，T.等，Gene Ther.(2000)7，4，348-58)；引入正常FANCC基因治疗Fanconi贫血(Liu，J.M.等，Hum.Gene Ther.(1999)10，14，2337-46)；引入一组细胞因子(血小板生成素、白细胞介素6和11，和Flt-3配体)增加干细胞的回体增殖(WO 99/07831)；表达嵌合蛋白，例如Flt-3激动剂，以治疗血细胞减少症(WO 98/46750)；引入人β珠蛋白基因以治疗β地中海贫血症(WO9741141)；用IL-6拮抗剂和自杀基因表达组合疗法治疗IL-6-依赖性多发性骨髓瘤(德国专利DE19704979号)；引入含有造血因子组合的受体激动剂等基因[白细胞介素(GM-CSF、G-CSF-Ser17，M-CSF、红细胞生成素、IL-1、IL-14、IL-2、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13和IL-15)，白血病抑制因子(LIF)，flt-3/flk2配体，人促生长素(somatotropin)、B细胞生长因子、B细胞分化因子、红细胞分化因子(EDF)或干细胞因子(SCF)](WO97/12985)，在干细胞培养和造血疾病的基因疗法中使用的c-mpl受体激动剂(WO97/12978)，用于人造血祖细胞增殖的IL-6和IL-6可溶性受体融合蛋白(Nat.Biotechnol.(1997)15，2，142-45)，用于造血祖细胞增殖的IL-6超激动剂和超拮抗剂(WO 96/18648)，用于血液疾病治疗的因子-X(J.Cell.Bioche.(1995)Suppl.21A，410)，用于人造血祖细胞增殖的干细胞因子、IL-6和可溶性IL-6受体复合物(Gene Ther.(1995)2，9，694)，以RNA病毒为靶的核酶，和用于预防HIV感染和细胞免疫的反义RNA和/或诱骗(decoy)RNA(WO 96/22368)。本发明涉及产生编码上述任何物质或其任何组合的病毒载体的方法，其中该病毒载体在其包膜中包含结合唾液酸(cyalicacid)的膜蛋白。
另外，通过本发明方法产生的载体对含粘液的细胞，例如鼻腔粘膜上皮细胞和肺支气管粘膜上皮细胞具有高感染力。使用常规病毒载体很难将基因导入含粘液的细胞，例如气管上皮粘膜细胞，并且导入时必需进行排除物理障碍的处理。例如，使用VSV-G假型的HIV载体进行基因导入不会产生足够的导入效率，除非组织被二氧化硫或类似物质破坏(Johnson L.G.等，Gene Therapy 7：568-574(2000))。然而，本发明方法产生的载体能在不破坏细胞或组织的情况下，将基因高效导入曾经难以导入的含粘液的细胞中(WO01/92508)。因此，本发明涉及使用本发明的病毒产生方法产生将基因导入含粘液的细胞的载体的方法。它还涉及将基因导入含粘液的细胞的方法，包括使含粘液的细胞与用本发明方法产生的载体接触，并用本发明方法产生的载体将基因导入含粘液的细胞。含粘液的细胞包括粘膜上皮细胞，具体如鼻腔或肺支气管粘膜上皮细胞。
具体应用实例包括，利用高浓度的抗原呈递细胞(APC)将基因(例如IL-2、IFN-γ、和TGF-β)导入皮肤和粘膜来诱导免疫系统(WO95/05853)，通过口服基因将轮状病毒疫苗导入粘膜(J.V.irol.72(7)：5757-5761(1998))，粘膜给药治疗自免疫疾病(WO97/46253)，粘膜给药预防传染性疾病(WO96/21356)，将基因导入女性生殖器官粘膜来预防性传播疾病或由乳头瘤病毒感染引起的宫颈癌(Infect.Immun.66(1)：322-329(1998))，以及通过粘膜给药使给药简化并且提高安全性(Proc.Am.Assoc.Cancer Res.36：86Meet.，418(1995))。
具体地，本发明产生重组反转录病毒载体的方法包括如下步骤，例如，(a)提供细胞(产生病毒的细胞)，在其中转录反转录病毒基因组RNA，并表达gag和pol蛋白以及与唾液酸结合的膜蛋白，和(b)在衍生自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶存在的情况下培养细胞，并回收产生的病毒。反转录病毒基因组RNA可以基于野生型病毒基因组而变化，只要它被包装进入病毒粒子并整合进入靶细胞染色体。例如，它可以是在两端都具有LTR并包含包装信号序列的RNA。基因组RNA中可以插入所需基因。这种插入的外源基因可通过LTR的启动子活性表达，或通过将另一启动子插入基因组内部来启动表达。
在产生病毒的细胞中表达的gag和pol蛋白，以及基因组RNA可衍生自其它病毒，只要它们装配形成病毒。例如，表达HIV病毒蛋白的包装细胞可用于包装SIV基因组RNA。在这种应用中，与唾液酸结合的膜蛋白可在包装细胞中瞬间表达或组成型表达。通过在衍生自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶存在的情况下培养上述产生病毒的细胞，包膜中具有与唾液酸结合的膜蛋白的反转录病毒被释放到培养基中。可回收培养物或培养上清以获得产生的病毒。
例如，本发明中反转录病毒载体可如下产生。下文具体的产生病毒载体的方法显示为实施例，本领域任何熟练的技术人员可以适当地进行修改。
为了用质粒载体表达使重组病毒假型化所用的病毒包膜蛋白，可以将编码蛋白的基因插入pCAGGSA载体(Niwa H.等，Gene 108：193-200(1991))等来构建表达载体。例如将编码负链RNA病毒(例如流感病毒或仙台病毒)HA(或HN)、F和M蛋白的基因插入表达载体。例如，构建流感病毒HA蛋白(H1N1)的表达质粒时，HA蛋白的ORF用pDREF HisD质粒(Microbiol.Immunol.44(8)：677-685(2000)作为模板、并用适当的引物对进行PCR扩增。扩增的片段用Notl消化，插入载体的NotI位点，该载体中pCAGGS带有XhoI-NotI位点。由此获得表达HA蛋白的pCAGGS-HA质粒(WO01/92508)。另一方面，可如下制备仙台病毒包膜蛋白的表达质粒：例如，从pSeV18+b(+)(仙台病毒Z株的完整基因组DNA(Hasan M.K.等，J.GeneralVirol.78：2813-2820(1997)))切下编码F、HN和M蛋白的基因，并插入pCAGGS的XhoI位点以构建仙台病毒F、HN和M蛋白的表达载体(分别称pCAGGS F、pCAGGS HN和pCAGGS M)(WO01/92508)。
在产生反转录病毒时，用例如人胚肾衍生细胞系293T细胞(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8392-8396(1993)作为产病毒的细胞。293T细胞在含有10％已灭活的胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Gibco BRL)中培养。用LIPOFECTAMINE PLUS(Gibco BRL)按照说明书导入DNA载体。例如，将293T细胞以1×106细胞/孔的密度置于6-孔塑料板中，在CO2气体培养箱中培养48小时(37℃、10％CO2)。导入前30分钟，培养基用含有1％牛血清清蛋白(Gibco BRL)/孔的800μl DMEM代替，然后继续培养。
基因导入载体不限于任何具体的病毒；例如，可使用鼠干细胞病毒(MSCV；Clontech)(Hawley R.G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：10297-10302(1996)；Hawley R.G.等，Gene Therapy 1：136-138(1994))。将要表达的所需基因插入到载体中。就DNA导入量而言，每孔可使用700ng基因导入载体和300ng包装载体(pCL-Eco，Pcl-Ampho(MuLV 4070A)，都可从IMGENEX获得)(Naviaux，R.K.等，J.Virol.70：5701-5705(1996))，除了这些，用于负链RNA病毒包膜蛋白的200ng上述表达载体可单独或以任何组合使用。将DNA溶于100μl OptiMEM，向其中加入6μl PLUS试剂(GibcoBRL)，混合后，溶液在室温静置15分钟。向DNA和PLUS试剂(Gibco BRL)的混合物中加入4μl LIPOFECTAMINE在100μl OptiMEM中的稀释液，混合后将该混合物在室温再培养15分钟。将含有如上述制备的DNA和LIPOFECTAMINE混合物的溶液滴加到6孔板的293T细胞培养物中，然后轻微混合，培养物CO2气体培养箱中培育3小时(37℃、10％CO2气体)。然后，每孔培养物中加入含1％牛血清清蛋白(Gibco BRL)和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的1ml DMEM(Gibco BRL)，在CO2气体培养箱中继续培育24小时(37℃、10％CO2)。随后，每孔培养基用含1％牛血清清蛋白、5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)和0.01U革兰氏阳性菌唾液酸苷酶的2ml DMEM代替，培养物继续培育24小时。然后，收集培养上清，经0.45μm过滤器(例如，DISMIC-25CS过滤器(ADVANTEC))过滤获得载体溶液。革兰氏阳性菌唾液酸苷酶可以是从放线菌衍生的NA，例如，具体地从绿色小单孢菌衍生的NA。NA的量可适当调整。具有负链RNA病毒的HA活性包膜蛋白的假型反转录病毒对含粘液的细胞，例如肺支气管粘膜上皮细胞具有高感染力。因此，如上述产生的这种载体可用于将基因导入含粘液的细胞。此外，这种能将基因导入人骨髓CD34阳性细胞和CD34阴性细胞的病毒载体可用于将基因导入造血细胞。
另外，基于莫洛尼鼠肉瘤病毒的假型反转录病毒载体可在本发明中适当地产生。而且，可制备进一步含有VSV-G蛋白作为包膜蛋白的载体。例如，使用上述pMSCV EGFP，或在莫洛尼鼠肉瘤病毒LTR控制下表达LacZ的pLZRNL载体(Yee J.-K.等，Methods In Cell Biology 43：99-112(1994)；Xu L.等，Virology 171：331-341(1989))作为基因导入载体，具有各种包膜蛋白的假型反转录病毒载体可如下制备。
在37℃、10％CO2气体的条件下，在含有10％已灭活的小牛血清(BIOWHITTAKER)的高葡萄糖DMEM(Gibco BRL)中培养293T细胞。细胞以5×105细胞/孔的密度置于6-孔塑料板中，并在37℃、10％CO2中培育48小时。然后，每孔培养基用含有1％牛血清清蛋白的800μl DMEM代替，对细胞进行导入。在每孔中，将700ng基因导入载体(pMSCV EGFP或pLARNL)与100ng VSV-G表达质粒pVSV-G(衍生自Indiana血清型株；Clontech)，200ng负链RNA病毒HA(或HN)、F、和M蛋白各自的表达质粒(用pCAGGS构建)，和300ng鼠反转录病毒衣壳蛋白表达质粒pCL-Eco和pCL-Ampho(Imgenex)(Naviaux R.K.等，J.Virol.70：5701-5705(1996))以任何组合混合，并溶于100μl OptiMEM中。加入6μl PLUS试剂(Gibco BRL)后，搅拌混合物，在室温静置15分钟。将在100μl OptiMEM中稀释的4μl LIPORECTAMINE试剂(Gibco BRL)加入混合物中并充分混合，进一步在室温培育15分钟。然后，将混合物逐滴加入上述293T细胞的培养物中，轻微混合，培养物在37℃、10％CO2气体条件下培育3小时。然后，各孔培养物中加入含有1％牛血清清蛋白和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的1ml DMEM，在37℃、10％CO2气体条件下再培育24小时。随后，各个加样孔中的培养基用含有1％牛血清清蛋白、5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)、和0.01U衍生自革兰氏阳性菌(例如放线菌)的唾液酸苷酶的2ml DMEM代替，培养物继续培养24小时。然后，收集培养上清，并通过孔径大小为0.45μm的过滤器过滤获得载体溶液。
此外，本发明尤其可用于慢病毒载体的产生。下文显示了用VSV-G蛋白产生假型慢病毒载体的实施例。
为了构建载体，可使用例如SIVagm TYO-1株，一种非洲绿猴免疫缺陷病毒的非病原性克隆。携带SIVagm TYO-1作为插入片段的质粒可从例如pSA212构建(J.Virol.64：307-312(1990))。基因导入载体和包装载体的构建可使用公开的文献作为参考进行(WO01/92508)。具体地，构建提供病毒粒子形成所必需的蛋白的表达质粒(包装载体)，其中gag、pol、tat、rev、vif、vpr/x序列都位于启动子的下游。为了避免产生野生型病毒，优选除去包装信号ψ和env的绝大部分。可以将SD序列插入gag上游，并将RRE序列插入和tat/rev的第一个外显子的下游，以表达包装载体中所有的基因。而且，可缺失全部的nef序列，该序列被认为对于载体包装不是必需的。
构建基因导入载体，该载体提供包装在该载体中的RNA，从而可以携带基因组两端的LTR序列、SD序列、ψ和RRE作为插入片段。而且，基因导入载体的5’-LTR启动区可用外源启动子取代。此外，3’-LTR的序列可部分缺失以制备自我不活化载体(SIN载体)，该载体防止靶细胞中编码完整载体的mRNA的转录。对于这种SIN载体，例如可插入CMV启动子作为启动子，而所需外源基因被插入该启动子的下游。
VSV-G表达载体可用做提供衣壳蛋白的载体以形成假型载体颗粒。例如，用于提供VSV-G的载体可以是实际上用于使反转录病毒载体和HIV载体假型化的pVSV-G(Burns.J.C.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8033-8037)。
下文中提供了更具体的描述。
<包装载体的构建>
使用适当的引物对，以pSA212作为模板，通过PCR制备对应于含有vif和tat/rev的第一个外显子的区域(5337-5770)的DNA片段。将限制性内切酶EcoRI的位点加入PCR引物之一，由此制备在3’末端含有EcoRI位点的DNA片段。PCR片段用BgIII和EcoRI消化，并使用琼脂糖凝胶电泳和Wizard PCR Preps DNA纯化系统(Promega)纯化。如上所述制备的DNA片段以及编码gag/pol区(从XhoI位点(356)到BgIII位点(5338))的另一个DNA片段连接进入XhoI和EcoRI位点之间的pBluescript KS+(Stratagene)。然后，Rev效应元件(RRE)和与包含tat/rev的第二个外显子的区域一致的DNA片段使用PCR扩增。使用例如pSA212作为模板通过PCR将NotI位点加入3’末端。获得的PCR片段用EcoRI和NotI双消化，随后纯化。该片段被插入在EcoRI和NotI位点之间含有gag-tat/rev的pBluescript KS+中。
合成的在其5’和3’末端分别具有XhoI位点和SaII位点、并含有剪接供体(SD)位点序列的DNA片段，被插入上述含有gag-RRE-tat/rev的pBluescriptKS+的XhoI位点。获得的质粒用XhoI和NotI消化。含有SD-gag-RRE-tat/rev的片段被纯化。通过在EcoRJ位点将XhoI/NotI接头插入pCAGGS(Gene，108卷，193-200，1991)制备质粒，然后在XhoI/NotI位点插入上述SD-gag-RRE-tat/rev片段。通过上述方法获得的质粒被用做包装载体pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev(WO01/92508)。
<基因导入载体的构建>
使用pSA212作为模板，使用适当的引物对，进行PCR以扩增SIVagmTYO1衍生的5’LTR区(8547到9053+1到982；在5’和3’末端分别含有KpnI位点和EcoRI位点)；3’LTR区(8521-9170；在5’末端含有NotI和BamII位点，在3’末端含有SacI位点)；和RRE序列(7380-7993；在5’和3’末端分别含有EcoRI和SacII位点)。衍生自pEGFPN2(Clontech)的CMV启动区(1-600；在5’和3’末端分别含有SacII和NotI位点)使用适当的引物对扩增。DNA片段在其末端被消化。纯化后，通过连接，5’LTR、RRE、CMV启动子和3’LTR以这样的次序在KpnI-SacI位点插入pBIuescript KS+。例如，含有衍生自pCMVβ(Clontech)的β-半乳糖苷酶基因的NotI片段使用适当的引物对分别插入5’和3’末端的位点。衍生自pEGFPN2(Clontech)CMV启动区(1-600；在5’和3’末端分别含有SacII和NotI位点)使用适当的引物对扩增。DNA片段在其末端被消化。纯化后，通过连接，5’LTR、RRE、CMV启动子和3’LTR以这样的次序在KpnI-SacI位点插入pBluescript KS+。例如，含有衍生自pCMVβ(Clontech)的β-半乳糖苷酶基因的NotI片段作为报道基因插入NotI位点。获得的质粒用KpnI和SacI消化以获得含有从5’LTR到3’LTR区域的DNA片段。在KpnI-SacI位点将该片段插入控制载体pGL3(Promega)。获得的质粒被用做基因导入载体pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMV F
β-gal/WT 3’LTR。
此外，衍生自pEGFPC2(Clontech)的CMV启动区以及编码EGFP的区域(1-1330；包含位于5’末端的SacII位点和位于3’末端的NotI、BamHI位点和翻译终止密码子)使用适当的引物对并使用pEGFPC2作为模板通过PCR扩增。四种类型的PCR片段分别用限制性内切酶KpnI和EcoRI、EcoRI和SacII、BamHI和SacI、以及SacII和BamHI消化。纯化后，通过连接，将5’LTR的片段、RRE、CMV启动子EGFP和3’LTR以这样的次序在KpnI和SacI位点之间插入pBluescript KS+(pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT 3’LTR)。质粒pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR用KpnI和SacI消化以制备含有从5’LTR到3’LTR的区域的DNA片段。该片段作为控制载体在KpnI-SacI位点被插入pGL3(Promega)以构建载体(pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR)。
<5’LTR的修饰>
含有5’LTR的TATA框下游的gag区(9039到9170+1到982)的片段使用适当的引物对并使用pSA212作为模板通过PCR扩增。巨细胞病毒的CMV L启动子(衍生自pCI(Promega)；核苷酸1-72)使用PCR扩增。含有5’LTR的TATA框下游区域的片段与含有启动子的片段结合。含有启动子和5’LTR的嵌合启动子的DNA片段使用混合物作为模板，且一个引物置于启动子的5’侧，另一个引物位于5’LTR的3’侧通过PCR制备。获得的DNA片段在KpnI-EcoRI位点被插入基因导入载体(pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3’LTR)以制备pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR。简言之，通过上述PCR试验获得的DNA片段还可插入载体pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR的KpnI-EcoRI位点以制备pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT 3’LTR。
<3’LTR-修饰的SIN载体(自我不活化载体)的制备>
含有5’末端27bp、3’末端15bp、以及来自3’LTR的U3区域的R区域的DNA片段使用适当的引物对并使用pSA212作为模板通过PCR扩增。该片段被插入基因导入载体  pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR的SalI-SacI的位点(制备该载体使之包含上一部分中所述的嵌合启动子)，以制备pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/3’LTRΔU3。简言之，该片段在SalI-SacI位点还被插入pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR以制备pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3’LTRΔU3(WO01/92508)。
构建的质粒通过常规方法转化为DH5α(Toyobo)，并在琼脂平板上培育。使用新生集落(emerging colonies)作为模板进行PCR以证实正确的结构。确定的克隆在100ml LB培养基中培养。用QIAGEN Plasmid Maxi试剂盒(QIAGEN)纯化质粒。
<病毒载体的回收>
293T细胞以5×105细胞/孔的密度置于6-孔塑料板中，在37℃、10％CO2气体条件下培养48小时。然后，培养基用每孔800μl OptiMEM(如果使用HA则包含1％BSA)取代用于导入。对于每一个加样孔，600ng上述基因导入载体和300ng上述包装载体与包膜蛋白的表达质粒混合，例如以任意组合、并溶于100μl OptiMEM中的100ng到300ng负链RNA病毒HA(或HN)和F蛋白的表达质粒(在pCAGGS中构建)，和100ng VSV-G蛋白(pVSV-G；Clontech)的表达质粒。加入6μl PLUS试剂后(Gibco BRL)，搅拌混合物，并在室温静置15分钟。将与4μl LIPOFECTAMINE试剂(Gibco BRL)混合的100μl OptiMEM加入混合物中，彻底混合，再在室温培育15分钟。然后，混合物逐滴加入上述293T细胞的培养物中，轻柔混合，并在37℃、10％CO2气体条件下培育3小时。然后，将1ml含有20％已灭活的小牛血清的DMEM(或者如果使用HA则用含有1％BSA和5μg/ml胰蛋白酶代替)加入各个加样孔的培养物中，该培养物在37℃、10％CO2气体条件下继续培养12小时。随后，各个加样孔的培养基用含有10％已灭活的小牛血清(或者如果使用HA，在衍生自M.viridifaciens的NA存在的情况下，用含有1％牛血清清蛋白和5μg/ml胰蛋白酶代替)的DMEM替换，培养物继续培养24小时。然后，回收培养上清，并通过孔径为0.45μm的过滤器过滤。
<SIVagm载体介导的基因导入>
293T细胞以5×105细胞/孔的细胞密度置于6-孔塑料培养平板中，在10％CO2、37℃的条件下培养48小时。除去培养基，1ml其中包含以8μg/ml终浓度加入了聚凝胺(polybrene)(Sigma)的载体溶液的溶液覆盖于细胞上。细胞在10％CO2、37℃培育3小时以完成载体导入。3小时后，1ml培养基加入细胞中。第二天，改变培养基。第三天，当使用的载体是β-Gal表达载体时，使用β-Gal染色试剂盒(Invitrogen)用X-gal作为底物进行染色，在光学显微镜观察到靶细胞中β-半乳糖苷酶的表达。然而，当使用的载体是EGFP表达载体时，在荧光显微镜下分析表达。
<载体滴定>
通过计算使用1ml载体溶液导入基因的细胞的数量进行载体滴定。293T细胞以1×106细胞/孔的细胞密度置于6-孔塑料培养平板中，并培养48到72小时。通过与上述相同的步骤，用系列稀释的载体溶液进行细胞感染。感染后48小时进行X-gal染色。例如，一个视野内包含导入基因的细胞的数量的平均值从光学显微镜下200倍放大的三个不同的视野确定，并乘以系数854.865确定，该系数基于视野的面积和平板的面积确定以确定滴度。这样计算的病毒载体滴度单位定义为导入单位(T.U.)/ml。
这样制备的SIVagm载体高效地介导基因导入培养细胞和其它体内和体外细胞。野生型病毒粒子重组的可能性在许多独立质粒共导入后包装的载体中假定非常低，例如上述基因导入载体、包装载体和包膜表达载体。此外，用做载体基础的SIVagm TYO-1本身，已被证实就天然和试验感染来说都显示没有致病性(Ohta，Y等，Int.J.Cancer：41，115-22，1988；Miura，T.等，J.Med.Primatol.：18(3-4)，255-9，1989；Honjo，S.等，J.Med.Primatol.19(1)，9-20，1990)。另外，该载体可以是高度安全的，因为通常慢病毒是高度种特异性的，并且除对于它们原始的靶种类外，对动物种类仅具有微弱的致病性(Novembre，F.J.等，J.Virol：71(5)，4086-91.1997)。
在这个载体产生系统中，包装信号序列从包装载体构建物中除去，因此编码病毒蛋白的RNA没有被包装成颗粒。rev蛋白与RRE的结合诱导RNA导入细胞质并抑制剪接，导致病毒蛋白的表达以及全长RNA包装成为病毒粒子。因此，包装载体和基因导入载体中插入的RRE可介导包装载体的mRNA的剪接，这因此可允许全部基因的表达。然后，基因导入载体的mRNA可被导入细胞质，并包装成载体颗粒。有一些vif和vpr/x从HIV-1载体中除去的例子(Dull，T.等，J.Virol，72(11)，8463-71.1998)，这说明蛋白对于载体颗粒的包装和行使功能非必需的可能性。人们认为vpr是负责对不分裂细胞的感染性的因子(Heinzinger，N.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91(15)，7311-5，1994)；报道描述HIV-1载体可将基因导入的细胞的类型依赖于vpr的存在而改变(Kim，V.N.等，J.Virol，72(1)，811-6，1998)。还已报道，如上文中描述的完全从包装载体中除去的nef，基于猴感染试验获得的证据，可以是引起SIV-介导的免疫缺陷的蛋白(von Gegerfelt，A.S.等，J.Virol.73，6159-65，1999；Kestler，H.W.3d.，Y.N.，Kodama，T.，King，N.W.，Daniel，M.D.，Li，Y.，Desrosiers，R.C.猿免疫缺陷病毒的感染性分子克隆对于发病机理研究的用途，J.Med.Primatol.18(3-4)：305-9，1989)。相应的序列完全从如上所述构建的SIVagm载体中除去；因此，即使形成含有衍生自包装载体的病毒基因的重组病毒粒子，这种颗粒的致病风险将进一步下降。
基于慢病毒的载体可将基因导入细胞周期停滞培养细胞和神经细胞，因为原始的慢病毒对不分裂的细胞具有感染性(Naldini，L.等，Science：272263-267，1996；Sutton，R.E.等，J.Viroi.，73(5)，3649-60，1999)。当这样的载体是由VSV-G制成的假型载体时，不象原始的SIV，该载体的感染性不限于感染CD4-和趋化因子受体-阳性细胞。已知VSV-G的受体是磷脂酰丝氨酸，它是一种磷脂，其分子存在于各种类型的细胞表面(Schlegel，R.等，Cell，32(2)，639-46，1983)。因此，由VSV-G制成的假型SIVagm载体具有较宽范围的感染性。人们预测当用具有唾液酸结合活性的膜蛋白制成的假型病毒基于这种载体制备时，它们能高效地将基因导入几乎所有类型的动物细胞。
在病毒载体的制备中用于导入细胞的质粒载体的量可适当调节。例如，可使用下列方法，虽然并不限于这些方法。
1.细胞培养
293T细胞(人胚肾衍生细胞系)在37℃、10％CO2的条件下，在含有10％已灭活的小牛血清(BIO WHITTAKER)的高葡萄糖DMEM(Gibco BRL)中培养。
2.载体的构建
293T细胞以5×105细胞/孔的密度置于6-孔塑料板中，并在37℃、10％CO2的条件下培育48小时。然后，各个加样孔中的培养基用含有1％牛血清清蛋白的800μl DMEM代替用于导入。对于各个加样孔，1200ng基因导入载体(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTRAU3，或pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/3LTRAU3)和360ng包装载体(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)与任何组合的包膜蛋白的表达质粒混合：120ng VSV-G表达质粒pVSV-G(Clontech)，和240ng负链RNA病毒(在pCAGGS中)HA(或HN)、F和M蛋白的各个表达质粒，并溶于100μlOptiMEM中。加入6μl PLUS试剂(Gibco BRL)后，搅拌混合物，并在室温静置15分钟。在100μl OptiMEM中稀释的4μl LIPOFECTAMINE试剂(GibcoBRL)加入混合物中，彻底混合，再在室温培育15分钟。然后，混合物逐滴加入上述293T细胞的培养物中，轻柔混合，在37℃、10％CO2的条件下培育3小时。然后，将含有1％BSA和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)(如果使用HA，则用10μg/ml胰蛋白酶替代)的1ml DMEM加入各个加样孔的培养物中，并在37℃、10％CO2的条件下培育24小时。随后，各个加样孔中的培养基用2ml DMEM替代，该DMEM含有1％牛血清清蛋白、7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)(5μg/ml胰蛋白酶用于HA)，和衍生自革兰氏阳性菌(例如放线菌)的0.01U的NA，且该培养物继续培育24小时。然后，回收培养上清，并通过孔径为0.45μm的过滤器过滤以获得载体溶液。
载体的大规模制备及其浓缩如下进行。例如，293T细胞以5×106个细胞/培养皿的密度置于直径为15cm的塑料培养皿中，在37℃、10％CO2的条件下培养48小时。各个培养皿中的培养基用10ml含有1％牛血清清蛋白的DMEM代替，对培养物进行导入。对于各个培养皿，8μg的基因导入载体和2.4μg的包装载体与任何组合的0.8μg的VSV-G表达质粒pVSV-G(Clontech)和1.6μg的负链RNA病毒(pCAGGS)HA(或HN)和F蛋白的各个表达质粒混合，并溶于1.5ml OptiMEM中。将40μl PLUS试剂((GibcoBRL)加入质粒溶液中，混合，混合物在室温静置15分钟。将在1.5mlOptiMEM中稀释的60μl LIPOFECTAMINE试剂(Gibco BRL)加入混合物中，彻底混合，并在室温再培育15分钟。然后，该混合物逐滴加入上述293T细胞的培养物中，轻柔混合，并在37℃、10％CO2的条件下培育3小时。然后，将10ml含有1％BSA和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM加入各个培养皿的培养物中，并在37℃、10％CO2的条件下培育24小时。随后，各个培养皿中的培养基用20ml DMEM替换，该DMEM含有1％牛血清清蛋白、7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)(如果使用HA则为5μg/ml胰蛋白酶)，和衍生自革兰氏阳性菌(例如放线菌)的大约0.05到0.5U的NA。在37℃、10％CO2的条件下再培育24小时后，回收培养上清，通过孔径为0.45μm的过滤器过滤，并在4℃以42,490xg离心90分钟(如果使用F/HN则为16,000xg)(TOMY SRX-201，TA21BH)。沉淀溶于PBS(含有5％FCS，2μg/ml聚凝胺)中，在-80℃保存直至使用。
在另一个实施例中，具有流感HA蛋白的假型慢病毒载体可被浓缩。浓缩可如下进行。293T细胞以5×106个细胞/培养皿的密度置于直径为15cm的塑料培养皿中，在37℃、10％CO2的条件下培养48小时。各个培养皿中的培养基用10ml含有1％牛血清清蛋白的DMEM替换，对培养物进行导入。对于各个培养皿，8μg的基因导入载体(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF  LacZ/3’LTRΔU3)与2.4μg的包装载体(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)和1.6μg的流感HA蛋白表达质粒pCAGGS-HA混合，并溶于1.5ml OptiMEM中(Gibco BRL)。将40μl PLUS试剂(Gibco BRL)加入质粒溶液中，混合，在室温静置15分钟。将在1.5mlOptiMEM中稀释的60μl LIPOFECTAMINE试剂(Gibco BRL)加入混合物中，彻底混合，再在室温培育15分钟。然后，混合物逐滴加入上述293T细胞的培养物中，轻柔混合，并在37℃、10％CO2的条件下培育3小时。然后，含有1％BSA和10μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的10ml DMEM加入各个培养皿的培养物中，并在37℃、10％CO2的条件下培育16-24小时。随后，各个培养皿中的培养基用20ml DMEM替换，该DMEM含有1％牛血清清蛋白、5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)，和衍生自革兰氏阳性菌(例如放线菌)的大约0.05到0.5U的NA。再培育24小时后，回收培养上清，通过孔径为0.45μm的过滤器过滤，并在4℃以16,000xg离心1小时(Beckman J-25I，JA-18)。沉淀重悬浮于PBS(含有5％FCS，2μg/ml聚凝胺)中，在-80℃储存。流感病毒HA的使用使之能在没有其它包膜蛋白例如VSV-G共表达的情况下进行基因导入。HA假型载体可通过离心高度浓缩。
此外，假型慢病毒载体可使用两种或多种唾液酸结合蛋白制备。下面描述的是用流感病毒和仙台病毒的包膜蛋白产生假型慢病毒载体的实施例。
<细胞培养>
在37℃、10％CO2的条件下，在含有10％已灭活的小牛血清(BIOWHITTAKER)的高葡萄糖DMEM(Gibco BRL)中培养293T细胞(人胚肾衍生细胞系)。
<载体构建>
293T细胞以5×105细胞/孔的密度置于6-孔塑料板中，并在37℃、10％CO2的条件下培育48小时。各个加样孔中的培养基用含有1％牛血清清蛋白的800μl DMEM代替，该培养物用于导入。对于各个加样孔，1200ng基因导入载体(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTRΔU3)，360ng包装载体(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)，和240ng仙台病毒HN蛋白(pCAGGS-HN)和HA蛋白的各个表达质粒混合，并溶于100μlOptiMEM(Gibco BRL)中。将6μl PLUS试剂(Gibco BRL)加入质粒溶液，混合，并在室温静置15分钟。将在100μl OptiMEM中稀释的4μlLIPOFECTAMINE试剂(Gibco BRL)加入混合物中，彻底混合，再在室温培育15分钟。然后，混合物逐滴加入上述293T细胞的培养物中，轻柔混合，在37℃、10％CO2的条件下培育3小时。然后，将含有1％BSA和10μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的1ml DMEM加入各个加样孔的培养物中，并在37℃、10％CO2的条件下培育16-24小时。随后，各个加样孔中的培养基用含有1％牛血清清蛋白和5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的2ml DMEM替换，且该培养物继续培育24小时。此外，各个加样孔中的培养基用含有1％牛血清清蛋白、5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)和衍生自革兰氏阳性菌(例如放线菌)的0.01U的NA的2ml DMEM替换，该培养物继续培育24小时。然后，回收培养上清，并通过孔径为0.45μm的过滤器过滤以获得载体溶液。
通过本发明方法产生的载体可使用通常已知的病毒纯化方法纯化。纯化可通过公众已知的纯化和分离方法进行，例如上述离心、过滤、吸附、和柱纯化，或它们的组合。由此可获得基本上纯化的含有与唾液酸结合的膜蛋白的病毒载体。本文中，基本上纯化的病毒载体是指，该病毒载体基本上不含能将核酸导入细胞的其它病毒载体。基本上纯化的病毒载体优选不含产病毒的细胞的任何碎片或其它污染物。
通过本发明方法产生的病毒载体可通过适当地将其与药物可接受的载体组合作为组合物提供。本文中，短语“药物可接受的载体”是指能与载体一起给予、并且不显著抑制载体-介导的基因导入的物质。具体地，例如，可使用无菌水、盐水、培养基、血清或磷酸缓冲盐水(PBS)与载体混合用于产生药物。此外，也可任选地包括其它物质，例如稳定剂或抗生素。本发明的组合物可以以水溶液、胶囊、悬浮液、糖浆等形式存在。含有通过本发明方法产生的病毒载体的这种组合物可以用作试剂(regent)或药物。例如，该组合物可用做用于体内或体外基因导入各种细胞的试剂，或用于回体或体内基因治疗的药物。通常，组合物通过本领域技术人员通常已知的方法给予患者：例如动脉注射、静脉注射、腹膜内注射、皮下注射、肠道给予、口服、鼻部给药、或回体给予。具体地，通过鼻或支气管粘膜给药，以及回体给药进入血细胞和造血细胞是适当的。载体给予的量可根据疾病、患者的体重、年龄、性别、症状、给药的目的、给药组合物的配方、给药方法以及被导入的基因而变化，但本领域熟练的技术人员应能适当地确定。
通过本发明方法产生的病毒载体可应用于各种遗传疾病的基因疗法。目标疾病不限于任何具体的一种。潜在的目标疾病及其单一责任基因的例子包括Gaucher氏病、β-脑苷酶(染色体20)；血友病，凝结因子VIII(染色体X)和凝结因子IX(染色体X)；腺苷酸脱氨酶缺乏症，腺苷酸脱氨酶；苯丙酮尿症，苯丙氨酸羟化酶(染色体12)；Duchenne型肌肉萎缩症，肌营养不良蛋白(染色体X)；家族性高胆固醇血症，LDL受体(染色体19)；和囊性纤维化，CFTR基因。这种基因可使用本发明的病毒载体整合进入染色体。此外，牵涉多基因的潜在的目标疾病包括神经变性疾病，例如Alzheimer氏病和Parkinson氏病，缺血性脑病，痴呆，和难控制的传染性疾病例如获得性免疫缺陷综合症(AIDS)。通过如下步骤进行基因治疗是可能的，从AIDS患者的体内取出造血干细胞，体外引入通过本发明方法产生的基于SIV的载体，在HIV感染发生前加强衍生自SIV的基因组的转录，将细胞放回患者体内，并因此除去HIV的转录因子。此外，在治疗慢性病的应用中，该载体可用于在缺血性心脏病中抑制VEGF和FGF-2基因的表达，或抑制与例如生长因子(例如PDGF和TGF-β)、依赖于细胞周期蛋白的激酶、或用于动脉硬化的基因疗法等的基因有关的细胞增殖。在糖尿病中，BDNF基因可以是候选基因。另外，该方法能应用于，例如互补疗法，其中编码肿瘤抑制基因的基因(其突变引起癌)，例如p53基因，被整合进入染色体，或超出癌症药物疗法的限制，通过体外引导多个药物抗性基因进入骨髓造血干细胞，并放回患者血液进行治疗。对于自身免疫疾病，例如多发性硬化、类风湿性关节炎、SLE、和肾小球肾炎的基因治疗，可通过反义表达抑制T细胞受体、各种粘附分子(例如ICAM-1、LFA-1、VCAM-1和LFA-4)、细胞因子和细胞因子受体(例如TNF、IL-8、IL-6和IL-1)、生长因子(例如PDGF和TGF-β)、效应分子(例如MMP)的表达。对于过敏性疾病的基因治疗，可通过反义表达抑制IL-4、FcεR-I等的表达。对于涉及组织移植的基因治疗，可通过人源化非-人动物供体的组织相容性抗原提高异种移植术的成功率。此外，可通过引导外源基因进入人ES细胞的染色体，治疗性的援助循环酶、生长因子等的缺乏，并因此补充否则在胚胎中缺乏的那些基因。
例如，白细胞介素-4(IL-4)促进辅助性T淋巴细胞分化为Th2淋巴细胞。Th2淋巴细胞反过来分泌调节与哮喘有关的炎症的IL-4、IL-5、IL-9、和IL-13、细胞因子。IL-4是涉及呼吸障碍的一种分子，它诱导肺粘膜的粘膜分泌。IL-4介导VCAM-1的表达，它是与存在于嗜酸性粒细胞表面的VLA4分子相互作用的细胞粘附分子。通过这种相互作用，嗜酸性粒细胞可从血流中迁移到肺部组织的炎症位点。IL-4诱导B细胞的增强和引发变态反应所需的抗原特异性IgE的产生。抗原特异性IgE诱导炎性介质例如组胺和白细胞三烯从肥大细胞释放，这导致支气管收缩。由于IL-4的这些作用，表达可溶性IL-4受体的载体可用于针对哮喘患者的治疗。
附图说明
图1包括一对照片，显示使用衍生自绿色小单孢菌(NA，右侧)并使用产生的病毒进行基因导入的结果。作为对照，简单地用另外的方法使用衍生自霍乱弧菌的NA产生病毒，用相同体积的产病毒的细胞的培养上清进行基因导入(vcNA，左侧)。
图2包括一组照片，显示使用不同数量的衍生自霍乱弧菌的NA产生的病毒的滴度。在相同条件下使用相同体积的产病毒的细胞的培养上清进行基因导入。各个系列上的数量表明增加的NA的量(单位)。
实施本发明的最佳方式
下文中通过参考实施例详细阐述了本发明，但不能认为仅限于此。这里引用的参考文献作为本文的一个部分结合在本文的描述中。
[实施例1]使用衍生自革兰氏阳性菌的NA制备具有流感病毒包膜的假型SIV载体。
细胞培养
293T细胞(人胚肾衍生细胞系)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：8392-8396(1993))在37℃、10％CO2的条件下，在添加了10％已灭活的小牛血清(BIOWHITTAKER)并具有丰富葡萄糖(Gibco BRL)的DMEM中培养。
载体构建
293T细胞以5×105细胞/孔的密度接种于6-孔塑料培养平板中，并在37℃、10％CO2的条件下培养48小时。培养基用每孔中含有1％牛血清清蛋白的800μl DMEM代替，对细胞进行导入。对于各个培养孔，1200ng基因导入载体pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTRΔU3、360ng包装载体pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev、和240ngHA蛋白表达质粒pCAGGS-HA溶于100μl Opti MEM(Gibco BRL)中，然后加入6μl PLUS试剂(Gibco BRL)，混合，并在室温培育15分钟(WO01/92508)。然后，将以100μl Opti MEM稀释的4μl LIPOFECTAMINE(Gibco BRL)加入溶液中，彻底混合，并在室温进一步培育15分钟。混合物逐滴加入上述293T细胞的培养物中，轻微混合，培养物在37℃、10％CO2的气体条件下培育3小时。然后，含有1％牛血清清蛋白和10μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的1ml DMEM加入各个加样孔中，培养物在37℃、10％CO2的条件下继续培养16-24小时。然后，各个加样孔的培养基用2ml含有1％牛血清清蛋白、5μg/ml胰蛋白酶(GibcoBRL)、和0.01U从绿色小单孢菌纯化的唾液酸苷酶的DMEM代替。培养24小时后，收集培养上清，并通过0.45μm孔径的过滤器过滤备用。作为对照，使用0.05单位的从霍乱弧菌(Roche)纯化的唾液酸苷酶通过类似的方法产生载体。
用SIVagm载体介导的基因导入
293T细胞、靶细胞以1×106细胞/孔的密度接种于6-孔塑料培养平板中，并在37℃、10％CO2的条件下培养48小时。从培养物中除去培养基，添加了8μg/ml(终浓度)聚凝胺(Sigma)的1ml载体溶液覆盖在培养物上，并在37℃、10％CO2的条件下培育3小时用于载体感染。然后，将添加了20％已灭活的胎牛血清(BIO WHITTAKER)的1ml培养基加入培养物中，在37℃、10％CO2的条件下继续培养48-72小时。
载体的滴定
通过计算用1ml载体溶液成功获得基因导入的细胞数量测定载体的滴度。如上所述，用1ml载体溶液感染细胞，并且，72小时后，在放大200倍的倒置荧光显微镜(DMIRB(SLR)；Leica)上检验。计算各个视野中基因导入细胞(GFP阳性细胞)的数量，并得到三个视野的平均数。该平均数乘以854.865，这是一个从视野与平板的面积获得系数，以计算滴度。滴度的单位以导入单位(TU)/ml表示。结果显示当用衍生自霍乱弧菌的NA(VcNA)获得的滴度为2.8×104(TU/ml)时，用衍生自绿色小单孢菌的NA(MvNA)获得的滴度是1.1×105，后者明显高于用VcNA获得的滴度(图1)。
[实施例2]增加的衍生自霍乱弧菌的NA的剂量对HA假型SIV载体的产生的影响
如上所述，通过加入变化量的衍生自霍乱弧菌的NA，进行HA假型SIV载体的产生，并检测影响。结果显示用以0.01到0.1U(0.005到0.05U/ml)加入的NA获得的病毒滴度没有明显区别。因此，结果证明使用衍生自霍乱弧菌的NA产生的载体的滴度低是由于使用的NA的数量少的可能性是站不住脚的。
工业适用性
本发明提供了使用衍生自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶产生包含与包膜中的唾液酸结合的膜蛋白的病毒载体的新方法。衍生自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶不仅能低价购买到，还能以低剂量产生具有高滴度的病毒。因此，本发明的方法在大规模的病毒工业产生中将获得极好的性能价格比。产生的载体适合于临床应用，包括基因治疗。
序列表
<110>株式会社载体研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)
<120>使用衍生自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶产生包含与唾液酸结合的膜蛋白作为包膜成分的病毒载体的方法
<130>D3-A0204P
<150>JP 2002-258576
<151>2002-09-04
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1941
<212>DNA
<213>Micromonospora viridifaciens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1941)
<223>
<400>1
atg act gcg aat ccg tac ctc cgc cgc ctg ccc cgg cgc cga gcc gtc    48
Met Thr Ala Asn Pro Tyr Leu Arg Arg Leu Pro Arg Arg Arg Ala Val
1               5                   10                  15
agc ttc ctg ctc gca cca gcg ctg gcg gcc gcc acg gtc gcc ggc gcg    96
Ser Phe Leu Leu Ala Pro Ala Leu Ala Ala Ala Thr Val Ala Gly Ala
            20                  25                  30
tcc ccc gca cag gcc atc gcc ggg gca ccc gtc ccg ccc ggc ggc gag    144
Ser Pro Ala Gln Ala Ile Ala Gly Ala Pro Val Pro Pro Gly Gly Glu
        35                  40                  45
ccg ctc tac acg gag cag gac ctc gcc gtg aac ggc agg gag ggc ttt    192
Pro Leu Tyr Thr Glu Gln Asp Leu Ala Val Asn Gly Arg Glu Gly Phe
    50                  55                  60
ccg aac tac cgc atc cca gcg ctg acc gtc acg ccc gac ggg gac ctg    240
Pro Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Thr Val Thr Pro Asp Gly Asp Leu
65                  70                  75                  80
ctg gcc tcg tac gac ggc cgc ccg acc ggt atc gac gcg ccc ggc ccc    288
ctg gcc tcg tac gac ggc cgc ccg acc ggt atc gac gcg ccc ggc ccc    288
Leu Ala Ser Tyr Asp Gly Arg Pro Thr Gly Ile Asp Ala Pro Gly Pro
                85                  90                  95
aac tcc atc ctc caa cgc cgc agc acc gac ggc ggc cgg acg tgg ggc    336
Asn Ser Ile Leu Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Arg Thr Trp Gly
            100                 105                 110
gag caa cag gtc gtc agc gcc ggc cag acc acc gcg ccg atc aag ggg    384
Glu Gln Gln Val Val Ser Ala Gly Gln Thr Thr Ala Pro Ile Lys Gly
        115                 120                 125
ttc tcc gac ccc agc tac ctt gtc gac cgg gaa acc ggg acc atc ttc    432
Phe Ser Asp Pro Ser Tyr Leu Val Asp Arg Glu Thr Gly Thr Ile Phe
    130                 135                 140
aac ttc cac gtc tac tcc cag cgg cag ggc ttc gcc ggc agc cgg ccc    480
Asn Phe His Val Tyr Ser Gln Arg Gln Gly Phe Ala Gly Ser Arg Pro
145                 150                 155                 160
ggc acc gac ccg gca gac ccc aac gtg ctc cac gcc aac gtc gcg acc    528
Gly Thr Asp Pro Ala Asp Pro Asn Val Leu His Ala Asn Val Ala Thr
                165                 170                 175
tcg acc gac ggc ggt ctg acc tgg tcg cac cgg acc atc acg gcc gac    576
Ser Thr Asp Gly Gly Leu Thr Trp Ser His Arg Thr Ile Thr Ala Asp
            180                 185                 190
atc acc ccg gat ccg ggc tgg cgc agc cgc ttc gcc gcc tcc ggc gaa    624
Ile Thr Pro Asp Pro Gly Trp Arg Ser Arg Phe Ala Ala Ser Gly Glu
        195                 200                 205
ggc atc cag ctc cgc tat gga ccc cac gcc ggt cga ctc atc cag cag    672
Gly Ile Gln Leu Arg Tyr Gly Pro His Ala Gly Arg Leu Ile Gln Gln
    210                 215                 220
tac acg atc atc aac gct gcc ggc gcc ttc cag gcg gtg agc gtg tac    720
Tyr Thr Ile Ile Asn Ala Ala Gly Ala Phe Gln Ala Val Ser Val Tyr
225                 230                 235                 240
agc gac gac cac gga agg acc tgg cgc gcc ggc gaa gcc gtc ggg gtc    768
Ser Asp Asp His Gly Arg Thr Trp Arg Ala Gly Glu Ala Val Gly Val
                245                 250                 255
ggc atg gac gag aac aag acc gtg gaa ctc tcc gat ggc cgg gtc ctg    816
Gly Met Asp Glu Asn Lys Thr Val Glu Leu Ser Asp Gly Arg Val Leu
            260                 265                 270
ctc aac agc cgc gac tcg gcc cgc agc gga tac cgt aag gtg gcc gtc    864
Leu Asn Ser Arg Asp Ser Ala Arg Ser Gly Tyr Arg Lys Val Ala Val
        275                 280                 285
tcc act gac ggc ggc cac agc tac ggc ccg gtg acc atc gac cgc gac    912
Ser Thr Asp Gly Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Thr Ile Asp Arg Asp
    290                 295                 300
ctc ccc gac ccg acg aac aac gca tcg atc atc cgg gcc ttc cct gac    960
Leu Pro Asp Pro Thr Asn Asn Ala Ser Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asp
305                 310                 315                 320
gcc ccg gcc ggc tcc gcg cgg gcc aag gtc ctg ctc ttc tcc aac gcc    1008
Ala Pro Ala Gly Ser Ala Arg Ala Lys Val Leu Leu Phe Ser Asn Ala
                325                 330                 335
gcc agc cag acc tcg cgc agt cag ggc acc atc cgg atg tcc tgc gac    1056
Ala Ser Gln Thr Ser Arg Ser Gln Gly Thr Ile Arg Met Ser Cys Asp
            340                 345                 350
gat ggc cag acc tgg ccg gtt tcg aag gtc ttc cag ccc ggc tcg atg    1104
Asp Gly Gln Thr Trp Pro Val Ser Lys Val Phe Gln Pro Gly Ser Met
        355                 360                 365
tcg tac tcc acc ctg acc gca ctg ccc gac ggc acc tac ggg ctg ctg    1152
Ser Tyr Ser Thr Leu Thr Ala Leu Pro Asp Gly Thr Tyr Gly Leu Leu
    370                 375                 380
tac gag ccg ggc acc ggc atc aga tac gcc aac ttc aac ctc gcc tgg    1200
Tyr Glu Pro Gly Thr Gly Ile Arg Tyr Ala Asn Phe Asn Leu Ala Trp
385                 390                 395                 400
ctg ggc ggc atc tgc gcg ccc ttc acg att ccg gat gtg gcg ctc gag    1248
Leu Gly Gly Ile Cys Ala Pro Phe Thr Ile Pro Asp Val Ala Leu Glu
                405                 410                 415
ccg ggc cag cag gtc act gtt ccg gtg gcc gtc acg aac cag tcc ggt    1296
Pro Gly Gln Gln Val Thr Val Pro Val Ala Val Thr Asn Gln Ser Gly
            420                 425                 430
atc gcg gta ccg aag ccg agc ctt cag ctc gac gca tcg ccg gac tgg    1344
Ile Ala Val Pro Lys Pro Ser Leu Gln Leu Asp Ala Ser Pro Asp Trp
        435                 440                 445
cag gtt cag ggt tcc gtc gag ccc ctc atg ccc gga cgg cag gcc aag    1392
Gln Val Gln Gly Ser Val Glu Pro Leu Met Pro Gly Arg Gln Ala Lys
    450                 455                 460
ggc cag gtg acc atc acg gtt ccc gcc ggc acc acc ccc ggt cgc tac    1440
Gly Gln Val Thr Ile Thr Val Pro Ala Gly Thr Thr Pro Gly Arg Tyr
465                 470                 475                 480
cgg gtc ggt gcg acg ctg cgc acc tcc gcg ggt aac gcg tcg acg acc    1488
Arg Val Gly Ala Thr Leu Arg Thr Ser Ala Gly Asn Ala Ser Thr Thr
                485                 490                 495
ttc acg gtc acg gtt gga ctg ctc gac cag gcc cgg atg agc atc gcg    1536
Phe Thr Val Thr Val Gly Leu Leu Asp Gln Ala Arg Met Ser Ile Ala
            500                 505                 510
gac gtc gac agc gag gag acc gcc cgc gaa gac ggg cgg gcg agc aac    1584
Asp Val Asp Ser Glu Glu Thr Ala Arg Glu Asp Gly Arg Ala Ser Asn
        515                 520                 525
gtg atc gac ggc aac ccc tcg acg ttc tgg cac acc gaa tgg tcg cgt    1632
Val Ile Asp Gly Asn Pro Ser Thr Phe Trp His Thr Glu Trp Ser Arg
    530                 535                 540
gcc gat gct cct ggc tac ccg cac cgc atc agc ctc gac ctc ggt ggc    1680
Ala Asp Ala Pro Gly Tyr Pro His Arg Ile Ser Leu Asp Leu Gly Gly
545                 550                 555                 560
acg cac acg atc agc ggc ctc cag tac acc cga cgg cag aac agc gcc    1728
Thr His Thr Ile Ser Gly Leu Gln Tyr Thr Arg Arg Gln Asn Ser Ala
                565                 570                 575
aac gag cag gtc gcg gac tac gag atc tac acc agc ctg aac ggc acg    1776
Asn Glu Gln Val Ala Asp Tyr Glu Ile Tyr Thr Ser Leu Asn Gly Thr
            580                 585                 590
acc tgg gat ggc ccg gtt gcc agc ggg cgc ttc acc acg tcc ctc gcg    1824
Thr Trp Asp Gly Pro Val Ala Ser Gly Arg Phe Thr Thr Ser Leu Ala
        595                 600                 605
ccg cag cgc gcg gtc ttc ccg gcg cgg gac gcc agg tac atc cgg ttg    1872
Pro Gln Arg Ala Val Phe Pro Ala Arg Asp Ala Arg Tyr Ile Arg Leu
    610                 615                 620
gtg gcc ctc agc gag cag acc ggg cac aag tac gcc gcg gtc gct gag    1920
Val Ala Leu Ser Glu Gln Thr Gly His Lys Tyr Ala Ala Val Ala Glu
625                 630                 635                 640
ctg gag gtg gaa ggc cag cgc                                        1941
Leu Glu Val Glu Gly Gln Arg
                645
<210>2
<211>647
<212>PRT
<213>绿色小单孢菌(Micromonospora viridifaciens)
<400>2
Met Thr Ala Asn Pro Tyr Leu Arg Arg Leu Pro Arg Arg Arg Ala Val
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Leu Ala Pro Ala Leu Ala Ala Ala Thr Val Ala Gly Ala
            20                  25                  30
Ser Pro Ala Gln Ala Ile Ala Gly Ala Pro Val Pro Pro Gly Gly Glu
        35                  40                  45
Pro Leu Tyr Thr Glu Gln Asp Leu Ala Val Asn Gly Arg Glu Gly Phe
    50                  55                  60
Pro Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Thr Val Thr Pro Asp Gly Asp Leu
65                  70                  75                  80
Leu Ala Ser Tyr Asp Gly Arg Pro Thr Gly Ile Asp Ala Pro Gly Pro
                85                  90                  95
Asn Ser Ile Leu Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Arg Thr Trp Gly
            100                 105                 110
Glu Gln Gln Val Val Ser Ala Gly Gln Thr Thr Ala Pro Ile Lys Gly
        115                 120                 125
Phe Ser Asp Pro Ser Tyr Leu Val Asp Arg Glu Thr Gly Thr Ile Phe
    130                 135                 140
Asn Phe His Val Tyr Ser Gln Arg Gln Gly Phe Ala Gly Ser Arg Pro
145                 150                 155                 160
Gly Thr Asp Pro Ala Asp Pro Asn Val Leu His Ala Asn Val Ala Thr
                165                 170                 175
Ser Thr Asp Gly Gly Leu Thr Trp Ser His Arg Thr Ile Thr Ala Asp
            180                 185                 190
Ile Thr Pro Asp Pro Gly Trp Arg Ser Arg Phe Ala Ala Ser Gly Glu
        195                 200                 205
Gly Ile Gln Leu Arg Tyr Gly Pro His Ala Gly Arg Leu Ile Gln Gln
    210                 215                 220
Tyr Thr Ile Ile Asn Ala Ala Gly Ala Phe Gln Ala Val Ser Val Tyr
225                 230                 235                 240
Ser Asp Asp His Gly Arg Thr Trp Arg Ala Gly Glu Ala Val Gly Val
                245                 250                 255
Gly Met Asp Glu Asn Lys Thr Val Glu Leu Ser Asp Gly Arg Val Leu
            260                 265                 270
Leu Asn Ser Arg Asp Ser Ala Arg Ser Gly Tyr Arg Lys Val Ala Val
        275                 280                 285
Ser Thr Asp Gly Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Thr Ile Asp Arg Asp
    290                 295                 300
Leu Pro Asp Pro Thr Asn Asn Ala Ser Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asp
305                 310                 315                 320
Ala Pro Ala Gly Ser Ala Arg Ala Lys Val Leu Leu Phe Ser Asn Ala
                325                 330                 335
Ala Ser Gln Thr Ser Arg Ser Gln Gly Thr Ile Arg Met Ser Cys Asp
            340                 345                 350
Asp Gly Gln Thr Trp Pro Val Ser Lys Val Phe Gln Pro Gly Ser Met
        355                 360                 365
Ser Tyr Ser Thr Leu Thr Ala Leu Pro Asp Gly Thr Tyr Gly Leu Leu
    370                 375                 380
Tyr Glu Pro Gly Thr Gly Ile Arg Tyr Ala Asn Phe Asn Leu Ala Trp
385                 390                 395                 400
Leu Gly Gly Ile Cys Ala Pro Phe Thr Ile Pro Asp Val Ala Leu Glu
                405                 410                 415
Pro Gly Gln Gln Val Thr Val Pro Val Ala Val Thr Asn Gln Ser Gly
            420                 425                 430
Ile Ala Val Pro Lys Pro Ser Leu Gln Leu Asp Ala Ser Pro Asp Trp
        435                 440                 445
Gln Val Gln Gly Ser Val Glu Pro Leu Met Pro Gly Arg Gln Ala Lys
    450                 455                 460
Gly Gln Val Thr Ile Thr Val Pro Ala Gly Thr Thr Pro Gly Arg Tyr
465                 470                 475                 480
Arg Val Gly Ala Thr Leu Arg Thr Ser Ala Gly Asn Ala Ser Thr Thr
                485                 490                 495
Phe Thr Val Thr Val Gly Leu Leu Asp Gln Ala Arg Met Ser Ile Ala
            500                 505                 510
Asp Val Asp Ser Glu Glu Thr Ala Arg Glu Asp Gly Arg Ala Ser Asn
        515                 520                 525
Val Ile Asp Gly Asn Pro Ser Thr Phe Trp His Thr Glu Trp Ser Arg
    530                 535                 540
Ala Asp Ala Pro Gly Tyr Pro His Arg Ile Ser Leu Asp Leu Gly Gly
545                 550                 555                 560
Thr His Thr Ile Ser Gly Leu Gln Tyr Thr Arg Arg Gln Asn Ser Ala
                565                 570                 575
Asn Glu Gln Val Ala Asp Tyr Glu Ile Tyr Thr Ser Leu Asn Gly Thr
            580                 585                 590
Thr Trp Asp Gly Pro Val Ala Ser Gly Arg Phe Thr Thr Ser Leu Ala
        595                 600                 605
Pro Gln Arg Ala Val Phe Pro Ala Arg Asp Ala Arg Tyr Ile Arg Leu
    610                 615                 620
Val Ala Leu Ser Glu Gln Thr Gly His Lys Tyr Ala Ala Val Ala Glu
625                 630                 635                 640
Leu Glu Val Glu Gly Gln Arg
                645

Claims (10)

1.一种产生含有与唾液酸结合的膜蛋白的病毒载体的方法，所述方法包括在衍生自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶存在的情况下，培养能产生病毒载体的细胞，并回收产生的病毒的步骤。
2.权利要求1所述的方法，其中所述革兰氏阳性菌是放线菌。
3.权利要求2所述的方法，其中所述放线菌属于小单孢菌科。
4.权利要求3所述的方法，其中所述属于小单孢菌科的放线菌是绿色小单孢菌。
5.根据权利要求1-4中任何一项所述的方法，其中所述病毒载体是反转录病毒载体。
6.权利要求5所述的方法，其中所述反转录病毒载体是慢病毒载体。
7.根据权利要求1-6中任何一项所述的方法，其中所述与唾液酸结合的膜蛋白是单链负链RNA病毒的包膜蛋白。
8.权利要求7所述的方法，其中所述单链负链RNA病毒是属于副粘病毒科或正粘病毒科的病毒。
9.根据权利要求1-6中任何一项所述的方法，其中所述与唾液酸结合的膜蛋白是流感病毒HA蛋白。
10.一种使用根据权利要求1-9中任何一项所述的方法产生的病毒。
CNA038249200A 2002-09-04 2003-09-04 使用衍生自革兰氏阳性菌的唾液酸苷酶产生包含与唾液酸结合的膜蛋白作为包膜成分的病毒载体的方法 Pending CN1694956A (zh)

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