CN117653723A - 一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法及其应用 - Google Patents

一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法及其应用，包括以下步骤收集蛋白质原液；蛋白质原液经免疫亲和层析，洗脱杂质；免疫亲和层析后的溶液经阴离子交换层析，去除毒素；阴离子交换层析后的溶液经分子筛，得纳米颗粒抗原。本发明的技术方案能够通过免疫亲和层析、阴离子交换层析和分子筛等技术步骤，可以高效地去除杂质和微量污染物，从而获得高纯度的重组犬瘟热病毒疫苗蛋白；纯化过程中的甘油和缓冲液的选择可以提高蛋白质的稳定性，并保持其抗原功能的完整性，确保疫苗的有效性和免疫效果，从而满足兽用疫苗的标准要求。

Description

一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法及其应用。
背景技术
犬瘟热病毒属单链负链RNA病毒，其基因组容易发生变异，并且缺乏内切修复机制，因此犬瘟热病毒的遗传变异速度相对较快。目前，犬瘟热疫苗的生产通常依托于犬瘟热病毒在细胞的复制和增殖，分为减毒疫苗和灭活疫苗。但犬瘟热病毒的变异可能产生免疫逃逸突变体，使得原来的疫苗效力降低。相对来说，以保守的抗原肽作为疫苗成分的表位疫苗在对抗易变异的犬瘟热病毒方面具有一定的优势。
表位疫苗不需要真核细胞中复杂的修饰和调控，属于较为简单的基因表达。因此，在犬瘟热疫苗的制造过程中，选择高通量、低成本的原核表达系统具有优势。2022年，BoWang等研究人员在大肠杆菌中表达了基于犬瘟热病毒血凝素的表位纳米颗粒，这些纳米颗粒能够有效诱导抗犬瘟热病毒的中和抗体和细胞免疫(Wang B,Li S,Qiao Y,et al.Self-assembling ferritin nanoparticles coupled with linear sequences from caninedistemper virus haemagglutinin protein elicit robust immune responses.JNanobiotechnology.2022；20(1):32.)。为了确保疫苗的质量和效果，并为临床试验做准备，需要研究表位纳米颗粒的纯化方法，以去除杂蛋白、核酸和内毒素等杂质。
当前大肠杆菌表达的重组犬瘟热表位疫苗在纯化上的技术难点主要包括以下几点：
1.多种杂质的存在：在纯化过程中可能存在多种非目标蛋白、DNA、RNA、细胞碎片、内毒素等杂质物质。这些杂质会干扰纯化过程并降低目标蛋白质的纯度。
2.蛋白稳定性和活性的损失：重组犬瘟热表位纳米颗粒在纯化过程中容易失去其正常折叠和功能活性。这可能是由于蛋白在裂解和纯化过程中的物理和化学环境的改变引起的。
综上所述，如何设计一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法，在保持高纯度的同时保持蛋白质的抗原功能完整性，是目前本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明实施例的主要目的在于提出一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法及其应用，旨在设计一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法，在保持高纯度的同时保持蛋白质的抗原功能完整性。
本发明解决上述技术问题的技术方案是，提供一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法，包括以下步骤：
收集蛋白质原液；
蛋白质原液经免疫亲和层析，洗脱杂质；
免疫亲和层析后的溶液经阴离子交换层析，去除毒素；
阴离子交换层析后的溶液经分子筛，得纳米颗粒抗原。
进一步地，所述收集蛋白质原液的步骤包括：
收集发酵的菌体；
将收集的菌体进行离心，将菌体与平衡液1混匀后进行声波破碎或机械破碎；收集菌体破碎后的上清液；
将上清液离心处理，离心后的上清液使用0.22μm滤器过滤，收集蛋白质原液。
进一步地，所述蛋白质原液经免疫亲和层析，洗脱杂质的步骤包括：
将蛋白质原液加入预处理好的已吸附目标蛋白特异性抗体的吸附柱中，使目标蛋白被吸附在柱子上；
用平衡液1洗涤柱子；
将洗脱液1升温至60℃洗涤柱子，收集洗脱液。
进一步地，所述平衡液1包括0.02M PB缓冲液，5％～20％甘油，平衡液1的pH值为7.5～8.5；
所述洗脱液1包括0.2M PB缓冲液、5％～20％甘油、0.5～1M NaCl、0.1％～1％Triton X-100或吐温-20，洗脱液1的pH为7.5～8.5，洗脱液1的温度为20～60℃。
进一步地，所述免疫亲和层析后的溶液经阴离子交换层析，去除毒素的步骤包括：
将免疫亲和层析后的溶液进行离心，将上清液透析至平衡液2中，使用0.22μm滤器过滤；
将上清液加入预处理好的阴离子交换层析柱中，使目标蛋白被吸附在柱子上；
用平衡液2洗涤柱子；
使用洗脱液2进行梯度洗脱，收集洗脱液。
进一步地，平衡液2包括0.02M PB缓冲液，平衡液2的pH值为7.5～8.5；
洗脱液2包括0.02M PB缓冲液，0.5～1M NaCl，洗脱液2的pH值为7.5～8.5。
进一步地，所述阴离子交换层析后的溶液经分子筛，得纳米颗粒抗原的步骤包括：
将阴离子交换层析后的溶液进行离心，将上清液使用截留100kDa的超滤膜包和/或超滤管和/或透析袋进行浓缩，并使用0.22μm滤器过滤；
将过滤后的上清液加入预处理好的分子筛柱中洗脱，收集第一个洗脱峰即为纳米颗粒抗原。
进一步地，所述阴离子交换层析后的溶液经分子筛，得纳米颗粒抗原的步骤之后还包括：
抗原为在大肠杆菌中可溶性表达的犬瘟热血凝素表位肽与幽门螺旋杆菌Ferritin的融合蛋白，形成纳米颗粒。
为了解决上述技术问题，本发明还提出了将重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法纯化的抗原在生产及疫苗制备中的应用。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、本发明提供了一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化工艺，通过免疫亲和层析、阴离子交换层析和分子筛等技术步骤，可以高效地去除杂质和微量污染物，从而获得高纯度的重组犬瘟热病毒疫苗蛋白；纯化过程中的甘油和缓冲液的选择可以提高蛋白质的稳定性，并保持其抗原功能的完整性，确保疫苗的有效性和免疫效果，从而满足兽用疫苗的标准要求。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明提供了一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化工艺，采用免疫亲和层析、离子交换层析和分子筛等技术相结合的纯化工艺，能够高效地分离纳米颗粒抗原，并在一定程度上降低纯化过程的时间和成本；通过使用不同的纯化技术和特定的纯化介质，可以对纯化过程进行精确的控制，并根据具体要求进行优化和调整，以满足不同的纯化需求，具备较高的可操作性和可调节性，适用于不同规模和类型的生产工艺。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：
本发明提供了一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化工艺，该工艺能降低纯化过程的时间和成本，提高蛋白的纯度和稳定性，并保持其抗原功能的完整性，从而确保疫苗的有效性和免疫效果，满足兽用疫苗的标准要求。该工艺技术方案的转化预计将为犬瘟热领域的生物医药企业带来显著的收益和商业价值，同时也为犬瘟热疾病的预防和治疗提供了更好的工具和选择。
(2)本发明的技术方案是否解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
本发明提供了一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化工艺，经该工艺可获得高纯度、稳定、具有完整抗原功能的纳米颗粒，符合兽用疫苗的标准。
(3)本发明的技术方案是否克服了技术偏见：
本发明利用免疫亲和层析、阴离子交换层析和分子筛等多种技术步骤，有效去除原核表达目标蛋白中的杂质和微量污染物，克服了原核表达蛋白纯化过程中的难度大和安全性差的技术偏见。本发明的多技术步骤组合是一种创新的方法，能够解决原核表达蛋白纯化过程中的技术难题，并达到高纯度和高质量的纯化效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明所述重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法的流程示意图；
图2为本发明所述收集蛋白质原液的流程示意图；
图3为本发明所述蛋白质原液经免疫亲和层析，洗脱杂质的流程示意图；
图4为本发明所述免疫亲和层析后的溶液经阴离子交换层析，去除毒素的流程示意图；
图5为本发明所述阴离子交换层析后的溶液经分子筛，得纳米颗粒抗原的流程示意图；
图6为本发明所述纯化后获得的抗原的电镜图。
具体实施方式
下面将结合本发明说明书附图中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“若干”、“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“连接”、“固定”等应做广义理解，例如，“固定”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
另外，本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
本发明提出一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法及其应用，旨在设计一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法，在保持高纯度的同时保持蛋白质的抗原功能完整性。
下面将在具体实施例中对本发明提出的重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法进行说明：
在本实施例的技术方案中，如图1所示，一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法，包括以下步骤：
S10：收集蛋白质原液；
S20：蛋白质原液经免疫亲和层析，洗脱杂质；
S30：免疫亲和层析后的溶液经阴离子交换层析，去除毒素；
S40：阴离子交换层析后的溶液经分子筛，得纳米颗粒抗原。
可以理解地，通过免疫亲和层析、阴离子交换层析和分子筛等技术步骤，可以高效地去除杂质和微量污染物，从而获得高纯度的重组犬瘟热病毒疫苗蛋白；纯化过程中的甘油和缓冲液的选择可以提高蛋白质的稳定性，并保持其抗原功能的完整性，确保疫苗的有效性和免疫效果，从而满足兽用疫苗的标准要求。
进一步地，如图2所示，所述收集蛋白质原液的步骤包括：
S11：收集发酵的菌体；
S12：将收集的菌体进行离心，将菌体与平衡液1混匀后进行声波破碎或机械破碎；收集菌体破碎后的上清液；
可以理解地，收集的菌体离心的条件为：在4℃的条件下，转速为4000rpm离心时间为30min。平衡液1包括5％～20％甘油，pH值为7.5～8.5，优选地pH值为8；菌体与平衡液1按照1:10的比例混合；声波破碎的条件为：冰浴，工作5s，停5s。
S13：将上清液离心处理，离心后的上清液使用0.22μm滤器过滤，收集蛋白质原液。
可以理解地，离心的条件为：4℃，离心机的离心力为16000rpm；离心时间为30min；用于去除菌和大分子杂质。
进一步地，如图3所示，所述蛋白质原液经免疫亲和层析，洗脱杂质的步骤包括：
S21：将蛋白质原液加入预处理好的已吸附目标蛋白特异性抗体的吸附柱中，使目标蛋白被吸附在柱子上；
可以理解地，预处理好的已吸附目标蛋白特异性抗体的吸附柱为已吸附表位肽和/或Ferritin特异性抗体的层析树脂或免疫磁珠。
S22：用平衡液1洗涤柱子；
可以理解地，通过平衡液1进行洗涤，用于去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质；
S23：将洗脱液1升温至60℃洗涤柱子，收集洗脱液。
可以理解地，使用洗脱液1进行盐浓度的梯度洗脱，洗脱液1可以破坏抗原与抗体之间的结合，促使抗原洗脱。
进一步地，所述平衡液1包括0.02M PB缓冲液，5％～20％甘油，平衡液1的pH值为7.5～8.5；所述洗脱液1包括0.2M PB缓冲液、5％～20％甘油、0.5～1M NaCl、0.1％～1％Triton X-100或吐温-20，洗脱液1的pH为7.5～8.5，洗脱液1的温度为20～60℃。
进一步地，如图4所示，所述免疫亲和层析后的溶液经阴离子交换层析，去除毒素的步骤包括：
S31：将免疫亲和层析后的溶液进行离心，将上清液透析至平衡液2中，使用0.22μm滤器过滤；
可以理解地，离心条件为：4℃，离心力为16000rpm，离心时间为30min。
S32：将上清液加入预处理好的阴离子交换层析柱中，使目标蛋白被吸附在柱子上；
可以理解地，阴离子交换层析柱为免疫亲和层析柱和免疫磁珠。
S33：用平衡液2洗涤柱子；
可以理解地，通过平衡液2洗涤柱子，进而去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。
S34：使用洗脱液2进行梯度洗脱，收集洗脱液。
可以理解地，阴离子交换层析使用Quaternary ammonium或DEAE树脂，洗脱液2为磷酸缓冲液，目标蛋白在100～200mM NaCl时洗脱，其中150mM NaCl的洗脱浓度最佳。
进一步地，平衡液2包括0.02M PB缓冲液，平衡液2的pH值为7.5～8.5；
洗脱液2包括0.02M PB缓冲液，0.5-1M NaCl，洗脱液2的pH值为7.5～8.5。
进一步地，如图5所示，所述阴离子交换层析后的溶液经分子筛，得纳米颗粒抗原的步骤包括：
S41：将阴离子交换层析后的溶液进行离心，将上清液使用截留100kDa的超滤膜包和/或超滤管和/或透析袋进行浓缩，并使用0.22μm滤器过滤；
可以理解地，离心条件为：温度4℃，离心力为16000rpm，离心时间为30min；
优选地，将上清液使用100kDa的超滤管进行浓缩。
S42：将过滤后的上清液加入预处理好的分子筛柱中洗脱，收集第一个洗脱峰即为纳米颗粒抗原。
可以理解地，洗脱采用洗脱液3，洗脱液3包括磷酸缓冲液、0.5～1MNaCl，洗脱液3的pH值为7.5～8.5。
进一步地，所述阴离子交换层析后的溶液经分子筛，得纳米颗粒抗原的步骤之后还包括：
S50：抗原为在大肠杆菌中可溶性表达的犬瘟热血凝素表位肽与幽门螺旋杆菌Ferritin的融合蛋白，形成纳米颗粒。
为了解决上述技术问题，本发明还提出了将重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法纯化的抗原在生产及疫苗制备中的应用。
实施例1
一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法，
收集发酵的菌体，并在4℃，离心力为4000rpm，离心30min；将菌体与平衡液1按照1:10的比例混匀后进行超声破碎(冰浴，工作5s，停5s)以释放细胞内的蛋白质；
收集菌体破碎后的上清液(在离心条件为：4℃，离心力为16000rpm，离心时间为30min)，将上清液使用0.22μm滤器过滤，以去除大分子杂质；
免疫亲和层析(物料包括已吸附目标蛋白特异性抗体的吸附柱；平衡液为0.02MPB缓冲液，5％甘油，pH为8.0；洗脱液1为0.02M PB缓冲液，5％甘油，500mM NaCl，0.1％的TritonX-100，pH为4.5～5.0)：
将上清液加入预处理好的已吸附目标蛋白特异性抗体的吸附柱中，使目标蛋白被吸附在柱子上；
用平衡液1洗涤柱子，去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质；
将洗脱液1升温至60℃进行洗脱，可以破坏抗原与抗体之间的结合，促使抗原洗脱，并收集洗脱液；
阴离子交换层析(物料包括：DEAE柱、平衡液2为0.02M PB缓冲液，pH 8.0、洗脱液2为0.02M PB缓冲液，1M NaCl，pH 8.0)：
收集经免疫亲和层析纯化并透析后的蛋白溶液(在离心条件为：4℃，离心力16000rpm，离心时间30min)，将上清液透析至平衡液2中，使用0.22μm滤器过滤；
将上清液加入预处理好的阴离子交换层析柱中，使目标蛋白被吸附在柱子上；
用平衡液2洗涤柱子，去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质；
使用洗脱液2进行梯度洗脱，并收集洗脱液进行分析，其中150mM NaCl的洗脱浓度最佳；
分子筛：
收集经离子交换层析纯化并透析后的蛋白溶液(在4℃下，16000rpm离心30min)，将上清液使用100kDa的超滤管进行浓缩，之后使用0.22μm滤器过滤；
将浓缩后的上清液加入预处理好的分子筛柱中，收集第一个洗脱峰即为纳米颗粒抗原。
经过实施例1纯化的抗原进行电镜扫描(犬瘟热Yanaka菌株血凝素蛋白的表位(364～411aa)与幽门螺旋杆菌Ferritin融合表达的纳米颗粒抗原)，电镜结果如图6所示，结果表明使用本发明的纯化工艺获得的重组犬瘟热病毒抗原的纯度在95％以上，内毒素含量低于5EU/mL。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
收集蛋白质原液；
蛋白质原液经免疫亲和层析，洗脱杂质；
免疫亲和层析后的溶液经阴离子交换层析，去除毒素；
阴离子交换层析后的溶液经分子筛，得纳米颗粒抗原。
2.根据权利要求1所述的重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法，其特征在于，所述收集蛋白质原液的步骤包括：
收集发酵的菌体；
将收集的菌体进行离心，将菌体与平衡液1混匀后进行声波破碎或机械破碎；收集菌体破碎后的上清液；
将上清液离心处理，离心后的上清液使用0.22μm滤器过滤，收集蛋白质原液。
3.根据权利要求2所述的重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法，其特征在于，所述蛋白质原液经免疫亲和层析，洗脱杂质的步骤包括：
将蛋白质原液加入预处理好的已吸附目标蛋白特异性抗体的吸附柱中，使目标蛋白被吸附在柱子上；
用平衡液1洗涤柱子；
将洗脱液1升温至60℃洗涤柱子，收集洗脱液。
4.根据权利要求3所述的重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法，其特征在于，所述平衡液1包括0.02M PB缓冲液，5％～20％甘油，平衡液1的pH值为7.5～8.5；
所述洗脱液1包括0.2M PB缓冲液、5％～20％甘油、0.5～1M NaCl、0.1％～1％TritonX-100或吐温-20，洗脱液1的pH为7.5～8.5，洗脱液1的温度为20～60℃。
5.根据权利要求1所述的重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法，其特征在于，所述免疫亲和层析后的溶液经阴离子交换层析，去除毒素的步骤包括：
将免疫亲和层析后的溶液进行离心，将上清液透析至平衡液2中，使用0.22μm滤器过滤；
将上清液加入预处理好的阴离子交换层析柱中，使目标蛋白被吸附在柱子上；
用平衡液2洗涤柱子；
使用洗脱液2进行梯度洗脱，收集洗脱液。
6.根据权利要求5所述的重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法，其特征在于，平衡液2包括0.02M PB缓冲液，平衡液2的pH值为7.5～8.5；
洗脱液2包括0.02M PB缓冲液，0.5～1M NaCl，洗脱液2的pH值为7.5～8.5。
7.根据权利要求1所述的重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换层析后的溶液经分子筛，得纳米颗粒抗原的步骤包括：
将阴离子交换层析后的溶液进行离心，将上清液使用截留100kDa的超滤膜包和/或超滤管和/或透析袋进行浓缩，并使用0.22μm滤器过滤；
将过滤后的上清液加入预处理好的分子筛柱中洗脱，收集第一个洗脱峰即为纳米颗粒抗原。
8.根据权利要求1所述的重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换层析后的溶液经分子筛，得纳米颗粒抗原的步骤之后还包括：
抗原为在大肠杆菌中可溶性表达的犬瘟热血凝素表位肽与幽门螺旋杆菌Ferritin的融合蛋白，形成纳米颗粒。
9.权利要求1-8中任一项所述的重组犬瘟热病毒疫苗的纯化方法纯化的抗原在生产及疫苗制备中的应用。
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