CN1370237A - 通过缺失或消除非必需基因而减毒的重组副流感病毒疫苗 - Google Patents
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Abstract
提供了重组副流感病毒(PIV),其C、D和/或V的翻译读码框(ORF)的表达降低或去除所产生的新的PIV候选疫苗。通过改变一个重组PIV基因组或反基因组而降低或消除C、D和/或V ORF的表达,例如通过引入一个终止密码子,RNA编辑位点的突变,改变由起始密码子定义的氨基酸的突变,或在靶ORF中的移码突变。或者,C、D和/或V ORF整体或部分缺失,使其编码的蛋白部分或完全地无功能,或同时完全破坏蛋白表达。C、D和/或V ORF缺失或剔除突变体具有在疫苗发展中非常好的表型特征。这些缺失或剔除突变在产生的病毒或亚病毒颗粒中特定地导致产生一种或多种所需的表型。产生的候选疫苗在病毒生长特性、减毒、噬菌斑大小、和/或细胞病理学变化,以及其它新的表型上有所改变。还提供了存在于本发明C、D和/或V ORF缺失或去除突变PIV中的各种突变和核苷酸修饰,以获得良好的表型和结构效果。
Description
发明背景
人副流感病毒3型(HPIV3)是幼儿和1岁以下儿童严重下呼吸道感染的一般诱因。它是仅次于呼吸道合胞病毒(RSV)的、导致该年龄段儿童因病毒性下呼吸道疾病入院的诱因(Collins等，p1205-1243，于B.N.Fields(Knipe等编辑)Fields Virology，3rd ed.，vol.1.，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996；Crowe等，Vaccine 13：415-421，1995；Marx，J.Infect.Dis.176：1423-1427，1997)。该病毒的感染使3岁以下儿童发生显著病症。HPIV1和HPIV2是喉气管支气管炎(哮吼)的主要病因，也能引起严重肺炎和细支气管炎(Collins等，3rd ed.In“Fields Virology”，B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley，R.M.Chanock，J.L.Melnick，T.P.Monath，B.Roizman，和S.E.Straus，Eds.，Vol.1，p1205-1243，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)。在为期20年的长期性研究中，发现HPIV1、HPIV2和HPIV3分别占因呼吸道疾病入院总数的6.0、3.2和11.5％，三者的总和占入院总数的18％，因此，需要有效的疫苗。(Murphy等，Virus Res.11：1-15，1988)。也发现副流感病毒占儿童中并发中耳炎的、由病毒诱发的中耳积液诱因的很大比例(Heikkinen等，N.Engl.J.Med.340：260-264，1999，在此引入作为参考)。因此，需要发展一种抗这些病毒的疫苗，以预防严重的下呼吸道疾病和伴随HPIV感染的中耳炎。
尽管对发展抗HPIV的有效疫苗疗法进行了大量的研究，仍然没有获得任何HPIV株的被认可的疫苗制剂，以及改善HPIV相关疾病的被认可的疫苗制剂。目前，仅有两个活的减毒PIV候选疫苗受到了特别关注。其中之一是一种牛PIV(BPIV3)株，其与HPIV3抗原相关，并显示可保护动物免受HPIV3侵袭。BPIV3在人幼儿和儿童中减毒、遗传稳定，并且具有免疫原性(Karron等，J.Inf.Dis.171：1107-14，(1995a)；Karron等，J.Inf.Dis.172：1445-1450，(1995b))。第二个PIV3候选疫苗(JS cp45)是HPIV3 JS野生型(wt)株的冷适应突变体(Karron等，1995b，同上；和Belshe等，J.Med.Virol.10：235-242，(1982))。这种活的、减毒的、冷传代(cp)的PIV3候选疫苗具有温度敏感(ts)、冷适应(ca)和减毒(att)的表型，在体内实验病毒复制后是稳定的。cp45病毒在实验动物中可保护性抵抗人PIV3的侵袭，并且在血清反应阴性的幼儿和儿童中是减毒、遗传上稳定并具有免疫原性的(Hall等，Virus Res.22：173-184，1992；Karron等，1995b，同上)。
近来，重组DNA技术促进PIV3候选疫苗的发展，使从cDNA中得到感染性负链RNA病毒成为可能(综述参见Conzelmann，J.Gen.Virol.77：381-389，1996；Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：11354-11358，1996)。文中报道了在必需病毒蛋白存在时，从cDNA编码的反基因组RNA中获得的一些重组病毒，这些病毒包括感染性呼吸道合胞病毒(RSV)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒、猿猴病毒5(SV5)、新城疫病毒(NDV)和仙台病毒(SeV)(参见，如，Garcin等，EMBO J.14：6087-6094，1995；Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：4477-4481，1995；Radecke等，EMBO J.14：5773-5784，1995；Schnell等，EMBOJ.13：4195-4203，1994；Whelan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：8388-8392，1995；Hoffman等，J.Virol.71：4272-4277，1997；Kato等Genes toCells 1：569-579，1996；Roberts等，Virology 247(1)：1-6，1998；Baron等，J.Virol.71：1265-1271，1997；国际申请WO 97/06270；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：11563-11567，1995；1997年7月15日的US专利申请08/892,403(相应于公布的国际申请WO 98/02530和之前的US临时申请：1997年5月23日的60/047,634，1997年5月9日的60/046,141，1996年7月15日的60/021,773)；Juhasz等，J.Virol.71(8)：5814-5819，1997；He等，Virology 237：249-260，1997；Baron等，J.Virol.71：1265-1271，1997；Whitehead等，Virology 247(2)：232-239，1998a；Whitehead等，J.Virol.72(5)：4467-4471，1998b；Peeters等，J.Virol.73：5001-5009，1999；Jin等，Virology 251：206-214，1998；Bucholz等，J.Virol.73：251-259，1999；Whitehead等，J.Virol.73(4)：3438-3442，1999；为各种目的在此分别全文引用作为参考)。
在特别地有关于目前的发明的方面，近来发展了一种获得具有来自cDNA的wt表型的HPIV的方法，可回收感染性的重组PIV3 JS株(参见，如，Durbin等，Virology 235：323-332，1997；1998年5月22目的美国专利申请09/083,793；1997年5月23日的美国临时专利申请60/047,575(相应于国际申请WO 98/53078)和1997年9月19日的美国临时专利申请60/059,385；在此分别引用作为参考)。此外，这些发现使可以进行cDNA克隆的遗传操作，以确定生物学突变体表型变化的遗传基础，如，在HPIV3 cp45中那些特定导致产生ts、ca和att表型的突变，以及BPIV3中那些特定导致产生其减毒表型的基因。此外，这些发现使可以构建新PIV候选疫苗，并估计其减毒、免疫原性和表型稳定性水平。
因此，现在可从cDNA中获得感染性野生型重组PIV3(r)PIV3，以及其多种ts衍生物，并使用反向遗传系统产生具有确定的减毒突变的感染性病毒，以及研究现存疫苗病毒减毒的遗传基础。例如，发现在cp45 L基因中的三个氨基酸替代，单独或组合，特定导致产生ts和减毒的表型。其它ts和减毒突变存在于PIV3 cp45的其它区域。此外，利用PIV3 cDNA拯救系统，在L区带有这三个减毒突变的PIV3全长cDNA中，将PIV3 HN和F读码框(ORF)替换为PIV1的，产生一种嵌合PIV1候选疫苗。衍生自该cDNA的重组嵌合病毒定名为rPIV3-1.cp45L(Skiadopoulos等，J.Virol.72：1762-1768，1998；Tao等，J.Virol.72：2955-2961，1998；Tao等，Vaccine 17：1100-1108，1999，在此引用作为参考)。rPIV3-1.cp45L在仓鼠中是减毒的，并能诱导对PIV1攻击的高水平抗性。获得了一个定名为rPIV3-1.cp45的重组嵌合病毒，其具有cp45中15个突变的13个，即，不包括发生于HN和F的突变，并且在仓鼠上下呼吸道中高度减毒(Skiadopoulos等，Vaccine，在印，1999)。
尽管在发展抗PIV不同组的有效疫苗中有许多进展，本领域仍然需要另外的工具和方法，工程化安全和有效疫苗以减轻PIV导致的严重的健康问题，特别是HPIV3感染导致幼儿和儿童的疾病。目前遗留的问题包括需要其它工具以产生用于不同临床背景的、适当减毒的、具免疫原性和遗传稳定性的候选疫苗。为达到这一目标，现存的检测并在重组疫苗毒株中引入减毒突变的方法需要扩展。本发明令人惊讶地满足这些需要，并提供了以下所述的其它优点。
发明简述
本发明提供了在感染性PIV中引入已定义的、预先确定的结构和表型改变的新工具和方法。本发明的一个实施方案中，提供了一种分离的多核苷酸分子，其具有一个可操作连接的转录启动子，一个编码PIV基因组或反基因组的多核苷酸序列和一个转录终止子。该基因组或反基因组含有一个降低或消除C、D和/或V ORF中一个或多个的表达的剔除突变，或使一个或多个C、D和/或V ORF的全部或部分缺失的突变。
本发明优选的方面中，C、D和/或V ORF中一个或多个的表达的降低或消除，是通过修饰PIV基因组或反基因组，使其具有一个将C ORF起始密码子从M改为T，或一个或多个终止密码子的突变。或者，一个或多个C、D和/或V ORF被整体或部分的缺失，或通过如点突变被修饰，使相应的蛋白部分或完全无功能，或彻底破坏蛋白表达。或者，可以在编辑位点产生突变，阻止编辑并消除由RNA编辑产生的蛋白的表达(Kato等，EMBO 16：578-587，1997和Schneider等，Virology227：314-322，1997)。
本发明在C、D和/或V有突变的重组PIV具有发展疫苗所期望的表型特征。以上所述在重组基因组或反基因组中的突变，在产生的病毒或亚病毒颗粒中特定导致一种或多种期望的表型改变。由此产生的候选疫苗表现一种或多种特征，表现为(i)细胞培养时生长性质的改变，(ii)在哺乳动物宿主的上下呼吸道中减毒，(iii)病毒噬菌斑大小的改变，(iv)细胞病理学效果的改变，以及(v)免疫原性的改变。
此处所述模式PIV重组体中，期望的表型变化包括，与相应的野生型或突变亲本PIV株相比，病毒在体外和/或哺乳动物宿主中生长的减弱。在更详细的方面，病毒在细胞培养中的生长可能因剔除或基因(或基因组区段)缺失突变而减弱约5-10倍。病毒在哺乳动物宿主的上下呼吸道中减毒优选约为10-100倍，有时100-1000倍或更高，以利于疫苗的发展。同时，本发明的重组PIV具有免疫原特性，可以在哺乳动物宿主的上下呼吸道中刺激抗wt PIV攻击的保护性免疫应答。
具有C、D和/或V剔除突变的PIV基因组或反基因组可以是人或非人PIV序列，或其被重组修饰的版本。一个实施方案中，该多核苷酸序列编码一个嵌合的基因组或反基因组，其具有重组地组合了一个非人PIV序列(如来自牛PIV(BPIV)的基因或基因组区段)的一个人PIV序列(参见，如，1999年7月9日由Bailey等人申请的案卷号为15280-399000US的美国临时专利申请，名为“减毒的人-牛嵌合副流感病毒疫苗”，在此引用作为参考)。其它实例中，该多核苷酸编码来自一个非人PIV和至少一个其它人或非人来源PIV序列的嵌合体。
另一些实施方案中，本发明提供了一种分离的感染性PIV颗粒，具有包含C、D和/或V剔除突变的重组PIV(rPIV)基因组或反基因组。该分离的感染性PIV颗粒可以是病毒或亚病毒颗粒。此处所述亚病毒颗粒指任何缺少完整病毒中存在的(如包括完整基因组或反基因组、核壳和包膜的装配了的毒粒)一个结构成分如一个基因组区段、基因、蛋白或蛋白功能结构域的感染性PIV颗粒。因此，本发明亚病毒颗粒的一个例子是具有一个基因组或反基因组、以及N、P和L基因产物的感染性核壳。其它亚病毒颗粒通过非必须基因、基因组区段和/或部分或完全的基因产物(如F，HN，M或C)及其它非必须基因组和结构成分的部分或完全的缺失或替代来产生。
除了具有C、D和/或V缺失或剔除突变的重组PIV产生的表型效果外，也期望通过引入额外的增加或降低该重组病毒的减毒、和/或调整免疫原活性的突变，以调整其减毒和免疫原表型。因此，候选疫苗株可以由引入的至少一个，优选两个或多个不同的减毒突变进一步减毒，如生物学来源的PIV突变体中发现的突变，或利用重组微复制子、重组病毒或生物学来源病毒中经验地发现的突变。文中优选突变PIV株包括冷传代(cp)、冷适应(ca)、宿主范围限制(hr)、小噬菌斑(sp)和/或温度敏感(ts)突变体，例如JS HPIV3 cp45突变株。在模式实施方案中，一个或多个减毒突变发生于聚合酶L蛋白中，如在相应于JS cp45的Tyr 942、Leu 992、Thr 1558的位置上。或者，N蛋白的减毒突变可被选择并引入C、D和/或V缺失或剔除突变体中，如其编码在相应于JS cp45残基Val 96或Ser 389处的氨基酸替代。其它或附加突变可能编码C蛋白中的氨基酸替代，如在相应于JS cp45残基Ile96处。调节本发明C、D和/或V缺失或剔除突变体减毒水平的其它突变也存在于F蛋白，如在相应于JS cp45残基Ile 420或Ala 450处，在HN蛋白，如在相应于JS cp45残基Val384处(Skiadopoulos等，J.Virol.73：1374-1381.1999；Skiadopoulos等，J.Virol.73：1374-1381，1999，分别在此引用作为参考)。
引入本发明C、D和/或V缺失或剔除突变体中的、来自生物学来源的PIV突变体的减毒突变也包括在PIV基因组或反基因组非编码部分的突变，例如在3’前导序列。文中的突变范例可在重组病毒3’前导序列(相应于JS cp45核苷酸23、24、28或45)工程化(Skiadopoulos等，J.Virol.73：1374-1381，1999，在此引用作为参考)。其它的突变范例可在重组病毒N基因起始序列工程化，如通过改变N基因起始序列一个或多个核苷酸，如相应于JS cp45核苷酸62位置处。
从JS cp45和其它生物学来源的PIV突变体，得到了减毒突变的大“菜单”，其中每个突变都可以与其它突变组合，调节具有C、D和/或V缺失或剔除突变的重组PIV的减毒水平。例如，本发明重组PIV内的突变包括一个或多个，优选两个或更多JS cp45突变。期望用于疫苗的本发明C、D和/或V缺失或剔除突变体经常有至少两个，有时三个或更多减毒突变，以获得满意的可广泛用于临床的减毒。优选的，具有C、D和/或V缺失或剔除突变的重组PIV包含一个或多个突变，由特定于该突变的密码子中的多个核苷酸替代使其稳定。
其它可以采用或转入本发明C、D和/或V缺失或剔除突变体的突变可在非PIV非区段化负链RNA病毒中发现，并引入本发明PIV突变体。确定在异源负链RNA病毒中发现的的突变位于受体PIV基因组或反基因组的相应同源位点，使受体现存序列突变为该突变体基因型(通过相同或保守突变)，可以容易地获得，在1999年4月13日Murphy等的美国临时专利申请(案卷号17634-000600)名为“从克隆的核苷酸序列制备减毒的负链RNA病毒疫苗”中有说明，在此引用作为参考。
除了上述突变，感染性C、D和/或V缺失或剔除突变体被希望包含来自任何异源PIV或PIV类病毒(如HPIV1、HPIV2、HPIV3、牛PIV(BPIV)或鼠PIV(MPIV))的异源编码或非编码核苷酸序列，从而形成一个嵌合的基因组或反基因组。例如，本发明的重组PIV可能包括来自两个或多个野生型或突变PIV株的序列，如HPIV1和HPIV3。或者，本发明C、D和/或V缺失或剔除突变体可能包括来自一个人和一个非人PIV的序列，如HPIV和BPIV。优选的，“受体”或“背景”基因组或反基因组中的一个或多个人PIV编码或非编码多核苷酸，被来自异源PIV或非PIV病毒的对应序列，单独或与一个或多个选择的点突变(如cp和/或ts突变)组合地替代，产生新的减毒疫苗株。分离的感染性PIV颗粒优选人PIV，更优选HPIV3(参见，如，1999年7月9日Bailey等的(案卷号15280-399000US)美国临时专利申请，名为“减毒的人-牛嵌合副流感病毒疫苗”，在此引用作为参考)。
本发明的相关方面，提供了分离的感染性PIV颗粒，其包含来自HPIV3的核苷酸序列与至少一个来自异源PIV(如HPIV1、HPIV2、BPIV、MPIV)的序列的融合。例如，HPIV3的完全基因都可以被来自其它形式PIV的对应基因替代，如PIV1或PIV2的HN和/或F糖蛋白基因。或者，一个选择的基因组区段(如HPIV1或HPIV2 HN或F中胞质尾区、跨膜区或胞外域)可以被对应HPIV3基因中的基因组区段替代，产生编码嵌合蛋白的构建体，如具有PIV3的胞质尾区和/或跨膜区和PIV1或PIV2胞外域融合的融合蛋白。或者，来自一个PIV的基因或基因组区段可以被添加进(即，没有替代)一个异源PIV背景中，在得到的克隆中创造出新免疫原特性。
除了具有C、D和/或V缺失或剔除突变的重组PIV，本发明还提供了相关的cDNA克隆、载体和粒子，均包含一个或多个此处所述的表型特异性突变。根据此处描述的方法，这些以选择性组合引入是重组cDNA基因组或反基因组的分离的多核苷酸，产生表达时适当减毒的感染性病毒或亚病毒颗粒。这一过程，与常规表型评价一起，提供了具有期望特性(如减毒、温度敏感、改变的免疫原性、冷适应、小噬菌斑、宿主范围限制、遗传稳定性等)的C、D和/或V缺失或剔除突变体。特别的，候选疫苗选择那些减毒但仍然带有足以在被免疫的哺乳动物宿主中诱导保护性免疫反应的免疫原性的。
本发明的另一些方面中，具有或没有采用额外的减毒突变(如来自生物学来源的突变病毒)的C、D和/或V缺失或剔除突变体，被构建使其具有额外的核苷酸修饰，以产生期望的表型、结构或功能的变化。典型的，这种选择的核苷酸修饰将特定导致表型变化，如生长特性、减毒、温度敏感、冷适应、噬菌斑大小、宿主范围限制或免疫原性的变化。文中的结构变化包括在PIV编码cDNA中引入或消除限制性位点，以利于操作和鉴定。
在优选的实施方案中，C、D和/或V缺失或剔除突变体基因组或反基因组的核苷酸改变包括，通过部分或完全缺失一个额外病毒基因，或降低或消除(剔除)其表达来修饰额外的病毒基因。文中突变的靶基因包括核壳蛋白N、磷蛋白P、大聚合酶亚单位L、基质蛋白M、血凝素-神经氨酸酶蛋白HN、融合蛋白F。在重组病毒保持活性和感染性时，这些蛋白的任何一个可以被选择性缺失、替代或重排，整体或部分，单独或与其它期望的修饰组合，以获得新的C、D和/或V缺失或剔除突变体。例如，这些基因的一个或多个可能整体或部分缺失，或其表达降低或消除(如，引入终止密码子、RNA编辑位点突变、改变了起始密码子决定的氨基酸的突变、或移码突变)，以改变所产生的重组克隆的表型，改善了生长、减毒、免疫原性或其它期望表型特征。
本发明C、D和/或V缺失或剔除突变体的其它核苷酸修饰包括，重组基因组或反基因组中的一个被选择基因的顺式作用调节序列的缺失、插入、添加或重排。一个范例中，一个PIV基因的顺式作用调节序列被改变为相应的异源调节序列，其可以是不同PIV相同基因的对应顺式作用调节序列，或不同PIV基因的顺式作用调节序列。例如，一个基因末端信号可以转化或替代为相同PIV株的不同基因末端信号。其它一些实施方案中，核苷酸修饰可能包括重组基因组或反基因组内转录起始位点的插入、缺失、替代或重排，如消除一种蛋白质所选择形式的转录起始位点。
此外，各种其它的遗传改变可以在具有C、D和/或V缺失或剔除突变的PIV基因组或反基因组中产生，单独或和一个或多个生物学来源的突变PIV的减毒突变组合。例如，非PIV来源的基因或基因组区段可以整体或部分插入。或者，可以改变基因排列顺序，或一个PIV基因组启动子用其反基因组的对应部分替代。在这种重组基因组或反基因组中的不同或额外的修饰有利于操作，如在各种基因间区域或其它位置插入唯一的限制性位点。不翻译的基因序列可以被去除以增加插入外源序列的能力。
在另一些方面，编码该重组PIV基因组或反基因组的多核苷酸或载体可以被修饰，使其编码可在目的宿主中诱导保护性免疫的非PIV序列(如细胞因子、T辅助表位、限制性位点标记)或微生物病原(如病毒、细菌、或真菌)。在一种这类实施方案中，构建了含有呼吸道合胞病毒(RSV)基因或基因组区段的C、D和/或V缺失或剔除突变体，例如含有编码RSV抗原蛋白(如F或G蛋白)、免疫原结构域或表位的基因。
本发明的相关方面，提供了产生具有C、D和/或V缺失或剔除突变的分离的感染性重组PIV的组合物(如具有PIV编码cDNA的分离的多核苷酸或载体)和方法。本发明的这些方面中包括了新的分离的多核苷酸分子和载体，其包含具有经C、D和/或V(ORF)部分或完全缺失或使其表达降低或消除的一个或多个核苷酸改变而被修饰的PIV基因组或反基因组的分子。也提供了具有编码N、P、L蛋白的一个或多个的分离的多核苷酸分子的相同或不同的表达载体。这些蛋白也可以直接由基因组或反基因组cDNA表达。载体优选在细胞或无细胞裂解液中表达或共表达，从而产生感染性C、D和/或V缺失或剔除突变PIV病毒颗粒或亚病毒颗粒。
以上产生C、D和/或V缺失或剔除突变PIV的方法和组合物产生感染性病毒颗粒或亚病毒颗粒，或其衍生物。重组感染性病毒与天然的PIV毒粒相当，并有同样的感染性。可直接感染新鲜细胞。感染性亚病毒颗粒典型的是病毒颗粒的一个亚成分，在适当条件下可引发感染。例如，具有基因组或反基因组RNA和N、P、L蛋白的核壳是亚病毒颗粒的一个范例，当其进入细胞质中，可以引发感染。本发明提供的亚病毒颗粒包括缺少一个或多个蛋白质、蛋白质区段或其它病毒成分的病毒颗粒。
其它实施方案中，本发明提供了含有一个具有包含上述C、D和/或V缺失或剔除突变PIV基因组或反基因组的分离的多核苷酸分子的表达载体，和具有包含编码PIV N、P、L蛋白的一个或多个分离的多核苷酸分子的(与前一个相同或不同的)表达载体的细胞或无细胞裂解液。这些蛋白质的一个或多个也可以从基因组或反基因组cDNA表达。表达后，基因组或反基因组和N、P、L组合产生感染性PIV病毒或亚病毒颗粒。
本发明其它实施方案中，提供了一种细胞或无细胞表达系统(如无细胞裂解液)，其含有一个具有包含上述C、D和/或V缺失或剔除突变PIV基因组或反基因组的分离的多核苷酸分子的表达载体，和具有包含编码PIV N、P、L蛋白的一个或多个的分离的多核苷酸分子的表达载体。这些蛋白质的一个或多个也可以从基因组或反基因组cDNA表达。表达后，基因组或反基因组和N、P、L组合产生感染性PIV颗粒，如病毒或亚病毒颗粒。
本发明的重组PIV以各种组合物形式用于在对PIV敏感的宿主中产生期望的抗PIV免疫反应。本发明减毒的C、D和/或V缺失或剔除突变体能在感染的哺乳动物宿主中诱导保护性免疫应答，且足够地减毒，不会在免疫化宿主中引发不可接受的严重呼吸疾病的症状。减毒的病毒或亚病毒颗粒可能存在于细胞培养物的上清中，从培养物中分离，或经部分或完全纯化。病毒也可以冷冻干燥，根据需要与多种成分组合以储藏或给药宿主。
本发明进一步提供了新疫苗，其包含一种生理上可接受的载体和/或佐剂，以及经分离的减毒的C、D和/或V缺失或剔除突变PIV病毒颗粒或亚病毒颗粒。优选实施方案中，该疫苗包含具有至少一个，优选两或多个额外的突变或以上所述的其它核苷酸修饰的C、D和/或V缺失或剔除突变PIV，使其减毒和免疫原性达到合适的平衡。疫苗配制为每剂103-107PFU的减毒病毒。病毒可能具有诱导抗单PIV株或抗多PIV株或组的减毒C、D和/或V缺失或剔除突变PIV。这方面，C、D和/或V缺失或剔除突变PIV在疫苗制剂中可与其它PIV疫苗株或其它病毒疫苗病毒如RSV组合。
在相关方面，本发明提供了在哺乳动物中刺激免疫系统以诱导抗PIV免疫应答的一种方法。该方法包含以足够的免疫量，给药存在于生理上可接受的载体和/或佐剂中的C、D和/或V缺失或剔除突变减毒PIV的制剂。一个实施方案中，免疫原组合物是包含具有至少一个，优选两或多个额外的突变或以上所述决定所希望表型的其它核苷酸修饰的C、D和/或V缺失或剔除突变PIV疫苗。疫苗配制为每剂103-107PFU的减毒病毒。该疫苗可能具有减毒C、D和/或V缺失或剔除突变PIV病毒，其可诱导抗单PIV、抗多PIV(如HPIV1和HPIV3)或抗一个或多个PIV和非PIV病原如RSV的免疫反应。文中，C、D和/或V缺失或剔除突变PIV可诱导抗单PIV的单特异性免疫应答，或抗多PIV或抗一个或多个PIV和非PIV病原如RSV的多特异性免疫应答。或者，具有不同免疫原特性的C、D和/或V缺失或剔除突变PIV可组合于疫苗混合物中，或在协同治疗方案中单独给药，以诱导抗单PIV、抗多PIV或抗一个或多个PIV和非PIV病原如RSV的更加有效的保护。优选的，免疫原组合物通过喷雾、滴入或气雾剂给药于上呼吸道。
附图简述
图1描述了HPIV3 P/C/D/V ORF的结构(不成比例)。以矩形表示具有P、C、D、V ORF的P mRNA的三个读码框(+1+2和+3)。显示了氨基酸长度。RNA编辑位点的位置以垂直线表示，其基序根据其在完整HPIV3反基因组序列上的位置编号。A组显示未编辑P mRNA的结构。显示了具有P和C ORF翻译起始位点的序列，并相应于完整反基因组序列来编号。P、C、D、V ORF在JS野生型克隆完整反基因组序列的核苷酸位置为：P，1784-3595；C，1794-2393；D，2442-2903；V，2792-3066。相应于P mRNA，P ORF的起始AUG位于80-82处。B组显示编辑后的P mRNA的组织结构，其中在编辑位点插入了两个非模板G(GG)残基。这改变了阅读顺序，框+2中的P ORF上游末端与框+3中的D ORF融合。产生的嵌合蛋白包含P ORF编码的N末端的241个氨基酸，其与D ORF编码的C末端131个氨基酸融合。C组表示干扰C、D和V ORF的模式突变的位置，在B组的编辑后P mRNA上显示。引入的终止密码子由矩形内的垂直线表示。CORF的密码子1由M改为T，并改变密码子7和26处从而创造了终止密码子。D ORF在密码子304、305、306处引入了终止密码子，其编号相应于P N末端的241个氨基酸和D C末端131个氨基酸融合产生的372个氨基酸的嵌合D蛋白。V ORF在密码子17和20处引入了终止密码子。这后两个突变在D ORF密码子354和357处产生了氨基酸替代突变(星号表示)。
图2显示放射免疫沉淀分析，表明C蛋白的表达在病毒rC-KO中被消除。(a)道：35S-标记的细胞裂解液用多克隆C特异的兔抗血清免疫沉淀。在rJS中出现了相应于C蛋白的22kD条带(空心箭头)，但在rC-KO(a)道中没有出现。(b)道：细胞裂解液被特异于HPIV3HN蛋白的两个单克隆抗体的混合物免疫沉淀。相应于HN蛋白的64kD条带(实心箭头)在二者细胞裂解液中都出现，确定它们确是HPIV3，且蛋白表达水平相似。
图3显示了模式的剔除突变rC-KO和rDV-KO与亲本病毒rJS相比的多循环复制的结果。病毒效价以TCID50/ml表示，是两次采样的平均。
具体实施方案的说明
本发明提供了重组的PIV(rPIV)，其中一个或多个C、D和/或V ORF的表达被降低或消除，以产生多种新的PIV候选疫苗。C、D和/或V ORF的表达降低或消除是通过修饰重组PIV基因组或反基因组，使其具有一个改变C ORF起始密码子编码排列的突变，或具有一个改变C、D和/或V ORF中一个或多个终止密码子编码排列的突变。其它破坏C、D和/或V ORF表达，或其相应的蛋白表达或蛋白功能的突变包括，部分或完全的缺失C、D和/或V编码序列，使C、D和/或V蛋白部分或完全失去功能，或终止其表达。
HPIV3是单负链病毒目副粘病毒科中新命名的呼吸道病毒属的成员。其基因组为负义的单链RNA，长度为15462个核苷酸(Galinski等，Virology 165：499-510，1988；Stokes等，Virus Res.25：91-103，1992)。PIV3基因组至少编码8个蛋白质：核壳蛋白(N)、核壳磷蛋白(P)、非结构蛋白C、D蛋白、基质蛋白M、融合糖蛋白F、血凝素-神经氨酸酶糖蛋白HN和一个大聚合酶蛋白(L)(Collins等，p.1205-1243.于B.N.Fields(Kinpe等编辑)，Fields Virology，3rd ed，vol.1.Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)。
M、HN、F蛋白是包膜相关的，后两个是表面糖蛋白，和每个PIV蛋白一样，是主要的中和和保护性抗原(Collins等，3rd ed.于“FieldsVirology”，B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley，R.M.Chanock，J.L.Melnick，T.P.Monath，B.Roizman，和S.E.Straus编辑，Vol.1，p1205-1243，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)。在各种PIV中可比较的HN或F蛋白的显著序列差异被认为是这种保护免疫特异性的基础(Collins等，3rd ed.于“Fields Virology”，B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley，R.M.Chanock，J.L.Melnick，T.P.Monath，B.Roizman，和S.E.Straus编辑，Vol.1，p1205-1243，Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia，1996；Cook等，Amer.Jour.Hyg.77：150-159，1963；Ray等，J.Infect.Dis.162：746-749，1990)。
除了包含4个ORF(即P、C、D、V)的P mRNA外(图1)，HPIV3基因分别以编码单个蛋白的单mRNA转录(Galinski等，Virology186：543-550，1992；和Spriggs等，J.Gen.Virol.67：2705-2719，1986)。在该mRNA中，P和C从独立但重叠的ORF中翻译(图1)。尽管所有的副粘病毒都编码P蛋白，只有呼吸道病毒和麻疹病毒属编码C蛋白。病毒个体在表达的C蛋白数量上和在体内和体外中该病毒的复制重要性上不同。仙台病毒(SeV)从C ORF不同位点启动，表达出四种蛋白：C’、C、Y1、Y2，其翻译起始点在mRNA上以此顺序排列(Curran等，Enzyme 44：244-249，1990；Lamb等，p.181-214，于D.Kingsbury(编辑)，The Paramyxoviruses，白金出版社，纽约，1991)，而HPIV3和麻疹病毒(MV)仅表达一个单独的C蛋白(Bellini等，J.Virol.53：908-919，1985；Sanchez等，Virology 147：177-186，1985；和Spriggs等，J.Gen.Virol.67：2705-2719，1986)。
全部的四个C衍生蛋白被消除的一个活性重组SeV在体外不能有效复制(Kurotani等，Genes Cells.3：111-124，1998)，而单个C蛋白的消除有复杂的效果(Cadd等，J.Virol.70：5067-74，1996；Curran等，Virology 189：647-56，1992；Latorre等，J.Virol.72：5984-93，1998)。具有使C蛋白170位置处苯丙氨酸(F)改为丝氨酸(S)的单点突变的重组SeV在小鼠中减毒，但其在细胞培养中的复制没有受到损害(Garcin等，Virology 238：424-431，1997；Itoh等，J.Gen.Virol.78：3207-15，1997)。与SeV显著相反，一个C-负型(C-minus)的麻疹病毒(MV)在Vero细胞中有效复制(Radecke等，Virology 217：418-21，1996)，尽管其复制在人外周血细胞中受到限制，且在体内表现一定的减毒(Escoffier等，J.Virol.73：1695-8，1999；Valsamakis等，J.Virol.72：7754-61，1998)。
除了P和C ORF外，PIV3的P mRNA另有两个ORF，即D和V。PIV3 D蛋白是P和D ORF的融合蛋白，通过转录编辑，或RNA编辑加工，从P基因中表达，其中在RNA编辑位点处将两个非模板G残基加入了P mRNA中(图1)(Galinski等，Virology 186：543-550，1992；和Pelet等，EMBO J.10：443-448，1991)。BPIV3是其它副粘病毒中唯一表达D蛋白的，其表达机制相同。
呼吸道病毒、麻疹病毒和Rubulavirus属的几乎所有成员都表达V蛋白。唯一确定不表达的是HPIV1，因其缺少V ORF(Matsuoka等，J.Virol.65：3406-3410，1991，在此引用作为参考)。V ORF的特征是存在高度保守的半胱氨基酸丰富区(Cattaneo等，Cell 56：759-764，1989；Park等，J.Virol.66：7033-7039，1992；Thomas等，Cell 54：891-902，1988；和Vidal等，J.Virol.64：239-246，1990；分别在此引用作为参考)。对存在于各HPIV3病毒的V ORF测序结果表明该ORF的表达是维持病毒功能所须的(Galinski等，Virology 155：46-60，1986；Spriggs等，J.Gen.Virol.67：2705-2719，1986；Stokes等，Virus Res.25：91-103，1992).
一个非模板G残基加入RNA编辑位点后，BPIV3 V蛋白表达(Pelet等，EMBO J.10：443-8，1991，在此引用作为参考)。但HPIV3中，2-4个翻译终止子存在于编辑位点和V ORF之间，仍不清楚是否HPIV3是该ORF不表达的另一个例子，或是否其以另一种机制表达。一种可能性是HPIV3编辑还发生在P基因下游的第二处，尽管在细胞培养中没有发现(Galinski等，Virology 186：543-550，1992，在此引用作为参考)。或者，可能核糖体通过移码接近V ORF。这类似MV P位点的情况。MV表达C、P、V蛋白，但也表达从P ORF到V ORF的移码所合成的一个新的R蛋白(Liston等，J.Virol.69：6742-6750，1995，在此引用作为参考)。
尽管仍不清楚HPIV3表达V的方式，其V ORF在不同株之间的极度保守暗示其确实是表达的。V蛋白的功能不十分明确，但V-负型MV和SeV重组体在体外可以有效复制，但在体内复制降低(Delenda等，Virology 228：55-62，1997；Delenda等，Virology 242：327-337，1998；Kato等，EMBO J.16：578-587，1997；Kato等，J.Virol.71：7266-7272，1997；和Valsamakis等，J.Virol.72：7754-7761，1998)。
PIV的病毒基因组也具有基因外前导序列和非转录尾序列，包含病毒复制和转录所必须的启动子。因此，PIV遗传图以3’前导序列-N-P/C/D/V-M-F-HN-L-5’非转录尾序列表示。转录从3’起始，并通过基因边缘处短的保守基元指导下的顺序终止-起始机制进行。每个基因的上游末端具有一个基因起始信号(GS)，指导其各自mRNA的起始。每个基因的下游末端具有一个基因终止信号(GE)，指导多腺苷酸化和终止。对人PIV3 JS株(Genbank接入号Z11575，在此引用作为参考)和Washington株(Galinski M.S.，The Paremyxoviruses，Kingsbury，D.W.编辑，pp.537-568，白金出版社，纽约，1991；在此引用作为参考)，牛PIV3 910N株(Genbank接入号D80487，在此引用作为参考)的模式序列进行了描述。
此处所用术语“PIV基因”一般指PIV基因组编码mRNA的部分，典型地，以基因起始信号(GS)开始于上游末端，以基因终止信号(GE)结束于下游末端。术语PIV基因也称为“翻译读码框”或ORF。除了基因外，PIV病毒基因组也包含非编码基因间隔序列，以及具有病毒复制和转录所必须启动子的基因外前导区和尾区。因此，PIV遗传图部分以3’-前导序列-N-P/C/D/V-M-F-HN-L-5’非转录尾序列表示。转录从3’起始，并通过基因边缘处短的保守基元指导下的顺序终止-起始机制进行。为构建本发明C、D、和/或V缺失突变体，必须对一个或多个PIV基因整体或部分缺失。这意味着可以在任何一个或多个PIV基因内的读码框和/或顺式作用调节序列制造部分或全部的缺失。“基因组区段”是指PIV基因组上任意长度的连续核苷酸，可以是ORF、基因或基因外区域的一部分或其组合。
其它构建本发明C、D、和/或V突变体的方式包括构建“剔除”病毒，在不缺失大部分PIV基因组情况下降低或消除基因表达。特别的，C、D和/或V ORF表达的降低或消除，优选通过修饰PIV基因组或反基因组进行，通过引入一个终止密码子、RNA编辑位点突变、改变起始密码子所决定的氨基酸的突变，或在靶ORF内产生移码突变。一个实施方案中，突变发生在编辑位点，阻止编辑并消除蛋白的表达，所述蛋白的mRNA由RNA编辑产生(Kato等，EMBO 16：578-587，1997和Schneider等，Virology 227：314-322，1997，在此引用作为参考)。
本发明的其它方面中，PIV基因组或反基因组经诱变在C、D和/或V ORF内产生一个或多个终止密码子。一个实例中，C ORF中的一个甲硫氨酸起始密码子转为苏氨酸。另一个实例中，在基因组或反基因组中突变(在核苷酸(nt)1795处(由T改为C)和nt 1813处(由C改为A))，引入两个终止密码子，终止密码子相应于C ORF的7和26处。由此产生了一个C剔除突变病毒，命名为rC-KO。本发明的三个其它模式突变病毒中，D和V ORF单独和组合地受到干扰。在单独的D剔除突变体中，其命名为rD-KO，引入在全长反基因组nt 2692、2695和2698处由C改为A的突变干扰D ORF的表达。这些点突变在公认的D ORF处创造出三个连续的终止密码子，导致D蛋白在372个氨基酸的嵌合D蛋白中在303密码子后提前终止。在其它更详细的方面，构建了一个单独的V剔除突变体，rV-KO，在全长反基因组nt2845(A到T)和2854(C到T)处引入两个点突变。这些点突变在可能的V ORF处创造提前的终止密码子(氨基酸17和20处)。将rD-KO和rV-KO中的改变同时引入一个单克隆中，创造一个组合DV剔除突变体，rDV-KO。
如上所述，本发明在C、D和/或V ORF内具有一个或多个突变的重组PIV具有发展疫苗所非常期望的表型特征。此处所述C、D和/或V ORF整体或部分缺失，或降低或消除C、D和/或V ORF表达的修饰，在得到的病毒或亚病毒颗粒中特定导致多种期望的表型改变。在优选的实施方案中，C、D和/或V剔除或缺失突变体与相应的野生型或突变亲本RSV株相比，表现减弱的病毒生长。与相应的野生型或突变亲本RSV株相比，生长(如在细胞培养时)可能降低约2倍，更可能是约5倍，优选约10倍或更高(如：在培养的7天时期内)。在更详细的方面，本发明的重组RSV表现改变的病毒生长动力学。
具有C、D和/或V ORF缺失和剔除突变的重组疫苗病毒也优选的在体内表现减毒表型。例如在认可的人体内PIV复制的动物模型(如仓鼠和非洲绿猴(AGM))的下和/或上呼吸道中，复制与相应的野生型或突变亲本PIV株的生长相比，降低约2倍，经常是约5、10、20倍，优选约100倍-1000倍，或更高(如，感染后连续3-8天中的一天或每天检测)。除了上述减毒表型之外，或与之同时存在，具有C、D和/或V ORF缺失和剔除突变的重组PIV可能也表现在病毒噬菌斑大小、细胞病理学效果和/或免疫原性的改变。
本发明重组疫苗病毒的特别优选的特征在于，尽管如上所述其是减毒的，但仍然具有感染性，并可以在接种了的宿主中诱导所希望水平的抗PIV免疫应答。特别的，本发明候选疫苗重组体有足够的免疫原性，可诱导对后来wt病毒攻击的保护性免疫应答。如此处范例所示，从前感染C、D和/或V ORF剔除突变病毒，可在仓鼠和AGM中诱导抗HPIV3的显著的HAI抗体，这表明，这些模式重组体是具有保护性的，并因此代表了有前途的候选疫苗。在本发明其它优选的疫苗重组体中，免疫原活性用来平衡减毒的水平，以获得有用的候选疫苗，典型的标志为攻击病毒(如rJS HPIV3)在模型宿主(如仓鼠和非人灵长类)下和/上呼吸道中复制的降低，降低倍数约50-100倍，100-500倍，优选约500-2000倍，多至3000倍或更高(如，攻击后3-8天检测)。因此，本发明的重组疫苗病毒保持免疫原活性的同时，也表现复制和生长的降低。这种令人惊讶的表型特征对疫苗的发展是非常有利的。
本发明提供了发展具有C、D和/或V ORF缺失或剔除突变的活的减毒RSV候选疫苗。这些重组病毒通过cDNA中间体和基于cDNA的回收系统构建。来自cDNA的重组病毒独立复制，并以与生物学来源病毒相同的方式增殖。C、D和/或V ORF缺失和剔除突变体可以被进一步修饰，包含特定的减毒突变，以及多种其它突变和核苷酸修饰，产生期望的结构和表型效果。从cDNA获得重组PIV的材料和方法的详细描述，以及制造和检测此处作为本发明附加方面所述的突变和核苷酸修饰，在以下文献中有详细说明：Durbin等，Virology 235：323-332，1997；1998年5月22日美国专利申请09/083,793；1997年5月23日美国临时专利申请60/047,575(相应于国际申请WO98/53078)；1997年9月19日美国临时专利申请60/059,385；分别在此引用作为参考。特别的，这些文件说明了诱变、分离和定性PIV以获得减毒突变株(如温度敏感(ts)、冷传代(cp)、冷适应(ca)、小斑(sp)和宿主范围限制(hr)突变株)和鉴定决定该减毒表型的遗传变化的方法和步骤。与这些方法一致，上述文件详细说明了，在认可的模型系统中(包括鼠和非人灵长类动物模型系统)，确定生物学来源的和重组产生的减毒人PIV的复制、免疫原性、遗传稳定性和有效保护性的方法。此外，这些文件说明发展和检测用于预防和治疗PIV感染的免疫原组合物(包括单价和二价疫苗)的一般方法。以上引用的文件中也说明了产生感染重组PIV的方法，即，构建和表达编码PIV基因组或反基因组的cDNA并与必须PIV蛋白基因共表达，还包括可用于产生感染PIV病毒克隆的以下模式质粒：p3/7(131)(ATCC97990)，p3/7(131)2G(ATCC97889)，p218(131)(ATCC97991)，依据布达佩斯协议，分别保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801，UniversityBoulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，USA)，以上提供了保藏号。
以上引用的文献中也揭示了构建和评估经修饰的感染性重组PIV的方法，其引入了在生物学来源的PIV突变体(如冷传代(cp)、冷适应(ca)、宿主范围限制(hr)、小噬斑(sp)和温度敏感(ts)突变株)(如JS HPIV3 cp45突变株)中发现的表型特异性突变。在这些突变株中发现的突变可以容易地用于具有C、D和/或V剔除突变的重组PIV中。在模式实施方案中，聚合酶L蛋白上有一个或多个减毒突变，如在相应于JS cp45的Tyr942、Leu992、Thr1558。优选的，这些突变通过生物突变体的相同或保守的氨基酸替代，引入本发明人-牛嵌合PIV中。因此，PIV重组体可能包括一个Tyr942被His替代、Leu992被Phe替代和/或Thr1558被Ile替代的突变。与这些被替代氨基酸保守的替代物可用于产生期望的突变表型。
来自生物学来源的PIV突变体的其它模式突变包括N蛋白的一个或多个突变，包括在相应于JS cp45残基Val96、Ser389处的氨基酸替代。在详细的方面，这些突变代表了Val96到Ala，或Ser389到Ala，或与之保守的替代。本发明重组PIV中有用的氨基酸替代还发生在C蛋白上，如在相应于JS cp45的Ile96上，优选与由Ile96到Thr的相同或保守的替代。来自生物学来源的PIV突变体的其它模式突变包括F蛋白的一个或多个突变，包括在JS cp45上相应于JS cp45残基Ile420或Ala450处，优选由Ile420到Val、Ala450到Thr的替代或与之保守的替代。本发明其它PIV重组体采用HN蛋白的一个或多个氨基酸替代，以下为范例，重组PIV采用了相应于JS cp45残基Val384处的一个突变，优选由Val384到Ala的替代。
本发明这方面的其它例子包括这种重组PIV，其在PIV基因组或反基因组非编码部分(如3’端前导区)具有一个或多个突变。文中的突变范例可在重组病毒3’前导序列中(相应于JS cp45核苷酸23、24、28或45)的一个位置上工程化。其它的突变范例可在重组病毒N基因起始序列中工程化，如通过改变N基因起始序列一个或多个核苷酸，如在相应于JS cp45核苷酸62位置处。更详细的方面，C、D和/或V剔除突变体在核苷酸23处由T变为C，在核苷酸24处由C变为T，在核苷酸28处由G变为T，和/或在核苷酸45处由T变为A。在基因外序列中的其它突变的例子是N基因起始序列相应于JS cp45核苷酸62位置处由A变为T。
可在C、D和/或V剔除突变中工程化的突变范例成功地被工程化，并在重组PIV中回收，如以下重组PIV克隆：rcp45、rcp45 L、rcp45F、rcp45 M、rcp45 HN、rcp45 C、rcp45 F、rcp45 3’N、3’NL和rcp45 3’NCMFHN(Durbin等，Virology 235：323-332，1997；Skiadopolos等，J.Virol.72：1762-8；1998年5月22日美国专利申请09/083,793；1997年5月23日美国临时专利申请60/047,575(相应于国际申请WO98/53078)；1997年9月19日美国临时专利申请60/059,385；分别在此引用作为参考)。
从JS cp45和其它生物学来源的PIV突变体，得到了减毒突变的大“菜单”，其中每个突变都可以与其它突变组合，调节带有C、D和/或V缺失或剔除突变的重组体PIV的减毒、免疫原性和遗传稳定性的水平。文中，本发明许多重组PIV包括一个或多个，优选两个或更多来自生物学来源的PIV突变体的突变，如JS cp45中发现的突变之一或组合。优选的本发明重组体PIV具有多个并直至全部在JS cp45或其它生物学来源的PIV突变体中发现的突变。优选的，由于在决定每个突变的密码子处有多个核苷酸替代，这些突变在具有C、D和/或V缺失或剔除突变的重组体PIV中稳定地抗回复突变。
其它可引入本发明C、D和/或V缺失或剔除突变PIV的突变是存在于异源PIV或更远源的非区段化负链RNA病毒的突变，如减毒突变。特别的，负链RNA病毒中的减毒或其它期望的突变可被“转移”，如被拷贝到C、D和/或V缺失或剔除突变体基因组或反基因组中的相应位置。简要的说，异源负链RNA病毒中期望的突变被转移到PIV受体。包括在异源病毒中定位该突变，经序列对比识别受体PIV中相应位点，将RSV受体的天然序列突变为该突变基因型(相同或保守突变)，在以下文献中进行了表述：1999年4月13日Murphy等(案卷号17634-000600)的美国临时专利申请，名为“从克隆的核苷酸序列制备减毒的负链RNA病毒疫苗”，在此引用作为参考。如这些文献所述，优选修饰受体基因组或反基因组以在突变位点编码一个变化，其保守地相应于异源突变病毒中的变化。例如，如果突变病毒中相应于野生型序列的一个氨基酸替代标志突变的一个位点，则重组病毒相应残基处可工程化产生一个相似的替代。优选，该替代应包括一个与突变病毒蛋白中替代残基相似或保守的氨基酸。但对于突变蛋白中的替代残基，也可能非保守地改变突变位点的天然氨基酸(如利用其它氨基酸破坏或消弱野生型残基的功能)。在其中鉴别模式突变并转移于本发明人-牛嵌合PIV中的负链RNA病毒包括：其它PIV(如HPIV1、HPIV2、HPIV3、BPIV或MPIV)、RSV、仙台病毒(SeV)、新城疫病毒(NDV)、猿猴病毒5(SV5)、麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒、犬瘟热病毒(CDV)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)等。本发明使用的多种突变范例在以上引用的文献中做了说明，包括但不限于：相应于的HPIV3 L蛋白456处苯丙氨酸(或保守性相关的氨基酸)并由此可转移的RSV L的521处苯丙氨酸。在标志为缺失或插入的突变中，这些可以作为相应的缺失或插入被引入背景基因组或反基因组中，但缺失或插入蛋白片段的大小和氨基酸序列不一。
在前述引用的文献中表述了多种其它类型的突变，它们可以容易地工程化引入本发明重组PIV中，调节生长、减毒、免疫原性、遗传稳定性，或提供其它有利的结构和/或表型效果。例如，限制性标记可常规地引入C、D和/或V ORF缺失或剔除突变体反基因组或基因组中，以利于cDNA的构建和操作。
本发明中也可用的是使C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV疫苗病毒作为嵌合人-牛PIV产生的方法和组合物。这些重组体可通过用人或牛PIV的异源基因、基因组区段或单个或多个核苷酸，替代或附加于部分或完整的牛或人PIV基因组或反基因组，产生一种人-牛嵌合PIV基因组或反基因组(参见，1999年7月9日案卷号为15280-399000US)Bailey等的美国临时专利申请，名为“减毒的人-牛嵌合副流感病毒疫苗”，在此引用作为参考)。本发明的一个方面，人-牛嵌合PIV包含一个部分或完整的牛背景PIV基因组或反基因组，其组合了来自一个或多个人PIV的一个或多个异源基因或基因组区段。或者，人-牛嵌合PIV可包含部分或完整的人背景PIV基因组或反基因组，其组合了来自一个或多个牛PIV的一个或多个异源基因或基因组区段。选择用于异源插入或添加到背景基因组或反基因组中的基因和基因组区段包括N、P、C、D、V、M、F、HN、或L的任何野生型或突变基因或基因组区段。在一个模式实施方案中，HPIV3受体或背景基因组的N基因的ORF被BPIV3 N基因的ORF所替代，产生了在非人灵长类宿主中表现与亲本BPIV病毒类似的宿主范围限制表型的感染性重组子。优选的，该异源人或牛基因编码一个或多个PIV的保护性抗原，优选一个或多个HN和/或F糖蛋白或其免疫原结构域或表位，尽管其它蛋白可能也有助于保护性免疫应答，其因此也是优选的目标用于构建用于本发明的人-牛PIV嵌合病毒。
或者，具有C、D和/或V缺失或剔除突变的人-牛嵌合PIV可能包含编码一个PIV抗原蛋白的胞质结构域、跨膜结构域、胞外域或免疫原性表位的一个或多个基因组区段。这些免疫原蛋白、结构域和表位在免疫化的宿主中产生新的免疫应答。例如，来自人PIV的一个或多个免疫原基因或基因组区段，对牛背景基因组或反基因组的添加或替代，产生一种重组的、嵌合的病毒或亚病毒颗粒，其能产生针对一种或多种特定人“供体”PIV株的免疫应答，而该牛骨架提供了减毒表型，使该嵌合体成为疫苗发展中有用的候选疫苗。
在C、D和/或V ORF中具有突变的人-牛嵌合PIV的构建，是通过将部分PIV背景基因组或反基因组中对应的基因或基因组区段替代为异源基因或基因组区段。或者，该异源基因或基因组区段可以被添加到例如一个基因的3’或5’非编码区，作为一个额外的基因或基因组区段组合一个完整的PIV背景基因组或反基因组(或部分背景基因组或反基因组，当缺失其它基因或基因组区段时)。该异源基因或基因组区段可以被添加到部分或完整PIV背景基因组或反基因组的基因间隔区，从而不破坏该背景基因组或反基因组中的读码框。或者，该异源基因或基因组区段可以在相应于其相应基因或基因组区段的野生型基因位置上被加入或替代到部分或完整PIV背景基因组或反基因组中，其对应的基因或基因组区段由此被替代或移位(如到更加远离启动子的位置)。其它一些实施方案中，部分或完整PIV背景基因组或反基因组中，异源基因或基因组区段可以在比其对应的基因或基因组区段的野生型基因位置更加接近或远离启动子的位置加入或替代，分别可以增强或降低该异源基因或基因组区段的表达。这些和所引用参考文献中所述的修饰可以引入本发明C、D和/或V ORF缺失和剔除突变体中。
产生嵌合PIV的异源免疫原蛋白、结构域或表位的引入尤其适用于在免疫化宿主中产生新的免疫应答。来自一个供体PIV的免疫原基因或基因组区段，对不同株的PIV受体基因组或反基因组的添加或替代所产生的免疫应答针对供体亚型或株、受体亚型或株、或针对二者。为达到这一目的，构建表达嵌合蛋白的C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV，如表达免疫原蛋白，其特异于一种PIV的细胞质尾和/或跨膜区与特异于另一种PIV胞外域融合，产生人-牛融合蛋白，或具有两种不同人PIV结构域的融合蛋白。优选实施方案中，C、D和/或V ORF缺失或剔除突变PIV基因组或反基因组在重组病毒颗粒或亚病毒颗粒中编码同时具有人和牛二者的糖蛋白结构域或免疫原性表位的嵌合糖蛋白。例如，编码人PIV HN或F糖蛋白的糖蛋白胞外域的异源基因组区段，可以与编码相应牛PIV3 HN或F糖蛋白的胞质结构域和/或跨膜结构域的多核苷酸序列(即，基因组区段)相连，形成人-牛嵌合PIV基因组或反基因组。
其它一些实施方案中，用于疫苗制剂中的C、D和/或V ORF缺失和剔除突变体可容易地被修饰，以适应循环病毒的抗原漂移。典型的，修饰发生在HN和/或F蛋白中。一种PIV株的完整HN或F基因，或编码其特定免疫原区的一个基因区段，通过替代不同PIV株或亚型受体克隆中的相应区段，或通过添加该基因的一个或多个拷贝，引入嵌合PIV基因组或反基因组cDNA，产生多种抗原形式。修饰后的PIV克隆的子代病毒可以用于抗一些PIV株的疫苗制剂。
人PIV的编码和非编码序列(如启动子、基因末端、基因起始、基因间区或其它顺式作用元件)经对应的异源部分如另一种人PIV或牛或鼠PIV的序列替代后，产生具有多种可能的减毒或其它表型效果的嵌合PIV。特别的，宿主范围和其它期望表型来自用牛或鼠PIV基因引入人PIV背景中，其中牛或鼠基因在人细胞中不能有效作用(如，由于异源序列或蛋白与生物交互作用的人PIV序列或蛋白(即通常与被替代序列或蛋白协作，参与病毒转运、翻译、装配等的序列或蛋白)不相容，或更典型的，与在许可和许可程度低的宿主之间存在宿主范围限制差异的一种细胞蛋白或细胞环境的其它方面不相容)。在模式实施方案中，基于已知的牛和人PIV结构和功能方面，选择牛PIV序列引入人PIV。
本发明其它方面中，产生了C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV，其中嵌合基因组或反基因组进一步通过引入一个或多个在产生的嵌合病毒或亚病毒颗粒中特定导致产生减毒或其它期望表型的突变被修饰。这些突变可以重新产生，并根据合理设计的诱变方式检测其减毒效果。或者，这些突变可以从现存的生物学来源突变PIV中鉴定，并引入本发明C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV中。这些重组PIV提供了疫苗制剂所须的上述改善的减毒和免疫原特性。文中，以上引用的文献说明了具有替代到部分HPIV3背景反基因组中的HPIV1HN和F基因的嵌合PIV重组体的构建，其进一步被修饰，以包含在HPIV3 JS cp45中发现的一个或多个减毒突变。一个这种嵌合重组体包含cp45 L基因中发现的所有减毒突变。也曾发现显示异源(HPIV1)HN和F基因外的所有cp45突变都可以引入HPIV3-1重组体中，以产生一个减毒的嵌合候选疫苗。
引入C、D和/或V ORF缺失和剔除突变体的来自生物学来源PIV的减毒突变，可以天然存在或可以通过已知的诱变方法引入野生型PIV。例如，不完全减毒的亲本PIV株可能通过病毒在细胞培养时添加化学诱变剂而产生，通过选择亚适温度时传代的病毒以诱导生长限制突变，或通过选择在细胞培养中产生小噬菌斑的被诱变病毒，方法在以上的引用文献中有述。
“生物学来源的PIV”是指任何不通过重组方式产生的PIV。因此生物学来源的PIV包括所有天然存在的PIV，包括如具有野生型基因组序列的天然存在的PIV，和具有与参照野生型RSV序列相比有等位基因差异或突变基因组差异的PIV，例如具有特异导致产生减毒表型的突变的PIV。同样，生物学来源的PIV包括亲本PIV经人工诱变和选择方法产生的PIV突变株。
如上所述，可以几种方式产生足够减毒的生物学来源的PIV。其中之一包括细胞培养中部分减毒的病毒在渐低的减毒温度中传代。例如，部分减毒的突变体在细胞培养中低于最适温度下的传代而产生。因此采用cp突变体或其它部分减毒PIV突变株，以使其在低温培养时通过传代而有效生长。与部分减毒的亲本相比，选择冷传代突变PIV显著降低了衍生株的任何残存毒性。
另外，特定突变可以通过对部分减毒亲本病毒进行化学诱变引入生物学来源的PIV中，如引入ts突变，或当该病毒已是ts突变时，引入额外的ts突变使足以产生比该减毒衍生物ts表型更加强的减毒和/或稳定性。ts突变引入PIV的方法包括，根据已知方法使病毒在诱变剂(如5-氟尿苷)存在时复制。也可以使用其它化学诱变剂。产生减毒的ts突变可产生在任何PIV基因内，尽管其特别可能的靶是聚合酶(L)基因。
在本发明使用的模式减毒PIV中，复制温度敏感性的水平，是通过比较其在许可温度和在几种限制性温度时的复制来确定。将与其在许可温度时相比复制下降100倍或更多倍的最低温度作为其截止温度。在实验动物和人中，PIV的复制和毒性都与该突变体截止温度相关。
JS cp45 HPIV3被认为是相对遗传稳定、高免疫原性和具有满意的减毒性。对这种包含多种所述单个突变和组合突变的生物学来源和重组病毒的核苷酸序列分析显示，减毒增加的每个水平都与特定核苷酸和氨基酸替代相关。上述引用文献也公布了如何常规地区分沉默的偶发突变和以下突变，它们因感染性PIV克隆基因组或反基因组中引入的独立或组合形式突变产生表型差异。该过程还包括对亲本和衍生病毒的表型特征进行评估，检测出导致如减毒、温度敏感、冷适应、小噬菌斑和宿主范围限制等这些期望性状的突变。
这样发现的突变被集结成一个“菜单”，可以按需要以单独或组合形式引入，以调整C、D和/或V ORF缺失和剔除突变体的相关性状，如减毒、免疫原性、对减毒表型回复突变的遗传抗性等。与以上所述相符，从cDNA中得到感染性PIV的能力使可以在C、D和/或VORF缺失和剔除突变体中引入具体的工程化变化。特别的，用感染性重组PIV来检测生物学来源减毒PIV株中具体的突变，如特定导致产生ts、ca、att和其它表型的突变。由此产生需要的突变，并引入重组的、C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV疫苗株中。从cDNA中得到PIV的能力使能够将突变单独或以各种选择的组合，常规地引入全长cDNA克隆中，随后可以容易地确定具有这些所引入突变的被援救重组病毒的表型。
通过在感染性PIV克隆中鉴定并引入与期望表型(如cp或ts表型)有关的特定的生物学来源突变，本发明提供了在鉴定的突变处，或位于其紧邻处的其它位点特异性修饰。多数生物学来源PIV中的减毒突变是单核苷酸位点改变，但也可利用重组技术将其它“位点特异性”突变引入生物学来源的或重组PIV中。此处所述位点特异性突变包括1-3直到约5-15或更多已变核苷酸(如变自野生型PIV序列，或选择的突变PIV株序列，或经诱变的亲本重组PIV克隆)的插入、替代、缺失或重排。这类位点特异性突变可被引入选择的生物学来源的点突变处，或其区域内。或者，突变可以引入PIV克隆的其它区域，如顺式作用调控区或编码蛋白活性位点、结合位点、免疫原性表位等的核苷酸序列或其附近。位点特异性PIV突变体典型的具有一个期望的减毒突变，但可能还表现与减毒无关的其它表型变化，如增强或扩大的免疫原性和/或改善的生长。位点特异性突变的进一步范例包括在决定减毒点突变的密码子处引入额外的稳定的核苷酸改变的重组PIV。如可行，在亲本突变PIV或重组PIV克隆中决定减毒氨基酸变化的密码子处，引入两个或更多核苷酸替代，产生对减毒表型的回复具有遗传抗性的生物学来源或重组PIV。其它一些实施方案中，位点特异性的核苷酸替代、插入、缺失或重排被引入靶核苷酸位置的上游(N末端方向)或下游(C末端方向)(如从1到3，5-10，直到15核苷酸或更靠近5’或3’端)，以例如构建或消除现有的顺式作用元件。
除了单和多点突变和位点特异性突变，此处公布的C、D和/或VORF缺失和剔除突变PIV的变化包括除缺失或消除的C、D和/或V ORF或基因组区段以外的整个基因或基因组区段的缺失、插入、替代或重排。基于变化的特点(即，少量碱基可能被改变以插入或消除一个免疫原性表位或改变一个小基因组区段，而大量碱基参与基因或大的基因组区段的添加、替代、缺失或重排)，这些突变可以改动供体或受体基因组或反基因组中少量碱基(如，从15-30碱基，到35-50碱基或更多)，大量核苷酸(如，50-100，100-300，300-500，500-1000个碱基或更多)，或几乎全部或全部基因(如，1000-1500，1500-2500，2500-5000个，500-65000个核苷酸或更多)。
在其它方面，本发明提供了来自生物学来源PIV的突变(如cp和ts突变)附加于重组PIV克隆中，在这进一步修饰的PIV克隆中伴随有涉及相同或不同基因的其它突变类型。每个PIV基因的表达水平可被选择性地改变，或整体或部分，单独或组合，被添加、缺失、替代或重排，以获得表现新的疫苗特征的C、D和/或V ORF缺失或剔除突变PIV。因此，除了来自生物学来源PIV突变体的减毒突变外，或与之组合，本发明也提供了基于对感染性PIV克隆遗传工程化的多种使之减毒或改变C、D和/或V ORF缺失或剔除突变PIV表型的其它方法。编码靶基因或基因组区段(包括嵌合PIV基因组或反基因组中用于引入感染性克隆的供体或受体基因或基因组区段)的分离的多核苷酸序列上可产生多种改变。更特定的，本发明为了在重组PIV中获得期望的结构和表型改变，许可引入使一个或多个来自亲本基因组或反基因组的核苷酸缺失、替代、引入或重排的突变，以及缺失、替代、引入或重排整个基因或基因组区段的突变，到C、D和/或V ORF缺失或剔除突变PIV克隆内。
因此提供了C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV中的修饰方法，其中除了缺失或去除的C、D和/或V ORF或基因组区段外，仅改变或消除了选定基因的表达，例如，在选定PIV的编码序列中引入终止子，改变与一个PIV基因与可操作连接启动子的相对位置，引入上游起始密码子以改变其表达速率，修饰(如，通过改变位置、变动现有序列或用一个异源序列替代现有序列)GS和/或GE转录信号以改变其表型(如生长和转录时的温度限制等)，和其它决定病毒复制、选定基因的转录或选定RNA的翻译的变化程度和性质的缺失、替代、添加和重排。文中，任何非生长所必须的PIV基因都可以在重组PIV中被消除或修饰，以在毒性、病原性、免疫原性和其它表型特征方面产生期望的效果。
此外，PIV基因组或反基因组中也可产生许多其它遗传改变，以单独或与生物学来源突变PIV来源的一个或多个减毒突变一起，引入人-牛嵌合PIV，例如用以调整其生长、减毒、免疫原性、遗传稳定性或其它有利的结构和/或表性效果。前述的引用文献中也公布了这些附加类型的突变，且其可容易地工程化引入本发明人-牛嵌合PIV。例如，可以在人-牛嵌合PIV反基因组或基因组中常规地引入限制性位点标记，以促进cDNA的构建和操作。
本发明也提供了在C、D和/或V ORF缺失或剔除突变PIV中的遗传修饰，其改变或消除了靶C、D和/或V ORF外所选择的基因或基因组区段的表达，且不从PIV克隆中去除该基因或基因组区段。例如，这可以通过引入改变一个起始密码子编码排列或在选择的编码序列中引入终止密码子的突变，改变基因位置或引入上游起始密码子以改变其表达，改变GS和/或GE转录信号以改变表型(如生长，转录中的温度限制等)来实现。本发明更详细的方面中，提供C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV，其除靶C、D和/或V ORF外的基因的表达在翻译水平被消除，该基因或其区段没有缺失，例如通过如在翻译读码框(ORF)中引入多个翻译终止子。这产生了活的病毒，其一个选择的基因在翻译水平沉默，但该基因未缺失。其它实施方案中，多个终止子被引入靶ORF中。或者，一个突变被引入RNA编辑位点，或引入改变起始密码子所决定的氨基酸的突变。这些剔除病毒形式在组织培养中常表现生长速率降低和小噬菌斑。因此，这些方法提供了其它的新型的减毒突变，其消除非主要病毒保护性抗原的病毒基因的表达。文中在未缺失基因或基因组区段产生的剔除病毒表型，也可以通过此处所述缺失诱变的方法获得，以有效地排除可能恢复靶蛋白合成的纠正性突变。C、D和/或V ORF缺失和剔除突变体的几种其它基因剔除可以利用本领域已知的其它设计和方法获得(例如，Kretschmer等，Virology 216：309-316，1996；Radicle等，Virology 217：418-412，1996；Kato等，EMBOSS J.16：178-587，1987；Schneider等，Virology 277：314-322，1996；在此分别引用作为参考)
引入本发明C、D和/或V ORF缺失或剔除突变PIV中的其它突变包括直接作用于顺式作用信号的突变，这可以利用PIV微基因组突变分析检测出。例如对前导序列、非转录尾序列和侧翼序列的插入和缺失分析检测出病毒的启动子和转录信号，并提供了一系列与RNA复制或转录下降的各种水平相关的突变。这些顺式作用信号的饱和诱变(每个位点轮流改为各种核苷酸)也检测出许多降低(或一种情况是增加)RNA复制或转录的突变。此处所述任何突变都可插入C、D和/或V ORF缺失或剔除突变PIV基因组或反基因组中。以上引用文献中描述的PIV微基因组可辅助完整的反基因组cDNA对反式作用蛋白和顺式作用RNA序列的评价和操作。
C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV中的其它突变包括基因组3’末端被其反基因组的对应部分替代，随之改变了RNA复制和转录。一个模式实施方案中，特定PIV蛋白(如保护性HN和/或F抗原)的表达水平可因其天然序列被所合成并设计的符合有效翻译的序列替代而增加。文中显示，密码子的使用是哺乳动物病毒蛋白翻译水平的主要影响因素(Haas等，Current Biol.6：315-324，1996，在此引用作为参考)。通过重组，使编码PIV HN和/或F蛋白(二者是主要保护性抗原)的mRNA中使用的密码子最适合，可使这些基因的表达增加。
另一个模式实施方案中，修饰了一个选定PIV基因的翻译起始位点(优选包括-3位置处的核苷酸)周围的序列(单独或同时引入一上游起始密码子)，因决定了翻译的上/下游调节而改变了PIV基因的表达。另外，或与此处所述的其它修饰组合，改变病毒任何选定基因的转录GS或GE信号，可调节C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV的基因表达。其它实施方案中，C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV的基因表达的调节发生在转录水平。一个方面中，将PIV基因图谱中选定基因的位置改为更为接近或远离启动子，从而该基因的表达将分别更高效或更低效。根据这方面，对特定基因表达进行调节，产生比野生型水平降低或增加2倍，更典型的是4倍，上至10倍或更高的基因表达，同时被交互地位置替代的基因的表达水平有相当量的下降。这些和其他转位变化，产生具有减毒表型的新的C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV，如具有参与RNA复制的选定病毒蛋白表达的下降，或具有如抗原表达增加之类的其它期望性状。
本发明感染性C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV也可根据这里公布的方法和组合物进行工程化，增强免疫原性并诱导比野生型PIV或亲本PIV感染所导致的更强的保护。例如，来自PIV异源株或型的或如RSV的非PIV的免疫原性表位可通过在编码基因组或反基因组的多核苷酸序列上适当的核苷酸变化，被加入重组克隆。另外，本发明突变PIV可被工程化地加入或消除(如通过氨基酸插入、替代或缺失)免疫原、蛋白结构域或与期望或不期望免疫反应相关的特殊蛋白。
本发明方法中，额外的基因或基因组区段可能被插入C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV基因组或反基因组中，或其附近。这些基因可与受体基因受相同的调控，或受一套独立转录信号的调控。目的基因包括以上说明的PIV基因和非PIV基因。目的非PIV基因包括编码细胞因子(如IL-2到IL-18，尤其是IL-2、IL-6、IL-12、IL-18)、IL-γ和富含T辅助细胞表位的蛋白的基因。这些额外的蛋白可作为独立蛋白或现存PIV蛋白(如HN或F)的多余拷贝表达。这能够在数量和质量上改变和提高抗PIV的免疫应答。
C、D和/或V ORF缺失或剔除突变PIV中涉及全部病毒基因或基因组区段的缺失、插入、替代和其它突变产生非常稳定的候选疫苗，在免疫抑制的个体中尤其重要。这些改变多数导致疫苗株的减毒，其它则特定导致不同类型的期望表型改变。例如，附属(即体外生长所不必须的)基因编码特异地干扰宿主免疫的蛋白，是良好的候选疫苗(参见Kato等，EMBO J.16：578-87，1997，在此引用作为参考)。疫苗病毒中消除这类基因将降低毒性和致病性，并/或提高免疫原性。
本发明更详细的方面，C、D和/或V ORF缺失和剔除突变体被用作其它病原(特别是如RSV等呼吸道病原)保护性抗原的载体。例如，重组PIV可以被工程化包含编码RSV保护性抗原的序列，以产生感染性减毒疫苗病毒。RSV cDNA的克隆和其它公布于一些文献中：1995年9月27日美国临时专利申请60/007,083；1996年9月27日美国专利申请08/720,132；1996年7月15日美国临时专利申请60/021,773；1997年5月9日美国临时专利申请60/046,141；1997年5月23日美国临时专利申请60/047,634；1997年7月15日美国临时专利申请08/892,403(相应于国际申请WO98/02530)；1999年4月13日名为“从克隆的核苷酸序列制备减毒的嵌合呼吸道合胞病毒”的美国临时专利申请(案卷号17634-000520)；1999年4月13日Murphy等名为“从克隆的核苷酸序列制备减毒的负链RNA病毒”的美国临时专利申请(案卷号17634-000600)；Collins等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 92：11563-11567，1995；Bukreyev等，J.Virol.70：6634-6641，1996；Juhasz等，J.Virol.71(8)：5814-5819，1997；Durbin等，Virology235：323-332，1997；He等，Virology 237：249-260，1997；Baron等，J.Virol.71：1265-1271，1997；Whitehead等，Virology 247(2)：232-9，1998a；Whitehead等，J.Virol.72(5)：4467-4471，1998b；Jin等，Virology251：206-214，1998；Whitehead等，J.Virol.73(4)：3438-3442，1999；Burkreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：2367-2372，1999；为各种目的分别在此全文引用作为参考)。
根据本发明的这方面，提供了包括至少一个RSV序列的C、D和/或V ORF缺失和剔除突变PIV。例如，HPIV3的单个基因可被来自人RSV对应的基因替代。或者，一个被选定的异源基因或基因组区段(如编码RSV糖蛋白细胞质尾、跨膜区或胞外域)替代了HPIV3中对应基因组区段，例如在HPIV3的相同基因或HPIV3中不同基因内的对应部分，或者加入HPIV3基因组或反基因组的非编码区中，产生嵌合的PIV-RSV糖蛋白。一种实施方案中，人RSV F基因的一个基因组区段替代了对应的HPIV3基因组区段，产生编码嵌合蛋白的构建体，如，其中PIV的胞质尾和/或跨膜区融合了RSV的胞外域，产生一种新的减毒病毒，和/或抗PIV/RSV二者的多价疫苗。
除了上述对C、D和/或V ORF缺失或剔除突变体的修饰外，也可在PIV克隆中制造不同或额外的修饰，以利于操作，如在各种基因间隔区或其它位置插入唯一的限制性位点(如G和F基因间插入唯一的StuI位点)。不翻译的基因序列也可以被去除，以增加插入外源序列的能力。
本发明其它方面中，提供了产生分离的感染性PIV的组合物(如具有人-牛嵌合PIV编码cDNA的多核苷酸和载体)。利用这些组合物和方法，可以从一个PIV基因组或反基因组、核壳蛋白(N)、核壳磷蛋白(P)和一个大的聚合酶蛋白(L)中产生感染性PIV。本发明的相关方面中，提供了在重组PIV中引入前述结构和表型改变以产生感染性减毒疫苗病毒的组合物和方法。
可利用多种已知方法，将之前定义的突变引入感染性C、D和/或V ORF缺失或剔除突变克隆中。关于DNA的“感染性克隆”，是指合成或其它来源的cDNA或其产物，可转录出作为产生感染性病毒或亚病毒颗粒基因组的模板的基因组或反基因组RNA。因此，可以利用传统方式(如定点诱变)将定义的突变引入基因组或反基因组的cDNA拷贝。此处所述使用基因组或反基因组cDNA的亚片段装配完整基因组或反基因组cDNA的优势是，每个区域都可以分别操作(越小的cDNA越易装配)，因此易于装配出完整cDNA。因此，该完整基因组或反基因组cDNA或其任何亚片段可用作寡核苷酸定向诱变的模板。这可通过单链噬菌粒形式介导(如使用伯乐实验室(Richmond，CA)的Muta-gene试剂盒)，或直接用双链噬菌粒做模板(如使用Strategene(La Jolla，CA)的Chameleon诱变试剂盒)，或通过用包含目的突变的寡核苷酸引物或模板中任何的一个进行聚合酶链式反应来完成。然后可以将一个突变的亚片段装配于该完整基因组或反基因组cDNA中。还有许多已知并可得的产生突变的技术，可用于在PIV基因组或反基因组cDNA中产生目的突变。突变范围不一，可以从单核苷酸改变到包含一个或多个基因或基因组区段的大cDNA片段的替代。
因此，在一个作为范例的实施方案中，利用伯乐的Muta-gene噬菌粒体外诱变试剂盒引入突变。简述如下，编码PIV基因组或反基因组一部分的cDNA克隆到质粒pTZ18U中，并转化CJ236细胞(LifeTechnologies)。按生产商的建议制备噬菌粒制剂。通过在该基因组或反基因组的需要位点引入一个改变的核苷酸，设计出用于诱发突变的寡核苷酸。扩增带有遗传改变的基因组或反基因组的质粒，突变片段被重新引入该全长基因组或反基因组克隆。
本发明也提供了从一个或多个分离的多核苷酸(如一个或多个cDNA)中产生感染性人-牛嵌合PIV的方法。根据本发明，构建编码PIV基因组或反基因组的cDNA，使其与必须的病毒蛋白在细胞内或体外共表达以形成感染性PIV。“PIV反基因组”是指作为子代PIV基因组合成模板的经分离的正义多核苷酸分子。优选，构建的cDNA是相应于复制中间体RNA的正义PIV基因组或反基因组，以降低其与编码产生转录复制核壳所必需蛋白的互补序列(如编码N、P和L蛋白的序列)的正义转录本杂交的可能。
本发明的重组PIV基因组或反基因组仅需要包含该病毒或亚病毒颗粒的感染性所必须的基因或其部分。此外，该基因或其部分可以多于一种多核苷酸分子形式提供，即，一个基因可以通过互补或类似方法来源于单独的核苷酸分子，或可直接由基因组或反基因组cDNA表达。
重组PIV是指一种PIV或PIV类的病毒或亚病毒颗粒，其直接或间接来自一个重组表达系统，或从重组表达系统所产生的病毒或亚病毒颗粒中增殖产生。该重组表达系统具有包含一个可操作地连接的转录单位的重组表达载体，该转录单位具有一个或几个遗传元件或对PIV基因表达有调控作用的元件，如启动子、一个可转录为PIV RNA的结构或编码序列，以及合适的转录起始和终止序列。
为了从cDNA所表达的基因组或反基因组中获得感染性PIV，将该基因组或反基因组与那些在以下情况中必须的PIV蛋白共表达，这些情况包括(i)产生可进行RNA复制的核壳；(ii)使子代核壳可进行RNA复制和转录。这种基因组核壳的转录提供了其它PIV蛋白，并引发有效感染。另外，共表达也可提供有效感染所需的其它PIV蛋白。
本发明感染性PIV是通过在细胞内或无细胞系统中共表达编码PIV基因组或反基因组RNA的一个或多个经分离的多核苷酸分子以及编码在产生转录复制核壳中必须的病毒蛋白的一个或多个多核苷酸分子来产生的。用于共表达产生感染性PIV病毒的蛋白包括：主要核壳蛋白(N)、核壳磷蛋白(P)、大的聚合酶蛋白(L)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶糖蛋白(HN)和基质蛋白(M)。PIV C、D、和VORF的产物也可用于该目的。
构建编码PIV基因组或反基因组的cDNA，使其与必须的病毒蛋白在细胞内或体外共表达以形成感染性PIV。“PIV反基因组”是指作为子代PIV基因组合成模板的分离的正义多核苷酸分子。优选，构建的cDNA是相应于复制中间体RNA的正义PIV基因组或反基因组，以降低其与编码对转录复制核壳必需的蛋白的互补序列的正义转录本杂交的可能。
本发明的一些实施方案中，重组PIV(rPIV)基因组或反基因组仅需要包含对该病毒或病毒颗粒的感染性所必需的基因或其部分。此外，该基因或其部分可以多于一种多核苷酸分子形式提供，即，一个基因可以通过互补或类似方法来源于单独的核苷酸分子。其它实施方案中，PIV基因组或反基因组编码病毒生长、复制和感染所必需的所有功能结构，而无须辅助病毒或质粒或辅助细胞系提供的病毒功能结构的参与。
“重组PIV”是指一种PIV或PIV类的病毒或亚病毒颗粒，其直接或间接来自一个重组表达系统，或从重组表达系统中产生的病毒或亚病毒颗粒中增殖产生。该重组表达系统具有包含一个可操作地连接的转录单位的重组表达载体，该转录单位具有一个或几个遗传元件或对PIV基因表达有调控作用的元件，如启动子、一个可转录为PIV RNA的结构或编码序列，以及合适的转录起始和终止序列。
为了从cDNA所表达的PIV基因组或反基因组中获得感染性PIV，将该基因组或反基因组与那些在以下情况中必须的PIV N、P和L蛋白共表达，这些情况包括(i)产生可进行RNA复制的核壳；(ii)使子代核壳可进行RNA复制和转录。这种基因组核壳的转录提供了其它PIV蛋白，并引发有效感染。另外，共表达也可提供有效感染所需的其它PIV蛋白。
PIV基因组或反基因组与上述病毒蛋白的共同合成也可在体外实现(无细胞系统)，如利用组合的转录-翻译反应，再转染细胞。另外，RNA基因组或反基因组也可在体外合成，并转染表达PIV蛋白的细胞。
本发明的某些实施方案中，编码生产可转录和翻译的核壳中所必需蛋白的互补序列由一个或多个辅助病毒提供。辅助病毒可以是野生型或突变型。优选，该辅助病毒与PIV cDNA编码的病毒在表型上可区分。例如，希望提供与该辅助病毒发生免疫反应，而不与PIV cDNA编码的病毒反应的单克隆抗体。这些抗体可以是中和抗体。一些实施方案中，可使用抗体亲和层析，将辅助病毒与重组病毒分开。可将突变引入PIV cDNA(如在HN或F糖蛋白基因中)，提供来自辅助病毒的抗原多样性，有助于这类抗体的获得。
本发明另外的实施方案中，N、P、L或其它期望的PIV蛋白由一个或多个非病毒表达载体编码，其可以与编码基因组或反基因组的表达载体相同或不同。也可根据需要包括其它蛋白，各由自己的载体编码，或由编码N、P、L或其它期望的PIV蛋白中的一个或多个或完整基因组或反基因组的载体编码。来自转染质粒的基因组或反基因组和蛋白的表达由T7 RNA聚合酶启动子控制下的各个cDNA产生，而该T7 RNA聚合酶启动子是由T7 RNA聚合酶表达系统(如表达T7RNA聚合酶的痘苗病毒MVA株重组子)的感染、转染、转导提供的(Wyatt等，Virology 210：202-205，1995，在此全文引用作为参考)。可通过转化哺乳动物细胞或成熟RNA或蛋白转染，获得该病毒蛋白和/或T7 RNA聚合酶。
构建用于本发明的PIV反基因组，通过排列克隆的cDNA区段(其集合代表了完整的反基因组)，通过PIV mRNA或基因组RNA反转录拷贝的聚合酶链式反应等实现(PCR述于美国专利4,683,195和4,683,202中和PCR方案：方法和应用指导(PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications)，Innis等，学术出版社，San Diego，1990，分别在此全文引用作为参考)。例如，得到的第一构建体包含具有从合适的启动子(T7 RNA聚合酶启动子)开始延伸的反基因组左臂末端的cDNA，该构建体装配在适当的表达载体中，如质粒、装配型质粒、噬菌体或DNA病毒载体。载体可通过诱变和/或合成多连接体的插入而修饰，这种多连接体带有便于装配的唯一的限制性位点。N、P、L或其它期望的PIV蛋白可装配于一个或多个载体上以便于制备。反基因组质粒右手末端可包含需要的其它序列，如侧翼的核酶和串联的T7转录终止子。核酶可以是锤头型(产生具有单个非病毒核苷酸的3’末端)(如Grosfeld等，1995，同上)，也可以是任何其它适合的核酶(如δ肝炎病毒的核酶，产生没有非PIV核苷酸的3’末端)(Perrotts等，Nature 350：434-436，1991，在此全文引用作为参考)。然后左和右手末端利用共同的限制性位点连接。
cDNA构建过程中或构建完成后，可在PIV基因组或反基因组中进行多种核苷酸的插入、缺失和重排。例如，可以合成特定需要的核苷酸序列，利用方便的限制性酶位点插入cDNA的合适区域。或者可使用如位点特异性诱变、丙氨酸扫描、PCR诱变或其它本领域现有技术将突变引入cDNA。
构建编码基因组或反基因组cDNA的其它方法，包括用改进的PCR条件进行反转录-PCR，以使亚单位cDNA成分降低至一或两个(如，在Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5695-5699，1994中所述的，在此引用作为参考)。其它实施方案中使用不同的启动子(如T3，SP6)或不同的核酶(如δ肝炎病毒的核酶)。增殖可使用不同的DNA载体(如装配型质粒)，以更能容纳大的基因组或反基因组。
编码基因组或反基因组的分离的多核苷酸(如cDNA)通过转染、电穿孔、机械插入、转导等方式插入合适的宿主，转染细胞是能够支持有效PIV感染的，如HEp-2、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero细胞。分离的多核苷酸序列的转染可通过磷酸钙介导的转染(Wigler等，Cell 14：725，1978；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics7：603，1981；Graham和Van der Eb，Virology 52：456，1973)、电穿孔(Neumann等，EMBO J.1：841-852，1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等编辑，Current Protocols in Molecular Biology，John Wileyand Sons，Inc.，New York，1987)、阳离子脂质介导的转染(Hawley-Nelson等，Focus 15：73-79，1993)或商业化转染试剂如LipofectACE(Life Technologies，Gaithersburg，MD)或其它同类物，引入培养细胞中(上述文献在此全文引用作为参考)。
如上所述，本发明一些实施方案中，N、P、L或其它期望的PIV蛋白由一个或多个辅助病毒编码，这种辅助病毒在表型上与编码基因组或反基因组的那些无显著差异。N、P、L或其它期望的PIV蛋白或其各种组合也可以由一个或多个表达载体编码，这种表达载体与编码基因组或反基因组的载体相同或不同。也可根据需要包括其它蛋白，其各由自己的载体编码，或由编码N、P、L和其它期望的PIV蛋白中的一个或多个或完整基因组或反基因组的载体编码。
通过提供感染性PIV克隆，本发明允许在PIV基因组(或反基因组)中重组产生广泛的改变，使得到特定导致期望表型改变的确定的突变。“感染性克隆”是指合成的或其它方式产生的可以直接进入感染性毒粒的cDNA或其产物RNA，而该感染性毒粒可以转录成作为感染性病毒或亚病毒颗粒模板的基因组或反基因组RNA。如上所述，许多常规方法(如定点诱变)可将特定的突变引入基因组或反基因组的cDNA拷贝中。此处所述用基因组或反基因组cDNA亚片段装配完整基因组或反基因组cDNA的优点在于，每个区域都可以分别操作，小的cDNA比大的cDNA容易操作，并容易装配出全长的cDNA。因此，完整基因组或反基因组cDNA或其选择的亚片段可用作寡核苷酸指导的诱变的模板。这可通过单链噬菌粒形式介导(如使用伯乐实验室(Richmond，CA)的MUTA-gen试剂盒)，或直接用双链噬菌粒做模板(如使用Strategene(La Jolla，CA)的Chameleon诱变试剂盒)，或通过用包含目的突变的寡核苷酸引物或模板中任何一个进行聚合酶链式反应来完成。然后可以将一个突变的亚片段装配于该完整基因组或反基因组cDNA中。还有许多已知并可得的产生突变的技术，可用于在本发明PIV基因组或反基因组cDNA中产生目的突变。
因此，在一个作为范例的实施方案中，突变利用伯乐的MUTA-gene噬菌粒体外诱变试剂盒引入。简述如下，编码PIV基因组或反基因组的cDNA克隆到质粒pTZ18U中，并转化CJ236细胞(LifeTechnologies)。按生产商的建议制备噬菌粒制剂。通过在该基因组或反基因组的需要位点引入一个改变的核苷酸，设计出用于诱发突变的寡核苷酸。扩增带有遗传改变的基因组或反基因组的质粒。
突变范围可以从单核苷酸改变到具有一个或多个基因或基因组区段的大cDNA片段的引入、缺失或替代。基因组区段可能相应于结构和/或功能域(如蛋白的胞质内、跨膜或胞外域)，活性位点(如介导与其它蛋白结合或其它相互作用的位点)，表位(如刺激抗体结合和/或体液或细胞免疫的位点)等。这方面有用的基因组区段范围从当基因组区段编码小的蛋白功能域(如表位)时的约15-35个核苷酸，至约50、75、100、200-500和500-1500或更多个核苷酸。
在感染性PIV中引入特定突变的能力有许多应用，包括PIV病原和免疫原机构的操作。例如PIV蛋白(包括N、P、M、F、HN和L蛋白，和C、D、V ORF产物)的功能可通过引入可以消除或降低蛋白表达水平或产生突变蛋白的突变来得以调节。各种基因组RNA的结构特征，如启动子、基因间隔区和转录信号，也可用本发明的方法和组合物常规操作。反式作用蛋白和顺式作用RNA序列的效果也可容易地确定，例如用完整反基因组cDNA，在平行分析中利用PIV小基因组(Dimock等，J.Virol.67：2772-2778，1993，在此全文引用作为参考)，其依赖拯救的状态可用于表征那些在非复制依赖性的感染性病毒中过强抑制从而难以回收的突变体。
本发明重组PIV内基因或基因组区段的某些替代、插入、缺失和重排(如编码选定蛋白或蛋白区域的基因组区段替代，如编码胞质尾、跨膜区或胞外域，表位位点或区域、结合位点或区域、活性位点或具有活性位点的区域等)在结构和功能上与来自相同或不同PIV或其它来源的现有“对应”基因或基因组区段相关。与野生性或亲本PIV或其它病毒株相比，修饰产生了具有期望表型变化的新重组子。例如，这类重组子可能表达一个PIV的胞质尾和/或跨膜区与另一个PIV的胞外域融合的嵌合蛋白。这类重组子的其它范例表达重复蛋白区域，如表达重复免疫原区域。
此处所述“对应”基因、基因组区段、蛋白或蛋白区域，典型的是异源来源(如来自不同的PIV基因)，或代表不同PIV型或株中的相同(即，同源或等位)基因或基因组区段。文中选择的典型的对应物具有总的结构特点，如每个对应物可能编码一个相当的蛋白或蛋白区，如胞质结构域、跨膜结构域、胞外域、结合位点或区域、表位位点或区域等。对应结构域和其编码基因组区段包含许多种的集合，其具有由在该结构域或基因组区段变异体之间相同的生物活性所定义的大小和序列变化。
用于产生本发明重组PIV的对应基因和基因组区段，以及这里公布的其它多核苷酸，常与被选择的多核苷酸“参照”序列(如其它选择的相当序列)具有基本同一性。此处所述“参照序列”是指用作序列比较的已定义的序列，例如全长cDNA的一个区段或基因，或一个完整的cDNA或基因序列。一般参照序列为至少20个核苷酸，经常是至少25个核苷酸，更多为至少50个核苷酸。因为两个多核苷酸可能(1)各具有一个彼此相同的序列(即，完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)进一步各包含二者间存在差异的序列，典型的两个(或更多)多核苷酸的序列比较是通过在“对比窗”上对比两个多核苷酸的序列，以发现并比较序列相似的局部区域。此处所述“对比窗”是指至少20个连续核苷酸位置的概念性区段，其中一个多核苷酸序列可以与至少20个连续核苷酸的一个参照序列相比较，并且与参照序列(不含有添加或缺失)相比较，其中该多核苷酸序列在对比窗的部分，可能包括两序列最优对比时20％或更少的添加或缺失(即间隙)。用于对对比窗进行序列对比的序列最优排列可通过以下方法进行：Smith和Waterman的局部同源算法(Adv.Appl.Math.2：482，1981；在此引用作为参考)，和Needleman&Lipman的同源对比算法(J.Mol.Biol.48：443，1970；在此引用作为参考)，Pearson&Lipman的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988；在此引用作为参考)，以及这些算法的计算机应用(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，于Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI，在此引用作为参考)，或通过检查，并选择出这多种方法产生的最佳排列(即，对比窗上序列相似性最高)。术语“序列同一性”指对比窗上两个多核苷酸序列相同(核苷酸逐个比较)。术语“序列同一性百分比”是比较对比窗上两个最优对比的序列，确定存在于两序列中的一致核酸碱基(如A、T、C、G、U或I)以产生相符位点的数量，用相符位点的数量除以对比窗中位点的总数(即窗的大小)，结果乘以100得到序列同一性百分比。此处所述术语“基本同一性”指一个多核苷酸序列的特征，其中该多核苷酸序列与参照序列在至少20个核苷酸的对比窗，经常是在至少25-50个核苷酸的对比窗中比较，具有至少85％的序列同一性，优选至少90％-95％的序列同一性，更多的是至少99％的序列同一性，序列同一性百分比的计算是通过在对比窗上，比较参照序列和可能包括总共20％或更少的该参照序列的缺失或添加的多核苷酸序列而计算得出的。该参照序列可能是一个大序列的一个子集。
除了这些多核苷酸序列关系，本发明重组PIV编码的蛋白和蛋白区域也典型的选择具有保守性关系，即，与选择的参照多肽具有基本的序列同一性或序列相似性。当用于多肽，术语“序列同一性”指肽在相应位置上具有相同氨基酸。术语“序列相似性”指肽在相应位置上具有相同或相似氨基酸。术语“基本同一性”指两个肽序列，当最优排列时(如用程序GAP或BESTFIT)，具有至少80％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性，更优选的是至少95％的序列同一性或更高(如99％的序列同一性)。术语“基本相似性”指两个肽序列的序列相似百分比相当。优选的，不一致的残基位点因保守氨基酸替代而差异。保守氨基酸替代是指具有相似侧链的残基可互换。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的氨基酸是丝氨酸、苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸；具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸、甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，天冬酰胺-谷氨酰胺。此处对氨基酸的简写依据传统用法(Immunology-A Synthesis，第2版，E.S.Golub&D.R.Gren.编辑，Sinauer Associates，Sunderland，MA，1991，在此引用作为参考)。这20种常规氨基酸的立体异构体(如D-氨基酸)、非天然氨基酸(如α，α-二取代氨基酸)、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也是本发明多肽的合适成分。非常规氨基酸包括4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、ω-N-甲基精氨酸，以及其它相似氨基酸和亚氨基酸(如4-羟脯氨酸)。此外，氨基酸还可以经糖基化和磷酸化等修饰。
根据本发明选择候选疫苗病毒时，用已知的方法决定活性、减毒性和免疫原性的标准。最希望用于本发明疫苗的病毒必须有活性，稳定的减毒表型，在免疫宿主体内有复制(即使水平低)，并在受接种者中有效地诱导免疫应答的产生，足以赋予对抗之后野生型病毒感染所导致的严重疾病的保护性。本发明重组PIV不仅是有活性，比先前的候选疫苗更适合地减毒的，而且在体内遗传上更稳定—仍具有刺激保护性免疫应答的能力，同时，因多处修饰的存在可将这种保护扩展，如，诱导抗不同病毒株系或亚型的保护，或一种不同的免疫基础赋予其这种扩展的保护，如分泌型与血清型免疫球蛋白，或细胞免疫等。
本发明重组PIV可以在多种被熟知并通常认可的体内和体外模型中检测，以确认疫苗使用中的足够减毒、对表型回复的抗性和免疫原性。体外分析中，修饰了的病毒(如多次减毒的、生物学来源的或重组PIV)被测试如病毒复制的温度敏感性(即ts表型)、小噬菌斑或其它期望的表型。修饰了的病毒进一步在PIV感染的动物模型中测试。在此引用的各种文献中描述了多种动物模型。评价PIV候选疫苗的减毒和免疫原性的PIV模式系统，(包括啮齿类动物和非人灵长类)，在本领域被广泛接受，从中获得的数据与人中PIV感染、减毒和免疫原性非常一致。
与以上所述一致，本发明还提供用于疫苗的分离的感染性重组PIV病毒组合物。作为疫苗一个成分的减毒病毒典型的是经分离和纯化的形式。分离的是指处于非野生型病毒所处的天然环境的PIV，如处于被感染人的鼻咽处。更常见的，分离的是指包括该减毒病毒细胞培养或其它人工培养基的一个成分，其中病毒可繁殖，并在控制的背景下定性。例如，本发明的减毒PIV可在感染的细胞培养物中产生，从细胞培养物中分离获得，并被加入稳定剂。
本发明重组PIV可直接用于疫苗制剂中，或根据需要，利用本领域技术人员所熟知的冷冻干燥方法进行冷冻干燥。冻干的病毒典型的保存在约4℃。使用前，冻干的病毒重溶于稳定性溶液中(如盐溶液、SPG、Mg++和HEPES)，其中也可能存在或不存在佐剂，以下将进一步说明。
本发明PIV疫苗包含按此处所述方法产生的、有效致免疫量的PIV作为活性成分。修饰的病毒可与一种生理上可接受的载体和/或佐剂共同引入宿主。本领域已知的载体有：水、缓冲的水、0.4％盐、0.3％甘氨酸，透明质酸等。得到的溶液可包装使用，或冷冻干燥，冻干的制剂在给药之前与无菌溶液混合，方法如上所述。根据要求，组合物可能包含药学上可接受的辅助物质，使其接近生理状态，如pH调节和缓冲剂、渗涨度调节剂、湿润剂等，例如：乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。可接受的佐剂包括不完全弗氏佐剂、MPLTM(3-O-去乙酰单磷酸脂质A；RIBI ImmunoChem Research，Inc，Hamilton，MT)和IL-2(遗传研究所，剑桥，MA)，以及其它本领域熟知的合适佐剂。
用如上所述的PIV组合物经喷雾、滴剂、口服、局部或其它途径免疫后，宿主的免疫系统产生特异于PIV病毒蛋白(如F和HN糖蛋白)的抗体作为应答。用如上所述的有效致免疫量的PIV接种，宿主至少部分或完全地对PIV的感染免疫，或对轻微或严重PIV感染有抗性，尤其在下呼吸道中。
疫苗接种的宿主可以是任何对PIV或其它近源病毒感染敏感，且对接种株的抗原产生保护性免疫应答的动物。相应的，本发明提供了制作多种用于人和动物的疫苗的方法。
包含本发明PIV的疫苗组合物给药对PIV敏感或易受PIV感染攻击的宿主，以增强该宿主的自身免疫力。这种量是“有效免疫原剂量”。使用中，在有效剂量内给药的PIV精确量依赖于宿主健康状态和体重、给药方式、制剂性质等，但一般范围是从每个宿主约103-约107或更多噬菌斑形成单位(PFU)的病毒，常见的是每个宿主约104-约106噬菌斑形成单位(PFU)的病毒。任何情况时，疫苗制剂应提供足量的本发明经修饰的PIV，以有效保护宿主对抗严重的或威胁生命的PIV感染。
根据本发明产生的PIV可以和其它PIV血清型或株病毒组合，达到抗多种PIV血清型或株的保护效果。此外，抗多种PIV血清型或株的保护效果也可通过组合多种血清型或株的保护性表位于一个病毒中。典型的，当给药多种病毒时混合同时给药，但也可以分别给药。一种毒株的免疫可以产生抗同种或不同血清型不同株的保护。
一些情况下，可能希望将本发明PIV疫苗与诱导对其它药物(特别是儿童期病毒)保护性应答的疫苗组合使用。本发明另一些方面中，PIV可用作其它病原(如呼吸道合胞病毒RSV或麻疹病毒)保护性抗原的载体，将编码这些保护性抗原的序列引入用来制造感染性PIV的PIV基因组或反基因组中。
对于所有个体，重组PIV疫苗的精确给药量以及给药时间和重复性依赖于宿主健康状态和体重、给药方式、制剂性质等，但剂量范围一般是从每个患者约103-约107或更多噬菌斑形成单位(PFU)的病毒，更常用的是每个患者约104-约106 PFU的病毒。任何情况时，疫苗制剂应提供足量的减毒PIV，以有效刺激或诱导抗PIV的免疫应答，如可通过补体活化、噬菌斑中和和/或酶联免疫分析，及其它方法进行确定。这方面，也需要监视个体是否有上呼吸道疾病出现的迹象和症状。对给药猕猴，该疫苗的减毒病毒在受接种者鼻咽中的复制水平，比野生性病毒低约10倍或更低，比不完全减毒PIV低约10倍或更低。
新生儿和幼儿中，需要多次给药以诱导足够水平的免疫。给药开始于出生后第一个月，儿童期按需要间隔给药，如隔2个月，6个月，1年，2年，以维持对天然(野生型)PIV感染的足够抗性。相似的，对重复性或严重PIV感染特别敏感的成人可能需要多次免疫以建立和/或维持保护性免疫应答，包括：医务工作者、护理工作者、家庭中有儿童的成员、老人、心肺功能损坏的个体。诱导的免疫水平可通过检测中和分泌和血清抗体确定，并需要调整剂量或重复接种以维持合适的保护水平。进一步，不同的疫苗病毒给药不同的受体组。例如，表达细胞因子或其它富含T细胞表位的蛋白的工程化PIV株可能特别适宜成人，而非幼儿。
根据本发明产生的PIV疫苗可以组合表达PIV其它亚型或株蛋白的病毒，以产生抗多种PIV亚型或株的保护。或者，该疫苗病毒可以包含工程化引入一个PIV克隆的多种PIV亚型或株的保护性表位。
本发明的PIV疫苗诱导抗因后来感染野生型PIV时产生的严重下呼吸道疾病(如肺炎和细气管炎)的免疫应答。尽管这种自然循环的病毒仍有感染性，特别在上呼吸道，其接种导致鼻炎发病几率的降低以及对后来的野生型感染增强的抗性。接种后，出现可检测水平的宿主造成的血清抗体，和可在体外和体内中和同源(同一亚型)野生型病毒的分泌性抗体。许多情况下宿主抗体也能中和不同的非疫苗亚型的野生型病毒。
本发明优选的PIV候选疫苗显示比在人体内自然循环的野生型病毒显著降低的毒性。该病毒足够减毒使感染症状在大多数免疫个体中不发生。一些情况时，该减毒病毒仍然可能分布到未经免疫的个体中。但由于其毒性基本去除，在免疫和偶然宿主中不会发生严重的下呼吸道感染。
确定PIV候选疫苗的减毒水平可通过例如量化被免疫宿主呼吸道中的病毒量，并将其与野生型PIV或其它被认为是候选疫苗株的减毒PIV的相应量比较。例如，在高度敏感的宿主(如猩猩)上呼吸道中，本发明的减毒病毒复制与野生型病毒复制水平相比，被很大程度地限制，如降低10-1000倍。为了进一步降低鼻液溢的发展(其与病毒在上呼吸道中的复制相关)，一个理想的候选疫苗病毒应表现在上下呼吸道复制水平都降低的性质。但为了赋予免疫个体保护，本发明的减毒病毒应在人中有足够的感染性和免疫原性。确定PIV在感染宿主鼻咽中水平的方法是本领域所熟知的。
本发明疫苗诱导的免疫水平可通过测定中和分泌性和血清型抗体的量来监测。基于检测结果，按需要调整疫苗剂量或重复接种，以维持理想水平的保护。进一步，不同的疫苗病毒可能适宜不同的受体组。例如，表达富含T细胞表位的其它蛋白的工程化PIV株可能特别适宜成人，而非幼儿。
本发明另外的方面中，PIV被用作呼吸道瞬时基因治疗的载体。根据这一实施方案，重组PIV基因组或反基因组包含能编码目的基因产物的序列。该基因产物受与控制PIV表达相同或不同的启动子控制。通过共表达N、P、L或其它需要的PIV蛋白和重组PIV基因组或反基因组来产生，并编码目的基因产物的序列，将这样的感染性PIV给药患者。给药一般通过气溶胶、喷雾器或其它局部施用，给药接受治疗患者的呼吸道。重组PIV的给药量应足以产生治疗或预防水平的期望的基因产物表达。这种方法中可给药的代表性基因产物优选适合瞬时表达的，如白介素-2、白介素-4、γ-干扰素、GM-CSF、G-CSF、红细胞生成素以及其它细胞因子、葡糖脑苷脂酶、苯丙氨酸羟化酶、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、细胞毒素、肿瘤抑制基因、反义RNA和疫苗抗原。
以下为说明目的提供了一些实施例，并非是对其的限制。这些实施例记录了使用重组cDNA系统在C ORF中引入一个代表性突变，所述C ORF在表达上完全沉默。作为本发明的另一代表，构建并检测了参与在D和V ORF中引入终止密码子以使相应蛋白表达沉默的突变。记录了这些突变对病毒复制和致病性的效果，由此确立了这些突变在发展抗PIV的活减毒疫苗中的作用。
在以下所述的一种名为rC-KO的突变病毒中，C蛋白的表达因C起始密码子由甲硫氨酸改为苏氨酸并在C ORF的氨基酸7和26处引入两个终止密码子而消除。用鼠和灵长类动物模型都证明，rC-KO突变体在体内和体外都高度减毒。rC-KO也能赋予对抗野生性HPIV3攻击的显著的保护。
尽管对D和V ORF单独进行干扰不会显著影响病毒在体内或体外的复制，对二者的同时干扰会使在体内的复制减弱。这些结果显示HPIV3 C、D、V蛋白各自参与病毒复制，这些模式突变提供了发展重组PIV候选疫苗的有用工具。
实施例l
HPIV3 C、D和V ORF剔除突变体的构建病毒和细胞
人Hep-2和猿猴LLC-MK2单层培养细胞生长在添加了2％的小牛血清、50μg/ml硫酸庆大霉素和4mM谷氨酰氨的OpiMEM1培养基中(Life Technologies，Gaithersburg，MD)维持生长。表达噬菌体T7 RNA聚合酶的改变的痘苗株Ankara(MVA)重组病毒由L.Wyatt和B.Moss博士惠赠(Wyatt等，Virology 210：202-205，1995)。PIV3的JS野生型(wt)株以及其减毒的ts衍生物，JS cp45，在LLC-MK2细胞中增殖，方法如上所述(Hall等，Virus Res.22：173-184，1992)。cDNA
编码JS wt病毒所有15462核苷酸的反基因组(p3/7(131)2G)全长cDNA克隆如前所述(GeneBank接入号#Z11575)(Durbin等，Virology235：323-332，1997；也参见1998年5月22日的美国专利申请09/083,793；1997年5月23日的美国临时申请60/047,575(相应于国际申请WO 98/53078)；1997年9月19的美国临时申请60/059分别在此引用作为参考)。该克隆被用作构建四个突变cDNA的模板，其中一个的C读码框(ORF)表达被完全消除，第二和第三个的D和V的阅读框分别被完全消除，第四个组合了D和V的阅读框上的突变(表1，图1)。
p3/7(131)2G(PIV反基因组的核苷酸1215-3903)从PmlI到BamHI的片段被亚克隆到质粒pUC119中(pUC119(PmlI-BamHI))，其经过改造在多克隆区包括了一个PmlI位点。用Kunkel的方法对pUC 119(PmlI-BamHI)进行定点诱变(Kunkel等，Methods Enzymol.154：367-382，1987)，以引入C、D和V读码框(ORF)中如下所述的突变。构建编码C剔除突变(rC-KO)的反基因组cDNA
使用两个引物，引入可使C ORF表达沉默的突变(见表1，图1C)。第一个突变引物通过改变全长反基因组上核苷酸1795(从T到C)将C ORF起始密码子由ATG改为ACG(甲硫氨酸到苏氨酸)，并通过改变核苷酸1813(从C到A)将C ORF氨基酸位置7处的丝氨酸改为一个终止密码子。第二个突变引物通过改变核苷酸1869(从C到A)将C ORF氨基酸位置26处的丝氨酸替换一个终止密码子。这些引入C ORF中的突变在P ORF中是沉默的。构建编码D、V和DV剔除突变(rD-KO，rV-KO，rDV-KO)的反基因组cDNA
突变的引入分别干扰D和V ORF的表达。D剔除引物在全长反基因组核苷酸2692，2695，2698处引入C到A的改变(表1，图1)。这些点突变在可能的D ORF上创造了三个连续的终止密码子，导致D蛋白在图1C所示的372氨基酸的嵌合D蛋白303密码子处提前终止。在D ORF上更早地引入这些终止密码子而不引起P ORF上并发的编码改变是不可行的。因此，该突变ORF的表达并非完全消除，而是产生一个具有P区域N末端241个氨基酸与D区域62个氨基酸(而非131个氨基酸)融合的截短的D蛋白。V剔除突变引物在全长反基因组核苷酸2845(从A到T)和2854(从C到T)处引入点突变(表1)。这些突变在可能的V ORF中创造提前的终止子(氨基酸位置17和20处)。这些突变在P ORF中是沉默的，但在D蛋白中引入两个氨基酸替代，即，Q354L，A357V。两个引物可以同时用于单突变反应以创造组合的DV剔除突变。
每个全长克隆的PmlI到BamHI片段被完整测序以确定引入突变的存在并确定其它突变没有被偶然的引入。然后分别将这些片段克隆回如上所述全长克隆p3/7(131)2G(Durbin等，Virology 235：323-332，1997)，以创造四种不同的反基因组cDNA克隆。
实施例II回收和表征重组的C剔除突变株(rC-KO)、D剔除突变株(rD-KO)、V剔除突变株(rV-KO)和DV剔除突变株(rDV-KO)
具有C、D、V或DV剔除突变株中任何一个的全长反基因组cDNA用LipofectACE(Life Technologies)在6孔板与支持质粒(pTM(N)，pTM(P无C)和pTM(L))共同转染到HEp-2细胞(Costar，Cambrige，MA)，这些细胞同时感染前述MVA-T7((Durbin等，Virology235：323-332，1997；也参见1998年5月22日的美国专利申请09/083,793；1997年5月23日的美国临时申请60/047,575(相应于国际申请WO 98/53078)；1997年9月19的美国临时申请60/059,385分别在此引用作为参考)。pTM(P无C)与前述pTM(P)质粒(参考文献同上)相似，但其C翻译起始位点已由ATG突变为ACG，使C ORF的第一个氨基酸由甲硫氨酸变为苏氨酸。32℃培养3天后转染的收获物传代到T25培养瓶中新鲜的单层LLC-MK2细胞上，32℃培养5天(称为第一次传代)。D、V和DV剔除第一次传代收获物中病毒量通过在单层LLC-MK2细胞培养物的噬菌斑滴度滴定，用如前所述的(参考文献同上)PIV3 HN-特异的单克隆抗体进行免疫过氧化酶染色，然后目测噬菌斑。C剔除病毒的生长状况似乎很差，因此其第一次传代收获物在T75培养瓶中单层LLC-MK2细胞中进一步扩增，进行第二次传代。第一次传代收获物中病毒量的测定方法同上所述。
第一次传代收获物上清中D、V和DV剔除突变病毒在LLC-MK2细胞中按前述方法进行三次噬菌斑纯化(Hall等，Virus Res.22：173-184，1992，在此引用作为参考)。C剔除病毒因不能形成容易辨认的噬菌斑，所以不能由噬菌斑纯化从生物学来源的克隆中获得。因此，它在96孔板(每个稀释度12孔)的LLC-MK2细胞中用两倍的稀释度进行最终稀释。从第三轮噬菌斑纯化或最终稀释度获得的生物学来源的克隆重组病毒在LLC-MK2细胞32℃扩增两次，以获得用于进一步表征的病毒。回收的重组病毒的序列分析
从感染细胞单层培养物清澈的培养基中浓缩病毒，使用前述聚乙二醇沉淀法(Durbin等，Virology 235：323-332，1997)。依照生产商的建议的步骤用TRIzol试剂(Life Technologies)纯化RNA。依推荐的方案用Advantage RT-for-PCR试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)进行RT-PCR。对照反应除了反应中不含反转录酶以外都相似，以确定该PCR产物完全来自病毒RNA而非可能的污染cDNA。使用引物获得全长反基因组跨越核苷酸1595-3104的PCR片段。该片段包括重组病毒全部的C、D和V ORF。得到的PCR产物用环式双脱氧核苷酸序列分析(New England Biolabs，Beverly，MA)进行测序。免疫沉淀分析蛋白
抗两种不同的C肽多抗原肽(MAP)技术(Research Genetics，Huntsville，AL)在兔中培养出两个PIV3 C特异性抗血清。这两个肽在C蛋白上分别跨越了氨基酸区域30-44和60-74。各C肽的8个拷贝被放在一个分支的载体核上，与弗氏佐剂一起分别注射兔(每个肽两只兔)。兔在2和4周被指定的MAP进行增强，并在4，8和10周取血。每个抗血清都以高效价识别用作免疫原的C肽，并在放射性免疫沉淀分析(RIPA)中都能从HPIV3感染细胞中沉淀出C蛋白。同样的，我们企图获得抗D和V蛋白的抗血清，但未能成功；产生的抗血清对其本身肽的效价极低，在野生型病毒感染的细胞中不能发现D或V蛋白的产生。
LLC-MK2的T25细胞单层被在感染复数为5(MOI＝5)的rC-KO，重组JS wt病毒(rJS)感染，或仅模拟感染，在32℃培养。感染后24小时，用无甲硫氨酸的DEME(Life Technologies)洗涤，然后在含10uCi/u 35S甲硫氨酸的负型DMEM(Met(-))中再培养6个小时。收获细胞，洗涤3次，在1ml RIPA缓冲液(1％(w/v)脱氧胆酸钠，1％(v/v)Triton X-100，0.2％(w/v)SDS，150mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.4)中重悬，冻溶，6500xg离心。细胞抽提物转移到一个新的eppendorf管中，两种C抗血清的混合物(每个5μl)加入到各样品中，不断混合下在4℃培养2小时。mAb 454/11和101/1的混合物(识别HPIV3 HN糖蛋白(van Wyke Coelingh等，J.Virol.61：1473-1477，1987))10ul加入各样品以确定回收的病毒确实是HPIV3。各样品中加入200ul 10％蛋白A葡聚糖珠(Sigma，St.Louis，MO)，不断混合下4℃培养过夜，沉淀免疫复合物。每个样品都被变性，还原，并依据生产商建议在4-12％聚丙烯酰氨凝胶(NuPAGE，Novex，San Diego，CA)中分析。干燥凝胶进行放射自显影分析。rPIV3s的多循环复制
T25培养瓶中单层LLC-MK2细胞以感染复数(MOI)为0.01被rCKO，rDV-KO，或rJS双份感染，在5％CO2 32℃培养。以间隔每24小时连续7天从各培养瓶中取250ul样品，并瞬时冷冻。每时间点上用等体积的新鲜培养基替换。各样品在96孔板的单层LLC-MK2细胞中32℃培养7天后测定效价。病毒通过血细胞吸附检测并以log10TCID50/ml表示。动物实验
每组21只4-6周大的金色叙利亚仓鼠，每只仓鼠鼻内接种0.1mlEMEM(Life Technologies)，其中含有105PFU的rC-KO，rDV-KO，rJS，cp45(JS wt病毒生物学来源的活减毒衍生物)，或呼吸道合胞病毒(RSV)。接种后第3、4和5天，每组中除了接种RSV以外的5只仓鼠被处死，取出肺和鼻甲。鼻甲和肺在L-15(Quality Biological，Gaithersburg，MD)中被匀浆，分别制备10％或20％的悬液，样品快速冷冻。样品中的病毒在96孔板的单层LLC-MK2细胞中32℃培养7天后测定效价。病毒通过血细胞吸附检测，并计算每组5只仓鼠每天的平均log10TCID50/g。在接种后0和28天采集每组剩余6只仓鼠的血清。利用前述的血凝素抑制(HAI)分析(van Wyke Coelingh等，Virology143：569-582，1985)评价血清抗体对各病毒的反应。第28天每组剩余的仓鼠，包括那些用RSV免疫的仓鼠，用106PFU的生物学来源PIV3 JSwt病毒鼻内攻击。攻击后4天处死动物，收集肺和鼻甲，并按上述方法处理。对攻击后样品病毒含量的测定如上法。另进行了一项独立的研究，rD-KO和rV-KO如上法给药仓鼠，除了动物不被攻击。
每组四只非洲绿猴(AGM)被鼻内和气管内接种106PFU的rC-KO，rDV-KO，JSwt，或cp45，方法如前述对于猕猴的早期研究(Durbin等，Vaccine 16：1324-30，1998)。鼻咽管样品在接种后连续12天每天采取，气管样品在接种后2，4，6，8，10天采取。样品被快速冷冻并储存在-70℃，直到所有的样品都采齐。样品中的病毒在96孔板的单层LLC-MK2细胞中32℃培养7天后测定效价。病毒通过血细胞吸附检测，并计算每天的平均log10TCID50/ml。在接种后0和28天采集每只猴的血清，测定PIV3 HAI抗体对各种突变体和PIV3野生型(JS)实验性感染的应答。接种后28天，AGM被106PFU生物学来源PIV3野生型病毒以1ml接种量鼻内和气管内攻击。鼻咽管样品在攻击后0，1，2，4，6，8，10，12天每天采样，气管样品在接种后2，4，6，8，10天采样。样品被快速冷冻并储存，依照前述方法测定病毒效价。重组突变体rC-KO、rD-KO、rV-KO和rDV-KO的回收
制备编码以下四种突变病毒的HPIV3反基因组cDNAs(参见表1，图1)：(i)rC-KO，其中C ORF的起始密码子由M变为T，并在密码子7和26处引入翻译终止子；(ii)rD-KO，其中在372氨基酸的嵌合D蛋白的密码子304、305和306处引入了翻译终止子；(iii)rV-KO，在V ORF位置17和20处引入了终止密码子；以及(iv)rDV-KO，其中组合了ii和iii中的突变。除了引入V ORF(iii)中的两个终止密码子外(其不能避免地导致D区域两个氨基酸替代，即Q354L和A357V)，各突变在重叠的ORF是翻译沉默的。此外，D中的终止密码子没有更早地引入该ORF中，是因为它们能改变P。每个突变都和一个翻译沉默限制位点标记共同引入(表1)。表1：引入rPIV3的核苷酸变化以产生rC-KO、rD-KO、rV-KO和rDV-KO3病毒rPIV3名称 氨基酸替代 野生型/突变序列的核苷酸序列1 引入的限制性
酶切位点rC-KO，突变#1 Met-1至Thr 1794-ATG CTA AAA ACT ATC AAA TCA TGG (SEQ ID NO.1) PIIM I
Ser-7至终止信号 ACG CTA AAA ACT ACC AAA
TAATGG (SEQ ID NO.2)rC-KO，突变#2 Ser-26至终止信号 1859-CCT CGG CCC TCA ACA TCA TTG (SEQ ID NO.3) BssH II
CCA GCG CGC
TAAACA TCA TTG (SEQ ID NO.4)rD-KO Ser-304至终止信号 22676-CCT CAT CAT GGA ATC TCA TCA TCG ACA AC(SEQ ID NO.5) Sac I
Ser 305至终止信号 CGA GCT CAT GGA ATC
TAA
TAA
TAGACA AC(SEQ ID NO.6)
Ser-306至终止信号rV-KO Arg-355至终止信号 2830-GGA AAG GAA GGA TAC AGA AGA GAG CAA TCG SEQ ID NO 7BsrB I
Gln-358至终止信号 GGA GCG GAA GGA TAC
TGAAGA GAG
TAATCG(SEQ ID NO.8)
1.显示了每个突变区域的核苷酸序列，并与野生型(wt)对比。每个序列中第一个核苷酸的定位是根据其在完整反基因组RNA中的位置而定。黑体的序列表示引入的突变，斜体序列表示引入的限制性酶切位点，下划线序列表示引入的终止密码子。
2.根据D融合蛋白(PN末端241个氨基酸与DC末端131个氨基酸融合)的序列(图1B)编号。
3.rD-KO和rV-KO中所述的突变组合产生rDV-KO病毒。
反基因组cDNA与三种PIV3支持质粒(pTM(N)，pTM(P无C)和pTM(L))共同转染HEp-2细胞，这些细胞同时感染表达T7 RNA聚合酶的MVA。具有C、D和V ORF突变的rPIV3的回收效率与p3/7(131)2G(表达先前从中回收了重组JS wt PIV3(rJS)的全长PIV3反基因组质粒(Durbin等，Virology 235：323-332，1997))相似感染-转染的HEp-2细胞培养物相比。32℃培养3天后收获感染细胞，每个上清传代到T25培养瓶中新鲜单层的LLC-MK2细胞上，32℃培养5天(第一次传代)。32℃培养5天后，rJS、rD-KO、rV-KO和rDV-KO的LLC-MK2细胞单层表现出3-4+细胞病理效果(CPE)。相应的rC-KO第一次传代显示(如果有)最少的CPE。由于不清楚rC-KO样品缺乏CPE是否是因为该突变病毒高水平的生长限制或是简单地由于病毒的起始回收较低，收获第一次传代物，上清传代到T75培养瓶中新鲜单层的LLC-MK2细胞，32℃培养7天(第二次传代)。T75培养瓶中单层的LLC-MK2细胞在培养7天后仅表现1-2+CPE，但血细胞吸附证实了HPIV3的存在。通过噬菌斑分离或最终稀释进行三轮生物克隆后，各重组突变体在LLC-MK2细胞中扩增了2次，得到用于进一步确定特性的病毒悬液。
为了证实回收的病毒的确是期盼的rC-KO，rD-KO，rV-KO，和rDV-KO突变体，采用扩增HPIV3反基因组跨越核苷酸1595-3104的DNA片段(包括包括具有C、D和V ORF的P基因部分)的引物对对各克隆的病毒通过RT-PCR进行分析。各PCR产物的产生都依赖反转录酶的加入，表明都来源于RNA而非污染的cDNA。rC-KO、rD-KO、rV-KO和rDV-KO的PCR产物用引入作为标记的限制性内切酶消化(表1)，证实了限制性酶切位点的存在。对RT-PCR产物也进行了核苷酸测序分析，确认了引入突变的存在。从各个克隆重组体中扩增的跨越核苷酸1595-3104的RT-PCR片段确认了所有引入的突变都存在，而在该片段中未发现其它偶发突变。
进行放射性免疫沉淀分析(RIPA)比较rC-KO突变病毒与野生型rJS wt病毒，以确定C ORF确实被沉默了。细胞被感染，并在感染后24-30小时在35S甲硫氨酸存在下培养，制备细胞裂解液。等量的总蛋白与抗C和抗HN抗体孵育，然后抗体结合于蛋白A葡聚糖珠上。rJS wt编码HN和C蛋白，而rC-KO不表达C蛋白(图3)。rC-KO和rDV-KO在细胞培养中的复制
两等份的LLC-MK2单层细胞被感染复数为0.01的rC-KO，rDV-KO，或rJS感染，32℃培养7天。每间隔24小时对各培养物的培养基取样，随后测定效价以评价各病毒在细胞培养中的复制。rDV-KO的复制与其亲本rJS wt在病毒生长速率和最高效价(图3)以在温度提高时的复制能力(数据未显示)等方面基本上没有区别。相反，rC-KO病毒复制更加缓慢并在第6天达到最高效价，这个值比rJS低100-1000倍。因此，C蛋白表达的缺乏对细胞培养中的病毒复制有重要影响。rC-KO，rD-KO，rV-KO，和rDV-KO在仓鼠中的复制
接着我们对比了突变病毒和rJS wt亲本在仓鼠上下呼吸道中复制的能力。一个初步研究表明rD-KO和rV-KO与rJS病毒在该分析中无显著区别(数据未显示)，因此对其不做进一步评价。第二个研究中，各组仓鼠被分别在鼻内每只仓鼠接种了rC-KO，rDV-KO，rJS或cp45(生物学来源的候选疫苗)105PFU。与rJS相比，检测的每一天rC-KO在上、下呼吸道中的复制都降低1000倍或更高(表2)，并且和cp45候选疫苗病毒同样减毒。尽管rDV-KO的复制在仓鼠上呼吸道没有降低，但在检测的三天中的任何一天其在下呼吸道降低至少20倍(表2)。感染rC-KO，rDV-KO，cp45或rJS的仓鼠对HPIV3有显著的抗体反应，并表现PIV3攻击病毒高水平的复制限制(表3)。rC-KO在上呼吸道赋予的保护是不完全的，但仍然显著。表2：rC-KO在仓鼠上下呼吸道减毒，而rDV-KO病毒在仓鼠下呼吸道减毒
感染后所示日的平均病毒效价(log10TCID50/g)±S.E.2
最高病毒效价(log10TCID50/g)±S.E.病毒1 第3天 第4天 第5天
鼻甲 肺 鼻甲 肺 鼻甲 肺 鼻甲 肺cp45 4.7±0.2 2.7±0.2 5.0±0.5 2.8±0.5 5.4±0.3 1.6±0.2 5.4±03(D)3 2.8±0.5(C)3rC-KO 3.4±0.2 2.9±0.1 3.6±0.1 2.1±0.3 2.9±0.4 1.6±0.2 3.6±0.1(C) 2.9±0.2(C)rDV-KO 7.2±0.2 5.5±0.3 6.9±0.2 4.6±0.1 5.4±0.1 5.9±0.2 7.2±0.2(A) 5.9±0.2(B)rJS 6.7±03 6.8±0.5 7.4±0.2 6.6±0.4 6.6±0.2 7.2±0.2 7.4±0.2(A) 72±0.2(A)
1. 5只仓鼠的各组鼻内接种105PFU的所示病毒。cp45是生物学来源的病毒，其它是重组病毒。
2.标准误差。
3.根据邓肯多差距测验，不同字母的右栏的平均值显著不同(a＝0.05)，相同字母的没有显著不同。
表3： rC-KO和rDV-KO病毒在仓鼠中有免疫原性和对抗PIV3 wt病毒攻击的保护性
对攻击的应答免疫病毒1 血清HAI抗体效价(倒 平均PIV3效价2
数平均值log2±S.E.) (log10TCID50/g)±S.E.
鼻甲 肺rC-KO 7.3±0.4 3.3±0.5 ＜1.2±0.0rDV-KO 11.3±0.2 ＜1.5±0.0 ＜1.2±0.0cp45 11.8±0.3 ＜1.5±0.0 ＜1.2±0.0rJS 12.1±0.2 ＜1.5±0.0 ＜1.2±0.0RSV ＜2.0±0.0 7.0±0.2 4.7±0.3
1.显示在0天用于免疫6只仓鼠组的病毒。
2.在28天，对所有的仓鼠取血以确定血清HAI抗体效价并接受106pFU生物学来源JS wt HPIV3的攻击。攻击后4天采集肺部和鼻甲的样品。rC-KO和rDV-KO在灵长类中的复制
将这些突变体各给药一组4只的AGM，并与cp45和JS wt对比其在上下呼吸道中的复制，以进一步评价rC-KO和rDV-KO的减毒表型和保护效率。rC-KO在AGM上呼吸道中的复制降低100倍或更多，而在此rDV-KO仅降低10倍。观察到的这两种病毒在上呼吸道中的减毒与cp45的相当(表4)。尽管rC-KO在AGM下呼吸道中是高度减毒的(超过105倍)，rDV-KO在此仅略有限制(小于10倍)。这两种病毒都诱导对HPIV3的HAI抗体应答，但AGM中对rC-KO的HAI应答，和在仓鼠中一样，显著地低于对其它病毒(表4)的应答。免疫的AGM在28天以IN和IT途径给药的106pFU生物学来源JS wt病毒攻击。曾接受rJS、rDV-KO或cp4候选疫苗病毒的动物在AGM上下呼吸道中对攻击病毒的复制有完全的保护抗性。rC-KO赋予对攻击病毒复制的保护作用是显著的但不完全的。攻击病毒的最高效价在该组动物上下呼吸道中有显著的降低，病毒从上下呼吸道中释放的时间分别从10天缩短到4天和从8天缩短到6天。
表4：rC-KO和rDV-KO在非洲绿猴中减毒并诱导血清HAI抗体应答
平均最高效价 在28天血清 攻击病毒4的平均最高效价病毒1 (log10TCID50/ml)±S.E.2 HAI抗体效价 (log10TCID50/ML)±S.E.
动物数
鼻咽擦拭 气管灌洗 (倒数平均值
鼻咽擦拭 气管灌洗
log2±S.E.)3RC-KO 3.6±0.3(C)5 1.5±0.1(D)5 4 9.2±1.1 4.2±0.47 3.6±1.07Cp45 5.1±0.4(B) 5.3±0.1(C) 4 12.0±0.6 ＜0.5±0.0 ＜0.5±0.0RDV-KO 5.3±0.2(B) 6.0±0.4(B) 4 12.0±0.6 ＜0.5±0.0 ＜0.5±0.0JSwt 6.3±0.2(A) 6.6±0.1(A) 66 13.2±0.2 ＜0.5±0.0 ＜0.5±0.0
1.AGM在0天用106PFU的所示病毒在鼻内和气管内接种。
2.标准误差。
3.在0天的平均血清HAI抗体效价(倒数平均Log2)≤2.0。
4.动物在第28天用病毒106PFU HPIV3 JS wt经鼻内和气管内接种攻击。
5.根据邓肯多差距测验，不同字母的每列的平均值显著不同(α＝0.05)，相同字母的没有显著不同。
6.组内2只动物接受重组JS wt病毒rJS，4只接受生物学来源的JS wt病毒。两个病毒的最高平均效价没有不同(上呼吸道中6.4：6.3；下呼吸道中6.6：6.7)。由于两个病毒的最高效价没有不同，合并这些组进行进一步分析。
7.在2和3列中比较JS wt病毒平均最高效价。
总结以上的发明内容，此处的结果显示从cDNA中成功地回收了感染性HPIV3，以构建其中C、D或V ORF的表达被包含突变的模式消除技术单独破坏的新型重组病毒，这些突变改变了起始密码子所决定的氨基酸，和/或引入翻译终止密码子。在其它模式的病毒克隆中，D和V ORF被同时干扰。这些例子表明HPIV3的附属C、D和V ORF对病毒在体内体外复制的重要性，并提供了对预防和治疗PIV有用的候选疫苗。特别的，rC-KO在AGM上下呼吸道中复制水平比cp45略低，是最有前途的PIV3候选疫苗株。尽管其在体内复制降低，rC-KO可诱导足够的免疫应答，限制HPIV3攻击病毒的复制，尽管为了在人体达到对wt病毒复制的高水平限制，需要以高剂量(如107TCID)或多剂量给药，仍认为该重组体是有用的候选疫苗。
利用重组DNA技术，在HPIV3突变体cp45中发现的突变可以单独或组合形式引入JS wt序列(Skiadopoulos等，J.Virol.73：1374-1381，1999；1998年5月22日的美国专利申请09/083,793；1997年5月23的美国临时申请60/047,575(相应于国际申请WO 98/53078)；1997年9月19的美国临时申请60/059,385，分别在此引用作为参考)。这使鉴定赋予候选疫苗减毒、温度敏感(ts)和/或冷适应表型的突变成为可能。这些突变，以及其它此处公布的重组PIV中的修饰，可用作附加突变，来调节具有C、D和/或V ORF剔除突变的本发明重组PIV的减毒水平、以及免疫原性和其它期望的表型特征。
在P座位中潜在编码的两个其它蛋白是V和D蛋白。除了HPIV-1以外，所有的呼吸道病毒、麻疹病毒和Rubulaviruses都具有完整的VORF。V ORF富含半胱氨酸的C末端部分是副粘病毒P基因中最保守的ORF，似乎除HPIV1和HPIV3以外的这类病毒都表达该部分。尽管HPIV3具有V ORF，仍不清楚它是如何获得的，但它保持完整的事实证明它是有作用的。不像副粘病毒的V顺反子，D蛋白在人和牛PIV3中是特有的。D蛋白的接触是通过两个非模板G残基在P mRNA编辑位点的插入，产生一个融合蛋白，其中P N末端的241个氨基酸融合了D ORF C末端的131个氨基酸。对D蛋白的功能一无所知，而且尽管发现了可编码D的编辑后的mRNA，在HPIV3感染的细胞或毒粒中未发现该蛋白。(Galinski等，Virology 186：543-550，1992)。我们获得一个在D ORF中具有三个连续终止密码子的重组HPIV3突变体，其可以表达由D ORF编码的包含61个氨基酸的截短形式的融合蛋白，企图解决这个问题。具有单个D或V ORF剔除突变的重组子在体内和体外的复制都没有显著的限制。但这些突变在PIV候选疫苗的发展中却非常有用。一个组合的V和D剔除突变体的成功回收说明了这一点，其组合了两套突变，同时在V和D ORF中创造了多个终止密码子。这种定名为rDV-KO的突变体在仓鼠的上下呼吸道中复制被限制，在AGM的上下呼吸道中也如此。由于P ORF不受引入突变的影响，可以合理的推测观察到的表型反映了V和D活性的丧失。尽管rDV-KO在体内复制是减毒的，其在细胞培养中的复制基本没有变化。这些结果提供了有力的证据，说明野生型HPIV3 D和V蛋白是表达的，并且二者同时的功能丧失对rDV-KO在体内的减毒表型负责。可能这些蛋白在分子水平互相作用，影响体内复制。
尽管为清晰理解目的，上述发明通过实施例进行了详细描述，但是业内人士而言很清楚，某些变化和修饰可在附加的权利要求书范围内进行，这些已通过图表方式说明，但不限于此范围。
微生物保藏信息
以下材料已保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801University Boulevard，Manassas，Virginia 201 10-2209)，遵循布达佩斯条约，并命名如下：
质粒 保存号 保存日期
p3/7(131) (ATCC97990) 1997年4月18日
p3/7(131)2G (ATCC97989) 1997年4月18日
D218(131) (ATCC97991) 1997年4月18日序列表<110>美国政府健康及人类服务部(The Government of the United Statea of America，as represented
by theSecretary of the Department of Health and Human Serviees)<120>通过缺失或消除非必需基因而减毒的重组副流感病毒疫苗(Recombinant Parainfluenza
virus Vaccines Attenuated by Deletion or Ablation of a Non-essential Gene)<130>15280-394000PC<140><141><150>09/350,821<151>1999-07-09<160>11<170>Patent In Ver.2.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：含有rD-KO突变的重组序列<400>1atgctaaaaa ctatcaaatc atgg<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：含有rD-KO突变的重组序列<400>2acgctaaaaa ctaccaaata atgg<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：含有rD-KO突变的重组序列<400>3cctcggccct caacatcatt g<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：含有rD-KO突变的重组序列<400>4ccagcgcgct aaacatcatt g<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：含有rD-KO突变的重组序列<400>5cctcatcatg gaatctcatc atcgacaac<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：含有rD-KO突变的重组序列<400>6cgagctcatg gaatctaata atagacaac<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：临近位点rV-KO突变的野生型序列<400>7ggaaaggaag gatacagaag agagcaatcg<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：含有rV-KO突变的重组序列<400>8ggagcggaag gatactgaag agagtaatcg<210>9<211>11<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：含有RNA编辑位点基元的序列<400>9aaaaaagggg g<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：含有P和C读码框的翻译起始位点的序列<400>10gttgatggaa agcgatgcta<210>11<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：在编辑位点具有2个G插入的P mRNA的部分序列<400>11aaaaaagggg ggg
Claims (53)
1.一种分离的感染性重组副流感病毒(PIV)，包含一个PIV基因组或反基因组、一个核壳蛋白(N)、一个磷蛋白(P)和一个大聚合酶蛋白(L)，其中在所述基因组和反基因组中引入了一种改变，这种改变包含一个或多个C、D或V ORF的部分或完全缺失，或使一个或多个C、D或V ORF的表达降低或消除的一个或多个核苷酸变化。
2.权利要求1的重组PIV，其中所述一个或多个C、D或V ORF的表达因引入的一个或多个终止密码子而降低或消除。
3.权利要求1的重组PIV，其中所述一个或多个C、D或V ORF的表达因RNA编辑位点的突变或改变起始密码子特定氨基酸的突变而降低或消除。
4.权利要求1的重组PIV，其中所述一个或多个C、D或V ORF的表达因引入的移码突变而降低或消除。
5.权利要求1的重组PIV，其中所述一个或多个C、D或V ORF被整体或部分地缺失。
6.权利要求1的重组PIV，其中在基因组或反基因组中引入的改变包括C ORF部分或全部的缺失或使C ORF表达降低或消除的一个或多个核苷酸改变。
7.权利要求6的重组PIV，其中C ORF的表达因引入的一个或多个终止密码子而降低或消除。
8.权利要求7的重组PIV，其中因所述基因组或反基因组在第1795处的一个核苷酸变化，C ORF起始密码子被改为苏氨酸密码子，并且通过改变在1813和1869处的核苷酸而引入了两个终止密码子。
9.权利要求6的重组PIV，其是rC-KO。
10.权利要求1的重组PIV，其中在基因组或反基因组中引入的改变包括D ORF部分或全部的缺失或使D ORF表达降低或消除的一个或多个核苷酸改变。
11.权利要求9的重组PIV，其中D ORF的表达因引入的一个或多个终止密码子而降低或消除。
12.权利要求10的重组PIV，其中通过改变在所述反基因组的第2692、2695、2698处的核苷酸而引入了三个终止密码子。
13.权利要求9的重组PIV，其是rD-KO。
14.权利要求1的重组PIV，其中在基因组或反基因组中引入的改变包括V ORF部分或全部的缺失或使V ORF表达降低或消除的一个或多个核苷酸改变。
15.权利要求12的重组PIV，其中V ORF的表达因引入的一个或多个终止密码子而降低或消除。
16.权利要求13的重组PIV，其中通过改变在所述反基因组第2845和2854处的核苷酸而引入了两个终止密码子。
17.权利要求13的重组PIV，其是rV-KO。
18.权利要求1的重组PIV，其中在基因组或反基因组中引入的改变包括所述C、D和V ORF中至少两个的部分或全部的缺失，或使所述C、D和V ORF中的至少两个的表达降低或消除的一个或多个核苷酸改变。
19.权利要求18的重组PIV，其中D和V ORF都被部分或全部地缺失，或发生了使二者表达降低或消除的一个或多个核苷酸改变的修饰。
20.权利要求18的重组PIV，其是rDV-KO。
21.权利要求1的重组PIV，其中在基因组或反基因组中的改变导致了重组PIV中一个或多个所需的表型变化，其选自：(i)在细胞培养中减毒，(ii)在哺乳动物宿主上和/或下呼吸道中减毒，(iii)病毒噬菌斑大小的改变，(iv)细胞病理学效果改变，以及(v)免疫原性改变。
22.权利要求21的重组PIV，其中病毒在细胞培养中的生长比相应野生型或突变亲本PIV株的生长降低约5-10倍或更多。
23.权利要求21的重组PIV，其中病毒在上、下呼吸道中的生长比相应野生型或突变亲本PIV株的生长降低约10-100倍或更多。
24.权利要求23的重组PIV，其中病毒在上、下呼吸道中的生长比相应野生型或突变亲本PIV株的生长降低约100-1000倍或更多。
25.权利要求1的重组PIV，其中所述基因组或反基因组被引入的在生物学来源的突变人PIV中发现的一个或多个减毒突变所进一步改变。
26.权利要求25的重组PIV，其中所述基因组或反基因组包含PIV3 JS cp45中的至少一个到全部减毒突变。
27.权利要求25的重组PIV，其中所述基因组或反基因组包含至少一个到全部的导致：PIV3 L基因中的Tyr 942、Leu 992和/或Thr1558；N中的Val 96和Ser 389；C中的Ile 96；F中的Ile 420和/或Ala550；HN中的Val 384处的氨基酸替代的减毒突变，和/或在3’前导区第23、24、28和/或45位和/或N基因起始序列62处的核苷酸替代。
28.权利要求25的重组PIV，其中所述基因组或反基因组包含至少两个减毒突变。
29.权利要求25的重组PIV，其中所述基因组或反基因组包含至少一个减毒突变，该减毒突变由特定于该突变的密码子内多个核苷酸的改变而稳定。
30.权利要求1的重组PIV，其中所述基因组或反基因组包含额外的导致以下表型变化的核苷酸改变，选自：生长特性、减毒、温度敏感、冷适应、噬菌斑大小、宿主范围限制或免疫原性的改变。
31.一种刺激个体免疫系统以诱导抵抗PIV的方法，包括以足够的免疫量给所述个体给药权利要求1的重组PIV并组合生理上可接受的载体。
32.权利要求31的方法，其中所述重组PIV以每剂103-107PFU给药。
33.权利要求31的方法，其中所述重组PIV给药于上呼吸道。
34.权利要求31的方法，其中所述重组PIV通过喷雾、滴加或气溶胶给药。
35.权利要求31的方法，其中所述重组PIV与第二种减毒PIV以混合物同时给药。
36.一种诱导抗PIV的免疫反应的免疫组合物，包含足够免疫量的与一种生理上可接受的载体结合的权利要求1的重组PIV。
37.权利要求36的免疫组合物，以每剂103-107PFU配制。
38.权利要求36的免疫组合物，被配制成以喷雾、滴加或气溶胶给药于上呼吸道的制剂形式。
39.权利要求36的免疫组合物，其中所述重组PIV诱导抗HPIV1，HPIV2和HPIV3中一种或多种病毒的免疫应答。
40.权利要求39的免疫组合物，其中所述重组PIV诱导抗HPIV3和其它选自HPIV1、HPIV2和HPIV3病毒的免疫应答。
41.一种分离的多核苷酸分子，包含一种重组PIV基因组或反基因组，其具有包括一个或多个C、D或V ORF的部分或完全缺失的核苷酸改变或使所述C、D或V ORF中一个或多个表达降低或消除的一个或多个核苷酸变化。
42.权利要求41的分离的多核苷酸分子，其中所述一个或多个C、D或V ORF的表达因引入的一个或多个终止密码子或因RNA编辑位点的突变或改变起始密码子特定氨基酸的突变而降低或消除。
43.权利要求41的分离的多核苷酸分子，其中所述一个或多个C、D或V ORF被整体或部分缺失。
44.权利要求41的分离的多核苷酸分子，其中引入所述基因组或反基因组的改变包括部分或完全缺失C ORF，或使C ORF表达降低或消除的一个或多个核苷酸变化。
45.权利要求41的分离的多核苷酸分子，其中引入所述基因组或反基因组的改变包括部分或完全缺失D ORF，或使D ORF表达降低或消除的一个或多个核苷酸变化。
46.权利要求41的分离的多核苷酸分子，其中引入所述基因组或反基因组的改变包括部分或完全缺失V ORF，或使D ORF表达降低或消除的一个或多个核苷酸变化。
47.权利要求41的分离的多核苷酸分子，其中引入所述基因组或反基因组的改变包括所述C、D或V ORF中的至少两个的部分或完全缺失，或使所述C、D或V ORF中至少两个的表达降低或消除的一个或多个核苷酸变化。
48.权利要求41的分离的多核苷酸分子，其中D和V ORF都被部分或完全缺失，或这二者的表达被一个或多个核苷酸的改变所降低或消除。
49.权利要求41的分离的多核苷酸分子，其中所述重组基因组或反基因组被一个或多个减毒突变进一步修饰。
50.权利要求41的分离的多核苷酸分子，进一步含有导致以下表型变化的核苷酸改变，其选自：生长特性、减毒、温度敏感、冷适应、噬菌斑大小、宿主范围限制或免疫原性的改变。
51.一种从一个或多个编码所述PIV的多核苷酸分子中产生感染性减毒重组PIV颗粒的方法，包括：在细胞或无细胞裂解液中表达表达载体，该载体包含具有重组PIV基因组或反基因组的分离的多核苷酸和PIV N、P和L蛋白，所述重组PIV基因组或反基因组具有的核苷酸改变包括：一个或多个C、D或V ORF的部分或完全缺失，或使所述C、D或V ORF中一个或多个的表达降低或消除的一个或多个核苷酸改变。
52.权利要求51的方法，其中所述嵌合PIV基因组或反基因组和N、P和L蛋自由两个或多个不同表达载体所表达。
53.一种表达载体，包含可操作地连接的转录启动子、一个编码PIV基因组或反基因组的多核苷酸序列和转录终止子，所述多核苷酸序列具有的核苷酸改变包括：一个或多个C、D或V ORF的部分或完全缺失，或使所述C、D或V ORF中一个或多个的表达降低或消除的一个或多个核苷酸改变。
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