DE60033939T2

DE60033939T2 - Rekombinante parainfluenzavirus vakzine, die durch deletion oder unterdrückung eines nicht wesentlichen gens abgeschwächt ist

Info

Publication number: DE60033939T2
Application number: DE60033939T
Authority: DE
Inventors: Anna P. Germantown DURBIN; Peter L. Rockville COLLINS; Brian R. Bethesda MURPHY
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1999-07-09
Filing date: 2000-07-06
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2020-07-07
Also published as: IL147446A0; JP2003504043A; WO2001003744A2; ES2283306T3; EP1196197B1; DE60033939D1; JP4813710B2; MXPA02000225A; IL147446A; CA2378497A1; CN1370237A; ATE356639T1; CN100491531C; KR100894849B1; BR0013194A; AU5917500A; AU783993C; KR20020092887A; US6410023B1; WO2001003744A3

Description

Menschlicher Parainfluenzavirus Typ 3 (HPIV3) ist eine häufige Ursache von schwerer Infektion des unteren Respirationstrakts in Säuglingen und Kindern, die weniger als ein Jahr alt sind. Es wird in dieser Altersgruppe nur vom Respiratorischen Synzytialvirus (RSV) als eine führende Ursache von Krankenhauseinweisung für virale Erkrankungen des unteren Respirationstrakts übertroffen (Collins et al., S. 1205-1243. In B.N. Fields (Knipe et al., Hrsg.) Fields Virology, 3. Ausgabe, Bd. 1 Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996; Crowe et al., Vaccine 13:415-421, 1995; Marx et al., J. Infect. Dis. 176:1423-1427, 1997). Infektionen durch dieses Virus resultieren in erheblicher Morbidität bei Kindern von weniger als 3 Jahren. HPIV1 und HPIV2 sind ursächliche Erreger von Laryngotracheobronchitis (Krupp) und können auch schwere Lungenentzündung und Bronchiolitis hervorrufen (Collins et al., 3. Ausgabe. In „Fields Virology", B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R. M. Chanock, J. L. Melnic, T.P. Monath, B. Roizman, und S. E. Straus, Hrsg. Bd. 1, S. 1205-1243. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996). In einer Langzeitstudie über eine Dauer von 20 Jahren wurden HPIV1, HPIV2 und HPIV3 als die ursächlichen Erreger für 6,0, 3,2 bzw. 11,5% der Hospitalisierungsfälle für Erkrankungen des Respirationstrakts identifiziert, die insgesamt für 18% der Hospitalisierungen verantwortlich sind, und aus diesem Grund gibt es einen Bedarf für einen wirkungsvollen Impfstoff (Murphy et al., Virus Res. 11, 1-15, 1988). Die Parainfluenzaviren sind auch als ein wesentlicher Anteil der Fälle von viral induziertem Mittelohr-Erguss in Kindern mit Otitis media identifiziert worden (Heikkinen et al., N Engl J Med 340:260-4, 1999). Es besteht daher ein Bedarf, einen Impfstoff gegen diese Viren zu produzieren, der die schwere Erkrankung des unteren Respirationstrakts und die Otitis media verhindern kann, die diese HPIV-Infektionen begleitet.
Trotz beträchtlicher Bemühungen, wirkungsvolle Impfstoff-Therapien gegen HPIV zu entwickeln, sind bis jetzt weder anerkannte Impfstoffmittel für irgendeinen HPIV-Stamm erzielt worden, noch für Erleichterung der mit HPIV verbundenen Krankheit. Bis jetzt haben nur zwei lebende abgeschwächte PIV-Impfstoffkandidaten besondere Aufmerksamkeit erregt. Einer dieser Kandidaten sind ein Rinder PIV (BPIV3)-Stamm der antigen mit dem HPIV3 verwandt ist und von welchen gezeigt worden ist, dass er Tiere gegen HPIV3 schützt. BPIV3 ist abgeschwächt, genetisch stabil und in menschlichen Säuglingen und Kindern immunogen (Karron et al., J. Inf. Dis. 171:1107-14 (1995a); Karron et al., J. Inf. Dis. 172:1445-1450, (1995b)). Ein zweiter PIV3 Impfstoff-Kandidat, JScp45, ist eine an Kälte angepasste Mutante des JS-Wildtyp (wt)-Stammes von HPIV3 (Karron et al., (1995b), vorstehend; Belshe et al., J.Med. Virol. 10:235-42 (1982)). Dieser lebende, abgeschwächte, Kältepassagierte (cp) PIV3 Impfstoff-Kandidat zeigt Temperatur-Sensitive (ts), Kälteangepasste (ca) und Attenuierungs- (att) Phänotypen, welche nach viraler Replikation in vivo stabil sind. Das cp45 Virus schützt in Testtieren gegen Herausforderung mit menschlichem PIV3 und ist abgeschwächt, genetisch stabil und in seronegativen menschlichen Säuglingen und Kindern immunogen (Hall et al., Virus Res. 22:173-184 (1992); Karron et al., (1995b), vorstehend).
Um die Entwicklung von PIV-Impfstoffkandidaten zu erleichtern, hat es vor kurzem rekombinante DNA-Technologie möglich gemacht, infektiöse RNA-Viren mit negativen Strängen aus der cDNA zu gewinnen (für Zusammenfassungen, siehe Conzelmann, J. Gen. Virol. 77:381-89 (1996); Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:11354-58 (1996)). In diesem Zusammenhang wurde die rekombinante Rettung ("rescue") für infektiösen Respiratorischen Synzytialvirus (RSV), Tollwutvirus (RaV), vesikulären Stomatitisvirus (VSV), Masernvirus (MeV), Rinderpestvirus, Simianvirus 5 (SV5), Newcastle-Disease-Virus (NDV) und Sendai-Virus (SeV) aus cDNA-codierter antigenomischer RNA, in der Anwesenheit von essentiellen viralen Proteinen, berichtet (siehe z.B. Garcin et al., EMBO J. 14:6087-6094 (1995); Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:4477-81 (1995); Radecke et al., EMBO J. 14:5773-5784 (1995); Schnell et al., EMBO J. 13:4195-203 (1994); Whelan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:8388-92 (1995); Hoffman et al., J. Virol. 71:4272-4277 (1997); Kato et al., Genes to Cells 1:569-579 (1996), Roberts et al., Virology 247(1), 1-6 (1998); Baron et al., J. Virol. 71:1265-1271 (1997); Internationale Veröffentlichung Nr. WO 97/06270; Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567 (1995); U.S. Patentanmeldung Nr. 08/892.403, eingereicht am 15. Juli 1997 (entsprechend der veröffentlichten Internationalen Anmeldung Nr. WO 98/02530 und der vorläufigen U.S. Prioritätsanmeldungen Nr. 60/047.634, eingereicht am 23. Mai 1997, 60/046.141, eingereicht am 9. Mai 1997 und 60/021.773, eingereicht am 15. Juli 1996); Juhasz et al., J. Virol. 71(8):5814-5819 (1997); He et al., Virology 237:249-260 (1997); Baron et al., J. Virol. 71:1265-1271 (1997); Whitehead et al., Virology 247(2):232-9 (1998a); Whitehead et al., J. Virol. 72(5):4467-4471 (1998b); Peeters et al., J. Virol. 73:5001-5009 (1999); Jin et al., Virology 251:206-214 (1998); Bucholz et al., J. Virol. 73:251-259 (1999); und Whitehead et al., J. Virol. 73:(4)3438-3442 (1999)).
Ein Verfahren zur Herstellung von HPIV mit einem Wildtyp-Phänotyp aus cDNA wurde vor kurzem zur Gewinnung des infektiösen rekombinanten PIV3 JS-Stammes entwickelt (siehe z.B. Durbin et al., Virology 235:323-332, 1997; U.S. Patentanmeldung Seriennr. 09/083.793, eingereicht am 22. Mai 1998; vorläufige U.S. Anmeldung Nr. 60/047.575, eingereicht am 23. Mai 1997 (entsprechend der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 98/53078) und vorläufige U.S. Anmeldung Nr. 60/059.385, eingereicht am 19. September 1997). Außerdem erlauben diese Offenbarungen genetische Manipulation der cDNA-Clone, um die genetische Basis von phänotypischen Änderungen in biologischen Mutanten zu bestimmen, z.B. welche Mutationen im HPIV3 cp45 Virus seine ts-, ca- und att-Phänotypen spezifizieren und welches) Gen(e) von BPIV3 seinen Abschwächungs-Phänotyp spezifizieren. Außerdem machen es diese Offenbarungen möglich, neue PIV-Impfstoffkandidaten zu konstruieren und ihren Abschwächungsgrad, Immunogenität und ihre phänotypische Stabilität zu bestimmen.
Infektiöses rekombinantes Wildtyp PIV3 (r)PIV3, sowie etliche ts-Derivate sind nun aus cDNA gewonnen worden und reverse genetische Systeme sind verwendet worden, um infektiöses Virus zu erzeugen, das definierte abschwächende Mutationen trägt, und die genetische Basis der Abschwächung von bestehenden Impfstoffviren zu bestimmen. Zum Beispiel ist von den drei Aminosäure-Substitutionen, die im L-Gen von cp45 allein oder in Kombination gefunden wurden, festgestellt worden, dass sie ts- und Abschwächungs-Phänotypen spezifizieren. Zusätzliche ts- und abschwächende Mutationen sind in anderen Regionen von PIV3cp45 vorhanden. Außerdem ist ein chimärer PIV1-Impfstoff-Kandidat unter Verwendung des PIV3 cDNA-Rettungssystems, durch Ersetzen der PIV3-HN und F-offenen Leserahmen (ORFs) mit jenen von PIV1 in einer PIV3-Volllängen- cDNA erzeugt worden, welche die drei abschwächenden Mutationen in L enthält. Das rekombinante chimäre Virus, das aus dieser cDNA stammt, wird als rPIV3-1.cp45L bezeichnet (Skiadopoulos et al., J. Virol. 72:1762-8, (1998); Tao et al., J. Virol. 72:2955-2961, 1998; Tao et al., Vaccine 17:1100-1108, 1999). rPIV3-1.cp45L wurde in Hamstern abgeschwächt und induzierte einen hohen Grad an Resistenz zu einer Herausforderung mit PIV1. Ein rekombinantes chimäres Virus, bezeichnet als rPIV3-1.cp45, ist erzeugt worden, das 13 der 15 cp45 Mutationen enthält, d.h. ohne die Mutationen in HN und F, und er ist im oberen und unteren Respirationstrakt von Hamstern stark abgeschwächt (Skiadopoulos et al., Vaccine, im Druck, 1999).
Trotz dieser zahlreichen Fortschritte in Richtung der Entwicklung von effektiven Impfstoffmitteln gegen verschiedenen PIV-Gruppen, verbleibt im Fachgebiet ein offensichtlicher Bedarf für zusätzliche Werkzeuge und Verfahren, um sichere und effektive Impfstoffe herzustellen, um die ernsthaften gesundheitlichen Probleme zu mildern, die auf PIV zurückzuführen sind, insbesondere Erkrankungen unter Säuglingen und Kindern aufgrund einer Infektion durch HPIV3. Unter den verbleibenden Herausforderungen besteht in diesem Zusammenhang der Bedarf für zusätzliche Werkzeuge, um geeignete abgeschwächte, immunogene und genetisch stabile Impfstoffkandidaten für die Verwendung in verschiedenen klinischen Situationen zu erzeugen. Um diese Ziele zu erleichtern, müssen bestehende Verfahren für die Identifizierung und den Einbau von abschwächenden Mutationen in rekombinante Impfstoffstämme erweitert werden. Überraschenderweise erfüllt die vorliegende Erfindung diesen Bedarf und stellt, wie nachstehend beschrieben, zusätzliche Vorteile bereit.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein infektiöses rekombinantes Parainfluenzavirus (PIV) bereitgestellt, umfassend ein PIV-Genom oder Antigenom, ein Nucleocapsidprotein (N), ein Phosphoprotein (P) und ein großes Polymerase-Protein (L), worin eine Modifikation in das Genom oder Antigenom eingeführt wird, umfassend eine teilweise oder vollständige Deletion von einem oder mehreren der C-, D- oder V-ORF(s) oder eine oder mehrere Nucleotid-Änderung(en), ausgewählt aus (i) Einführung von einem oder mehreren Stopp-Codons, (ii) einer Mutation in einer RNA-editierenden Stelle, (iii) einer Mutation, die eine Aminosäure, die durch ein Initiationscodon spezifiziert wird, verändert, und (iv) Einführung einer Rasterverschiebungsmutation, wobei die Expression von einem oder mehreren der C-, D- oder V-ORF(s) reduziert oder unterdrückt (ablatiert) wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation im Genom oder Antigenom eine oder mehrere erwünschte phänotypische Änderungen im rekombinanten PIV spezifiziert, ausgewählt aus (i) Abschwächung (Attenuierung) in der Zellkultur, (ii) Abschwächung im oberen und/oder unteren Respirationstrakt eines Säugerwirts.
Vorzugsweise umfasst die in das Genom oder Antigenom eingeführte Modifikation eine partielle oder vollständige Deletion von mindestens zwei der C-, D- oder V-ORF(s) oder eine oder mehrere Nucleotid-Änderung(en), welche die Expression von mindestens zwei dieser C-, D- oder V-ORF(s) vermindert oder unterdrückt.
Ferner bevorzugt werden die D- und V-ORFs beide durch eine partielle oder vollständige Deletion oder eine oder mehrere Nucleotid-Änderung(en) modifiziert, welche ihre Expression vermindert oder unterdrückt.
Vorzugsweise werden drei Stopp-Codons durch Nucleotid-Änderung an den Positionen 2692, 2695 und 2698 des D-ORF-Antigenoms eingeführt.
Vorzugsweise werden 2 Stopp-Codons durch Nucleotid-Änderung an den Positionen 2845 und 2854 des V-ORF Antigenoms eingeführt.
Vorzugsweise wird das C-ORF-Startcodon durch eine Nucleotid-Änderung an Position 1795 von diesem Genom oder Antigenom in ein Threonin-Codon verändert und zwei Stopp-Codons werden durch Änderung der Nucleotide 1813 und 1869 eingeführt.
Vorzugsweise wird das virale Wachstum in Zellkultur verglichen mit dem Wachstum des entsprechenden Wildtyps oder des mutierten Eltern-PIV-Stammes im Wesentlichen 5-10-fach oder mehr abgeschwächt.
Vorzugsweise wird das virale Wachstum im oberen und unteren Respirationstrakt verglichen mit dem Wachstum des entsprechenden Wildtyps oder des mutierten Eltern-PIV-Stammes im Wesentlichen 10-100-fach oder mehr abgeschwächt.
Vorzugsweise wird das virale Wachstum im oberen und unteren Respirationstrakt verglichen mit dem Wachstum des entsprechenden Wildtyps oder des mutierten Eltern-PIV-Stammes im Wesentlichen 100-1.000-fach oder mehr abgeschwächt.
Vorzugsweise ist das Genom oder Antigenom durch Einführung von einer oder mehreren abgeschwächten Mutationen, die in einem biologisch-abgeleiteten mutierten menschlichen PIV identifiziert wurden, weiter modifiziert.
Vorzugsweise beinhaltet das Genom oder Antigenom mindestens zwei abschwächende Mutationen.
Vorzugsweise umfasst das Genom oder Antigenom mindestens eine abschwächende Mutation, die durch multiple Nucleotidänderungen in einem Codon, welches die Mutation spezifiziert, stabilisiert wird.
Vorzugsweise beinhaltet das Genom oder Antigenom mindestens eine und bis zu einem vollständigen Komplement von abschwächenden Mutationen, die im PIV3 JS cp45 vorliegen.
Vorzugsweise beinhaltet das Genom oder Antigenom mindestens eine und bis zu einem vollständigen Komplement von abschwächenden Mutationen, die eine Aminosäuresubstitution an Tyr 942, Leu 992 und/oder Thr 1558 im PIV3-L-Gen; Val 96 und Ser 389 in N; Ile 96 in C; Ile 420 und/oder Ala 550 in F; Val 384 in HN und/oder Nucleotidsubstitutionen im 3'-Leader bei Position 23, 24, 28 und/oder 45 und/oder bei Position 62 in der Genstartsequenz von N spezifizieren.
Vorzugsweise umfasst das Genom oder Antigenom eine zusätzliche Nucleotidmodifikation, die eine phänotypische Änderung spezifiziert, ausgewählt aus einer Änderung in den Wachstumscharaktaristika, Abschwächung, Temperaturempfindlichkeit, Kälteanpassung, Plaquegröße, Wirtsbereichrestriktion oder einer Änderung in der Immunogenität.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine immonogene Zusammensetzung zur Auslösung einer Immunreaktion gegen PIV bereitgestellt, wobei die Zusammensetzung eine immunogen ausreichende Menge des rekombinanten PIV in einem physiologisch akzeptablen Träger umfasst.
Vorzugsweise wird die immunogene Zusammensetzung in einer Dosis von 10³ bis 10⁷ PbE formuliert.
Vorzugsweise wird die immunogene Zusammensetzung zur Verabreichung an den oberen Respirationstrakt durch Spray, Tropfen oder Aerosol formuliert. Vorzugsweise löst das rekombinante PIV eine Immunreaktion gegen ein oder mehrere Viren aus, ausgewählt aus HPIV1, HPIV2 und HPIV3.
Vorzugsweise löst das rekombinante PIV eine Immunantwort gegen HPIV3 und einen anderen Virus aus, ausgewählt aus HPIV1 und HPIV2.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Polynucleotid-Molekül bereitgestellt, umfassend ein rekombinantes PIV-Genom oder -Antigenom, das eine Nucleotidmodifikation einbezieht, umfassend eine partielle oder vollständige Deletion von einem oder mehreren C-, D- oder V-ORF(s) oder eine oder mehrere Nucleotidänderung(en), welche die Expression des einen oder der mehreren C-, D- oder V-ORF(s) reduzieren oder unterdrücken, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation im Genom oder Antigenom eine oder mehrere erwünschte phänotypische Änderungen im rekombinanten PIV spezifiziert, ausgewählt aus (i) Abschwächung in der Zellkultur, (ii) Abschwächung im oberen und/oder unteren Respirationstrakt eines Säugerwirts.
Vorzugsweise ist die Expression des einen oder der mehreren C-, D- oder V-ORF(s) durch Einführung entweder eines oder mehrerer Stopp-Codons, einer Mutation einer RNA-editierenden Stelle, einer Mutation, welche die durch eine Initiationscodon spezifizierte Aminosäure ändert, oder Deletion von einem oder mehreren C-, D- oder V-ORF(s) insgesamt oder zum Teil, reduziert oder unterdrückt.
Vorzugsweise umfasst die Modifikation, die in das Genom oder Antigenom eingeführt wird, eine partielle oder vollständige Deletion von mindestens zwei der C-, D- oder V-ORFs oder eine oder mehrere Nucleotidänderung(en), die eine Expression von mindestens zwei der C-, D- oder V-ORFs reduziert oder unterdrückt.
Vorzugsweise sind die D- und V-ORFs beide durch eine partielle oder vollständige Deletion oder eine oder mehrere Nucleotidänderung(en), die ihre Expression reduzieren oder unterdrücken, modifiziert.
Vorzugsweise ist das rekombinante Genom oder Antigenom weiterhin durch eine oder mehrere abschwächende Mutationen modifiziert.
Vorzugsweise umfasst das isolierte Polynucleotid weiterhin eine Nucleotidmodifikation, die eine phänotypische Änderung spezifiziert, ausgewählt aus einer Änderung in den Wachstumscharakteristika, Abschwächung, Temperaturempfindlichkeit, Kälteanpassung, Plaquegröße, Wirtsbereichrestriktion oder eine Änderung in der Immunogenität.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines infektiösen abgeschwächten rekombinanten PIV-Partikels aus einer oder mehreren isolierten Polynucleotidmolekülen, welche dieses PIV codieren, bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst: Exprimieren eines Expressionsvektors in einer Zelle oder einem zellfreien Lysat, der ein isoliertes Polynucleotid sowie PIV N-, P- und L-Proteine umfasst.
Vorzugsweise werden das chimäre PIV-Genom oder Antigenom sowie die N-, P- und L-Proteine durch zwei oder mehrere unterschiedliche Expressionsvektoren exprimiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Expressionsvektor bereitgestellt, umfassend einen funktionsfähigen verknüpften Transkriptionspromotor, eine Polynucleotidsequenz und einen Transkriptionsterminator.
Hierin beschrieben werden Werkzeuge und Verfahren zum Einführen von definierten, vorbestimmten strukturellen und phänotypischen Änderungen im infektiösen PIV. In einem Beispiel wird ein isoliertes Polynucleotidmolekül bereitgestellt, umfassend einen funktionsfähig verknüpften Transkriptionspromotor, eine Polynucleotidsequenz, die ein PIV-Genom oder -Antigenom codiert und einen Transkriptionsterminator. Das Genom oder Antigenom bezieht eine Knockout-Mutation ein, welche die Expression von einem oder mehreren der C-, D- und/oder V-Gen(e) reduziert oder unterdrückt, oder eine Mutation, welche alle oder einen Teil von einer oder mehreren der C-, D- und/oder V-ORFs deletiert.
Die Expression von einem oder mehreren der C-, D- und/oder V-ORFs kann durch Modifikation des PIV-Genoms oder -Antigenoms reduziert oder unterdrückt sein, indem eine Mutation einbezogen wird, welche das Startcodon für den C-ORF von M auf T verändert, oder ein oder mehrere Stopp-Codons. Alternativ wird ein oder mehrere der C-, D- und/oder V-ORFs vollständig oder teilweise deletiert oder durch andere Mutationen, wie zum Beispiel Punktmutationen modifiziert, um die (das) entsprechende(n) Protein(e) partiell oder vollständig nichtfunktionell zu machen oder die Proteinexpression ganz zu zerstören. Alternativ können Mutationen in der Editierungsstelle ausgeführt werden, welche Editieren verhindern und die Expression von Proteinen unterdrücken, die durch RNA-Editieren zugänglich gemacht werden (Kato et al., EMBO 16:578-587, 1997 und Schneider et al., Virology 227:314-322, 1997).
Der rekombinante PIV, welcher Mutationen in C, D und/oder V aufweist, besitzt höchst wünschenswerte phänotypische Charakteristika für die Impfstoffentwicklung. Die vorstehend identifizierten Modifikationen in dem rekombinanten Genom oder Antigenom spezifizieren eine oder mehrere erwünschte phänotypische Änderungen in dem daraus resultierenden Virus oder subviralen Partikel. Impfstoff-Kandidaten, die auf diese Weise hergestellt werden, zeigen ein oder mehrere Charakteristika, identifiziert als (i) ein Änderung in den Wachstumseigenschaften der Zellkultur, (ii) Abschwächung im oberen und unteren Respirationstrakt des Säugerwirts, (iii) Änderung in der viralen Plaquegröße, (iv) eine Änderung im cytopathischen Effekt und (v) eine Änderung in der Immunogenität.
In den hierin beschriebenen exemplarischen PIV-Rekombinanten, umfassen gewünschte phänotypische Änderungen Abschwächung des Viruswachstums in vitro und/oder in Säugerwirten, verglichen mit dem Wachstum des entsprechenden Wildtyps oder des mutierten Eltern-PIV-Stammes. In einem genaueren Aspekt kann das virale Wachstum in der Zellkultur, zurückführbar auf einen Knockout oder Gen (oder Gensegment)-Deletionsmutationen ungefähr 5-10-fach abgeschwächt sein. Virale Abschwächung im oberen und/oder unteren Respirationstrakt von Säugerwirten wird vorzugsweise 10-100-fach abgeschwächt und manchmal 100-1.000-fach oder mehr, um die Impfstoffentwicklung zu erleichtern. Gleichzeitig haben wie hierin beschriebene rekombinante PIV immunogene Eigenschaften, welche eine schützende Immunantwort gegen WT-PIV-Herausforderung, sowohl in oberen als auch in unteren Respirationstrakten von Säugerwirten, stimulieren.
Das PIV-Genom oder -Antigenom, welches eine C-, D und/oder V-Knockout-Mutation(en) trägt, kann eine menschliche oder nicht-menschliche PIV-Sequenz sein oder eine rekombinante modifizierte Version davon. In einem Beispiel codiert die Polynucleotidsequenz ein chimäres Genom oder Antigenom, umfassend eine menschliche PIV-Sequenz, die mit einer nicht-menschlichen PIV-Sequenz rekombinant verbunden ist, wie zum Beispiel ein Gen oder Gensegment aus Rinder-PIV (BPIV) (siehe z.B. vorläufige U.S. Patentanmeldung mit dem Titel ATTENUATED HUMAN-BOVINE CHIMERIC PARAINFLUEINZA VIRUS VACCINES, eingereicht durch Bailey et al., am 9. Juli 1999 und identifiziert durch die Anwalts-Aktennummer 15280-399000 US).
In weiteren Beispielen codiert das Polynucleotid ein Chimär von Sequenzen aus einem nicht-menschlichen PIV und mindestens einem anderen PIV von menschlichem oder nicht-menschlichen Ursprung.
Außerdem beschrieben wird ein isoliertes infektiöses PIV-Partikel, umfassend ein rekombinantes PIV (rPIV)-Genom oder -Antigenom, das eine C-, D- und/oder V-Knockout-Mutation(en) beinhaltet. Das isolierte infektiöse PIV-Partikel kann ein virales oder subvirales Partikel sein. Wie hierin verwendet bezieht sich subvirales Partikel auf irgendein infektiöses PIV-Partikel, dem ein strukturelles Element fehlt, z.B. ein Gensegement, Gen, Protein oder eine funktionelle Proteindomäne, die in einem vollständigen Virus vorhanden ist (z.B. ein assembliertes Virion, umfassend ein vollständiges Genom oder Antigenom, Nucleocapsid und Hülle). Ein Beispiel eines subviralen Partikels ist daher ein infektiöses Nucleocapsid, umfassend ein Genom oder Antigenom und die Produkte der N-, P- und L-Gene. Andere subvirale Partikel werden durch teilweise oder vollständige Deletionen oder Substituionen von nicht-essentiellen Genen, Genomsegmenten und/oder partiellen oder vollständigen Genprodukten (z.B. F, HN, M oder C), unter andern nicht-essentiellen genomischen und strukturellen Elementen, hergestellt.
In Kombination mit den phänotypischen Effekten, die in dem rekombinanten PIV bereitgestellt werden, das eine C-, D- und/oder V-Deletions- oder (eine) Knockout-Mutation(en) trägt, ist es oft wünschenswert die Abschwächung und den immunogenen Phänotyp durch Einführen von zusätzlichen Mutationen anzupassen, welche die Abschwächung erhöhen oder verringern und/oder die immunogene Aktivität des rekombinanten Virus modulieren. Kandidaten-Impfstoffstämme können daher durch Einfügen von mindestens einer und vorzugsweise zwei oder mehreren unterschiedlichen abschwächenden Mutationen, zum Beispiel Mutationen, die in einer biologisch abgeleiteten PIV-Mutante identifiziert wurden oder empirisch unter Verwendung von rekombinanten Mini-Replikons, rekombinantem Virus oder biologisch abgeleiteten Virus identifiziert wurden, weiter abgeschwächt. Bevorzugte Mutanten-PIV-Stämme sind in diesem Zusammenhang Kälte-passagiert (cp), Kälteangepasst (ca), Wirtsbereich-beschränkt (hr), kleine Plaque (sp) und/oder Temperatur-sensitive (ts)-Mutanten, zum Beispiel der JS HPIV3 cp45-Mutantenstamm. In beispielhaften Ausführungsformen kommen einen oder mehrere abschwächende Mutationen im Polymerase L-Protein vor, z.B. an einer Position, die Tyr942, Leu992 oder Thr1558 von JS cp45 entspricht. Zum Beispiel können Mutationen im N-Protein ausgewählt sein und in eine C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-Mutante eingefügt sein, welche zum Beispiel Aminosäuresubstitution(en) an einer Position codiert, die den Resten Val96 oder Ser389 von JS cp45 entspricht. Alternative oder zusätzliche Mutationen können Aminosäuresubstitution(en) im C-Protein codieren, z.B. an einer Position, entsprechend Ile96 von JS cp45. Noch weitere Mutationen zum Einstellen der Abschwächung einer C-, D- und/oder V-Deletions- oder einer Knockout-Mutante werden im F-Protein gefunden, z.B. an einer Position, die Ile420 oder Ala450 von JS cp45 entspricht und im HN-Protein, z.B. an einer Position entsprechend dem Rest Val384 von JS cp45 (Skiadopoulos et al., J. Virol. 73:1374-1381, 1999).
Abschwächende Mutationen aus biologisch abgeleiteten PIV-Mutationen zur Einfügung in C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-Mutationen umfassen auch Mutationen in nicht-codierenden Abschnitten des PIV-Genoms oder -Antigenoms, zum Beispiel in einer 3'-Leader-Sequenz. Beispielhafte Mutationen können in diesem Zusammenhang an einer Position im 3'-Leader eines rekombinanten Virus an einer Position erzeugt werden, welche dem Nucleotid 23, 24, 28 oder 45 von JS cp45 entspricht (Skiadopoulos et al., J. Virol. 73:1374-1381, 1999).
Noch weitere beispielhafte Mutationen können in der N-Gen-Startsequenz, zum Beispiel durch Änderung von einem oder mehreren Nucleotiden in der N-Gen- Startsequenz, z.B. an einer Position, die dem Nucleotid 62 von JS cp45 entspricht, erzeugt werden.
Aus JS cp45 und anderen biologisch abgeleiteten PIV-Mutationen wird ein großes „Menü" an abschwächenden Mutationen bereitgestellt, wobei jede der Mutationen mit irgendeiner anderen Mutation(en) zur Einstellung eines Abschwächungsgrades in einem rekombinanten PIV kombiniert werden kann, das C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-Mutation(en) trägt. Zum Beispiel können Mutationen innerhalb des rekombinanten PIVs eine oder mehrere und vorzugsweise zwei oder mehrere Mutationen von JS cp45 umfassen. Gewünschte C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-Mutanten der Erfindung, ausgewählt zur Impfstoffverwendung, weisen oft mindestens zwei und manchmal drei oder mehrere abschwächende Mutationen auf, um einen zufriedenstellenden Abschwächungsgrad für umfassende klinische Anwendung zu erzielen.
Rekombinantes PIV, das C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-Mutation(en) trägt, kann eine oder mehrere abschwächende Mutation(en) einschließen, die durch multiple Nucleotid-Substitutionen in einem Codon stabilisiert sind, das die Mutation spezifiziert.
Zusätzliche Mutationen, die in C-, D-, und/oder V-Deletions- oder Knockout-Mutanten eingesetzt oder übertragen werden können, können in nicht-PIV, nicht-segmentierten, Negativ-Strang-RNA-Viren identifiziert werden und in PIV-Mutanten der Erfindung einbezogen werden. Das wird leicht durch Kartierung der Mutation erzielt, die in einem heterologen Negativ-Strang-RNA-Virus zu einer entsprechenden homologen Stelle in dem Empfänger-PIV-Genom oder Antigenom identifiziert wurde und durch Mutieren der bestehenden Sequenz im Empfänger des Mutanten-Genotyps (entweder durch eine identische oder konservative Mutation), wie es in der U.S. Patentanmeldung mit dem Titel PRODUCTION OF ATTENUATED NEGATIVE STRANDED RNA VIRUS VACCINES FROM CLONED NUCLEOTIDE SEQUENCES, eingereicht durch Murphy et al., am 13. April 1999 und identifiziert durch Anwalts-Aktennummer 17634-000600, beschrieben wurde.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Mutationen beziehen infektiöse C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-Mutanten wünschenswerterweise heterologe, codierende oder nicht-codierende Nucleotidsequenzen aus irgendeinem heterologen PIV oder PIV-ähnlichen Virus ein, z.B. HPIV1, HPIV2, HPIV3, Rinder- PIV (BPIV) oder Mäuse-PIV (MPIV), um ein chimäres Genom oder Antigenom zu bilden. Zum Beispiel kann rekombinantes PIV Sequenzen aus zwei oder mehr Wildtyp oder PIV-Mutantenstämmen z.B. HPIV1 und HPIV3 einbeziehen. Alternativ können C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-Mutanten Sequenzen aus einem menschlichen und nicht-menschlichen PIV einbeziehen, z.B. HPIV und BPIV.
Ein oder mehrere menschliches PIV codierende oder nicht-codierende Polynucleotide in einem „Empfänger"- oder „Hintergrund"-Genom oder Antigenom werden mit einer Gegenstück-Sequenz aus einem heterologen PIV oder Nicht-PIV-Virus, alleine oder in Kombination mit einer oder mehreren abschwächenden Punktmutationen substituiert, z.B. cp- und/oder ts-Mutationen, um neue abgeschwächte Impfstoffstämme zu ergeben. Das isolierte infektiöse PIV-Partikel kann ein menschliches PIV, oder menschliches PIV3 (HPIV3) darstellen (siehe z.B. vorläufige U.S. Patentanmeldung mit dem Titel ATTENUATED HUMAN-BOVINE CHIMERIC PARAINFLUEINZA VIRUS VACCINES, eingereicht durch Bailey et al., am 9. Juli 1999 und identifiziert durch die Anwalts-Aktennummer 15280-399000US).
Isolierte, infektiöse PIV-Partikel, die Nucleotidsequenzen von HPIV3 einbeziehen, die mit mindestens einer Sequenz aus einem heterologen PIV verbunden sind, wie zum Beispiel HPIV1, HPIV2, BPIV oder MPIV, werden auch beschrieben. Zum Beispiel können die gesamten Gene von HPIV3 durch Gegenstück-Gene von anderen Formen von PIV, wie zum Beispiel HN- und/oder F-Glykoprotein-Gene von PIV1 oder PIV2 ersetzt werden. Alternativ kann ein ausgewähltes Genomsegment, zum Beispiel ein cytoplasmatischer Schwanz, eine Transmembrandomäne oder eine Ectodomäne von HN oder F von HPIV1 oder HPIV2 für ein entsprechendes Gensegment in einem Gegenstück-HPIV3-Gen ausgetauscht werden, um Konstrukte zu ergeben, die chimäre Proteine codieren, z.B. Fusionsproteine, die einen cytoplasmatischen Schwanz und/oder eine Transmembrandomäne von PIV3 aufweisen, verbunden mit einer Ectodomäne von PIV1 oder PIV2. Alternativ können Gene oder Genomsegmente aus einem PIV hinzugefügt werden (d.h. ohne Substitution) innerhalb eines heterologen PIV-Hintergrunds, um neue immunogene Eigenschaften innerhalb des daraus resultierenden Clons zu erzeugen.
Zusätzlich zu rekombinantem PIV, das C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-Mutationen aufweist, werden verwandte cDNA-Clone, Vektoren und Partikel beschrieben, von denen alle ein oder mehrere der hierin dargelegten gegenständlichen phänotyp-spezifischen Mutationen einbezieht. Diese werden in ausgewählten Kombinationen eingeführt, z.B. in ein isoliertes Polynucleotid, welches ein rekombinantes cDNA-Genom oder -Antigenom darstellt, um nach der Expression, gemäß den hierin beschriebenen Verfahren, ein in geeigneter Weise abgeschwächtes Virus oder subvirales Partikel herzustellen. Dieser Prozess, gepaart mit phänotypischer Routine-Evaluierung, stellt C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-Mutanten bereit, die solche erwünschten Charakteristika wie Attenuierung, Temperatur-Sensitivität, veränderte Immunogenität, Kälteanpassung, kleine Plaquegröße, Wirtsbereichrestriktion, genetische Stabilität usw. besitzen. Insbesondere werden Impfstoff-Kandidaten ausgewählt, die abgeschwächt und trotzdem ausreichend immunogen sind, um eine schützende Immunantwort in dem geimpften Säugerwirt hervorzurufen.
C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-Mutanten, mit oder ohne zusätzliche abschwächende Mutationen, die z.B. aus einem biologisch abgeleiteten Mutantenvirus übernommen werden, können konstruiert werden, um zusätzliche Nucleotidmodifikation(en) aufzuweisen, um eine gewünschte phänotypische, strukturelle oder funktionelle Änderung zu ergeben. Üblicherweise wird die ausgewählte Nucleotid-Modifikation eine phänotypische Änderung spezifizieren, zum Beispiel eine Änderung in den Wachstumscharakteristika, Attenuierung, Temperatursensitivität, Kälteanpassung, Plaquegröße, Wirtsbereichrestriktion oder Immunogenität. Strukturelle Änderungen umfassen in diesem Zusammenhang die Einführung oder Unterdrückung von Restriktionsstellen in PIV-codierende cDNAs zur Erleichterung der Manipulation und Identifizierung.
Nucleotidänderungen innerhalb des Genoms oder des Antigenoms von einer C-, D- und/oder V-Deletions- oder einer Knockout-Mutation, umfassen die Modifikation von einem zusätzlichen viralen Gen durch partielle oder vollständige Deletion des Gens oder Reduktion oder Unterdrückung (Knockout) seiner Expression. Zielgene für die Mutation umfassen in diesem Zusammenhang das Nucleocapsidprotein N, Phosphoprotein P, große Polymerase Untereinheit L, Matrixprotein M, Hämagglutinin-Neuraminidase-Protein HN, Fusionsprotein F. Soweit das rekombinante Virus lebensfähig und infektiös bleibt, kann jedes dieser Proteine selektiv deletiert, substituiert oder neu angeordnet werden, insgesamt oder teilweise, alleine oder in Kombination mit anderen gewünschten Modifikationen, um neue C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-Mutanten zu erzielen. Zum Beispiel kann ein oder mehrere dieser Gene als Ganzes oder teilweise deletiert werden oder seine Expression reduziert oder unterdrückt werden (z.B. durch Einführung eines Stopp-Codons, durch eine Mutation in einer RNA-editierenden Stelle, durch eine Mutation, welche die Aminosäure ändert, die durch ein Initiationscodon oder durch eine Rasterverschiebungsmutation spezifiziert ist), um den Phänotyp des daraus resultierenden rekombinanten Clons zu verändern, um Wachstum, Attenuation, Immunogenität oder andere gewünschte phänotypische Eigenschaften zu verbessern.
Alternative Nucleotidmodifikationen in C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-Mutanten umfassen eine Deletion, Insertion, Addition oder eine Neuanordnung einer cis-agierenden regulatorischen Sequenz für ein ausgewähltes Gen in dem rekombinanten Genom oder Antigenom. In einem Beispiel wird eine cis-agierende regulatorische Sequenz von einem PIV-Gen verändert, um einer heterologen regulatorischen Sequenz zu entsprechen, die eine cis-agierende regulatorische Gegenstück-Sequenz des gleichen Gens in einem unterschiedlichen PIV darstellen kann oder eine cis-agierende regulatorische Sequenz eines unterschiedlichen PIV-Gens. Zum Beispiel kann ein Gen-Endsignal durch Konversion oder Substitution in dem gleichen PIV-Stamm in ein Gen-Endsignal eines unterschiedlichen Gens modifiziert werden. Die Nucleotid-Modifikation kann eine Insertion, Deletion, Substitution oder eine Neuanordnung einer Transkriptions-Startstelle innerhalb des rekombinanten Genoms oder Antigenoms umfassen, z.B. um eine alternative Translations-Startseite für eine ausgewählte Form des Proteins zu unterdrücken.
Außerdem kann eine Vielzahl von anderen genetischen Änderungen in einem PIV-Genom oder -Antigenom hergestellt werden, die eine Deletions- oder ein Knockout von C-, D- und/oder V aufweist, alleine oder gemeinsam mit einer oder mehreren abschwächenden Mutationen, die aus einer biologisch abgeleiteten PIV-Mutante übernommen wurden. Zum Beispiel können Gene oder Genomsegmente aus nicht-PIV-Quellen vollständig oder teilweise inseriert werden. Alternativ kann die Reihenfolge der Gene geändert werden oder ein PIV-Genompromotor kann mit seinem Antigenom-Gegenstück ersetzt werden. Unterschiedliche oder zusätzliche Modifikationen in dem rekombinanten Genom oder Antigenom können durchgeführt werden, um Manipulationen wie zum Beispiel die Insertion von einmaligen Restriktionstellen in verschiedenen intergenomischen Regionen oder anderswo zu erleichtern. Nicht-translatierte Gensequenzen können entfernt werden, um die Kapazität für die Insertion von Fremdsequenzen zu erhöhen.
In noch weiteren Aspekten können Polynucleotid-Moleküle oder Vektoren, welche das rekombinante PIV-Genom oder -Antigenom codieren, modifiziert werden, um Nicht-PIV-Sequenzen, z.B. ein Cytokin, ein T-Helfer-Epitop, einen Restriktionsmarker, oder ein Protein eines mikrobiellen Pathogens (z.B. ein Virus, Bakterium oder einen Pilz) zu codieren, die im Stande sind, in einem beabsichtigten Wirt eine schützende Immunantwort hervorzurufen. C-, D- und/oder V-Deletion und Knockout-Mutanten, die ein Gen oder Genomsegment aus einem respiratorischen Synzytialvirus (RSV) einbeziehen, zum Beispiel ein Gen, das ein antigenes Protein codiert (z.B. ein F oder G-Protein), immunogene Domäne oder Epitop von RSV, werden konstruiert.
Zusammensetzungen (z.B. isolierte Polynucleotide und Vektoren, welche eine PIV-codierende cDNA einbeziehen) und auch Verfahren zur Herstellung eines isolierten infektiösen rekombinanten PIV werden beschrieben, das eine C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-Mutation(en) trägt. Einbezogen innerhalb dieser Beispiele sind neue, isolierte Polynucleotid-Moleküle und Vektoren, die solche Moleküle einbeziehen, welche ein PIV-Genom oder -Antigenom umfassen, das durch eine partielle oder vollständige Deletion der C-, D- und/oder V-ORFs oder einer oder mehrerer Nucleotidänderungen modifiziert ist, welche die Expression davon reduzieren oder unterdrücken. Außerdem beschrieben wird der gleiche oder ein unterschiedlicher Expressionsvektor, umfassend eine oder mehrere isolierte Polynucleotid-Moleküle, die N-, P- und L-Proteine codieren. Diese Proteine können auch direkt aus der Genom- oder Antigenom-cDNA exprimiert werden. Der (die) Vektor(en) kann (können) in einem Zell- oder zellfreien Lysat exprimiert oder coexprimiert werden und dadurch ein infektiöses C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-PIV-Mutantenpartikel oder subvirales Partikel erzeugen.
Die vorstehenden Verfahren und Zusammensetzungen zum Herstellen einer C-, D- und/oder V-Deletions- und Knockout PIV-Mutante ergeben infektiöse virale oder subvirale Partikel oder Derivate davon. Ein infektiöses Virus ist mit dem authentischen PIV-Viruspartikel vergleichbar und ist genauso infektiös. Es kann frische Zellen direkt infizieren. Ein infektiöses subvirales Partikel ist üblicherweise eine Unterkomponente des Viruspartikels, die eine Infektion unter geeigneten Bedingungen initiieren kann. Zum Beispiel ist ein Nucleocapsid, das die genomische oder antigenomische RNA und die N-, P- und L-Proteine enthält ein Beispiel für ein subvirales Partikel, das eine Infektion initiieren kann, wenn es in das Cytoplasma der Zellen eingeführt wird. Subvirale Partikel umfassen virale Partikel, welchen ein oder mehrere Protein(e), Proteinsegment(e) oder andere virale Komponenten fehlen.
Außerdem wird eine Zelle oder ein zellfreies Lysat beschrieben, das den Expressionsvektor enthält, der ein isoliertes Polynucleotidmolekül umfasst, umfassend ein C-, D- und/oder V-Deletions- oder ein wie vorstehend beschriebenes Knockout-Mutanten-PIV-Genom oder -Antigenom und einen Expressionsvektor (der gleiche oder ein unterschiedlicher Vektor), der ein oder mehrere isolierte Polynucleotidmoleküle umfasst, welche die N-, P- und L-Proteine von PIV codieren. Ein oder mehrere dieser Proteine können auch aus der Genom- oder Antigenom-cDNA exprimiert werden. Nach der Expression vereinigen sich Genom oder Antigenoms und N, P und L, um ein infektiöses PIV-Virus oder subvirales Partikel zu bilden.
Ferner wird eine Zelle oder ein zellfreies Expressionssystem (z.B. ein Zellfreies Lysat) beschrieben, das einen Expressionsvektor einschließt, der ein isoliertes Polynucleotidmolekül umfasst, das ein PIV-Genom oder -Antigenom codiert, das (eine) C-, D- und/oder V-Knockout-Mutation(en) trägt und einen Expressionsvektor, der ein oder mehrere isolierte Polynucleotidmoleküle umfasst, welche die N-, P- und L-Proteine von einem PIV codieren. Nach der Expression vereinigen sich das Genom oder Antigenom und N, P und L-Proteine, um ein infektiöses PIV-Partikel, wie zum Beispiel ein virales oder subvirales Partikel, herzustellen.
Die rekombinanten PIVs sind in verschiedenen Zusammensetzungen nützlich, um eine gewünschte Immunantwort gegen PIV in einem Wirt hervorzurufen, der für eine PIV-Infektion empfänglich ist. Abgeschwächte C-, D- und/oder V-Deletions- und Knockout-Mutanten sind im Stande, in einem infizierten Säugerwirt eine schützende Immunantwort hervorzurufen, sind jedoch ausreichend abgeschwächt, damit sie keine unwillkommenen Symptome einer schweren Atemwegserkrankung in dem immunisierten Wirt hervorrufen. Dieses abgeschwächte Virus oder subvirale Partikel kann in einem Zellkulturüberstand vorhanden sein, der aus der Kultur isoliert wird, oder partiell oder vollständig gereinigt sein. Das Virus kann auch lyophilisiert werden und kann mit einer Vielzahl an anderen Komponenten für die Lagerung oder Verabreichung an den Wirt wie erwünscht kombiniert werden.
Auch beschrieben werden Impfstoffe, umfassend einen physiologisch akzeptablen Träger und/oder Hilfsstoff und ein isoliertes, abgeschwächtes C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout PIV-Mutantenpartikel oder subvirales Partikel.
Der Impfstoff besteht aus einer C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout PIV-Mutante, welche mindestens eine und vorzugsweise zwei oder mehrere zusätzliche Mutationen oder andere Nucleotidmodifikationen aufweist wie sie vorstehend beschrieben werden, um ein geeignetes Gleichgewicht von Abschwächung und Immunogenität zu erzielen. Der Impfstoff kann in einer Dosis von 10³ bis 10⁷ PbE an abgeschwächtem Virus formuliert sein. Der Impfstoff kann abgeschwächtes C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-Virus umfassen, das eine Immunantwort gegen einen einzelnen PIV-Stamm oder gegen mehrere PIV-Stämme hervorruft. In diesem Zusammenhang kann die C-, D- und/oder V-Deletions- und Knockout-PIV-Mutante in einer Impfstoff-Rezeptur mit anderen PIV-Impfstoffstämmen vereinigt sein oder mit anderen viralen Impfstoffviren, wie zum Beispiel RSV.
Ferner beschrieben wird ein Verfahren zum Stimulieren des Immunsystems einer Person, um eine Immunreaktion gegen PIV in einer Säugertestperson hervorzurufen. Das Verfahren umfasst das Verabreichen einer Rezeptur einer immunologisch ausreichenden Menge an abgeschwächter C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-PIV-Mutante in einem physiologisch verträglichen Träger und/oder Hilfsstoff. Die immunogene Zusammensetzung ist ein Impfstoff, umfassend eine C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-PIV-Mutante, welche mindestens ein und vorzugsweise zwei oder mehrere abschwächende Mutationen oder andere Nucleotid-Modifikationen aufweist, welche wie vorstehend beschrieben einen gewünschten Phänotyp spezifizieren. Der Impfstoff kann in einer Dosis von 10³ bis 10⁷ PbE an abgeschwächtem Virus formuliert sein. Der Impfstoff kann eine abgeschwächte C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-PIV-Mutante umfassen, das eine Immunreaktion gegen ein einzelnes PIV, gegen multiple PIVs, z.B. HPIV1 und HPIV3 oder gegen ein oder mehrere PIV(s) und ein nicht-PIV-Pathogen wie zum Beispiel RSV hervorruft. In diesem Zusammenhang kann eine C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-PIV-Mutante eine monospezifische Immunantwort oder eine polyspezifische Immunantwort gegen multiple PIVs oder gegen ein oder mehrere PIVs und ein Nicht-PIV-Pathogen wie zum Beispiel RSV, hervorrufen. Alternativ kann eine C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-PIV-Mutante, die unterschiedliche immunogene Charakteristika aufweist in einem Impfstoffgemisch kombiniert werden oder getrennt in einem koordinierten Behandlungsprotokoll verabreicht werden, um effektiveren Schutz gegen ein PIV, gegen multiple PIVs oder gegen ein oder mehrere PIVs) und ein nicht-PIV-Pathogen wie zum Beispiel RSV, hervorzurufen.
Die immunogene Zusammensetzung kann z.B. durch Spray, Tropfen oder Aerosol an den oberen Respirationstrakt verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun mit Bezugnahme auf die begleitenden Darstellungen beschrieben werden. Es soll festgehalten werden, dass der Schutzbereich des gewährten Schutzes so besteht, wie er in den Ansprüchen definiert ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER DARSTELLUNGEN
1 zeigt die Organisation der HPIV3 P/C/V-ORFs (nicht im Maßstab). Die drei Leserahmen der P-mRNA werden in (+1, +2 und +3) gezeigt, mit den P-, C-, D- und V-ORFs dargestellt als Rechtecke. Aminosäurelängen werden angezeigt. Die Position der RNA-editierenden Stelle wird als eine vertikale Linie gezeigt und ihr Sequenzmotiv wird gezeigt und gemäß seiner Nucleotidposition in der vollständigen HPIV3 antigenomischen Sequenz nummeriert. Feld A zeigt die Organisation der nicht editierten P-mRNA genau. Die Sequenz, welche die Translations-Startseiten der P und C-ORFs enthält, wird gezeigt und ist entsprechend der vollständigen antigenomischen Sequenz nummeriert. Die Nucleotid-Positionen der P-, C-, D-, und V-ORFs in der vollständigen antigenomischen Sequenz des JS-Wildtypclons sind: P, 1784-3595; C, 1794-2393; D, 2442-2903; V, 2792-3066. Relativ zur P-mRNA liegt das AUG, welches den P-ORF eröffnet an Positionen 80-82. Feld B zeigt die Organisation einer editierten Version der P-mRNA genau, welche eine Insertion von zwei nicht in der Matrize vorliegenden G-Resten (GG) in der Editierungsstelle zeigt. Das verändert das Leseregister, sodass das stromaufwärts-Ende des P-ORFs im Rahmen +2 mit dem D-ORF im Rahmen +3 verbunden ist. Das resultierende chimäre Protein enthält die N-terminalen 241 Aminosäuren, die durch den P-ORF codiert werden, verbunden mit den C-terminalen 131 Aminosäuren, die durch den D-ORF codiert werden. Feld C zeigt die Positionen von beispielhaften Mutationen, welche die C-, D- und V-ORFs unterbrechen, welche auf der editierten Version der P-mRNA von Feld B dargestellt sind. Eingeführte Stopp-Codons werden durch vertikale Linien innerhalb der Rechtecke dargestellt. Der C-ORF wurde modifiziert, um Codon 1 von M nach T zu verändern und Codons 7 und 26, um Stopp-Codons zu erzeugen. Der D-ORF wurde modifiziert, um Stopp-Codons an den Codons 304, 305 und 306 zu erzeugen, die gemäß dem 372-Aminosäure-chimären D-Protein nummeriert sind, welches die N-terminalen 241 Aminosäuren von P enthält, das mit dem C-terminalen 131 Aminosäuren von D verbunden ist. Der V-ORF wurde modifiziert, um Stopp-Codons an den Codons 17 bis 20 einzuführen. Diese letzteren zwei Mutationen resultierten in Aminosäuresubstitutionen an den Codons 354 und 357 des D-ORFs (Sterne).
2 stellt einen Radioimmun-Präzipitationstest bereit, der zeigt, dass die Expression des C-Proteins im Virus rC-KO aufgehoben wurde. In Spur (a) wurden ³⁵S-markierte Zelllysate mit einem polyclonalen, C-spezifischen Kaninchen-Antiserum immunpräzipitiert. Eine 22kD Bande, welche dem C-Protein entspricht (offener Pfeil) ist in rJS eindeutig vorhanden, fehlt aber in Spur (a) von rC-KO. Spur (b): Zelllysate wurden durch ein Gemisch aus zwei monoclonalen Antikörpern immunpräzipitiert, die spezifisch für das HPIV3 HN-Protein sind. Die 64 kD Bande, die dem HN-Protein entspricht (geschlossener Pfeil) ist in beiden Virus-Lysaten vorhanden, was bestätigt, dass sie tatsächlich HPIV3 darstellen und ähnliche Proteinmengen exprimieren.
3 zeigt die Ergebnisse der Multizyklus-Replikation der beispielhaften Knockout-Mutanten rC-KO und rDV-KO, verglichen mit dem Elternvirus rJS. Die Virustiter werden als TCID₅₀/ml gezeigt und sind der Durchschnitt der Proben in zweifacher Ausführung.
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinantes PIV (rPIV) bereit, in welchem die Expression von einem oder mehreren der C-, D- und/oder V-ORFs reduziert oder unterdrückt ist, um eine Zusammensetzung von neuen PIV-Impfstoffkandidaten zu erhalten. Expression der C-, D- und/oder V-ORFs kann durch Modifizieren eines rekombinanten PIV-Genoms oder Antigenoms reduziert oder unterdrückt werden, um eine Mutation einzubeziehen, welche die Änderungen in der Codierungs-Festsetzung des Initiationscodons des C-ORF oder eine oder mehrere Stopp-Codons in dem C-, D- und/oder V-ORF verändert. Andere Änderungen, um Zerstörung der C-, D- und/oder V-Expression oder Expression der Funktion von (vom) entsprechenden Protein(en) zu erzielen, um abgeschwächte PIV-Impfstoffkandidaten zu erzeugen, umfassen partielle oder vollständige Deletion der C-, D- und/oder V- codierenden Sequenz(en), im gesamten oder einem Teil, um die (das) C-, D- und/oder V-Protein(e) partiell oder vollständig nichtfunktionell zu machen oder ihre Expression zu beenden.
HPIV3 ist ein Mitglied der neu benannten Gattung Respirovirus der Familie der Paramyxoviridae in der Ordnung der Mononegavirales. Sein Genom ist ein einzelner Strang an Negativ-Sense-RNA, 15462 Nucleotide (nt) lang (Galinski et al., Virology 165:499-510, (1988); Stokes et al., Virus Res. 25:91-103 (1992)). Mindestens acht Proteine werden durch PIV3 codiert: das Nucleocapsidprotein N, das Phosphoprotein P, das nicht-strukturelle Protein C, das D-Protein, das Matrixprotein M, das Fusions-Glykoprotein F, das Hämagglutinin-Neuraminidaseprotein HN und das große Polymeraseprotein L (Collins et al., S. 1205-1243. In B.N. Fields (Knipe et al., Hrsg.), Fields Virology, 3. Ausgabe, Bd. 1 Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
Die M-, HN- und F-Proteine sind mit der Hülle assoziiert und die letzteren zwei sind Oberflächenproteine, welche, wie es bei jedem PIV der Fall ist, die Haupt-Neutralisierungs- und Schutzantigene darstellen (Collins et al., 3. Ausgabe In „Fields Virology" (B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R. M. Chanock, J. L. Melnick, T.P. Monath, B. Roizman, und S. E. Straus, Hrsg.) Bd. 1, S. 1205-1243. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996). Von der signifikanten Sequenzdivergenz zwischen vergleichbaren PIV-HN- oder -F-Proteinen unter den PIVs wird angenommen, dass sie die Basis für die Typ-Spezifität der schützenden Immunität ist (Collins et al., 3. Ausgabe In „Fields Virology" (B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R. M. Chanock, J. L. Melnick, T.P. Monath, B. Roizman, und S. E. Straus, Hrsg.) Bd. 1, S. 1205-1243. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996; Cook et al., Amer Jour Hyg 77:150-159,1963; Ray et al., J Infect. Dis. 162:746-9, 1990).
Alle HPIV3-Gene werden als einzelne mRNA transkribiert, die ein einzelnes Protein codiert, mit der Ausnahme, der P-mRNA, welche vier ORFs enthält, nämlich P, C, D und V (1) (Galinski et al., Virology 186:543-550, 1992; Spriggs et al., J. Gen Virol. 67;2705-2719, 1986). Die P- und C-Proteine werden von getrennten überlappenden ORFs in der mRNA translatiert (1). Während alle Paramyxoviren ein P-Protein codieren, codieren nur die Mitglieder der Gattung Respirovirus und Morbillivirus ein C-Protein. Einzelne Viren variieren in der Zahl der vom C-ORF exprimierten Proteine und in ihrer Wichtigkeit in der Replikation des Virus in vitro und in vivo. Sendai-Virus (SeV) exprimiert vier unabhängig initiierte Proteine vom C-ORF: C', C, Y1 und Y2, deren Transkriptions-Startseiten in dieser Reihenfolge auf der mRNA erscheinen (Curran, et al., Enzyme 44:244-9, 1990; Lamb et al., S. 181-214. In D. Kingsbury (Hrsg.), The Paramyoviruses. Plenum Press, New York, 1991), wohingegen HPIV3 und das Masernvirus (MV) nur ein einzelnes C-Protein exprimieren (Bellini et al., J Virol. 53:908-19, 1985; Sanchez et al., Virolo 147:177-86, 1985; Spriggs et al., J Gen Virol. 67:2705-2719, 1986).
Ein lebensfähiges rekombinantes SeV, in welchem alle vier von C stammenden Proteine unterdrückt waren, wurde in vitro ineffizient repliziert (Kurotari et al., Genes Cells 3:111-124, 1998), wohingegen Ablatierung von einzelnen C-Proteinen komplexe Wirkungen hatte (Cadd et al., J Virol. 70:5067-74, 1996; Curran et al., Virology 189:647-56, 1992; Latorre et al., J Virol. 72:5984-93, 1998). Ein rekombinantes SeV, das eine einzelne Punktmutation trägt, die in einer Phenylalanin (F)- nach Serin (S)-Substitution an der Aminosäureposition 170 des C-Proteins resultiert, war in Mäusen abgeschwächt, aber seine Replikation in der Zellkultur war nicht gestört (Garcin et al., Viroligy 238:424-431, 1997; Itoh et al., J Gen Virol. 78:3207-15, 1977). Im deutlichen Gegensatz zu SeV replizierte ein C-minus-Masernvirus (MV) effizient in Verozellen (Radecke et al., Virology 217:418-21, 1996), obwohl es in menschlichen peripheren Blutzellen Restriktion der Replikation zeigte und in vivo etwas abgeschwächt zu sein schien (Escoffier et al., J Virol. 73:1695-8, 1999; Valsamakis et al., J Virol. 72:7754-61, 1998).
Zusätzlich zu den P- und C-ORFs hat die P-mRNA von PIV3 zwei andere ORFs und zwar D und V. Das PIV3 D-Protein, ein Fusionsprotein der P- und D-ORFs, wird vom P-Gen durch den Prozess der Transkriptionseditierung oder RNA-Editierung exprimiert, in welcher zwei nicht in der Matrize vorliegende G-Reste an der RNA-Editierungsstelle zu der P-mRNA hinzugefügt werden. (1) (Galinski et al. Virology 186:543-550, 1992; Pelet et al., EMBO J. 10:443-8, 1991). BPIV3 ist das einzige Paramyxovirus, das ein D-Protein exprimiert, und es führt das durch den gleichen Mechanismus aus.
Fast alle Mitglieder der Gattung Respirovirus, Rubulavirus und Morbillivirus exprimieren ein V-Protein. Das eine Mitglied, das es offensichtlich nicht tut, ist HPIV1, welchem der intakte V-ORF fehlt (Matsuoka et al., J Virol. 65:3406-10, 1991).
Der V-ORF ist durch die Anwesenheit einer Cystein-reichen Domäne gekennzeichnet, die hoch konserviert ist (Cattaneo et al., Cell 56:759-64, 1989; Park et al., J Virol. 66:7033-9, 1992; Thomas et al., Cell 54:891-902, 1988; Vidal et al., J Virol. 64:239-46, 1990). Der V-ORF wird in jedem der HPIV3-Viren, die bis heute sequenziert wurden, beibehalten, was darauf hindeutet, dass dieser ORF exprimiert ist und eine Funktion für dieses Virus behält (Galinski et al., Virology 155:46-60, 1986; Spriggs et al., J Gen Virol. 67:2705-2719, 1986; Stokes et al., Virus Res. 25:91-103, 1992).
Das BPIV3 V-Protein wird exprimiert, wenn ein nicht in der Matrize vorhandener G-Rest an der RNA-Editierungsstelle hinzugefügt wird (Pelet et al., EMBO J 10:443-8, 1991). Im Falle von HPIV3 liegen jedoch zwei bis vier Translations-Stopp-Codons zwischen der Editierungsstelle und dem V-ORF und es ist nicht klar, ob HPIV3 ein anderes Beispiel darstellt, in dem dieser ORF nicht exprimiert wird, oder ob er durch irgendeinen anderen Mechanismus exprimiert wird. Eine Möglichkeit ist, dass HPIV3-Editierung auch an einer zweiten, stromabwärts gelegenen Stelle im P-Gen stattfindet, obwohl das in der Zellkultur nicht vorzukommen schien (Galinski et al., Virology 186:543-550, 1992).
Alternativ könnte es sein, dass Ribosomen durch ribosomale Rasterverschiebung Zugang zum V-ORF erlangen. Das wäre mit der Situation mit dem P-Locus von MV vergleichbar. MV exprimiert C-, P- und V-Proteine, exprimiert aber auch neues R-Protein, das durch Rasterverschiebung vom P-ORF auf den V-ORF synthetisiert wird (Liston et al., J Virol. 69:6742-50, 1995).
Obwohl das Mittel durch welches HPIV3 sein V-Protein exprimiert, unklar ist, deutet die extreme Konservierung seines V-ORFs in unterschiedlichen Stämmen darauf hin, dass es tatsächlich exprimiert wird. Die Funktion des V-Proteins ist nicht gut definiert, aber V-minus-MV und -SeV-Rekombinanten sind gewonnen worden, welche in vitro effizient replizieren, aber in vivo reduzierte Replikation zeigen (Delenda, et al., Virology 228:55-62, 1997; Delena et al., Virology 242:327-37, 1998; Kato et al., EMBO J. 16:578-587, 1997; Kato et al., J. Virol. 71:7266-7272, 1997; Valsamakis et al., J. Virol. 72:7754-61, 1998).
Das virale Genom von PIV enthält auch extragene Leader- und Trailer-Regionen, welche Promotoren besitzen, die für die virale Replikation und Transkription benötigt werden. Die genetische Karte von PIV wird daher als ein 3'-Leader-N-P/C/D/V-M-F-HN-L-5'-Trailer dargestellt. Die Transkription wird am 3'-Ende initiiert und durch einen sequenziellen Stopp-Start-Mechanismus fortgesetzt, der durch kurze konservierte Motive gelenkt wird, die an den Genübergängen liegen. Das Stromaufwärts-Ende von jedem Gen enthält ein Gen-Start (GS)-Signal, welches die Initiation der jeweiligen mRNA lenkt. Der Stromabwärts-Terminus von jedem Gen enthält ein Gen-Ende (GE)-Motiv, welches die Polyadenylierung und Termination lenkt. Beispielhafte Sequenzen sind für den menschlichen PIV3-Stamm JS beschrieben worden (GenBank Zugangsnummer Z11575) und Washington (Galinski M.S. In Kingsbury, D.W. (Hrsg.), The Paramyxoviruses, Seiten 537-568, Plenum Press, New York, 1991), und für den Rinder-PIV3-Stamm 910N (GenBank Zugangsnummer D80487).
Wie hierin verwendet bezieht sich „PIV-Gen" allgemein auf einen Teil des PIV-Genoms, der eine mRNA codiert und üblicherweise an dem Stromaufwärts-Ende mit einem Gen-Start (GS)-Signal beginnt und am Stromabwärts-Ende mit dem Gen-Ende (GE)-Signal endet. Der Begriff PIV-Gen ist auch mit dem Begriff „offener Translations-Leserahmen" oder ORF austauschbar. Zusätzlich zu Genen enthält das virale Genom von PIV auch nicht-codierende, intergene Sequenzen und extragene Leader- und Trailer-Regionen, welche Promotoren besitzen, die für die virale Replikation und Transkription benötigt werden. Die Genkarte von PIV ist daher partiell als 3'Leader-N-P/C/D/V-M-F-HN-L-5'Trailer dargestellt. Transkription initiiert am 3'-Ende und wird durch einen sequentiellen Stopp-Start-Mechanismus fortgesetzt, der durch kurze konservierte Motive geleitet wird, die an den Genübergängen liegen. Um die C-, D- und/oder V-Deletionsmutanten der Erfindung zu konstruieren, können ein oder mehrere PIV-Gen(e) ganz oder teilweise deletiert werden. Das bedeutet, dass teilweise oder vollständige Deletionen in den offenen Leserahmen und/oder cis-agierenden regulatorischen Sequenzen von irgendeinem oder mehreren der PIV-Gene durchgeführt werden können. Mit „Gensegement" ist jede Länge an fortlaufenden Nucleotiden aus dem PIV-Genom gemeint, die Teil von einem ORF, einem Gen oder einer extragenen Region oder einer Kombination davon sein kann.
Alternative Mittel zur Konstruktion von C-, D- und/oder V-Mutanten der Erfindung umfassen die Konstruktion von „Knockout"-Viren, um die Genexpression von wesentlichen Teilen des PIV-Genoms ohne Deletion zu reduzieren oder zu unterdrücken. Insbesondere wird die Expression der C-, D- und/oder V-ORF(s) vorzugsweise reduziert oder unterdrückt indem das rekombinante PIV-Genom oder Antigenom durch Einführung eines Stopp-Codons, durch eine Mutation ein einer RNA-Editierungsstelle, durch eine Mutation, welche die durch ein Initiationscodon spezifizierte Aminosäure ändert oder durch eine Rasterverschiebungsmutante in dem (den) ORF(s), modifiziert wird, auf den(die) abgezielt wird. Eine Mutation kann an der Editierungsstelle durchgeführt werden, welche das Editieren verhindert und die Expression der Proteine unterdrückt, deren mRNA durch RNA-Editierung erzeugt wird (Kato et al., EMBO J. 16:578-587, 1997 und Schneider et al., Virology 227:314-322, 1997).
Das PIV-Genom oder Antigenom kann einer Mutagenese unterzogen werden, um eine oder mehrere Stopp-Codons in die C-, D- und/oder V-ORF(s) einzuführen. In einem Beispiel wird ein Methionin-Initiationscodon im C-ORF in Threonin verändert. In einem anderen Beispiel werden zwei Stopp-Codons durch Mutationen an der Nucleotidposition (nt) 1795 (verändern von T nach C) und nt 1813 (verändern von C nach A) im Genom oder Antigenom eingeführt, die Stopp-Codons entsprechend an den Positionen 7 bis 26 des C-ORFs einführen. Das erzeugt ein C-Knockout Mutantenvirus, das als rC-KO bezeichnet wird. In drei anderen Mutantenviren wurden die D- und V-ORFs einzeln und in Kombination unterbrochen. In der einzelnen D-Knockout-Mutante, bezeichnet als rD-KO, wurden Mutationen eingeführt, um die Expression des D-ORFs zu unterbrechen, welche C nach A-Änderungen an den Nucleotidpositionen 2692, 2695 und 2698 des Volllängen-Antigenoms einführten. Diese Punktmutationen erzeugten drei aufeinander folgende Stopp-Codons im mutmaßlichen D-ORF, was in der verfrühten Termination des D-Proteins resultierte, gefolgt von Codon 303 innerhalb eines 372-Aminosäure chimären D-Proteins. In anderen Beispielen wurde eine einzelne V-Knockout-Mutante, rV-KO, durch Einführung von zwei Punktmutationen an den Positionen 2845 (A nach T) und 2854 (C nach T) des Volllängen-Antigenoms, erzeugt. Diese Mutationen erzeugten frühe Stopp-Codons (Aminosäureposition 17 und 20) in dem mutmaßlichen V-ORF. Die Änderungen in rD-KO und rV-KO wurden gemeinsam in einen einzelnen Clon eingeführt, um eine DV-Kombinations-Knockout-Mutante, rDV-KO, zu erzeugen.
Wie vorstehend angemerkt besitzt das PIV der Erfindung, das eine oder mehrere Mutationen in den C-, D- und/oder V-ORF(s) trägt, höchst wünschenswerte phänotypische Eigenschaften für die Impfstoffentwicklung. Die hierin beschriebenen Modifikationen, welche die C-, D- und/oder V-ORF(s) ganz oder teilweise deletieren, oder die Expression der C-, D- und/oder V-ORF(s) reduzieren oder unterdrücken, spezifizieren eine Reihe an erwünschten phänotypischen Änderungen im daraus resultierenden Virus oder subviralen Partikel. C-, D- und/oder V-Deletion und Knockout-Mutanten zeigen verglichen mit dem Wachstum eines entsprechenden Wildtyps oder mutierten Eltern-RSV-Stammes, abgeschwächtes virales Wachstum. Wachstum, zum Beispiel in Zellkulturen, kann insgesamt, verglichen mit dem Wachstum des entsprechenden Wildtyps oder des mutierten Eltern-RSV-Stammes, etwa zweifach, öfter etwa 5-fach und vorzugsweise etwa 10-fach oder mehr reduziert sein (wie z.B. nach ein 7-tägigen Kulturdauer gemessen). In genaueren Aspekten zeigt das rekombinante RSV der Erfindung eine geänderte Kinetik des viralen Wachstums.
Rekombinante Impfstoffviren, die C-, D- und/oder V-ORF-Deletions- und Knockout-Mutation(en) tragen, können in vivo auch Attenuierungs-Phänotypen zeigen. Zum Beispiel kann die Replikation im unteren und/oder oberen Respirationstrakt in einem akzeptablen Tiermodell für PIV-Replikation in Menschen, z.B. Hamstern und Afrikanischen grünen Affen (AGMs), verglichen mit dem Wachstum des entsprechenden Wildtyp oder mutierten Eltern-PIV-Stammes um insgesamt etwa zweifach, öfter etwa 5-fach, 10-fach oder 20-fach und vorzugsweise etwa 100-fach bis 1.000-fach oder mehr reduziert sein (wie z.B. an einem oder jedem von 3 bis 8 aufeinander folgenden Tagen nach der Infektion gemessen). Zusätzlich dazu oder in Verbindung damit können die vorstehend angeführten Abschwächungs-Phänotypen, rekombinantes PIV, das C-, D- und/oder V-ORF-Deletion und Knockout-Mutation(en) trägt, auch eine Änderung in der viralen Plaquegröße; eine Änderung im cytopathischen Effekt und/oder eine Änderung in der Immunogenität zeigen.
Eine besondere Eigenschaft der rekombinanten Impfstoffviren der Erfindung ist es, dass sie, obwohl sie wie vorstehend angemerkt abgeschwächt sind, trotzdem infektiös sind und einen gewünschten Grad an anti-PIV-Immunreaktivität in dem geimpften Wirt hervorrufen. Insbesondere sind die Kandidaten-Impfstoff-Rekombinanten der Erfindung ausreichend immunogen, damit sie eine schützende Immunreaktion gegen folgende Herausforderungen durch ein wt-Virus hervorrufen. Wie in den Beispielen hierin gezeigt, induzierte eine frühere Infektion mit C-, D- und/oder V-Knockout Mutantenviren sowohl in Hamstern als auch in AGMs eine erhebliche HAI-Antikörperantwort zu HPIV3, was darauf hindeutet, dass diese experimentellen Rekombinanten schützend sind und daher vielversprechende Impfstoffkandidaten darstellen. In den Impfstoff-Rekombinanten wird die immunogene Aktivität gegen den Attenuierungsgrad abgewogen werden, um nützliche Impfstoffkandidaten zu erhalten und wird insgesamt üblicherweise durch eine Reduktion der Replikation des Herausforderungsvirus z.B. rJS HPIV3 im unteren und/oder oberen Respirationstrakt von Modellwirten (z.B. Hamster und nicht-menschliche Primaten) um etwa 50-100-fach, 100-500-fach, vorzugsweise 500-2.000-fach und bis zu 3.000-fach oder mehr gekennzeichnet sein (z.B. wie gemessen zwischen 3-8 Tagen nach der Herausforderung). Die rekombinanten Impfstoffviren der Erfindung behalten die Immunogenität bei während sie gleichzeitige Reduktionen in Replikation und Wachstum zeigen. Die überraschende Zusammenstellung von phänotypischen Merkmalen ist für die Impfstoffentwicklung höchst wünschenswert.
Die vorliegende Erfindung stellt die Entwicklung von lebend-abgeschwächten RSV-Impfstoffkandidaten bereit, welche die C-, D- und/oder V-ORF(s)-Deletions- oder Knockout-Mutationen einbeziehen. Diese rekombinanten Viren werden über eine cDNA-Zwischenstufe und ein auf cDNA basierendes Wiederfindungssystem konstruiert. Rekombinante Viren, die aus cDNA gemacht werden, replizieren unabhängig und werden in der gleichen Weise propagiert als ob sie biologisch- abgeleitet wären. C-, D- und/oder V-ORF(s)-Deletions- und Knockout-Mutanten werden ferner modifiziert, um spezifische abschwächende Mutationen einzubeziehen, sowie auch eine Vielzahl an anderen Mutationen und Nucleotidmodifikationen, um gewünschte strukturelle oder phänotypische Wirkungen zu ergeben. Genaue Beschreibungen der Materialien und Verfahren zur Herstellung von rekombinantem PIV aus cDNA und für die Herstellung und das Testen der ganzen Auswahl an Mutationen und Nucleotidmodifikationen, die hierin dargelegt werden, werden z.B. in Durbin et al., Virology 235:323-332, 1997; U.S. Patentanmeldungs-Seriennummer 09/083.793, eingereicht am 22. Mai 1998; vorläufige U.S. Anmeldungsnummer 60/047.575, eingereicht am 23. Mai 1997 (entsprechend der Internationalen Veröffentlichungsnummer WO 98/53078) und der vorläufigen U.S. Anmeldungsnummer 60/059.385, eingereicht am 19. September 1997, bereitgestellt.
Insbesondere beschreiben diese Dokumente Verfahren und Methoden zur Mutagenisierung, Isolierung und Charakterisierung von PIV, um abgeschwächte Mutantenstämme (z.B. temperatursensitive (ts), Kälte-passagierte (cp), Kälteangepasste (ca), kleine Plaque (sp) und Wirtsbereich-eingeschränkte (hr) Mutantenstämme) zu erhalten und zur Identifizierung der genetischen Änderungen, welche den abgeschwächten Phänotyp spezifizieren. In Verbindung mit diesen Verfahren beschreiben die vorangehenden Dokumente genaue Verfahrensabläufe zur Bestimmung von Replikation, Immunogenität, genetischer Stabilität und Schutzwirkung von biologisch-abgeleiteten und rekombinant hergestellten, abgeschwächten menschlichen PIV in akzeptablen Modellsystemen, einschließlich Mäuse- und nicht-menschlichen Primaten-Modellsystemen. Außerdem beschreiben diese Dokumente allgemeine Verfahren zur Entwicklung und zum Testen von immunogenen Zusammensetzungen, einschließlich monovalenten und bivalenten Impfstoffen für die Vorbeugung und Behandlung von PIV-Infektionen. Verfahren zur Herstellung von infektiösem rekombinantem PIV durch Konstruktion und Expression von cDNA, die ein PIV-Genom oder -Antigenom codiert, das mit wesentlichen PIV-Proteinen co-exprimiert wird, werden auch in den vorstehenden Dokumenten beschrieben, welche die Beschreibung der folgenden beispielhaften Plasmide umfassen, die eingesetzt werden können, um infektiöse virale PIV-Clone herzustellen: p3/7(131) (ATCC 97990); p3/7(131)2G (ATCC 97889) und p218(131) (ATCC 97991); jeder wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrages bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A. hinterlegt und mit den vorstehend identifizierten Hinterlegungsnummern versehen.
Außerdem werden in den vorstehenden Referenzen Verfahren zur Konstruktion und Evaluierung von infektiösem rekombinantem PIV offenbart, das modifiziert wurde, um Phänotyp-spezifische Mutationen einzuführen, die in biologisch-abgeleitete PIV-Mutanten identifiziert wurden, z.B. Kälte-passagiert (cp), Kälte-angepasst (ca), Wirtsbereich-beschränkt (hr), kleine Plaque (sp), und/oder temperatursensitive (ts)-Mutanten, zum Beispiel den JS HPIV3 cp45 Mutanten-Stamm. In diesen Mutanten identifizierte Mutationen können leicht in rekombinantes PIV übernommen werden, das (eine) C-, D- und/oder V-Knockout-Mutation(en) trägt. In einem Beispiel treten eine oder mehrere abschwächende Mutationen in dem Polymerase L-Protein auf, z.B. an einer Position, die Tyr942, Leu992 oder Thr1558 von JS cp45 entspricht. Diese Mutationen können durch eine identische oder konservative Aminosäuresubstitution, wie sie in der biologischen Mutante identifiziert wurde, in rekombinantes PIV der Erfindung eingeführt werden. PIV-Rekombinanten können daher eine Mutation beinhalten, worin Tyr₉₄₂ durch His, ersetzt wird, Leu992 durch Phe ersetzt ist und/oder Thr₁₅₅₈ durch Ile ersetzt wird. Substitutionen die konservativ zu diesen Ersatz-Aminosäuren sind, sind nützlich, um einen gewünschten Mutanten-Phäntyp zu erzeugen.
Andere beispielhafte Mutationen, die aus einer biologisch abgeleiteten PIV-Mutante übernommen werden, umfassen einen oder mehrere Mutationen im N-Protein, einschließlich spezifischen Mutationen an einer Position die den Resten Val₉₆ oder Ser₃₈₉ von JS cp45 entspricht. In genaueren Aspekten werden diese Mutationen als Val₉₆ nach Ala oder Ser₃₈₉ nach Ala oder Substitutionen dargestellt, die konservativ dazu sind. Auch nützlich innerhalb des rekombinanten PIVs der Erfindung sind Aminosäuresubstitutionen im C-Protein, z.B. eine Mutation an einer Position entsprechend Ile₉₆ von JS cp45, vorzugsweise dargestellt durch eine identische oder konservative Substitution von Ile₉₆ nach Thr. Weitere beispielhafte Mutationen, die aus biologisch-abgeleiteten PIV-Mutanten übernommen wurden, umfassen eine oder mehrere Mutationen im F-Protein, einschließlich Mutationen, die aus JS cp45 übernommen wurden, an eine Position, die den Resten Ile420 oder Ala₄₅₀ von JS cp45 entspricht, vorzugsweise dargestellt durch Aminosäure-Substitutionen von Ile₄₂₀ nach Val oder Ala₄₅₀ nach Thr oder Substitutionen die konservativ dazu sind. Andere PIV-Rekombinanten übernehmen eine oder mehrere Aminosäure-Substitutionen im HN-Protein, wie nachstehend beispielhaft durch ein rekombinantes PIV dargestellt, das eine Mutation an einer Position übernimmt, die dem Rest Val₃₈₄ von JS cp45 entspricht, vorzugsweise dargestellt durch die Substitution Val₃₈₄ nach Ala.
Noch weitere Beispiele umfassen rekombinanten PIV, der ein oder mehrere Mutationen in nicht-codierenden Teilen des PIV-Genoms oder Antigenoms einbezieht, zum Beispiel in einer 3'-Leadersequenz. Beispielhafte Mutationen können in diesem Zusammenhang an einer Position im 3'-Leader eines rekombinanten Virus erzeugt werden, die dem Nucleotid 23, 24, 28 oder 45 von JS cp45 entspricht. Noch weitere beispielhafte Mutationen können in der N-Gen Startsequenz erzeugt werden, zum Beispiel durch Änderung einer oder mehrerer Nucleotide in der N-Gen Startsequenz, z.B. an einer Position, die den Nucleotiden 62 von JS cp45 entspricht. In genaueren Aspekten beziehen C-, D- und/oder V-Knockout-Mutanten eine T nach C Änderung bei Nucleotid 23 ein, eine C nach T Änderung bei Nucleotid 24, eine G nach T Änderung bei Nucleotid 28 und/oder eine T nach A Änderung bei Nucleotid 45. Zusätzliche Mutationen in den extragenen Sequenzen werden beispielhaft durch eine A nach T Änderung in der N-Gen-Start-Sequenz an der Position dargestellt, die Nucleotid 62 von JS entspricht.
Diese vorhergehenden beispielhaften Mutationen, die in einer C-, D- und/oder V-Knockout-Mutante erzeugt werden können, sind erfolgreich erzeugt worden und in rekombinantem PIV wiedergefunden worden – wie sie durch die rekombinanten PIV-Clone, die als rcp45, rcp45 L, rcp45 M, rcp45 HN, rcp45 C, rcp45 F, rcp453'N, 3'NL, und rcp45 3'NCMFHN dargestellt werden (Durbin et al., Virology 235:323-332, 1997; Skiadopoulos et al., J Virol. 72:1762-8; U.S. Patentanmeldungsseriennummer 09/083.793, eingereicht am 22. Mai 1998; vorläufige U.S. Anmeldungsnummer 60/047.575, eingereicht am 23. Mai, 1997 (entsprechend der Internationalen Veröffentlichungsnummer WO 98/53078) und vorläufige U.S. Anmeldungsnummer 60/059.385, eingereicht am 19. September 1997.
Aus JScp45 und anderen biologisch-abgeleiteten PIV-Mutanten wird ein großes „Menü" an abschwächenden Mutationen bereitgestellt, von denen Mutationen zur Einstellung des Abschwächungsgrades, Immunogenität und genetischer Stabilität in einem rekombinanten PIV, das C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-Mutation(en) trägt. In diesem Zusammenhang können viele rekombinante PIVs ein oder mehrere und vorzugsweise zwei oder mehrere Mutationen aus biologisch-abgeleiteten PIV-Mutanten umfassen, z.B. irgendeine oder eine Kombination von Mutationen, die in JScp45 identifiziert wurden. PIV-Rekombinanten innerhalb der Erfindung werden eine Vielzahl und bis zu einem vollen Komplement der Mutationen beinhalten, die in JScp45 oder anderen biologisch-abgeleiteten PIV-Mutanten-Stämmen vorhanden sind. Diese Mutationen können durch multiple Nucleotidsubstitutionen in einem Codon, das jede Mutation spezifiziert, gegen eine Reversion in rekombinantem PIV stabilisiert werden, das C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-Mutation(en) trägt.
Noch zusätzliche Mutationen, die in die C-, D- und/oder V-ORF(s)-Deletions- und Knockout PIV-Mutanten eingeführt werden können, sind Mutationen, z.B. abschwächende Mutationen, die in heterologen PIV identifiziert wurden, oder ferner verwandte nicht-segmentierte Negativ-Strang RNA-Viren. Insbesondere können abschwächende und andere erwünschte Mutationen, die in einem Negativ-Strang RNA-Virus identifiziert wurden, „transferiert" werden, z.B. auf eine entsprechende Position innerhalb des Genoms oder Antigenoms der C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- und Knockout-Mutanten kopiert werden. Kurz gesagt werden erwünschte Mutationen in einem heterologen Negativ-Strang RNA-Virus in den PIV-Empfänger transferiert. Das beinhaltet das Kartieren der Mutation im heterologen Virus, anschließende Identifizierung der entsprechenden Stelle in dem Empfänger-PIV durch Sequenzabgleich und Mutieren der nativen Sequenz in dem RSV-Empfänger zum Mutanten-Genotyp (entweder durch eine identische oder konservative Mutation), wie beschrieben in der U.S. Patentanmeldung mit dem Titel PRODUCTION OF ATTENUATED NEGATIVE STRANDED RNA VIRUS VACCINES FROM CLONED NUCLEOTIDE SEQUENCES, eingereicht durch Murphy et al., am 13. April 1999 und identifiziert durch die Anwalts-Aktennummer 17634-000600. Wie diese Offenbarung lehrt, ist es vorzuziehen, das Empfängergenom oder -Antigenom zu modifizieren, um eine Änderung der Subjektstelle der Mutation zu codieren, die der Änderung konservativ entspricht, die in dem heterologen Mutantenvirus identifiziert wurde. Wenn eine Aminosäuresubstitution zum Beispiel verglichen mit der entsprechenden Wildtyp-Sequenz eine Mutationsstelle im Mutantenvirus markiert, dann sollte eine ähnliche Substitution in dem (den) entsprechenden Rest(en) im rekombinanten Virus erzeugt werden. Die Substitution kann eine identische oder konservative Aminosäure zu dem substituierten Rest einbeziehen, der in dem mutierten viralen Protein vorhanden ist. Es ist jedoch auch möglich den nativen Aminosäurerest an der Stelle der Mutation mit Bezug auf den substituierten Rest in dem mutierten Protein nicht-konservativ zu ändern (z.B. durch Verwendung irgendeiner Aminosäure, um die Funktion des Wildtyprestes zu zerstören oder zu behindern). Negativ-strängige RNA-Viren aus welchen beispielhafte Mutationen identifiziert werden und in einen rekombinanten PIV transferiert werden, umfassen unter anderem andere PIVs (z.B. HPIV1, HPIV2, HPIV3, BPIV oder MPIV), RSV, Sendai-Virus (SeV), Newcastle-Disease-Virus (NDV), Simian Virus 5 (SV5), Masern-Virus (MeV), Rinderpestvirus, Hundestaupe-Virus (CDV), Tollwutvirus (RaV) und Virus der vesikulären Stomatitis (VSV). Eine Vielzahl an beispielhaften Mutationen werden offenbart, einschließlich einer Aminosäuresubstitution von Phenylalanin an Position 521 des RSV L-Proteins entsprechend und daher übertragbar auf eine Substitution von Phenylalanin (oder eine konservativen verwandten Aminosäure) an Position 456 des HPIV3 L-Proteins. Im Falle von Mutationen, die durch Deletionen oder Insertionen markiert wurden, können diese als entsprechende Deletionen oder Insertionen in den rekombinanten Virus einbezogen werden, die spezielle Größe und Aminosäuresequenz des deletierten oder inserierten Proteinfragments kann variieren.
Eine Vielzahl an zusätzlichen Mutationsarten werden auch in den vorhergehenden Referenzen offenbart und können leicht in ein rekombinantes PIV der Erfindung eingefügt werden, um Wachstum, Abschwächung, Immunogenität, genetische Stabilität auszugleichen oder andere vorteilhafte strukturelle und/oder phänotypische Effekte bereitzustellen. Zum Beispiel werden Restriktionsschnittstellenmarker routinemäßig in die C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- oder Knockout-Mutanten- Antigenome oder Genome eingeführt, um cDNA-Konstruktion und Manipulation zu erleichtern.
Außerdem werden Verfahren und Zusammensetzungen beschrieben, welche die Herstellung von C-, D- und/oder V-ORF(s)-Deletions- und Knockout Mutanten-PIV-Impfstoffvirus als ein chimäres Mensch-Rinder-PIV ermöglichen. Diese Rekombinanten werden durch Austausch oder Addition von (einem) heterologen Gen(en), Genom-Segment(en) oder einzelnen oder multiplen Nucleotiden eines menschlichen oder Rinder-PIV zu einem teilweisen oder vollständigen Hintergrund an Rinder- oder menschlichem PIV-Genom oder Antigenom gemacht, um ein chimäres Mensch-Rinder-PIV-Genom oder Antigenom zu produzieren (siehe vorläufige U.S. Patentanmeldung mit dem Titel ATTENUATED HUMAN-BOVINE CHIMERIC PARAINFLUEINZA VIRUS VACCINES, angemeldet durch Bailey et al., am 9. Juli 1999 und identifiziert durch die Anwalts-Aktennummer 15280-399000 US).
In einem Beispiel umfasst ein chimäres Mensch-Rinder-PIV ein partielles oder vollständiges Rinder-Hintergrund-PIV-Genom oder -Antigenom, das mit einem oder mehreren heterologen Genen oder Genom-Segement(en) aus einem oder mehreren menschlichen PIVs verbunden ist. Alternativ kann ein chimäres Mensch-Rinder-PIV ein partielles oder vollständiges menschliches Hintergrund-PIV-Genom oder – Antigenom umfassen, kombiniert mit einem heterologen Gen oder Genomsegment aus einem oder mehreren Rinder-PIVs. Gene und Genomsegmente, die zur Verwendung als heterologe Inserts oder Additionen zu dem Hintergrundgenom oder -Antigenom ausgewählt werden, umfassen irgendwelche Wildtyp- oder Mutantengene oder Genomsegemente von N, P, C, D, V, M, F, HN, oder L. In einem Beispiel ist der ORF des N-Gens von einem HPIV3-Empfänger oder Hintergrundgenom mit dem N-Gen-ORF von BPIV3 substituiert, der eine infektiöse Rekombinante ergab, die in einem nicht-menschlichen Primatenwirt, der ähnlich dem Eltern-BPIV-Virus war, einen auf den Wirtsbereich beschränkten Phänotyp zeigte. Das (die) heterologe(n) menschliche(n) oder Rinder-Gen(e) kann (können) ein oder mehrere der PIV-Schutzantigene codieren, vorzugsweise ein oder mehrere der HN- und/oder F-Glykoproteine oder eine immunogene Domäne oder ein Epitop davon, obwohl andere Proteine zu einer schützenden Immunantwort beitragen können und daher auch bevorzugte Objekte zur Konstruktion von chimären menschlichen-Rinder PIV-Viren sind.
Alternativ kann das chimäre Mensch-Rinder-PIV, das eine C-, D- und/oder V-Deletions- oder Knockout-Mutation zeigt ein oder mehrere Genomsegment(e) einbeziehen, die eine cytoplasmatische Domäne, Transmembran-Domäne, Ectodomäne oder ein immunogenes Epitop eines PIV-Antigenproteins codieren. Diese immunogenen Proteine, Domänen und Epitope erzeugen auch neue Immunantworten in einem immunisierten Wirt. Zum Beispiel ergibt die Addition oder die Substitution von einem oder mehreren immunogenen Gen(en) oder Genom-Segment(en) aus einem menschlichen PIV innerhalb eines Rinder-Hintergrundgenoms oder -Antigenoms ein rekombinantes chimäres Virus oder ein subvirales Partikel, das im Stande ist eine Immunantwort zu erzeugen, die gegen eine oder mehrere spezifische menschliche PIV-„Spender"-Stämme gerichtet ist, während das Rinder-Gerüst einen abgeschwächten Phänotyp verleiht, der das Chimär zu einem nützlichen Kandidaten für die Impfstoffentwicklung macht.
Chimäres Mensch-Rinder-PIV, das (eine) Mutation(en) im C-, D- und/oder V-ORF(s) trägt, kann konstruiert werden, indem das heterologe Gen oder des Genomsegment in einem partiellen PIV-Hintergrund-Genom oder -Antigenom für ein Gegenstückgen oder -Genomsegment ausgetauscht wird. Alternativ kann das heterologe Gen oder Genomsegment hinzugefügt werden, z.B. zu einer 3' oder 5' nicht-codierenden Region eines Gens, als ein überzähliges Gen oder Genomsegment in Kombination mit einem vollständigen (oder partiellen, wenn ein anderes Gen oder Genomsegment deletiert wurde) PIV-Hintergrund-Genom oder -Antigenom. Das heterologe Gen oder Genomsegment kann an einer intergenomischen Position innerhalb eines partiellen oder vollständigen PIV-Hintergrund-Genoms oder -Antigenoms hinzugefügt werden, sodass ein offener Leserahmen innerhalb des Hintergrund-Genoms oder -Antigenoms nicht unterbrochen wird. Alternativ kann das heterologe Gen oder Genomsegment an einer Position hinzugefügt oder substituiert werden, die einer Wildtyp-Genordnungsposition eines Gegenstückgens oder -Genomsegments innerhalb des partiellen oder vollständigen PIV-Hintergrundgenoms oder -Antigenoms entspricht, wobei dieses Gegenstück-Gen oder -Genomsegment dadurch ersetzt oder verschoben wird (z.B. auf eine mehr distale Position vom Promotor). In noch weiteren Beispielen wird das heterologe Gen oder Genomsegment an eine Position hinzugefügt oder substituiert, die proximaler zum Promotor liegt oder, verglichen mit einer Wildtyp-Genordnungsposition, distal zum Promotor der Gegenstück-Gen oder Genomsegment innerhalb des Hintergrund-Genoms oder -Antigenoms, wobei die Expression des heterologen Gens oder Genomsegments jeweils erhöht oder reduziert wird. Diese und andere in den zitierten Referenzen offenbarten Modifikationen sind für den Einbau innerhalb der C-, D- und/oder V-ORF(s)-Deletions- und Knockout-Mutanten der Erfindung zugänglich.
Die Einführung von heterologen immunogenen Proteinen, Domänen und Epitopen, um chimäres PIV herzustellen ist besonders nützlich, um neue Immunantworten in einem immunisierten Wirt zu erzeugen. Addition oder Substitution eines immunogenen Gens oder Genomsegments aus einem Spender-PIV innerhalb eines Empfängergenoms oder -Antigenoms eines unterschiedlichen PIVs kann eine Immunantwort erzeugen, die gegen die Spender-Untergruppe oder den Stamm gerichtet ist, die Empänger-Untergruppe oder den Stamm oder sowohl gegen die Spender- als auch die Empfängeruntergruppe oder den Stamm. Um diesen Zweck zu erreichen kann das C-, D- und/oder V-ORF(s)-Deletions- und Knockout Mutanten-PIV auch so konstruiert werden, dass es ein chimäres Protein exprimiert, z.B. ein immunogenes Glykoprotein, das einen cytoplasmatischen Schwanz und/oder eine Transmembrandomäne aufweist, die spezifisch für ein PIV ist, das mit einer Ectodomäne eines unterschiedlichen PIVs verbunden ist, um z.B. ein Mensch-Rinder-Fusionsprotein bereitzustellen oder ein Fusionsprotein, das Domänen aus zwei unterschiedlichen menschlichen PIVs einschließt. In einem Beispiel codiert ein C-, D- und/oder V-ORF(s)-Deletions- oder Knockout Mutanten-PIV-Genom oder -Antigenom ein chimäres Glykoprotein in dem rekombinanten Virus oder subviralen Partikel, das sowohl menschliche als auch Rinder-Glykoproteindomänen oder immunogene Epitope aufweist. Zum Beispiel kann ein heterologes Genomsegment, das eine Glykoprotein-Ectodomäne aus einem menschlichen PIV-HN oder F-Glykoprotein codiert, mit einer Polynucleotidsequenz (z.B. einem Genomsegment) verbunden werden, welches die entsprechenden cytoplasmatischen und/oder Transmembrandomänen des Rinder-HN oder F-Glykoproteins aufweist, um das chimäre Mensch-Rinder-PIV-Genom oder -Antigenom zu bilden.
In anderen Beispielen können die C-, D- und/oder V-ORF(s)-Deletions- und Knockout-Mutanten, die in einer Impfstoffformulierung nützlich sind, bequem modifiziert werden, um die Antigen-Veränderung (antigenic drift) in dem zirkulierenden Virus aufzunehmen. Üblicherweise wird die Modifizierung in dem HN und/oder F-Proteinen stattfinden. Ein vollständiges HN- oder F-Gen oder ein Genomsegment, das eine spezifische immunogene Region davon codiert, wird durch Austausch einer entsprechenden Region in einem Empfängerclon von einem unterschiedlichen PIV-Stamm oder Untergruppe, aus einem PIV-Stamm in eine chimäre PIV-Genom oder -Antigenom-cDNA einbezogen oder durch Hinzufügen von einer oder mehreren Kopien des Gens, sodass die verschiedenen antigenen Formen repräsentiert sind. Viren-Nachkommen, die aus dem modifizierten PIV-Clon hergestellt wurden, können dann in den Impf-Protokollen gegen in Erscheinung tretende PIV-Stämme verwendet werden.
Austausch einer menschlichen PIV-codierenden Sequenz oder nicht-codierenden Sequenz (z.B. einem Promotor, Gen-Ende, Gen-Start, intergenes oder anderes cis-agierendes Element) mit einem heterologen Gegenstück, z.B. einer anderen menschlichen-PIV oder einer Rinder- oder Mäuse-PIV-Sequenz, ergibt chimäres PIV, das eine Vielzahl von möglichen abschwächenden oder anderen phänotypischen Effekten aufweist. Insbesondere entstehen Wirtsbereich und andere erwünschte Effekte aus der Substituierung eines Rinder- oder Mäuse-PIV-Gens, das in einen menschlichen PIV-Hintergrund importiert wurde, wobei das Rinder- oder Mäusegen in einer menschlichen Zelle nicht effizient wirkt, z.B. durch Inkompatibilität der heterologen Sequenz oder des Proteins mit einer biologisch-interaktiven menschlichen PIV-Sequenz oder einem Protein (d.h. eine Sequenz oder ein Protein, das normalerweise mit der substituierten Sequenz oder dem Protein für virale Transkription, Translation, Zusammenbau, usw. kooperiert) oder, typischer in einer Wirtsbereich-Restriktion, mit einem zellulären Protein oder einem anderen Aspekt des zellulären Milieus, das zwischen dem permissiven und weniger permissiven Wirt unterschiedlich ist.
Rinder-PIV-Sequenzen werden zum Einführen in menschliches PIV basierend auf bekannten Aspekten von Rinder- und menschlichen PIV-Strukturen und Funktionen ausgewählt.
In zusätzlichen Beispielen werden C-, D- und/oder V-ORF(s)-Deletions- und Knockout-Mutanten-PIVs hergestellt, in welchen das chimäre Genom oder Antigenom ferner durch Einführen von einer oder mehreren Mutationen modifiziert ist, die eine Abschwächung oder einen anderen gewünschten Phänotyp in dem daraus resultierenden chimären Virus oder subviralen Partikel spezifizieren. Diese Mutationen können neu erzeugt werden und gemäß einer rationalen Mutagenesestrategie für den Entwurf auf Abschwächungseffekte getestet werden. Alternativ können die abschwächenden Mutationen in bestehenden biologisch-abgeleiteten Mutanten-PIV identifiziert werden und danach in C-, D- und/oder V-ORF(s)-Deletions- und Knockout Mutanten-PIV eingeführt werden. Dieses rekombinante PIV bietet, wie vorstehend beschrieben, verbesserte Eigenschaften von Attenuation und Immunogenität für die Verwendung als Impfstoffe. In diesem Zusammenhang beschreiben die vorstehenden Referenzen die Konstruktion von chimären PIV-Rekombinanten, die HN und F-Gene von HPIV1 aufweisen, die in ein partielles Hintergrund-Antigenom substituiert sind, das ferner modifiziert ist, um ein oder mehrere abschwächende Mutationen zu tragen, die in HPIV3 JS cp45 identifiziert wurden. Eine solche chimäre Rekombinante bezieht alle der abschwächenden Mutationen ein, die in dem L-Gen von cp45 identifiziert wurden. Es ist seitdem gezeigt worden, dass alle der cp45-Mutationen außerhalb der heterologen (HPIV1) HN und F-Gene in eine HPIV3-1-Rekombinante eingebaut werden können, um einen abgeschwächten chimären Impfstoffkandidaten zu ergeben.
Abschwächende Mutationen in biologisch-abgeleitetem PIV, für den Einbau innerhalb der C-, D- und/oder V-ORF(s)-Deletions- und Knockout-Mutanten, können natürlich vorkommen oder können in Wildtyp-PIV-Stämme durch gut bekannte Mutageneseverfahren eingeführt werden. Zum Beispiel können unvollständig abgeschwächte PIV Eltern-Stämme durch chemische Mutagenese während des Viruswachstums in den Zellkulturen hergestellt werden, zu welchen ein chemisches Mutagen hinzugefügt worden ist, durch Selektion von Virus, das dann einer Passage bei suboptimalen Temperaturen unterzogen wurde, um die Wachstumsbeschränkungs-Mutationen einzuführen, oder wie in den vorstehenden Referenzen beschrieben durch Auswahl von einem mutagenisierten Virus, das in der Zellkultur kleine Plaques (sp) erzeugt.
Mit „biologisch-abgeleitetes PIV" ist jedes PIV gemeint, das nicht durch rekombinante Mittel erzeugt wurde. Biologisch-abgeleitetes PIV umfasst daher alle natürlich vorkommenden PIVs, einschließlich z.B. natürlich vorkommendes PIV, das eine Wildtyp genomische Sequenz aufweist und PIV, das allelische oder mutierte genomische Variationen von einer Referenz-Wildtyp PIV-Sequenz aufweist, z.B. PIV, das eine Mutation aufweist, die einen abgeschwächten Phänotyp spezifiziert. Auf ähnliche Weise umfasst biologisch abgeleitetes PIV PIV-Mutanten, die unter anderem aus einem Eltern-PIV durch künstliche Mutagenese und Selektionsverfahren abgeleitet wurden.
Wie vorstehend angemerkt kann die Herstellung einer ausreichend abgeschwächten biologisch-abgeleiteten PIV-Mutante durch verschieden bekannte Verfahren erzielt werden. Ein solches Verfahren umfasst, das Aussetzen eines partiell abgeschwächtes Virus einer Passage in Zellkultur bei immer niedrigeren abschwächenden Temperaturen. Zum Beispiel werden partiell abgeschwächte Mutanten durch Passage in Zellkulturen bei suboptimalen Temperaturen erzeugt. Eine cp-Mutante oder ein anderer partiell abgeschwächter PIV-Stamm wird einem effizienten Wachstum durch Passage in einer Kultur bei einer niedrigeren Temperatur angepasst. Diese Selektion von Mutanten-PIV während der kalten Passage reduziert, wenn verglichen mit dem partiell abgeschwächten Elternstamm, jede verbleibende Virulenz in den Derivat-Stämmen wesentlich.
Alternativ können spezifische Mutationen in biologisch-abgeleitetes PIV eingeführt werden, indem ein partiell abgeschwächtes Elternvirus einer chemischen Mutagenese unterzogen wird, z.B. um ts-Mutationen einzuführen oder, im Falle von Viren, die schon ts sind, zusätzliche ts-Mutationen, die ausreichend sind, um erhöhte Abschwächung und/oder Stabilität des ts-Phänotyps des abgeschwächten Derivats zu verleihen. Mittel für das Einführen der ts-Mutationen in PIV, umfassen die Replikation des Virus bei Anwesenheit von einem Mutagen wie 5-Fluorouridin gemäß allgemein bekannter Verfahren. Andere chemische Mutagene können verwendet werden. Abschwächung kann aus einer ts-Mutation in fast jedem PIV-Gen resultieren, obwohl festgestellt worden ist, dass das Polymerase (L)-Gen ein besonders zugängliches Ziel für diesen Zeck ist.
Der Grad an Temperatursensitivität der Replikation in abgeschwächtem PIV wird durch Vergleichen seiner Replikation bei einer permissiven Temperatur mit jener bei mehreren restriktiven Temperaturen bestimmt. Die niedrigste Temperatur bei welcher die Replikation des Virus im Vergleich mit seiner Replikation bei der permissiven Temperatur 100-fach oder mehr reduziert ist, wird als „Shutoff"-Temperatur bezeichnet. In Versuchstieren und Menschen korreliert sowohl die Replikation als auch die Virulenz von PIV mit der Shutoff-Temperatur der Mutante.
Es ist festgestellt worden, dass die JScp45 HPIV3-Mutante genetisch relativ stabil, hoch immunogen und zufriedenstellend abgeschwächt ist. Die Nucleotidsequenzanalyse dieser biologisch-abgeleiteten und rekombinanten Viren, bei denen festgestellt wurde, dass sie verschiedenste einzelne und kombinierte Mutationen beinhalten, deutet darauf hin, dass jeder Grad an verstärkter Abschwächung mit spezifischen Nucleotid- und Aminosäure-Substitutionen in Zusammenhang steht. Die vorstehenden Referenzen offenbaren auch wie routinemäßig zwischen stillen zufälligen Mutationen und jenen unterschieden werden kann, die für die phänotypischen Unterschiede verantwortlich sind, indem die Mutationen, getrennt und in verschiedenen Kombinationen in die Genome oder Antigenome von infektiösen PIV-Clonen eingeführt werden. Dieser Prozess, gekoppelt mit der Evaluierung von phänotypischen Charakteristika von Eltern- und Derivat-Virus, identifiziert Mutationen, die für solche erwünschten Eigenschaften wie Attenuierung, Temperatur-Sensitivität, Kälte-Adaption, kleine Plaquegröße, Wirtsbereicheinschränkung usw. verantwortlich sind.
Auf diese Weise identifizierte Mutationen werden in einem „Menu" zusammengestellt und werden dann, wie erwünscht, einzeln oder in Kombination eingeführt, um eine C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- oder Knockout-Mutante auf einen geeigneten Grad an Attenuierung, Immunogenität, genetischer Resistenz zur Reversion von einem abgeschwächten Phänotyp usw. wie erwünscht einzustellen. In Übereinstimmung mit der vorhergehenden Beschreibung erlaubt die Fähigkeit infektiöses PIV aus cDNA herzustellen die Einführung von spezifisch erzeugten Änderungen innerhalb der C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- oder Knockout-Mutanten. Insbesondere werden infektiöse rekombinante PIVs für die Identifizierung von spezifischen Mutation(en) in biologisch-abgeleiteten, abgeschwächten PIV-Stämmen eingesetzt, zum Beispiel Mutationen, welche ts, ca, att und andere Phänotypen spezifizieren. Erwünschte Mutationen werden auf diese Weise identifiziert und in die Rekombinante, die C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- oder Knockout-Mutanten PIV-Impfstoffstämme, eingeführt. Die Fähigkeit Virus von cDNA zu erzeugen ermöglicht Routine-Einführungen dieser Mutationen, einzeln oder in verschiedenen ausgewählten Kombinationen in einen Volllängen cDNA-Clon, wonach die Phänotypen der gewonnenen rekombinanten Viren, die die eingeführten Mutationen enthalten, leicht bestimmt werden zu können.
Durch Identifizieren und Einfügen von spezifischen, biologisch-abgeleiteten Mutationen, die mit erwünschten Phänotypen assoziiert sind, z.B. einen cp oder ts-Phänotyp, in infektiöse PIV-Clone, kann man andere ortsspezifische Modifikationen an oder nahe bei der identifizierten Mutation bereitstellen. Wohingegen die meisten abschwächenden Mutationen, die in biologisch-abgeleitetem PIV hergestellt werden einzelne Nuclteotidänderungen sind, können andere „ortsspezifische" Mutationen auch durch rekombinante Techniken in biologisch-abgeleitetes oder rekombinantes PIV eingebaut werden. Wie hierin verwendet umfassen ortsspezifische Mutationen Insertionen, Substitutionen, Deletionen oder Neuanordnungen von 1 bis 3, bis zu etwa 5-15 oder mehr geänderten Nucleotiden (z.B. geändert von einer Wildtyp-PIV-Sequenz, aus einer Sequenz eines ausgewählten Mutanten-PIV-Stammes oder aus einem rekombinanten Eltern-PIV-Clon, der einer Mutagenese unterzogen wurde). Derartige ortsspezifische Mutationen können an oder innerhalb der Region von einer ausgewählten biologisch-abgeleiteten Punktmutation eingeführt werden. Alternativ können die Mutationen in verschiedenen anderen Zusammenhängen innerhalb des PIV-Clons eingeführt werden, zum Beispiel nahe einer cis-agierenden regulatorischen Sequenz oder Nucleotidsequenz, die eine aktive Stelle des Promotors, Bindungsstelle, ein immunogenes Epitop usw., codiert. Ortsspezifische PIV-Mutanten behalten üblicherweise einen erwünschten abschwächenden Phänotyp bei, können aber zusätzlich veränderte phänotypische Charakteristika zeigen, die nicht mit der Abschwächung in Zusammenhang stehen, z.B. verstärkte oder erweiterte Immunogenität, und/oder verbessertes Wachstum. Weitere Beispiele von erwünschten ortsspezifischen Mutationen umfassen rekombinantes PIV, das entworfen wurde, um zusätzliche stabilisierende Nucleotidmutationen in einem Codon einzuführen, das eine abschwächende Punktmutation spezifiziert. Wo es möglich ist, werden zwei oder mehrere Nucleotid-Substitutionen bei Codons eingeführt, die abschwächende Aminosäureaustausche in einer Eltern-Mutante oder einem rekombinanten PIV-Clon spezifizieren, was ein biologisch-abgeleitetes oder rekombinantes PIV ergibt, das eine Resistenz gegen Reversion aus einem abgeschwächten Phänotyp aufweist. In anderen Beispielen werden ortsspezifische Nucleotid-Substitutionen, Additionen, Deletionen oder Neuanordnungen stromaufwärts (N-terminale Richtung) oder stromabwärts (C-terminale Richtung) eingeführt, z.B. von 1 bis 3, 5-10 und bis zu 15 Nucleotiden oder mehr 5' oder 3' relativ zu einer Nucleotidposition auf die abgezielt wird, z.B. um ein bestehendes cis-agierendes regulatorisches Element zu konstruieren oder zu unterdrücken.
Zusätzlich zu einzelnen und multiplen Punktmutationen und ortsspezifischen Mutationen umfassen hierin offenbarte Änderungen zum C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- und Knockout Mutanten-PIV Deletionen, Insertionen, Substitutionen und Neuanordnungen von ganzen Genen oder Genomsegmenten außerhalb des (der) deletierten oder unterdrückten C-, D- und/oder V-ORF(s) oder der Genomsegmente. Diese Mutationen können kleine Zahlen an Basen ändern (z.B. von 15-30 Basen bis zu 35-50 Basen oder mehr), große Blöcke an Nucleotiden (z.B. 50-100, 100-300, 300-500, 500-1.000 Basen) oder fast vollständige oder gesamte Gene (z.B. 1.000-1.500 Nucleotide, 1.500-2.500 Nucleotide, 2.500-5.000 Nucleotide, 5.000-6.500 Nucleotide oder mehr) im Spender oder Empfängergenom oder -Antigenom, abhängig von der Art der Änderung (d.h. eine kleine Zahl an Basen kann verändert werden, um ein immunogenes Epitop zu inserieren oder zu unterdrücken oder ein kleines Genomsegment zu verändern, wohingegen (ein) große(r) Block (Blöcke) an Basen beteiligt sind, wenn Gene oder große Genomsegmente hinzugefügt, substituiert, deletiert oder neu angeordnet werden.
Zusätzliche Beispiele stellen den Austausch von Mutationen bereit, die aus biologisch-abgeleitetem PIV in einen rekombinanten PIV-Clon übernommen werden, z.B. cp- und ts-Mutationen mit zusätzlichen Arten an Mutationen, welche die gleichen oder unterschiedliche Gene in einem weiter modifizierten PIV-Clon einbeziehen. Jedes der PIV-Gene kann bezüglich den Expressionsgraden selektiv verändert werden oder kann im Ganzen oder teilweise, alleine oder in Kombination mit anderen erwünschten Modifikationen hinzugefügt, deletiert, substituiert oder neu angeordnet werden, um ein C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- und Knockout Mutanten-PIV zu ergeben, das neue Impfstoff-Charakteristika zeigt. Zusätzlich oder in Kombination mit abschwächenden Mutationen, die aus biologisch-abgeleiteten PIV-Mutanten stammen, stellen die Beispiele daher auch eine Reihe an zusätzlichen Verfahren für die Abschwächung oder andersartige Modifikation des Phänotyps des C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- und Knockout Mutanten-PIV bereit, die auf der Konstruktion von rekombinanten infektiösen PIV-Clonen basieren. Eine Vielzahl von Änderungen kann in einer isolierten Polynucleotidsequenz hergestellt werden, die ein Gen oder Genomsegment codiert auf das abgezielt wird, einschließlich Spender oder Empfängergen oder Genomsegment in einem chimären PIV-Genom oder -Antigenom für das Einfügen in infektiöse Clone. Genauer gesagt beschreiben die Beispiele die Einführung von Modifikationen, die ein ausgewähltes Nucleotid oder eine Vielzahl an Nucleotiden aus einem Eltern-Genom oder -Antigenom deletieren, substituieren, einführen oder neu anordnen, um erwünschte strukturelle und phänotypische Änderungen im rekombinanten PIV zu erzielen, sowie auch Mutationen, die (ein) ganzes) Gen(e) oder Genomsegment(e) innerhalb eines C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- und Knockout-Mutanten-PIV-Clons deletieren, substituieren, einfügen oder neu anordnen.
Beschrieben werden auf diese Weise Modifikationen im C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- und Knockout-Mutanten-PIV, welche die Expression eines ausgewählten Gens zusätzlich zu dem deletierten oder unterdrückten C-, D- und/oder V-ORF(s) oder Genomsegment(en) einfach ändern oder unterdrücken, z.B. durch Einführen eines Terminationscodons innerhalb einer ausgewählten PIV-Codierungssequenz, Ändern der Position eines PIV-Gens hinsichtlich einem funktionsfähig verknüpften Promotors, Einführen eines stromaufwärts gelegenen Start-Codons, um die Expressionsraten zu verändern, Modifizieren von (z.B. durch Änderung der Position, Änderung einer bestehenden Sequenz, oder Austausch einer bestehenden Sequenz mit einer heterologen Sequenz) GS- und/oder GE-Transkriptionssignalen, um den Phänotyp zu verändern (z.B. Wachstum, Temperatureinschränkungen auf die Transkription usw.) und verschiedene andere Deletionen, Substitutionen, Additionen und Neuanordnungen, welche quantitative oder qualitative Änderungen in der viralen Replikation spezifizieren, Transkription von (einem) ausgewählten Gen(en), oder Translation von (einem) ausgewählten Protein(en). In diesem Zusammenhang kann jedes PIV-Gen, das für das Wachstum nicht essentiell ist unterdrückt oder auf andere Weise in einen rekombinanten PIV modifiziert werden, um die gewünschten Effekte von Virulenz, Pathogenese, Immunogenität und andere phänotypische Eigenschaften zu ergeben.
Außerdem kann eine Vielzahl von anderen genetischen Änderungen in einem PIV-Genom oder -Antigenom zum Einfügen in chimäres Mensch-Rinder-PIV, alleine oder gemeinsam mit einer oder mehreren abschwächenden Mutationen hergestellt werden, die aus einem biologisch-abgeleiteten Mutanten-PIV übernommen wurden, z.B. um Wachstum, Abschwächung, Immunogenität, genetische Stabilität einzustellen oder andere vorteilhafte strukturelle und/oder phänotypische Wirkungen bereitzustellen. Diese zusätzlichen Arten von Mutationen werden auch in den vorangehenden Referenzen offenbart und können leicht in chimärem Mensch-Rinder-PIV erzeugt werden. Zum Beispiel werden Restriktionsstellenmarker routinemäßig innerhalb des chimären Mensch-Rinder-PIV-Antigenoms oder -Genoms eingeführt, um cDNA-Konstruktion und Manipulation zu erleichtern.
Auch beschrieben werden genetische Modifikationen in einem C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- und Knockout-Mutanten-PIV, welche die Expression eines ausgewählten Gens oder Genomsegments außerhalb des (der) C-, D- und/oder V-ORF(s) auf die abzezielt wird ändern oder unterdrücken, ohne dass das Gen oder Genomsegment aus dem PIV-Clon entfernt wird. Zum Beispiel kann das durch Einführen einer Mutation erzielt werden, welche die Codierungs-Zuordnung eines Initiationscodons ändert oder ein Terminationscodon innerhalb einer ausgewählten Codierungssequenz einführt, die Position eines Gens ändert oder ein Startcodon stromaufwärts einführt, um seine Expressionsrate zu ändern oder GS- und/oder GE-Transkriptionssignale verändert, um den Phänotyp (z.B. Wachstum, Temperaturrestriktionen auf die Transkription usw.) zu ändern. In genaueren Beispielen werden die C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- und Knockout-Mutanten-PIVs bereitgestellt, in welchen die Expression eines Gens außerhalb der C-, D- und/oder V-ORF(s) auf die abgezielt wird auf dem Translationsniveau ohne Deletion des Gens oder eines Segments davon unterdrückt wird, zum Beispiel durch Einführen von multiplen Translations-Terminationscodons in einen offenen Translationsleserahmen (ORF). Das ergibt lebensfähiges Virus in welchem ein ausgewähltes Gen auf dem Translationsniveau, ohne die Deletion seines Gens, stillgelegt wurde. In anderen Beispielen werden multiple Stopp-Codons in die ORF(s) eingeführt, auf die abgezielt wird. Alternativ wird eine Mutation in eine RNA-Editierungsstelle eingeführt oder eine Mutation wird eingeführt, welche die Aminosäure ändert, die durch ein Initiationscodon spezifiziert ist. Diese Arten von Knockout-Virus werden in der Gewebekultur oft reduzierte Wachstumsraten und kleine Plaquegrößen zeigen. Diese Verfahren stellen daher noch weitere neue Arten an abschwächenden Mutationen bereit, welche die Expression eines viralen Gens unterdrücken, das nicht eines der schützenden viralen Hauptantigene darstellt. In diesem Zusammenhang können Knockout-Virus-Phänotypen, die ohne Deletion eines Gens oder Genomsegments erzeugt wurden, alternativ durch die hierin beschriebene Deletions-Mutagenese erzeugt werden, um korrigierende Mutationen effektiv auszuschließen, welche die Synthese des Zielproteins wiederherstellen könnten. Mehrere andere Gen-Knockouts für die C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- und Knockout-Mutanten können unter Verwendung von Ersatzkonstruktionen und Verfahren gemacht werden, die im Fachgebiet gut bekannt sind (wie zum Beispiel beschrieben in (Kretschmer et al., Virology 216:309-316, 1996; Radicle et al., Virology 217:418-412, 1996; und Kato et al., EMBO J. 16:578-87, 1987; und Schneider et al., Virology 277:314-322, 1996).
Andere Mutationen zum Einführen in das C-, D- und/oder V-ORF(s)-Deletions- und Knockout Mutanten-PIV umfassen Mutationen die gegen cis-agierende Signale gerichtet sind, die z.B. durch Mutationsanalyse von PIV-Minigenomen identifiziert werden können. Zum Beispiel identifiziert die Insertions- oder Deletionsanalyse des Leaders und Trailers und der flankierenden Sequenzen virale Promotoren und Transkriptionssignale und stellt eine Reihe an Mutationen bereit, die mit variierenden Graden an Reduktion von RNA-Replikation oder Transkription im Zusammenhang stehen. Die Sättigungsmutagenese hat (wobei jede Position nacheinander zu jeder der Nucleotidalternativen modifiziert wird) von diesen cis-agierenden Signalen auch viele Mutationen identifiziert, welche die RNA-Replikation oder Transkription reduziert hat (oder in einem Fall erhöht). Jede dieser Mutationen kann in ein C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- oder Knockout-Mutanten-PIV-Antigenom oder -Genom, wie es hierin beschrieben wurde, eingeführt werden. Evaluierung und Manipulation von trans-wirkenden Proteinen und cis-agierenden RNA-Sequenzen unter Verwendung der gesamten Antigenom-cDNA wird, wie in den vorstehend Referenzen beschriebenen, durch die Verwendung von PIV-Minigenomen, unterstützt.
Zusätzliche Mutationen innerhalb des C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- oder Knockout Mutanten-PIVs beziehen den Austausch des 3'-Endes des Genoms mit seinem Gegenstück aus dem Antigenom ein, was mit Änderungen in der RNA-Replikation und Transkription in Zusammenhang steht. In einem Beispiel kann der Expressionsspiegel von spezifischen PIV-Proteinen, wie zum Beispiel den schützenden HN- und/oder F-Antigenen, durch Substitution der natürlichen Sequenzen mit solchen erhöht werden, die synthetisch hergestellt und entworfen wurden, um mit einer effizienten Translation übereinzustimmen. In diesem Zusammenhang ist gezeigt worden, dass die Codonverwendung ein Hauptfaktor bei der Translationsmenge von viralen Proteinen von Säugern sein kann (Haas et al., Current Biol. 6:315-324, 1996). Die Untersuchung der Codonverwendung der mRNAs, welche die HN- und F-Proteine von PIV codieren, die die hauptsächlichen Schutzantigene darstellen, wird eine Verbesserung der Codonverwendung durch rekombinante Verfahren bereitstellen, um verbesserte Expression für diese Gene zu erzielen.
In einem anderen Beispiel wird eine Sequenz, die eine Translations-Startstelle (vorzugsweise einschließlich einem Nucleotid in der -3-Position) von einem ausgewählten PIV-Gen umgibt, alleine oder in Kombination mit der Einführung eines stromaufwärts gelegenen Startcodons modifiziert, um die PIV-Genexpression zu verändern, indem das Rauf- und Runterregulieren der Translation festgelegt wird. Alternativ oder in Kombination mit anderen hierin offenbarten PIV-Modifikationen, kann die C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- oder Knockout-Mutanten-PIV-Genexpression durch Änderung eines GS oder GE-Transkriptionssignals von (einem) ausgewählten Gen(en) des Virus moduliert werden. In alternativen Beispielen werden Genexpressionsspiegel in den C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- oder Knockout-Mutanten auf dem Transkriptionsniveau modifiziert. In einem Aspekt kann die Position eines ausgewählten Gens in der PIV-Genkarte in eine mehr Promotor-proximale oder Promotor-distale Position verändert werden, wodurch das Gen jeweils mehr bzw. weniger effizient exprimiert werden wird. Gemäß diesem Aspekt kann die Modulation der Expression für spezifische Gene erzielt werden was, verglichen mit den Wildtypmengen, die oft von einer im Einklang stehenden Verringerung der Expressionsmengen für reziproke, positionell substituierte Gene begleitet werden, zu Reduktionen oder Erhöhungen der Genexpression von zweifach, typischererweise vierfach, bis zu zehnfach oder mehr führt. Diese und andere transpositionierende Änderungen ergeben neue C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- oder Knockout Mutanten von PIV, die abgeschwächte Phänotypen aufweisen, zum Beispiel aufgrund von verringerter Expression von ausgewählten viralen Proteinen, die an der RNA-Replikation beteiligt sind oder andere wünschenswerte Eigenschaften wie zum Beispiel erhöhte Antigen-Expression aufweisen.
Infektiöse C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- oder Knockout-Mutanten-PIV-Clone können gemäß den hierin offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen erzeugt werden, um die Immunogenität zu erhöhen und einen Grad an Schutz zu induzieren, der größer ist als jener, der durch die Infektion mit einen Wildtyp-PIV oder einen Eltern-PIV bereitgestellt wird. Zum Beispiel kann ein immunogenes Epitop aus einem heterologen PIV-Stamm oder Typ, oder aus einer nicht-PIV-Quelle, wie zum Beispiel RSV, zu einem rekombinanten Clon durch entsprechende Nucleotidänderung in der Polynucleotidsequenz, die das Genom oder Antigenom codiert, hinzugefügt werden. Alternativ kann Mutanten-PIV erzeugt werden, um immunogene Proteine, Proteindomänen, oder Arten von spezifischen Proteinen, die mit wünschenswerten und nicht-wünschenswerten immunologischen Reaktionen in Zusammenhang stehen, hinzuzufügen oder zu unterdrücken (z.B. durch Aminosäure-Insertion, Substitution oder Deletion).
Innerhalb der hierin beschriebenen Verfahren können zusätzliche Gene oder Genomsegmente in oder nahe dem C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- oder Knockout-Mutanten-PIV-Genom oder -Antigenom eingeführt werden. Diese Gene können unter gemeinsamer Kontrolle mit Empfängergenen stehen oder können unter Kontrolle von einer unabhängigen Gruppe an Transkriptionssignalen stehen. Gene von Interesse umfassen die PIV-Gene, die vorstehend identifiziert wurden sowie nicht-PIV-Gene. Nicht-PIV-Gene von Interesse umfassen jene, die Cytokine codieren (z.B. IL-2 bis IL-18, insbesondere IL-2, IL-6 und IL-12, IL-18 usw.) Gamma-Interferon und Proteine, die reich an T-Helferzellen-Epitopen sind. Diese zusätzlichen Proteine können entweder als getrenntes Protein exprimiert werden oder als eine überzählige Kopie eines bestehenden PIV-Proteins, wie zum Beispiel HN oder F. Das stellt die Fähigkeit bereit die Immunantwort gegen PIV sowohl quantitativ als auch qualitativ zu modifizieren und zu verbessern.
Deletionen, Insertionen, Substitutionen und andere Mutationen, die Änderungen von gesamten viralen Genen oder Genomsegmenten innerhalb der C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- oder Knockout-Mutante einbeziehen, ergeben höchst stabile Impfstoff-Kandidaten, die im Falle von immunsupprimierten Personen besonders wichtig sind. Viele dieser Änderungen werden zu einer Abschwächung von daraus resultierenden Impfstoffstämmen führen, wohingegen andere unterschiedliche Arten an erwünschten phänotypischen Änderungen spezifizieren werden. Zum Beispiel sind zusätzliche (d.h. für das in vitro Wachstum nicht wesentliche) Gene ausgezeichnete Kandidaten, um Proteine zu codieren, die spezifisch mit der Wirtsimmunität interferieren (siehe z.B. Kato et al., EMBO J 16:578-87, 1997).
Es wird erwartet, dass die Unterdrückung solcher Gene in Impfstoffviren die Virulenz und Pathogenese vermindert und/oder Immunogenität verbessert.
In genaueren Beispielen werden die C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- oder Knockout-Mutanten als Vektoren für schützende Antigene von anderen Pathogenen eingesetzt, insbesondere von Pathogenen des Respirationstraktes wie zum Beispiel RSV. Zum Beispiel kann rekombinantes PIV erzeugt werden, das Sequenzen einschließt, die schützende Antigene von RSV codieren, um infektiöses, abgeschwächtes Impfstoffvirus zu produzieren. Die Clonierung der RSV-cDNA und eine anderen Offenbarung wird in der vorläufigen U.S. Patentanmeldungsnummer 60/007.083, eingereicht am 27. September 1995; der U.S. Patentanmeldungsnummer 08/720.132, eingereicht am 27. September 1996; der vorläufigen U.S. Patentanmeldungsnummer 60/021.773, eingereicht am 15. Juli 1996; der vorläufigen U.S. Patentanmeldungsnummer 60/046.141, eingereicht am 9. Mai 1997; der vorläufigen U.S. Patentanmeldungsnummer 60/047.634, eingereicht am 23. Mai 1997; der U.S. Patentanmeldungsnummer 08/892.403, eingereicht am 15. Juli 1997 (entsprechend der Internationalen Veröffentlichungsnummer WO 98/02530); der U.S. Patentanmeldung mit dem Titel PRODUCTION OF ATTENUATED CHIMERIC RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINES FROM CLONED NUCLEOTIDE SEQUENCES, eingereicht am 13. April 1999 und identifiziert durch die Anwalts-Aktennummer 17634-000520; der U.S. Patentanmeldung mit dem Titel PRODUCTION OF ATTENUATED NEGATIVE STRANDED RNA VIRUS VACCINES FROM CLONED NUCLEOTIDE SEQUENCES, eingereicht durch Murphy et al., am 13. April 1999 und identifiziert durch Anwalts-Aktennummer 17634-000600; Collins et al., Proc Natl Acad Sci USA 92:11563-11567, 1995; Bukreyev, et al., J Virol. 70:6634-41, 1996, Juhasz et al., J. Virol. 71(8):5814-5819, 1997; Durbin et al., Virology 235:323-332, 1997; He et al., Virology 237:249-260, 1997; Baron et al., J. Virol. 71:1265-1271, 1997; Whitehead et al., Virology 247(2):232-9, 1998a; Whitehead et al., J. Virol. 72(5):4467-4471, 1998b; Jin et al., Virology 251:206-214, 1998; und Whitehead et al., J. Virol. 73(4):3438-3442, 1999 und Bukreyev, et al., Proc Natl Acad Sci USA 96:2367-72, 1999).
Gemäß diesem Beispiel wird C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- oder Knockout-Mutanten-PIV bereitgestellt, das mindestens eine RSV-Sequenz einschließt. Zum Beispiel können einzelne Gene von HPIV3 mit den Gegenstückgenen aus menschlichem RSV ersetzt werden. Alternativ wird ein ausgewähltes heterologes Genomsegment, das z.B. einen cytoplasmatischen Schwanz, eine Transmembrandomäne oder Ectodomäne eines RSV-Glykoproteins codiert, durch ein Gegenstück-Genomsegment ausgetauscht z.B. in das gleiche Gen in HPIV3 oder innerhalb eines unterschiedlichen Gens in HPIV3 oder innerhalb einer nicht-codierenden Sequenz des HPIV3-Genoms oder Antigenoms hinzugefügt, um ein chimäres PIV-RSV-Glykoprotein zu ergeben. In einem Beispiel wird ein Genomsegment aus einem F-Gen des menschlichen RSV durch ein Gegenstück-HPIV3-Genomsegment ausgetauscht, um Konstrukte zu ergeben, die chimäre Proteine codieren, z.B. Fusionsproteine, die einen cytoplasmatischen Schwanz und/oder eine Transmembrandomäne von PIV aufweisen, fusioniert mit einer Ectodomäne von RSV, um ein neues abgeschwächtes Virus zu ergeben und/oder einen multivalenten Impfstoff, der sowohl gegen PIV als auch gegen RSV immunogen ist.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Modifikationen der C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- oder Knockout-Mutanten können unterschiedliche oder zusätzliche Modifikationen in den PIV-Clonen durchgeführt werden, um Manipulationen wie zum Beispiel Insertion von einzigartigen Restriktionstellen in verschiedenen intergenen Regionen oder anderswo zu erleichtern (z.B. eine einzigartige Stul-Stelle zwischen den G und F-Genen). Nicht-translatierte Gensequenzen können entfernt werden, um die Kapazität für die Insertion von Fremdsequenzen zu erhöhen.
In einem anderen Beispiel werden Zusammensetzungen (z.B. isolierte Polynucleotide und Vektoren, die chimäre Mensch-Rinder-PIV-codierende cDNA enthalten) für die Produktion eines isolierten infektiösen PIVs bereitgestellt. Unter Verwendung dieser Zusammensetzungen und Verfahren werden infektiöse PIVs aus einem PIV-Genom oder -Antigenom, einem Nucleocapsid (N)-Protein, einem Phosphoprotein (P) und einem großen (L) Polymeraseprotein erzeugt. In ähnlichen Beispielen werden Zusammensetzungen und Verfahren zum Einführen der vorstehend erwähnten strukturellen und phänotypischen Änderungen in ein rekombinantes PIV bereitgestellt, um infektiöse abgeschwächte Impfstoffviren zu ergeben.
Einführen der vorhergehend definierten Mutationen in einen infektiösen C-, D- und/oder V-ORF(s) Deletions- oder Knockout-Mutanten-Clon kann durch eine Vielzahl an gut bekannten Verfahren erzielt werden. Mit „infektiösem Clon", bezüglich der DNA, wird cDNA oder ihr Produkt gemeint, synthetisch oder anders, das in genomische oder antigenomische RNA transkribiert werden kann, die im Stande ist als eine Matrize zu dienen, um das Genom eines infektiösen Virus oder subviralen Partikels zu erzeugen. Definierte Mutanten können daher durch herkömmliche Techniken (z.B. ortsspezifische Mutagenese) in eine cDNA-Kopie des Genoms oder Antigenoms eingeführt werden. Die Verwendung von antigenomischen oder genomischen cDNA-Unterfragmenten, um eine vollständige antigenome oder genomische cDNA zusammenzusetzen, wie sie hierin beschrieben wird, hat den Vorteil, dass jede Region getrennt manipuliert (kleinere cDNAs sind leichter zu manipulieren als größere) und dann leicht in vollständige cDNAs zusammengesetzt werden kann. Die vollständige antigenomische oder genomische cDNA, oder irgendein Unterfragment davon, kann daher als eine Matrize für die Oligonucleotidgerichtete Mutagenese verwendet werden. Das kann durch das Zwischenprodukt einer einzelsträngigen Phagmidform, wie zum Beispiel unter Verwendung des Mutagene^® Kits von Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA) oder durch ein Verfahren, das ein doppelsträngiges Plasmid direkt als Matrize verwendet, wie zum Beispiel dem Chameleon-Mutagenesekit von Stratagene (La Jolla, CA), oder durch die Polymerase-Kettenreaktion, entweder unter Einsatz eines Oligonucleotidprimers oder einer Matrize sein, welche die Mutation(en) von Interesse enthält. Ein mutiertes Unterfragment kann dann in die vollständige antigenomische oder genomische cDNA zusammengesetzt werden. Eine Vielfalt an anderen Mutationstechniken ist bekannt und zur Verwendung in der Herstellung der Mutationen von Interesse in der antigenomischen oder genomischen PIV-cDNA verfügbar. Mutationen können von einzelnen Nucleotidänderung bis zum Austausch von großen cDNA-Stücken variieren, die ein oder mehrere Gene oder Genomregionen enthalten.
In einem veranschaulichenden Beispiel werden Mutationen unter Verwendung des Muta-gene-Phagemid in vitro Mutageneskits eingeführt, der von Bio-Rad erhältlich ist. Kurz gesagt wird cDNA, die einen Teil des PIV-Genoms oder Antigenoms codiert, in das Plasmid pTZ18U cloniert und verwendet, um CJ236-Zellen (Life Technologies) zu transformieren. Phagmid-Präparationen werden wie vom Hersteller empfohlen präpariert. Oligonucleotide werden für die Mutagenese durch Einführung eines geänderten Nucleotids an der gewünschten Position des Genoms oder Antigenoms entworfen. Das Plasmid, welches das genetisch veränderte Genom- oder Antigenomfragment enthält, wird dann amplifiziert und das mutierte Stück wird dann wieder in den Volllängen-Genom oder -Antigenom-Clon eingeführt.
Außerdem werden Verfahren zur Herstellung von infektiösem chimärem Mensch-Rinder-PIV aus einem oder mehreren isolierten Polynucleotiden beschrieben, z.B. ein oder mehreren cDNAs. cDNA, die ein PIV-Genom oder -Antigenom codiert, wird für intrazelluläre oder in vitro Co-Expression mit den nötigen viralen Proteinen konstruiert, um infektiöses PIV zu bilden. Unter „PIV-Antigenom" ist ein isoliertes Polynucleotid-Molekül mit positivem Sinn ("positive-sense") zu verstehen, das als eine Matrize für die Synthese der Nachkommen-PIV-Genoms dient. Eine cDNA, die eine Version des PIV-Genoms mit positivem Sinn darstellt, entsprechend der replikativen Zwischenprodukt-RNA, oder dem Antigenom, kann konstruiert werden, damit die Möglichkeit der Hybridisierung mit positive-sense-Transkripten der komplementierenden Sequenzen, die Proteine codieren, die nötig sind um ein transkribierendes, replizierendes Nucleocapsid zu erzeugen, d.h. Sequenzen, die N-, P- und L-Protein codieren, minimiert wird.
Das Genom oder Antigenom dieses rekombinanten PIVs muss nur jene Gene oder Teile davon enthalten, die notwendig sind um die dadurch codierten viralen oder subviralen Partikel infektiös zu machen. Ferner können die Gene oder Teile davon durch mehr als ein Polynucleotid-Molekül bereitgestellt werden. D.h. ein Gen kann durch Komplementierung oder ähnliches aus einem getrennten Nucleotidmolekül bereitgestellt werden, oder kann direkt aus der genomischen oder antigenomischen cDNA exprimiert werden.
Mit rekombinantem PIV wird ein PIV oder PIV-ähnliches virales oder subvirales Partikel gemeint, das direkt oder indirekt aus einem rekombinanten Expressionssystem stammt oder aus Virus- oder subviralen Partikeln propagiert wird, die davon erzeugt werden. Das rekombinante Expressionssystem wird einen rekombinanten Expressionsvektor einsetzen, der eine funktionsfähig damit verknüpfte Transkriptionseinheit umfasst, umfassend eine Zusammensetzung von mindestens einem genetischen Element oder Elementen, die in der PIV-Genexpression eine regulatorische Rolle spielen, zum Beispiel ein Promotor, eine strukturelle oder codierende Sequenz, die in PIV-RNA transkribiert wird und geeignete Transkriptionsinitiations- und Terminationssequenzen.
Um infektiöses PIV aus cDNA-exprimiertem Genom oder Antigenom herzustellen, wird das Genom oder Antigenom mit jenen PIV-Proteinen co-exprimiert, die notwendig sind um (i) ein Nucleocapsid herzustellen, das zur RNA-Replikation fähig ist, und (ii) Nachkommen-Nucleocapside zu ergeben, die sowohl zur RNA-Replikation als auch zur Transkription im Stande sind. Transkription durch das Genom-Nucleocapsid stellt die anderen PIV-Proteine bereit und initiiert eine produktive Infektion. Alternativ können zusätzliche PIV-Proteine durch Co-Expression geliefert werden, die für eine produktive Infektion benötigt werden.
Infektiöses PIV wird durch intrazelluläre zellfreie Co-Expression von einem oder mehreren isolierten Polynucleotidmolekülen hergestellt, die eine PIV-Genom oder -Antigenom-RNA, gemeinsam mit einem oder mehreren Polynucleotiden codieren, die virale Proteine codieren, die notwendig sind, um ein transkribierendes, replizierendes Nucleocapsid zu erzeugen. Unter den viralen Proteinen, die für die Co-Expression notwendig sind, um infektiöses PIV zu ergeben sind das Haupt-Nucleocapsidprotein (N), Nucleocapsid-Phosphoprotein (P), das große (L) Polymeraseprotein, das Fusionsprotein (F), das Hämagglutinin-Neuraminidase Glykoprotein (HN) und das Matrixprotein (M). In diesem Zusammenhang sind außerdem Produkte der C-, D- und V-ORFs von PIV nützlich.
cDNAs, die ein PIV-Genom oder -Antigenom codieren werden für intrazelluläre oder in vitro Co-Expression mit den nötigen viralen Proteinen konstruiert, um infektiöses PIV zu bilden. Mit „PIV-Antigenom" wird ein isoliertes positive-sense Polynucleotid-Molekül gemeint, das als ein Matrize für die Synthese des Nachkommen-PIV-Genoms dient. Es kann eine cDNA konstruiert werden, die eine positive-sense-Version des PIV-Genoms darstellt, die der replikativen Zwischenprodukt RNA, oder dem Antigenom entspricht, damit die Möglichkeit des Hybridisierens mit den positive-sense-Transkripten von komplementierenden Sequenzen minimiert wird, die Proteine codieren die nötig sind, um ein transkribierendes, replizierendes Nucleocapsid zu erzeugen.
In manchen Beispielen muss das Genom oder Antigenom eines rekombinanten PIVs (rPIV) nur diese Gene oder Teile davon enthalten, die notwendig sind, um die viralen oder subviralen Partikel, die dadurch codiert werden, infektiös zu machen. Die Gene oder Teile davon können ferner durch mehr als ein Polynucleotidmolekül bereitgestellt werden d.h. ein Gen kann durch Komplementierung oder ähnliches aus einem separaten Nucleotidmolekül bereitgestellt werden. In anderen Ausführungsformen codiert das PIV-Genom oder Antigenom alle Funktionen, die für das virale Wachstum, die Replikation und Infektion, ohne der Beteiligung eines Helfervirus oder der durch ein Plasmid oder Helfer-Zelllinie bereitgestellten viralen Funktion, notwendig sind.
Mit „rekombinantem PIV" wird ein PIV oder PIV-ähnliches virales oder subvirales Partikel gemeint, das direkt oder indirekt aus einem rekombinanten Expressionssystem stammt oder aus vitalen oder subviralen Partikeln davon hergestellt wird. Das rekombinante Expressionssystem wird einen rekombinanten Expressionsvektor einsetzen, der eine funktionsfähig verknüpfte Transkriptionseinheit einschließt, umfassend eine Anordnung von mindestens einem genetischen Element oder Elementen, die in der PIV-Genexpression eine regulatorische Rolle spielen, zum Beispiel ein Promotor, eine strukturelle oder codierende Sequenz, die in eine PIV-RNA transkribiert wird und geeignete Transkriptionsinitiations- und Terminationssequenzen.
Um infektiöses PIV aus einem cDNA-exprimierten PIV-Genom oder -Antigenom herzustellen, wird das Genom oder Antigenom mit jenen PIV-N, P und L-Proteinen co-exprimiert, die notwendig sind um (i) ein Nucleocapsid herzustellen, das zur RNA-Replikation im Stande ist und (ii) Nachkommen-Nucleocapside zu ergeben, die sowohl zur RNA-Replikation als auch Transkription im Stande sind. Transkription durch das Genom-Nucleocapsid stellt die anderen PIV-Proteine bereit und initiiert eine produktive Infektion. Alternativ können zusätzliche PIV-Proteine durch Co-Expression geliefert werden, die für eine produktive Infektion benötigt werden.
Synthese von PIV-Antigenom oder -Genom, gemeinsam mit den vorstehend erwähnten vitalen Proteinen, kann auch in vitro (zellfrei) erzielt werden, z.B. unter Verwendung einer kombinierten Trankriptions-Translationsreaktion, gefolgt durch Transfektion in Zellen. Alternativ kann Antigenom oder Genom-RNA in vitro synthetisiert werden und in Zellen transfiziert werden, die PIV-Proteine exprimieren.
In einem anderen Beispiel werden komplementierende Sequenzen, die Proteine codieren, die notwendig sind, um ein transkribierendes, replizierendes PIV-Nucleotcapsid zu erzeugen durch ein oder mehrere Helferviren bereitgestellt. Solche Helferviren können Wildtyp oder Mutanten sein.
Das Helfervirus kann phänotypisch von dem Virus unterschieden werden, das durch die PIV-cDNA codiert wird. Zum Beispiel ist es wünschenswert monoclonale Antikörper bereitzustellen, die immunologisch mit dem Helfervirus, aber nicht mit dem Virus reagieren, das durch die PIV-cDNA codiert wird. Solche Antikörper können neutralisierende Antikörper sein. Die Antikörper können in der Affinitäts-Chromatographie verwendet werden, um das Helfervirus von dem rekombinanten Virus abzutrennen. Um die Beschaffung solcher Antikörper zu unterstützen, können Mutationen in die PIV-cDNA eingeführt werden, um antigene Vielfalt von dem Helfervirus bereitzustellen, wie zum Beispiel in den HN- oder F-Glykoproteingenen.
In Alternativbeispielen werden die N, P, L und andere erwünschte PIV-Proteine durch ein oder mehrere nicht-virale Expressionsvektoren codiert, die die gleichen oder unterschiedliche von jenen sein können, die das Genom oder Antigenom codieren. Zusätzliche Proteine können wenn erwünscht einbezogen werden, jedes codiert durch seinen eigenen Vektor oder durch einen Vektor, der ein oder mehrere der N, P, L und andere gewünschte PIV-Proteine codiert, oder das vollständige Genom oder Antigenom. Die Expression des Genoms oder Antigenoms und der Proteine aus transfizierten Plasmiden können zum Beispiel durch jede cDNA erzielt werden, die unter der Kontrolle eines Promotors für die T7 RNA-Polymerase steht, welcher wiederum durch Infektion, Transfektion oder Transduktion mit einem Expressionssystem für die T7-Polymerase bereitgestellt wird, z.B. einer Vacciniavirus-MVA-Stamm-Rekombinante, welche die T7 RNA-Polymerase exprimiert (Wyatt et al., Virology, 210:202-205 (1995)).
Die viralen Proteine und/oder T7 RNA-Polymerase, kann auch durch transformierte Säugerzellen oder durch Transfektion von vorgeformter mRNA oder Protein bereitgestellt werden.
Ein PIV-Antigenom kann z.B. durch Zusammenbau von clonierten cDNA-Segmenten, durch Polymerase-Kettenreaktion oder ähnliches (PCR; beschrieben z.B. in U.S. Patentnummern 4.683.195 und 4.683.202 und PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Hrsg. Academic Press, San Diego (1990)) von revers-transkribierten Kopien der PIV-mRNA oder Genom-RNA konstruiert werden, die in der Gesamtheit das vollständige Antigenom darstellen. Zum Beispiel wird ein erstes Konstrukt erzeugt, das cDNAs umfasst, welche das linke Ende des Antigenoms enthält, das einen geeigneten Promotor umspannt (z.B. T7 RNA- Polymerasepromotor) und in einem geeigneten Expressionsvektor, wie zum Beispiel einem Plasmid, Cosmid, Phagen oder DNA-Virusvektor zusammengesetzt wird. Der Vektor kann durch Mutagenese modifiziert sein und/oder durch Insertion eines synthetischen Polylinkers, der einzigartige Restriktionsstellen umfasst, die zur Erleichterung des Zusammenbaus entworfen wurden. Zur Erleichterung der Erzeugung können die N, P, L und andere gewünschte PIV-Proteine in einem oder mehreren getrennten Vektoren zusammengefügt werden. Das rechte Ende des Antigenom-Plasmids kann, wenn erwünscht, zusätzliche Sequenzen, wie zum Beispiel flankierende Ribozyme und Tandem T7 Transkriptionsterminatoren enthalten. Das Ribozym kann von Hammerkopf-Typ sein (z.B. Grosfeld et al., (1995), vorstehend) der ein 3'-Ende ergeben würde, das ein einzelnes nicht-virales Nucleotid enthält, oder kann jedes andere geeignete Ribozym darstellen, wie zum Beispiel das eines Hepatitis-Deltavirus (Perrotta et al., Nature 350:434-436 (1991)), das ein 3'-Ende ergeben würde, das frei von nicht-PIV-Nucleotiden ist. Die linken und rechten Enden werden dann über eine gemeinsame Restriktionsstelle verbunden.
Eine Vielzahl an Nucleotid-Insertionen, Deletionen und Neuanordnungen kann im PIV-Genom oder -Antigenom während oder nach der Konstruktion der cDNA durchgeführt werden. Zum Beispiel können spezifisch erwünschte Nucleotidsequenzen an den geeigneten Regionen in der cDNA unter Verwendung von geeigneten Restriktionsenzymstellen synthetisiert und inseriert werden. Alternativ können solche Techniken wie ortsspezifische Mutagenese, Alanin-Durchmusterung, PCR-Mutagenese oder andere solcher Techniken, die im Fachgebiet gut bekannt sind verwendet werden, um Mutationen in die cDNA einzuführen.
Alternative Mittel, um cDNA zu konstruieren, die das Genom oder Antigenom codiert, umfassen reverse Transkriptions-PCR unter Verwendung von verbesserten PCR-Bedingungen (z.B. wie beschrieben in Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699 (1994)), welche die Zahl von cDNA-Untereinheiten-Komponenten auf so wenige wie ein oder zwei Stücke reduziert. Unterschiedliche Promotoren können verwendet werden (z.B. T3, SP6) oder unterschiedliche Ribozyme (z.B. die des Hepatitis Deltavirus). Unterschiedliche DNA-Vektoren (z.B. Cosmide) können zur Vermehrung verwendet werden, um die größeren Genome oder Antigenome besser aufnehmen zu können.
Isolierte Polynucleotide (z.B. cDNA), die das Genom oder Antigenom codieren können durch Transfektion, Elektroporation, mechanische Insertion, Transduktion oder ähnliches in geeignete Wirtszellen inseriert werden, die im Stande sind eine schützende PIV-Infektion zu unterstützen, z.B. HEp-2, FRhl-DBS2, LLC-MK2, MRC-5 und Verozellen. Die Transfektion von isolierten Polynucleotidsequenzen kann in gezüchtete Zellen z.B. durch Calciumphosphat-vermittelte Transfektion (Wigler et al., Cell 14:725 (1978); Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603 (1981); Graham und Van der Eb, Virology 52:456 (1973)), Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, (1982)), DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion (Ausubel et al., (Hrsg). Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY (1987), Kationische, Lipid-vermittelte Transfektion (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73-79 (1993)) oder einem im Handel erhältlichen Transfektionsreagens z.B. LipofectACE^® (Life Technologies, Gaithersburg, MD) oder ähnlichem, eingeführt werden.
Wie vorstehend angemerkt werden die N, P, L und andere erwünschte PIV-Proteine in manchen Beispielen durch ein oder mehrere Helferviren codiert, das phänotypisch von jenem unterscheidbar ist, das das Genom oder Antigenom codiert. Die N, P, L und anderen erwünschten PIV-Proteine können auch durch ein oder mehrere Expressionsvektoren codiert werden, die gleich oder unterschiedlich zu jenem sein können, welches das Genom oder Antigenom codiert und verschiedenen Kombinationen davon. Zusätzliche Proteine, die durch ihren eigenen Vektor oder durch einen Vektor codiert werden, der ein oder mehrere der N, P, L und andere gewünschte PIV-Proteine codiert oder das vollständige Genom oder Antigenom, können, falls erwünscht, einbezogen werden.
Durch Bereitstellen von infektiösen Clonen von PIV erlaubt die Erfindung eine große Auswahl an Änderungen, die rekombinant innerhalb des PIV-Genoms (oder Antigenoms) hergestellt werden können und definierte Mutationen ergeben, die gewünschte phänotypische Änderungen spezifizieren. Unter „infektiöser Clon" ist zu verstehen: cDNA oder ihr Produkt, synthetisch oder anders, RNA, die in der Lage ist direkt in infektiöse Virionen eingebaut zu werden, die in genomische oder antigenomische RNA transkribiert werden kann, die im Stande ist als eine Matrize zu dienen, um das Genom von infektiösen viralen oder subviralen Partikeln herzustellen. Wie vorstehend angemerkt können definierte Mutationen durch eine Vielzahl an herkömmlichen Techniken (z.B. ortsgerichtete Mutagenese) in eine cDNA-Kopie des Genoms oder Antigenoms eingeführt werden. Die Verwendung von genomischen oder antigenomischen cDNA-Subfragmenten für den Zusammenbau einer vollständigen genomischen oder antigenomischen cDNA, wie sie hierin beschrieben wird, hat den Vorteil, dass jede Region getrennt manipuliert werden kann, wobei kleine cDNA-Stücke eine bessere Manipulationserleichterung bereitstellen als große cDNA-Stücke und dann leichter in eine vollständige cDNA zusammengesetzt werden. Die vollständige antigenomische oder genomische cDNA, oder ein ausgewähltes Unterfragment davon kann als eine Matrize für Oligonucleotidgerichtete Mutagenese verwendet werden. Das kann durch das Zwischenprodukt einer einzelsträngigen Phagmidform stattfinden, wie zum Beispiel unter Verwendung des MUTA-gen^® Kits von Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA) oder ein Verfahren unter direkter Verwendung des doppelsträngigen Plasmids als eine Matrize wie zum Beispiel des Chameleon^® Mutagenesekits von Stratagene (La Jolla, CA), oder der Polymerasekettenreaktion, entweder unter Einsatz eines Oligonucleotidprimers oder einer Matrize, welche die Mutation(en) von Interesse enthält. Ein mutiertes Unterfragment kann dann in die vollständige Antigenom- oder Genom-cDNA zusammengesetzt werden. Eine Vielzahl von anderen Mutagenese-Techniken ist bekannt und kann routinemäßig für die Verwendung in der Herstellung von Mutationen von Interesse in einer antigenomischen oder genomischen PIV-cDNA angepasst werden.
In einem veranschaulichenden Beispiel werden daher Mutationen durch Verwendung des MUTA-gene^® Phagmid in vitro Mutagenesekits eingeführt, der von Bio-Rad Laboratories erhältlich ist. Kurz gesagt wird cDNA in das Plasmid pTZ18U cloniert, das ein PIV-Genom oder Antigenom codiert und verwendet, um CJ236-Zellen (Life Technologies) zu transformieren. Phagmiderzeugungen werden wie vom Hersteller empfohlen erzeugt. Oligonucleotide werden durch die Einführung von geänderten Nucleotiden an der gewünschten Position des Genoms oder Antigenoms für die Mutagenese entworfen. Das Plasmid, welches das genetisch veränderte Genom oder Antigenom enthält, wird amplifiziert.
Mutationen können von einzelnen Nucleotidaustauschen bis zur Einführung, Deletion oder dem Austausch von großen cDNA-Segmenten variieren, die ein oder mehrere Gene oder Genomsegmente enthalten. Genomsegmente können strukturellen und/oder funktionellen Domänen entsprechen, z.B. cytoplasmatischen, Transmembran- oder Ectodomänen von Proteinen, aktiven Stellen wie zum Beispiel Stellen, welche die Bindung oder andere biochemische Interaktionen mit unterschiedlichen Proteinen vermitteln, epitopischen Stellen, z.B. Stellen, welche die Antikörperbindung und/oder humorale oder zellvermittelte Immunreaktionen usw. stimulieren. Nützliche Genomsegmente erstrecken sich in diesem Zusammenhang von etwa 15-35 Nucleotiden im Falle von Genomsegmenten, die kleinere funktionelle Domänen von Proteinen codieren, z.B. epitopische Stellen bis etwa 50, 75, 100, 200-500 und 500-1.500 oder mehr Nucleotiden.
Die Fähigkeit definierte Mutationen in infektiösen PIV einzuführen hat viele Anwendungen, einschließlich der Manipulation von PIV-pathogenen und immunogenen Mechanismen. Zum Beispiel können die Funktionen von PIV-Proteinen, einschließlich der N, P, M, F, HN und L-Proteine und C-, D- und V-ORF-Produkte durch Einführen von Mutationen manipuliert werden, die den Proteinexpressionsgrad unterdrücken oder reduzieren, oder welche Mutantenprotein ergeben. Verschiedene genomische strukturelle RNA-Merkmale, wie zum Beispiel Promotoren, intergenische Regionen und Transkriptionssignale, können routinemäßig manipuliert werden.
Die Effekte von trans-wirkenden Proteinen und cis-agierenden RNA-Sequenzen kann leicht bestimmt werden, zum Beispiel unter Verwendung einer vollständigen antigenomischen cDNA in parallelen Tests, die PIV-Minigenome einsetzen (Dimock, et al., J. Virol. 67:2772-8 (1993)), deren Gewinnung("Rescue")-abhängiger Zustand bei der Charakterisierung jener Mutanten nützlich ist, die zu hemmend wirken, um in einem replikationsunabhängigen infektiösen Virus wiedergefunden zu werden.
Bestimmte Substitutionen, Insertionen, Deletionen oder Neuanordnungen der Gene oder Gensegmente innerhalb des rekombinanten PIVs (z.B. Substitutionen eines Gensegments, das ein ausgewähltes Protein oder eine Proteinregion codiert, zum Beispiel einen cytoplasmatischen Schwanz, Transmembrandomäne oder Ectodomäne, einer Epitopstelle oder Region, eine Bindungsstelle oder Region, eine aktive Stelle oder Region, die eine aktive Stelle enthält, usw.) werden in strukturelle oder funktionelle Beziehung mit einem bestehenden „Gegenstück"-Gen oder Gensegment aus dem gleichen oder unterschiedlichen PIV oder einer anderen Quelle gestellt. Solche Modifikationen ergeben neue Rekombinanten, die, verglichen mit den Wildtyp oder Eltern-PIV oder anderen viralen Stämmen, gewünschte phänotypische Änderungen aufweisen. Zum Beispiel können Rekombinanten dieser Art ein chimäres Protein codieren, das einen cytoplasmatischen Schwanz und/oder eine Transmembrandomäne von einem PIV aufweist, das mit einer Ectodomäne eines anderen PIV fusioniert ist. Andere beispielhafte Rekombinante dieser Art exprimieren zweifache Proteinregionen, wie zum Beispiel zweifache immunogene Regionen.
Wie hierin verwendet sind „Gegenstück"-Gene, Gensegmente, Proteine oder Proteinregionen die üblicherweise aus heterologen Quellen sind (z.B. aus unterschiedlichen PIV-Genen, oder repräsentieren das gleiche (d.h. homologe oder allelische) Gen oder Gensegment in unterschiedlichen PIV-Arten oder Stämmen). Übliche Gegenstücke, die in diesem Zusammenhang ausgewählt werden, teilen grobe strukturelle Merkmale, z.B. kann jedes Gegenstück ein vergleichbares Protein oder eine strukturelle Proteindomäne, wie zum Beispiel eine cytoplasmatische Domäne, Transmembrandomäne, Ectodomäne, Bindungsstelle oder -Region, Epitopstelle oder Region usw. codieren. Gegenstück-Domänen und ihre codierenden Gensegmente schließen eine Sammlung von Arten ein, die eine Reihe an Größen- und Sequenzvariationen aufweisen, die durch eine gemeinsame biologische Aktivität zwischen der Domäne oder dem Gensegement definiert werden.
Gegenstück-Gene und -Gensegmente sowie auch andere hierin offenbarte Polynucleotide für die Herstellung von rekombinantem PIV, teilen oft beträchtliche Sequenzidentität mit einer ausgewählten Polynucleotid-„Referenzsequenz", z.B. mit einer anderen ausgewählten Gegenstück-Sequenz. Wie hierin verwendet ist eine „Referenz-Sequenz" eine definierte Sequenz, die als eine Basis für den Sequenzvergleich verwendet wird, zum Beispiel ein Segment von einer Volllängen-cDNA oder einem Gen oder einer vollständigen cDNA oder Gensequenz. Im Allgemeinen ist eine Referenzsequenz mindestens 20 Nucleotide lang, häufig mindestens 25 Nucleotide lang und oft mindestens 50 Nucleotide lang. Nachdem zwei Polynucleotide jeweils (1) eine Sequenz umfassen können (d.h. einen Teil der vollständigen Polynucleotidsequenz), die zwischen den beiden Polynucleotiden ähnlich ist und (2) ferner eine Sequenz umfassen können, die zwischen den beiden Polynucleotiden unterschiedlich ist, werden Sequenzvergleiche zwischen zwei (oder mehreren) Polynucleotiden üblicherweise durch Vergleichen der Sequenzen der beiden Polynucleotide über ein „Vergleichsfenster" durchgeführt, um lokale Regionen der Sequenzähnlichkeit zu identifizieren und zu vergleichen. Ein „Vergleichsfenster", wie es hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein konzeptionelles Segment von mindestens 20 zusammenhängenden Nucleotidpositionen, wobei eine Polynucleotidsequenz mit einer Referenzsequenz von mindestens 20 zusammenhängenden Nucleotiden verglichen werden kann und wobei der Anteil der Polynucleotidsequenz in dem Vergleichsfenster, für optimalen Abgleich der beiden Sequenzen, Additionen und Deletionen (d.h. Lücken) von 20 Prozent oder weniger, verglichen mit der Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) umfassen kann. Optimalen Abgleich (Alignment) der Sequenzen zum Abgleich eines Vergleichsfensters kann durch den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith & Waterman, Adv. Appl Math. 2:482 (1981), durch den Homologie-Alignment-Algorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), durch das Verfahren mittels Suche nach Ähnlichkeit von Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), durch computerisierte Ausführung dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA, und TFASTA in der Wisconsin Genetics Software Package Release 7,0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison WI, die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist) oder durch Überprüfung ausgeführt werden und der beste, durch die verschiedenen Verfahren erzeugte Abgleich (d.h. resultierend in der höchsten Sequenzähnlichkeit über das Vergleichsfenster) wird ausgewählt. Der Begriff „Sequenzidentität" bedeutet, dass zwei Polynucleotidsequenzen (d.h. auf einer Nucleotid-zu-Nucleotidbasis) über das Vergleichsfenster identisch sind. Der Begriff „Prozent an Sequenzidentität" wird durch Vergleichen von zwei optimal abgeglichenen Sequenzen über das Vergleichsfenster berechnet, wobei die Anzahl der Positionen bestimmt wird, bei denen die identische Nucleinsäurebase (z.B. A, T, C, G, U oder I) in beiden Sequenzen vorkommt, um die Zahl an übereinstimmenden Positionen zu bestimmen, Dividieren der Zahl an übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtzahl an Positionen im Vergleichsfenster (d.h. der Fenstergröße) und Multiplizieren des Ergebnisses mit 100, um den Prozentsatz an Sequenzidentität zu ergeben. Der Begriff „im wesentlichen identisch" wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine Charakteristik einer Polynucleotidsequenz, wobei das Polynucleotid eine Sequenz umfasst, die mindestens 85 Prozent Sequenzidentität aufweist, vorzugsweise mindestens 90 bis 95 Prozent Sequenzidentität, üblichererweise mindestens 99 Prozent Sequenzidentität, wie verglichen mit einer Referenzsequenz über ein Vergleichsfenster von mindestens 20 Nucleotidpositionen, oft über ein Fenster von mindestens 25-50 Nucleotiden, wobei der Prozentsatz an Sequenzidentität durch Vergleichen der Referenzsequenz mit der Polynucleotidsequenz berechnet wird, die Deletionen oder Additionen umfassen kann, die insgesamt 20 Prozent oder weniger der Referenzsequenz über das Vergleichsfenster ausmachen. Die Referenzsequenz kann eine Untergruppe einer größeren Sequenz darstellen.
Zusätzlich zu diesen Polynucleotidsequenzbeziehungen werden üblicherweise auch Proteine und Proteinregionen, die durch rekombinantes PIV codiert sind, ausgewählt, um konservative Beziehungen zu haben, d.h. um erhebliche Sequenzidentität oder Sequenzähnlichkeit mit ausgewählten Referenz-Polypeptiden aufzuweisen. Wenn auf Polypeptide angewandt, bedeutet der Begriff „Sequenzidentität" Peptide, die identische Aminosäuren an entsprechenden Positionen teilen. Der Begriff „Sequenzähnlichkeit" bedeutet Peptide, die identische oder ähnliche Aminosäuren (d.h. konservative Substitutionen) an übereinstimmenden Positionen aufweisen. Der Begriff „wesentliche Sequenzidentität" bedeutet, dass zwei Peptidsequenzen, wenn sie optimal abgeglichen sind, wie zum Beispiel durch die Programme GAP oder BESTFIT unter Verwendung von „Default gap weights", mindestens 80 Prozent Sequenzidentität, vorzugsweise mindestens 90 Prozent Sequenzidentität, stärker bevorzugt mindestens 95 Prozent Sequenzidentität oder mehr (z.B. 99 Prozent Sequenzidentität) teilen. Der Begriff „wesentliche Ähnlichkeit" bedeutet, dass zwei Peptidsequenzen übereinstimmende Prozentsätze an Sequenzähnlichkeit teilen. Vorzugsweise unterscheiden sich die Positionen der Reste, die nicht identisch sind durch konservative Aminosäureaustausche. Konservative Aminosäuresubstitutionen beziehen sich auf die Austauschbarkeit von Resten, die ähnliche Seitenketten aufweisen. Eine Gruppe von Aminosäuren, die aliphatische Seitenketten aufweist ist zum Beispiel Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin; eine Gruppe von Aminosäuren, die aliphatische Hydroxylseitenketten aufweist ist Serin und Threonin; eine Gruppe von Aminosäuren, die amidenthaltende Seitenketten aufweist, ist Asparagin und Glutamin; eine Gruppe von Aminosäuren, die aromatische Seitenketten aufweist ist Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan; eine Gruppe an Aminosäuren, die basische Seitenketten aufweist ist Lysin, Arginin und Histidin; und eine Gruppe von Aminosäuren, die Schwefelseitenketten aufweist ist Cystein und Methionin. Bevorzugte konservative Aminosäuresubstitutionsgruppen sind: Valin-Leucin-Isoleucin, Phenylalanin-Tyrosin, Lysin-Arginin, Alanin-Valin und Asparagin-Glutamin. Abkürzungen für die hierin verwendeten zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren folgen der herkömmlichen Verwendung (Immunology – A Synthesis (2. Ausgabe, E.S. Golub & D.R. Gren, Hrsg. Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1991)).
Stereoisomere (z.B. D-Aminosäuren) von den zwanzig herkömmlichen Aminosäuren, nicht natürliche Aminosäuren, wie zum Beispiel α,α-disubstituierte Aminosäuren, N-Alkyl-Aminosäuren, Milchsäure und andere nicht herkömmliche Aminosäuren können auch geeignete Komponenten für Polypeptide der vorliegenden Erfindung sein. Beispiele von nicht herkömmlichen Aminosäuren umfassen: 4-Hydroxyprolin, γ-Carboxyglutamat, ε-N,N,N-Trimethyllysin, ε-N-Acetyllysin, O-Phosphoserin, N-Acetylserin, N-Formylmethionin, 3-Methylhistidin, 5-Hydroxylysin, ω-N-Methylarginin und andere ähnliche Aminosäuren und Iminosäuren (z.B. 4-Hydroxyprolin). Darüber hinaus können Aminosäuren durch Glykosylierung, Phosphorylierung und ähnliches modifiziert werden.
Um Kandidaten-Impfstoffviren auszuwählen, werden die Kriterien von Lebensfähigkeit, Attenuierung und Immunogenität gemäß gut bekannten Verfahren bestimmt. Viren, die als Impfstoffe der Erfindung am meisten erwünscht sein werden, müssen Lebensfähigkeit beibehalten, einen stabilen Attenuierungs-Phänotyp aufweisen, Replikation in einem immunisierten Wirt zeigen (trotz niedriger Spiegel) und wirkungsvoll die Erzeugung einer Immunantwort in einem Geimpften hervorrufen, ausreichend, um Schutz gegen schwere Erkrankung zu verleihen, die durch anschließende Infektion von Wildtypvirus verursacht wird. Die rekombinanten PIVs der Erfindung sind nicht nur lebensfähig, und angemessener abgeschwächt als frühere Impfstoffkandidaten, sondern sind in vivo genetisch stabiler, wobei sie die Fähigkeit eine schützende Immunantwort zu stimulieren beibehalten und in manchen Fällen den durch mehrere Modifikationen verliehenen Schutz ausdehnen, z.B. Schutz gegen unterschiedliche virale Stämme oder Untergruppen induzieren oder Schutz gegen eine unterschiedliche immunologische Basis, z.B. sekretorisch im Vergleich mit Serum-Immunglobulinen, zellulärer Immunität und ähnlichem.
Rekombinantes PIV kann in verschiedenen gut bekannten und allgemein anerkannten in vitro und in vivo Modellen getestet werden, um angemessene Attenuierung, Resistenz gegen phänotypische Reversion und Immunogenität für Impfstoffverwendung zu bestätigen. In in vitro Tests wird das modifizierte Virus (z.B. eine vielfach abgeschwächtes, biologisch-abgeleitetes oder rekombinantes PIV) getestet, z.B. auf Temperatursensitivität der Virusreplikation, d.h. ts-Phänotyp und auf den kleinen Plaque- oder anderen gewünschten Phänotyp. Modifizierte Viren werden in Tiermodellen für PIV-Infektion weiter untersucht. Eine Vielzahl an Tiermodellen ist beschrieben worden und wurde hierin in verschiedenen Referenzen zusammengefasst. PIV-Modellsysteme, einschließlich Nager und nicht-menschlichen Primaten, zur Evaluierung von Attenuierung und immunogener Aktivität der PIV-Impfstoffkandidaten, werden im Fachgebiet weithin akzeptiert und die davon erhaltenen Daten korrelieren gut mit der PIV-Infektion, Attenuierung und Immunogenität in Menschen.
In Übereinstimmung mit der vorhergehenden Beschreibung werden isolierte, infektiöse rekombinante virale PIV-Zusammensetzungen zur Verwendung als Impfstoff beschrieben. Das abgeschwächte Virus, das ein Bestandteil eines Impfstoffes ist, liegt in einer isolierten und einer üblicherweise gereinigten Form vor. Mit isoliert wird gemeint, dass es sich auf PIV bezieht, das in einer anderen als einer natürlichen Form eines Wildtypvirus vorliegt, wie zum Beispiel dem Nasopharynx eines infizierten Individuums. Allgemeiner gesagt, soll isoliert bedeuten, dass das abgeschwächte Virus als ein Teil einer Zellkultur oder eines anderen künstlichen Mediums vorliegt, wo es vermehrt und in einem kontrollierten Milieu charakterisiert werden kann. Zum Beispiel kann abgeschwächtes PIV durch eine infizierte Zellkultur hergestellt werden, von der Zellkultur abgetrennt und zu einem Stabilisator hinzugefügt werden.
Zur Verwendung als Impfstoff kann rekombinantes PIV direkt in Impfstoffformulierungen verwendet werden oder wenn erwünscht unter Verwendung von Lyophilisierungsprotokollen, die Fachleuten gut bekannt sind, lyophilisiert werden. Lyophilisiertes Virus wird üblicherweise bei etwa 4°C beibehalten. Wenn es für die Verwendung bereit ist, wird das lyophilisierte Virus in einer stabilisierenden Lösung rekonstituiert, z.B. Salzlösung, SPG, Mg⁺⁺ und HEPES, mit oder ohne Adjuvans, wie nachstehend weiter beschrieben.
PIV-Impfstoffe enthalten als Wirkstoff eine immunologisch wirkungsvolle Menge an PIV, die wie hierin beschrieben erzeugt wurde. Das modifizierte Virus kann mit einem physiologisch akzeptablen Träger und/oder Adjuvans in einen Wirt eingeführt werden. Nützliche Träger sind im Fachgebiet gut bekannt und umfassen z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Salzlösung, 0,3% Glycin, Hyaluronsäure und ähnliches. Die daraus resultierenden wässrigen Lösungen können wie sie sind zur Verwendung verpackt werden oder lyophilisiert werden, das lyophilisierte Präparat wird, wie vorstehend erwähnt, vor der Verabreichung mit einer sterilen Lösung vereinigt. Die Zusammensetzungen können, falls sie benötigt werden, pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe enthalten, um physiologischen Bedingungen nahe zu kommen, wie zum Beispiel pH-Wert-Einstellung und puffernde Mittel, Tonizität-einstellende Mittel, Befeuchtungsmittel und ähnliches, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat und ähnliches. Akzeptable Hilfsstoffe umfassen inkomplettes Freud's Adjuvans, MPL^TM (3-o-deacyliertes Monophosphoryl-Lipid A; RIBI ImmunoChem Research, Inc. Hamilton, MT) und IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA) unter vielen anderen im Fachgebiet gut bekannten Hilfsstoffen.
Nach der wie hierin beschriebenen Immunisierung mit einer PIV-Zusammensetzung über Aerosol, Tröpfchen, oral, topisch oder einen anderen Weg, reagiert das Immunsystem des Wirts durch Erzeugung von Antikörpern auf den Impfstoff, die spezifisch für die PIV-Virusproteine sind, z.B. F- und HN-Glykoproteine. Als ein Ergebnis der Impfung mit einer immunogen effektiven Menge an PIV, die wie hierin beschrieben erzeugt wurde, wird der Wirt zumindest partiell oder vollständig immun gegen PIV-Infektion oder resistent für die Entwicklung einer mittelmäßigen oder schweren PIV-Infektion – insbesondere des unteren Respirationstrakts.
Der Wirt, dem Impfstoffe verabreicht wurden, kann jeder Säuger sein, der für die Infektion durch PIV empfänglich ist oder ein nahe verwandter Virus und wobei der Wirt im Stande ist eine schützende Immunantwort gegen die Antigene des Impfstoffstammes zu erzeugen. Demgemäß werden Verfahren zur Erzeugung von Impfstoffen für eine Vielzahl an menschlichen und tierärztlichen Verwendungen bereitgestellt.
Die Impfstoffzusammensetzungen, die PIV enthalten, können an einen Wirt verabreicht werden, der für PIV-Infektion empfänglich oder anders gefährdet ist, um die Fähigkeit zur wirtseigenen Immunantwort zu erhöhen. Eine solche Menge wird als eine „immunogen effektive Dosis" definiert. In dieser Verwendung wird die genaue Menge an PIV, die innerhalb einer effektiven Dosis verabreicht werden soll, vom Gesundheitszustand und Gewicht des Wirtes, der Art der Verabreichung, der Natur der Formulierung usw. abhängig sein, wird aber im Allgemeinen zwischen etwa 10³ bis etwa 10⁷ Plaque bildenden Einheiten (PbE) oder mehr an Virus pro Wirt liegen, üblicherweise von etwa 10⁴ bis 10⁶ PbE Virus pro Wirt. Auf jeden Fall sollten die Impfstoffformulierungen eine Menge an modifiziertem PIV bereitstellen, die ausreichend ist, um den Wirtspatienten vor einer schweren lebensbedrohenden PIV-Infektion zu schützen.
Das PIV kann mit Viren von anderen PIV-Serotypen oder Stämmen kombiniert werden, um Schutz gegen multiple PIV-Serotypen oder Stämme zu erzielen. Alternativ kann der Schutz wie hierin beschrieben gegen multiple PIV-Serotypen oder Stämme durch Kombination der schützenden Epitope von multiplen Serotypen oder Stämmen erzielt werden die in einem Virus erzeugt werden. Üblicherweise, wenn unterschiedliche Viren verabreicht werden, werden sie in Beimengung und gleichzeitig verabreicht, sie können aber auch getrennt verabreicht werden. Die Immunisierung mit einem Stamm kann gegen unterschiedliche Stämme des gleichen oder unterschiedlichen Serotypen schützen.
In manchen Fällen kann es wünschenswert sein die PIV-Impfstoffe mit Impfstoffen zu kombinieren, welche schützende Antworten gegen andere Mittel induzieren, insbesondere andere Kindheits-Viren. In einem anderen Beispiel kann das PIV als ein Vektor für schützende Antigene von anderen Pathogenen eingesetzt werden, wie zum Beispiel respiratorisches Synzytial-Virus (RSV) oder Masernvirus, indem die Sequenzen, die für diese schützenden Antigene codieren in das verwendete PIV-Genom oder -Antigenom eingeführt werden um infektiöses PIV wie vorhin beschrieben herzustellen.
In allen Probanden wird die genaue Menge an verabreichtem rekombinantem PIV-Impfstoff und die zeitliche Koordination und Wiederholung der Verabreichung basierend auf dem Gesundheitszustand und Gewicht des Patienten, der Verabreichungsart, der Art der Formulierung usw., bestimmt werden. Dosierungen werden sich im Allgemeinen zwischen etwa 10³ und etwa 10⁷ Plaque bildenden Einheiten (PbE) oder mehr Virus pro Patient erstrecken; üblichererweise von etwa 10⁴ bis 10⁶ PbE Virus pro Patient. In jedem Fall sollten die Impfstoffformulierungen eine Menge an abgeschwächten PIV bereitstellen, die ausreichend ist, um eine anti-PIV-Immunantwort effektiv zu stimulieren oder induzieren, z.B. wie es unter anderen Verfahren durch Komplementfixierung, Plaque-Neutralisierung und/oder Enzymgekoppeltem Immunadsorptions-Test bestimmt werden kann. In diesem Zusammenhang werden Personen auch auf Zeichen und Symptome für die Erkrankung der oberen Atemwege beobachtet. Wie bei der Verabreichung an Schimpansen, wo das abgeschwächte Virus des Impfstoffes im Nasopharynx von Geimpften bei Mengen von ungefähr 10-fach oder niedriger als der Wildtyp-Virus oder ungefähr 10-fach oder niedriger wächst, als wenn es mit Mengen an nicht vollständig abgeschwächten PIV verglichen wird.
In Neugeborenen und Säuglingen kann eine mehrfache Verabreichung benötigt werden, um ausreichende Immunitätsgrade hervorzurufen. Die Verabreichung sollte innerhalb des ersten Lebensmonat beginnen und bei Intervallen während der ganzen Kindheit durchgeführt werden, wie zum Beispiel falls nötig nach zwei Monaten, sechs Monaten oder einem Jahr und zwei Jahren, um ausreichende Schutzgrade gegen native (Wildtyp)-PIV-Infektion aufrecht zu erhalten. Auf ähnliche Weise können Erwachsene, die besonders anfällig für wiederholte oder schwere PIV-Infektion sind, wie zum Beispiel Gesundheitspersonal, Kinderbetreuungspersonal, Familienmitglieder von kleinen Kindern, ältere Menschen, Personen die beeinträchtigte Herz-Lungen-Funktion aufweisen, multiple Impfungen benötigen, um schützende Immunantworten auszubauen und/oder beizubehalten. Der Grad der induzierten Immunität kann durch Messung der Mengen an neutralisierenden sekretorischen und Serumantikörpern überwacht werden und Dosierungen angeglichen oder Impfungen, wenn nötig wiederholt werden, um gewünschte Schutzgrade beizubehalten. Unterschiedliche Impfstoffviren können ferner für Verabreichung in unterschiedlichen Empfängergruppen indiziert sein. Zum Beispiel kann ein erzeugter PIV-Stamm, der Cytokin oder zusätzliches Protein exprimiert, das reich an T-Zell-Epitopen ist, eher besonders vorteilhaft für Erwachsene als für Säuglinge sein.
PIV-Impfstoffe können mit Viren vereinigt werden, die Antigene von einer anderen Untergruppe oder PIV-Stamm exprimieren, um Schutz gegen multiple PIV-Untergruppen oder Stämme zu erzielen. Alternativ kann das Impfstoffvirus schützende Epitope von multiplen PIV-Stämmen oder Untergruppen einbeziehen, die wie vorstehend beschrieben in dem PIV-Clon erzeugt werden.
Die PIV-Impfstoffe der Erfindung lösen die Erzeugung einer Immunantwort aus, die gegen schwere Erkrankung des unteren Respirationstraktes schützt, wie zum Beispiel Lungenentzündung und Bronchiolitis, wenn die Person anschließend mit Wildtyp-PIV infiziert wird. Während das natürlich zirkulierende Virus noch immer im Stande ist insbesondere im oberen Respirationstrakt eine Infektion zu verursachen, gibt es als Folge der Immunisierung und möglicherweise Boosten der Resistenz durch anschließende Infektion durch das Wildtyp-Virus eine stark verringerte Möglichkeit von Rhinitis. Nach der Impfung gibt es nachweisbare Mengen an wirtserzeugtem Serum und sekretorischen Antikörpern, die im Stande sind homologes (von der gleichen Untergruppe) Wildtyp-Virus in vitro und in vivo zu neutralisieren. In manchen Fällen werden die Wirtsantikörper auch Wildtyp-Virus von unterschiedlichen nicht-Impfstoff-Untergruppen neutralisieren.
Bevorzugte PIV-Impfstoff-Kandidaten zeigen eine sehr erhebliche Verminderung der Virulenz, wenn es mit dem Wildtypvirus verglichen wird, das unter Menschen natürlich zirkuliert. Das Virus wird ausreichend abgeschwächt, sodass Symptome der Infektion in den meisten immunisierten Personen nicht vorkommen werden. In manchen Fällen kann das abgeschwächte Virus noch immer im Stande sein an nicht geimpfte Personen übertragen zu werden. Seine Virulenz ist jedoch ausreichend abgeschwächt, sodass schwere Infektionen des unteren Respirationstraktes in geimpften oder zufälligen Wirten nicht vorkommen.
Der Attenuierungsgrad der PIV-Impfstoff-Kandidaten kann zum Beispiel durch Quantifizierung der Virusmenge bestimmt werden, die in dem Respirationstrakt eines immunisierten Wirts vorhanden ist und indem die Menge mit der verglichen wird, die durch Wildtyp-PIV oder andere abgeschwächte PIV erzeugt wird, die als Kandidaten-Impfstoffstämme evaluiert worden sind. Zum Beispiel wird das abgeschwächte Virus im oberen Respirationstrakt von einem hoch empfänglichen Wirt, wie zum Beispiel einem Schimpansen, verglichen mit den Replikationsgraden des Wildtypvirus einen größeren Grad an Replikationsrestriktion aufweisen, z.B. 10-1000-fach weniger. Um die Entwicklung von Rhinorrhö weiter zu reduzieren, die mit der Replikation von Virus im oberen Respirationstrakt verbunden ist, sollte ein idealer Impfstoff-Kandidatenvirus sowohl im oberen als auch im unteren Respirationstrakt eine eingeschränkte Replikationsmenge zeigen. Die abgeschwächten Viren müssen in Menschen jedoch ausreichend infektiös und immunogen sein, um in geimpften Individuen Schutz zu vermitteln. Verfahren zur Bestimmung von PIV-Spiegeln im Nasopharynx eines infizierten Wirts sind in der Literatur bekannt.
Der Grad an induzierter Immunität, die durch die Impfstoffe bereitgestellt wurde, kann auch durch Messen der Mengen an neutralisierenden sekretorischen und Serumantikörpern gemessen werden. Basierend auf diesen Messungen, können Impfstoffdosierungen eingestellt oder Impfungen wenn nötig wiederholt werden, um gewünschte Schutzgrade beizubehalten. Unterschiedliche Impfstoffviren können ferner für unterschiedliche Empfängergruppen vorteilhaft sein. Zum Beispiel kann ein erzeugter PIV-Stamm, der ein zusätzliches Protein exprimiert das reich an zusätzlichen T-Zellepitopen ist, eher besonders vorteilhaft für Erwachsene als für Säuglinge sein.
In noch einem weiteren Beispiel wird das PIV als ein Vektor für transiente Gentherapie des Respirationstraktes eingesetzt. Demgemäß bezieht das rekombinante PIV-Genom oder -Antigenom eine Sequenz ein, die im Stande ist ein Genprodukt von Interesse zu codieren. Das Genprodukt von Interesse steht unter der Kontrolle des gleichen oder eines anderen Promotors, von dem die PIV-Expression kontrolliert wird. Das infektiöse PIV, das durch Co-Expression des rekombinanten PIV-Genoms oder Antigenoms mit N-, P-, L oder anderen erwünschten PIV-Proteinen erzeugt wird und eine Sequenz enthält, die das Genprodukt von Interesse codiert, kann an einen Patienten verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt üblicherweise durch Aerosol, Zerstäuber oder eine andere topische Verabreichung an den Respirationstrakt eines Patienten, der behandelt wird. Rekombinantes PIV wird in einer Menge verabreicht, die ausreichend ist, um in der Expression von therapeutischen oder prophylaktischen Mengen des erwünschten Genproduktes zu resultieren. Repräsentative Genprodukte, die innerhalb dieses Verfahrens verabreicht werden können, sind vorzugsweise für transiente Expression geeignet, zum Beispiel einschließlich Interleukin-2, Interleukin-4, Gamma-Interferon, GM-CSF, G-CSF, Erythropoietin und andere Cytokine, Glukocerebrosidase, Phenylalanin- Hydrolase, cystische Fibrose Transmembran-Übertragungsregulator (CFTR), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase, Cytotoxine, Tumorsuppressorgene, Antisense-RNAs und Impfstoff-Antigene.
Die folgenden Beispiele werden als Erläuterung und nicht als Einschränkung bereitgestellt. Diese Beispiele dokumentieren die Verwendung eines rekombinanten cDNA-Systems, um eine repräsentative Mutation in den C-ORF einzuführen, die seine Expression völlig stilllegt. Auch repräsentativ für die Erfindung wurden Mutationen konstruiert und bewertet, welche die Einführung von Stopp-Codons in die D- und V-ORFs umfassen, um die Expression der entsprechenden Proteine stillzulegen. Die Effekte dieser Mutationen auf die virale Replikation und Pathogenese werden dokumentiert und die Nützlichkeit dieser Mutationen in der Entwicklung von lebenden abgeschwächten Impfstoffen gegen PIV wird dadurch etabliert.
In einem nachstehend beschriebenen Mutantenvirus, bezeichnet als rC-KO, wird die Expression des C-Proteins durch Umwandlung des C-Startcodons von Methionin in Threonin und Einführung von zwei Stopp-Codons an den Aminosäurepositionen 7 und 26 des C-ORF aufgehoben. In einem zweiten Mutantenvirus ist die rC-KO-Mutante in vivo und in vitro höchst abgeschwächt, wie sowohl unter Verwendung des Mäuse- als auch des Primatenmodells gezeigt wird. rC-KO verleit auch erheblichen Schutz gegen die Herausforderung mit dem Wildtyp HPIV3.
Obwohl die einzelne Unterbrechung der D- und V-ORFs die Replikation des Virus in vitro und in vivo nicht wesentlich beeinträchtigt hat, hat die gemeinsame Unterbrechung beider die Replikation in vivo abgeschwächt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die C-, D- und V-Proteine von HPIV3 alle eine Rolle in der Virusreplikation haben und dass die beispielhaften Mutationen starke Werkzeuge für die Entwicklung von rekombinanten PIV-Impfstoff-Kandidaten darstellen.
BEISPIEL I
Konstruktion von Knockout-Mutationen in den HPIV3 C-, D- und V-ORFs
Zellen und Viren
Menschliches HEp-2 und Affen-LLC-MK2-Monolayer-Zellkulturen wurden in OptiMEM 1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) beibehalten, das mit 2% fötalem Rinderserum, Gentamicin-Sulfat (50μg/ml) und 4 mM Glutamin ergänzt war. Das modifizierte, rekombinante Vaccinia-Stamm Ankara (MVA) Virus, das Bakteriophagen T7 RNA-Polymerase exprimiert, wurde großzügigerweise von Drs. L. Wyatt und B. Moss (Wyatt et al., Virology 210:202-205, 1995) zur Verfügung gestellt. Der JS-Wiltyp (wt) Stamm von PIV3 und sein abgeschwächtes ts-Derivat, JS cp45, wurden in LLC-MK2-Zellen wie vorstehend beschrieben (Hall et al., Virus Res. 22:173-184, 1992)) vermehrt.
cDNAs
Der Volllängen-cDNA-Clon, der das gesamte 15462 nt Antigenom {p3/7(131)2G} des JS wt-Virus codiert wurde vorstehend beschrieben (Genebank Zugangsnummer #Z11575) [Durbin et al., Virology 235:323-332, 1997; siehe auch U.S. Patentanmeldungsseriennummer 09/083.793, eingereicht am 22. Mai 1998; vorläufige U.S. Anmeldungsnummer 60/047.575, eingereicht am 23. Mai 1997 (entsprechend der Internationalen Veröffentlichungsnummer WO 98/53078) und vorläufige U.S. Anmeldungsnummer 60/059.385, eingereicht am 19. September 1997)].
Dieser Clon wurde als eine Matrize für die Konstruktion von vier mutierten cDNAs verwendet, eine, in welcher die Expression des C-ORF vollständig aufgehoben war, eine zweite und dritte, in welchen die Expression der D- und V-Leserahmen einzeln abgeschafft war und eine vierte, in welcher die D- und V-Leserahmenmutationen kombiniert waren (Tabelle 1, 1).
Das PmlI bis BamHI-Fragment des p3/7(131)2G (nt 1215-3903 des PIV3-Antigenoms) wurde in das Plasmid pUC119 {pUC119(PmlI-BamHI)} subcloniert, das modifiziert worden ist, um eine PmlI-Stelle in die multiple Clonierungsregion einzubeziehen. Ortsspezifische Mutagenese wurde dann an pUC119(PmlI-BamHI) unter Verwendung des Kunkel-Verfahrens (Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367- 382, 1987) durchgeführt, um die Mutationen in die C-, D- und V-ORFs einzuführen, die nachstehend beschrieben werden.
Konstruktion von antigenomischer cDNA, welche die C-Knockout-Mutante (rC-KO) codiert.
Zwei Primer wurden verwendet um Mutationen einzuführen, welche die Expression des C-ORFs stilllegen würden (siehe Tabelle 1, 1C). Der erste mutagene Primer änderte das C-ORF-Startcodon von ATG zu ACG (Methionin zu Threonin), indem die nt-Position 1795 (T→C) des Volllängen Antigenoms geändert wurde und wandelte die Aminosäureposition 7 des C-ORFs durch Änderung der nt-Position 1813 (C→A) von Serin in ein Stopp-Codon um. Der zweite mutagene Primer ersetzte das Serin an der Aminosäureposition 26 des C-ORFs durch ein Stopp-Codon, indem die nt-Position 1869 von C nach A geändert wurde. Diese Mutationen, die in den C-ORF eingeführt wurden, waren im P-ORF still.
Konstruktion von antigenomischen cDNAs, die D-, V- und DV-Knockout-Mutanten codieren (rD-KO, rV-KO und rDV-KO) codieren
Mutationen wurden eingeführt, welche sowohl die Expression des D- und V-ORFs einzeln unterbrechen würden. Der D-Knockout-Primer führte C nach A-Änderungen an den nt-Positionen 2692, 2695 und 2698 des Volllängen-Antigenoms ein (Tabelle 1, 1). Diese Punktmutationen erzeugten drei aufeinander folgende Stopp-Codons im mutmaßlichen D-ORF, die in vorzeitiger Termination des D-Proteins, nach dem Codon 303 innerhalb des 372-Aminosäuren langen, chimären D-Protein, das in 1 C gezeigt wird, resultieren würden. Es war nicht möglich diese Stopp-Codons früher in den D-ORF einzuführen ohne eine gleichzeitige Codierungsänderung im P-ORF zu verursachen. Die Expression des mutierten ORFs wird daher nicht vollständig aufgehoben, sondern würde ein verkürztes D-Protein codieren, das die N-terminalen 241 Aminosäuren von P, eher verbunden mit 62 als mit 131 Aminosäuren der D-Domäne enthält. Der mutagene V-Knockout-Primer, führte zwei Punktmutationen an den nt-Positionen 2845 (A nach T) und 2854 (C nach T) des Volllängen Antigenoms (Tabelle 1) ein. Diese Mutationen erzeugten frühe Stopp-Codons (Amiosäure-Positionen 17 und 20) im mutmaßlichen V-ORF. Diese Mutationen waren im P-ORF still, führten aber zwei Aminosäuresubstitutionen in das D-Protein ein, nämlich Q354L und A357V. Beide Primer wurden gemeinsam in einer einzelnen Mutagenesereaktion verwendet, um die kombinierten DV-Knockout-Mutationen zu erzeugen.
Das PmlI bis BamHI-Fragment von jedem Volllängen-Clon wurde in seiner Gesamtheit sequenziert, um die Anwesenheit der eingeführten Mutationen zu bestätigen und um zu bestätigen, dass keine zufällig anderen Mutationen zufällig eingeführt wurden. Diese Fragmente wurden dann, wie vorstehend beschrieben (Durbin et al., Virology 235:232-332, 1997) getrennt zurück in den Volllängen-Clon p3/7(131)2G cloniert, um die vier unterschiedlichen antigenomischen cDNA-Clone zu ergeben.
BEISPIEL II
Gewinnung und Charakterisierung von rekombinanten C-Knockout (rC-KO)-, D-Knockout (rD-KO)-, V-Knockout (rV-KO)- und DV-Knockout (rDV-KO)-Mutanten
Die Volllängen antigenomischen cDNAs, die entweder die C-, D-, V- oder DV-Knockout-Mutationen tragen, wurden gemeinsam mit den Unterstützungs-Plasmiden {pTM(N), pTM(P kein C) und pTM(L)} unter Verwendung von LipofectACE (Life Technologies) in HEp-2-Zellen auf Platten mit 6 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) transfiziert und die Zellen wurden gleichzeitig mit MVA-T7 infiziert, wie vorstehend beschrieben in Durbin et al., Virology 235:323-332, 1997; siehe auch U.S. Patentanmeldungsseriennummer 09/083.793, eingereicht am 22. Mai, 1998; vorläufige U.S. Anmeldungsnummer 60/047.575, eingereicht am 23. Mai 1997 (entsprechend der Internationalen Veröffentlichungsnummer WO 98/53078) und vorläufige U.S. Anmeldungsnummer 60/059.385, eingereicht am 19. September 1997). pTM(P kein C) ist, mit der Ausnahme dass die C-Transkriptions-Startseite von ATG nach ACG mutiert wurde, wobei die erste Aminosäure im C-ORF von Methionin nach Threonin verändert wurde, identisch zum pTM(P) Plasmid, das vorstehend (ebenda) beschrieben wurde. Nach Inkubation bei 32°C für drei Tage wurde die Transfektionsernte auf einen frischen LLC-MK2-Zellmonolayer in einer T25-Flasche passagiert und für 5 Tage bei 32°C (bezeichnet als Passage 1) inkubiert. Die Menge an Virus, das in der D-, V- und DV-, Knockout-Passage 1 vorhanden war, wurde durch Plaque-Titration auf LLC-MK2-Monolayer-Kulturen bestimmt, mit Plaques, die durch Immunperoxidasefärbung mit PIV3 HN-spezifischen Antikörpern wie vorstehend beschrieben (ebenda) sichtbar gemacht wurden. Das C-Knockout-Virus schien schlecht zu wachsen und deshalb wurde seine Passage-1-Ernte durch eine zweite Passage in einem Monolayer von LLC-MK2-Zellen in einer T75-Flasche weiter amplifiziert. Die Virusmenge, die in der Passage-2-Ernte vorhanden war, wurde wie vorstehend beschrieben bestimmt.
Die D-, V- und DV-Knockout-Viren, die in den Überständen der Passage-1-Ernte vorhanden waren, wurden dann wie vorstehend beschrieben (Hall et al., Virus Res. 22:173-184, 1992) dreimal auf LLC-MK2-Zellen Plaque-gereinigt.
Das C-Knockout-Virus konnte nicht biologisch durch Plaque-Reinigung cloniert werden, da es nicht im Stande war identifizierbare Plaques leicht zu bilden. Es wurde daher unter Verwendung von zweifachen Verdünnungen auf Platten mit 96 Vertiefungen (12 Vertiefungen pro Verdünnung) der LLC-MK2-Zellen begrenzt verdünnt. Die biologisch clonierten, rekombinanten Viren aus der dritten Runde der Plaque-Reinigung oder der endgültigen Verdünnung wurden dann zweimal in LLC-MK2-Zellen bei 32°C amplifiziert, um Virus für eine weitere Charakterisierung herzustellen.
Sequenzanalyse der gewonnenen rekombinanten Viren
Virus wurde aus geklärtem Medium aus infizierten Zell-Monolayern durch Polyethylen-Glycol-Ausfällung wie vorstehend beschreiben konzentriert (Durbin et al., Virology 235:323-332, 1997). Die RNA wurde mit TRIzol-Reagens (Life Technologies) gereinigt, indem das vom Hersteller empfohlene Verfahren befolgt wurde. RT-PCR wurde mit dem Advantage RT-for-PCR-Kit (Clontech, Palo Alto, CA), entsprechend dem empfohlenen Protokoll durchgeführt. Kontrollreaktionen waren identisch, außer dass reverse Transkriptase von der Reaktion ausgelassen wurde, um zu bestätigen, dass die PCR-Produkte ausschließlich aus viraler RNA und nicht aus möglicher kontaminierender cDNA stammten. Primer wurden verwendet, um das PCR-Fragment zu erzeugen, das die Nucleotide 1595-3104 des Volllängen-Antigenoms umspannte. Dieses Fragment umfasst die vollständigen C-, D- und V-ORFs der rekombinanten Viren. Die daraus resultierenden PCR-Produkte wurden dann unter Verwendung der Zyklus-Didesoxynucleotid-Sequenzanalyse sequenziert (New England Biolabs, Beverly, MA).
Proteinanalyse durch Immunpräzipitation
Zwei PIV3 C-spezifische Antiseren wurden in Kaninchen durch multiple Antigenpeptid (MAP)-Technik gegen zwei verschiedene C-Peptide (Research Genetics, Huntsville, AL) erzeugt. Die beiden Peptide umspannten die Aminosäureregionen 30-44 und 60-74 des C-Proteins. Acht Kopien von jedem C-Peptid wurden auf einen verzweigten Trägerkern gegeben und mit Freud-Adjuvans getrennt in Kaninchen injiziert (zwei Kaninchen pro Peptid). Die Kaninchen wurden mit dem ausgewiesenen MAP nach 2 und 4 Wochen geboostet und bei 4, 8 und 10 Wochen wurde Blut entnommen. Jedes Antiserum erkannte das C-Peptid, das mit hohem Titer als ein Immunogen verwendet wurde und fällte C-Protein aus HPIV3-infizierten Zellen in einem Radioimmun-Präzipitationstest (RIPA) aus. Auf ähnliche Weise haben wir versucht Antiseren gegen die D- und V-Proteine herzustellen, waren aber nicht erfolgreich; die erzeugten Antiseren hatten niedrige Titer gegen die Peptide selbst und es war uns nicht möglich die D- oder V-Proteine, die von den mit Wildtyp-Virus infizierten Zellen mutmaßlich hergestellt wurden, nachzuweisen.
T25 Zell-Monolayer von LLC-MK2-Zellen wurden bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 5 entweder mit rC-KO, rekombinantem JS wt Virus (rJS) infiziert oder wurden zum Schein infiziert und bei 32°C inkubiert. 24 Stunden nach der Infektion wurde der Monolayer mit Methionin ohne DMEM (Life Technologies) gewaschen und in der Anwesenheit von 10 μCi/μl an ³⁵S-Methionin in Methionin ohne DMEM für zusätzliche 6 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden dann geerntet, 3-mal gewaschen und in 1 ml RIPA-Puffer resuspendiert {1 % (Gew./Vol.) Natrium-Deoxycholat, 1 % (Vol./Vol.) Triton X-100, 0,2% (Gew./Vol.) SDS, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4}, gefriergetrocknet und bei 6500 × g pelletiert. Das Zellextrakt wurde in ein frisches Eppendorf-Röhrchen transferiert und ein Gemisch von beiden C-Antiseren (jeweils 5μl) wurde zu jeder Probe hinzugefügt und bei konstantem Mischen für 2 Stunden bei 4°C inkubiert. 10 μl eines Gemischs von mAk 454/11 und 101/1, die das HN-Glykoprotein von HPIV3 erkennen (van Wyke Coelingh et al., J. Virol. 61:1473-1477, 1987) wurden zu jeder Probe hinzugefügt, um zu bestätigen, dass wiedergefundenes Virus tatsächlich HPIV3 war. Immunkomplexe wurden durch Hinzufügen von 200 μl einer 10% Suspension von Protein A-Sepharoseperlen (Sigma, St. Louis, MO) zu jeder Probe ausgefällt, gefolgt von konstantem Mischen bei 4°C über Nacht. Jede Probe wurde denaturiert, reduziert und auf einem 4-12% Polyacrylamidgel (NuPAGE, Novex, San Diego, CA) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers analysiert. Das Gel wurde getrocknet und durch Autoradiographie analysiert.
Multizyklus-Replikation von rPIV3
Monolayer von LLC-MK2-Zellen in T25-Flaschen wurden in zweifacher Ausführung mit rC-KO, rDV-KO oder rJS bei einer MOI von 0,01 infiziert und bei 32°C in 5% CO₂ inkubiert. 250 μl Proben wurden bei 24-Stunden Intervallen für 7 aufeinander folgende Tage aus jeder Flasche entnommen und Blitzgefroren. Zu jedem Zeitpunkt wurde wieder ein äquivalentes Volumen an frischem Medium hinzugefügt. Jede Probe wurde auf LLC-MK2-Zellmonolayern in Platten mit 96-Vertiefungen titriert, die bei 32°C für 7 Tage inkubiert wurden. Virus wurde durch Hämadsorption nachgewiesen und als log₁₀TCID₅₀/ml ausgewiesen.
Tierstudien
4-6 Wochen alte golden Syrische Hamster wurden in Gruppen von 21 intranasal mit 0,1 ml an EMEM (Life Technologies) pro Tier inokuliert, das 10⁵ PbE von entweder rC-KO, rDV-KO oder rJS, cp45 (das biologisch-abgeleitete, lebend abgeschwächte Derivat des JS wt-Virus), oder respiratorisches Synzytialvirus (RSV) enthielt. An den Tagen 3, 4 und 5 nach der Inokulation wurden von jeder Gruppe, außer jenen die RSV erhielten, 5 Hamster getötet und die Lungen und die Nasenmuscheln wurden geerntet. Die Nasenmuscheln und Lungen wurden homogenisiert, um eine 10% bzw. 20% Gew./Vol. Suspension in L-15 (Quality Biologicals, Gaithersburg, MD) zu erzeugen und die Proben wurden rasch eingefroren. Virus, das in den Proben vorhanden war, wurde auf Platten mit 96 Vertiefungen von LLC-MK2-Zellmonolayern titriert, die bei 32°C für 7 Tage inkubiert wurden. Virus wurde durch Hämadsorption nachgewiesen und die durchschnittliche log₁₀TCID₅₀/g wurde für jeden Tag, für jede Gruppe von fünf Hamstern berechnet. Seren wurden aus den verbleibenden 6 Hamstern in jeder Gruppe an den Tagen 0 und 28 nach der Inokulierung gesammelt. Serum-Antikörperantworten zu jedem Virus wurden durch Hämagglutionations-Inhibierungs (HAI)-Test, wie vorhergehend beschrieben (van Wyke Coelingh et al., Virology 143:569-582, 1985) evaluiert. Am Tag 28 wurden die in jeder Gruppe verbleibenden Hamster, einschließlich jener, die mit RSV immunisiert wurden, intranasal mit 10⁶ PbE an biologisch-abgeleitetem PIV3 JS wt-Virus herausgefordert. Die Tiere wurden am 4. Tag nach der Herausforderung getötet und die Lungen und Nasenmuscheln wurden geerntet und wie vorstehend beschrieben verarbeitet. Die in den Herausforderungsproben vorhandene Virusmenge wurde wie vorstehend beschrieben bestimmt. Eine getrennte Studie wurde durchgeführt in welcher rD-KO, rV-KO an Hamster wie vorstehend beschrieben verabreicht wurden, außer dass die Tiere nicht herausgefordert wurden.
Afrikanische grüne Affen (AGMs) wurden in Gruppen von 4 Tieren jeweils intranasal und intratracheal mit 10⁶ PbE von entweder rC-KO, rDV-KO, JSwt oder cp45 inokuliert wie es vorstehend für frühere Studien in Rhesusaffen beschrieben wurde (Durbin et al., Vaccine 16:1324-30, 1998). Nasopharyngale Abstrichproben wurden täglich für 12 aufeinander folgende Tage nach der Inokulation gesammelt und tracheale Spülungsproben wurden an den Tagen 2, 4, 6, 8 und 10 nach der Inokulierung gesammelt. Die Proben wurden Blitzgefroren und bei –70°C gelagert bis alle Proben gesammelt worden waren. In den Proben vorhandenes Virus wurde auf LLC-MK2-Zellmonolayern in Platten mit 96 Vertiefungen titriert, die bei 32°C für 7 Tage inkubiert wurden. Virus wurde durch Hämadsorption nachgewiesen und der durchschnittliche log₁₀TCID₅₀/ml wurde für jeden Tag berechnet. Serum wurde aus jedem Affen an Tagen 0 und 28 gesammelt und die PIV3 HAI-Antikörperantwort zu experimenteller Infektion mit den verschiedenen Mutanten und dem PIV3-Wildtyp (JS) wurde bestimmt. Am Tag 28 nach der Inokulierung wurden die AGMs mit 10⁶ PbE des biologisch-abgeleiteten PIV3-Wildtyp-Virus herausgefordert, das in einem 1 ml Inoculum intranasal und intratracheal verabreicht wurde. Nasopharyngale Abstrichproben wurden an den Tagen 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10 und 12 nach der Herausforderung gesammelt und tracheale Spülungsproben wurden an den Tagen 2, 4, 6, 8 und 10 nach der Herausforderung gesammelt. Proben wurden Blitzgefroren, gelagert und vorhandenes Virus wurde wie vorstehend beschrieben titriert.
Gewinnung der rekombinanten Mutanten rC-KO, rD-KO, rV-KO und rDV-KO
HPIV3 antigenomische cDNAs wurden hergestellt, um die folgenden vier Mutantenviren (siehe Tabelle 1, 1) zu codieren: (i) rC-KO, in dem der C-ORF modifiziert war, um das Initiationscodon von M nach T zu ändern und Translations-Stopp-Codons 7 und 26 einzuführen; (ii) rD-KO, in dem die Translationsstopps an den Codon 304, 305 und 306 in dem chimären 372-Aminosäure-D-Protein eingeführt wurden; (iii) rV-KO, in dem die Stopp-Codons an den Positionen 17 und 20 in den V-ORF eingeführt wurden; und (iv) rDV-KO, in dem die Mutationen ii und iii kombiniert wurden. Jede Mutation war in den überlappenden ORFs translationell still, außer in dem Fall in dem zwei Stopp-Codons in den V-ORF (iii) eingeführt wurden, was in zwei Aminosäure-Substitutionen in D resultierte, nämlich Q354L und A357V, die nicht verhindert werden konnten. Darüber hinaus wurden die Stopp-Codons in D nicht früher in den ORF eingeführt, da sie P geändert hätten. Jede Mutation wurde gemeinsam mit einem translationell stillen Restriktionsstellenmarker eingeführt (Tabelle 1).
Die antigenomischen cDNAs wurden gemeinsam mit den drei PIV3-Unterstützungsplasmiden {pTM(P kein C), pTM(N), pTM(L)} in Hep-2-Zellen transfiziert und die Zellen wurden gleichzeitig mit MVA infiziert, das die T7 RNA-Polymerase exprimiert. Die Effizienz der Wiederfindung von rPIV3, das die Mutationen in den C-, D- oder V-ORFs enthält, wurde mit der einer ähnlich transfizierten-infizierten HEp-2-Zellkultur unter Verwendung des p3/7(131)2G verglichen, dem Plasmid welches das Volllängen PIV3-Antigenom exprimiert aus welchem rekombinantes JSwt PIV3 früher wiedergefunden wurde (Durbin et al., Virology 235:323-332, 1997). Nach Inkubation für 3 Tage bei 32°C wurden die transfizierten Zellen geerntet und jeder Überstand wurde auf einem frischen Monolayer von LLC-MK2-Zellen in einer T25-Flasche passagiert und für 5 Tage bei 32°C (Passage 1) inkubiert. Nach 5 Tagen bei 32°C zeigte der LLC-MK2-Zellmonolayer von rJS, rD-KO, rV-KO und rDV-KO 3-4+ cytopatischen Effekt (CPE). Die entsprechende Passage 1 von rC-KO zeigte wenn überhaupt nur minimalen CPE. Da unklar war ob das Fehlen des cytopatischen Effekts in der rC-KO-Probe auf einen hohen Grand an Wachstumsrestriktion des Mutantenvirus zurückzuführen war, oder einfach einer sehr niedrigen anfänglichen Wiederfindung des Virus zuzuschreiben war, wurde die Passage 1 geerntet und der Überstand in einer T75-Flasche auf einen frischen Monolayer an LLC-MK2-Zellen passagiert und für 7 Tage bei 32°C inkubiert (Passage 2). Der T75-Monolayer von LLC-MK2-Zellen zeigte nur 1-2+ cytopatischen Effekt nach 7 Tagen der Inkubation, aber die Anwesenheit von HPIV3 wurde durch Hämadsorption bestätigt. Nach drei Runden an biologischer Clonierung durch Plaqueisolierung oder terminaler Verdünnung wurde jede Rekombinante zweimal in LLC-MK2-Zellen amplifiziert, um eine Lösung an Virus für die weitere Charakterisierung zu erzeugen.
Um zu bestätigen, dass gewonnene Viren auch wirklich die erwarteten rC-KO, rD-KO, rV/-KO und rDV-KO-Mutanten darstellten, wurde jedes clonierte Virus durch RT-PCR unter Verwendung eines Primerpaares analysiert, das ein DNA-Fragment amplifizierte, das nt 1595-3104 des HPIV3-Antigenoms umspannte, welches den Teil des P-Gens umfasste, der die C-, D- und V-ORFs umfasste. Die Erzeugung von jedem PCR-Produkt war vom Einbeziehen von RT abhängig, was darauf hinwies, dass jedes von RNA und nicht von kontaminierender cDNA stammte. Die PCR-Produkte von rC-KO, rD-KO, rV-KO und rDV-KO wurden dann mit Restriktionsenzymen, die als Marker eingeführt waren (Tabelle 1) gespalten und die Anwesenheit der Restriktionsenzymstellen wurde bestätigt. Nucleotidsequenzierung wurde auch an den RT-PCR-Produkten durchgeführt, um die Anwesenheit von eingeführten Mutationen zu bestätigen. Von allen eingeführten Mutationen wurde bestätigt, dass sie im RT-PCR-Fragment vorhanden waren, welches die nt 1595-3104 umspannte, die aus jeder clonierten Rekombinante amplifiziert wurden und andere zufällige Mutationen wurden in diesem Fragment nicht gefunden.
Um zu bestätigen, dass der C-ORF tatsächlich stillgelegt worden war, wurden Radioimmunpräzipitationstests (RIPA) durchgeführt, um das rC-KO-Mutantenvirus mit dem rJS wt-Virus zu vergleichen. Die Zellen wurden infiziert, in der Anwesenheit von ³⁵S-Methionin von 24 bis 30 Stunden nach der Infektion inkubiert und Zelllysate wurden erzeugt. Äquivalente Mengen des Gesamtproteins wurden mit anti-C und anti-HN-Antikörpern inkubiert und der Antikörper wurde dann an Protein A Sepharoseperlen gebunden. rJS wt codierte sowohl die HN als auch die C-Proteine, wohingegen rC-KO das C-Protein nicht exprimierte (3).
Replikation von rC-KO und rDV-KO in Zellkultur
Zweifache Kulturen von LLC-MK2-Zellmonolayern wurden mit rC-KO, rDV-KO oder rJS bei einer Multiplizität der Infektion von 0,01 infiziert und für 7 Tage bei 32°C inkubiert. Medium für jede Kultur wurde bei 24-Stunden Intervallen entnommen und dieses Material wurde anschließend titriert, um die Replikation von jedem Virus in der Zellkultur zu bewerten. Die Replikation von rDV-KO war im Wesentlichen von jener des Eltern-rJS-wt sowohl im Hinblick auf die Virus-Produktionsrate als auch den Peak-Titer (3), sowie auch der Fähigkeit bei erhöhter Temperatur (Daten nicht gezeigt) zu replizieren, nicht zu unterscheiden. Im Gegensatz dazu replizierte das rC-KO Virus langsamer und erreichte einen Peak-Titer am 6. Tag, was 100 bis 1.000-fach niedriger als der des rJS war. Das Fehlen der Expression des C-Proteins hatte daher einen wesentlichen Effekt auf die Virusreplikation in Zellkultur.
Replikation von rC-KO, rD-KO, rV-KO und rDV-KO in Hamstern
Wir haben dann die Mutantenviren und den Eltern-rJS-wt auf die Fähigkeit verglichen, im oberen und unteren Respirationstrakt von Hamstern zu replizieren. Eine vorläufige Studie zeigte, dass die rD-KO und rV-KO-Viren vom rJS-Virus in diesem Test (Daten nicht gezeigt) nicht zu unterscheiden waren und sie wurden von weiterer Evaluierung ausgeschlossen. In einer zweiten Studie wurden Gruppen an Hamstern intranasal mit 10⁵ PbE pro Tier an rC-KO, rDV-KO, rJS oder cp45, dem biologisch-abgeleiteten Impfstoffkandidaten, inokuliert. Verglichen mit rJS war die Replikation von rC-KO sowohl im oberen als auch im unteren Respirationstrakt der Hamster an jedem getesteten Tag (Tabelle 2) tausendfach oder mehr reduziert und war genauso abgeschwächt wie das cp45-Impfstoff-Kandidatenvirus. Obwohl die Replikation von rDV-KO im oberen Respirationstrakt von Hamstern nicht reduziert war, war sie im unteren Respirationstrakt (Tabelle 2) an jedem der 3 getesteten Tage mindestens 20-fach reduziert. Die Hamster, die mit rC-KO, rDV-KO, cp45 oder rJS infiziert waren, hatten ein erhebliche Antikörperantwort gegen HPIV3 und zeigten einen hohen Grad an Replikationsrestriktion des PIV3 Herausforderungsvirus (Tabelle 3). Der im oberen Respirationstrakt durch rC-KO gewährte Schutz war unvollständig aber doch erheblich.
Replikation von rC-KO und rDV-KO in Primaten
Um den abgeschwächten Phänotyp und die schützende Wirksamkeit von rC-KO und rDV-KO weiter zu evaluieren wurde jede dieser Mutanten an eine Gruppe von vier AGMs verabreicht und ihre Replikation in den oberen und unteren Respirationstrakten wurde mit der von cp45 und JSwt verglichen. Die Replikation von rC-KO war im oberen Respirationstrakt der AGMs 100-fach oder reduziert, wohingegen rDV-KO an dieser Stelle 10-fach reduziert war. Die für diese beiden Viren beobachtete Abschwächung im oberen Respirationstrakt war mit der von cp45 (Tabelle 4) vergleichbar. Obwohl rC-KO im unteren Respirationstrakt der AGMs stark abgeschwächt war (mehr als 10⁵-fach), war rDV-KO an dieser Stelle nur wenig (<10-fach) eingeschränkt. Beide Viren induzierten eine HAI-Antikörperantwort in HPIV3 obwohl die HAI-Antwort von AGMs zu rC-KO, wie jene von Hamstern, erheblich geringer war als jene der anderen Viren (Tabelle 4). Die immunisierten AGMs wurden am 28. Tag mit 10⁶ PbE an biologisch-abgeleitetem JS wt-Virus herausgefordert, das intranasal und intratracheal verabreicht wurde. Die Tiere, die rJS, rD-KO oder das cp45-Impfstoff-Kandidatenvirus erhielten waren sowohl im oberen als auch im unteren Respirationstrakt der AGMs vollständig gegen die Replikation des Herausforderungsvirus geschützt. Der durch rC-KO vermittelte Schutz gegen die Replikation des Herausforderungsvirus war erheblich, wenn auch nicht vollständig. Peak-Titer des Herausforderungsvirus waren sowohl im oberen als auch im unteren Respirationstrakt von Tieren in dieser Gruppe erheblich reduziert und die Dauer der Virusabsonderung von den oberen und unteren Respirationstrakten war von 10 Tagen auf 4 Tage bzw. von 8 Tagen auf 6 Tage reduziert.
Fasst man die vorstehende Offenbarung zusammen, so demonstrieren die Ergebnisse hierin die erfolgreiche Wiedergewinnung von infektiösem HPIV3 aus cDNA, um neue rekombinante Viren zu konstruieren, in welchen die Expression der C-, D- oder V-ORFs durch eine beispielhafte Unterdrückungstechnik einzeln unterbrochen ist, die Mutationen einbezieht, die eine Aminosäure ändern, die ein Initiationscodon spezifiziert und/oder die Einführung von Translations-Stopp-Codons, In einem anderen beispielhaften viralen Clon, wurden die D- und V-ORFs gemeinsam unterbrochen. Diese Beispiele offenbaren die Wichtigkeit der akzessorischen C-, D- und V-ORFs von HPIV3 für die Virusreplikation in vitro und in vivo und stellen nützliche Impfstoffkandidaten für die Prävention und Behandlung von PIV bereit. Insbesondere lag der Replikationsgrad von rC-KO im oberen und unteren Respirationstrakt von AGMs etwas unter dem von cp45, des vielversprechendsten PIV3-Impfstoff-Kanditatenstammes. Trotz seiner reduzierten Replikation in vivo war rC-KO im Stande eine ausreichende Immunantwort zu induzieren, um die Replikation des HPIV3-Herausforderungsvirus einzuschränken, was diese Rekombinante als einen nützlichen Impfstoffkandidaten qualifiziert, obwohl sie mit einer höheren Dosis, wie zum Beispiel 10^7,0TCID oder in mehrfachen Dosen an Menschen verabreicht werden muss, um einen höheren Grad an Replikationsrestriktion des wt-Virus zu erreichen.
Unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie sind Mutationen einzeln oder in Kombination in die JS wt-Sequenz eingeführt worden, die in der HPIV3 cp45-Mutante identifiziert wurden (Skiadopoulos et al., J. Virol. 73:1374-1381, 1999; U.S. Patentanmeldungsseriennummer 09/083.793, eingereicht am 22. Mai 1998; vorläufige U.S. Anmeldungsnummer 60/047.575, eingereicht am 23. Mai 1997 (entsprechend der Internationalen Veröffentlichungsnummer WO 98/53078) und vorläufige U.S. Anmeldungsnummer 60/059.385, eingereicht am 19. September 1997).
Das hat die Identifizierung von Mutationen ermöglicht, die zu den abgeschwächten, Temperatur-sensitiven (ts) und/oder Kälte-angepassten Phänotypen dieser Impfstoff-Kandidaten beitragen. Diese Mutationen und andere Modifikationen von rekombinantem, hierin offenbarten PIV sind nützliche beigeordnete Mutationen, um den Attenuierungsgrad einzustellen, sowie die Immunogenität und andere erwünschte phänotypische Charakteristika vom rekombinanten PIV der Erfindung, das C-, D- und V-ORF Knockout-Mutationen aufweist.
Die zwei anderen Proteine, die möglicherweise innerhalb des P-Lokus codiert werden, sind die V- und D-Proteine. Mit der Ausnahme von HPIV-1 enthalten alle Respiroviren, Morbilliviren und Rubulaviren einen intakten V-ORF. Der Cystein-reiche C-terminale Teil des V-ORFs ist der am meisten konservierte ORF des P-Gens in dem Paramyxovirinae und scheint von allen diesen Viren exprimiert zu werden, außer von HPIV1 und HPIV3. Obwohl HPIV3 den V-ORF enthält, ist unklar wie er zugänglich gemacht wird, aber die Tatsache, dass er intakt bleibt, deutet darauf hin, dass er benützt wird. Im Gegensatz zum V-Cistron der Paramyxoviridae ist das D-Protein einmalig für menschliches und Rinder-PIV3. Das D-Protein wird durch Insertion von zwei nicht in der Matrize vorliegende G-Reste an der Editierungsstelle der P-mRNA zugänglich gemacht, was in einem Fusionsprotein resultiert, in dem die N-terminalen 241 Aminosäuren von P mit den C-terminalen 131 Aminosäuren des D-ORF verbunden sind. Über die Funktion des D-Proteins ist nichts bekannt und es ist in HPIV3 infizierten Zellen oder Virionen noch nicht identifiziert worden, obwohl eine editierte mRNA nachgewiesen wurden, die im Stande ist D zu codieren. (Galinski et al., Virology 186:543-550, 1992). In einem Versuch sich dieser Frage zuzuwenden haben wir eine rekombinante HPIV3-Mutante wiedergewonnen, die drei aufeinander folgende Stopp-Codons im D-ORF aufwies, die ein verkürztes Fusionsprotein exprimieren würden, enthaltend 61 Aminosäuren codiert durch den D-ORF. Keine der Rekombinanten, die eine einzelne D- oder V-ORF-Knockout-Mutation enthielt war in vivo oder in vitro erheblich in der Replikation eingeschränkt. Diese Mutationen sind jedoch trotzdem höchst nützlich für die Entwicklung von PIV-Impfstoffkandidaten. Das wird durch die erfolgreiche Wiedergewinnung einer kombinatorischen V- und D-Knockout-Mutante veranschaulicht, die durch Kombination von zwei Gruppen an Mutationen hergestellt wurde, um sowohl im V- als auch im D-ORF multiple Stopp-Codons zu erzeugen. Diese als rDV-KO bezeichnete Mutante war in ihrer Replikation im unteren Respirationstrakt von Hamstern eingeschränkt, sowie sowohl im oberen und unteren Respirationstrakt von AGMs. Da der P-ORF durch die eingeführten Mutationen nicht beeinträchtigt war ist es begründet anzunehmen, dass die Phänotypen, die wir beobachteten, den Verlust von V- und D-Aktivität widerspiegeln. Obwohl die Replikation von rDV-KO in vivo abgeschwächt war, war die Replikation in der Zellkultur im Wesentlichen unverändert. Diese Ergebnisse stellen den zwingenden Beweis bereit, dass die D- und V-Proteine des Wildtyp-HPIV3 exprimiert werden und dass die funktionelle Aufhebung beider gemeinsam für den abgeschwächten Phänotyp in vivo verantwortlich ist, der durch rDV-KO gezeigt wird. Es ist möglich, dass diese Proteine miteinander auf einem molekularen Niveau interagieren, um in vivo Replikation zu beinträchtigen.
Obwohl die vorhergehende Erfindung durch die Beispiele zum Zwecke der Klarheit des Verstehens genau beschrieben wurde, wird es für einen Fachmann offensichtlich sein, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen im Geltungsbereich der beigefügten Ansprüche ausgeführt werden können, die als eine Veranschaulichung und nicht als Einschränkung präsentiert wurden.
Hinterlegungsinformation der Mikroorganismen
Die folgenden Materialien sind mit der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt und wie folgt bezeichnet worden:
SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Infektiöser rekombinanter Parainfluenzavirus (PIV), umfassend ein PIV-Genom oder -Antigenom, ein Nucleocapsidprotein (N), ein Phosphoprotein (P) und ein großes Polymerase-Protein (L), worin eine Modifikation in das Genom oder Antigenom eingeführt wird, umfassend eine partielle oder vollständige Deletion von einem der C-, D- oder V-ORF(a) oder eine oder mehreren Nucleotid-Änderung(en), ausgewählt aus (i) Einführung von einem oder mehreren Stopp-Kodons, (ii) einer Mutation in einer RNA-editierenden Stelle, (iii) einer Mutation, die eine Aminosäure, die durch ein Initiationskodon spezifiziert wird, verändert, und (iv) Einführung einer Rahmenverschiebungsmutation, wobei die Expression von einem oder mehreren der C-, D- oder V-ORF(s) reduziert oder unterdrückt bzw. ablatiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation im Genom oder Antigenom eine oder mehrere erwünschte phenotypische Änderungen im rekombinanten PIV spezifiziert, ausgewählt aus (i) Abschwächung bzw. Attenuierung in der Zellkultur, (ii) Abschwächung bzw. Attenuierung im oberen und/oder unteren Respirationstrakt eines Säugetierwirts.
Infektiöses rekombinantes PIV nach Anspruch 1, worin die Modifikation, die in das Genom oder Antigenom eingeführt wird, eine partielle oder vollständige Deletion von mindestens zwei der C-, D- oder V-ORF(s) oder eine oder mehrere Nuceotid-Änderung(en) umfasst, die die Expression vom mindestens zwei der C, D- oder V-ORF(s) reduzieren oder unterdrücken.
Infektiöses rekombinantes PIV nach Anspruch 2, worin die D- und V-ORFs beide durch eine partielle oder vollständige Deletion oder eine oder mehrere Nucleotid-Änderung(en), die ihre Expression verringern oder unterdrücken, modifiziert sind.
Infektiöses rekombinantes PIV nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin drei Stopp-Kodons durch Nucleotid-Änderung an den Positionen 2692, 2695 und 2698 des D-ORF-Antigenoms eingeführt sind.
Infektiöses rekombinantes PIV nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin zwei Stopp-Kodons durch Nucleotid-Änderung an den Positionen 2845 und 2854 des V-ORF-Antigenoms eingeführt sind.
Infektiöses rekombinantes PIV nach Anspruch 1, worin das C-ORF-Startkodon in ein Threonin-Kodon durch eine Nucleotid-Änderung an Position 1795 des Genoms oder Antigenoms geändert ist und zwei Stopp-Kodons durch Ändern der Nucleotide 1813 und 1869 eingeführt sind.
Infektiöses rekombinantes PIV nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin virales Wachstum in Zellkultur im Wesentlichen um das 5- bis 10-fache oder mehr, verglichen mit dem Wachstum des entsprechenden Wild-Typ- oder mutierten Eltern-PIV-Stamms, abgeschwächt ist.
Infektiöses rekombinantes PIV nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin virales Wachstum im oberen und unteren Respirationstrakt im Wesentlichen um das 10- bis 100-fache oder mehr, verglichen mit dem Wachstum des entsprechenden Wild-Typ- oder mutierten Eltern-PIV-Stamms, abgeschwächt ist.
Infektiöses rekombinantes PIV nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin virales Wachstum im oberen und unteren Respirationstrakt im Wesentlichen um das 100- bis 1000-fache oder mehr, verglichen mit dem Wachstum des entsprechenden Wild-Typ- oder mutierten Eltern-PIV-Stamms, abgeschwächt ist.
Infektiöses rekombinantes PIV nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin das Genom oder Antigenom durch Einführung von ein oder mehreren abschwächenden Mutationen, identifiziert in einem biologisch abgeleiteten mutierten Human-PIV, weiter modifiziert ist.
Infektiöses rekombinantes PIV nach Anspruch 10, worin das Genom oder Antigenom mindestens zwei abschwächende Mutationen einbezieht.
Infektiöses rekombinantes PIV nach Anspruch 10 oder 11, worin das Genom oder Antigenom mindestens eine abschwächende Mutation enthält, die durch multiple Nucleotid-Änderungen in einem Kodon, das die Mutation spezifiziert, stabilisiert ist.
Infektiöses rekombinantes PIV nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 12, worin das Genom oder Antigenom mindestens eines und bis zu einem vollständigen Komplement von abschwächenden Mutationen, die im PIV3 JS cp45 vorliegen, einbezieht.
Infektiöses rekombinantes PIV nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 13, worin das Genom oder Antigenom mindestens eines und bis zu einem vollständigen Komplement von abschwächenden Mutationen, die eine Aminosäure-Substitution an Tyr 942, Leu 992 und/oder Thr 1558 im PIV3 L-Gen; Val 96 und Ser 389 in N; Ile 96 in C; Ile 420 und/oder Ala 550 in F; Val 384 in HN und/oder Nucleotid-Substitution im 3'-Leader bei Position 23, 24, 28 und/oder 45 und/oder bei Position 62 in der Gen-Startsequenz von N, einbezieht.
Infektiöses rekombinantes PIV nach ingendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin das Genom oder Antigenom eine zusätzliche Nucleotid-Modifikation umfasst, die eine phenotypische Änderung spezifiziert, ausgewählt aus einer Änderung in den Wachstums-Charakteristika, Abschwächung, Temperaturempfindlichkeit, Kälte-Anpassung, Plaquegröße, Wirtsbereichs-Restriktion oder einer Änderung in der Immunogenität.
Immunogene Zusammensetzung zur Auslösung einer Immunreaktion gegen PIV, wobei die Zusammensetzung eine immunogen ausreichende Menge des rekombinanten PIV nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 in einem physiologisch akzeptablen Träger umfasst.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 16, formuliert im einer Dosis von 10³ bis 10⁷ PFU.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16 oder 17, formuliert zur Verabreichung an den oberen Respirationstrakt durch Spray, Tropfen oder Aerosol.
Immunogene Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 16 bis 18, worin das rekombinante PIV eine Immunreaktion gegen ein oder mehrere Viren, ausgewählt aus HPIV1, HPIV2 und HPIV3, auslöst.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 19, worin das rekombinante PIV eine Immunantwort gegen HPIV3 und einen anderen Virus, ausgewählt aus HPIV1 und HPIV2, auslöst.
Isoliertes Polynucleotid-Molekül, umfassend ein rekombinantes PIV-Genom oder -Antigenom, das eine Nucleotid-Modifikation einbezieht, umfassend eine partielle oder vollständige Deletion von einem oder mehreren C-, D- oder V-ORF(s) oder eine oder mehrere Nucleotid-Änderung(en), die die Expression des einen oder der mehreren C-, D- oder V-ORF(s) reduzieren oder unterdrücken bzw. ablatieren, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation im Genom oder Antigenom eine oder mehrere erwünschte phenotypische Änderungen im rekombinanten PIV spezifiziert, ausgewählt aus (i) Abschwächung bzw. Attenuierung in der Zellkultur, (II) Abschwächung bzw. Attenuierung im oberen und/oder unteren Respirationstrakt eines Säugetierwirts.
Isoliertes Polynucleotid-Molekül nach Anspruch 21, worin die Expression des einen oder der mehreren C-, D- oder V-ORF(s) durch Einführung entweder eines oder mehrerer Stopp-Kodons, einer Mutation einer RNA-editierenden Stelle, einer Mutation, die die durch ein Initiatonskodon spezifizierte Aminosäure ändert oder Deletion von einem oder mehreren C-, D- oder V-ORF(s) ingesamt oder zum Teil, reduziert oder unterdrückt ist.
Isoliertes Polynucleotid-Molekül nach einem der Ansprüche 21 oder 22, worin die Modifikation, die in das Genom oder Antigenom eingeführt wird, eine partielle oder vollständige Deletion von mindestens zwei der C-, D- oder V-ORFs oder eine oder mehrere Nucleotid-Änderung(en) umfasst, die eine Expression von mindestens zwei der C-, D- oder V-ORFs reduziert oder unterdrückt.
Isoliertes Polynucleotid-Molekül nach Anspruch 23, worin die D- und V-ORFs beide durch eine partielle oder vollständige Deletion oder eine oder mehrere Nucleotid-Änderung(en), die ihre Expression reduziert oder unterdrückt, modifiziert sind.
Isoliertes Polynucleotid-Molekül nach irgendeinem der Ansprüche 21 bis 24, worin das rekombinante Genom oder Antigenom weiterhin durch eine oder mehrere abschwächende Mutationen modifiziert ist.
Isoliertes Polynucleotid-Molekül nach irgendeinem der Ansprüche 21 bis 25, weiterhin umfassend eine Nucleotid-Modifikation, die eine phenotypische Änderung spezifiziert, ausgewählt aus einer Änderung in den Wachstums-Charakteristika, Abschwächung, Temperaturempfindlichkeit, Kälte-Anpassung, Plaquegröße, Wirtsbereichs-Restriktion oder eine Änderung in der Immunogenität.
Verfahren zur Herstellung eines infektiösen abgeschwächten rekombinanten PIV-Partikels aus einem oder mehreren isolierten Polynucleotid-Molekülen, die PIV kodieren, wobei das Verfahren umfasst: Exprimieren in einer Zelle oder einem zellfreien Lysat eines Expressionsvektors, der ein isoliertes Polynucleotid nach irgendeinem der Ansprüche 22 bis 27 sowie PIV N-, P- und L-Proteine umfasst.
Verfahren nach Anspruch 27, worin das chimäre PIV-Genom oder -Antigenom und die N-, P- und L-Proteine durch zwei oder mehrere verschiedene Expressionsvektoren exprimiert werden.
Expressionsvektor, umfassend einen funktionsfähig verknüpften Transkriptionspromotor, eine Polynucleotid-Sequenz nach irgendeinem der Ansprüche 21 bis 26 und einen Transkriptionsterminator.