CN1263511C - 与佐剂一起注射的重组活疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组活疫苗，其包含一种结合和体内表达异源核苷酸序列、优选一个病原因子基因的病毒载体，和至少一种选自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和马来酸酐与链烯基衍生物的共聚物的佐剂化合物。特别涉及由糖或多元醇的多链烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物(聚羧乙烯聚合物)，尤其是由烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。该佐剂化合物也可以是例如有由二乙烯醚交联的马来酸酐和乙烯的共聚物。

Description

与佐剂一起注射的重组活疫苗
本发明涉及一种结合和体内表达一个或多个异源基因的重组活疫苗的改进。特别涉及包含佐剂的这种疫苗，涉及佐剂化合物在这种疫苗应用中的用途以及相关的接种方式。本发明也涉及制备这些疫苗的方法。
结合灭活或亚单位疫苗佐剂来增强对这些疫苗包含的抗原的免疫应答是常规方式。
同样当微生物的减毒导致免疫反应减低时，可以在减毒活疫苗中结合佐剂。
最近，也已提出针对数种病原体联合免疫，其中利用灭活疫苗作为一价和减毒活疫苗作为另一单价。还提出了重建减毒活疫苗，在包含佐剂的灭活疫苗组合物中以冻干形式保存。所说的组合物作为活疫苗的重建载体，而不寻求任何佐剂效果。
EP-A-532 833提出一种抗马鼻肺炎(rhinopneumonia)的疫苗，这种病是由马疱疹病毒(EHV)引起的疾病。该疫苗是一种灭活的包含佐剂的疫苗，由灭活的EHV-4和EHV-1病毒组合，包含基于聚丙烯酸聚合物的Havlogen佐剂。
对于大部分疱疹病毒，当前没有有效的疫苗来在感染后迅速清除病毒。已知的疫苗尝试对临床症状的出现进行保护。总之，对于病毒排泄的效果有限。
根据EP-A-532 833，据认为所开发的疫苗导致病毒排泄79％到93％的降低(见结果部分)。9个中8个对照动物中在攻击后平均排泄病毒1.4天，而攻击后通常的排泄期为多于或等于5天。这代表低剂量的攻击，接受免疫的马与对照相比人为地增加了保护。本实验中病毒排泄的减少因此并不显著。
聚羧乙烯聚合物(carbomer)类型的佐剂还被用于含灭活病毒的马流感疫苗(IEV)中。
Mumford等(Epidemiol.Infect.(1994)，112，421-437)指出需要两剂量的马流感疫苗诱导产生瞬时的体液免疫和在马中抗病毒的弱保护作用。作者比较了灭活疫苗中加入或不加破伤风类毒素时聚羧乙烯聚合物和磷酸铝的佐剂效果。在所有病例中，针对H7N7和H3N8株，第一次免疫后，利用SRH(单辐射溶血)技术检测到低抗体滴度，需要第二次及第三次免疫来产生较强的瞬时免疫反应。
US-A-4 500 513也在加入聚羧乙烯聚合物的灭活疫苗进行了抗马流感病毒的接种试验。没有精确描述动物的来源及医学状态，可能为田间动物(11拦，第二段)。利用血凝抑制技术检测到较高的抗体滴度，表明试验动物可能已被流感病毒感染，因此免疫后诱导的反应是加强类型，而不是初始免疫类型。
最后，Fort Dodge Solvay推出了聚羧乙烯聚合物佐剂中的灭活马流感疫苗(DuvaxynIE和IE-T plus)和灭活马鼻肺炎疫苗(DuvaxynEHV1，4)。
包含氢氧化铝佐剂的抗马流感的商业灭活疫苗(例如Tetagripiffa，Merial，Lyons，法国)也已知。
大量的其他佐剂用于常规商业灭活或亚单位疫苗。可以提到例如，氢氧化铝，磷酸铝，Avridine，DDA，单磷酰基脂A，Pluronic L121和其他的嵌段聚合物，胞壁酰肽，皂苷，海藻糖二霉菌酸酯，马来酐和乙烯的共聚物，苯乙烯和丙烯酸或甲基丙烯酸的共聚物，聚磷腈，油性乳剂及类似物。
WO-A-94 16681建议以油包水、水包油或水包油包水乳剂形式的佐剂疫苗组合物补充表达异源包膜病毒基因的重组活疫苗。
这样的溶液可能有许多的缺点。
实际应用中，在一方面，最终用户应该有冻干的活性组分，另一方面，有已经配好的乳剂，使得能够将冻干活性组分重构。
储存过程中乳剂缺乏稳定性对于重建疫苗的效果和安全性可能有害。
减毒活微生物的活性因为油相的不稳定可能受到质疑。当病毒因此失去其存活性时尤其如此。
乳剂中的疫苗在注射部位的安全性也会产生问题。
因此本发明的目的是提供新的疫苗组合物，其基于表达至少一种异源核酸序列、特别是异源基因的重组活疫苗，包含能够使得与无佐剂的相同疫苗相比显著增强免疫并且非常适合于这类疫苗的佐剂。
申请人现发现聚羧乙烯聚合物类化合物在这种类型疫苗的要求条件下能够作为佐剂，而且其比例出人意料。在动物疱疹病毒上进行的试验(EHV-1，马疱疹病毒)显示添加聚羧乙烯聚合物在实验感染中能够以出人意料的比例降低病毒排泄。其余在马中用马流感病毒A进行的试验令人惊异的表明，能够获得较早和较高的血清抗体滴度，优于那些用最好的商业疫苗获得的效果。
因此本发明的主题是一种重组活疫苗，其包含一种结合和体内表达异源核酸序列、优选一个病原因子基因的病毒载体，和至少一种选自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和马来酸酐和链烯基衍生物的共聚物的佐剂化合物。
优选的化合物是尤其由糖或多元醇的多链烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物。这些化合物以聚羧乙烯聚合物(carbomer)的名称为人所知(Pharmeuropa Vol.，8，No.2，1996年6月)。本领域技术人员还可以参看US-A-2 909 462(作为文献引入)，其描述了由多羟基化合物交联的这种丙烯酸聚合物，该多羟基化合物至少有3个羟基，优选的不多于8个，至少3个羟基的氢原子被至少有2个碳原子的不饱和脂肪基团取代。优选的基团含有2-4个碳原子，如乙烯基，烯丙基和其他乙烯不饱和基团。不饱和基团本身可含有其他取代基，例如甲基。称为Carbopol的销售产品(BF Goodrich，Ohio，USA)是特别适合的。它们是由烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联的。其中，可提到Carbopol974P，934P，和971P。
在马来酸酐和链烯基衍生物的共聚物中，优选共聚物EMA(Monsanto)，为线性或交联的马来酸酐和乙烯的共聚物，例如由二乙烯醚交联。可参考文献J.Fields等，自然(Nature)，186：778-780，1960年6月4日，作为文献引入。
从结构方面看，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物和共聚物EMA优选有下式的基本单元形成：
其中：
-R1和R2相同或不同，代表H或CH3
-x＝0或1，优选x＝1
-y＝1或2，并且x+y＝2。
对于共聚物EMA，x＝0，y＝2。对于聚羧乙烯聚合物，x＝y＝1。
这些聚合物在水中的溶解产生酸性溶液，该溶液将被中和优选至生理pH，以得到佐剂溶液，疫苗本身将结合到佐剂溶液中。因此聚合物羧基部分以COO-形式存在。
优选的，本发明的佐剂溶液，特别是聚羧乙烯聚合物的溶液，在蒸馏水中制备，优选加入氯化钠，得到的溶液为酸性pH。该贮存溶液以如下方式稀释，将其加入到规定量(以得到需要的最终浓度)(或其大部分)的加有NaCl的水中、优选生理盐水(NaCl 9g/l)，所有的一次或分几部分加入伴随或随后中和(pH7.3-7.4)，优选利用NaOH中和。该生理pH的溶液本身将被用于重建疫苗，特别以冻干形式贮存的疫苗。
最终的疫苗组合物中的聚合物浓度将为0.01％-2％w/v，特别是0.06％-1％w/v，优选0.1-0.6％w/v。
已证实本发明对于抗动物疱疹病毒免疫接种特别有效。本发明特别涉及马疱疹病毒(特别是EHV-1和EHV-4)，猫疱疹病毒(FHV)，犬疱疹病毒(CHV)，禽疱疹病毒(Marek和ILTV)，牛疱疹病毒(BHV)和猪疱疹病毒(PRV＝Aujeszky病病毒或假狂犬病病毒)。
本发明主题因此是含有至少一种结合和表达该疱疹病毒的至少一种基因的病毒载体和至少一种本发明的佐剂的重组活疫苗。
作为例子，本领域技术人员可参见WO-A-92 15672(作为文献引入)描述了基于能表达该基因的痘病毒的表达载体的产生。可以看到例如表达EHV-1的gB，gC，gD基因的金丝雀痘(vCP132)，它还可用于EHV-4；表达这些相同基因的痘苗病毒(vP 1043)；表达EHV-1的gI(gB)，gIII(gC)和gIV(gD)基因的痘苗病毒；表达FHV-1的gD的金丝雀痘病毒；或表达PRV的gI(gB)，gIII(gC)和gp50(gD)重组体。还可参考WO-A-95/26 751(作为文献引入)，它描述了重组病毒vCP320，vCP322和vCP294，它们分别表达CHV的gB，gC，gD基因。还可参考FR-A-2 647808或WO-A-9012882中的重组体表达FHV、PRV和BHV基因，作为文献引入。
还证实本发明用于抗流感病毒的免疫接种的特别有利，如本文对于EIV(马流感病毒)所证明的。还可提到禽流感(AIV)、猪流感(猪流感病毒)。
作为实例，本领域技术人员可以参见WO-A-92 15 672中的表达EIVHA基因的重组金丝雀痘。
本发明主题因此是包含至少一种结合和表达该流感病毒的至少一个基因的病毒载体和本发明的至少一种佐剂的重组活疫苗。特别的，该疫苗含有2或3个载体的混合物，每个载体结合和表达HA基因，这些基因从不同病毒株获得，例如马流感株Prague、Kentucky和Newmarket。与此相似，单一载体可用于结合和表达2或3株病毒的HA。
本发明还可用于其他动物病原体，如特别是FeLV(还参见如WO-A-92 15672中表达env、gag的金丝雀痘病毒重组体＝vCP93和vCP97)，破伤风(还参见WO-A-92 15672和表达破伤风毒素的重组体vCP161和vCP1075，金丝雀痘病毒和痘苗病毒)，Carre’s病病毒(犬瘟病毒或CDV)(见WO-A-95 27780中的重组体vCP258，作为文献引入)。
本发明主题因此是包含至少一种结合和表达该病毒至少一个基因的病毒载体的重组活疫苗。
本发明的主题还在于多价重组疫苗，即包含两个或多个表达两个或多个疾病抗原的重组载体，以混合物的形式存在于本发明的佐剂溶液中。
另外，本发明还可用于任何类型的病毒表达载体，例如痘病毒(痘苗病毒，包括根据WO-A-92/15672的NYVAC，鸡痘，金丝雀痘，鸽痘，猪痘等)，腺病毒，疱疹病毒。发现金丝雀痘，例如ALVAC(WO-A-95/27780和WO-A-92/15672)在本发明中特别适合。
在一种即用型、尤其是重建的疫苗中，病毒载体以正常使用和文献中描述的量存在。
重组活疫苗通常以冻干形式存在，便于贮藏，应用前立即重建于溶剂或赋形剂中，即本发明的佐剂溶液中。
本发明的主题还在于免疫接种的套件，包括独立包装的冻干疫苗和本发明用于重建冻干疫苗的佐剂化合物溶液。
本发明的主题还在于免疫接种方法，包括通过肠胃外优选皮下、肌肉内或皮内途径或粘膜途径使用本发明的疫苗一次或多次，任选地包括一个在佐剂化合物溶液中重建冻干疫苗(重组载体)的前置步骤。
该方法的一个目的是保护动物免于临床症状和减少病毒排泄，特别是对于单纯疱疹病毒的情形。
另一个目的是增强免疫应答使得其较早产生，特别在第一次免疫接种时开始诱导抗体产生。
本发明的主题还在于本发明的佐剂化合物在制备重组活疫苗中的应用，特别是诱导改进的和较早的免疫应答和/或增强的病毒排泄减少的疫苗。可参考上文所述内容。
现将通过非限制性实施例和参照附图更详尽地描述本发明：
-图1代表EIV Newmarket 2/93株的EIV HA基因的核酸序列；
-图2代表FHV-1 gC基因的核酸序列；
-图3代表显示免疫接种抗马疱疹病毒的不同疫苗的马中，试验感染后病毒排泄变化的图表。
实施例
实施例1：金丝雀痘病毒“ALVAC”中C3，C5和C6插入位点的供体质粒的产生
金丝雀痘病毒“ALVAC”不同插入位点的供体质粒(Tartaglia等，病毒学(Virology)1992.188.217-232，作为文献引入)描述在WO-A-95/27780的实施例20中。
这些质粒在本申请中以下列方式命名：
“质粒VQH6CP3LSA.2”用于“C3”位点
“质粒HC5LSP28”用于“C5”位点
“质粒pC6L”用于“C6”位点。
实施例2：重组病毒vCP258(ALVAC/CDV HA+F)的产生
CDV病毒的Onderstepoort株用于分离HA和F基因(HA基因序列被描述于Curran等，病毒学1991.72.443-447中，F基因序列被描述于Barrett等，病毒研究(Virus Research)1987.8.373-386，均作为文献引入)。
供体质粒pMM103的用于在ALVAC病毒的C6座位插入H6痘苗启动子-CDV F基因和H6痘苗启动子-CDV HA基因的表达盒，其构建被描述于WO-A-95/27780的实施例19中。
该质粒被用于和ALVAC病毒的体外重组的供体质粒(Piccini等，酶学方法(Methods in Enzymology)1987.153.545-564，作为文献引入)，产生称为vCP258的重组病毒，如上面所述申请的实施例19。
实施例3：重组病毒vCP1502(ALVAC/EIV Prague株HA)的产生
HA基因(EIV Prague株)的序列列于WO-A-92/15672的图23中。马流感病毒Prague 56株基因组的病毒RNA利用CLONTECH(Palo Alto，CA)的提取试剂盒“总RNA分离试剂盒”(Cat#K1042-1)从该病毒的100ul病毒悬液中提取。收集RNA沉淀于10ul超纯水中，随后取2ul纯化的病毒RNA作模板并利用下面的寡核苷酸，按PCR反应(RT-PCR)扩增EIV Prague株的HA基因进行互补DNA合成反应：
TAY51A(SEQ ID No.1)(70碱基)
5′CGCGGCCATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAACACTCAAATTCT
AATATTAGCCACTTCGG3′
和TAY53A(SEQ ID No.2)(36碱基)
5′CGCGCGGCGGTACCTTATATACAAATAGTGCACCGC3′
将得到的PCR片段连接到载体pCRII(Invitrogen，San Diego，CA)产生质粒pJT007。
用NruI和Asp718消化质粒pJT007，分离约1800bp的NruI-718片段，其包含H6启动子的末端和全长的EIV Prague株的HA基因。该片段与预先用NruI和Asp718消化的供体质粒C5 HC5LSP28连接，产生质粒pJT008。该质粒含有H6-Prague 56HA基因的表达盒，位于ALVAC病毒的C5座位。该质粒的结构通过测序和完全酶切图得到证实。
该质粒是将H6-Prague 56HA基因的表达盒插入到C5座位的供体质粒。
用NotI线性化后，质粒pJT008被用做供体质粒和ALVAC病毒体外重组(Piccini等，酶学方法1987.153.545-563)，产生的重组病毒命名为vCP1502。
实施例4：重组病毒vCP1529(ALVAC/EIV Kentucky 1/94株HA)的产生
马流感病毒Kentucky 1/94株(Daly等，J.Gen.Virol.1996.77.661-671，作为文献引入)基因组的病毒RNA利用CLONTECH(Palo Alto，CA)抽提试剂盒“总RNA分离试剂盒”(Cat#K1042-1)从该病毒的100ul病毒悬液中抽提。收集RNA沉淀于10ul超纯水中，随后取2ul纯化的病毒RNA作为模板和下面的寡核苷酸，为扩增HA基因进行RT-PCR反应：
TAY55A(SEQ ID No.3)(70碱基)
5′CGCGGCCATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAAGACAACCATTAT
TTTGATACTACTGACCC3′
和TAY57A(SEQ ID No.4)(42碱基)
5′CGCGCGGCGGTACCTCAAATGCAAATGTTGCATCTGATGTTG3′
将得到的PCR片段连接到载体pCRII(Invitrogen，San Diego，CA)中产生质粒pJT001。克隆到质粒pJT001中的EIV Kentucky 1/94株HA基因的序列与GenBank数据库中的EIV Kentucky 1/94株HA基因的序列没有不同(登录号L39914，作为文献引入)。
用NruI和Asp718消化含有HA基因(Kentucky 1/94株)的质粒pJT001，分离约1800bp的NruI-718片段(包含H6启动子的末端和全长的Kentucky 1/94株HA基因)。该片段与预先用NruI和Asp718消化的供体质粒C5 HC5LSP28连接，产生质粒pJT005。该质粒含有H6-Kentucky 1/94株HA基因的表达盒，位于ALVAC病毒的C5座位。该质粒的结构通过测序和完全酶切图得到证实。
该质粒是将H6-Kentucky1/94株HA基因的表达盒插入到C5座位的供体质粒。
用NotI线性化后，质粒pJT005被用做供体质粒和ALVAC病毒体外重组(Piccini等，酶学方法1987.153.545-563)，产生的重组病毒命名为vCP1529。
实施例5：重组病毒vCP1533(ALVAC/EIV Newmarket 2/93HA)的产生
马流感病毒Newmarket 2/93株(Daly等，J.Gen.Virol.1996.77.661-671)基因组的病毒RNA利用CLONTECH(Palo Alto，CA)抽提试剂盒“总RNA分离试剂盒”(Cat#K1042-1)从该病毒的100ul病毒悬液中抽提。收集RNA沉淀于10ul超纯水中，随后取2ul纯化的病毒RNA作为模板并利用下面的寡核苷酸，为扩增HA基因进行RT-PCR反应：
CCL007(SEQ ID No.5)(40碱基)
5′TTGTCGACTCAATCATGAAGACAACCATTATTTTGATACT3′
和CCL0018(SEQ ID No.6)(34碱基)
5′TTGGATCCTTACTCAAATGCAAATGTTGCAYCTG3′
将得到的PCR片段连接到载体pCRII(Invitrogen，San Diego，CA)中，产生质粒pCCL026。HA基因(EIV Newmarket 2/93株)的序列显示于
图1(SEQ ID No.7)。
含HA基因(EIV Newmarket 2/93株)的质粒pCCL026用SpeI和AccI消化。下述的寡核苷酸：
TAY99N(SEQ ID No.8)(74碱基)
5′CTAGTTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAAGACAACCATTATTTT
GATACTACTGACCCATTGGGT3′
TAY100N(SEQ ID No.9)(72碱基)
5′AGACCCAATGGGTCAGTAGTATCAAAATAATGGTTGTCTTCATTACGATACAA
ACTTAACGGATATCGCGAA3′
被退火并与SpeI+AccI消化的质粒pCCL026连接得到pJT003。双链寡核苷酸TAY99N/TAY100N含有截至NruI位点的H6启动子的3’区域和HA基因的头40个编码碱基。
用NruI和XhoI消化质粒pJT003，分离约1800bp的包含H6启动子的末端和全长HA基因的NruI-XhoI片段。该片段与预先用NruI和XhoI消化的供体质粒C5 HC5LSP28连接，产生质粒pJT004。该质粒含有H6-Newmarket 2/93株HA基因的表达盒，位于ALVAC病毒的C5座位。该质粒的结构通过测序和完全酶切图得到证实。
该质粒是将H6-Newmarket 2/93株HA基因的表达盒插入到C5座位的供体质粒。
用PvuI线性化后，质粒pJT004被用做供体质粒和ALVAC病毒体外重组(Piccini等，酶学方法1987.153.545-563)，产生的重组病毒命名为vCP1533。
实施例6：重组病毒vCP132(ALVAC/EHV-1 gB+gC+gD)的产生
重组病毒的构建被描述于WO-A-92/15762的实施例25和26中。该病毒通过ALVAC病毒和供体质粒pJCA049的体外重组产生。供体质粒含有下述3个克隆到C3插入位点的表达盒：
I3L痘苗启动子-EHV-1 gB基因
H6痘苗启动子-EHV-1 gC基因
42K昆虫痘病毒启动子-EHV-1 gD基因
EHV-1的gB、gC、gD基因的序列被描述于专利申请WO-A-92/15672的图2(EHV-1的gp13基因序列＝gC)、图6(EHV-1的gp14基因序列＝gB)和图12(EHV-1的gD、gp63和gE基因序列)。
实施例7：重组病毒vCP243(ALVAC/FHV-1 gB+gC+gD)的产生
FHV-1的gB基因(CO株)的序列被描述于专利申请WO-A-90/12882的图34中。
FHV-1的gC基因(CO株)(序列示于图2)(SEQ ID No.10)从EcoRI F片段(7.6kbp)中克隆。基因长度1599bp，编码一533氨基酸的蛋白。
FHV-1的gD基因(CO株)(序列示于WO-A-92/15762的图28中)从EcoRI M片段(4.4kbp)中克隆(质粒pFHVEcoRIM)。
在早期转录终止信号(TTTTTNT)水平突变的I3L-FHV-1 gB基因 表达盒的构建
用下列寡核苷酸：
MP287(SEQ ID No.11)(20碱基)
5′GATTAAACCTAAATAATTGT 3′
和JCA158(SEQ ID No.12)(21碱基)
5′TTTTTCTAGACTGCAGCCCGGGACATCATGCAGTGGTTAAAC3′
以含有I3L痘苗启动子(Riviere等，J.Virol.199266.3424-3434，座位文献引入)的质粒为模板进行PCR扩增，产生120bp的XbaI平端片段(含有I3L痘苗启动子)＝片段A。用下列寡核苷酸：
JCA213(SEQ ID No.13)(18碱基)
5′GGGTTTCAGAGGCAGTTC3′
JCA238(SEQ ID No.14)(21碱基)
5′ATGTCCACTCGTGGCGATCTT 3′
以质粒pJCA001为模板进行PCR扩增，产生720bp的BamHI平端片段(含有FHV-1gB基因的5’部分)＝片段B。
用XbaI消化片段A，然后磷酸化。用BamHI消化片段B，然后磷酸化。片段A和片段B共同和预先用XbaI+BamHI消化的载体pBluescriptSK+进行连接，产生质粒pJCA075。
下列寡核苷酸：
JCA158(SEQ ID No.15)和JCA211(SEQ ID No.16)(21碱基)
5′GTGGACACATATAGAAAGTCG3′
用于以质粒pJCA075为模板的PCR扩增，产生510bp的XbaI平端片段(含有融合到在早期转录终止信号(TTTTTNT)水平突变的FHV-1 gB基因的5’端的I3L痘苗启动子)＝片段C。
下列寡核苷酸：
JCA212(SEQ ID No.17)(21碱基)
5′CACCTTCAGGATCTACTGTCG3′
和JCA213(SEQ ID No.13)(18碱基)
用于以质粒pJCA001为模板的PCR扩增，产生330bp的BamHI平端片段(含有FHV-1 gB基因的中间部分)＝片段D。
用XbaI消化片段C，然后磷酸化。用BamHI消化片段D，然后磷酸化。片段C和片段D共同和预先用XbaI+BamHI消化的载体pBluescriptSK+进行连接，产生质粒pJCA076。
下列寡核苷酸：
JCA239(SEQ ID No.18)(24碱基)
5′ACGCATGATGACAAGATTATTATC3′
和JCA249(SEQ ID No.19)(18碱基)
5′CTGTGGAATTCGCAATGC 3′
用于通过以质粒pJCA001为模板的PCR扩增产生695bp的EcoRI平端片段(含有FHV-1 gB基因开始的3’部分)＝片段E。下列寡核苷酸：
JCA221(SEQ ID No.20)(48碱基)
5′AAAACTGCAGCCCGGGAAGCTTACAAAAATTAGATTTGTTTCAGTATC3′
和JCA247(SEQ ID No.21)(36碱基)
5′GGTATGGCAAATTTCTTTCAGGGACTCGGGGATGTG3′
用于通过质粒pJCA001为模板的PCR扩增产生560bp的PstI平端片段(含有在早期转录终止信号(TTTTTNT)水平突变的FHV-1 gB基因3’端第二部分)＝片段F。
用EcoRI消化片段E，然后磷酸化。用PstI消化片段F，然后磷酸化。片段E和片段F共同和预先用EcoRI+PstI消化的载体pIBI24(International Biotechnologies Inc.，New Haven，CT)进行连接，产生质粒pJCA077(包含I3L痘苗启动子-FHV-1 B基因的表达盒)。
42K-FHV-1 gD表达盒的构建
下列寡核苷酸：
RG286(SEQ ID No.22)(17碱基)
5′TTTATATTGTAATTATA3′
和M13F(SEQ ID No.23)(17碱基)
5′GTAAAACGACGGCCAGT3′
用于以含有42K昆虫痘病毒AmEPV启动子的质粒(被描述于专利US-A-5,505,941的实施例21中)为模板的PCR扩增，产生130bp的EcoRI平端片段(含有42K昆虫痘苗启动子)＝片段A。
下列寡核苷酸：
JCA234(SEQ ID No.24)(21碱基)
5′ATGATGACACGTCTACATTTT 3′
和JCA235(SEQ ID No.25)(21碱基)
5′TGTTACATAACGTACTTCAGC 3′
用于通过以质粒pFHVEcoRIM为模板的PCR扩增产生185bp的BamHI平端片段(含有FHV-1 gD基因的5’部分)＝片段B。
用EcoRI消化片段A，然后磷酸化。用BamHI消化片段D，然后磷酸化。片段C和片段D共同和预先用EcoRI+BamHI消化的载体pBluescript SK+进行连接，产生质粒pJCA078。
用BamHI和XhoI消化质粒pFHVEcoRIM(见上文)分离得到1270bp的BamHI-XhoI片段(含有FHV-1 gD基因的3’部分)。该片段与预先用BamHI和XhoI消化的载体pIBI24连接得到质粒pJCA072。
下列寡核苷酸：
JCA242(SEQ ID No.26)(18碱基)
5′GAGGATTCGAAACGGTCC3′
和JCA237(SEQ ID No.27)(53碱基)
5′AATTTTCTCGAGAAGCTTGTTAACAAAAATCATTAAGGATGGTAGATTGCATG3′
用于以质粒pFHVEcoRIM为模板的PCR扩增，产生290bp的XbaI-XhoI片段。用XbaI和XhoI消化该片段＝片段C(含有FHV-1 gD基因的末端)。
用XbaI和XhoI消化质粒pJCA072，分离得到3575bp的XbaI-XhoI片段(载体pIBI24+FHV-1+FHV-1 gD基因的3’开始部分)＝片段D。将片段C和片段D进行连接，产生质粒pJCA073。
用BamHI和XhoI消化质粒pJCA073，分离得到960bp的BamHI-XhoI片段(FHV-1 gD基因的3’部分)＝片段A。用HpaI-BamHI消化质粒pJCA078，分离得到310bp的HpaI-BamHI片段(含有融合到FHV-1 gD基因的5’部分的42K启动子)＝片段B。片段A和片段B共同和预先用EcoRV+XhoI消化的载体pBluescript SK+进行连接，产生质粒pJCA080(含有42K启动子-FHV-1 gD基因的表达盒)。
H6-FHV-1 gC表达盒的构建
用EcoRI消化FHV-1病毒(CO株)的基因组DNA，将约7500bp的EcoRIF片段克隆到pBluescript SK+，得到质粒pFHVEcoRIF。下列寡核苷酸：
JCA274(SEQ ID No.28)(55碱基)
5′CATTATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAGACGATATAGGATGGG
AC3′
和JCA275(SEQ ID No.29)(18碱基)
5′ACTATTTTCAATACTGAC3′
用于以质粒pFHVEcoRIF为模板的PCR扩增，产生的片段用NruI-SalI消化后产生107bp的NruI-SalI片段(含有融合到FHV-1 gC基因的5’部分的H6痘苗启动子的3’部分)＝片段A。
下列寡核苷酸：
JCA276(SEQ ID No.30)(18碱基)
5′AAATGTGTACCACGGGAC3′
和JCA277(SEQ ID No.31)(54碱基)
5′AAGAAGCTTCTGCAGAATTCGTTAACAAAAATCATTATAATCGCCGGGGATGA
G3′
用于以质粒pFHVEcoRIF为模板的PCR扩增，产生片段用EcoRV和HindIII消化后产生370bp的EcoRV-HindIII片段(含有FHV-1 gC基因的3’部分和HpaI-EcoRI-PstI-HindIII位点)＝片段B。
用NruI和HindIII消化质粒pJCA020(见上文)，分离得到NruI-HindIII片段(包含H6痘苗启动子的5‘部分)＝片段C。用BamHI和EcoRV消化质粒pFHVEcoRIF，分离得到580bp的BamHI-EcoRV片段(包含FHV-1 gC基因中间部分)＝片段D。片段A和片段C共同和预先用HindIII和SalI消化的载体pBluescript SK+进行连接，产生质粒pJCA097。片段B和片段D共同和预先用BamHI和HindIII消化的载体pBluescript SK+进行连接，产生质粒pJCA099。
用PstI和SalI消化质粒pJCA097，分离得到200bp的PstI-SalI片段(包含H6-gC 5’部分的表达盒)＝片段E。用BamHI和SalI消化质粒pFHVEcoRIF，分离得到600bp的SalI-BamHI片段(FHV-1 gC的第二段中间部分)＝片段F。片段E和片段F共同和预先用BamHI和PstI消化的载体pBluescript SK+进行连接，产生质粒pJCA098。用EcoRI和BamHI消化质粒pJCA098，分离得到820bp的EcoRI-BamHI片段(包含H6-FHV-1 gC 5’部分的表达盒)＝片段G。用BamHI和HindIII消化质粒pJCA099(见上文)，分离得到960bp的BamHI-HindIII片段(含有FHV-1 gC基因的3’部分)＝片段H。片段G和片段H共同和预先用EcoRV和HindIII消化的载体pBluescript SK+进行连接，产生质粒pJCA100(包含H6痘苗启动子-FHV-1 gC基因的表达盒)。
用NruI和EcoRI消化质粒pJCA100，分离得到1650bp的包含融合到FHV-1gC基因的H6启动子的3’部分的NruI-EcoRI片段。该片段和预先用NruI和EcoRI消化的载体pJCA053(表达盒位VQH6-IBV M于载体pBluescript SK+中)进行连接，产生质粒pJCA108(包含载体pBluescript SK+中的VQH6-gC表达盒)。用SmaI和BamHI消化质粒pJCA079(见上文)，分离得到840bp的SmaI-BamHI片段(包含表达盒I3L-FHV-1 gB基因的5’部分)＝片段A。还利用HindIII和BamHI消化质粒pJCA079，分离得到2155bp HindIII-BamHI的片段(包含FHV-1gB基因的3’部分)＝片段B。用HindIII和EcoRI消化质粒pJCA108(见上文)，分离得到1830bp的HindIII-EcoRI片段(包含VQH6-FHV-1gC表达盒)＝片段C。用XhoI和EcoRI消化质粒pJCA080(见上文)，分离得到1275bp的XhoI-EcoRI片段(包含42K-FHV-1 gD基因的表达盒)＝片段D。片段A、B、C和D和供体质粒pC6L共同连接得到质粒pJCA109。
该质粒包含位于ALVAC病毒的C6座位中的H6-FHV-1 gC、I3L-FHV-1gB基因和42K-FHV-1 gD基因的表达盒。该质粒的结构通过测序和完全酶切图谱得到证实。
该质粒是将H6-FHV-1 gC、I3L-FHV-1 gB基因和42K-FHV-1 gD基因的表达盒插入到ALVAC病毒的C6座位的供体质粒。
用NotI线性化后，质粒pJCA109被用做供体质粒和ALVAC病毒体外重组(Piccini等，酶学方法1987.153.545-563)，产生的重组病毒命名为vCP243。
实施例8：佐剂
本发明疫苗中应用的聚羧乙烯聚合物是Carbopol974P，由BFGoodrich公司生产(分子量大约为3百万)。
贮藏液含有1.5％w/v的Carbopol974P，首先制备于含有1g/l氯化钠的蒸馏水中。
该贮藏液随后用于制备的生理盐水中的4mg/ml Carbopol溶液。
将贮藏液一次或任选地分数次倒入全部生理盐水(或任选地大部分生理盐水)中，每次用NaOH(例如1N或浓度更高)调节pH到大约7.3-7.4。
这样获得的Carbopol的即用溶液可被最终用户用于重建冻干重组疫苗。
实施例9：应用表达I型马疱疹病毒(EHV-1)的糖蛋白gB、gC和gD的重组金丝雀痘病毒载体vCP132(见实施例6)进行马的免疫接种
1.免疫接种和攻击的方法
无显示最近暴露于EHV-1和EHV-4的血清学症状的20匹小马(Welsh山小马)被随机分成4组(A-D)，每组5匹。
对A和B组免疫接种表达EHV-1 Kentucky D株的糖蛋白gB、gC和gD的重组金丝雀痘病毒vCP132。疫苗被重建于无菌水(A组)或实施例8的4mg/ml的聚羧乙烯聚合物溶液(B组)中。
对C组免疫接种商业灭活全EHV疫苗，其包含灭活的EHV-1和EHV-4和6mg聚羧乙烯聚合物，每剂量体积为1.5ml。
D组是对照组，对该组动物免疫接种表达流感A/equi-1/Prague56病毒的HA糖蛋白的重组金丝雀痘病毒vCP1502(见实施例3)，与B组相同的条件下重建于聚羧乙烯聚合物中。
疫苗的详细情况示于表1中：
  组别   疫苗   抗原   稀释剂/佐剂   剂量(1ml)
  A   vCP132   EHV-1   无菌水   108.0TCID50
  B   vCP132   EHV-1   Carbopol974P   108.0TCID50
  C   商业疫苗   EHV-1EHV-4   Carbopol   107.3TCID50灭活前EHV-1107.3TCID50灭活前EHV-4
  D   vCP1502   HA-Prague 56   Carbopol974P   108.0TCID50
每个动物在第0和第35天颈部深肌肉注射接受一剂量的疫苗。
在第56天，小马通过鼻内滴入105TCID50的EHV-1 Ab4/8株进行攻击。
2.血清学检测
根据Thompson等，Equine Vet.J.，8，58-65，1976描述的技术进行中和试验SN。EHV-1病毒(RACH)用作抗原。
SN滴度被表达为产生50％中和的血清稀释度的倒数(log10)。
3.病毒学监测
病毒的表达每日监测一次，共10天。利用鼻咽拭子收集病毒至病毒运送培养基中。拭子提取物在微量滴定板上利用兔肾细胞RK13进行滴定。滴度利用Karber公式计算，表达为log10TCID50/ml。
4.结果
这些免疫接种后没有观察到明显的局部或系统的反应。
血清中和SN抗体的平均反应(引起50％中和活性的稀释度的log10)是：
  组别   第0天的滴度   第56天的滴度(攻击前)
  ABCD   1.69+/-0.491.69+/-0.471.19+/-0.301.57+/-0.45   1.93+/-0.152.61+/-0.422.47+/-0.321.55+/-0.37
在聚羧乙烯聚合物中的疫苗vCP132中观察到抗体滴度的显著性增加。
所有的5匹对照小马都通过鼻咽排泄病毒。这些未免疫马的病毒排泄平均持续5天，最大的病毒排泄在感染后4天。
A、C和D组的所有的小马在攻击后都排泄病毒。与此对照，接种本发明疫苗的B组5匹小马中只有两匹排泄病毒。另外，B组病毒的排泄量明显少于包括C组的其他组动物的排泄量。B组动物病毒排泄期较其他组动物短。
可参见图1和下面的曲线下面积值，其中非常清楚地表明聚羧乙烯聚合物存在下的疫苗vCP132免疫接种的小马基本没有病毒排泄。特别与商业疫苗相比，结果非常显著。与对照相比，可观察到B组动物病毒排泄的显著性减少，而在C组和对照之间未观察到显著性差异。病毒排泄的明显和出人意料的减少水平有特别的益处，有利于在马与马之间限制病毒的传播。
每匹小马总病毒(曲线下面积)：
A：17.1
B：3.0
C：9.7
D：16.3
实施例10：应用表达流感A/eqiu-2/Newmarket/2/93病毒糖蛋白HA均重组金丝雀痘病毒载体vCP1533(见实施例5)加入聚羧乙烯聚合物进行马的免疫接种
1.免疫和攻击方法
本实验利用7-8月龄的20匹小马(Welsh山小马)，它们无可检测到的抗H3N8和H7N7病毒抗体，用SRH(单辐射溶血)实验测定。动物的阴性状态使得可以在最好的条件下，根据体液免疫反应研究各种疫苗的效力。小马被随机分成4组(A-D)，每组5-6匹。
对A组免疫接种表达流感A/eqiu-2/Newmarket/2/93病毒糖蛋白HA的重组金丝雀痘病毒vCP1533。疫苗被重建于含有4mg/ml的聚羧乙烯聚合物Carbopol974P中。
对B组免疫接种商业疫苗，其包含3株灭活的流感病毒Prague/56、Suffolk/89和Miami/63、破伤风类毒素及聚羧乙烯聚合物(4mg)和氢氧化铝(2.2mg)佐剂的混合物，每剂量体积为1.5ml。
对C组免疫接种疫苗C，其含有2种灭活流感株Prague/56、Newmarket/2/93及破伤风类毒素和氢氧化铝。
对D组免疫接种重组金丝雀痘苗vCP132(见上文)，疫苗被重建于含有4mg/ml聚羧乙烯聚合物974P的溶液中。最后一组用做攻击对照组。
疫苗的详细情况描述于表II中：
  组别   疫苗   抗原   稀释剂/佐剂   剂量(1ml)
  A   vCP1533   HA-Nermarket/2/93   Carbopol974P   107.7TCID50
  B   商业疫苗   Prague/56；Suffolk/89Miami/63；破伤风类毒素   CarbopolAl(OH)3   每株HA 15ug
  C   疫苗C   Prague/56；Newmarket/2/93破伤风类毒素   Al(OH)3   每株HA 15ug
  D   vCP132   GB，gC，gD-EHV-1   Carbopol974P   108.0TCID50
每个动物以5周间隔颈部深肌肉注射接受二剂量的每剂1ml的疫苗。
第二次免疫后两周，每匹小马被暴露于总107.7EID50的流感A/eqiu-2/Sussex/89病毒约20ml的尿囊液得到的气溶胶进行感染，利用ULTRA2000型喷雾装置(De Villbiss，Somerset PA)，如Mumford等，EquineVet J.，22：93-98，1990中所述。
2.血清学检测
在下列天收集全血样品：0(第一次免疫以前及同一天)、7、14、35(第二次免疫前及同一天)、49(攻击前及同一天)、56和63。
准备血清贮存和保藏于-20℃到使用。对所有血清检测抗流感A/eqiu-1/Prague/56和流感A/eqiu-2/Newmarket/2/93的SRH抗体，如Wood等(J.Hyg.，90，371-384，1983)所述。
溶血区直径利用自动读数仪在垂直的两个方向测量。计算区域的表面积，50％的增加被认为有显著性。滴度表示成溶血的mm2
3.病毒学监视
按如下方法监视病毒的排泄：利用鼻咽拭子收集10天，每日一次，收集到病毒运送培养基上。每只拭子的洗出物10倍系列稀释于pH7.2的PBS中，将0.1ml的稀释液接种到10日龄鸡胚的尿囊腔中。从34℃72小时培养后收集的鸡胚尿囊液中的血凝活性计算拭子提取物的病毒滴度(EID50/ml)。
4.结果
第一次免疫接种后没有观察到明显的局部或系统的反应，B组中的一匹马例外。
应注意Suffolk和Newmarket株是相似的(Daly等，J.Gen..Virol1996，661-671)，这使得与在实验条件下与商业疫苗的比较完全有效。
实验开始时，没有小马具有可检测到的抗流感A/eqiu-2/Newmarket/2/93或流感A/eqiu-1/Prague/56的SRH抗体。第一次免疫后一周的血清学结果显示，没有小马预先感染了流感(无可观察到的加强效果)。
第一次免疫后二周，没有小马产生可检测到的抗流感A/eqiu-1/Prague/56抗体反应。另外，免疫疫苗C的6匹小马中的6匹，免疫商业疫苗B和对照组D的5匹小马中的4匹无可检测到的抗流感A/eqiu-2/Newmarket/2/93 SRH抗体。相反，用加入聚羧乙烯聚合物佐剂的金丝雀痘苗免疫的5匹都检测到较高的SRH抗体：平均155.4+/-32.9。表III显示从每匹动物的SRH抗体滴度得到的结果。
表III.SRH结果(mm2)
  小马   组别   PRAGUE(D0，7，D14)   NEWMARKET
  D0   D7   D14
  M26   A   0   0   0   158.0
  M27   A   0   0   0   104.2
  M28   A   0   0   0   160.3
  M29   A   0   0   0   196.4
  M30   A   0   0   0   158.0
  M31   B   0   0   0   0
  M32   B   0   0   0   0
  M33   B   0   0   0   0
  M34   B   0   0   0   0
  M35   B   0   0   0   81.2
  M36   C   0   0   0   0
  M37   C   0   0   0   痕量
  M38   C   0   0   0   0
  M39   C   0   0   0   0
  M40   C   0   0   0   痕量
  M41   C   0   0   0   0
  M42   D   0   0   0   0
  M43   D   0   0   0   0
  M44   D   0   0   0   0
  M45   D   0   0   0   0
  M46   D   0   0   0   0
本发明的疫苗第一次免疫后14天引起高抗体滴度的出现，而对于疫苗B和C，同期第一次免疫没有引起可检测水平的抗体出现。这样早的抗体滴度的产生是显著的和不可预期的结果，是以前从未观察到的。
实施例11：应用表达流感A/eqiu-1/Prague/56病毒糖蛋白HA的重组金丝雀痘苗载体vCP1502(见实施例3)加入聚羧乙烯聚合物进行马的免疫接种
vCP1502免疫接种的实施例1的对照，也被用于血清学的检测。
下表IV显示在免疫加入Carbpol947P的108pfu的vCP1502的动物中，第0(第一次注射V1)和35(第二次注射V2)天得到的IHA(血凝抑制)滴度。
表IV
  抗-H7N7 IHA滴度
  小马   第0天(V1)   第7天   第14天   第35天(V2)   第56天
  RM16   0   0   128   64   128
  RM17   0   0   32   128   256
  RM18   0   0   16   64   512
  RM19   0   0   32   32   256
  RM20   0   0   128   64   128
如上一个实施例，观察到注射与聚羧乙烯聚合物混合的金丝雀痘-EIV(表达A equi-1/Prague病毒的HA基因)免疫后14天可得到高的特异性IHA滴度。值得注意的是，该高滴度在加强后进一步显著增加，达到以前从未在未进行预先刺激的马中观察到的对EIV H7N7病毒HA抗原高平均滴度水平。
实施例12：对猫的应用
受试的重组病毒是表达猫疱疹病毒gB、gC、gD基因的重组金丝雀痘病毒(猫疱疹病毒＝FHV)。该重组病毒称为vCP243(见实施例7)。
FHV模型中的免疫/攻击方法如下。
 组别   猫数   疫苗   稀释剂/佐剂   剂量
 A   6   vCP243   水   107.5pfu
 B   6   vCP243   Carbopol947P   107.5pfu
 C   6   CORIFELIN   ---   1商业剂量
 D(对照)   6   ---   ---   ---
在D0和D28通过皮下途径对猫免疫接种。
疫苗CORIFELIN是Merial(法国，里昂)销售的一种亚单位FHV疫苗，其含有至少200IDR单位的FHV病毒组分，25ug纯化的猫杯状病毒抗原，0.1mg的乙基汞硫代水杨酸钠和1ml油性赋形剂QS。
利用FHV攻击株通过口鼻途径在D49进行攻击。
攻击后14天进行临床监测，注意临床征兆(根据欧洲药典的规则记录临床征兆)。
攻击后根据下列标准评估保护：
-每组的平均临床分，与其他每组和对照组的平均临床分相比较。
-攻击后FHV病毒排泄的水平(攻击后D0-D10每日一次准备的咽拭子上病毒载量的测量)。
-在D0、D28、D49和D63收集的血样中FHV中和抗体的滴度。
对于所有这些标准，每组的平均水平还与其他每组和对照组的平均水平相比较。
实施例13：对于狗的应用
受试的重组病毒是表达Carre病病毒(犬瘟病毒，CDV)的HA和F基因的重组金丝雀痘病毒。该重组病毒称为vCP258(见实施例2)。
CDV模型中的免疫/攻击方法如下。
  狗数   疫苗   稀释剂/佐剂   剂量
  A   6   vCP258   水   107.0pfu
  B   6   vCP258   Carbopol947P   107.0pfu
  C   6   EURICAN   ---   1商业剂量
  D(对照)   6   ---   ---   ---
在D0和D28通过皮下途径对猫免疫接种。
疫苗EURICAN是Merial(法国，里昂)销售的一种活疫苗。一商业剂量含有最少104pfu的CDV Onderstepoort疫苗株。
在D56用1/10稀释度的CDV“Snyderhill”攻击株(由USDA分批制备和提供)通过颅内方式进行攻击。攻击后21天进行临床监测，注意临床征兆(根据欧洲药典规则记录临床征兆)。
攻击后根据下列标准评估保护：
-每组的平均临床分，与其他每组和对照组的平均临床分相比较。
-攻击后CDV病毒血症的水平(在D56、D61、D63、D66、D70、D77测定淋巴细胞中的病毒载量)。
-在D0、D14、D28、D42、D56、D63、D77的CDV中和抗体滴度。
对于所有这些标准，每组的平均水平还与其他每组和对照组的平均水平相比。

Claims (54)

1.一种疫苗，其包含：(i)一种重组病毒载体，该重组病毒载体含有并在体内表达编码至少一种流感病毒抗原或动物疱疹病毒抗原的核苷酸序列；和(ii)一种佐剂，该佐剂含有至少一种丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，或马来酸酐和链烯基衍生物的共聚物。
2.权利要求1的疫苗，其中所述佐剂是具有下述通式的单体单元的聚合物：
其中R1和R2相同或不同，且为H或CH3；x为0或1；y为1或2；且x+y＝2。
3.权利要求1的疫苗，其中所述佐剂是丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物。
4.权利要求1的疫苗，其中所述佐剂是丙烯酸聚合物。
5.权利要求1的疫苗，其中所述佐剂是甲基丙烯酸聚合物。
6.权利要求1的疫苗，其中所述佐剂是交联的丙烯酸聚合物。
7.权利要求2的疫苗，其中x＝0。
8.权利要求2的疫苗，其中x＝1。
9.根据权利要求1的疫苗，其中所述佐剂含有由糖或多元醇的多链烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物。
10.根据权利要求9的疫苗，其中所述聚合物是由烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联的。
11.根据权利要求1的疫苗，其中所述佐剂含有线性或交联的马来酸酐和乙烯的共聚物。
12.根据权利要求11的疫苗，其中所述马来酸酐和乙烯的共聚物是由二乙烯醚交联的。
13.根据权利要求1的疫苗，其中所述佐剂含有聚羧乙烯聚合物。
14.根据权利要求1-13中任一项的疫苗，其中所述佐剂以0.01％-2％w/v的量存在于疫苗中。
15.根据权利要求14的疫苗，其中所述佐剂的量为0.06％-1％w/v。
16.根据权利要求15的疫苗，其中所述佐剂的量为0.1％-0.6％w/v。
17.根据权利要求1的疫苗，其中所述病毒载体含有并在体内表达编码至少一种马流感病毒抗原、禽流感病毒抗原或猪流感病毒抗原的核苷酸序列。
18.根据权利要求1的疫苗，其中所述病毒载体含有并在体内表达编码至少一种马疱疹病毒(EHV)抗原的核苷酸序列。
19.根据权利要求18的疫苗，其中所述病毒载体含有并在体内表达编码EHV-1抗原的核苷酸序列、编码EHV-4抗原的核苷酸序列、或编码EHV-1抗原和EHV-4抗原的核苷酸序列。
20.根据权利要求1的疫苗，其中所述病毒载体含有并在体内表达编码来自猫疱疹病毒、犬疱疹病毒、禽疱疹病毒ILTV或马莱克病病毒、牛疱疹病毒或猪疱疹病毒的抗原的核苷酸序列。
21.根据权利要求1的疫苗，其中所述病毒载体含有并在体内表达编码流感病毒抗原或马疱疹病毒抗原的核苷酸序列。
22.根据权利要求21的疫苗，其中所述病毒载体含有并在体内表达编码EHV-1抗原的核苷酸序列、编码EHV-4抗原的核苷酸序列、或编码EHV-1抗原和EHV-4抗原的核苷酸序列。
23.根据权利要求21的疫苗，其中所述病毒载体含有并在体内表达编码马流感病毒抗原的核苷酸序列。
24.根据权利要求1的疫苗，其中所述病毒载体选自痘病毒、腺病毒和疱疹病毒。
25.根据权利要求24的疫苗，其中所述痘病毒是痘苗病毒。
26.根据权利要求25的疫苗，其中所述痘苗病毒是NYVAC。
27.根据权利要求24的疫苗，其中所述痘病毒是禽痘病毒。
28.根据权利要求24的疫苗，其中所述痘病毒是金丝雀痘病毒。
29.根据权利要求28的疫苗，其中所述金丝雀痘病毒是ALVAC。
30.根据权利要求24的疫苗，其中所述痘病毒是鸽痘病毒。
31.根据权利要求24的疫苗，其中所述痘病毒是猪痘病毒。
32.根据权利要求28或29的疫苗，其中所述金丝雀痘病毒表达EHV-1和/或EHV-4的gB、gC和gD。
33.根据权利要求26的疫苗，其中所述NYVAC表达EHV-1和/或EHV-4的gB、gC和gD。
34.根据权利要求1的疫苗，含有两种或三种重组金丝雀痘病毒，每种含有并在体内表达编码来自不同马流感病毒株系的马流感病毒HA的核苷酸序列。
35.根据权利要求1的疫苗，含有重组金丝雀痘病毒，其中所述重组金丝雀痘病毒含有并在体内表达编码两种或三种来自不同马流感病毒株系的马流感病毒HA的核苷酸序列。
36.根据权利要求34或35的疫苗，其中所述马流感病毒株系是Prague、Kentucky和/或Newmarket。
37.丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物或马来酸酐和链烯基衍生物的共聚物作为佐剂在制备含有病毒载体的疫苗中的应用，所述病毒载体含有并在体内表达编码至少一种流感病毒抗原或动物疱疹病毒抗原的核苷酸序列。
38.用于制备根据权利要求1的疫苗的免疫接种试剂盒，含有：(i)冻干形式存在的重组病毒载体，该载体含有并在体内表达编码至少一种流感病毒抗原或动物疱疹病毒抗原的核苷酸序列；和(ii)至少一种含有丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物或马来酸酐和链烯基衍生物的共聚物的佐剂，其中(i)和(ii)是分开包装的，目的是为了在使用前混合。
39.根据权利要求38的免疫接种试剂盒，其中所述佐剂含有聚羧乙烯聚合物。
40.根据权利要求38或39的免疫接种试剂盒，其中所述病毒载体含有并在体内表达编码马流感病毒抗原、禽流感病毒抗原或猪流感病毒抗原的核苷酸序列。
41.根据权利要求38或39的免疫接种试剂盒，其中所述病毒载体含有并在体内表达编码至少一种马疱疹病毒(EHV)抗原的核苷酸序列。
42.根据权利要求41的免疫接种试剂盒，所述病毒载体含有并在体内表达编码EHV-1抗原的核苷酸序列、编码EHV-4抗原的核苷酸序列、或编码EHV-1抗原和EHV-4抗原的核苷酸序列。
43.根据权利要求38的免疫接种试剂盒，其中所述病毒载体是痘病毒、腺病毒或疱疹病毒。
44.根据权利要求43的免疫接种试剂盒，其中所述痘病毒是痘苗病毒。
45.根据权利要求44的免疫接种试剂盒，其中所述痘苗病毒是NYVAC。
46.根据权利要求43的免疫接种试剂盒，其中所述痘病毒是禽痘病毒。
47.根据权利要求43的免疫接种试剂盒，其中所述痘病毒是金丝雀痘病毒。
48.根据权利要求47的免疫接种试剂盒，其中所述金丝雀疸病毒是ALVAC。
49.根据权利要求43的免疫接种试剂盒，其中所述痘病毒是鸽痘病毒。
50.根据权利要求43的免疫接种试剂盒，其中所述痘病毒是猪痘病毒。
51.根据权利要求47或48的免疫接种试剂盒，其中所述病毒载体是表达EHV-1和/或EHV-4的gB、gC和gD的金丝雀痘病毒。
52.根据权利要求45的免疫接种试剂盒，其中所述病毒载体是表达EHV-1和/或EHV-4的gB、gC和gD的NYVAC。
53.根据权利要求47或48的免疫接种试剂盒，其中含有两种或三种重组金丝雀痘病毒，每种含有并在体内表达编码来自不同马流感病毒株系的马流感病毒HA的核苷酸序列。
54.根据权利要求47或48的免疫接种试剂盒，含有金丝雀痘病毒，其中所述金丝雀痘病毒含有并在体内表达编码两种或三种来自不同马流感病毒株系的马流感病毒HA的核苷酸序列。
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