JPS62201575A - 家禽用インフルエンザ生ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、新規な家禽用インフルエンザワクチン（生
ワクチン）に関する。

［発明の背景］ 家禽のインフルエンザウィルスによる感染はきわめて激
しく、感染家禽のほとんど１００％が死亡し、伝染性も
極めて激烈である。このインフルエンザは昔から家禽ペ
ストとして非常に恐れられており、現在家禽の法定伝染
病に指定されている。

諸外国では、七面鳥を中心とする家禽インフルエンザの
発生が毎年報告されており、特に、１９８３年４月から
アメリカ合衆国ペンシルバニア州の養鶏場を中心に大流
行したインフルエンザは養鶏家に大きな被害を与えた。

［発明が解決しようとする問題点］ 我が国に於いては、幸いここ＠ＩＯ年間、インフルエン
ザウィルスに基づく家禽病の大流行は報告されていない
。しかしながら、最近のウイルス学の発達により、家禽
インフルエンザの多くはカモ類を中心とする渡り鳥によ
って感染することが判明した為、渡り鳥が多数飛来する
我が国に於いては、かかろ家禽インフルエンザに対する
警戒をおろそかにすることは許されない。事実、我が国
で捕獲された渡り鳥が種々の抗原型のインフルエンザウ
ィルスを保有していることが、本発明者らの研究によっ
て確認されている［アクタ・バイオロジカ（Ａｃｔａ　
ｖｉｒｏｌ、）　２８　：　５２４．１９８４］。

かかるインフルエンザウィルスの一種であって、英国で
既に分離されているＨ　？　Ｎ　？抗原型インフルエン
ザウィルスに基づく家禽病が、将来養鶏場を中心に流行
する可能性があるが、現在までのところこのウィルスに
対するワクチンの製造に成功したという報告は全くない
。従って、Ｈ’ｒ　Ｎ　を抗原型ウィルスに対するワク
チンの開発は、当業界に多大の貢献をなすものと期待さ
れている。

一般にワクチンとしては、生ワクチンと不活化ワクチン
があり、それぞれ長所、短所を有している。生ワクチン
は不活化ワクチンと異なり、スプレー法または経口投与
法などによって家禽に接種でき１．労力を省力化できる
利点がある。家禽に生ワクチンを使用するには、感染の
恐れのないように、病原性ウィルス株を完全に弱毒化し
、安全性および安定性を有する免疫効果の高いウィルス
株を作らなければならない。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、我が国に飛来する渡り鳥から、インフル
エンザウィルスＨ？　Ｎ　７株を分離した［Ｚｂｌ。

Ｂａｋｔ、　Ｈｙｇ、、　　（、Ａｂｔ、　Ｏｒｉｇ、
　Ｂ　　ｌ　７３゜４９４−５００．　１９８１　；　
Ａｖｉａｎ　　Ｄｉｓｅａｓｅｓ。

２６（２）、３１４−３２０．　１９８２］（このＨ７
Ｎ７株は、広島市南区宇品神田町１−５９０在、広島県
衛生研究所つィルス研究室武井直己氏に分譲されている
。分譲臼：昭和６１年２月２１日。

ウィルス株名：インフルエンザウイルスＡ／コノｈクチ
目つ／島根／４２／８０株）。このウィルスＨ７’Ｎ　
７株のヒナに対する感受性は古典的な家禽のインフルエ
ンザウィルスＨ？　Ｎ　７株とは全（異なる。

本発明者らは、この分離したインフルエンザウィルスＨ
７Ｎ　ｑ株を使用して、弱毒株の作出を種々の方法で試
みた結果、Ｈｔ　Ｎ　を株を完全に弱毒化することに成
功した。即ち、家禽に対して病原性を持たず、強力な抗
体産生能を有する弱毒性ウィルス変異株が得られた。こ
のウィルス変異株を用いて生ワクチンを製造し、家禽に
接種したところ、体内で免疫が高まり、その免疫活性は
長期間持続した。

本発明に係るインフルエンザ生ワクチンの製造方法を以
下に詳述する。

１、インフルエンザウィルスＨｑ　Ｎ　を株の分離採取
した新鮮なコハクチョウの糞を大量の抗生物質（ペニシ
リン：　　８，０ＯＯＵ／ｘＱおよびストレプトマイシ
ン：８，０００μ９ＩＲＱ）を含む燐酸緩衝液（ｐＨ７
，２）に混じて乳剤を調製し、この乳剤を１０日口の発
育鶏卵に接種する。３３℃で３日間インキュベートした
後漿尿液を採取し、角界血球の凝集性を調べることによ
りウィルス分離の有無を判定する。鶏卵血球凝集性を有
する漿尿液を３．０００回転で約３０分間遠心して残渣
を除くと、上清からウィルスＨｔ　Ｎ　を株（Ａ／コハ
クチョウ／島根／４２／８０株）が得られる。

２、インフルエンザウィルスＨ？　Ｎ　７株の弱毒化以
下に述べる方法で、インフルエンザウィルス８７　Ｎ　
？　株ヲ−１−）ロソグアニジンまたは紫外線で処理し
、弱毒性のインフルエンザウィルスＨｔ　Ｎ　ｔ　−Ｔ
Ｓ株（温度感受性変異株）を作成した。（このＨ７Ｎ６
株は、広島市南区宇品神田町１−５９０在、広島県衛生
研究所つィルス研究室武井直己氏に分譲されている。分
譲臼：昭和６１年２月２１日。

ウィルス株名：インフルエンザウイルスＴＳ−Ａ／コハ
クチジウ／島根／４２／８０株）。

１）温度感受性変異株の誘発 （１）小角ビンで増殖させたニワトリ胎児線維芽細胞（
ＣＥ細胞）を用いる方法 常法に従って小角ビンに３日間ＣＥ細胞を増殖させる。

インフルエンザウィルスＨ？　Ｎ　７株が５〜１０　Ｍ
、Ｏ、Ｉ　、（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆｉｎｆ
ｅｃｔｉｏｎ、感染多重度）感染するように、ウィルス
８７　Ｎ　７株をＣＥ細胞に接種し、３７℃で６０分間
インキュベートする。得られたＣＥ細胞に５　ｐｐｍの
トリプシンを含むイーグル培地（以下ＭＭと称する）を
入れ、次いで感染３時間後に、２００μｇ／ｊ１１２か
ら０．２μｇ／ａＱの濃度となるようにＮ−メチル−Ｎ
ｏ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を添加
し、更に１時間培養する。次に、このＮＴ’Ｇ含有ＭＭ
液を除き、感染ＧＥ細胞をＭＭ液でよく洗浄し、ＮＴＧ
を含まない新しい培地に換え、培養を続ける。培地を換
えた後２１時間目に培養液（ウィルス液）を集める。

（２）発育鶏卵を用いる方法 ２００μ９／ｊｌＱ〜０．２μ９／ｊ！σの濃度に段階
希釈したＮＴＧ溶液とウィルスＨ７Ｎ　７株の燐酸緩衝
懸濁液（１０’ＥＩＤ６゜／酎）を等量混合した後、そ
の得られた液０．２πＱを発育鶏卵に接種し、３４℃で
Ｉ日〜２日間培養する。漿尿液を採取し、３，０００回
転で約３０分間遠心して胛部の残渣を除き、上清（ウィ
ルス液）を得る。

２）インフルエンザウオルスＨ”ｒＮ７　ＴＳ株の分離 上記（１）および（２）の方法で得られたＮＴＧ処理ウ
ィルス液をｌＯ倍段階希釈し、常法に従いその０　、３
　ｍＱを、シャーレに培養したＣＥ細胞に接種した。３
７℃で６０分間インキュベートした後、１％バクトアガ
ーおよび４０ｐｐｍのトリプシンを含むＭＭ液３ｍＱを
分注する。３４°Ｃで３日間培養した後、０．４％中性
紅および１％バクトアガーを含むＭＭ液３酎を重層し、
３４℃で約２４時間培養する。プラーク数が１枚のシャ
ーレ当たり２０個前後出現したシャーレを選び、各プラ
ークの周囲をフェルトペンにより正確に印をつけて、４
０℃の恒温器に移す。

２４時間後に、サイズの変化をしなかったプラークを毛
細管ピペットで採取する。採取したプラークを０．５村
のＭＭ液に入れ、細胞破壊後発育鶏卵に接種し、３４℃
で増殖させる。増殖したウィルスＨ７Ｎ　７株をＣＥ細
胞に接種し、再びプラークを形成させ、形成させた個々
のプラークを採取することによるクローニングを３回行
なう。クローニングしたウィルス８７Ｎ　７株について
、３４℃および４０℃の培養温度におけるプラークの出
現状況を調べる。平板効率（Ｅ。

０、Ｐ）がＰＦＵであり、４０℃／３０℃の比がｌｏ−
４以下のものをインフルエンザウィルスＨ７Ｎ７−ＴＳ
株（温度感受性変異株）とする。

３、生ワクチンの製造 作出した弱毒性株（ウィルスＨ７Ｎ７−ＴＳ株）を胛卵
の漿尿腔または培養細胞に接種し、３０’Ｃ〜３７°Ｃ
（好ましくは３０℃〜３５℃）で増殖させる。

この漿尿液を取り出し、この漿尿液から胛卵の残渣およ
び細胞を除き、上清（ウィルス液）を得る。

培養細胞としては、たとえばニワトリ、コハクチョウ、
ウズラ、ハト、七面鳥などの細胞が使用できる。

生ワクチンの凍結乾燥粉末を作る場合、上記の上清（ウ
ィルス液）に分散媒を加えて、通常の方法で凍結乾燥す
る。分散媒としては、種々の糖類（たとえば蔗糖、果糖
、乳糖など）、アミノ酸のよろな低分子物質またはペプ
トンや血清など高分子物質が使用できる。また、それら
の分散媒の組み合わせも使用できる。

生ワクチンの溶液を作るには、上記の上清（ウィルス液
）にアジュバントを加える。本発明で使用し得るアジュ
バントには、たとえば水酸化アルミニウムゲル、燐酸ア
ルミニウムゲル、燐酸カルシウムゲルまたは明ばんなど
がある。本発明の生ワクチンはアジュバントを含まなく
とも免疫活性を示すが、アジュバントを加えた方が免疫
活性を増強させるのに都合よい。生ワクチンに添加する
アジュバント量は適当量でよいが、免疫活性を増強させ
るにはワクチン１００容量中に１〜９５容量入っていれ
ばよい。

本発明の生ワクチンは凍結乾燥粉体で保存し、使用時に
溶液にしてもよいし、また溶液の形で保存してそのまま
使用することもできる。本発明の生ワクチンを溶液の形
で保存する場合は、そのワクチンに防腐剤を加えてもよ
い。本発明で使用される防腐剤には、抗生物質たとえば
タイロシン、ポリミキシン、またはグラミシジンなどが
ある。

ただし、本発明に使用する防腐剤はこれらに限定される
ものではなく、ウィルスの抗原活性を不活化させずに、
菌の繁殖をおさえる防腐剤ならすべて使用し得る。

以上、インフルエンザウィルスＨ７Ｎ？　　ＴＳ株を培
養して得られる家禽用インフルエンザ生ワクチンの製造
法について説明したが、ＨＥＮＴ　　ＴＳ株と共通の抗
原を有する弱毒性インフルエンザウィルス株を使用して
も、同様の生ワクチンを得ることができる。従って、本
発明は、Ｈ，Ｎ、−ＴＳ株という特定のウィルスの培養
上清から得られる生ワクチンに限定されるものではなく
、Ｈ７Ｎ　、−ＴＳ株と共通の抗原を有する弱毒性イン
フルエンザウィルスから得られるものをも包含するもの
と解釈されねばならない。

本発明に係る生ワクチンは単独で、あるいは他のワクチ
ンと混合した混合ワクチンの形で、ニワトリ、七面鳥、
アヒル、ウズラなどのあらゆる家禽類に使用することが
できる。投与法に特に制限なく、噴霧法、穿刺法、経鼻
、点眼、経口投与（飲料水または飼料に添加）などのい
ずれであってもよい。

投与量の例を下記に示す。

ｌ）生ワクチンが溶液の場合 家禽Ｉ別当たり本発明の生ワクチンを０．１〜１．０１
投与すれば良い。

２）生ワクチンが凍結乾燥体の場合 ２）−１本発明生ワクチンの１バイアル（弱毒ウィルス
株約１０’〜ｌｏ’ＥＩＤ、。含有）をＩＱの水で溶解
し、飲水器に入れて自由に飲水させる。

２）−２本発明生ワクチンの１バイアル（弱毒ウィルス
）約ｉｏ’〜１０７ＥＩＤ５゜含有）を１００Ｈの水で
溶解し、ワクチン用噴霧機で１．Ｇｏｏ〜ｔｏ、０００
羽のヒナに噴霧する。

以下に実施例および試験例を挙げ、本発明を更に詳細に
説明する。

［実施例コ 弱毒性ウィルス８７　Ｎ　？　’　Ｔ　９株約１０’Ｅ
ＩＤ！。

を９〜２日目の貯部の漿尿腔に接種し、３４℃の瞬卵器
で約７２〜９６時間増殖させた。郷卵の漿液を取り出し
、この漿尿液を３，０００回転で約３０分間遠心し、郷
卵の残渣を除き、Ｈ７Ｎ　？−ＴＳ上清を得、以下の生
ワクチンを調製した。

１）４％生ワクチン 上記の方法で得たＨＥＮＴ　　ＴＳ上清（ウィルス８７
Ｎ？−ＴＳ株約１０８〜１０’Ｅ　ＩＤ５０／＋１１２
）４．５容量と水酸化アルミニウムゲル５０容量を混合
し、その混合液に滅菌燐酸緩衝食塩水４５゜５容量を加
えた。

２）７．５％生ワクチン 上記の８７Ｎ？−ＴＳ上清（ウィルスＴ−１ｔ　Ｎ　？
−ＴＳ株約１０６〜ｌ　Ｏ’ＥＩＤｇｏ／Ｊ！７２）７
．５容量と水酸化アルミニウムゲル５０容量を混合し、
その混合液に滅菌燐酸緩衝食塩水４２．５容量を加えた
。

３）１０％生ワクチン ト？のＨ，Ｎ、−ＴＳヒ清（ウィルスＨ？　Ｎ　７−Ｔ
Ｓ株約１０°〜Ｉ　Ｏ’　Ｅ　Ｉ　Ｄ　５゜／　ｍ（１
）　１０容量と燐酸アルミニウムゲル５０容量を混合し
、その混。

合液に滅菌燐酸緩衝食塩水４０容量を加えた。

４）凍結乾燥粉末 上記のＨＥＮＴ　　ＴＳ上清（ウィルスＨ、Ｎ　７−Ｔ
Ｓ株約１０”　〜ｌ　Ｏ７Ｅ　Ｉ　Ｄ５０／、ｔｄ）７
．５容量に分散媒としてＬバイアル当たり蔗糖５４幻お
よびペプトンＬＣＪｍｇを加え、通常の方法で凍結乾燥
した。

これらの生ワクチンを８〜９週令のニワトリのヒナに噴
霧接種し、インフルエンザに対する免疫活性を判定した
。免疫活性の判定は、ＨＩ抗体価（赤血球凝集抑制）の
測定により行なった。

ＨＩ抗体価の測定法 マイクロプレート（１２Ｘ８穴）に燐酸緩衝液０゜０２
５ｍＱを分注した後、抗血清を加えて２倍段階希釈の抗
血清希釈列を作った。次いで、燐酸緩衝液で赤血球凝集
抗体が４ＨＡ単位含まれるように調製したウィルス液を
０．０２Ｆ＋ｏ２ずつ加えた。

十分にマイクロプレートを振盪させた後、室温に１時間
静置した。次ぎに０．５％鶏赤血球浮遊液を０．０５３
１１２加え、振盪後、室温に１時間静置して判定した。

赤血球凝集を抑制した抗血清の最大希釈倍数の逆数に４
を乗じた数値をＨ１抗体価とした。

実験結果 実施例で製造した７、５％生ワクチンをニワトリのヒナ
に投与した時に産生されるＨｒ抗体価（１群の幾何平均
値）を表１に示す。この表から、本発明の生ワクチンが
、家禽のインフルエンザの予防に有効である。

表１７．５％生ワクチンの抗体産生 （）の数字は４ＨＡのウィルスを阻止する血清の希釈倍
数を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）インフルエンザウイルスＨ＿７Ｎ＿７株またはウ
   イルス株と共通の抗原を有するインフルエンザウイルス
   株を弱毒化した弱毒化ウイルスＨ＿７Ｎ＿７−ＴＳ株ま
   たは該Ｈ＿７Ｎ＿７−ＴＳ株と共通の抗原を有する弱毒
   化ウイルス株。
2. （２）インフルエンザウイルスＨ＿７Ｎ＿７株またはそ
   のウイルス株と共通の抗原を有するインフルエンザウイ
   ルス株を弱毒化することを特徴とする弱毒化ウイルスＨ
   ＿７Ｎ＿７−ＴＳ株または該Ｈ＿７Ｎ＿７−ＴＳ株と共
   通の抗原を有する弱毒化ウイルス株の製造法。
3. （３）インフルエンザウイルスＨ＿７Ｎ＿７株またはそ
   のウイルス株と共通の抗原を有するインフルエンザウイ
   ルス株を弱毒化した弱毒化ウイルスＨ＿７Ｎ＿７−ＴＳ
   株または該Ｈ＿７Ｎ＿７−ＴＳ株と共通の抗原を有する
   弱毒化ウイルス株を有効成分とする家禽用インフルエン
   ザワクチン。