KR810001063B1 - 생 뉴캣슬(Newcastle)병 바이러스 백신의 제법 - Google Patents

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Description

생 뉴캣슬(Newcastle)병 바이러스 백신의 제법

본 발명은 조류 백신 및 그 제법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 백신은 뉴유캣슬병 바이러스 백신이다. 그의 활성성분은 P/77/8 NDV(Newcastl disease virus, 뉴우캣슬병 바이러스) 균주이다.

본 발명의 백신은 분무식으로 닭에게 투여하므로서 뉴우캣슬병의 예방에 유용하다.

본 발명은 백신용으로 가치있는 개선된 뉴우캣슬병 바이러스(NDV)균주의 제조방법과 균주를 함유한 생 백신에 관한 것이다.

렌토게닉(lentogenic) 또는 메소게닉(mosogenic)균주를 함유하고 여러 방법으로 투여할 수 있는 생 NDV(뉴우캣슬병 바이러스)백신이 알려져 있다. 기지의 백신의 NDV균주의 예로서는 라소타(La Sota) 및 힛치너(Hitchner) B1 균주이다. NDV 백신의 투여법을 예를 들면 음료수에 현탁시키거나 눈이나 코에 투여하는 액체 또는 분무제로서 투여한다.

NDV에 대한 대량 면역을 위한 백신주사의 바람직한 방법은 라소타 또는 힛치너 B1 균주와 같은 생 렌토게닉 바이러스를 분무식으로 적용하는 것이다. 그러나 이러한 균주의 분무식 투여는 어린 닭에게 오히려 중요한 이병율을 수반하는 것으로 보이며 특히 대단히 어린 닭에 있어서는 더욱 그러하다(R.E. GOUGH and W.H. ALLAN Vet. ReC. 95(12), 263-65, 1974).

우리 벨지알 특허 N°851880에 있어서 우리는 분무식으로 투여할 수 있고 자외선 또는 아질산 변이 유발소에 의해서 뉴우캣슬병 바이러스 균주로 부터 얻은 약독화, 온도에 민감하고, 한냉에 적응하는 균주의 유효량(백신주사를 투여한 동물중에서 100% 혈청 전화를 유발하는 양)을 함유한 뉴우캣슬병에 저항하는 개선된 백신에 대해서 기술하였다. ＂냉균주(＂cold strain＂)＂라는 용어는 본 바이러스의 정상 성장온도보다 낮은 온도에서 모균주(Parent strain) 보다 현저하게 높은 성장을 보이는 균주를 지칭하는 것이며, ＂온도-민감성(＂temperature-sensitive＂)＂라는 표현은 변성된 균주에 대해 언급한 것이고, 본 균주의 성장은 비교적 고온에서(특히 숙주의 내부 온도와 근사한 온도에서 더욱 그러하다) 확실히 억제되는데 모균주의 성장은 이와 같은 온도에서는 변성되지 않는다.

그러한 백신의 예로서는 루드윅-막시밀리안(Ludwig-Maximilians) 종합대학(서독 뮬헨)의 미생물학과 감염증 및 전염병학 연구소에서의 비교 바이러스학상의 평가자료 및 수집을 위해서 세계보건기구 공동 연구쎈타에에 보관된 뉴우캣슬병 바이러스 P/76/5균주의 유효량을 함유한 백신을 들 수 있다.

뉴우캣슬병 바이러스 P/76/5 돌연변이 균주를 모 뉴캣슬병 바이러스 균주(즉 라 소타 균주)를 함유하고 있는 백신과 비교했을 때 분무식으로 투여하므로서 생후 1-8일밖에 안되는 병아리에 대해서 현저하게 감소된 이병율을 나타냈다. 또한 본 백신의 유효량은 공기 매입방 후우트방 10^7-5EID₅₀(접종된 계란의 50%가 감염되는 용량)으로 나타났다.

상기와 같이 열거된 특허명세에 있어서 P/76/5균주는 NDV 라 소타 균주로부터 얻은 한냉에 적응하고 온도에 민감한 돌연변이 균주로서 기술되었으며 더욱 문헌상에는 라 소타 균주로부터 얻은 개선된 뉴우캣슬병 백신의 분무식 백신으로서 강력한 것으로서 명명하였다.

1976년 8월 8일부터 9월 2일까지 투니스(Tuni)에서 개척된 수의학자, 미생물학자, 면역학자 및 감염성질환에 있어서의 전문가들의 세계적 협회의 국제심포지움에서 발명자들에 의해서 제시된 시험관네 연구에 있어서 P/76/5 균주는 닭의 태아 결합조직 형성세포(CEF)에 있어서의 그의 감염성 성질에 관하여 더욱 특징화되었다.

본 특징에 대한 정보의 개요는 본 심포지움(A.M.V.M.I, 메이슨스-알포-트, 프란스)의 후원자들에 의해서 발표되었다.

이러한 특징은 뉴우캣슬병 바이러스 균주의 약독화의 정도를 잘 반영시킬 수 있다. 바이러스학 72 : 494, 1976에 있어서 나가이등(NAGAI ET AL.)에 의해서 제시된 바와 같이 세포배양에 있어서 상이한 NDV균주의 병원성의 정도와 그들의 감염성 간에는 상관관계가 존재한다. 정의를 내리면 약독화 균주는 감소된 감염성을 나타내지만 이 감염성은 바이러스를 트립신으로 처리하므로서 증대된다.

우리는 닭의 태아 결합조직 형성세포에 대한 균주 P/76/5의 감염성이 라 소타 모 균주의 감염성 보다 현저하게 낮다는 것을 제시했고 또한 트립신의 존재하에서 감염성의 증가가 라 소타 균주에 대한 것보다 P/76/5 균주에 대한 것이 훨씬 더 높다는 것을 제시했다. 이러한 특징은 P/76/5 균주의 보다 강한 약독화(弱毒化)와도 상관관계가 있다.

우리는 이제 이러한 관계를 발견했으며 이것이 현 발명의 목적인 것이다. 즉, NDV P/76/5 균주를 비허용 온도 특히 41℃에서 닭의 태아 결합조직 형성 세포(CFF)상에 2회 계대접종(繼代接種)시킨 후 한냉과 온도에 민감한 P/76/5 균주의 특징은 없으나 여전히 CEF에 있어서 같은 감소된 감염성과 트립신에 의해서 활성화되는 같은 능력을 나타내는 균주를 분리해낼 수가 있었다.

본 발명의 방법에 따라 얻은 뉴우캣슬병 바이러스의 균주는 비교 바이러스학상의 자료의 평가와 수집을 위해서 세계보건기구 공동 연구쎈타에 보관되었으며 이곳에서 본 균주는 상속번호 P/77/8을 부여받았다.

놀라웁게도 그와 같이 획득한 균주는 한냉성이고 온도에 민감한 모균주인 P/75/5 균주보다 현저하게 면역성이 강하다는 것이 발견되었다.

우리는 본 발명의 균주 즉 NDV P/77/8 균주의 유효량(백신주사를 실시한 동물에 있어서 100% 혈청전화를 초래하는 양)이 공기 매입방 후우트당 10⁶EID₅₀즉 모균주 P/76/5 균주를 함유하고 있는 백신의 유효량 보다 10배나 낮은 양임을 분명히 발견하였다.

이와 같이 본 발명의 백신은 뉴우캣슬병을 예방하는 개선된 백신이며 분무식 투여와 NDV P/77/8 균주의 유효량을 위해서 약학적 희석제를 함유한 분무식 투여형 백신이다.

본 발명의 개선된 NDV 백신은 P/76/5 NDV 균주를 비 허용 온도하에 CEF(닭은 태아 결합조직 형성세포)에서 2회 계대접종시키고 2차 계대접종으로부터 얻은 균주를 체취하여 이것으로 분무 투여가능한 생백신의 제법에 따라 제조한다. 전술한 백신은 바람직하게 냉동 건조되는데 특히 안정제의 첨가후에 더 냉동 건조한다.

본 발명에 의한 백신의 대량생산에 대한 예를 들면 NDV P/77/8 균주를 34~37℃의 온도에서 특수한 병원체가 없는(SPF) 수태된 계란중에서 성장시키고 3일간의 배양기간이 지난 후 이 계란으로부터 바이러스를 채취한다.

채취된 바이러스는 다음에 바람직하게 안정제용액으로 보충된다. 안정제 용액의 예로서는 펩톤 또는 아르기닌 또는 자당 또는 바람직한 것으로 이들의 혼합물을 물에 용해시킨 수용액으로 유리 바이알에 주입하여 냉동 건조한다. 본 백신은 완전히 밀폐된 바이알 중에서 냉동 건조된 상태에서 보관된다. 그리고 투여전 재수화(再水和) 된다.

본 발명의 개선된 백신은 어떠한 다른 생백신 또는 조류의 호흡기 질환을 백신 예를 들면 분무식으로 투여할 수 있는 조류의 감염성 기관지염 백신과 혼합할 수 있다.

백신을 주사함에 있어서 본 백신은 즉시 재수화되고 분무식으로 NDV 백신 투여에 대한 기지의 방법으로 닭에게 투여된다.

이러한 구체화된 방법에 따라 본 발명은 뉴우캣슬병 바이러스에 저항하는 닭에 대한 면역을 위한 방법에 대한 것이다. 전술한 방법은 전술한 닭에 대해 상술한 바와 같이 NDV P/77/8 균주를 적어도 공기 매입방 후우트방 10⁶EID₅₀의 용량으로서 분무식으로 투여하는 방법에 대한 것도 포함하고 있다.

다음 실시예는 본 발명을 예증하는 것으로 그 범위를 제한하여 해석해서는 안된다.

[실시예 1]

P76/5 균주의 시공품(ml 당 10⁵EID₅₀역가의 현탁액 0.2ml)을 닭의 태아 결합조직 형성세포(CEF) 단일층(10⁶세포)에다 접종하였다. 접종된 세포를 2%(V/V) 태아의 비(비) 혈청으로 보충된 최저 이이글(Eagle)의 매질로서 덮고 4일간 41℃에서 배양하였다. 그후 상징액(上澄液)을 채취하였다.

매 ml당 10^2-5TCID₅₀역가를 갖는 희석되지 않은 채취액의 부분표본 0.2ml(세포배양의 50%가 감염되는 양)를 닭의 태아 결합 조직형성세포 단일층에다 접종하고 접종된 세포를 첫번째 계대접종(繼代接種)을 위해서 지적한 바와 같이 배양하였다.

두번째 계대접종으로부터 채취된 상징액을 특수한 병원체가 없는(SPF) 계란에다 접종하면 35℃에서 종말희석에 의하여 크론(clone)을 형성한다.

P/77/8이라고 명명한 생성된 크론의 종군체(種群體)는 전술한 크론을 3일간 35℃에서 SPF(특수한 병원체가 없는)계란중에서 성장시키므로서 제조할 수 있다.

[실시예 2]

NDV P/77/8 균주의 특징

(a) 온도에 대한 감수성

P/77/8 균주를 P/76/5 균주 및 La Sota 균주와 구별하기 위해서 이들 균주를 각각 별도로 CEF 단일층에다 접종하고 이렇게 접종된 세포는 5일간 각각 35℃와 41℃에서 배양하였다. 본 감염역가를 하기 표 1에 표시했으며 본 표 1에 의하면 P/77/8 균주는 P/76/5 균주가 갖는 온도에 대한 감수성이 없는 것으로 나타나고 있다.

[표 1]

(X) 0.05ml당 log₁₀TCID₅₀으로 표시된 것.

(b) 한냉에 대한 적응성

한냉에 대한 적응성 여부를 실험하기 위해서 수태된 계란을 10^3-5EID₅₀역가의 바이러스로서 접종하고 26℃ 또는 35℃에서 배양했다. 2일후 바이러스를 채취하고 트립신(5㎍/ml)의 존재하에서 35℃에서 CEF에 대해 역가를 측정했다.

[표 2]

(X) CEF에 대해 측정하여 얻은 역가로서 0.05ml당 10g₁₀TCID₅₀으로 표시된 것.

표 2에 나타난 바와 같이 P/77/8 균주는 그의 모균주인 P/76/5 균주가 갖는 한냉에 대한 적응성을 잃었다.

(C) CEF에 있어서의 P/77/8 균주의 감염성에 대한 평가 및 본 감염성에 대한 트립신의 영향

P/77/8 균주의 감염성은 CEF에 있어서 측정되었고 다른 균주들의 감염성과 비교되었다. 이에 대한 병원성의 정도는 잘 알려져 있다(NAGAIY. ET AL. 바이러스학 72 : 494, 1976).

CEF에 있어서의 감염성의 저하는 CEF에서의 감염역가와 계란에서의 감염염가간의 차이의 증가에 의해서 표시된다. CEF에서의 이러한 상이한 균주의 감염역가에 대한 트립신의 영향도 역시 측정되었다.

이에 대한 결과를 표 3에 표시한다.

[표 3]

(X) 0.1ml당 10g₁₀ID₅₀인, 감염역가(CEF의 50%가 감염되는 감염양 : 괄호로 표시한 표준 편차간의 수치)

표 3은 평가된 특성이 상이한 균주를 3종의 별개의 유별로 분리시키고 또한 P/77/8 균주는 현저하게 La Sota 균주와 상이하다는 것을 명백히 지적하고 있다. CEF에서의 그의 감염성은 더욱 현저하게 감소되고 있으며 트립신에 의해서 더욱 활성화되는데 민감하다.

(d) 혈구응집소의 비내열성

혈구응집소의 비내열성을 기시험하기 위해서 P/77/8 균주를 상이한 지속시간에서 상이한 온도에 노출시켰다. 표 4는 P/77/8 균주, 병원성 균주(Essex) 및 약독화된 균주(La Sota) 각각에 대한 시험결과를 나타낸 것이다.

[표 4]

혈구응집소의 비내열성 : 혈구응집소 역가의 역수

P/77/8 균주의 혈구응집소는 La Sota의 혈구응집소와 같은 비내열성을 갖고 있는 것으로 보인가.

(e) pH 감수성

P/77/8과 La Sota 균주의 pH 감수성을 비교하기 위해서 양균주를 4시간 동안 35℃에서 여러 pH에다 노출시켰다. 그들의 잔류 감염역가를 표 5중에 기록했다.

[표 5]

pH 감수성

(X) CEF에서의 0.05ml당 10g₁₀TCID₅₀역가로서 표시된 것.

상기 표에서 보는 바와 같이 P/77/8과 La Sota 균주는 비교할 수 있는 pH 감수성을 갖고 있다.

[실시예 3]

실시예 1에서 얻은 종군체로 부터의 바이러스를 3일간 35℃에서 SPF(특수한 병원체가 없는)의 수태된 계란중에서 배양하고 채취된 상징액을 펩톤(10%W/V), 아르기닌(3%W/V) 및 자당(5%W/V)으로 형성된 안정제 용액으로 보충했다. 본 혼합액을 매 ml당 10⁶EID₅₀역가를 함유하도록 5ml 유리 바이알중에 주입하고 냉동 건조 후 바이알을 단단히 밀폐하여 분무식 투여를 위해 수회분주용 백신주사로 만들었다.

[실시예 4]

P/77/8 균주에 의한 동물시험

(a) 무해성 시험

P/77/8 균주의 무해성을 시험하기 위해서 격리장치내에서 유지된 생후 1일된 SPF 병아리에게 터르베어(Turbair) 분무식 발생기(Turbair Ltd., Britannica Works, Waltham Abbey, Essex, Great Britain)를 사용하여 50ml의 백신(10^7-5EID₅₀/0.5ml)을 투여하였다. 그리고 10일간 관찰했다. 같은 조건으로 La Sota 균주를 SPF의 생후 1일된 병어리 군(群)에게 백신 주사하였다.

본 시험결과를 하기 표 6에 요약한다.

[표 6]

P/77/8 균주의 무해성

(X) 접종후 10일간의 관찰기간에 산출된 병원성 지수 (PI)

평점 체계로서 이환율=1 사망율=2

표 6의 시험결과는 분무식으로 투여할 때 P/77/8 균주가 La Sota 균주보다 생후 1일된 병아리에 대하여 더 약독화된다는 것을 지적하고 있다.

(b) 투여량 한계

백신에 있어서 P/77/8 균주의 용량범위를 측정하기 위해서 SPF의 생후 1일된 병아리군(매군당 10마리)에게 여러 용량의 백신을 투여하였다.

하기 표 7에 백신 주사 3주 후에, 혈청양성인 병아리의 HI에 의해서 혈청 전화율과 기하평균 역가(GMT)를 나타낸 것이다.

[표 7]

NT : 시험불실시

갈호내 수치는 5마리 이내의 동물시험에서 얻는 수치이다.

표 7에 의하면 P/77/8 균주를 함유한 NDV 백신에 대한 100% 혈체전화를 초래하는 용량(유효량)은 10⁶EID₅₀인 것으로 나타나고 있다.

Claims (1)

1. P/76/5 NDV 균주를 비허용 온도하에 CEF에서 2회 계대 접종시키고 2차 계대 접종에서 얻은 균주를 채취하여 이것으로 분무식으로 투여 가능한 생백신 제조방법에 따라 분무식 투여형의 뉴캣슬병 예방을 위한 백신의 제조방법.