JPS587611B2 - カキンヨウコンゴウナマワクチン ノ セイゾウホウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はマレツク病生．ワクチン用ウ庁ルス感染活性細
胞浮遊液にニューカンフル病および鶏伝染性気管支炎生
ウィルスワクチン材料の１種もしくは２種を添加して凍
結処理することを特徴とする家禽用混合生ウイルスワク
チンの製造方法に関する０ マレツク病生ワクチンの製造に用いられるウイルスとし
ては、七面鳥ヘルペスウイルヌや弱毒マレツク病ウイル
ヌがあり、これらは相互に共通な抗原性を有しており、
強毒マレツク病ウイルスの感染に対してすぐれた免疫効
果を生体に付与せしめる性質を有しているので、本願明
細書においては、上記の七面鳥ヘルペスウイルヌや弱毒
マレツク病ウイルスをマレツク病生ワクチン用ウイルヌ
と総称する。

家禽のマレツク病はウイルスを原因とし、伝染性がきわ
めて強く、広範囲にわたり発生している。

一般には３０日令以上になってから脚または翼の神経を
おかし神経麻痺を起す。

また内臓に腫瘍を発生し、食欲不振あるいは脊痩などを
起す。

一部のものでは羽のうがおかされ皮膚に腫瘍を発生させ
る。

このため本病は種鶏あるいは産卵鶏の育成率低下、ある
いはブロイラーの肉質低下の一犬原因として家禽界では
きわめておそれられているＯ ニューカッスル病はわが国でも広く発生し、濃厚に存在
しているウイルス性の病気で、感染すると急性の全身性
の症状を示し、神経を麻痺させ、下痢便を排泄し、開口
呼吸、食欲不振などをおこし、１００％死亡させる。

本病は家禽界では最もおそれられており、また本病によ
る被害もきわめて甚大である。

鶏伝染性気管支炎はウイルスを原因とし、主として呼吸
器をおかす伝染病で、伝染性が強ク、一般的には開口呼
吸、くしやみ、せき、呼吸時の異常音などの呼吸器症状
を主徴とする。

本病単独では雛以外の死亡率はきわめて低いが、成長中
のものでは発育阻害、産卵期のものでは産卵停止などい
ずれも家禽界に経済的に甚大な被害を与えている。

現在マレツク病、ニューカッスル病および鶏伝染性気管
支炎はそれそれ生ウイルスワクチンが開発され広く応用
されている。

マレツク病においてハ凍結生ワクチンと凍結乾燥生ワク
チンの２つが開発されており、前者は活性細胞を含むが
、後者は凍結乾燥のため活性細胞を含まないという特徴
を有し、それぞれ所期の効果をあげている。

ニューカッスル病および鶏伝染性気管支炎においてはそ
れぞれ混合製剤の単味製剤および凍結乾燥生ワクチンが
実用されている。

これらの生ワクチンによる各疾病の予防対策をみると、
次の通りである。

マレツク病にあっては、手軽にできる飲水あるいは噴霧
などの接種力法では免疫か全く成立しないので、労力的
あるいは技術的に煩雑ではあるが皮下、腹腔内あるいは
筋肉内接種法が行なわれ、１日令雛に１回適用されるだ
けで、きわめて顕著な効果があがっている。

また、ニューカツヌヌ病および鶏伝染性気管支炎は３〜
４日令以上の日令において、点鼻、点眼、飲水および噴
霧などの方法で、数回接種して抗体をつくらせるのが常
法である。

これらの接種方法のうち、点鼻、点眼接種法は確実な免
疫を産生させるが、いずれも接種反応、他病の誘発ある
いは省力などの点からあまり行なわれていない。

一般的には家禽の免疫体出現にかなりのばらつきがある
飲水あるいは噴霧接種方法が止むを得ず行なわれている
現状である。

従来これらの生ワクチンは初回接種の時期がきわめて近
接しているにもかかわらず、それぞれ単独に接種されて
いる。

場合によっては、ニューカッスル病および鶏伝染性気管
支炎についてはそれそれの単味ワクチンを混合して接種
されることもある。

最近この２渚については、乾燥混合生ウイルヌワクチン
の提供がみられるなど、ワクチン接種の省力化をめざし
た製剤の検討が行なわれている。

しかし、この両ワクチンウイルヌは免疫の産生にあたり
いすれも移行抗体の影響をうけやすいことや、また両名
の間には干渉現象かおこり、かかる同時接種の場合いさ
さか抗原性が低下することか知られている。

このようにニューカツヌル病と鶏伝染性気管支炎におい
ては、生ウイルスワクチンは単味製剤および混合製剤の
いすれにおいても、抗体産生などの点が問題としてのこ
されている０ ここにおいて、従来のニューカッヌル病あるいは鶏伝染
性気管支炎生ウイルヌワクチンにみられる問題点を解決
し、さらにマレツク病も含めて高度の免疫を１回の予防
接種で同時に成立させ得るような混合生ワクチンが開発
されれば、多数羽飼育形態が一般化した現在、ワクチン
接種の省力化、経費節減の上からも、またワクチン製造
コヌト低減の面からも、その意義と価値はきわめて大き
いものがあるといわねばならない。

本発明者らはこのような要件を満足する混合生ワクチン
の作出のために種々研究を行なった結果、ここに新規製
造方法の創案に成功した。

すなわち、この技術はマレツク病生ワクチン用ウイルス
、ニューカッスル病ウイルヌ、鶏伝染性気管支炎ウイル
ヌは活性細胞の存在下において共存せしめれば、これを
家禽体内に接種した場合各ウイルヌの抗原性がきわめて
著明に発揮されるという本発明渚らの知見にもとすいた
ものである。

マレツク病生ワクチン用ウイルスは他のウイルヌと性質
かことなり、人工培養した場合殆んど細胞に随伴した状
態で増殖し、培養液中に遊離してくるウイルヌ粒ナはき
わめて少い。

遊離状態のウイルヌ粒子を得るためには伺らかの方法で
細胞を破壊することを必要とするくらいで、またこのよ
うなウイルヌは犬そう不安定である。

次に、マレツク病生ワクチン用ウイルヌが増殖した細胞
は活性機能をあまり失なうことがなく、なお増殖を続け
うる程度の活力を有している。

これに対して、ニューカツヌル病および鶏伝染性気管支
炎ウイルスは顕著な細胞変性作用を示しながら増殖する
。

以上のような理由により、本発明に供する活性細胞とし
ては、マレツク病生ワクチン用ウイルスを増殖せしめた
培養細胞を利用するのが、もつとも効率的であり製造コ
ヌトも低廉である。

本法の要点を説明する。

まずマレツク病生ワクチン用ウイルスを培養細胞内で充
分増殖せしめ、この細胞がいまだ活性を保持している状
態の時に、あらかじめ別々に培養して得られたニューカ
ッスル病ウイルスと鶏伝染性気管支炎ウイルヌをこれに
添加して、さぎの培養細胞に吸着もしくは重感染せしめ
ることによって、混合ワクチンの原液を得る。

これを適当な凍結保護剤を含有せしめたメジウムに浮遊
し、超低温において凍結する。

活性細胞としていろいろなものが適用されるが、マレツ
ク病生ワクチン用ウイルヌが増殖可能で、さらにニュー
カンヌル病ウイルヌ、鶏伝染性気管支炎ウイルスが増殖
もしくはすくなくとも生存可能なものが好ましく、たと
えばアヒル、鶏、七面鳥、ウズラなどの胎児や腎臓に由
来するものがこれに相当する。

ここに得られたワクチンはニューカツヌル病あるいは鶏
伝染性気管支炎についてみると、各々をそれぞれ単独に
接種するかまたは同時に混合接種した場合よりも抗体の
産生がいずれも著しく向土すること、従来みられたよう
な両ワクチンウイルヌの混合によっておこる相互の干渉
現象を全くおこさないことおよび免疫効果は移行抗体保
有雛においても充分発揮されるということを見出した。

雛の体内には親が保有していた種々の疾病に対する防御
抗体が移行し、おおむね生後４週令程度持続する。

移行抗体か存在すると通常ワクチン接種による抗体の産
生が殆んどおさえられるので、この消失をまって接種し
なければならない。

消失の時期は卿化時の抗体保有量如例によって種々変動
し、ワクチン接種の適期の判定はなかなかむずかしいも
のである。

本法によって得られたワクチンは含有ウイルヌがいずれ
もワクチン中の活性細胞に吸着または重感染した状態に
あるので、生体に接種されても移行抗体からウイルヌは
充分に保護され、このことはまた従来みられたような複
数の生ワクチンの同時接種によっておこるウイルヌ相互
間の干渉現象から各々のウイルヌが保護されることにも
つながるものである。

従って、このような保護効果によりワクチンによる抗体
の産生が著しく強化されるということである。

マレツク病生ワクチンは本来その効果を発揮するために
は、１羽宛確実に皮下、腹腔内または筋肉内に接種をし
なければならない。

本発明のワクチンはマレツク病生ワクチン用ウイルヌを
その重要な構成要素としており、マレツク病に対する免
疫効果を期待するには、その単味ワクチンと同様な接種
法を必要とするのはいうまでもない。

従って、この製剤に配合された他のワクチンウイルヌも
皮下、腹腔内または筋肉内に確実に接種されるので、免
疫のできかたにばらつきが少なくなる。

また直接の感染経路である呼吸器以外に接種されるため
に、生ウイルヌワクチンの接種による副作用も出現しな
い。

皮下、腹腔内または筋肉内接種法は飲水や噴霧接種法に
比べると煩雑で技術を要するが、マレンク病の他に二二
一カンフル病や鶏伝染性気管支炎を同時に且つ確実に予
防できること、安全性の高い接種法が用いられること、
１日令雛に１回接種するだけで高い免疫を長期間持続さ
せることなど種々の利点を考慮すると、本ワクチンは現
在家禽界で要望されているワクチン接種時の労力を総合
的に節約するものということができる。

さきの接種法は本ワクチンの実用性を拡大するものであ
って、決してそこなうものではないＯ 表（１），（３）に示すようＫ、マレツク病生ワクチン
用ウイルヌとの混合生ウイルヌワクチンを雛に接種する
と、ニューカツヌル病に対する赤血球凝集抑制（ＨＩ）
抗体価はニューカツヌル病単味生ワクチンの場合に比較
して２〜３倍の値を示し、また鶏伝染性気管支炎の中和
価も対照の鶏伝染性気管支炎単味生ワクチンおよびニュ
ーカツヌル病、鶏伝染性気管支炎混合生ウイルヌワクチ
ンの場合よりも高かった。

マレツク病生ワクチン用ウイルスの回収率については、
混合生ウイルヌワクチン接種雛の皮下、腹腔内および筋
肉内接種群では８３〜１００％、また単味接種群では１
．００％となり、両名の間に有意の差は認められなかっ
た。

本発明にかかわる混合ウィルヌワクチンの製造方法を以
下に記載するが、これに限定されるものではない。

すなわち七面鳥ヘルペヌウィルスＹＴ一７株（このウイ
ルヌに限らすＹＴ−７株と共通抗原を有する七面鳥へル
ペヌウィルヌおよびマレンク病ウィルヌ弱毒株のすべて
を使用できる）を鶏胎児線維芽、アヒル胎児維芽などの
培養細胞に接種し増殖させる。

培養細胞をトリブシンでばらばらにし１遠心沈澱で集め
、細胞培養用または細胞維持用培地にＤＭＳＯクリセリ
ンなどの凍結保護剤を加えた凍結用メジウムに浮遊し、
感染細胞浮遊液を作成する。

ニューカンヌル病ウィルヌＢ１ａ（このウィルス株に限
らすＢ１株と共通抗原を有するニューカッスル病ウイル
ヌ弱毒株のすべてを使用できる）を発育鶏卵あるいは培
養細胞などの適当な方法で増殖させ、ウイルヌ材科を採
増する。

鶏伝染性気管支炎ウィルス練馬株（このウィルヌに限ら
す鶏伝染性気管支炎ウィルス弱毒株のすべてを使用でき
る）を発育鶏卵あるいは培養細胞など適当な方法で増殖
させ、ウィルヌ材科を採取する。

次に、マレンク病生ワクナン用ウイルヌ感染活性細胞浮
遊液にニューカツヌル病、鶏伝染性気管支炎のワクチン
ウイルヌ材料の１種もしくは２種を適当量添加しそれぞ
れ均等ドーヌになるよう調整する。

これを約１時間以内に小分容器に封入したまま超低温で
凍結することによって、上記ワクチンウイルヌから構成
される２種または３種混合生ウイルスワクチンが得られ
る。

このワクチンの力価は−１００℃以下の状態で保存すれ
ば、すくなくとも１２カ月間は安定であり、表（２）及
び（４）に示したように含有ウイルヌ量の減衰は全く認
められない。

以下本発明の実施例を述べる。

実施例 １）七面鳥ヘルペヌウイルスＹＴ−７株の約１ｏ３ＰＦ
Ｕ／ｍｅを、トリプシンで消化し、ばらばらにしたアヒ
ル胎児線維芽細胞の浮遊液を分注した大型の培養瓶に接
種し、３７℃で５〜６日間ウイルスによるＣＰＥの発現
をみながら回転培養し、ＣＰＥの出現の最もよいときに
培養液（たとえばイークル液、１９９培養液など）をす
てる。

これに０．２５％のトリプシン液をいれ約１０分間作用
させる。

これにより脱落した細胞を１０００ｒｐｍで２分間遠心
沈澱により集め、これを５〜８Ｘ１０７個／ｍｌになる
ように牛血清，ＤＭＳＯを加えた細胞培養液よりなる凍
結用メジウムで感染活性細胞浮遊液を作成する。

一方ニューカツヌル病ウイルスＢ１株の約１０’ＥＩＤ
，ｏ／ｍｌを９〜１０日令の発育鶏卵の尿腔内に接種し
、３７℃で３〜４日間増殖させる。

その後接棟卵の尿腔液をとり出して、２０００ｒｐｍで
５分間遠心沈澱し、その上清を採取する。

これをニューカッスル病ウイルヌの原液とする。

また鶏伝染性気管支炎ウイルヌ練馬株の約１０４ＥＩＤ
，ｏ／ｍｌを９〜１０日令の発育鶏卵の尿腔内に接種し
、３７℃で２〜３日間増殖させる。

その後接種卵の尿腔液をとり出し、２００Ｏｒｐｍで５
分間遠心沈澱し、その上清を採取する。

これをニューカッスル病ウイルスの原液とする。

また鶏伝染性気管支炎ウイルス練馬株の約１０４ＥＩＤ
５ｏ／ｍｌを９〜１０日令の発育鶏卵の尿腔内に接種し
、３７℃で２〜３日間増殖させる。

その後接種卵の尿腔液をとり出し、２０００ｒ［Ｉで５
分間遠心沈澱し、その上清を採取する。

これを鶏伝染性気管支炎ウイルスの原液とする。

上記の七面鳥ヘノレペヌウイルス感染活性細胞浮遊液、
ニューカツヌル病および鶏伝染性気管支炎ウイルス原液
を２：１：１の割合に混合し、十分攪拌する。

約１時間以内にこの混合液を５ｍｌのアンプールに２ｍ
ｌ宛分注し溶封する。

アンプールは一夜−９０℃の令凍装置において予備凍結
し、次いで液体窒素の気層もしくは液層（−１００℃以
下）に貯蔵する。

これによりマレツク病、ニューカッスル病および鶏伝染
性気管支炎混合ウイルスワクチンを得る。

２）■）の方法により製造したマレツク病ウイルヌ感染
活性細胞浮遊液とニューカツヌル病ウイルヌ原液を１）
に準じて処理することによってマレツク病、ニューカツ
ヌル病混合生ウイルスワクチンを得る。

３）１）の方法により製造したマレツク病ウイルス感染
活性細胞浮遊液と鶏伝染性気管支炎ウイルヌ原液を１）
に準じて処理することによってマレツク病、鶏伝染性気
管支炎混合生ウイルヌワクチンを得る。

４）弱毒マレツク病ウイルスＳＤ−３株の約１０５ＰＦ
Ｕ／ｍｌを、トリブシンで消化し、ばらばらにしたアヒ
ル胎児線維芽細胞の浮遊液を分注した大型の培養瓶に接
種し、３７℃で５〜６日間ウイルスによるＣＰＥの発現
をみながら回転培養し、ＣＰＥの出現の最もよいときに
培養液（たとえばイーグル液、１９９培養液など）をす
てる。

これに０．２５％のトリプシン液をいれ約１０分間作用
させる。

これにより脱落した細胞を１０００回転で２分間遠心沈
澱により集め、これを５〜８×１０７個／ｍｌになるよ
うに牛血清、ＤＭＳＣを加えた細胞培養液よりなる凍結
用メジウムで感染活性細胞浮遊液を作成する。

一方ニューカッスル病ウイルスＢ１株の約１０’ＥＩＤ
５０／ｍｌを９〜１０日令の発育鶏卵の尿腔内に接種し
、３７℃で３〜４日間増殖させる。

その後接種卵の尿腔液をとり出して、２０００回転で５
分間遠心沈澱し、その上清を採取する。

これをニューカッスル病ウイルスの原液とする。

また鶏伝染性気管支炎ウイルヌ練馬株の約１０４ＥＩＤ
５ｏ／ｍｌを９〜１０日令の発育鶏卵の尿腔内に接棟し
、３７℃で２〜３白間増殖させるその後接種卵の尿腔液
をとり出し、２０００回転で５分間遠心沈澱し、その上
清を採取する。

コレヲニューカツヌル病ウイルヌの原液トスルまた鶏伝
染性気管支炎ウイルヌ練馬株の約１０４ＥＩＤ５ｏ／ｍ
ｌを９〜１０日令の発育鶏卵の尿腔内に接棟し、３７℃
で２〜３日間増殖させる。

その後接種卵の尿腔液をとり出し、２０００回転で５分
間遠心沈澱し、その上清を採取するこれを鶏伝染性気管
支炎ウイルヌの原液とする。

上記の弱毒マレツク病ウイルヌ感染活性細胞浮遊液、ニ
ューカッスル病および鶏伝染性気管支炎ウイルヌ原液を
２：１：１の割合に混合し十分攪拌する。

約１時間以内にこの混合液を５一のアンプールに２ｍｌ
宛分注し溶封する。

アンブールは一夜−９０℃の令凍装置において予備凍結
し、次いで液体窒素の気層もしくは液層（−１００℃以
下）に貯蔵する。

これによりマレツク病、ニューカツヌル病および鶏伝染
性気管支炎混合ウイルヌワクチンを得る。

５）４）の方法により製造した弱毒マレツク病ウイルヌ
感染活性細胞浮遊液とニューカツヌル病ウイルヌ原液を
４）に準じて処理することによってマレツク病、ニュー
カツヌル病混合生ウイルヌワクチンを得る。

６）４）の方法により製造した弱毒マレツク病ウイルヌ
感染活性細胞浮遊液と鶏伝染性気管支炎ウイルスを液を
４）に準じて処理することによってマレツク病、鶏伝染
性気管支炎混合生ウイルヌワクチンを得る。

１），２），３），４），５），６）のいずれも使用に
あたっては細胞培養用または細胞維持用培地よりなる溶
解用液（たとえばイーグル液、１９９培養液など）の中
に急速にとかしたワクチンを加えよく混合する。

これら溶解した混合生ウイルスワクチンはただちに接種
に供するのがもつとも好ましいが、これを５℃に保存す
ればおおむね２時間は供用してさしつかえない。

ワクチン効果の判定方法 マレツク病に対するワクチン効果判定法として現在用い
られている方法は、ウイルス分離のみであり、マレツク
病生ワクチン用ウイルスの感染（ウイルヌが分離される
）の成立があれば、効果を認めたと判定されている。

従って、ここでは、マレツク病の効果判定は、ウイルヌ
感染（ウイルヌ分離）の有無で行なった。

鶏は１日令のもので各６〜１４羽を用い、混合生ウイル
スワクチンを０．２ｍｌ宛接種後アインレーターで飼育
を行なった。

接種後３週目に殺処分して腎臓を摘出しこの中にウイル
ヌが存在するかどうかを検討した。

−カニューカツヌル病については３週目の殺処分時に採
血した血液中のＨＩ抗体を、また鶏伝染性気管支炎につ
いては３週目の血液中の中和抗体を検査した。

成績例 本発明によって得られた混合生ウイルヌワクチンの安全
性および免疫効果を表１及び表３に示す。

１日令雛に対し混合生ウイルヌワクチンを接種したとこ
ろ、３週間みるべき臨床変化を認めず、発育性にも影響
はみられなかった。

ニューカツヌル病ウイルヌに対するＨＩ抗体価はニュー
カンフル病ワクチン単味群よりもマレツク病ワクチンと
の混合群が著しく高かった。

また鶏伝染性気管支炎ウイルヌに対する中和価も単味ワ
クチン接種群、ニューカツヌル病ワクチン接種群のいず
れよりもマレツク病ワクチンとの混合接種群の方が同様
に高い値を示した。

一方マレツク病生ワクチン用ウイルヌの分離率は混合お
よび単味ワクチンのいずれにおいても差を認めなかった
。

接種方法として、点鼻接種群では当然のことながら、マ
レンク病生ワクチン用ウイルヌの分離は陰性であり、こ
のことからも本混合ワクチンの効果は皮下、腹腔内およ
び筋肉内接種法によってのみきわめて効果的に発揮され
ることがわかる。

なお、ニューカンヌル病強毒ウイルヌによる攻撃試験を
行なったところ、本発明の混合ワクチン接種群の方が、
ニューカツヌル病、鶏伝染性気管支炎混合ワクチン接種
群よりもすぐれた成績を示した。

以上のことから本混合ワクチンが安全かつ有効であるこ
とを示している。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アヒル、鶏、七面鳥、ウズラ又はこれらと同等物の
   胎児や腎に由来する活性細胞内にマレツ多病生ワクチン
   用ウイルスを接種し増殖せしめることにより得られたマ
   レツク病生ワクチン用ウイルス感染活性細胞浮遊液にニ
   ューカッスル病および鶏伝染性気管支炎生ウイルスワク
   チン材科の１種若しくは２種を添加し、先のウイルヌ感
   染活性細胞に添加ウイルヌを吸着若しくは重感染せしめ
   、これを凍結処理することを特牽とする家禽用混合生ウ
   イルヌワクチンの製造方法。