KR101258619B1 - 새로운 약독형 유전아형의 뉴캣슬병 바이러스 백신주 및 이를 포함하는 뉴캣슬병 바이러스 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 닭의 악성 전염병인 뉴캣슬병(ND: Newcastle disease)을 예방할 수 있는 뉴캣슬병 바이러스 백신주 및 이를 포함하는 뉴캣슬병 바이러스 백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 국내 가금 오리로부터 분리되고 바이러스 F 단백질의 핵산 염기서열을 기초로 계통분류학적 분석(phylogenetic analysis)에서 class 1의 유전형 I의 유전아형 d (Id)에 속하는 뉴캣슬병 바이러스 백신주 및 이를 포함하는 뉴캣슬병 바이러스 백신에 관한 것이다.

Description

새로운 약독형 유전아형의 뉴캣슬병 바이러스 백신주 및 이를 포함하는 뉴캣슬병 바이러스 백신{New subtype vaccine strain of lentogenic Newcastle disease virus and the viral vaccine comprising thereof}
본 발명은 닭의 악성 전염병인 뉴캣슬병(ND: Newcastle disease)을 예방할 수 있는 뉴캣슬병 바이러스 백신주 및 이를 포함하는 뉴캣슬병 바이러스 백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 국내 가금 오리로부터 분리되고 바이러스 F 단백질의 핵산 염기서열을 기초로 계통분류학적 분석(phylogenetic analysis)에서 class 1의 유전형 I의 유전아형 d (Id)에 속하는 뉴캣슬병 바이러스 백신주 및 이를 포함하는 뉴캣슬병 바이러스 백신에 관한 것이다.
뉴캣슬병(ND: Newcastle disease)은 닭에서 전염성이 빠르고 높은 치사율을 나타내는 양계의 대표적인 악성 전염병이다. ND는 1920년대 초에 인도네시아, 영국 및 한국 등에서 처음 발생이 보고된 이래로, 아시아와 아프리카 및 유럽 등 많은 국가들에서 현재까지도 지속적으로 발생하고 있다. 이 질병은 닭에 감염될 경우 심한 호흡기 증상, 소화기 증상 및 높은 치사율을 나타낸다. 산란하는 닭에서는 심한 산란율 저하와 비정상 기형란 발생 증가 등을 유발하여 양계의 생산성을 크게 악화시킨다. 특히, 면역이 형성되어 있지 않은 양계농장에서 ND가 발생할 경우 2주 이내 농장 내 대부분의 닭들이 치사할 수 있다.
ND를 일으키는 병원체인 뉴캣슬병 바이러스(NDV: Newcastle disease virus)는 파라믹소비리데(Paramyxoviridae)과에 속하는 아불라바이러스(Avulavirus)속의 조류파라믹소바이러스 제1형(APMV-1:　Avian paramyxovirus type 1)이다.
NDV는 닭에서 피해를 일으키는 정도에 따라 강독형(velogenic), 중간독형(mesogenic) 및 약독형(lentogenic)으로 병원성 타입이 분류된다. 강독형 NDV는 닭에서 매우 심한 호흡기 증상을 일으키며 높은 치사율을 나타내는 바이러스로, 병증에 따라 다시 심한 설사와 같은 소화기 병변을 심하게 일으키는 장친화성 (viscerotropic velogenic)과 심한 신경성 증상을 나타내는 신경친화성(nuerotropic velogenic)으로 나뉜다. 중간독형 NDV는 닭 치사율이 낮으며, 호흡기 증상을 심하게 일으킨다. 약독형 NDV는 닭 치사율이 거의 없거나 낮으며 병증도 매우 약하거나 없기 때문에 약독형 바이러스 중 일부는 뉴캣슬병 예방을 위한 백신주로 사용되고 있다.
NDV는 전 세계적으로 단일한 혈청형만 존재하지만 유전학적으로는 다양한 유전형(genotype) 또는 유전아형(subgenotype)이 있다. NDV 유전형은 크게 제1형(class 1)과 제2형(class 2)으로 분류되며, 이 중 닭에서 피해를 일으키는 것은 제2형에 속하는 유전형 바이러스들이다. 제2형은 보다 세분하면 현재까지 최소한 9개의 유전형(I형 내지 IX형)으로 구성되어 있다. 이 중 유전형 I과 유전형 II는 대부분 야생조류나 닭 이외의 조류종에서 주로 분리되며 닭에서 피해를 유발하지 않는 약독형 NDV들이다. 유전형 III에서 유전형 IX형에 속하는 NDV는 주로 닭에서 분리되며 닭에서 피해를 심하게 일으키는 바이러스들이 주종을 이룬다. 최근 우리나라를 포함한 아시아 국가의 양계산업에 심각한 피해를 입히고 있는 강독형 NDV의 유전형은 대부분 유전형 VII이다.
닭에서 ND 발병에 의한 피해를 줄이거나 예방하기 위한 최선의 방법은 닭에 예방 백신을 접종하는 것이다. 닭에서 피해를 일으키지 않는 약독형 NDV를 닭 종란에서 대량증식시킨 다음, 바이러스의 감염성을 그대로 유지하는 바이러스 형태(생독백신) 또는 포르말린이나 베타프로피오락톤 등으로 바이러스의 감염성을 제거한 형태(사독백신)로 예방백신을 제조하는 것이 통상적인 방법이다.
사독백신은 면역반응을 증강시키기 위하여 감염성을 제거한 NDV를 겔(gel)이나 기름(oil)과 섞어서 제조하며, 통상적인 적용 방법은 닭이 산란을 시작하기 3주 내지 4주 전에 닭의 근육으로 주사하여 접종하는 것이다. 생독백신은 어린 닭에서 ND 피해를 예방하기 위하여 주로 사용한다. 통상적으로 적용하는 방법은 생독백신을 물에 첨가하여 닭에게 먹이거나(음수) 또는 분무기로 살포하여 닭이 호흡하는 동안 살포한 백신 입자를 흡입하게 하는(분무) 것이다.
ND 백신을 제조하는데 통상적으로 사용하는 NDV는 제2형의 유전형 I 또는 유전형 II에 속하는 약독형 NDV이다. NDV 유전형 I에 해당되는 백신 바이러스는 Ulster 2C주 및 V4주가 대표적이다. NDV 유전형 II에 속하는 백신 바이러스는 La Sota주, B1 히츠너주 및 VG/GA주 등이 대표적이다.
이들 백신 바이러스는 닭에서 면역반응을 강하게 일으키면서 병원성을 나타내지 않는 바이러스주를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 대부분 NDV의 경우 닭에서 면역반응이 강할수록 반대로 닭에서 병원성을 나타내는 정도가 강해지는 부작용을 나타낸다. 특히 생독백신으로 통상적으로 사용하는 La Sota주 또는 B1주의 경우 2주령 이내의 어린 닭에 접종하면 면역반응이 높게 형성되는 장점이 있지만 호흡기에 친화성이 강하여 심한 호흡기 부작용을 나타내며 심지어 일부 개체가 치사하기도 한다. 그러므로 어린 닭에서 예방 접종을 실시할 경우 닭에서의 병원성은 최소화하면서 면역반응을 높게 형성시키는 NDV를 백신 바이러스로 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 현재 국내 양계에서 통상적으로 사용하고 있는 백신 바이러스는 외국에서 사육 또는 서식하고 있는 조류 종에서 분리된 바이러스이다. 따라서, 국내에서 사육하는 가금류로부터 분리된 바이러스를 이용하여 NDV에 대한 면역력을 높여야 할 필요성이 대두되고 있다.
이에 본 발명자들은 국내에서 사육하고 있는 가금 오리로부터 NDV를 분리하고 이를 분석하는 과정에서 현재 통상적으로 사용하고 있는 백신 바이러스들과 유전학적으로 다른 새로운 유전아형의 NDV가 국내에 존재하고 있다는 사실을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 분리된 NDV를 대상으로 분석을 거듭한 결과, 상기 새로운 유전아형의 NDV가 어린 닭에서 병원성을 나타내지 않으면서 호흡기 및 소화기 점막 모두에서 증식성이 있어 강독형 NDV로 인공 감염시켰을 때 탁월한 예방 효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 종래에 백신 바이러스로 사용하고 있는 NDV와 유전아형이 다른 새로운 유전아형의 NDV 백신주를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 기탁번호 KCTC 11718BP의 뉴캣슬병 바이러스 백신주를 제공한다.
또한 본 발명에서는 뉴캣슬병 바이러스 백신주를 포함하는 뉴캣슬병 예방용 백신을 제공한다.
본 발명에 의한 뉴캣슬병 바이러스 백신주는 닭에서 병원성이 없는 약독형 뉴캣슬병 바이러스로서, 닭에 역계대한 이후에도 병원성이 회복되지 않아 닭에 대한 안전성이 확인되었다. 또한, 상기 백신주는 호흡기뿐만 아니라 소화기에서도 친화성을 나타내었고, 이러한 특징으로 말미암아 닭에 분무(호흡기 면역)하거나 경구 및 점안(소화기 면역)으로 접종하였을 때 우수한 면역형성능을 나타내었으며, 강독형 뉴캣슬병 바이러스에 대하여 현재 시판되고 있는 다른 백신들보다도 우수한 방어 효능을 나타내었다.
도 1은 본 발명에 의한 NDRL09-01주의 F 단백질의 분절부위 예측 아미노산 서열을 보여준다. 박스로 표시된 부분은 F 단백질의 분절부위 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 의한 NDRL09-01주의 F 단백질 유전자 염기서열에 기초한 계통분류학적 분석 결과이다. 괄호 안의 내용은 유전자은행(genbank)의 등록(accession) 번호이고, 화살표는 본 발명의 백신주를 나타낸다.
본 발명은 새로운 약독형 유전아형의 뉴캣슬병 바이러스 백신주에 관한 것이다. 본 발명자들은 국내 가금 오리로부터 분리한 새로운 약독형 뉴캣슬병 바이러스를 뉴캣슬병 바이러스 "NDRL09-01"이라 명명하였고, 2010년 6월 25일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11718BP를 부여받았다.
본 발명에 의한 약독형 뉴캣슬병 바이러스는 바이러스 F 단백질의 핵산 염기서열을 기초로 계통분류학적 분석(phylogenetic analysis)에서 제1형의 유전형 I의 유전아형 d(Id)에 속하는 뉴캣슬병 바이러스 백신주로서, 어린 닭에 접종하였을 때 닭의 호흡기 및 소화기 점막에서 국소적으로 증식하여 점막면역을 형성한다. 또한 닭에서 병원성을 나타내지 않으면서 강병원성 NDV에 대한 예방 효과가 우수하고, 어린 닭에 접종하였을 때 닭의 호흡기 및 소화기에서 모두 국소적으로 증식하여 점막면역을 형성하므로 분무 및 음수 경로로 적용하기에 바람직하다.
또한 본 발명은 새로운 약독형 유전아형의 뉴캣슬병 바이러스 백신주를 포함하는 뉴캣슬병 바이러스 백신에 관한 것이다.
본 발명에 의한 뉴캣슬병 바이러스 백신은 당업계에 통상적으로 알려진 방법으로 제조가 가능하며, 상기 뉴캣슬병 바이러스를 단독으로 또는 다른 질병 백신주와 혼합한 백신, 상기 NDV를 불활화한 사독 백신, 상기 약독형 뉴캣슬병 바이러스의 유전자를 사용하여 생산한 NDV 서브유니트(subunit) 백신, 벡터(vector) 백신, 키메라(chimera) 백신 또는 DNA 백신 등과 같은 다양한 형태로 제조될 수 있으므로, 그 활용도가 매우 넓다. 상기 백신은 당업계에서 통상적으로 사용하는 수의학적으로 수용가능한 매개체 또는 부형제를 포함할 수 있으며, 아주번트를 추가로 더 포함할 수 있다. 본 발명의 백신을 접종하는 방법에는 특별한 제한은 없지만, 음수, 점안 또는 분무 방식으로 접종하는 것이 바람직하다.
본 발명이 일 실시예에서는 상기 약독형 뉴캣슬병 바이러스를 닭 종란에 접종하여 대량 증식한 다음 이를 포함하는 생독백신의 형태로 제조하였으나, 이에만 한정되는 것은 아니다. 이때, 본 발명에 의한 약독형 뉴캣슬병 바이러스의 증식 방법, 계란 내 접종과정, 배양 조건, 백신제조 방법 및 제조시약 등은 당업계에 통상적으로 알려져 있는 임의의 방법을 제한없이 이용할 수 있다. 또한 종란에서 상기 바이러스의 계대 배양 횟수에는 특별한 제한은 없지만, 종독(master seed) 바이러스를 5대 이내의 횟수로 계대 배양을 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 약독형 뉴캣슬병 바이러스를 함유한 생독백신은 어린 연령의 닭에 분무 또는 음수 방식으로 접종하였을 때 닭에서 부작용 피해가 없이 뉴캣슬병 예방에 충분한 수준의 면역원성을 유발하였다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
[실시예 1] 뉴캣슬병 바이러스 분리 및 동정
2009년 뉴캐슬병 백신 접종을 실시하지 않았던 가금 오리 농장에 사육중인 오리에서 채취한 검체시료를 대상으로 뉴캣슬병 바이러스를 분리하였다. 보다 구체적으로 살펴보면, 먼저 외관상 건강한 오리의 총배설강(cloaca) 내 존재하는 분변을 면봉으로 채취한 다음 1 ml의 0.01 M PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4) 용액을 첨가하여 철저히 혼합하였다. 상기 분변 혼합액을 원심분리기에서 1,500 g에서 30분간 원심분리한 후, 원심 상층액을 일회용 0.45 ㎛ 여과기로 여과하여 분변 내 존재하는 세균을 제거한 다음 바이러스 분리용 검체시료로 사용하였다.
37℃ 부란기에서 태아를 9일 내지 11일간 발육시킨 SPF 닭 종란(embryonating egg)의 장요막강 내로 종란당 0.1 ㎖씩 상기 검체시료를 접종하였다. 종란 난각의 접종 부위를 멸균 파라핀으로 밀봉한 다음 37℃ 부란기에 넣고 5일간 배양하였다. 그 후 접종 종란을 부란기에서 꺼내어 4℃에서 하룻밤 동안 냉각사(chilling)시킨 다음, 종란의 난각을 제거한 후 장요막강액을 무균적으로 채취하여 닭 혈구를 응집시키는지를 조사하였다. 닭 혈구를 응집시키는 바이러스가 증식된 시료들(종란 장요막강액)은 다시 뉴캣슬병 표준 항혈청과 혼합하여 실온에서 30분간 중화시킨 다음 혈구응집억제반응(HI: Hemagglutination inhibition)이 일어나는지를 조사하였다. 그 결과, 가금오리 시료를 접종한 종란의 장요막강액에서 닭 혈구를 응집시키는 바이러스가 증식되었음을 확인하였다. 또한 이 바이러스를 접종한 종란의 태아는 5일간의 배양기간 동안 모두 폐사하지 않았고, 뉴캣슬병 표준항혈청에 의해 혈구응집 억제반응을 나타내었다. NDV 검출용 RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction) 검사킷트(인트론바이오테크놀로지, 한국 대전 소재)를 사용하여 바이러스 시료들 중 표준항혈청에 의하여 닭 혈구 응집을 억제시키는 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01을 최종 동정하였다.
분리한 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01을 SPF 닭 종란에서 한계 희석법(endpoint titration)으로 3회 클로닝하여 정제한 다음 SPF 종란에서 대량 배양하여 뉴캣슬병 백신주로 사용하였다.
[실시예 2] 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01의 종란 내 증식성 조사
상기 실시예 1의 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01을 SPF 종란에 접종하여 바이러스의 증식성을 조사하였다. 즉, 부란기에서 9일 내지 11일간 태아를 발육시킨 SPF 종란의 장요막강 내로 계란당 0.1 ㎖씩 바이러스액을 접종한 다음, 37℃ 부란기에서 다시 넣고 배양하였다. 접종 종란을 5일간 배양한 다음 종란을 부란기에서 꺼내어 4℃에서 하룻밤동안 방치하여 냉각사시켰다. 그 후 종란의 난각을 제거한 후 장요막강액을 무균적으로 채취함으로써 바이러스를 증식 배양하였으며, 바이러스 HA단백량 측정과 바이러스 감염량 측정 등 두 가지 방법으로 바이러스 양을 측정하였다.
바이러스 HA 단백량은 혈구응집반응법을 사용하여 측정하였다. 바이러스액을 96웰 U형 마이크로플레이트(microplate)에서 멸균 PBS로 2배씩 단계 희석하여 웰당 50 ㎕씩 첨가한 다음 0.5%(v/v) 닭 혈구 용액을 동량으로 첨가한 후 실온에서 40분간 방치하였다. 그 후 닭 혈구가 응집되어 가라않은 바이러스액의 최대희석배수의 역수를 HA 역가로 결정하였다.
바이러스 감염량은 상기 실시예 1과 동일한 SPF 닭 종란 접종법으로 실시하여 측정하였다. 바이러스액을 멸균 PBS로 10배씩 단계 희석하여, 희석액당 종란 5개씩 SPF 종란에 실시예 1과 동일한 방법으로 접종하여 실시하였다. 접종 5일째 계란의 장요막강액을 채취하여 닭 혈구에 대한 응집반응 여부를 조사하여, 혈구 응집이 일어난 경우 종란이 뉴캣슬병 바이러스에 감염된 것으로 간주하였다. 감염역가의 측정은 종란 태아의 50%를 감염시키는(EID50: 50% embryo infective dose) 바이러스액 희석 배수의 역수를 나타낸 것으로서, Reed & Muench (1938)의 방법에 따라 산출하였다(Reed LJ & Muench H. American J Hyg, 27:493-497, 1938).
SPF 종란 내 바이러스 증식성을 조사한 결과, 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01주는 바이러스 HA 단백량으로는 최소 1,000배 이상, 바이러스 감염량으로는 최소 1010.0 EID50 이상의 높은 감염역가를 나타내었다. 이러한 결과는 NDRL09-01주는 백신주로서 종란 내 증식성이 매우 우수한 것을 확인하였다.
[실시예 3] 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01의 닭에 대한 병원성
본 발명의 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01주의 닭에 대한 병원성은 SPF 종란에서의 평균치사시간(MDT: mean death time) 측정법과 1일령 SPF 병아리에서의 뇌 내 병원성 지수(ICPI: intracerebral pathogencity index) 측정법 등 두 가지 방법을 사용하여 측정하였다.
< MDT 측정 >
실시예 1의 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01주를 10개의 SPF 닭 종란에 접종하였다. 즉, 접종 당일 오전 9시에 5개 SPF 닭 종란에, 그리고 오후 5시에 나머지 5개의 SPF 닭 종란에 바이러스액을 접종한 다음 37℃에 배양하면서 매일 오전 9시와 오후 5시에 검란하여 종란 내 태아의 치사여부를 관찰하여 평균 치사시간(MDT)을 측정하였다. 측정된 MDT가 60시간 이내인 경우 강병원성 뉴캣슬병 바이러스로, 60시간에서 90시간의 경우 중병원성 뉴캣슬병 바이러스로, 그리고 90 이상일 경우 약병원성 뉴캣슬병 바이러스로 간주하였다. 본 발명의 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01주는 배양 5일 동안 어떠한 접종 종란에서도 태아 폐사가 일어나지 않아 MDT가 최소한 120시간 이상으로 약병원성 바이러스의 범주에 속하였다.
< ICPI 측정 >
실시예 1의 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01주를 10수의 1일령 SPF 닭의 뇌 내로 접종하였다. 즉, 바이러스액을 1일령 SPF 병아리 10수에 병아리 1수당 0.05 ml씩 뇌 내로 접종하여 8일간 관찰하면서 병원성을 측정하였다. 관찰기간 동안 정상 병아리 1수당 0점, 병증을 나타내는 병아리 1수당 1점, 죽은 병아리 1수당 2점을 매겨서 매일 누적 합계로 총 합계점수를 80으로 나누어서 최종적으로 ICPI를 계산하였다. ICPI 수치가 1.2 이상일 경우 강병원성 바이러스로, 0.6에서 1.2 사이일 경우 중병원성 바이러스로, 그리고 0.6 이하일 경우 약병원성 바이러스로 분류하였다. 본 발명의 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01주는 ICPI 수치가 0.2로 약병원성 뉴캣슬병 바이러스의 범주에 속하였다.
본 발명의 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01주의 ICPI 측정 결과
접종 후 일수 합계 가중치 총계**
1 2 3 4 5 6 7 8
정상 10* 10 10 10 8 8 8 8 72 0 0
병증 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
폐사 0 0 0 0 2 2 2 2 8 2 16
ICPI=(각 총계의 합/80) 16/80=0.2
* 개체수
** 총계=합계＊가중치
통상적인 뉴캣슬병 바이러스의 병원성 측정방법인 MDT와 ICPI 측정 결과, 본 발명의 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01주는 약병원성 뉴캣슬병 바이러스임을 확인하였다.
[실시예 4] 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01의 유전형 분석
실시예 1의 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01바이러스의 유전형은 바이러스 F 단백질 유전자를 RT-PCR법으로 증폭한 다음 핵산 염기서열을 취하여 계통발생학적 분석법으로 실시하였다.
바이러스 게놈 RNA는 바이러스 RNA 추출킷트(viral gene-spin, 인트론바이오테크놀로지)를 사용하여 제조사에서 권장하는 방법에 따라 추출하였다. cDNA 합성 및 특이유전자 증폭은 Accupower RT-PCR 프리믹스 킷트(바이오니아(Bioneer co.), 한국 대전 소재)를 사용하여 제조사에서 권장하는 방법에 따라 RT-PCR을 실시하였다. 이때, RT-PCR 반응은 하기 표 2의 프라이머를 사용하였고, 반응 조건은 Lee 등(Lee 등, Avian Pathol, 2004)이 제시한 대로 수행하였다.
서열번호 프라이머 서열
1 5'-GCT GAT CAT GAG GTT ACC TC-3'
2 5'-AGT CGG AGG ATG TTG GCA GC-3'
상기의 프라이머들은 뉴캣슬병 바이러스 M 유전자의 1,055번째 부위에서 F 유전자의 508번째 부위까지 총 695 bp의 핵산이 증폭하도록 설계된 것이다. RT-PCR을 통하여 증폭된 695 bp의 핵산 물질은 아가로스겔 전기영동을 통하여 순수하게 추출하여 염기서열을 결정하였다. 염기서열 분석에는 사이클릭 시퀀싱 킷트(PRISM ready reaction dye terminator kit, Applied Biosystems사 제품)와 자동염기서열 분석장치(ABI PRISM version 377 DNA autosequencer, Applied Biosystems사 제품)를 사용하였다.
상기 과정을 통하여 결정한 695개의 핵산 염기서열 중 F 유전자의 첫 389개의 핵산 염기서열을 취하여 예측되는 아미노산 서열을 분석하였다. 그 결과, 뉴캣슬병 바이러스의 독력과 관련 있는 F0 단백질의 F1/F2 분절부위 아미노산은 112Gly(G)-Arg(R)-Gln(Q)-Gly(G)-Arg(R)-Leu(L)117의 아미노산 서열을 가지고 있었다 (도 1, 서열번호 3 및 4). 이와 같이 분절부위를 구성하는 아미노산들에서 연속적으로 염기성 아미노산을 구성하지 않는 것은 약독형 뉴캣슬병 바이러스들에서 나타나는 특징이다. 이러한 특징은 La Sota주, Ulster2C주, B1주, 및 VG/GA주 등 종래의 백신주들에서도 공통적인 특징이다. 그러므로, 실시예 1의 NDRL09-01주가 가지고 있는 F 단백질 분절부위의 아미노산 서열은 약독형 뉴캣슬병 바이러스임을 나타내는 병원성 마커(marker)일 뿐이며, 본 발명의 NDRL09-01주만이 가지고 있는 특징적인 것은 아니다.
실시예 1에서 분리한 NDRL09-01주의 유전형을 결정하기 위하여, 바이러스 F 단백질 유전자의 첫 389개의 핵산 염기서열을 취하여 NJ(neighboring-joining) 방법을 사용하여 계통분류학적 분석(phylogenetic analysis)을 실시하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 보여지는 바와 같이, 실시예 1의 NDRL09-01주는 La Sota주(IIa형), B1주(IIa형), VG/GA주(IIa형), Ulster2C주(Ic형) 및 V4주(Ia형) 등 종래의 백신 바이러스들과는 전혀 다른 새로운 유전아형(Id형)으로 분류되었다. 따라서, 본 발명자들은 신규 유전아형의 뉴캣슬병 바이러스인 실시예 1의 NDRL09-01주를 2010년 6월 25일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11718BP를 부여받았다.
다음으로, 본 발명의 NDV NDRL09-01주의 백신 바이러스로서의 효능을 평가하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
[시험예 1] 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01의 닭 장기친화성 조사
실시예 1의 NDRL09-01주의 장기 친화성을 조사하기 위하여 6주령 SPF 병아리 접종실험을 실시하였다. 즉, 8수의 SPF 닭에 수당 107 EID50의 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01주를 점안 접종(eye drop)하였다. 현재 뉴캣슬병 백신주로 사용 중인 La Sota주나 VG/GA주를 동일한 방법으로 접종한 각각의 실험군을 두어 비교하였다. 대조군에는 8수의 SPF 닭에 멸균 PBS 용액을 동일한 방법으로 접종하였다. 각 바이러스를 접종한 후 4일과 7일에 실험군마다 각각 닭 4수씩 안락사시켜 기관(trachea), 폐(lung), 십이지장(duodenum) 및 맹장편도(cecal tonsil)를 각각 채취하였다. 채취한 조직시료는 유발을 이용하여 유제한 다음 10%(w/v)가 되도록 멸균 PBS 용액을 첨가한 다음, 원심분리기에서 1,500 g에서 30분간 원심분리하여 그 상층액을 일회용 0.45 ㎛ 여과기로 여과하여 바이러스용으로 사용하였다. 각 시료를 실시예 1과 동일한 방법으로 SPF 종란에 접종하여 바이러스 분리를 시도하였다. 접종 종란의 장요막강액을 채취하여 닭 혈구를 응집시키는 경우 뉴캣슬병 바이러스가 분리된 것으로 잠정적으로 간주하고, 실시예 1과 동일한 RT-PCR 검사킷트(인트론바이오테크놀로지)로 뉴캣슬병 바이러스 여부를 최종 판단하였다. 각 바이러스의 친화성 장기조직을 조사한 결과를 표 3에 나타내었다.
본 발명의 NDRL09-01주의 닭에서의 장기친화성 실험결과
접종군 바이러스 장기별 바이러스 분리 결과
접종 4일째 접종 7일째
T* L* D* Ct* T L D Ct
G1 NDRL09-01 + + + + - - + +
G2 VG/GA + + + + - - + +
G3 La Sota + + - - + + - -
대조군 PBS - - - - - - - -
* T, 기관(trachea); L, 폐(lung); D, 십이지장(duodenum); Ct, 맹장편도(cecal tonsil)
표 3의 결과에서, 본 발명의 NDRL09-01주는 접종 후 4일과 7일 째에 호흡기(기관과 폐)와 소화기(십이지장, 맹장편도)에서 모두 바이러스가 증식되었다. 반면, La Sota주는 접종 후 4일과 7일 째에 호흡기(기관과 폐)에서만 바이러스가 증식되었다. 이러한 결과는 본 발명의 NDRL09-01주는 호흡기뿐만 아니라 소화 장기에서도 친화성이 있는 바이러스라는 것을 말해준다. 그러므로, 본 발명의 NDRL09-01주는 분무(호흡기 감염유도), 점안(하드레안선 국소면역 유도) 및 경구(소화기 감염유도) 등 다양한 방법으로 백신 접종을 실시하더라도 면역반응을 잘 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.
[시험예 2] 본 발명의 NDRL09-01주를 분무 접종한 닭에서의 면역반응 조사
닭에서 분무 접종에 의한 면역반응 효과를 조사하기 위하여 1일령 SPF 병아리에 분무 접종 실험을 실시하였다. 즉, 11수의 1일령 SPF 병아리에 실시예 1의 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01주를 수당 106.5EID50 농도로 분무접종(입자크기 60-80 ㎛)하였다. 뉴캣슬병 백신의 면역반응 비교를 위하여 이미 공지된 백신주인 VG/GA주와 La Sota주를 동일한 조건과 동일 개체수로 사용하였다. 또한, 동일 연령의 병아리 6 마리에 멸균 PBS 용액을 분무 접종하여 대조군으로 하였다. 모든 실험군에 대하여 접종 후 14일간 임상증상과 폐사 상황을 관찰하여 기록하였다. 뉴캣슬병 백신 접종후 면역반응 측정을 위하여 접종전과 접종 후 14일에 각각 모든 개체를 채혈하여 면역반응 정도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
1일령 SPF 병아리에 본 발명의 NDRL09-01주를 분무 접종한 실험결과
접종군 백신 접종 상황 폐사율* 평균 항체역가
(HI 역가, log2)
바이러스 접종경로 접종량 접종수수 접종 전 접종 14일 후
G1 NDRL09-01 분무 106.5EID50 11 0% 0 2.0±1.0
G2 VG/GA 분무 106.4EID50 11
0%		 0 2.6±1.0
G3 La Sota 분무 106.8EID50 11
27%		 0 5.5±2.6
대조군 PBS 분무 - 6
0%		 0 -
* (폐사수/접종수)×100
표 4의 결과에서 알 수 있듯이, 실시예 1의 NDRL09-01주를 접종한 실험군과 뉴캣슬병 VG/GA 백신주를 접종한 실험군에서 14일간의 실험기간 동안 폐사한 병아리가 관찰되지 않았다. 반면, 뉴캣슬병 La Sota 백신주를 접종한 실험군의 경우 접종개체의 27%(3/11수)가 호흡기 증상을 보이며 폐사하였다. 대조군은 14일간의 관찰기간 동안 어떠한 임상 증상을 나타내지 않았다.
또한, 백신접종 후 면역 형성 정도를 측정한 결과는 표 4에서 보여지는 바와 같다. 본 발명의 NDRL09-01주를 접종한 실험군은 평균 HI 항체가(log2 기준)가 2.0±1.0으로, 닭에서 호흡기 부작용이 있었던 La Sota 백신주 접종실험군(5.5±2.6) 보다는 면역반응이 낮고, VG/GA 백신주 접종 실험군(2.6±1.0)과는 유의성이 있는 차이를 보이지 않았다. 상기의 결과들을 종합해 볼 때 La Sota 백신주는 면역반응은 가장 우수하나 일부 닭을 폐사시킬 정도로 호흡기 부작용이 심하기 때문에 어린 연령에 생독 백신으로 사용하기에 적절하지 않으며, 본 발명의 NDRL09-01주는 닭에서 호흡기 증상 등 부작용이 없으면서 VG/GA 백신주와 유사한 면역반응을 나타내므로 뉴캣슬병 예방을 위한 분무용 백신으로 적합한 것을 확인할 수 있었다.
[시험예 3] 본 발명의 NDRL09-01주를 구강 및 점안으로 접종한 닭에서의 면역반응 조사
실시예 1의 NDRL09-01주의 닭에서의 음수접종이나 점안 접종에 의한 면역원성을 조사하기 위하여 1일령 10수의 SPF 병아리를 대상으로 접종실험을 실시하였다. 이들 SPF 병아리에 뉴캣슬병 바이러스 NDRL09-01주를 수당 107 EID50의 농도로 구강 및 점안으로 동시 접종을 실시하였다. 또한, 1일령 SPF 병아리 6수를 멸균 PBS 용액을 구강 및 점안으로 동시에 접종하여 대조군으로 하였다. 모든 실험군에 대하여 접종 후 14일간 임상증상과 폐사 상황을 관찰하여 기록하였다. 뉴캣슬병 백신 접종후 면역반응 측정을 위하여 접종 전과 접종 후 7일과 14일에 각각 모든 개체를 채혈하여 면역반응 정도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
접종군 바이러스 평균 항체역가 (HI 역가, log2)
접종 전 접종 7일 후 접종 14일 후
G1 NDRL09-01 0 3.7±2.1 5.1±3.3
대조군 PBS 0 0 0
표 5의 결과에서, 실시예 1의 NDRL09-01주를 접종한 군은 관찰기간 동안 어떠한 임상증상을 나타내지 않았으며, 접종 전에는 HI 항체가(log2 기준)가 검출되지 않았으나 7일후에는 3.7±2.1, 14일 후에는 5.1±3.3이었다. 대조군에서는 관찰기간 동안 어떠한 면역반응을 나타내지 않았다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 NDRL09-01주를 닭에 음수접종이나 점안접종으로도 조기에 보다 강한 면역반응을 유도하므로 닭에서 뉴캣슬병에 대한 면역 형성 효과가 매우 탁월함을 알 수 있다. 즉, 본 발명에 의한 NDRL09-01주는 분무, 경구 및 점안으로 접종하였을 때 강독형 뉴캣슬병 방어에 충분한 면역반응을 나타내었고, 이는 본 발명에 의한 NDRL09-01주를 분무, 음수 및 점안 등의 다양한 방법으로 접종하였을 때 강독형 뉴캣슬병에 대하여 방어 효능을 발휘할 수 있다는 것을 말해 준다. 그러므로 본 발명에 의한 NDRL09-01주는 강독형 뉴캣슬병에 의한 피해를 예방하기 위한 생독백신주로서 적합하다.
[시험예 4] 본 발명의 NDRL09-01주의 강독형 NDV에 대한 방어 효능 평가
실시예 1의 NDRL09-01주가 강독형 뉴캣슬병에 대한 방어 효능이 있는지를 조사하기 위하여, 상술된 실험들을 완료한 모든 실험군 닭들을 대상으로 국내 강독형 뉴캣슬병 바이러스인 교정원주(수당 106.3 EID50)를 근육으로 접종하고, 14일간 임상증상과 폐사 등을 관찰하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
실험군 백신주 접종수수 공격접종* 방어율**
G1 NDRL09-01 11 교정원주 81.8%(9/11)
G2 VG/GA 11 교정원주 63.6%(7/11)
G3 La Sota 8 교정원주 75.0%(6/8)
대조군 PBS 6 교정원주 0%(0/6)
* 마리당 106.3 ELD50의 바이러스를 근육내 접종
** 생존수/접종수*100
표 6의 결과에서, 본 발명에 의한 NDRL09-01주로 접종한 실험군은 강독형 뉴캣슬병 바이러스로 인공감염시켰을 때 관찰기간 동안 방어율이 81.8%(9/11수)이었다. 다른 백신주인 VG/GA백신주 및 La Sota주로 접종한 실험군의 방어율은 각각 63.6%(7/11수) 및 75.0%(6/8수)이었다. 대조군의 경우 접종 후 5일 이내에 모두 폐사하였다(방어율 0%). 상기 결과로부터, 본 발명에 의한 NDRL09-01주가 다른 백신주에 비해 강독형 뉴캣슬병에 대해 가장 우수한 방어 효능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
[시험예 5] 본 발명에 의한 NDRL09-01주의 닭에서의 병원성 회복여부 시험
3일령 내지 5일령 SPF 닭 최소 3수에 실시예 1의 NDRL09-01주를 수당 0.1㎖ (107.5 EID50)씩 경구 및 점안으로 동시에 접종하였다. 접종 5일째 닭을 안락사시킨 후 기관(trachea)을 채취하였다. 그 후 기관을 무균적으로 채취하여 항생제가 함유된 PBS용액으로 10%가 되도록 유제한 다음 다시 새로운 SPF 닭에 동일한 방법으로 접종하였다. 이러한 방법으로 닭에서 6회 반복 계대하였으며, 최종 6대 계대한 계대시료는 실시예 3과 동일한 방법으로 1일령 SPF 병아리에서 뇌 내 병원성 지수(ICPI)를 측정하였다.
그 결과, 닭에 6대 역계대한 1일령 SPF 병아리에서 NDRL09-01주의 뇌내병원성지수(ICPI)는 약독형(0.6 이하)의 범주에 해당하는 0.15로 나타났다. 이로부터, 본 발명에 의한 NDRL09-01주는 닭에 역계대한 후에도 병원성을 회복하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC11718BP 20100625
<110> REPUBLIC OF KOREA(Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries. National Veterinary Research and Quarantine Service(NVRQS)) <120> New subtype vaccine strain of lentogenic Newcastle disease virus and the viral vaccine comprising thereof <130> YPD/201005-0011 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gctgatcatg aggttacctc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agtcggagga tgttggcagc 20 <210> 3 <211> 389 <212> DNA <213> Newcastle disease virus F protein gene <220> <221> CDS <222> (1)..(387) <400> 3 atg ggc tcc aga tct tct acc agg atc tca gta cct ctg atg cta act 48 Met Gly Ser Arg Ser Ser Thr Arg Ile Ser Val Pro Leu Met Leu Thr 1 5 10 15 gtt cgg gtc gcg ctg gca ctg tgt tgc gtc cgt ctg aca agt tcc ctt 96 Val Arg Val Ala Leu Ala Leu Cys Cys Val Arg Leu Thr Ser Ser Leu 20 25 30 gat ggc agg cct ctt gca gct gca ggg att gtg gta aca gga gat aaa 144 Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys 35 40 45 gca gtc aac ata tac acc tca tcc cag aca ggg tcg atc ata gtc aag 192 Ala Val Asn Ile Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys 50 55 60 tta ctc ccc aat atg ccc aag gac aaa gag gca tgt gca aaa gcc ccg 240 Leu Leu Pro Asn Met Pro Lys Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro 65 70 75 80 ttg gaa gcg tac aac agg aca ttg act act ctg ctc acc ccc ctt ggt 288 Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly 85 90 95 gat tct atc cgt agg ata caa gag tcc gtg act aca tct gga gga ggg 336 Asp Ser Ile Arg Arg Ile Gln Glu Ser Val Thr Thr Ser Gly Gly Gly 100 105 110 aaa cag gga cgc ctt ata ggc gct att atc ggt ggt gcg gct ctc gga 384 Lys Gln Gly Arg Leu Ile Gly Ala Ile Ile Gly Gly Ala Ala Leu Gly 115 120 125 gtt gc 389 Val <210> 4 <211> 129 <212> PRT <213> Newcastle disease virus F protein gene <400> 4 Met Gly Ser Arg Ser Ser Thr Arg Ile Ser Val Pro Leu Met Leu Thr 1 5 10 15 Val Arg Val Ala Leu Ala Leu Cys Cys Val Arg Leu Thr Ser Ser Leu 20 25 30 Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys 35 40 45 Ala Val Asn Ile Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys 50 55 60 Leu Leu Pro Asn Met Pro Lys Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro 65 70 75 80 Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly 85 90 95 Asp Ser Ile Arg Arg Ile Gln Glu Ser Val Thr Thr Ser Gly Gly Gly 100 105 110 Lys Gln Gly Arg Leu Ile Gly Ala Ile Ile Gly Gly Ala Ala Leu Gly 115 120 125 Val

Claims (9)

  1. 기탁번호 KCTC 11718BP의 뉴캣슬병 바이러스 백신주.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 뉴캣슬병 바이러스 백신주는 F 단백질의 핵산 염기서열을 기초로 계통분류학적 분석에서 제1형의 유전형 I의 유전아형 d(Id)에 속하는 것인 뉴캣슬병 바이러스 백신주.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 뉴캣슬병 바이러스 백신주는 닭의 호흡기 및 소화기에 친화성을 보이는 것인 뉴캣슬병 바이러스 백신주.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 뉴캣슬병 바이러스 백신주는 닭의 호흡기 및 소화기에서 국소적으로 증식하여 점막면역을 형성하는 바이러스인 뉴캣슬병 바이러스 백신주.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 의한 뉴캣슬병 바이러스 백신주를 포함하는 뉴캣슬병 예방용 백신.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 백신은 음수, 점안 또는 분무 방식으로 닭에 접종되는 것인 뉴캣슬병 예방용 백신.
  7. 삭제
  8. 제 5항에 있어서, 상기 백신은 수의학적으로 수용가능한 매개체 또는 부형제를 포함하는 것인 뉴캣슬병 예방용 백신.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 백신은 아주번트를 추가로 더 포함하는 것인 뉴캣슬병 예방용 백신.
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