KR101104911B1

KR101104911B1 - 비병원성 전염성낭병 바이러스 및 이의 백신으로서의 용도

Info

Publication number: KR101104911B1
Application number: KR1020100035668A
Authority: KR
Inventors: 권혁준; 김선중; 안영진; 조선희; 김태은; 김재홍; 박영호; 김채현; 정청환
Original assignee: 주식회사 바이오포아
Priority date: 2010-04-19
Filing date: 2010-04-19
Publication date: 2012-01-12
Also published as: KR20110116315A

Abstract

본 발명은 전염성낭병에 대하여 백신 효능이 우수한 신규한 비병원성 전염성낭병 바이러스(BP-IBDVac), 이를 포함하는 전염성낭병 백신, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

비병원성 전염성낭병 바이러스 및 이의 백신으로서의 용도{Avirulent infectious bursal disease virus and use thereof as a vaccine}

닭의 전염성낭병 (Infectious bursal disease: IBD)은, 일명 감보로병(Gumboro disease)으로도 알려진 병으로, IBD 바이러스(IBDV)에 의하여 발병되는 전염병이다. IBDV는 Family Birnaviridae에 속하며 게놈은 두 가닥(double-stranded)인 RNA 2개 (A와 B)　분절로 이루어져 있으며 분절 A에는 VP5, VP2-VP4-VP3 유전자가 있고, 분절 B에는 RNA polymerase인 VP1 유전자가 있다. 병은 닭의 체액성 면역의 중심 기관인 Fabricius 낭(Bursa of Fabricius: F-낭)을 집중적으로 파괴하여 면역억제를 일으키는 병으로, 급성 폐사뿐 아니라 2차 감염에 의해 경제적 피해를 초래하는 질병이다.

이 병을 예방하기 위한 IBD 백신주는 병원성에 따라 약독, 중간독, 중간독 플러스(+)로 분류되는데, 살아있는 바이러스를 감염시키는 경우 약독주의 경우 F낭의 위축을 초래하지 않으나 중간독주와 중간독+주는 약하거나 뚜렷한 위축을 초래한다. F낭이 위축되는 원인은 F낭에 존재하는 미성숙 B-세포들이 IBDV에 의해 죽기 때문인데 이러한 미성숙 B-세포들은 향후 분화하여 다양한 병원체에 결합할 수 있는 항체를 만들게 되므로 F낭 위축은 체액성 면역을 억제하는 결과를 초래한다.

백신 접종 방법 중에는 발육중인 18일령 계태아에 난각을 뚫고 접종하는 in ovo 백신법이 있는데, 이 방법은 자동화되어 대량 작업이 가능하고, 백신을 개별 개태아에 직접 접종하므로 가장 효과적인 백신법으로 알려져 있으나 18일령 계태아는 외부 자극에 민감하여 백신주의 병원성이 있는 경우 부화하지 못해 오히려 문제를 일으키므로 in ovo 백신이 가능할 정도로 병원성이 낮은 백신주의 개발이 중요하다.

경제성 있는 백신을 생산하기 위해서는 그에 맞는 생산시스템이 필요한데 고병원성 IBDV는 계태아유래 세포나 세포주에서 증식이 일어나지 않아 바이러스를 얻기 위해서는 감수성 있는 SPF(specific pathogen free) 닭에 감염시킨 후 F낭을 유제하여야 하므로 직접 백신으로 생산하는데 비용이 많이 들며, 세포주나 초대배양세포에 적응시켜 배양세포에서 증식 가능한 고병원성 IBDV주와 적응 관련 VP2 유전자의 돌연변이도 알려져 있으나 현재 이러한 바이러스를 이용한 백신은 개발되어 있지 않다. 또한 계태아 섬유아세포에서 증식 가능한 IBDV는 원가대비 증식성이 비교적 낮고, 백신 생산을 위한 숙주 시스템으로 Vero 세포주가 가장 좋은 것으로 알려져 있으나(US 6,129,920), 이에 대한 검증이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 야외 가검물 시료를 계태아의 섬유아세포에 접종하여 분리한 비병원성 전염성낭병 바이러스(BP-IBDVac)가 18일령 계태아와 SPF 닭에 대한 병원성이 없고, 면역원성이 뛰어나, 사독백신뿐 아니라 in ovo 백신이나 생독백신으로 사용할 수 있으며, 접종시 고병원성 IBDV 감염에 의한 폐사와 F-낭의 위축을 방어할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일례는 신규한 비병원성 전염성낭병 바이러스 (BP-IBDVac) 균주를 제공하는 것이다.

또 다른 예는 상기 비병원성 전염성낭병 바이러스 (BP-IBDVac) 균주 및/또는 이의 배양물의 전염성낭병에 대한 백신으서의 용도를 제공하는 것이다.

또 다른 예는 상기 비병원성 전염성낭병 바이러스 (BP-IBDVac)를 최적의 배지 조건에서 배양하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 SPF 닭 및/또는 계태아에 대한 병원성이 없고, 계태아 섬유아세포 및 다양한 세포주에서 증식 가능한 비병원성 전염성낭병 바이러스 (BP-IBDVac) 균주, 이의 백신으로서의 용도 및 그 생산 방법에 관한 것이다.

우선, 야외 가검물 시료를 계태아의 섬유아세포에 접종하여 분리한 비병원성 전염성낭병 바이러스(BP-IBDVac) 균주가 제공된다.

상기 계태아는 5 내지 15일령, 바람직하게는 10-12일령인 것일 수 있다.

상기 비병원성 전염성낭병 바이러스(BP-IBDVac) 균주의 게놈 염기서열과 VP(viral protein)1, VP2-VP4-VP3, 및 VP5 단백질의 아미노산 서열을 분석한 결과, 게놈 염기서열은 서열번호 11(A 분절)과 서열번호 12(B 분절) 염기서열로 표현되며, VP1, VP2-VP4-VP3, 및 VP5 단백질은 각각 서열번호 13(VP1 단백질), 서열번호 14(VP2-VP4-VP3 단백질), 및 서열번호 15(VP5 단백질)의 아미노산 서열을 갖는 것으로 나타났다.

본 발명에서 분리된 비병원성 전염성낭병 바이러스(BP-IBDVac) 균주의 게놈 염기서열인 서열번호 11과 서열번호 12를 전염성낭병 바이러스에 속하는 균주들과 비교 분석 결과, 서열번호 11 (분절 A) 경우, 97.8%(Edgar AY918950 embryo-adapted (3195/3266)), 98.5%(Edgar AY462026 tissue culture-adapted (3214/3264)) 또는 99.3%(Lukert AY918948 (3239/3261)), 서열번호 12 (분절 B) 경우, 99.5%(Lukert AY918947 (2814/2828)) 또는 99.9%(Edgar AY459320 (2825/2827), Edgar AY918949 (2820/2827))의 서열상동성을 보이는 것으로 나타났다. 이 결과로부터 본 발명에서 분리된 비병원성 전염성낭병 바이러스(BP-IBDVac) 균주가 전염성낭병 바이러스에 속하는 균주임을 확인하였다.

한편, 전염성낭병 바이러스 사이에 비교적 아미노산 변이빈도가 높은 VP2-VP4-VP3 단백질의 아미노산 서열을 비교한 결과, 본 발명의 비병원성 전염성낭병 바이러스(BP-IBDVac) 균주의 VP2-VP4-VP3 단백질의 아미노산 서열(서열번호 14, A 분절로부터 번역된 폴리프로테인)은 다른 전염성낭병 바이러스와 비교하여 다양한 아미노산 치환을 보이는 것으로 나타났다 (표 1 참조). 이러한 변화는 전염성낭병 바이러스가 단지 아미노산 1개 또는 2개가 변해도 숙주세포의 범위가 달라지거나 항원성이 변화한다는 사실을 고려할 때 결코 작은 변이가 아니며, 따라서, 본 발명의 비병원성 전염성낭병 바이러스(BP-IBDVac) 균주가 기존의 전염성낭병 바이러스 균주들과는 다른 신규한 균주임을 의미하는 것이다.

따라서, 본 발명의 일례는 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 VP2-VP4-VP3 단백질을 생산하는 것을 특징으로 하는 비병원성 전염성낭병 바이러스(BP-IBDVac) 균주를 제공한다.

상기 균주는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VP1 단백질 및/또는 서열번호 5의 VP5 단백질을 생산하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 균주는 게놈 서열이 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 표현되는 것일 수 있다.

구체예에서, 상기 균주는 기탁번호 KCTC 18189P의 균주일 수 있다.

또한 본 발명자들은 상기 BP-IBDVac 균주의 병원성과 면역원성을 알아보기 위해 18일령 계태아에 1x10⁶ 및 1x10⁴TCID₅₀의 바이러스를 접종하여 부화율을 측정한 결과 PBS만 접종한 경우 87.5%(7/8), 1x10⁶TCID₅₀접종군은 62.5%, 1x10⁴TCID₅₀ 접종군은 75.0%였고, 부화 후 14일령과 32일령에 채혈하여 BP-IBDVac를 사용하여 중화시험을 수행한 결과 14일령의 경우 1x10⁶TCID₅₀ 접종군은 평균 7.0, 1x10⁴TCID₅₀ 접종군은 평균 4.8, 32일령의 경우 1x10⁶TCID₅₀ 접종군은 평균 7.25, 1x10⁴TCID₅₀ 접종군은 평균 5.0의 중화항체가를 보여 in ovo 백신으로서의 효능이 확인되었고, 37일령 부검하여 BB ratio를 측정한 결과 시험군간 유의적인 차이를 보이지 않아 BP-IBDVac에 의한 비가역적 면역억제는 관찰되지 않아 안전성과 면역원성이 확인되었다.

또한 본 발명자들은 BP-IBDVac의 사독오일백신으로써의 효능을 알아보기 위해 BP-IBDVac으로 제조한 사독오일백신 및 인터베트코리아의 GNI 사독오일백신 접종 3주후 채취한 혈청으로 AGPT 및 바이러스 중화시험 실시하여 IBDV 항체 측정한 결과 AGP 검사법에서는 모두 양성을 보였으며 BP-IBDVac을 이용한 바이러스 중화 시험법에서 3주에 채취한 혈청의 경우 BP-IBDVac에서 비교적 높은 중화항체가를 얻을 수 있었으나 4주에는 인터베트 백신 접종군과 차이를 보이지 않았다. 또한 고병원성 IBDV(SNU1035C)로 공격하였을 때 폐사율과 F-낭 위축을 완벽하게 방어하는 것으로 나타났다.

이와 같이, 본 발명의 비병원성 전염성낭병 바이러스(BP-IBDVac) 균주는 우수한 면역원성과 함께 안전성을 가지며, 사독백신뿐 아니라 in ovo 백신과 생독백신으로서도 안전하고 유효하게 사용될 수 있음이 확인되었다.

따라서, 본 발명의 다른 예는 상기 비병원성 전염성낭병 바이러스(BP-IBDVac) 균주 및/또는 상기 균주의 무세포, 또는 세포-포함 배양물을 포함하는 전염성낭병의 백신 조성물을 제공한다.

구체예에서, 상기 백신은 생독백신, 사독백신 및/또는 in ovo 백신일 수 있다.

상기 배양물은 상기 비병원성 전염성낭병 바이러스(BP-IBDVac) 균주를 배양하여 얻어진 무세포(cell-free) 또는 세포 포함 배양물일 수 있다.

본 발명의 비병원성 전염성낭병 바이러스(BP-IBDVac) 균주는 계태아 추출물, 바람직하게는 16일령 내지 21일령의 계태아 추출물, 더욱 바람직하게는 18일령 내지 부화 직전의 계태아 추출물을 포함하는 배양배지에서 배양하는 경우, 증식율이 우수한 것으로 나타났다. 또한, 계태아 섬유아세포 (예컨대, 5 내지 15일령, 바람직하게는 10 내지 12일령의 계태아 섬유아세포), 및/또는 다양한 포유류 유래 세포, (예컨대, ST(swine testis, CRL-1746) 세포, 또는 PK-15(porcine kidney-15, CCL-33) 세포 등)에서 배양시 증식율이 우수한 것으로 나타났다.

따라서, 상기 배양물은 상기 비병원성 전염성낭병 바이러스(BP-IBDVac) 균주를 5 내지 15일령, 바람직하게는 10 내지 12일령의 계태아 섬유아세포, ST세포, 또는 PK-15세포, 및/또는 16일령 내지 21일령, 바람직하게는 18일령 내지 21일령의 계태아 추출물을 포함하는 배양 배지에서 배양하여 얻어진 것일 수 있다.

상기 계태아 추출물은 16일령 내지 21일령, 바람직하게는 18일령 내지 21일령의 계태아를 세절하고, 세절한 계태아에 완충용액을 첨가하여 유효성분을 추출한 것일 수 있다. 상기 21일령은 부화 직전의 계태아를 포함하는 의미이다.

상기 계태아는 난황을 제거을 제거하여 사용하는 것이 배양 효율을 높일 수 있어서 바람직하다. 또한 계태아의 세절 크기는 적절하게 조절 가능하며, 예컨대 가로x세로x높이가 각각 0.1-10mm x 0.1-10mm x 0.1-10mm일 수 있으나 이에 제한 되는 것은 아니다.

상기 세절된 계태아는 인산완충용액, 식염수, 및 평형염용액(balanced salt solution) 등으로 구성된 군에서 선택되는 용매에서 추출될 수 있다. 상기 용매는 중성의 pH, 예컨대, pH 6-8을 갖는 것일 수 있으며, 추출 온도는 약 0℃ 내지 실온 (약 25℃), 바람직하게는 냉장온도, 예컨대 2 내지 8℃ 정도로 하고, 추출 시간은 약 1 내지 12시간, 바람직하게는 3 내지 10 시간 정도로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.　 사용되는 용매의 양은 세절된 계태아 중량을 기준으로 1:0.5 내지 1.5 (계태아:용매), 바람직하게는 대략 동량으로 하는 것이 좋다.

배양 효율을 고려하여, 계태아 추출물의 첨가량은 배지 전체 중량에 대하여 0.1 내지 50중량%, 바람직하게는 1 내지 20 중량%, 더욱 바람직하게는 3 내지 15 중량%, 예컨대, 5 내지 10 중량% 범위로 할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 통상의 방부제, 안정제, 및/또는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명자들은 상기 비병원성 전염성낭병 바이러스(BP-IBDVac)의 생산성을 높이기 위해 계태아 섬유아세포 뿐 아니라 다양한 포유류 유래의 세포주와, 배지 첨가제로 통상적으로 사용하는 우혈청 이외에 16일령 내지 21일령, 바람직하게는 18일령에서 부화 직전 계태아를 사용해 제조한 계태아 추출물을 첨가제로 사용하여 증식성을 비교한 결과 포유류 유래의 PK-15와 ST 세포주에서의 증식성이 기존에 증식성이 좋은 것으로 알려진 Vero 세포주보다 뛰어나다는 사실을 확인하였고, 우혈청보다는 계태아 추출물을 첨가 하였을 때 생산성이 더 높다는 사실을 확인하여 새로운 IBDV 배양법을 개발하였다.

또 다른 예에서, 본 발명은 상기 비병원성 전염성낭병 바이러스(BP-IBDVac)의 배양 방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 상기 배양 방법은 상기 비병원성 전염성낭병 바이러스 균주를 5 내지 15일령, 바람직하게는 10 내지 12일령의 계태아 섬유아세포, ST세포, 또는 PK-15세포에서 16 내지 21일령의 계태아 추출물을 포함하는 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 비병원성 전염성낭병 바이러스 (BP-IBDVac) 및 그의 생산법은 전염성낭병 예방을 위한 백신을 제조하는데 유용하게 사용될 수 있을 뿐 아니라 그 게놈 염기서열과 전염성낭병 바이러스 배양용 세포주 및 배양액 조성은 새로운 백신을 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 BP-IBDVac의 포유류 세포주에서의 증식성을 형광항체법으로 검사한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> BP - IBDVac 의 게놈 염기서열 결정 및 VP1 , VP2 - VP4 - VP3 , 및 VP5 아미노산 서열 분석

<1-1> 바이러스의 분리

야외 육계 농장으로부터 의뢰된 육계로부터 하안검, 기관, 맹장편도(cecal tonsil), F-낭을 채취하여 멸균 인산완충용액(pH7.2)을 넣어 10중량%의 유제액을 만들었다. 이를 3,000g에서 15분간 원심분리하여 세포와 조직을 침전시키고, 상층액을 0.4㎛의 주사기 여과기로 여과하였다. 10내지 12일령 SPF 발육란(SPAFAS, USA)으로부터 얻은 계태아 섬유아세포를 199 배지(GIBCO-BRL, NY, USA)와 F10 배지(GIBCO-BRL, NY, USA)를 1:1로 혼합하고, 5% 우태혈청(fetal bovine serum, FBS)(GIBCO-BRL, NY, USA))을 첨가한 배지에 부유하여 24-웰 배양용기에 배양하고 상기에서 얻어진 여과액을 각 웰에 50㎕씩 3개-웰에 접종하여 1주일간 5% CO₂ 농도로 37℃에서 배양하였다. CPE (cytopathic effect, 세포변성효과로서, 바이러스가 세포에 감염되어 증식시 세포가 사멸하는 세포 변화를 의미)가 관찰된 웰의 배양액을 수확하여 6-웰에 배양한 계태아 섬유아세포에 다시 100㎕씩 접종하여 상기 조건과 동일한 조건 하에서 7일간 배양하였다.

각 6-웰로부터 수확된 배양액 500㎕를 T75 배양용기에서 계태아 섬유아세포와 함께 상기 조건 하에서 배양하고, 7 일후 상층액의 바이러스를 수확한 후 -70℃에서 보관하였다. 96-웰 배양용기에 계태아 섬유아세포를 배양하여 보관한 바이러스를 배양 배지로 10진 희석한 후, 웰당 10㎕씩 접종하여 7일간 배양하여 바이러스 역가(TCID₅₀)를 정해진 계산식에 따라 계산하였으며, 이에 따라 한계희석법으로 바이러스를 클로닝 하였다(Reed, L.J. & Muench, H. American Journal of Hygiene, 27:493-497, 1938). 즉 10진 희석으로 12단계 희석한 바이러스를 96-웰 배양용기에 8반복 접종한 후 7일간 배양하며 CPE를 관찰하였으며, 계산된 역가를 고려하여 한계 희석배수에서 CPE를 보이는 8개중 1-2개의 웰에서 배양액을 수확하여 상기의 방법으로 바이러스를 증식시켰고, 동일한 과정을 3회 반복하여 얻어진 바이러스를 BP-IBDVac으로 명명하였다. 상기 바이러스 BP-IBDVac는 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 2010.03.11자로 기탁되어 기탁번호 KCTC 18189P를 부여 받았다.

<1-2> RNA 분리와 RT - PCR

바이러스 게놈 RNA는 산-구아니디넘-페놀(acid-guanidinium-phenol) 방법(Chomzinski and Sacci, 1985)에 의해 요막액으로부터 추출하였다.

구체적으로 10내지 12일령 SPF 발육란(SPAFAS, USA)에 바이러스를 접종하고 3일 후 수확한 요막액 100 ㎕를 1 ㎖의 TRI 반응물(MRC co., MA)에 첨가하여 추출하고, RNA 침전물을 0.1%(w/v) DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 일차증류수(DW) 50 ㎕로 녹였다. 상기에서 추출한 RNA 1 ㎕, 랜덤 헥사머(random hexamer, Bioneer Co., Korea, 20 ng/㎕) 1 ㎕, 5x 1st 가닥 버퍼 2 ㎕, DEPC 처리된 DW 4.5 ㎕를 잘 섞어서 72℃에서 15분간 반응시키고 얼음에 냉각하였다. dNTPs(Bioneer co., Korea) 1 ㎕와 MMLV 역전사 효소(Superscript Ⅱ, Gibco, BRL) 0.5 ㎕를 상기 반응물에 첨가하여 42℃에서 60분간 반응시키고, 역전사 효소는 94℃에서 5분 동안 처리하여 불활성화 시켰다.

이와 같이 얻어진 cDNA를 4배 희석한 cDNA 용액 1 ㎕, 10x PCR 버퍼 1 ㎕, 2.5 mM dNTPs 0.2 ㎕, 하기의 서열번호 1 내지 서열번호　10으로 기재되는 각각의 프라이머 2 ㎕, Taq 중합효소(Bioneer co., 1 U/㎕) 1 ㎕ 및 DW 7.2 ㎕를 혼합하였다.

서열번호 1

SA-F GGATACGATSGGTCTGAY

서열번호 2

P2R TCAGGATTTGGGATCAGC

서열번호 3

P3F GCCCAGAGTCTACACCATAACTGC

서열번호 4

SA-VP-R ATAGCGTGGCACCCTCTCT

서열번호 5

SA-VP-F CGTCAGGAAAAGCAAGRGCY

서열번호 6

SA-R-1-1 GAGGGGACCCGCGAACGGATCCA

서열번호 7

SB-F GGATRCGATGGGTCTGAMCCT

서열번호 8

SB-VPIR TGTCATCAATGGACCTCTCA

서열번호 9

SB-VPIF GAATGCAGCCACGTTCATCA

서열번호 10

SB-R1 GGGGGCCCCCGCAGGCGAA

상기 반응액을 94℃에서 4분 동안 변성시킨 후, 94℃ 30초, 52℃ 10초, 72℃ 60초로 35번 반복 실시하고 난 뒤 72℃에서 7분간 더 반응시켰다. 이와 같이 얻어진 PCR 산물은 2중량% 아가로스 젤에서 전기영동 하여 EtBr로 염색하여 관찰하였다.

<1-3> 게놈염기서열 결정 및 아미노산 서열 분석

실시예 <1-2>에서 증폭된 RT-PCR 증폭산물을 정제하여 ABI3100 자동염기서열분석기를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 그 결과 서열번호 11 (분절 A)과 서열번호 12 (분절 B)로 표시되는 본 발명의 BP-IBDVac의 게놈 염기서열을 얻었으며, 이로부터 Bioedit (Ver 3.0)을 이용하여 서열번호 13 내지 15로 표시되는 VP1 (서열번호 13), VP2-VP4-VP3 (서열번호 14), 및 VP5 (서열번호 15) 단백질의 아미노산 서열을 얻었다.

얻어진 서열들을 GenBank 상에 등록된 국내외 전염성낭병 바이러스들과 BLAST 검색(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)과 Bioedit 프로그램을 사용하여 비교 분석하였다. 그 결과, BP-IBDVac의 게놈 염기서열 서열번호 11은 GenBank 상의 Lukert 주(AY918948)와 99.3%, Edgar(CEF) 주(AY462026)와 98.5%, 서열번호 12는 Lukert 주(AY918947)와 99.5%, Edgar(CEF) 주(AY459320) 주와 99.9% 일치하였다. 전염성낭병 바이러스 사이에 비교적 아미노산 변이빈도가 높은 VP2-VP4-VP3 단백질의 아미노산 서열인 서열번호 14는 다양한 아미노산 치환을 보였으며, 이를 아래의 표 1에 정리하였다.

BP-IBDVac의 VP2-VP4-VP3 polyprotein의 아미노산 서열 비교

코돈	BP-IBDVac	Lukert	Edgar	코돈	BP-IBDVac	Lukert	Edgar
132	S	N	-	444	F	-	L
137	T	S	-	445	K	-	R
138	D	E	-	447	I	-	R
143	G	E	-	448	I	-	A
144	L	F	-	450	A	-	Y
145	M	A	-	451	I	-	L
146	S	P	-	452	R	-	S
147	A	S	-	453	R	-	L
251	S	R	-	456	V	-	L
253	H	Q	-	457	P	-	L
314	T	A	-	460	S	-	F
430	A	-	N	461	T	-	S
431	D	-	G	467	A	-	E
432	L	-	R	468	P	-	L
437	K	-	H	471	L	-	H
438	I	-	T	686	V	-	I
439	A	-	G	858	I	-	F
442	F	-	L	948	V	-	A

이러한 변이는 IBDV의 VP2-VP4-VP3 단백질의 아미노산이 단지 1개 또는 2개가 변해도 숙주세포의 범위가 달라지거나 항원성이 변화한다는 사실을 고려할 때 결코 작은 변이가 아니며, 본 발명의 BP-IBDVac주가 기존의 바이러스와 비교하여 신규한 균주임을 입증하는 것이다.

< 실시예 2> BP - IBDVac 의 특성 분석

<2-1> BP - IBDVac 의 18일령 계태아 안전성 및 in ovo 백신 효능

BP-IBDVac의 in ovo 안전성 및 in ovo 백신 효능을 알아보기 위하여, 발육중인 18일령 SPF(specific pathogen free) 계태아(SPAFAS, USA)에 1x10⁶ 및 1x10⁴TCID₅₀의 바이러스(BP-IBDVac)를 in ovo injection 하여 부화율(표 2), 14일령과 32일령에 중화항체가(표 3), 37일령에 BB ratio [F-낭 중량(g)/체중(g) x 1000](표 4)를 측정하였다. BP-IBDVac의 부화율에 대한 영향을 아래의 표 2에 나타내었다.

BP-IBDVac의 부화율에 대한 영향

시험군	부화율(빈도)
대조군	87.5%(7/8)
1x10⁴TCID₅₀ 접종군	75.0%(6/8)
1x10⁶TCID₅₀ 접종군	62.5%(5/8)

표 2에 나타낸 바와 같이, 대조군(무접종)은 87.5%, 1x10⁴TCID₅₀ 접종군은 75.0%, 1x10⁶TCID₅₀ 접종군은 62.5%의 부화율을 보였다.

부화한 병아리들을 사육하여 14일령과 32일령에 채혈하고 혈청을 분리하여 바이러스 중화시험을 수행하였다. 바이러스 중화시험을 위해 혈청은 56℃에서 30분간 비동화 하였다. 이 혈청을 시험관에서 PBS로 2진 희석한 후, 96-웰 플레이트에 100㎕씩 옮기고, 동량의 바이러스(BP-IBDVac) (100 TCID₅₀/25㎕)를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 중화시켰다. 상기에서 중화한 중화재료 25㎕와 10내지 12일령 SPF 계태아에서 채취한 섬유아세포를 배양 배지(199 배지(GIBCO-BRL, NY, USA)와 F10 배지(GIBCO-BRL, NY, USA)를 1:1로 혼합한 배지)에 부유한 부유액 100㎕를 각 96-웰에 접종하였다. 37℃에서 4일간 배양하여 완전 중화가 일어나 세포변성효과가 전혀 나타나지 않은 최고 희석 배수의 역수를 중화 역가로 하였다. 이와 같이 얻어진 결과를 아래의 표 3에 나타내었다.

BP-IBDVac의 in ovo 백신 효능

시험군	바이러스 중화항체(평균± 표준편차)
시험군	14일령	32일령
대조군	0.00	0.00
1x10⁴TCID₅₀ 접종군	4.83± 3.13	5.00± 4.00
1x10⁶TCID₅₀ 접종군	7.00± 1.15	7.25± 1.50

표 3에서 확인되는 바와 같이, 대조군에서는 항체가 검출되지 않았으나, 1x10⁴TCID₅₀ 접종군은 평균 4.8과 5.0의 중화항체를 보이고, 1x10⁶TCID₅₀ 접종군은 평균 7.0과 7.3의 중화항체를 보여, 본 발명의 바이러스 BP-IBDVac가 in ovo 백신으로서 효능이 있음이 확인되었다

F-낭의 위축여부를 알아보기 위하여, 부화한 병아리들을 37일령에 희생시켜 BB-율[(F-낭 중량(g)/체중(g))x1000]을 측정하여, 그 결과를 아래의 표 4에 나타내었다.

BP-IBDVac의 F-낭에 대한 영향

시험군	중량(그램)		BB-율	평균 BB-율 (±표준편차)
시험군	체중	F-낭	BB-율	평균 BB-율 (±표준편차)
대조군	288	1.38	4.8	5.4 ± 1.2
	266	1.77	6.7
	260	1.82	7.0
	216	0.98	4.5
	310	1.32	4.3
	234	1.44	6.2
	140	0.59	4.2
1x10⁴TCID₅₀ 접종군	266	1.35	5.1	4.5 ± 0.9
	272	1.54	5.7
	218	0.82	3.8
	228	1.02	4.5
	208	0.71	3.4
1x10⁶TCID₅₀ 접종군	284	1.50	5.3	6.2 ± 0.8
	222	1.32	5.9
	216	1.55	7.2
	276	1.76	6.4

표 4에 나타난 바와 같이, F-낭 비율에 있어서 대조군 대비 접종군에서 유의적인 차이가 관찰되지 않았으며(p>0.01), 이는 BP-IBDVac에 의한 F-낭 위축은 일어나지 않아 안전성이 확보됨을 의미하는 것이다.

즉, 표 3 및 4에서, 본 발명의 바이러스 BP-IBDVac는 in ovo 백신으로서 효능이 우수함과 동시에 안정성도 확보됨을 알 수 있다.

<2-2> BP - IBDVac 의 SPF 닭에 대한 안전성 및 생독백신 효능

생독백신으로서 사용시의 BP-IBDVac의 SPF 닭에 대한 안정성을 확인하기 위하여, F-낭이 성숙 단계에 있는 SPF 닭에서의 폐사율을 조사하였다. SPF 종란(SPAFAS, USA)을 자체 부화하여 얻은 46일령 SPF 11수에 BP-IBDVac 5x10⁶TCID₅₀/20㎕를 점안 접종한 후 임상증상 및 폐사율을 14일간 관찰하였고, 21일 후에 채혈하여 실시예 2-1과 동일한 방법으로 중화항체를 측정하였다. 그 결과 14일간 침울이나 깃털 역립은 관찰되지 않았으며 폐사도 없었다. BP-IBDVac 접종 후 21일에 채혈하여 분리한 혈청으로 바이러스 중화시험 결과를 표 5에 나타내었다.

BP-IBDVac의 생독백신 효능

	바이러스 중화항체 역가
	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	평균 ± 표준편차
BP-IBDVac							1		4	6				8.36 ± 0.92

표 5에 나타낸 바와 같이, 평균 8.36의 중화항체를 보여, 본 발명의 바이러스 BP-IBDVac 생독백신으로서 유용함이 확인되었다.

<2-3> BP - IBDVac 사독오일백신의 효능

BP-IBDVac의 사독오일백신으로써의 효능을 알아보기 위하여, SPF 종란(SPAFAS, USA)을 자체 부화하여 얻은 4-6주령 SPF 시험계에 BP-IBDVac으로 제조한 사독오일백신 및 대조군으로 악조노벨사의 GNI 사독오일백신을 수당 500㎕ 접종하고 3주 후 채취한 혈청으로 AGP 검사와 바이러스 중화시험을 실시하여 중화항체 수준을 측정하였다.

BP-IBDVac 사독오일백신은 BP-IBDVac을 계태아 섬유아세포에 접종하여 7일간 배양하여 얻은 배양상층액을 0.3% 포름알데히드로 불활화하고, 불활화된 바이러스 배양액 30%에 ISA70오일(SEPPIC, Cosmetics/Pharmacy Division, Paris, France) 70%를 유화하여 제조하여 시험에 사용하였다. AGP 검사는 Hirai 등의 방법과 유사하나 항원으로 D78 주의 재조합 VP2 단백질을 사용하는 ㈜제노바이오의 VDPro

아이비디 에이지아이디 키트를 사용하여 수행하였으며(K. Hirai, S. Shimakura and M. Hirose. 1972. Immunodiffusion Reaction to Avian Infectious Bursal Virus. Avian Diseases, 16(4): 961-964), 그 결과 모두 양성을 보였다.

바이러스 중화시험 결과를 아래의 표 6에 나타내었다.

BP-IBDVac의 사독백신 효능

시험군	바이러스 중화항체(평균± 표준편차)
시험군	21DPI	28DPI
BP-IBDVAc	8.1± 2.1	9.0± 1.5
GNI	6.9± 1.4	9.0± 1.8
음성 대조군	0.00	0.00

표 6의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 혈청채취 시기가 3주인 경우 경우 BP-IBDVac를 접종한 군에서 비교적 높은 중화항제 역가를 얻을 수 있었으나, 4주에는 GNI 백신 접종군과 유의적인 차이를 보이지 않았다.

또한 BP-IBDVac과 GNI의 야외 고병원성 IBDV 감염에 대한 방어효능을 비교하기 위해, 서울대학교 수의과대학 조류질병실에서 분리한 고병원성 야외주인 SNU1035를 SPF 종란(SPAFAS, USA)을 자체 부화하여 얻은 4내지 6주령 SPF 닭에 감염시킨 후 3일 후에 F-낭을 채취하여 인산완충용액으로 10% 유제액을 만들어 원액을 비강과 구강으로 접종하여 14일간 폐사율 및 F-낭 위축 방어능력(BB-율)을 조사하여, 아래의 표 7에 나타내었다.

BP-IBDVac 사독오일백신의 야외주 감염에 의한 폐사 및 F-낭 위축 방어 효능

시험군		BB-율(평균±표준편차)	폐사율(%)
BP-IBDVac		3.50 ±1.75	0
GNI		3.95 ±0.65	0
바이러스대조군	생존계	1.66 ±0.16	60
	폐사계	3.13 ±1.51
음성대조군		4.12 ±0.63	0

(바이러스 대조군: 백신을 접종하지 않고 바이러스 공격한 군)

표 7에 나타낸 바와 같이, BB-율을 측정한 결과, BP-IBDVac 사독오일백신은 야외주에 의한 폐사 및 F-낭 위축을 100% 방어 하는 것으로 확인되어, 사독오일백신으로서의 효능이 우수한 것을 확인하였다.

< 실시예 3> BP - IBDVac 의 배양법

<3-1> BP - IBDVac 의 계태아 섬유아세포 생산성

BP-IBDVac의 계태아 섬유아세포에서의 최적의 증식 조건을 알아보기 위해, 계태아 섬유아세포의 수, 세포와 바이러스의 비율(multiplicity of infection, moi) 및 우태혈청 또는 계태아 추출액 첨가 여부에 따른 바이러스 역가를 확인하였다.

구체적으로, SPF 종란(SPAFAS, USA)을 자체 부화하여 얻은 11일령의 계태아 몸통을 세절하고, 0.25%(w/v) 트립신을 첨가하여 37℃에서 10분간 2회 소화시켰다. 소화된 세포를 두겹의 거즈로 여과하여 1,500g에서 3분간 원심분리하였다. 원심분리된 계태아 섬유아세포를 인산완충용액(pH 7.2)으로 2회 원심 세척한 후, 세포수를 9x10⁵/웰(1x) 또는 3x10⁵/웰(1/3)로 조정하여, 9x10⁴TCID₅₀ (10^-1또는 3x10^-1moi) 또는 9x10³TCID₅₀(10^-2또는 3x10^-2moi)의 BP-IBDVac와 혼합하여 6-웰 배양용기에서 5% CO₂ 농도로 37℃에서 배양하였다. 배양 배지는 199 배지(GIBCO-BRL, NY, USA)와 F10 배지(GIBCO-BRL, NY, USA)를 1:1로 혼합한 것을 사용하였다. 우태혈청(fetal bovine serum, FBS)(GIBCO-BRL, NY, USA))을 5%, SPF 종란(SPAFAS, USA)을 자체 부화하여 얻은 18일령내지 부화 직전의 계태아로부터 얻어진 계태아 추출액을 5% 또는 10% 농도로 배양 배지에 첨가하여 5% CO₂ 농도로 37℃에서 배양함으로써, 계태아 섬유아세포에서 BP-IBDVac의 배양성을 비교하여 아래의 표 8에 나타내었다.

상기 계태아 추출액은 18일령 내지 부화직전의 계태아의 난황을 제거하고, 가로x세로x높이 5mmx5mmx5mm 미만으로 세절한 후, 질량 기준으로 동량의 생리식염수를 첨가하여 냉장 온도(4℃)에서 교반하면서 6시간 이내에 유효성분을 추출하며, 1,500g에서 원심분리하여 세포를 제거하고, 상청액을 수확하여 56℃에서 30분간 열처리한 후 3,000g 이상에서 원심분리 하여 상청액을 수확한 후 0.4㎛, 0.2㎛, 0.1㎛ 여과지로 여과하여 제조하였다.

계태아 섬유아세포에서 BP-IBDVac의 최적 배양조건

세포수	배지첨가물	moi	TCID₅₀/25㎕(7DPI)
1x	계태아 추출액 10%	10^-1	8.00
1x	계태아 추출액 5%	10^-1	7.25
1x	우태혈청 5%	10^-1	7.13
1/3	계태아 추출액 10%	3x10^-1	6.63
1/3	계태아 추출액 5%	3x10^-1	7.00
1/3	우태혈청 5%	3x10^-1	6.63
1x	계태아 추출액 10%	10^-2	7.25
1x	계태아 추출액 5%	10^-2	7.13
1x	우태혈청 5%	10^-2	7.63
1/3	계태아 추출액 10%	3x10^-2	7.00
1/3	계태아 추출액 5%	3x10^-2	6.50
1/3	우태혈청 5%	3x10^-2	6.75

표 8의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 9x10⁵/웰의 계태아 섬유아세포에 BP-IBDVac를 10^-1moi로 접종하고, 계태아 추출액 10%를 첨가하는 경우 배양 7일째에 10⁸TCID₅₀/25㎕(4x10⁹TCID₅₀/ml)에 도달하여 가장 높은 바이러스 역가를 보였다.

<3-2> BP - IBDVac 의 포유류 세포주 증식성

BP-IBDVac의 포유류 유래 세포주에서의 증식성을 알아보기 위해, ST, PK-15, Vero, MDCK, Hep2, HeLa 세포주(모두 ATCC에서 구입)를 RPMI-1640 배지에 FBS 5%를 첨가하여 4x10⁵/ml로 부유하여 96-웰 배양용기에 200㎕씩 첨가하여 배양하여 단층 형성을 확인한 후 BP-IBDVac을 10^-1moi로 감염시킨 후 형광항체법으로 바이러스 증식여부를 확인하여, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 형광항체법은 96well plate에서 배양한 각각의 세포에 IBD 바이러스를 감염시키고 72시간 배양 하였다. 각 well로부터 배지를 제거한 후 100% 메탄올을 첨가하여 -20℃ 냉동고에서 10분간 배양하고 3% FBS가 들어있는 PBS를 첨가하여 120분간 실온에서 blocking 반응을 진행하였다. 동일한 blocking 버퍼로 IBDV 백신혈청을 희석하여(1:80) 각 well에 첨가한 후 90분간 실온에서 배양 후 PBS 용액으로 3회 세척하고, blocking 버퍼로 형광색소가 부착되어있는 항체(Antichicken IgG 1mg/ml)를 희석하여(1:100) 각 well에 첨가한 후 90분간 실온에서 배양하였다. 반응을 끝낸 후 PBS 용액으로 3회 세척하고, 200배 배율의 형광현미경으로 관찰하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 모든 세포주에서 핵을 제외한 세포질 부분에서 형광이 관찰되어, 본 발명의 바이러스의 포유류 유래 세포주에서의 증식성이 확인되었다.

Vero 세포주는 전염성낭병의 백신주인 D78의 배양에 최적인 것으로 알려져 있으며, 바이러스 역가도 10⁹TCID₅₀/ml 이상에 도달하는 것으로 알려져 있다(US 6,129,920). BP-IBDVac과 D78(악조-노벨)의 증식성을 비교하기 위해 Vero와 MDCK 세포주(ATCC)에서 7일간 배양한 후 계태아 섬유아세포에서 바이러스 역가(TCID₅₀)를 측정하여 아래의 표 9에 나타내었다.

IBDVac의 MDCK와 Vero 세포주에서의 증식성

바이러스	moi	바이러스 역가(TCID₅₀/25㎕, log₁₀)
바이러스	moi	MDCK	Vero
BP-IBDVAc	10^-1	6.67	6.67
D78	10^-1	5.83	5.17
BP-IBDVAc	10^-2	5.50	4.83
D78	10^-2	5.00	3.67

표 9의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, D78은 10^-1moi로 접종 시 MDCK에서 10^5.83TCID₅₀/25㎕, Vero에서 10^5.17TCID₅₀/25㎕의 역가를 보였고, BP-IBDVac은 MDCK에서 10^6.67TCID₅₀/25㎕, Vero에서 10^6.67TCID₅₀/25㎕을 보였다. 10^-2moi로 접종한 경우 바이러스와 세포주에 상관없이 10^-1moi 접종한 경우보다 낮은 역가를 보였다. Vero에서의 낮은 증식성(100배)은 예상하지 못한 결과로 Vero에서의 BP-IBDV 증식성은 계태아 섬유아세포 보다 100배 이상 낮아 사용할 수 없었다.

또한, 배지 첨가물에 따른 BP-IBDVac의 증식성을 Vero, ST, 및 PK-15 세포주에서 시험하여, 얻어진 결과를 아래의 표 10에 나타내었다.

BP-IBDVac의 Vero, ST, PK-15 세포주에서의 증식성 비교

세포주	배지첨가물	바이러스 수확(log₁₀)
세포주	배지첨가물	5일 후	7일 후
Vero	우태혈청 5%	5.83	6.00
	계태아 추출액 5%	5.67	5.13
	계태아 추출액 10%	5.83	5.38
ST	우태혈청 5%	5.83	6.13
	계태아 추출액 5%	6.50	5.63
	계태아 추출액 10%	6.50	6.50
PK-15	우태혈청 5%	6.00	6.25
	계태아 추출액 5%	7.17	6.50
	계태아 추출액 10%	7.33	7.00

표 10의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, BP-IBDVac은 Vero에서 우태혈청 5% 는 7일 후에 최고 10^6.00TCID₅₀/25㎕, 계태아 추출액 5%와 10%는 5일 후에 각각 최고 10^5.67TCID₅₀/25㎕와 10^5.83TCID₅₀/25㎕에 도달하였으며 ST는 우태혈청 5%에서 7일 후에 최고 10^6.13TCID₅₀/25㎕, 계태아 추출액 5%와 10%에서 각각 5일 후에 최고 10^6.50TCID₅₀/25㎕, 5일과 7일 후에 최고 10^6.50TCID₅₀/25㎕에 도달하였다. PK-15는 우태혈청 5%에서 7일 후 최고 10^6.25TCID₅₀/25㎕, 계태아 추출액 5%와 10%에서 각각 5일 후에 최고 10^7.17TCID₅₀/25㎕와 7일 후에 최고 10^7.33TCID₅₀/25㎕에 도달하였다. 따라서 BP-IBDVac은 ST와 PK-15에서 배양하는 경우 Vero 보다 월등히 높은 증식성을 보였으며 PK-15에 계태아 추출액 10%를 첨가하여 5일간 배양하는 경우 가장 높은 바이러스 역가를 보였다.

한국생명공학연구원

KCTC18189

20100311

서열목록 전자파일 첨부

Claims

비병원성 전염성낭병 바이러스로서,
합성되는 VP2-VP4-VP3 단백질이 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는,
비병원성 전염성낭병 바이러스 균주.
제1항에 있어서,
상기 바이러스 균주에서 합성되는 VP1은 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖고, VP5 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 것인,
비병원성 전염성낭병 바이러스 균주.
제1항에 있어서,
상기 바이러스 균주는 게놈 염기서열이 서열번호 11 및 서열번호 12로 표현되는 것이 특징인,
비병원성 전염성낭병 바이러스 균주.
제1항에 있어서,
기탁번호 KCTC 18189P의 비병원성 전염성낭병 바이러스 균주.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 비병원성 전염성낭병 바이러스 균주, 또는 상기 균주의 무세포, 또는 세포-포함 배양물을 포함하는, 전염성낭병의 백신 조성물.
제5항에 있어서,
상기 백신 조성물은 생독백신 또는 사독백신 형태인,
백신 조성물.
제5항에 있어서,
상기 백신 조성물은 in ovo 백신인,
백신 조성물.
제5항에 있어서,
상기 배양물은 상기 비병원성 전염성낭병 바이러스 균주를 16일령 내지 21일령의 계태아 추출물을 포함하는 배양 배지에서 배양하여 얻어진 것인,
백신 조성물.
제5항에 있어서,
상기 배양물은 상기 비병원성 전염성낭병 바이러스 균주를 10 내지 12일령의 계태아 섬유아세포, ST(swine testis) 세포 (CRL-1746), 또는 PK-15(porcine kidney-15) 세포 (CCL-33)에서 배양하여 얻어진 것인,
백신 조성물.
제5항에 있어서,
상기 배양물은 상기 비병원성 전염성낭병 바이러스 균주를 10 내지 12일령의 계태아 섬유아세포, ST세포, 또는 PK-15세포에서 16일령 내지 21일령의 계태아 추출물을 포함하는 배양배지에서 배양하여 얻어진 것인,
백신 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 비병원성 전염성낭병 바이러스 균주를 10 내지 12일령의 계태아 섬유아세포, ST세포, 또는 PK-15세포에서 16일령 내지 21일령의 계태아 추출물을 포함하는 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로하는,
비병원성 전염성낭병 바이러스의 배양 방법.