ES2237931T3 - Vacunas recombinantes y adyuvadas contra el virus de la influenza y el virus del herpes. - Google Patents
Vacunas recombinantes y adyuvadas contra el virus de la influenza y el virus del herpes.Info
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Abstract
Vacuna viva recombinante que comprende un vector viral que incorpora y expresa in vivo una secuencia nucleotídica heteróloga seleccionada entre un gen de un herpes virus animal y un gen de un virus influenza, y al menos un compuesto adyuvante seleccionado entre los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maléico y de derivado alquenilo.
Description
Vacunas recombinantes y adyuvadas contra el virus
de la influenza y el virus del herpes.
La presente invención se refiere a un
perfeccionamiento en las vacunas vivas recombinantes que integran y
expresan in vivo uno o varios genes heterólogos. La invención
se refiere en particular a tales vacunas adyuvadas, a la utilización
de compuestos adyuvantes particulares para la realización de tales
vacunas así como a los métodos de vacunación relacionados. La
invención tiene también por objeto un procedimiento de preparación
de estas vacunas.
Resulta clásico incorporar a las vacunas
inactivadas o de subunidades de adyuvantes destinados para
incrementar la respuesta inmunitaria respecto a antígenos que
comprenden estas vacunas.
Se ha pensado también incorporar adyuvantes a las
vacunas vivas atenuadas cuando la atenuación de microorganismos ha
conducido a una disminución de la respuesta inmunitaria.
Recientemente, también se han propuesto
vacunaciones combinadas contra varios patógenos con la ayuda de una
vacuna inactivada para una valencia y una vacuna viva atenuada para
la otra valencia. Así se ha propuesto recuperar la vacuna viva
atenuada, conservada en forma liofilizada, en la composición de
vacuna inactivada adyuvada. Esta juega el papel de vehículo de
recuperación para la vacuna viva, sin que ningún efecto adyuvante
sea buscado para este último.
La patente
EP-A-532.833 propone una vacuna
contra la rinopneumonia del caballo, patología provocada por el
herpes virus equino (EHV). La vacuna es una vacuna inactivada y
adyuvada, que reagrupa los virus EHV-1 y
EHV-4 inactivados, adyuvados por el adyuvante
Havlogen®, a base de polímero poliacrílico.
Como para la mayoría de los herpesvirus, no
existe actualmente ninguna vacuna eficaz que permita la eliminación
rápida del virus después de la infección. Las vacunas conocidas
intentan proteger contra la aparición de los signos clínicos. En
general, el efecto sobre la excreción viral está limitado.
Según la Patente
EP-A-532.833, la vacuna desarrollada
conduciría a una caída de la excreción viral que va de un 79 a un
93% (ver parte de resultados). Ocho animales testigo de nueve han
excretado virus después de un ensayo sobre una media de 1,4 días
mientras que la duración de excreción normal después de la prueba
es habitualmente superior o igual a 5 días. Ello significa una
prueba de baja intensidad que mejora artificialmente la protección
de los caballos vacunados con relación a los testigos. La baja de 1
excreción viral no es por consiguiente significativa en este
ensayo.
ensayo.
Adyuvantes de tipo carbomero (carbomer) han sido
también utilizados en vacunas contra la influenza equina (IEV) con
virus inactivado.
Mumford y col. (Epidemiol. Infect. (1994), 112,
421-437) recuerdan que es preciso dos dosis de
vacuna IEV equina para inducir en el caballo una respuesta humoral
transitoria y una baja protección contra el virus. Los autores
comparan los efectos adyuvantes del carbomero y del fosfato de
aluminio en vacunas inactivadas en presencia o no de anatoxina
tetánica. En todos los casos, se obtuvo un bajo título en
anticuerpos medido por la técnica SRH (single radial haemolysis)
respecto a las cepas H7N7 y H3N8 después de una primera vacunación y
es preciso esperar una segunda y luego una tercera vacunación para
apreciar respuestas transitorias más fuertes.
La Patente
US-A-4.500.513 presenta también
ensayos de vacunación contra el virus de la influenza equina con una
vacuna inactivada en presencia de un carbomero. El origen de los
animales y su estatuto médico no se indica con precisión y parece
que se trata de animales del lugar (columna 11, 2º párrafo). Los
títulos elevados en anticuerpos, medidos por una técnica de
inhibición de la hemaglutinación, indican que los animales habían
sido ya probablemente infectados por la gripe y que la respuesta
inducida después de la vacunación era de tipo de recuerdo, y no de
primera vacunación.
Por último, Fort Dodge Solvay comercializa
vacunas contra la influenza equina inactivadas (Dwaxyn® IE e
IE-T más) y una vacuna contra la rinoneumonía equina
inactivada (Duvaxyn® EHV_{1,4}), en adyuvante carbomero.
Se conocen también vacunas inactivadas
comerciales contra la influenza equina, adyuvadas mediante hidróxido
de alúmina (por ejemplo Tetagripiffa®, Mérial, Lyon, Francia).
Un gran número de otros adyuvantes son utilizados
en el marco de las vacunas clásicas inactivadas o de subunidades
(ver por ejemplo E.J. Haanes y col., Vaccine 1997, 15,
617:730-738). Se pueden citar por ejemplo el
hidróxido de alúmina, fosfato de alúmina, Avridine®, DDA,
manophosphoryl lipid A, Pluronic L121 y otros polímeros en bloque,
péptidos de muramilo, saponinas, dimicolato de trehalosa,
copolímeros de anhídrido maléico y de etileno, copolímeros de
estireno y de ácido acrílico o metacrílico, polifosfaceno,
emulsiones aceitosas, etc.
G. Pialoux y col., AIDS Research and Human
Retroviruses 1995, 11, 3: 373-381, describen un
protocolo prime-boost que comprende una primera
administración con una vacuna a base de un vector canaripox que
expresa gp160 de HIV, luego una dosis de recuerdo con una vacuna de
subunidad a base de gp160. Solo esta última está adyuvada.
El documento
WO-A-97/49825 describe una vacuna
viva recombinante, que utiliza un herpesvirus canino (CHV) como
vector para la expresión in vivo de un antígeno de un agente
patógeno canino, por ejemplo antígeno del virus de la enfermedad de
Carré, del virus de la rabia o del virus parainfluenza de tipo 2.
Este documento no considera el aporte de un adyuvante. Existen por
otro lado pocos ejemplos concretos de vacuna de este tipo formuladas
con un adyuvante.
El documento
WO-A-94 16689 sugiere adyuvar una
vacuna viva recombinante que expresa un gen heterólogo de un virus
envuelto por una composición vaccínea en forma de emulsión
agua-en-aceite,
aceite-en-agua o
agua-en-aceite-en
agua.
Una solución de este tipo puede sin embargo
presentar un cierto número de inconvenientes.
En la práctica, el usuario final debe disponer
por una parte de principio activo liofilizado y por otra parte una
emulsión ya constituida, que debe permitir recuperar el principio
activo liofilizado.
Una falta de estabilidad de la emulsión en el
transcurso del almacenado podría ser perjudicial para la eficacia y
para la inocuidad de la vacuna reconstituida.
La actividad de los microorganismos vivos
atenuados puede cuestionarse como consecuencia de su inestabilidad
en la fase aceitosa. Esto puede ser particularmente el caso para los
virus que pueden entonces perder su viabilidad.
Las vacunas en emulsión pueden también plantear
problemas de inocuidad en el sitio de la inyección.
La presente invención tiene por consiguiente por
objetivo proponer nuevas composiciones de vacuna a base de vacuna
viva recombinante que expresa al menos una secuencia nucleotídica
heteróloga, particularmente gen heterólogo, que comprende un
adyuvante que sea capaz de incrementar de forma notable la inmunidad
conferida con relación a la misma vacuna sin adyuvar y que se adapte
perfectamente a este tipo de vacuna.
La solicitante ha encontrado que los compuestos
de la clase de los carbomeros estaban en condiciones de adyuvar en
las condiciones requeridas este tipo de vacuna y ello en unas
proporciones inesperadas. Ensayos realizados sobre los herpesvirus
de animales (EHV-1, Equine Herpes Virus) han
mostrado que el aporte del carbomero permitía disminuir la excreción
viral en una infección experimental, en unas proporciones
inesperadas. Otros ensayos realizados sobre el virus de la Influenza
A equina han permitido obtener de forma sorprendente, en el caballo,
títulos serológicos precoces y muy elevados, superiores a los
obtenidos con las mejores vacunas comerciales.
La presente invención tiene por consiguiente por
objeto una vacuna viva recombinante que comprende un vector viral
que incorpora y expresa in vivo una secuencia nucleotídica
heteróloga seleccionada entre un gen de un herpes virus animal y un
gen de un virus influenza, y al menos un compuesto adyuvante
seleccionado entre los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y
los copolímeros de anhídrido maléico y de derivado alquenilo.
Los compuestos preferidos son los polímeros del
ácido acrílico o metacrílico reticulados, particularmente por éteres
polialquenilícos de azúcares o de polialcoholes. Estos compuestos
son conocidos bajo el término de carbomero (Pharmeuropa vol. 8, nº
2, Junio 1996). El experto en la materia puede también referirse a
la Patente US-A-2.909.462
(incorporada a título de referencia) que describe tales polímeros
acrílicos reticulados mediante un compuesto polihidroxilado con al
menos 3 grupos hidroxilo, de preferencia no más de 8, siendo
sustituidos los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos por
radicales alifáticos insaturados con al menos 2 átomos de carbono.
Los radicales preferidos son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos
de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos
etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden por sí
mismos contener otros sustituyentes, tal como metilo. Los productos
vendidos bajo la denominación Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) son
particularmente apropiados. Se reticulan mediante una alil sacarosa
o mediante el alilpentaeritritol. Entre ellos, se pueden citar los
Carbopol® 974P, 934P y 971P.
Entre los copolímeros de anhídrido maléico y de
derivado alquenilo, se prefieren los EMA® (Monsanto) que son
copolímeros de anhídrido maléico y de etileno, lineales o
reticulados, por ejemplo reticulados mediante diviniléter. Se puede
hacer referencia a J. Fields y col., Nature, 186:
778-780, 4 de Junio de 1960, incorporado a título de
referencia.
En el plano de su estructura, los polímeros de
ácido acrílico o metacrílico y los EMA® están formados de
preferencia por unidades de base de la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
en la
cual:
- -
- R_{1} y R_{2}, idénticos o diferentes, representan H o CH_{3}
- -
- x = 0 ó 1, de preferencia x = 1
- -
- y = 1 ó 2, con x + y = 2.
Para los EMA®, x = 0 e y = 2. Para los
carbomeros, x = y = 1.
La disolución de estos polímeros en agua conduce
a una solución ácida que se neutralizará, de preferencia hasta un pH
fisiológico, para proporcionar la solución adyuvante en la cual se
incorporará la vacuna propiamente dicha. Los grupos carboxílicos del
polímero se encuentran entonces en parte en forma de COO^{-}.
De forma preferida, se realiza una solución de
adyuvante según la invención, particularmente de carbomero, en agua
destilada, de preferencia en presencia de cloruro de sodio,
encontrándose la solución obtenida a un pH ácido. Se diluye esta
solución madre añadiéndola en la cantidad necesaria (para la
obtención de la concentración final deseada), o una parte importante
de esta, agua cargada de NaCl, de preferencia agua fisiológica (NaCl
9 g/l), en una o varias veces con neutralización concomitante o
subsecuente (pH 7,3 a 7,4), de preferencia mediante NaOH. Esta
solución con pH fisiológico se utilizará tal cual para recuperar la
vacuna, conservada particularmente en forma liofilizada.
La concentración en polímero en la composición de
vacuna final será de un 0,01% a un 2% PN, más particularmente de un
0,06 a un 1% P/V, de preferencia de un 0,1 a un 0,6% PN.
La invención se muestra particularmente útil para
la vacunación contra los herpesvirus de animales. La invención se
refiere muy particularmente a los herpesvirus equino
(EHV-1 y EHV-4 particularmente),
felino (FHV), canino (CHV), aviar (Marek e ILTV), bovino (BHV),
porcino (PRV = virus de la enfermedad de Aujeszky o virus de la
pseudo-rabia).
La invención tiene por consiguiente por objeto
vacunas vivas recombinantes que comprenden al menos un vector viral
que incorpora y expresa al menos un gen de dicho herpesvirus, y al
menos un adyuvante conforme a la invención.
A título de ejemplo, el experto en la materia
puede referirse al documento WO-A-92
15672 (incorporado a título de referencia), que describe la
realización de vectores de expresión a base de poxvirus capaces de
expresar tales genes. Se encontrará en ellos por ejemplo un
canarypox que expresa los genes gB, gC y gD de EHV-1
(vCP132), lo cual es aplicable también a EHV-4, un
virus de la vacuna que expresa estos mismos genes (vP 1043), un
virus de la vacuna que expresa los genes gl(gB),
glll(gC), gIV(gD) de 8HV-1, un
canarypox que expresa gD de FHV-1, o también
recombinantes que expresan los genes gll (gB), glll (gC), gp50 (gD)
de PRV. También puede hacerse referencia a
WO-A-95/26 751 (incorporado a título
de referencia), que describe virus recombinantes vCP320, vCP322 y
vCP294 que expresan los genes gB, gC, gD, respectivamente de CHV.
También puede hacerse referencia a los recombinantes que expresan
genes de FHV, PRV, BHV en FR-A-2.647
808 o WO90/12882 (indicados a título de referencia).
La invención se muestra también particularmente
interesante para la vacunación contra los virus influenza, como se
demuestra aquí para EIV (virus de la influenza equina o virus de la
gripe equina). Se puede también citar la gripe aviar (AIV), la gripe
porcina (Swine influenza virus).
A título de ejemplo, el experto en la materia
puede referirse al canarypox recombinante que expresa el gen HA de
EIV en el documento WO-A-92 15
672.
La invención tiene por consiguiente por objeto
vacunas vivas recombinantes que comprenden al menos un vector viral
que incorpora y expresa al menos un gen de dicho virus influenza, y
al menos un adyuvante conforme a la invención. Particularmente, la
vacuna comprende una mezcla de dos o tres vectores que incorporan y
expresan cada uno un gen HA, procediendo los genes de cepas
diferentes, por ejemplo cepas de influenza equina (gripe equina)
Prague, Kentucky y Newmarket. En el mismo orden de ideas, un solo
vector puede utilizarse para incorporar y expresar los HA de 2 o de
3 cepas.
La invención se aplica también a otros patógenos
animales, tales como particularmente FeLV (ver también recombinantes
canarypox en WO-A-92 15672 a título
de ejemplo, expresando env, gag = vCP93 y vCP97), el tétanos (ver
también WO-A-92 15672 y los
recombinantes vCP161 y vP1075, canarypox y vacuna, que expresa la
toxina tetánica), virus de la enfermedad de Carré (canine distemper
virus o CDV) (ver recombinante vCP 258 en
WO-A-95 27780, incorporado a título
de referencia).
La invención tiene por consiguiente por objeto
vacunas vivas recombinantes que comprenden al menos un vector viral
que incorpora y expresa al menos un gen de dicho virus.
La invención tiene también por objeto vacunas
recombinantes multi-valentes, es decir que contienen
dos o varios vectores recombinantes que expresan antígenos de dos o
varias enfermedades, en mezcla en una solución adyuvante conforme a
la invención.
En resumen, la invención se aplica para la
utilización de cualquier tipo de vector viral de expresión, tal como
poxvirus (virus de la vacuna, comprendido el NYVAC según
WO-A-92/15672, fowlpox, canarypox,
pigeonpox, swinepox, etc.), adenovirus, herpesvirus. El canarypox,
por ejemplo ALVAC (WO-A-95/27780 y
WO-A-92/15672), se muestra
particularmente apropiado en el marco de la presente invención.
En la vacuna lista para el empleo,
particularmente reconstituida, el vector viral está presente en las
cantidades habitualmente utilizadas y descritas en la
literatura.
Las vacunas vivas recombinantes se presentan en
general bajo una forma liofilizada que permite su conservación y su
recuperación extemporáneamente en un disolvente o excipiente, que
será aquí la solución de adyuvante conforme a la invención.
La invención tiene por consiguiente también por
objeto un conjunto de vacunación que comprende, acondicionados por
separado, vacuna liofilizada y una solución del compuesto adyuvante
según la invención para la recuperación de la vacuna
liofilizada.
La invención tiene también por objeto un método
de vacunación que consiste en administrar por vía parenteral, de
preferencia subcutánea, intramuscular, intradérmica, o por vía
mucosal, una vacuna conforme a la invención, a razón de una o varias
administraciones, eventualmente con una etapa previa de recuperación
de vacuna liofilizada (el vector recombinante) en una solución de
compuesto adyuvante.
Un objetivo de un método de este tipo puede ser
proteger los animales en el plano clínico y disminuir la excreción
viral, lo cual corresponde sobre todo al caso de los
herpesvirus.
Otro objetivo puede ser incrementar la respuesta
inmunitaria y hacerla más precoz, particularmente mediante inducción
de anticuerpos desde la primera administración.
La invención tiene también por objeto la
utilización de los compuestos adyuvantes conformes a la invención
para la realización de vacunas vivas recombinantes, confiriendo
particularmente una respuesta inmunitaria mejorada y más precoz y/o
un bajo incremento de la excreción viral. Se hará referencia a lo
que se ha indicado anteriormente.
La invención se describirá ahora con más detalle,
con la ayuda de modos de realización tomados a título de ejemplos no
limitativos y haciendo referencia al dibujo en el cual:
- la figura 1 representa la secuencia
nucleotídica del gen EIV HA de la cepa EIV Newmarket 2/93;
- la figura 2 representa la secuencia
nucleotídica del gen FHV-1 gC;
- la figura 3 representa un gráfico que muestra
la evolución de la excreción viral después de la infección
experimental en caballos vacunados con la ayuda de diferentes
vacunas contra el herpesvirus equino.
Los plásmidos donadores para los diferentes
emplazamientos de inserción en el virus canarypox "ALVAC"
(Tartaglia y col. Virology. 1992, 188.
217-232 incorporado a título de referencia) se
describen en la solicitud
WO-A-95/27780, ejemplo 20.
Estos plásmidos han sido designados en esta
solicitud del modo siguiente:
"plásmido VQH6CP3LSA.2" para el
emplazamiento "C3"
"plásmido HC5LSP28" para el emplazamiento
"C5"
"plásmido pC6L" para el emplazamiento
"C6"
La cepa Onderstepoort del virus CDV fue utilizada
para separar los genes HA y F. (Secuencia del gen HA descrita por
Curran y col. Virology. 1991. 72. 443-447, y
secuencia del gen F descrita por Barrett y col. Virus Research.
1987. 8. 373-386, incorporados a título de
referencia).
La construcción del plásmido donador pMM103 para
la inserción de las casetes de expresión promotor vacuna H6- gen CDV
F y promotor vacuna H6-gen CDV HA en el locus C6 del
virus ALVAC se describe en el ejemplo 19 de la solicitud
WO-A-95/27780.
Este plásmido se utilizó como plásmido donador
para la recombinación in vitro (Piccini y col. Methods in
Enzymology. 1987. 153. 545-563, incorporado a
título de referencia) con el virus ALVAC para generar el virus
recombinado designado por vCP258 como en el ejemplo 19 de la
solicitud mencionada anteriormente.
La secuencia del gen HA (cepa EIV Prague) se
presenta en la figura No. 23 de la solicitud
WO-A-92/15672. El ARN viral del
genoma del virus de la gripe equina cepa Prague 56 se extractó a
partir de 100 \mul de una suspensión viral de este virus con el
kit de extracción "Total RNA Separator kit" de CLONTECH (Palo
Alto, CA)(Cat#K1042-1). El residuo de ARN se
recuperó en 10 \mul de agua ultrapura y se realizó una reacción de
síntesis de ADN complementaria, seguida de una amplificación PCR (=
reacción "RT-PCR") tomando como matriz 2 \mul
de ARN viral purificado y los oligonucleótidos siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
para ampliar el gen EIV HA Prague.
El fragmento PCR así obtenido se ligó en el vector pCRII
(InVitrogen, San Diego, CA) para proporcionar el plásmido
pJT007.
El plásmido pJT007 ha sido digerido por NruI y
Asp718 para separar un fragmento NruI-718 de
aproximadamente 1800 pb conteniendo el final del promotor H6 y el
gen HA Prague 56 en su totalidad. Este fragmento se ligó con el
plásmido donador C5 HC5LSP28, previamente digerido por NruI y
Asp718, para proporcionar finalmente el plásmido pJT008. Este
plásmido contiene la casete de expresión H6-gen HA
Prague 56 en el locus C5 del virus ALVAC. La estructura de este
plásmido fue comprobada por secuenciado y tarjeta de restricción
completa.
Este plásmido es el plásmido donador para la
inserción de la casete de expresión H6-gen HA Prague
56 en el locus C5.
Después de la linealización mediante NotI, el
plásmido pJT008 fue utilizado como plásmido donador para la
recombinación in vitro (Piccini y col. Methods in Enzymology.
1987, 153, 545-563) con el virus ALVAC para generar
el virus recombinado designado vCP1502.
El ARN viral del genoma del virus de la gripe
equina cepa Kentucky 1/94 (Daly y col. J. Gen. Virol. 1996,
77, 661-671, incorporado a título de
referencia) se extractó a partir de 100 \mul de una suspensión
viral de este virus con el kit de extracción "Total RNA Separador
kit" de CLONTECH (Palo Alto, CA)(Cat#K1042-1). El
resto de ARN se recuperó en 10 \mul de agua ultrapura y se realizó
una reacción RT-PCR tomando como matriz 2 \mul de
ARN viral purificado y los oligonucleótidos siguientes:
para ampliar el gen HA. El
fragmento PCR así obtenido se ligó en el vector pCRII (InVitrogen,
San Diego, CA) para proporcionar el plásmido pJT001. La secuencia
del gen EIV HA cepa Kentucky 1/94 clonado en el plásmido pJT001 no
es diferente de la secuencia del gen EIV HA cepa Kentucky 1/94
disponible en la base de datos GenBank (Número de acceso L39914,
incorporado a título de
referencia).
El plásmido pJT001 que contiene el gen HA
(Kentucky 1/94) fue digerido por NruI y Asp718 para separar un
fragmento NruI-Asp718 de 1800 pb (conteniendo el
final del promotor H6 y el gen HA Kentucky 1/94 en su totalidad).
Este fragmento fue ligado con el plásmido donador C5 HC5LSP28,
previamente digerido por NruI y Asp718, para proporcionar finalmente
el plásmido pJT005. Este plásmido contiene la casete de expresión
H6-gen HA Kentucky 1/94 en el locus C5 del virus
ALVAC. La estructura de este plásmido se comprobó por secuenciado y
tarjeta de restricción completa.
Este plásmido es el plásmido donador para la
inserción de la casete de expresión H6-gen HA
Kentucky 1/94 en el locus C5.
Después de la linealización mediante NotI, el
plásmido pJT005 se utilizó como plásmido donador para la
recombinación in vitro (Piccini y col. Methods in Enzymology.
1987, 153, 545-563) con el virus ALVAC para
generar el virus recombinado designado vCP1529.
El ARN viral del genoma del virus de la gripe
equina cepa Newmarket 2/93 (Daly y col. J. Gen. Virol. 1996,
77, 661-671) se extractó a partir de 100
\mul de una suspensión viral de este virus con el kit de
extracción "Total RNA Separador kit" de CLOTECH (Cat#K1042-)).
El resto de ARN se recuperó en 10 \mul de agua ultrapura y se
realizó una reacción RT-PCR tomando como matriz 2
\mul de ARN viral purificado y los oligonucleótidos
siguientes:
para ampliar el gen HA. El
fragmento PCR así obtenido fue ligado en el vector pCRII
(InVitrogen, San Diego, CA) para proporcionar el plásmido pCCL026.
La secuencia del gen HA (cepa EIV Newmarket 2/93) se presenta en la
figura Nº 1 (SEC ID nº
7).
El plásmido pCCL026 que contiene el gen HA (cepa
Newmarket 2/93) ha sido digerido por SpeI y AccI. Los
oligonucleótidos siguientes:
se juntaron y ligaron con el
plásmido pCCL026 digerido por SpeI+AccI para proporcionar el
plásmido pJT003. El oligonucleótido de doble ramificación
TAY99N/TAY100N contiene la región 3' del promotor H6 hasta el
emplazamiento NruI y las 40 primeras bases codantes del gen
HA.
El plásmido JT003 ha sido digerido por NruI y
XhoI para separar un fragmento NruI-XhoI de
aproximadamente 1800 pb conteniendo el final del promotor H6 y el
gen HA en su totalidad. Este fragmento se ligó con el plásmido
donador C5 HC5LSP28, previamente digerido por NruI y XhoI, para
proporcionar finalmente el plásmido pJT004. Este plásmido contiene
la casete de expresión H6-gen HA Newmarket: 2/93 en
el locus C5 del virus ALVAC. La estructura de este plásmido se
comprobó por secuenciado y tarjeta de restricción completa.
Este plásmido es el plásmido donador para la
inserción de la casete de expresión H6-gen HA
Newmarket 2/93 en el locus C5.
Después de la linealización mediante PvuI, el
plásmido pJT004 se utilizó como plásmido donador para la
recombinación in vitro (Piccini y col. Methods in Enzymology.
1987, 153, 545-563) con el virus ALVAC para
generar el virus recombinado designado vCP1533.
La construcción del virus recombinado se describe
en los ejemplos 25 y 26 de la solicitud
WO-A-92/15672. Este virus se generó
por recombinación in vitro entre el virus ALVAC y el plásmido
donador pJCA049. Este plásmido contiene las 3 casetes de expresión
siguientes clonadas en el emplazamiento de inserción C3:
promotor vacuna I3L-gen
EHV-1 gB
promotor vacuna H6-gen
EHV-1 gC
promotor entomopox 42K-gen
EHV-1 gD
Las secuencias de los genes EHV-1
gB, gC y gD se describen en la solicitud
WO-A-92/15672 en las figuras Nº 2
(secuencia del gen EHV-1 gp13 = gC), Nº 6 (secuencia
del gen EHV-1 gp14 = gB) y Nº 12 (secuencia de los
genes EHV-1 gD, gp63 y gE).
La secuencia del gen FHV-1 gB
(cepa CO) se presenta en la figura Nº 34 de la solicitud
WO-A-90/12882.
El gen FHV-1 gC (cepa CO)
(secuencia presentada en la figura Nº 2 (SEC ID Nº 10) se clonó a
partir del fragmento EcoRI F (7,6 kpb). Tiene un tamaño de 1599 pg y
código para una proteína de 533 aminoácidos.
El gen FHV-1 gD (cepa CO)
(secuencia presentada en la figura Nº 28 de la solicitud
WO-A-92/15672) se clonó a partir del
fragmento EcoRI M (4,4 kpb) (plásmido pFHVEcoRIM).
Los oligonucleótidos siguientes:
se utilizaron para una
amplificación PCR con la matriz de un plásmido que contiene el
promotor de vacuna I3L (Rivière y col. J. Virol. 1992, 66,
3424-3434, incorporado a título de referencia) para
generar un fragmento XbaI-bout franco de 120 pb
(conteniendo el promotor de vacuna I3L) = fragmento A. Los
oligonucleótidos
siguientes:
se utilizaron para generar mediante
PCR a partir de la matriz del plásmido pJCA001 un fragmento bout
franco-BamHI de 720 pb (conteniendo la parte 5' del
gen FHV-1 gB) = fragmento
B.
El fragmento A fue digerido por XbaI, luego
fosforilado. El fragmento B fue digerido por BamHI, luego
fosforilado. Los fragmentos A y B fueron seguidamente ligados juntos
con el vector pBluescript SK+, previamente digerido por XbaI y
BamHI, para proporcionar el plásmido pJCA075.
Los oligonucleótidos siguientes:
se utilizaron para generar mediante
PCR a partir de la matriz del plásmido pJCA075 un fragmento
XbaI-bout franco de 510 pb (conteniendo el promotor
13L fusionado en la parte 5' del gen FHV-1 gB mutada
a nivel de la señal TTTTTNT) = fragmento
C.
Los oligonucleótidos siguientes:
se utilizaron para generar mediante
PCR a partir de la matriz del plásmido pJCA001 un fragmento bout
franco-BamHI de 330 pB (conteniendo la parte central
del gen FHV-1 gB) = fragmento
D.
El fragmento C fue digerido mediante XbaI, y
luego fosforilado. El fragmento D fue digerido por BamHI, y luego
fosforilado. Los fragmentos C y D han sido entonces ligados juntos
con el vector pBluescript SK+, previamente digerido por XbaI y
BamHI, para proporcionar el plásmido pJCA076.
Los oligonucleótidos siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
se utilizaron para generar mediante
PCR a partir de la matriz del plásmido pJCA001 un fragmento
EcoRI-bout franco de 695 pb (conteniendo la primera
parte 3' del gen FHV1 gB) = fragmento E. Los oligonucleótidos
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
se utilizaron para generar mediante
PCR a partir de la matriz del plásmido pJCA001 un fragmento bout
franco-PstI de 560 pb (conteniendo la segunda parte
3' del gen FHV-1 gB mutada a nivel de la señal
TTTTTNT) = fragmento
F.
El fragmento E fue digerido por EcoRI, y luego
fosforilado. El fragmento F fue digerido por PstI, y luego
fosforilado. Los fragmentos E y F fueron entonces ligados juntos con
el vector pIBI24 (International Biotechnologies Inc., New Haven,
CT), previamente digerido por EcoRI y PstI, para proporcionar el
plásmido pJCA077 (conteniendo la casete promotora de vacuna
I3L-gen FHV-1 B).
Los oligonucleótidos siguientes:
se utilizaron para generar mediante
PCR a partir de la matriz del plásmido que contiene el promotor
Entomopoxvirus AmFPV 42K (descrito en el ejemplo 21 de la patente
US-A-5.505.941) un fragmento
EcoRI-bout franco de 130 pb (conteniendo el promotor
entomopox 42 K) = fragmento A. Los oligonucleótidos
siguientes:
se utilizaron para generar mediante
PCR a partir de la matriz del plásmido pFHVEcoRIM un fragmento bout
franco-BamHI de 185 pb (conteniendo la parte 5' del
gen FHV-1 gD) = fragmento B. El fragmento A ha sido
digerido por EcoRI, y luego fosforilado. El fragmento B ha sido
digerido mediante BamHI, y luego fosforilado. Los fragmentos A y B
fueron entonces ligados juntos con el vector pBluescript SK+,
previamente digerido por EcoRI y BamHI, para proporcionar el
plásmido
pJCA078.
El plásmido pFHVEcoRIM (ver más arriba) fue
digerido mediante BamHI y XhoI para separar el fragmento
BamHI-XhoI de 1270 pb (conteniendo la parte 3' del
gen FHV-1 gD). Este fragmento fue entonces ligado
con el vector plBl24, previamente digerido mediante BamHI y XhoI,
para proporcionar el plásmido pJCA072. Los oligonucleótidos
siguientes:
se utilizaron para generar mediante
PCR a partir de la matriz pFHVEcoRIM un fragmento
XbaI-XhoI de 290 pb. Este fragmento fue digerido
mediante XbaI y XhoI = fragmento C (conteniendo el final del gen
FHV-1
gD).
El plásmido pJCA072 fue digerido por XbaI y XhoI
para separar el fragmento XbaI-XhoI de 3575 pb
(vector pIBI24 + comienzo de la parte 3' del gen
FHV-1 gD) = fragmento D. Los fragmentos C y D fueron
entonces ligados juntos para proporcionar el plásmido pJCA073.
El plásmido pJCA073 fue digerido por BamHI y XhoI
para separar el fragmento BamHI-XhoI de 960 pb
(conteniendo la parte 3' del gen PHV-1 gD) =
fragmento A. El plásmido pJCA fue digerido por HpaI y BamHI para
separar el fragmento HpaI-BamHI de 310 pb
(conteniendo el promotor 42K fusionado en la parte 5' del gen
FHV-1 gD) = fragmento B. Los fragmentos A y B fueron
ligados juntos con el vector pBluescript SK+, previamente digerido
por EcoRV y XhoI, para proporcionar le plásmido pJCA080 (conteniendo
la casete promotora 42K-gen FHV-1
gD).
El ADN genómico del virus FHV-1
(cepa CO) ha sido digerido por EcoRI y el fragmento EcoRI F de
aproximadamente 7500 pg fue clonado en pBluescript SK+ para
proporcionar el plásmido pFHVEcoRIF. Los oligonucleotidos
siguientes:
se utilizaron para generar mediante
PCR a partir de la matriz pFHVEcoRIF un fragmento que fue digerido
por NruI y SalI para proporcionar un fragmento
NruI-SalI de 107 pb (conteniendo la parte 3' del
promotor vacuna H6 fusionada con la parte 5' del gen
FHV-1 gC) = fragmento A. Los oligonucleótidos
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
se utilizaron para generar mediante
PCR a partir de la matriz pFHVEcoRIF un fragmento que fue digerido
por EcoRV y HindIII para proporcionar un fragmento
EcoRV-HindIII de 370 pb (conteniendo la parte 3' del
gen FHV-1 gC y los emplazamientos
HpaI-Eco-RI-PstI-HindIII)
= fragmento
B.
El plásmido pJCA020 (ver más arriba) fue digerido
por NruI y HindIII para separar el fragmento
HindIII-NruI (conteniendo la parte 5' del promotor
de vacuna H6) = fragmento C. El plásmido pFHVEcoRIF fue digerido por
BamHI y EccRV para separar el fragmento BamHI-EcoRV
de 580 pb (conteniendo la parte central del gen
FHV-1 gC) = fragmento D. Los fragmentos A y C fueron
ligados juntos con el vector pBluescript SK+, previamente digerido
por HindIII y SalI para proporcionar le plásmido pJCA097. Los
fragmentos B y D fueron ligados juntos con el vector pBluescript
SK+, previamente digerido por BamHI y HindIII, para proporcionar el
plásmido pJCA099.
El plásmido pJC097 fue digerido por PstI y SalI
para separar el fragmento PstI-SalI de 200 pb
(conteniendo la casete H6-parte 5' de gC) =
fragmento E. El plásmido pFHV1EcoRIF fue digerido por BamHI y SalI
para separar el fragmento SalI-BamHI de 600 p (2ª
parte central de FHV-1 gC) = fragmento F. Los
fragmento E y F fueron entonces ligados juntos con el vector
pBluescript SK+, previamente digerido por BamHI y PstI, para
proporcionar el plásmido pJCA098. El plásmido pJCA098 fue
seguidamente digerido por EcoRI y BamHI para separar el fragmento
EcoRI-BamHI de 820 pb (conteniendo la casete
H6-parte 5' de FHV-1 gC) = fragmento
G. El plásmido pJCA099 (ver más arriba) fue digerido por BamHI y
HindIII para separar el fragmento BamHI-HindIII de
960 pb (conteniendo la parte 3' del gen FHV-1 gC) =
fragmento H. Los fragmentos G y H fueron entonces ligados juntos con
el vector pBluescript SK+, previamente digerido por EcoRV y HindIII,
para proporcionar el plásmido pJCA100 (conteniendo la casete de
expresión promotora de vacuna H6-gen
FHV-1 gC).
El plásmido pJCA100 fue digerido por NruI y EcoRI
para separar el fragmento NruI-EcoRI de 1650 pb
conteniendo la parte 3' del promotor H6 fusionada con el gen
FHV-1 gC. Este fragmento se ligó con el plásmido
pJCA053 (casete VQH6-IBV M en el vector pBluescript
SK+), previamente digerido por NruI y EcoRI, para proporcionar el
plásmido pJCA 108 (conteniendo la casete VQH6-gC en
pBluescript SK+). El plásmido pJCA079 (ver más arriba) fue digerido
por SmaI y BamHI para separar el fragmento
BamHI-SmaI de 840 pb (conteniendo la casete
l3L-parte 5' del gen FHV-1 gB) =
fragmento A. El plásmido pJCA079 fue igualmente digerido por BamHI y
HindIII para separar el fragmento BamHI-HindIII de
2155 pb (conteniendo la parte 3' del gen FHV-1 gB) =
fragmento B. El plásmido pJCA108 (ver más arriba) fue digerido por
HindIII y EcoRI para separar el fragmento
HindIII-EcoRI de 1830 pb (conteniendo la casete
VQH6-FHV-1 gC) = fragmento C. El
plásmido pJCA080 (ver más arriba) fue digerido por EcoRI y XhoI para
separar el fragmento EcoRI-XhoI de 1275 pb
(conteniendo la casete 42K-gen FHV-1
gD) = fragmento D. Los fragmentos A, B, C y D fueron entonces
ligados juntos con el plásmido donador pC6L para proporcionar le
plásmido pJCA109.
Este plásmido contiene las casetes de expresión
H6-gen FHV-1 gC,
l3L-gen FHV-1 gB y
42K-gen FHV-1 gD en el locus C6 del
virus ALVAC. La estructura de este plásmido fue comprobada por
secuenciado y tarjeta de restricción completa.
Este plásmido es el plásmido donador para la
inserción de las casetes de expresión H6-gen
FHV-1 gC, I3L-gen
FHV-1 gB y 42K-gen
FHV-1 gD en el locus C6 del virus ALVAC.
Después de la linealización por NotI, el plásmido
pJCA109 fue utilizado como plásmido donador para la recombinación
in vitro (Piccini y col. Methods in Enzymology. 1987, 153,
545-563) con el virus ALVAC para generar el virus
recombinado designado vCP243.
El carbomero utilizado en las vacunas conformes a
la presente invención es el Carbopol® 974P fabricado por la Sociedad
BF Goodrich (PM aproximadamente 3 millones).
Se preparó primeramente una solución madre al
1,5% P/V de Carbopol® 974P en agua destilada conteniendo cloruro de
sodio en 1 g/l.
Esta solución madre se utilizó seguidamente para
la fabricación de una solución de Carbopol® en agua fisiológica en 4
mg/ml. La solución madre se vertió en la totalidad del agua
fisiológica (o eventualmente en la mayor parte de ésta) en una vez o
eventualmente en varias veces con cada vez ajuste del pH con la
ayuda de NaOH (por ejemplo 1 N o más concentrado) a un valor de
aproximadamente 7,3 a 7,4.
Se obtuvo entonces una solución de Carbopol®
lista para el empleo que podrá utilizarse por el usuario final para
recuperar una vacuna recombinante liofilizada.
20 poneys (Welsh mountain poneys) que no
presentan signos serológicos que traduzcan una exposición reciente a
EHV-1 y EHV-4 fueron repartidos al
azar en 4 grupos (A a D) de 5 poneys.
Los grupos A y B fueron vacunados con el
canarypox recombinante vCP132 que expresa las glicoproteínas gB, gC
y gD de la cepa Kentucky D de EHV-1. La vacuna se
recuperó en agua estéril (grupo A) o en una solución de carbomero 4
mg/ml (grupo B) según el ejemplo 8.
El grupo C fue vacunado con una vacuna EHV entera
inactivada del comercio conteniendo, bajo un volumen de dosis de 1,5
ml, valencias EHV-1 y EHV-4
inactivadas y 6 mg de carbomero.
El grupo D es el grupo testigo en el cual los
animales fueron vacunados con un virus canarypox recombinante
vCP1502 que expresa la glicoproteína HA del virus Influenza
A/equino-1/Prague56 (ver ejemplo 3) recuperado con
carbonero en las mismas condiciones que para el grupo B.
Las vacunas se describen con detalle en la tabla
I:
Cada animal recibió 1 dosis de vacuna
correspondiente en el D0 y en el D35 mediante inyección
intramuscular profunda en el cuello.
En el D 56, los poneys fueron sometidos a ensayo
mediante instilación intra-nasal de 10^{5}
TCID_{50} de la cepa Ab4/8 de EHV-1.
Se realizaron ensayos de neutralización SN según
la técnica descrita en Thompson y col., Equine Vet. J., 8,
58-65, 1976. El virus EHV-1 (RACH)
se utilizó como antígeno.
Los títulos SN se expresaron como la inercia de
la dilución de suero que proporciona el 50% de neutralización
(log_{10}).
La expresión de virus fue seguida diariamente en
10 días mediante limpiados nasofaríngeos que se recogieron en medio
de transporte de virus. Los extractos de limpiado se titularon en
células de riñón de conejo RK13 en placas de microtitulación. Los
títulos fueron calculados utilizando la fórmula de Karber expresada
en log_{10} TCID_{50} para 1 ml.
Ninguna reacción local o sistémica significativa
fue observada a continuación de estas vacunaciones.
Las respuestas en anticuerpos seroneutralizantes
SN (log 10 de la dilución produciendo el 50% de neutralización)
medias fueron:
Se observó con la vacuna vCP132 en carbomero un
aumento significativo del título en anticuerpos.
La totalidad de los 5 poneys testigo excreta
virus por la nasofaringe. La excreción viral en estos poneys no
vacunados ha continuado durante una media de 5 días, con un máximo
de excreción viral de 4 días de la
post-infección.
Todos los poneys de los grupos A, C, D excretan
virus después del ensayo. Por el contrario, solo dos poneys de los 5
poneys del grupo B vacunados según la invención excretan virus.
Además, la cantidad de virus excretada en el grupo B es
significativamente inferior a la cantidad excretada por los demás
grupos comprendido el grupo C. De igual modo, el tiempo de excreción
en los animales del grupo B es mucho más corto que en los demás
grupos.
Se puede hacer referencia a la figura 1 y a los
valores de área bajo las curvas dadas a continuación, que reflejan
muy claramente la casi ausencia de excreción viral en los poneys
vacunados por el vCP132 en presencia de carbomero. El resultado es
muy significativo si se compara en particular con la vacuna
comercial. Se observa una reducción significativa de la excreción
viral en los animales del grupo B con relación a los testigos,
mientras que no se observa diferencia significativa entre los
animales del grupo C y los testigos. Esta reducción de un grado
notable e inesperado de la excreción de virus resulta
particularmente interesante para sus implicaciones muy favorables en
la limitación de la transmisión del virus de caballo a caballo.
Virus total por poney (área bajo la curva):
| A: 17,1 |
| B: 3,0 |
| C: 9,7 |
| D: 16,3 |
20 poneys (Welsch mountain ponies), de 7 a 8
meses de edad, sin presentar anticuerpos detectables contra los
virus H3N8 y H7N7, medidos por el ensayo SRH (para single radial
hemolysis o hemolisis radial simple), se utilizaron en este estudio.
El estado negativo de los animales permitió estudiar en las mejores
condiciones la eficacia de las diferentes vacunas en términos de
respuesta humoral. Los poneys fueron repartidos al azar en 4 grupos
(A a D) de 5 a 6 poneys.
Los poneys del grupo A fueron vacunados con la
ayuda de un canarypox recombinante (vCP1533) que expresa la
glicoproteína HA del virus influenza
A/equi-2/Newmarket/2/93. Esta vacuna se recuperó en
una solución que contiene 4 mg/ml de carbomero, Carbopol® 974P.
El grupo B fue vacunado con una vacuna comercial
conteniendo, bajo un volumen de dosis de 1,5 ml, una mezcla de 3
cepas inactivadas de influenza a saber Prague/56, Suffolk/89 y
Miami/63, la anatoxina tetánica, así como carbomero (4 mg) e
hidróxido de aluminio (2,2 mg) como adyuvantes.
El grupo C fue vacunado con la ayuda de una
vacuna C que comprende 2 valencias inactivadas influenza a saber
Prague/56, Newmarket/2/93, así como la anatoxina tetánica, en
hidróxido de aluminio.
El grupo D fue vacunado con la ayuda de un vector
canarypox recombinante vCP132 visto anteriormente y reconstituido
con una solución que contiene 4 mg/ml de carbomero 974P. Este último
ha servido de testigo para la prueba.
Las vacunas se describen con detalle en la tabla
II
2 dosis de 1 ml de cada vacuna se administraron a
cada animal con 5 semanas de intervalo por inyección intramuscular
profunda en el cuello.
2 semanas después de la segunda vacunación, cada
poney fue infectado por exposición a un aerosol procedente de
aproximadamente 20 ml de fluido alantoidiano para un total de
10^{7\text{.}3}EiD_{50} de virus influenza
A-equi-2/Sussex/89, utilizando un
nebulizador modelo ULTRA 2000 (De Villbiss, Somerset PA) como se ha
descrito por Mumford y col., Equine Vet, J., 22 :
93-98, 1990.
Muestras de sangre total fueron recogidas en los
días siguientes: 0 (el mismo día que y antes de la primera
vacunación), 7, 14, 35 (el mismo día que y antes de la segunda
vacunación), 49 (el mismo día que y antes del ensayo), 56 y 63.
El suero se preparó y almacenó y conservó
mediante congelación a -20ºC hasta su utilización. Todos los sueros
fueron sometidos a ensayo para la presencia de anticuerpos SRH
respecto a la Influenza A/equi-1/Prague/56 y la
Influenza A/equi-2/Newmarket/2/93 como se ha
descrito por Wood y col. (J. Hyg. 90: 371 - 384, 1983).
Los diámetros de las zonas de hemolisis fueron
medidos en dos direcciones en ángulo recto utilizando un lector
automático. La superficie de las zonas fue calculada y un aumento
del 50% fue considerado como significativo. Los títulos fueron
expresados en mm^{2} de hemolisis.
La excreción viral fue seguida diariamente en 10
días recogiendo muestras nasofaríngeas en un medio de transporte de
virus. El exudado de cada muestra fue diluido por diluciones de
razón 10 en PBS a un pH de 7,2 y 0,1 ml de cada dilución fue
inoculado en el espacio alantoidiano de huevos embrionados de 10
días de edad. El título viral (EID_{50}/ml) en los extractos de
muestras fue calculado a partir de la actividad hemaglutinante en
líquidos alantoidianos recogidos después de 72 horas de incubación
de los huevos a 34ºC.
No se observó reacción local o sistémica
significativa a continuación de la primera vacunación a excepción de
un caballo del grupo B.
Hay que observar que las cepas Suffolk y
Newmarket son similares (Daly y col., J. Gen. Virol. 1996,
77, 661-671) lo cual hace perfectamente
valedero la comparación con la vacuna comercial en las condiciones
de ensayo.
Ninguno de los poneys tenía anticuerpos SRH
detectables contra la Influenza
A/equi-2/Newmarket/2/93 o Influenza
A/equi-1/Prague/56 al comienzo del estudio. Los
resultados sexológicos a 1 semana después de la primera vacunación
han mostrado que ninguno de los poneys había sido previamente
infectado por Influenza (ningún efecto de recuerdo observable).
2 semanas después de la primera vacunación,
ninguno de los poneys ha desarrollado respuesta en anticuerpos
detectable contra Influenza A/equi-1/Prague/56.
Además no ha habido anticuerpos SRH detectables contra Influenza A/
equi-2/Newmarket/93 en 6 animales de 6 vacunados con
vacuna C, en 4 animales de 5 vacunados con la vacuna del comercio B
y en el grupo testigo D. Por el contrario un título de anticuerpos
SRH muy fuerte ha sido observado en el conjunto de los 5 poneys
vacunados con el canarypox en presencia del adyuvante carbomero:
media 155,4 \pm 32,9. La tabla III siguiente presenta los
resultados obtenidos animal por animal en lo que respecta a los
títulos en anticuerpos SRH.
La vacuna según la invención conduce a la
aparición de un elevado título en anticuerpos desde los 14 días
después de la primera vacunación mientras que, generalmente, para
las vacunas B y C, la primera vacunación no produce en este tiempo
la aparición de anticuerpos a niveles detectables. La obtención
también precoz de un título de este tipo es un resultado notable e
inesperado, nunca observado antes.
Los testigos del ejemplo 1, vacunados mediante
vCP1502, fueron también seguidos en el plano serológico.
La tabla IV siguiente muestra los título IHA
(Inhibición de la hemaglutinación) obtenidos en los animales
inmunizados con 10^{a} pfu de vCP1502 con Carbopol® 974P a 0 (1ª
inyección V1) y 35 (2ª inyección V2) días
Como en el ejemplo precedente, se observa que la
inyección de un canarypox - EIV (que expresa el gen HA del virus A
equi-1/Prague) mezclado con carbomero permite la
obtención de título IHA específicos elevados desde el D14 después de
una vacunación. De forma notable, estos título elevados son también
aumentados de forma significativa después del recuerdo para llegar a
un título medio muy elevado, con un nivel nunca observado antes para
el antígeno HA de virus EIV H7N7 en caballos no estimulados
previamente.
El virus recombinado sometido a ensayo es un
virus canarypox recombinado que expresa los genes gB, gC y gD del
herpesvirus felino (Feline Herpesvirus = FHV). Este virus
recombinado es identificado por vCP243 (ver ejemplo 7)
El protocolo de vacunación/prueba en el modelo
FHV es el siguiente.
Los gatos se vacunaron el D0 y el D28 por vía
subcutánea.
La vacuna CORIFELIN® es una vacuna FHV en
subunidades comercializada por Mérial, Lyon, Francia, que comprende
al menos 200 unidades IDR de fracciones virales de FHV, 25 \mug de
antígeno purificado de calicivirus felino, 0,1 mg de tiomersal y de
excipiente aceitoso QSP 1 ml.
El ensayo se realizó en el D49, por vía oronasal
de una cepa de ensayo FHV.
El seguimiento clínico se realizó durante 14 días
después del ensayo anotando los signos clínicos (anotación de los
signos clínicos según las normas de la Farmacopea Europea).
La protección fue apreciada después de la prueba
con los criterios siguientes:
- -
- marcadores clínicos medios de cada grupo, comparados entre sí y con marcador clínico medio del grupo testigo
- -
- nivel de excreción viral FHV después del ensayo (medición de la carga viral en muestras faríngeas realizadas diariamente desde el D0 al D10 después de la prueba)
- -
- títulos anticuerpos neutralizantes del virus FHV en tomas sanguíneas en los D0, D28, D49, D63.
Para todos estos criterios, los porcentajes
medios de cada grupo son igualmente comparados entre sí y con el
porcentaje medio del grupo testigo.
El virus recombinado sometido a ensayo es un
virus canarypox recombinado que expresa los genes HA y F del virus
de la enfermedad de Carré (Canine Distemper Virus, CDV). Este virus
recombinado se identificó vCP258 (ver ejemplo 2).
El protocolo de vacunación/prueba en el modelo
CDV es el siguiente.
Los perros se vacunaron el D0 y el D28 por vía
subcutánea.
La vacuna EURICAN® (CHPP12) es una vacuna viva
comercializada por Merial, Lyon, Francia. Una dosis comercial
contiene como mínimo 10^{4} pfu de la cepa vacunal CDV
Onderstepoort
El ensayo se realizó el D56, mediante
administración intracraniana de una dilución al 1/10ª de la cepa de
ensayo CDV "Zinder-Hill" (lote preparado y
suministrado por USDA). El seguimiento clínico se realizó durante 21
días después del ensayo anotando los signos clínicos (anotación de
los signos clínicos según las normas de la Farmacopea Europea).
La protección se apreció después del ensayo sobre
los criterios siguientes:
- -
- marcadores clínicos medios de cada grupo, comparados entre sí y con el marcador clínico medio del grupo testigo
- -
- nivel de viremia CDV después de la prueba (medición de la carga viral en los linfocitos el D56, D61, D63, D66, D70, D77)
- -
- títulos anticuerpos neutralizantes de los virus CDV en el D0, D14, D28, D42, D56, D63, D77.
Para todos estos criterios, los porcentajes
medios de cada grupo se compararon igualmente entre sí y con el
porcentaje medio del grupo testigo.
Claims (39)
1. Vacuna viva recombinante que comprende un
vector viral que incorpora y expresa in vivo una secuencia
nucleotídica heteróloga seleccionada entre un gen de un herpes virus
animal y un gen de un virus influenza, y al menos un compuesto
adyuvante seleccionado entre los polímeros del ácido acrílico o
metacrílico y los copolímeros de anhídrido maléico y de derivado
alquenilo.
2. Vacuna según la reivindicación 1,
caracterizada porque comprende como compuesto adyuvante un
polímero del ácido acrílico o metacrílico reticulado por un éter
polialquenilico de azúcar o de polialcohol.
3. Vacuna según la reivindicación 2,
caracterizada porque el polímero es reticulado por una alil
sacarosa o por alilpentaeritritol.
4. Vacuna según la reivindicación 1,
caracterizada porque comprende como compuesto adyuvante un
copolímero de anhídrido maléico y de etileno lineal o reticulado,
por ejemplo reticulado por diviniléter.
5. Vacuna según la reivindicación 1,
caracterizada porque, como compuesto adyuvante, comprende un
carbomero.
6. Vacuna según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el compuesto
adyuvante está presente en la vacuna a razón de 0,01% a 2% PN.
7. Vacuna según la reivindicación 6,
caracterizada porque la concentración es de 0,06 a 1% en PN,
de preferencia de 0,1 a 0,6% en P/V.
8. Vacuna según una de las reivindicaciones 1 a
7, caracterizada porque comprende un vector que incorpora y
expresa al menos un gen de un herpes virus animal.
9. Vacuna según la reivindicación 8,
caracterizada porque el gen proveniente de un herpes virus
seleccionado entre el grupo que consiste en herpes virus equino
EHV-1 y/o EHV-4, herpes virus felino
FHV, herpes virus canino CHV, herpes virus aviar ILTV o Marek,
herpes virus bovino BHV y herpes virus porcino PRV.
10. Vacuna según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque comprende al
menos un vector que incorpora y que expresa al menos un gen de un
virus influenza.
11. Vacuna según la reivindicación 10,
caracterizada porque el vector expresa un gen de un virus
influenza seleccionado entre el grupo que consiste en virus de gripe
equina, virus de gripe aviar y virus de gripe porcina.
12. Vacuna según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, destinada para la vacunación de un animal de
la especie equina y que comprende un vector viral que incorpora un
gen del herpesvirus equino o un gen de un virus influenza.
13. Vacuna según la reivindicación 12,
caracterizada porque comprende un gen del herpesvirus equino
EHV-1 y/o EHV-4.
14. Vacuna según la reivindicación 12,
caracterizada porque comprende un gen de un virus influenza
equina.
15. Vacuna según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque el vector viral
es elegido entre el grupo que consiste en poxvirus, adenovirus,
herpes virus.
16. Vacuna según la reivindicación 15,
caracterizada porque el poxvirus es elegido entre el grupo
que consiste en virus de la vacuna, fowlpox, canarypox, pigeonpox,
swinepox.
17. Vacuna según la reivindicación 16,
caracterizada porque el virus de la vacuna es el NYVAC.
18. Vacuna según la reivindicación 13,
caracterizada porque comprende un vector canarypox que
incorpora y expresa los genes gB, gC y gD del virus herpes equino
EHV-1 y/o EHV-4.
19. Vacuna según la reivindicación 14,
caracterizada porque comprende dos o tres vectores canarypox
que comprenden cada uno un gen HA del virus de influenza equina,
proviniendo cada gen HA de una cepa diferente.
20. Vacuna según la reivindicación 14,
caracterizada porque comprende un vector canarypox que
comprende dos o tres genes HA de cepas diferentes de virus de
influenza equina.
21. Vacuna según la reivindicación 19 ó 20,
caracterizada porque comprende dos o tres genes HA que
proceden de las cepas Prague, Kentucky y/o Newmarket.
\newpage
22. Vacuna según una de las reivindicaciones 16,
18-21, caracterizada porque el vector
canarypox es un vector ALVAC.
23. Vacuna según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, destinada a la vacunación de un animal de
una especie aviar contra el virus influenza y que comprende un
vector viral que incorpora un gen de un virus influenza.
24. Conjunto de vacunación que comprende,
acondicionados por separado, por una parte, en forma liofilizada,
una vacuna viva recombinante que comprende un vector viral que
incorpora y expresa in vivo una secuencia nucleotídica
heteróloga seleccionada entre un gen de un herpes virus animal y un
gen de un virus influenza, de preferencia tal como se ha definido en
una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 23, y por otra parte, una
solución de al menos un compuesto adyuvante seleccionado entre los
polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de
anhídrido maléico y de derivado alquenilo, tal como se ha definido
en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, estando la solución
de adyuvante destinada para la recuperación de la vacuna
liofilizada.
25. Utilización de un compuesto seleccionado
entre los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los
copolímeros de anhídrido maléico y de derivado alquenilo, tales como
los definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y de
un vector viral que comprende y expresa in vivo la secuencia
nucleotídica de un gen de un herpes virus animal, para la producción
de una vacuna viva recombinada adyuvada destinada a proteger un
animal en relación con la enfermedad causada por este herpes
virus.
26. Utilización según la reivindicación 25,
caracterizada porque el gen es un gen de un herpes virus
equino EHV-1 y/o EHV-4, para la
producción de una vacuna viva recombinada adyuvada destinada a
proteger un animal de la especie equina respecto a la enfermedad
causada por este herpes virus.
27. Utilización de un compuesto seleccionado
entre los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los
copolímeros de anhídrido maléico y de derivado alquenilo, tales como
se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y
de un vector viral que incorpora y expresa in vivo la
secuencia nucleotídica de un gen de un virus influenza, para la
producción de una vacuna viva recombinada destinada a proteger un
animal contra la gripe.
28. Utilización según la reivindicación 28,
caracterizada porque el gen es un gen de un virus influenza
equina, para la producción de una vacuna viva recombinada adyuvada
destinada a proteger un animal de la especie equina contra la gripe
equina.
29. Utilización de un compuesto seleccionado
entre los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los
copolímeros de anhídrido maléico y de derivado alquenilo, tales como
se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y
un vector viral que incorpora y expresa in vivo la secuencia
nucleotídica de un gen de un herpes virus equino, para la producción
de una vacuna viva recombinada adyuvada que permite inducir en un
animal de la especie equina una disminución significativa de la
excreción viral relativa al herpes virus equino.
30. Utilización de un compuesto seleccionado
entre los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los
copolímeros de anhídrido maleíco y de derivado alquenilo, tales como
se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y
de un vector viral que incorpora y expresa in vivo la
secuencia nucleotídica de un gen de un virus influenza, para la
producción de una vacuna viva recombinada adyuvada que permite
inducir en un animal de la especie equina una disminución
significativa de la excreción viral relativa al virus influenza.
31. Utilización de un compuesto seleccionado
entre los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los
copolímeros de anhídrido maléico y de derivado alquenilo, tales como
se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y
un vector viral que incorpora y expresa in vivo la secuencia
nucleotídica de un gen de un virus influenza, para la producción de
una vacuna viva recombinada adyuvada que permite inducir en un
animal de la especie equina la producción precoz de anticuerpos
contra el virus influenza.
32. Utilización según la reivindicación 31,
caracterizada porque se trata de una producción de
anticuerpos observada después de una sola administración.
33. Utilización de un compuesto seleccionado
entre los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los
copolímeros de anhídrido maléico y de derivado alquenilo, tales como
se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y
de un vector viral que incorpora y expresa in vivo la
secuencia nucleotídica de un gen de un virus influenza, para la
producción de una vacuna viva recombinada adyuvada destinada para
proteger un animal de una especie aviar contra la gripe aviar.
34. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 33, caracterizada porque, como
adyuvante, se utiliza un carbomero.
35. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 34, caracterizada porque el vector
viral es un poxvirus, de preferencia seleccionado entre el virus de
la vacuna, fowlpox, canarypox, pigeonpox y swinepox.
36. Utilización según la reivindicación 28, 30,
31 ó 32, caracterizada porque el vector viral es un canarypox
que comprende un gen HA del virus influenza.
37. Utilización según la reivindicación 36,
caracterizada porque se utilizan dos o tres vectores
canarypox que comprenden un gen HA del virus influenza equina,
proviniendo cada gen HA de una cepa diferente.
38. Utilización según la reivindicación 37,
caracterizada porque se trata de las cepas Prague, Kenctucky
y Newmarket.
39. Utilización según la reivindicación 26 ó 29,
caracterizada porque el vector viral es un canarypox que
comprende los genes gB, gC y gD de EHV-1 y/o
EHV-4.
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