MXPA00008524A - Vacunas vivas recombinantes y adyuvantes - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la vacuna viva recombinante comprende un vector viral que incorpora y expresa in vivo una secuencia nucleotídica heteróloga, preferentemente un gen de un agente patógeno, y por lo menos un compuesto adyuvante elegido entre los polímeros acrílico o metacrílico y los copolimeros de anhídrido maleico y de derivado alquenilo. Se trata particularmente de un polímero delácido acrílico o metacrílico reticulado por unéter polialcenílico de azúcar o de polialcohol (carbómero), en particular reticulado por una alil sacarosa o por alilpentaeritrita. También se puede tratar de un copolímero de anhídrido maleico y de etileno reticulado, por ejemplo poréter divinílico.

Description

VACUNAS VIVAS RECOMBINANTES Y ADYUVANTES DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un perfeccionamiento de vacunas vivas recombinantes que integran y expresan in vi vo uno o varios genes heterólogos. Trata en particular de tales vacunas adyuvantes, de la utilización de compuestos adyuvantes » particulares para la aplicación de tales vacunas así como de los métodos de vacunación relacionados. También tiene por objeto un procedimiento de preparación de tales vacunas. Es clásico incorporar a las vacunas inactivadas o de subunidades, adyuvantes destinados a aumentar la respuesta inmunitaria con respecto a los antígenos que comprenden estas vacunas. Se ha pensado también incorporar adyuvantes a las vacunas vivas atenuadas cuando la atenuación de los microorganismos ha llevado a una disminución de la respuesta inmunitaria. Recientemente también se han propuesto vacunaciones combinadas contra varios patógenos con ayuda de una vacuna inactivada para una valencia y de una vacuna viva atenuada para la otra valencia. Se ha REF: 122586 propuesto también econstituir la vacuna viva atenuada, conservada bajo forma liofilizada, en la composición de vacuna inactiva adyuvada. Esta tiene el rol de vehículo de recionstitución para la vacuna viva, sin que se haya inve tigado ningún efecto adyuvante para esta última. La EP-A-53283 propone una vacuna contra la rinoneumonía del caba. lo, patología provocada por el virus del herpes equin 3 (EHV) . La vacuna es una vacuna inactivada y adyuvada, que reagrupa los virus EHV-1 y los virus EHV-4 inactiv idos, adyuvados por el adyuvante Havlogen(R), a base de polímero poliacrílico. Como para la IIayoría de los virus del herpes, no existe actualment e ninguna vacuna eficaz que permita la eliminación rápida del virus después de la infección. Las vacuna ; conocidas tratan de proteger contra la aparición de síntomas clínicos. En general, el efecto sobre la exc eción viral es limitado. Según la EP-A-532833, la vacuna desarrollada conduciría a una caída de la excreción viral de 79 a 93% (ver parte Resul :ados) . Ocho animales testigos sobre nueve han excr stado el virus después de la prueba sobre un promec io de 1.4 días mientras que la duración de excreción normal después de la prueba es habitualmente superior o igual a 5 días. Esto refleja una prueba de débil intensidad que mejora artificialmente la protección de los caballos vacunados en relación con los testigos. La disminución de la excreción viral no es significativa en esta experiencia. También se han utilizado adyuvantes del tipo carbómero (carbomer) en vacunas de influenza equinas (IEV) con virus inactivado. Mu ford y col. (Epidemiol . Infect. (1994), 112, 421-437) recuerdan que hacen falta dos dosis de vacuna IEV equina para inducir en el caballo una respuesta humoral transitoria y una débil protección contra el virus. Los autores comparan los efectos adyuvantes del carbómero y del fosfato de aluminio sobre las vacunas inactivadas en presencia o no de anatoxina tetánica. En todos los casos, se obtiene un débil título de anticuerpos medido por la técnica SRH ("single radial haemolysis") frente a cepas H7N7 y H3N8 después de una primera vacunación y es necesario esperar una segunda, luego una tercera vacunación para que aparezcan las respuestas transitorias más fuertes. La US-A-4 , 500 , 513 presenta también ensayos de vacunación contra el virus de la influenza equina con una vacuna inactivada en presencia de un carbómero. El origen de los animales y su estado clínico no es - i - .*.-« indicado con precisión y parece que se trata de animales de campo (columna 11, 2do párrafo) . Los títulos elevados de anticuerpos, medidos por una técnica de inhibición de la hemaglutinación, indican que los animales ya habían sido infectados probablemente por influenza y que la respuesta inducida después de la vacunación era del tipo revacunación, y no de primovacunación . Finalmente, Fort Dodge Solvay comercializa vacunas contra la influenza equina inactivadas (Duvaxyn(R) IE e IE-T plus) y una vacuna contra la rinoneumonía equina inactivada (Duvaxyn(R) EHV?,4), en adyuvante carbómero. Se conocen también vacunas inactivadas comerciales contra la influenza equina, adyuvadas por hidróxido de aluminio (por ejemplo Tetagripif fa (R) , Mérial, Lyon, Francia) . Un gran número de otros adyuvantes ha sido utilizado en el marco de las vacunas clásicas inactivadas o de subunidades. Se pueden mencionar por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, Avridine(R), DDA, monofosforil lípido A, Pluronic L121 y otros polímeros en bloque, muramil péptidos, saponinas, trehalosa dimicolato, copolímeros de anhídrido maleico y de etileno, copolímeros de estireno y de ácido acrílico o metacrílico, polifosfaceno, emulsiones oleosas, etc. La WO-A-94 16881 sugiere adyuvar una vacuna viva recombinante que expresa un gen heterólogo de un virus envuelto por una composición vacunal bajo forma de emulsión agua en aceite, aceite en agua o agua en aceite en agua. Una solución como ésta puede presentar, sin embargo, un cierto número de inconvenientes. En la práctica, el usuario final debe disponer de una parte de principio activo liofilizado y de otra parte de una emulsión ya constituida, que debe permitir reconstituir el principio activo liofilizado. Una falta de estabilidad de la emulsión durante el almacenamiento podría ser perjudicial para la eficacia la inocuidad de la vacuna reconstituida. La actividad de los microorganismos vivos atenuados puede declinar como consecuencia de su inestabilidad en la fase oleosa. Este puede ser particularmente el caso para los virus que pueden perder su viabilidad. Las vacunas en emulsión pueden tener también problemas de inocuidad en el sitio de la inyección. La presente invención se ha puesto co o objetivo proponer nuevas composiciones de vacunas en base a vacunas vivas recombinantes que expresan por lo menos una secuencia nucleotídica heteróloga, particularmente genes heterólogos, que comprenden un adyuvante que sea capaz de aumentar de manera importante la inmunidad conferida con relación a la misma vacuna no adyuvada y que se adapte perfectamente a este tipo de vacuna. El solicitante ha hallado que los compuestos de la clase de los carbómeros pueden adyuvar en las condiciones requeridas a este tipo de vacuna y esto en proporciones inesperadas. Los ensayos realizados con los virus del herpes animales (EHV-1, Equine Herpes Virus) han mostrado que el aporte del carbómero permite disminuir la exreción viral después de una infección experimental, en proporciones inesperadas. Otros ensayos realizados sobre el virus de la influenza A equina han permitido obtener de manera sorprendente, en el caballo, dosajes serológicos precoces y muy elevados, superiores a los obtenidos con las mejores vacunas comerciales. La presente invención tiene por objeto una vacuna viva recombinante que comprende un vector viral que incorpora y expresa in vi vo una secuencia nucleotídica heteróloga, preferentemente un gen de un agente patógeno, y por lo menos un compuesto adyuvante elegido entre los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhidro maleico y del derivado alquenilo. Los compuestos preferidos son los polímeros del ácido acrílico o metacrílico reticulados, particularmente por éteres polialcenílieos de azúcares o de polialcoholes. Estos compuestos son conocidos bajo el término carbómero (Pharmeuropa vol. 8, No. 2, junio 1996) . El experto en la técnica puede referirse también a la US-A-2 , 909, 462 (incorporada como referencia) que describe tales polímeros acrílicos reticulados por un compuesto polihidroxilado que tiene por lo menos 3 grupos hidroxilo, preferentemente no más de 8, estando reemplazados los átomos de hidrógeno de por lo menos tres hidroxilos por radicales alifáticos insaturados que tienen por lo menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente msaturados . Los radicales insaturados pueden ellos mismos contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos vendidos bajo la denominación Carbopol (R) (BF Goodrich, Ohio, EEUU) son particularmente apropiados. Son reticulados por una alil sacarosa o por alilpentaeritrita. Entre ellos se pueden citar los Carbopol(R) 974P, 934P y 971P. Entre los copolímeros de anhídrido maleico y de derivado alquenilo, se prefieren los EMA(R) (Monsanto) que son copolímeros de anhírido maleico y de etileno, lineales o reticulados, por ejemplo, reticulados por éter divinílico. Se puede hacer referencia a J. Fields y col., Nature, 186; 778-780, 4 de junio de 1960, incorporado como- referencia. Sobre el plano de su estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los EMA(R) son formados preferentemente con motivos de base de la siguiente fórmula: en donde : - Ri y R2, idénticos o diferentes, respresentan H o CH3, - X = 0 ó 1, preferentemente x = 1, - y = 1 ó 2, con x + y = 2. Para los EMA(R), x = 0 e y = 2. Para los carbómeros, x = y = 1.

La disolución de estos polímeros en el agua conduce a una solución acida que será neutralizada, preferentemente hasta un pH fisiológico, para dar la solución adyuvante en la cual la vacuna propiamente dicha será incorporada. Los grupos carboxílicos del polímero están en parte bajo la forma COO. De manera preferida, se realiza una solución de adyuvante según la invención, particularmente de carbómero, en agua destilada, preferentemente en presencia de cloruro de sodio, estando la solución obtenida a pH ácido. Se diluye esta solución madre agregando en la cantidad necesaria (para la obtención de la concentración final deseada) o una parte importante de la misma, de agua cargada en NaCl, preferentemente agua fisiológica (NaCl 9 g/1), de una o varias veces con neutralización concomitante o subsiguiente (pH 7.3 a 7.4), preferentemente por NaOH. Esta solución de pH fisiológico será utilizada tal cual para reconstituir la vacuna, particularmente conservada bajo forma liofilizada. La concentración de polímero en la composición de la vacuna final será de 0.01% a 2% P/V, más particularmente de 0.06 a 1% P/V, preferentemente de 0.1 a 0.6% P/V.

La invención se revela particularmente útil para la vacunación contra los virus herpes animales. La invención se refiere particularmente a los virus del herpes equinos (EHV-1 y EHV-4 particularmente), felinos (FHV), caninos (CHV), aviares (Marek e ILTV) , bovinos (BHV) , porcinos (PRV = virus de la enfermedad de Aujeszky o virus de la pseudorrabia ) . La invención tiene por objeto vacunas vivas recombinantes que comprenden por lo menos un vector viral que incorpora y expresa por lo menos un gen de un virus del herpes y por lo menos un adyuvante de acuerdo con la invención. A título de ejemplo, el experto en la técnica puede referirse a la O-A-92 15672 (incorporada como referencia) que describe la realización de vectores de expresión en base al virus de la viruela ("poxvirus") capaces de expresar tales genes. Se hallará por ejemplo, la viruela del canario que expresa los genes gB, gC y gD de EHV-1 (Vcpl32), que es aplicable también al EHV-4, un virus de la vacuna que expresa estos mismos genes (vP 1043), un virus de la vacuna que expresa los genes g?(gB), g?II(gC), g?V(gD) de BHV-1, una viruela del canario que expresa el gD de FHV- 1 , o también los recombinantes que expresan los genes gil (gB), g?II(gC), gp50 (gD) de PRV. Se puede ^^^¿¿-^^^ referir también a la WO-A-95/26751 (incorporada como referencia), que describe los virus recombinantes vCP320, vCP322 y vCP294 que expresan los genes gB, gC, gD, respectivamente, de CHV. También se puede referir a los recombinantes que expresan los genes FHV, PRV, BHV en FR-A-2 , 647 , 808 o WO 90/12882 (incorporados como referencia) . La invención se revela también como particularmente interesante para la vacunación contra los virus de la influenza, como se demuestra aquí para el EIV (virus influenza equino o virus de la gripe equina) . También se puede mencionar la gripe aviar (AIV) , la gripe porcina (Swine influenza virus) . A título de ejemplo, el experto en la técnica puede referirse a la viruela del canario recombinante que expresa el gen HA del EIV en la WO-A-92 15 672. La invención tiene por objeto las vacunas vivas recombinantes que comprenden por lo menos un vector viral que incorpora y expresa por lo menos un gen de un virus influenza, y por lo menos un adyuvante de acuerdo con la invención. Particularmente, la vacuna comprende una mezcla de dos o tres vectores que incorporan y expresan cada uno un gen HA, proveniendo los genes de cepas diferentes, por ejemplo, de cepas de influenza equina (gripe equina), Prague, Kentucky y Newmarket. En el mismo orden de ideas, puede utilizarse un solo vector para incorporar y expresar los HA de 2 o de 3 cepas. La invención se aplica también a otros patógenos animales, tales como particularmente FeLV (ver también viruela del canario recombinante en la WO-A-92 15672 a título de ejemplo, que expresan env, gag = vCP93 y vCP97), el tétanos (ver también la WO-A- 92 15672 y los recombinantes vCPlßl y VP1075, viruela del canario y vacuna, que expresan la toxina tetánica), virus de la enfermedad de Carré (canine distemper virus o CDV) (ver recombinante vCP 258 en la WO-A-95 27780, incorporado como referencia) . La invención tiene por objeto vacunas vivas recombinantes que comprenden por lo menos un vector viral que incorpora y expresa por lo menos un gen de tales virus . La invención también tiene por objeto vacunas recombinantes muí tivalentes , es decir, que contienen dos o varios vectores recombinantes que expresan antígenos de dos o más enfermedades, mezcladas en una solución adyuvante de acuerdo con la inyección. En resumen, la invención se aplica a la utilización de todo tipo de vector viral de expresión, tal como el virus de la viruela (virus de la vacuna, y que comprende NYVAC según la WO-A-92/15672 , la viruela de las aves, la viruela del canario, la viruela de las palomas, la viruela porcina, etc.), adenovirus, virus del herpes. La viruela del canario,- por ejemplo ALVAC (WO-A-95/27780 y WO-A-92/15762 ) , se revela particularmente apropiada en el marco de la presente invención. En la vacuna lista para usar, particularmente reconstituida, el vector viral está presente en las cantidades habitualmente utilizadas y descritas en la bibliografía. Las vacunas vivas recombinantes se presentan en general bajo una forma liofilizada que permite su conservación y su preparación extemporánea en un solvente o excipiente, que será aquí la solución del adyuvante de acuerdo con la invención. La invención tiene también por objeto un kit de vacunación que comprende, acondicionados en forma separada, vacuna liofilizada y una solución del compuesto adyuvante de acuerdo con la invención para la reconstitución de la vacuna liofilizada. La invención tiene también por objeto un método de vacunación que consiste en administrar por vía parenteral, preferentemente subcutánea, intramuscular, intradérmica, o por vía mucosa, una vacuna de acuerdo con la invención, a razón de una o varias administraciones, eventualmente con una etapa previa de reconstitución de la vacuna liofilizada (el vector recombinante) en una solución de compuesto adyuvante. Un objetivo de un método como este puede ser proteger a los animales en el plano clínico y disminuir la excreción viral, lo que corresponde sobre todo al caso de los virus del herpes. Otro objetivo puede ser aumentar la respuesta inmunitaria y hacerla más precoz, particularmente por inducción de anticuerpos desde la primera administración. La invención tiene además por objeto la utilización de compuestos adyuvantes de acuerdo con la invención para la realización de las vacunas vivas recombinantes, particularmente que confieren una respuesta inmunitaria mejorada y más precoz y/o una disminución aumentada de la excreción viral . Se hará referencia a lo dicho precedentemente. La invención será descrita ahora con mayor detalle con ayuda de formas de realización tomadas a título de ejemplos no limitativos y que se refieren al dibujo en el cual: la figura 1 representa la secuencia nucleotídica del gen EIV HA de la cepa EIV Ne market 2/93; la figura 2 representa la secuencia nucleotídica del gen FHV- 1 gC; ^H¡^^§^ s¡^^ la figura 3 representa un gráfico que muestra la evolución de la excreción viral después de la infección experimental en los caballos vacunados con ayuda de diferentes vacunas contra el virus del herpes equino .

EJEMPLOS Ejemplo 1: Generación de los plásmidos dadores para los sitios de inserción C3, C5 y C6 en el virus de la viruela del canario "ALVAC" Los plásmidos dadores para los diferentes sitios de inserción en el virus de la viruela del canario "ALVAC" (Tartaglia y col., Virology, 1992, 188, 217-232 incorporado como referencia), se describen en la solicitud WO-A-95/27780 , ejemplo 20. Estos plásmidos han sido denominados en esta solicitud de la siguiente manera: "plásmido VQH6CP3LSA.2 " para el sitio "C3" "plásmido HC5LSP28" para el sitio "C5" "plásmido pC6L" para el sitio "C6".

Ejemplo 2: Generación del virus recombinado vCP258 (ALVAC /CDV HA+F) La cepa Onders tepoort del virus CDV ha sido utilizada para aislar los genes HA y F. (Secuencia del gen HA descrita por Curran y col., Virology, 1991, 72, 443-447, y la secuencia del gen F descrita por Barrett y col., Virus Research, 1987, 8, 373-386, incorporados como referencia) . La construcción del plásmido dador pMM103 para la inserción de los cassettes de expresión promotor vacuna H6-gen CDV F y promotor vacuna H6-gen CDV HA en el locus C6 del virus ALVAC se describe en el ejemplo 19 de la solicitud WO-A- 95/27780. Este plásmido ha sido utilizado como plásmido dador para la recombinación in vi tro (Piccini y col., Methods m Enzymology, 1987, 153, 545-583, incorporado como referencia) con el virus ALVAC para generar el virus recombinado designado vCP258 como en el ejemplo 19 de la solicitud mencionada más arriba.

Ejemplo 3: Generación del virus recombinado VCP1502 (ALVAC/EIV HA Prague) La secuencia del gen HA (cepa EIV Prague) se presenta en la figura No. 23 de la solicitud WO-A-92/15672. El ARN viral del genoma del virus de la gripe equina cepa Prague 56 fue extraído a partir de 100 µl de una suspensión viral de este virus con el kit de extracción "Total RNA Separator kit" de CLONTECH (Palo Alto, CA) ( CAt#Kl 0242- 1 ) . El residuo de ARN es retomado en 10 µl de agua ultrapura y se realizó una reacción de síntesis de ADN complementario, seguida por una amplificación PCR (=reacción "RT-PCR") tomando como matriz 2 µl de ARN viral purificado y los oligonucleótidos siguientes: TAY51A (SEQ ID No. 1) (70 mer) 5 ' CGCGGCCATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAACACTCAAATTC TAATATTAGCCACTTCGG 3' y TAY53A (SEQ ID No. 2) (36 mer) 5' CGCGCGGCGGTACCTTATATACAAATAGTGCACCGC 3' para amplificar el gen EIV HA Prague. El fragmento PCR así obtenido fue ligado en el vector pCRII (InVitrogen, San Diego, CA) para dar el plásmido pJT007) . El plásmido pJT007 fue digerido por NruI y Asp718 para aislar un fragmento NruI-718 de aproximadamente 1800 pb que contiene el final del promotor H5 y el gen HA Prague 56 en su totalidad. Este fragmento fue ligado con el plásmido dador C5 HC5LSP28, digerido previamente por NruI y Asp718, para dar finalmente el plásmido pJT008. Este plásmido contiene el cassette de expresión H6-gen Ha Prague 56 en el locus C5 del virus ALVAC. La estructura de este plásmido fue verificada por secuenciación y mapa de restricción completo. ~tAA¿?>. y Este plásmido es el plásmido dador para la inserción del cassette de expresión H6-gen HA Prague 56 en el locus C5. Después de la linealización por Notl, el plásmido pJTOOd fue utilizado como plásmido dador para la recombinación in vi t ro (Piccini y col., Methods in Enzymology 1987, 153, 545-563) con el virus ALVAC para generar el virus recombinado denominado vCP1502.

Ejemplo 4: Generación del virus recombinado vCP1529 (ALVAC/EIV HA Kentucky 1/94) El ARN viral del genoma del virus de la gripe equina cepa Kentucky 1/94 (Daly y col., J. Gen.

Virol., 1996, 77, 661-671, incorporado como referencia) fue extraído a partir de 100 µl de una suspensión viral de este virus con el kit de extracción "Total RNA Separator kit" de CLONTECH (Palo Alto, CA) (Cat#K1042-l) . El residuo de ARN fue retomado en 10 µl de agua ultrapura y se realizó una reacción RT-PCR tomando como matriz 2 µl de ARN viral purificado y los siguientes oligonucleótidos : TAY55A (SEQ ID No. 3) (70 mer) 5 ' CGCGGCCATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAAGACAACCATTA TTTTGATACTACTGACCC 3' y TAY57A (SEQ ID No. 4) (42 mer) S^WSfeBlfiMtefe 5' CGCGCGGCGGTACCTCAAATGCAAATGTTGCATCTGATGTTG 3' para amplificar el gen HA. El fragmento PCR así obtenido fue ligado en el vector pCRII (InVitrogen, San Diego, CA) para dar el plásmido pJTOOl. La secuencia del gen EIV HA cepa Kentucky 1/94 clonado en el plásmido pJTOOl no es diferente de la secuencia del gen EIV HA cepa Kentucky 1/94 disponible en la base de datos GenBank (Número de acceso L39914, incorporado como referencia) . El plásmido pJTOOl que contiene el gen HA (Kentucky 1/94) fue digerido por NruI y Asp718 para aislar un fragmento Nrul-Asp718 de 1800 pb (que contiene el final del promotor H6 y el gen HA Kentucky 1/94 en su totalidad) . Este fragmento fue ligado con el plásmido dador C5 HC5LSP28, previamente digerido por NruI y Asp718, para dar finalmente el plásmido pJT005. Este plásmido contiene el cassette de expresión H6-gen HA Kentucky 1/94 en el locus C5 del virus ALVAC. La estructura de este plásmido fue verificada por secuenciación y mapa de restricción completo . Este plásmido es el plásmido dador para la inserción del cassette de expresión H6-gen HA Kentucky 1/94 en el locus C5. \ ?- ; -»- * i -*& & *,* f ^ ^ -&H&L ~?£g- Después de la linealización por Notl, el plásmido pJT005 fue utilizado como plásmido dador para la recombinación in vi t ro (Piccini y col., Methods in Enzymology, 1987, 153, 545-563) con el virus ALVAC para generar el virus recombinado designado vCP1529.

Ejemplo 5: Generación del virus recombinado vCP1533 (ALVAC/EIV HA Newmarket 2/93 El ARN viral del genoma del virus de la gripe equina cepa Newmarket 2/93 (Daly y col., J. Gen. Virol. 1996, 77, 661-671) fue extraído a partir de 100 µl de una suspensión viral de este virus con el kit de extracción "Total RNA Separator kit" de CLONTECH (Cat#K1042): El residuo de ARN fue retomado en 10 µl de agua ultrapura y se realizó una reacción RT-PCR tomando como matriz 2 µl de ARN viral purificado y los siguientes oligonucleótidos: CCL007 (SEQ ID No. 5) (40 mer) 5' TTGTCGACTCAATCATGAAGACAACCAATTATTTTGATACT 3' y CCL0018 (SEQ ID No. 6) (34 mer) 5' TTGGATCCTTACTCAAATGCAAATGTTGCAAYCTG 3' para amplificar el gen HA. El fragmento PCR así obtenido fue ligado en el vector pCRII (Invitrogen, San Diego, CA) para dar el plásmido pCCL026. La secuencia del gen HA (cepa EIV Newmarket 2/93) se presenta en la figura No. 1 (SEQ ID No. 7) . El plásmido pCCL026 que contiene el gen HA (cepa Newmarket 2/93) fue digerido por Spel y Accl . Los siguientes oligonucleótidos: TAY99N (SEQ ID No. 8) (74 mer) 5 ' CTAGTTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAAGACAACCATTATTT TGATACTACTGACCCATTGGGT 3' y TAY100N (SEQ ID No. 9) (72 mer) 5 ' AGACCCAATGGGTCAGTAGTATCAAAATAATGGTTGTCTTCATTACGATACA AACTTAACGGATATCGCGAA 3' fueron apareados y ligados con el plásmido pCCL026 digerido por Spel+Accl para dar el plásmido pJT003. El oligonucleótido de doble hebra TAY99N/TAY100N contiene la región 3' del promotor H6 hasta el sitio NruI y las primeras 40 bases codificadoras del gen HA. El plásmido JT003 fue digerido por NruI y Xhol para aislar un fragmento Nrul-Xhol de aproximadamente 1800 pb que contiene el final del promotor H6 y el gen HA en su totalidad. Este fragmento fue ligado con el plásmido dador C5 HC5LSP28, previamente digerido por NruI y Xhol, para dar finalmente el plásmido pJT004. Este plásmido contiene el cassette de expresión H6-gen HA Newmarket 2/93 en el locus C5 del virus ALVAC. La estructura de este plásmido fue verificada por secuenciación y mapa de restricción completo. Este plásmido es el plásmido dador para la inserción del cassette de expresión H6-gen HA Newmarket 2/93 en el locus C5. Después de la linealización por Pvul, el plásmido pJT004 fue utilizado como plásmido dador para la recombinación in vi t ro (Piccini, y col., Methods in Enzy ology, 1987, 153, 545-563) con el virus ALVAC para generar el virus recombinado denominado VCP1533.

Ejemplo 6: Generación del virus recombinado vCP132 (ALVAC/EHV-1 gB+gC+gD) La construcción del virus recombinado se describe en los ejemplos 25 y 26 de la solicitud WO-A-92/15672. Este virus fue generado por recombinación in vi tro entre el virus ALVAC y el plásmido dador pJCA049. Este plásmido contiene los 3 cassettes de expresión siguientes clonados en el sitio de inserción C3: promotor vacuna 13L-gen EHV-1 gB promotor vacuna H6-gen EHV-1 gC promotor entomopox 42K-gen EHV-1 gD Las secuencias de los genes EHV-1 gB, gC y gD se describen en la solicitud WO-A- 92/15672 en las figuras No. 2 (secuencia del gen EHV-1 gpl3 = gC), No. 6 (secuencia del gen EHV-1 gpl4 = gB) y No. 12 (secuencia de los genes EHV-1 gD, gp63 y gE ) .

Ejemplo 7: Generación del virus recombinado vCP243 (ALVAC/FHV-1 gB+gC+gD La secuencia del gen FHV-1 gB (cepa CO) se presenta en la figura No. 34 de la solicitud WO-A-90/12882. El gen FHV- 1 gC (cepa CO) (secuencia presentada en la figura No. 2) (SEQ ID No. 10) fue clonado a partir del fragmento EcoRI F (7.6 kpb ) . Hay un tamaño de 1599 pb y codifica una proteína de 533 aminoácidos . El gen FHV-1 gD (cepa CO) (secuencia presentada en la figura No. 28) de la solicitud WO-A-92/15872) fue clonado a partir del fragmento EcoRI M (4.4 kpb) (plásmido pFHVEcoRIM) .

Construcción del cassette de expresión 13L-gen FHV- 1 gB mutado al nivel de las señales de detención precoz de la transcripción (TTTTTNT) . Los siguientes oligonucleótidos: MP287 (SEQ ID No. 11) (20 mer) 5' GATTAAACCTAAATAATTGT 3' y JCA158 (SEQ ID No. 12) (21 mer) .& -- .«- * 5' TTTTTCTAGACTGCAGCCCGGGACATCATGCAGTGGTTAAAC 3' fueron utilizados para una amplificación PCR con la matriz de un plásmido que contenía el promotor vacuna 13L (Riviére y col., J. Virol. 1992, 66, 3424-3434, incorporado como referencia) para generar un fragmento Xbal-extremo libre de 120 pb (que contenía el promotor vacuna 13L) = fragmento A. Los siguientes oligonucleótidos: JCA213 (SEQ ID No. 13 (18 mer) 5'GGGTTTCAGAGGCAGTTC 3' y JCA238 (SEQ ID No. 14) (21 mer) 5'ATGTCCACTCGTGGCGATCTT 3' fueron utilizados para generar por PCR a partir de la matriz del plásmido pJCOOl un fragmento de extremo libre-BamHI de 720 pb (que contiene la parte 5' del gen FHV-1 gB ) = fragmento B. El fragmento A fue digerido por Xbal, luego fosforilado. El fragmento B fue digerido por Ba Hl, luego fosforilado. Los fragmentos A y B fueron ligados a continuación junto con el vector pBluescript SK+, digerido previamente por Xbal y BamHl, para dar el plásmido pJCA075. Los siguientes oligonucleótidos: JCA158 (SEQ ID No. 15) Y JCA211 (SEQ ID No. 16) (21 mer) : 5' GTGGACACATATAGAAAGTCG 3' fueron utilizados para generar por PCR a partir de la matriz del plásmido pJCA075 un fragmento Xbal-extremo libre de 510 pb (que contiene el promotor 13L fusionado a la parte 5' del gen FHV-1 gB mutado al nivel de la señal TTTTTNT) = fragmento C. Los siguientes oligonucleótidos: JCA212 (SEQ IP No. 17) ( 21 mer) 5'CACCTTCAGGATCTACTGTCG 3' y JCA213 (SEQ IP No. 13) (18 mer) fueron utilizados para generar por PCR a partir de la matriz del plásmido pJCAOOl un fragmento de extremo libre-BamHI de 330 pb (que contiene la parte central del gen FHV- 1 gB) = fragmento P. El fragmento C fue digerido por Xbal, luego fosforilado. Los fragmentos C y P fueron ligados luego junto con el vector pBluescript SK+, digerido previamente por Xbal y BamHl, para dar el plásmido pJCA076. Los siguientes oligonucleótidos: JCA239 (SEQ ID No. 18) (24 mer) 5'ACGCATGATGACAAGATTATTATC 3' y JCA249 (SEQ ID No. 19) (18 mer) 5' CTGTGGAATTCGAAATGC 3' fueron utilizados para generar por PCR a partir de la matriz del plásmido pJCAOOl un fragmento EcoRI-extremo libre de 695 pb (que contiene la primera parte 3' del gen FHV1 gB) = fragmento E. Los siguientes oligo ucleótidos : JCA221 (SEQ IP No. 20) (48 mer) 5' AAAACTGCAGCCCGGGAAGCTTACAAAAATTAGATTTGTTTCAGTATC 3' y JCA247 (SEQ IP No. 21) (36 mer) 5 ' GGTATGGCAAATTTCTTTCAGGGACTCGGGGATGTG 3 ' fueron utilizados para generar por PCR a partir de la matriz del plásmido pJCAOOl un fragmento de extremo libre-Pstl de 560 pb (que contiene la segunda parte 3' del gen FHV-1 gB mutado al nivel de la señal TTTTTNT) = fragmento F. El fragmento E fue digerido por EcoRI, luego fosforilado. El fragmento F fue digerido por PstI, luego fosforilado. Los fragmentos E y F fueron ligados junto con el vector plB124 (International Biotechnologies Inc., New Haver, CT, digerido previamente por EcoRI y PstI, para dar el plásmido pJCA077 (que contiene el cassette promotor de vacuna 13L-gen FHV-1 B) . Construcción del cassette de expresión 42KFHV-1 gP Los siguientes oligonucleótidos: RG286 (SEQ IP No. 22) (17 mer) 5' TTTATATTGTAATTATA 3' y M13F (SEQ IP No. 23) (17 mer) 5' GTAAAACGACGGCCAGT 3' fueron utilizados para generar por PCR a partir de la matriz del plásmido que contiene el promotor Entomopoxvirus AmEPV 42K (descrito en el ejemplo 21 de la patente US-A-5 , 505 , 941 ) un fragmento EcoRI-extremo libre de 130 pb (que contiene el promotor entomopox 42K) = fragmento A. Los siguientes oligonucleótidos: JCA234 (SEQ IP No. 24) (21 mer) 5' ATGATGACACGTCTACATTTT 3' y JCA235 (SEQ IP No. 25) (21 mer) fueron utilizados para generar por PCR a partir de la matriz del plásmido pFHVEcoRIM un fragmento extremo libre-BamHI de 185 pb (que contiene la parte 5' del gen FHV- 1 gP) = fragmento B. El fragmento A fue digerido por EcoRI, luego fosforilado. El fragmento B fue digerido por Ba Hl, luego fosforilado. Los fragmentos A y B fueron ligados junto con el vector pBluescript SK+, digerido previamente por EcoRI y BamHl, para dar el plásmido pJCA078. El plásmido pFHVEcoRIM (ver más arriba) fue digerido por Ba Hl y Xhol para aislar el fragmento Ba HI-Xhol de 1270 pb (que contiene la parte 3' del gen FHV-1 gP) . Este fragmento fue ligado con el vector pIBI24, digerido previamente por BamHl, para dar el plásmido pJCA072.

Los siguientes oligonucleótidos: JCA242 (SEQ IP No. 26) (18 mer) 5' GAGGATTCGAAACGGTCC 3' y JCA237 (SEQ IP No. 27) (53 mer) 5 ' AATTTTCTCGAGAAGCTTGTTAACAAAAATCATTAAGGATGGTAGATTGCATG 3 ' fueron utilizados para generar por PCR a partir de la matriz pFHVEcoRIM un fragmento Xbal-Xhol de 290 pb . Este fragmento fue digerido por Xbal y Xhol = fragmento C (que contiene el final del gen FHV-1 gP) . El plásmido pJCA072 fue digerido opr Xbal y Xhol para aislar el fragmento Xbal-Xhol de 3575 pb (vector pIBI24 + comienzo de la parte 3' del gen FHV-1 gP) = fragmento P. Los fragmentos C y P fueron ligados luego juntos para dar el plásmido pJCA073. El plásmido pJCA073 fue digerido por BamHl y Xhol para aislar el fragmento BamHI-XhoI de 960 pb (que contiene la parte 3' del gen FHV-1 gP) = fragmento A. El plásmido pJCA078 fue digerido por Hpal y BamHl para aislar el fragmento Hpal-BamHI de 310 pb (que contiene el promotor 42K fusionado a la parte 5' del gen FHV-1 gP) = fragmento B. Los fragmento A y B fueron ligados junto con el vector pBluescript SK+, digerido previamente por EcoRV y Xhol, para dar el plásmido pJCA080 (que contiene el cassette promotor 42K-gen FHV-1 gP) .

Construcción del cassette H6-FHV-1 gC El APN genómico del virus FHV- 1 (cepa CO) fue digerido por EcoRI y el fragmento EcoRI F de aproximadamente 7500 pb fue clonado en pBluescript SK+ paa dar el plásmido pFHVEcoRIF. Los siguientes nucleótidos: JCA274 (SEQ IP No. 28) (55 mer) 5 ' CATTATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAGACGATATAGGATGGGAC 3 ' y JCA275 (SEQ IP No. 29) (18 mer) 5'ACTATTTTCAATACTGAC 3' fueron utilizados para generar por PCR a partir de la matriz pFHVEcoRIF un fragmento que fue digerido por NruI y Salí para dar un fragmento Nrl-Sall de 107 pb (que contiene la parte 3' del promotor vacuna H6 fusionado con la parte 5' del gen FHV-1 gC ) = fragmento A. Los siguientes oligonucleótidos: JCA276 (SEQ IP No. 30) (18 mer) 5'AAATGTGTACCACGGGAC 3' y JCA277 (SEQ IP No. 31) (54 mer) 5 ' AAGAAGCTTCTGCAGAATTCGTTAACAAAAATCATTATAATCGCCGGGGATGAG 3 ' fueron utilizados para generar por PCR a partir de la matriz pFHVEcoRIF un fragmento que fue digerido por EcoRV e HindIII para dar un fragmento EcoRV-HindI I I de 370 pb (que contiene la parte 3' del gen FHV-1 gC y los sitios hpal-EcoRI-Pstl-HindlI I ) = fragmento B. El plásmido pJCA020 (ver más arriba) fue digerido por NruI e HindIII para aislar el fragmento HindIII-NruI (que contiene la parte 5' del promotor vacuna H6) = fragmento C. El plásmido pFHVEcoRIF fue digerido por Ba Hl y EcoRV para aislar el fragmento BAMHI-EcoRV de 580 pb (que contiene la parte central del gen FHV-1 gC) = fragmento P. Los fragmentos A y C fueron ligados junto con el vector pBluescript SK+ digerido previamente por HindIII y Salí para dar el plásmido pJCA097. Los fragmentos B y P fueron ligados junto con el vector pBluescript SK+ digerido previamente por BamHl e HmdlII, para dar el plásmido pJCA099. El plásmido pJC097 fue digerido por PSTI y Salí para aislar el fragmento PstI-SalI de 200 pb (que contiene el cassette H6-parte 5' de gC) = fragmento E. El plásmido pFHVIEcoRIF fue digerido por BamHl y Salí para aislar el fragmento SalI-BamHI de 600 pb (2da. parte central de FHV-1 gC) = fragmento F. Los fragmentos E y F fueron ligados junto con el vector pBluescript SK+, digerido previamente por BamHl y PstI, para dar el plásmido pJCA098. El plásmido pJCA098 fue digerido a continuación por EcoRI y Ba Hl para aislar el fragmento Ecs?.I-BamHI de 800 pb (que contiene el cassette HC-parte 5' de FHV-lgC) = fragmento G. El plásmido pJCA099 (ver más arriba) fue digerido por Ba Hl e HindIII para aislar el fragmento BamHI-HindI 11 de 960 pb (que contiene la parte 3' del gen FHV-1 gC) = fragmento H. Los fragmentos G y H fueron ligados junto con el vector pBluescript SK+, digerido previamente por EcoRV e HindIII, para dar el plásmido pJCAlOO (que contiene el cassette de expresión promotor vacuna H6-gen FHV- 1 gC) . El plásmido pJCAlOO fue digerido por NruI y EcoRI para aislar el fragmento NruI-EcoRI de 1650 pb que contiene la parte 3' del promotor H6 fusionado al gen FHV- 1 gC . Este fragmento fue ligado con el plásmido pJCA053 (cassette VQH6-IBV M en el vector pBluescript SK+), digerido previamente por NruI y EcoRI, para dar el plásmido pJCAlOd (que contiene el cassette VQH6-gC en pBluescript SK+) . El plásmido pJCA079 (ver más arriba) fue digerido por Smal y BamHl para aislar el fragmento BamHI-Smal de 840 pb (que contiene el cassette 13L-parte 5' del gen FHV-1 gB) = fragmento A. El plásmido pJCA079 fue digerido igualmente por BamHl e HindIII para aislar el fragmento BamHI-HindI I I de 2155 pb (que contiene la parte 3' del gen FHV-1 gB) = fragmento B. El plásmido pJCA108 (ver más arriba) fue digerido por HindIII y EcoRI para aislar el fragmento HindI II-EcoRI de 1830 pb (que contiene el cassette VQH6-FHV-1 gC) fragmento C. El plásmido pJCA080 (ver más arriba) fue digerido por EcoRI y Xhol para aislar el fragmento EcoRI-Xhol de 1275 pb (que contiene el cassette 42K-gen FHV-1 gP) = fragmento P. Los fragmentos A, B, C y P fueron ligados junto con el plásmido dador pC6L para dar el plásmido pJCA109. Este plásmido contiene los cassettes de expresión H6-gen FHV-1 gC, 13L-gen FHV-1 gB y 42K-gen FHV-1 gP en el locus C6 del virus ALVAC. La estructura de este plásmido fue verificada por secuenciación y mapa de restricción completos. Este plásmido es el plásmido dador para la inserción de los cassettes de expresión H6-gen FHV-1 gC, 13L-gen FHV- 1 gB y 42K-gen FHV-1 gP en el locus C6 del virus ALVAC. Pespués de la lineali zación por Notl, el plásmido pJCA109 fue utilizado como plásmido dador para la recombinación in vi tro (Piccini y col., Methods in Enzymology, 1987, 153, 545-563) con el virus ALVAC para generar el virus recombinado denominado vCP243.

Ejemplo 8: Adyuvante El carbómero utilizado en las vacunas de acuerdo con la presente invención es el Carbopol (R) 974P fabricado por la firma BF Goodrich ( PM aproximadamente 3 millones) . Se prepara primero una solución madre de 1.5% P/V de Carbopol (R) 974P en agua destilada que contiene cloruro de sodio 1 g/1. Esta solución madre es utilizada luego para la fabricación de una solución de Carbopol (R) en agua fisiológica a 4 mg/ml. La solución madre es vertida en la totalidad del agua fisiológica (o eventualmente en la mayoría de la misma) de 1 vez o eventualmente en varias veces ajustando en cada caso el pH con ayuda de NaOH (por ejemplo ÍN o más concentrado) a un valor de aproximadamente 7.3 a 7.4. Se obtiene una solución de Carbopol (R) lista para usar que puede ser utilizada por el usuario final para reconstituir una vacuna recombinante liofilizada.

Ej empilo 9: Vacuñación de los cabalíos con ayuda del vector de la viruela del canario recombinante VPC132 ( ver e emplo 6) que expresa las qlucoproteínas gB, gC y gP de 1 virus del herpes equino de tipo I (EHV- 1) . 1. Protocolo de inmunización y prueba Se repartieron al azar 20 poneys (Welsh mountain ponies) que no presentaban signos serológicos que reflejaran una exposición reciente a EHV-1 y EHV-4 en 4 grupos (A a P) de 5 poneys. Los grupos A y B fueron vacunados con la viruela del canario recombinante vCP132 que expresa las glucoproteínas gB, gC y gP de la cepa Kentucky P de EHV-1. La vacuna fue reconstituida en agua estéril (grupo A) o en una solución de carbómero 4 mg/ml (grupo B) según el ejemplo B. El grupo C fue vacunado con una vacuna EHV entera inactivada comercial que contiene, en un volumen de dosis de 1.5 ml , las valencias EHV-1 y EHV-4 inactivadas y 6 mg de carbómero. El grupo P es el grupo testigo en el cual los animales fueron vacunados con un virus de la viruela del canario recombinante vCP1502 que expresa la glucoproteína HA del virus de la Influenza A/equi-1/Prague56 (ver ejemplo 3) reconstituido con carbómero en las mismas condiciones que para el grupo B.

Las vacunas se describen en detalle en la Tabla I Cada animal recibió 1 dosis de vacuna correspondiente a los días PO y P35 por inyección intramuscular profunda en el cuello. Al día P56 los poneys fueron probados por instilación intranasal de 105TCIP50 de la cepa Ab4/B de EHV-1. 2. Pruebas serológicas Se han realizado pruebas de neutralización SN según la técnica descrita en Thompson y col., Equine Vet. J., 8, 58-65, 1976. El virus EHV-1 (RACH) fue utilizado como antígeno.

Los títulos SN son expresados coo la inversa de la dilución de suero que da 50% de neutralización (logio) . 3. Seguimiento virológico: La expresión del virus fue seguida cotidianamente durante 10 días por limpiezas nasofaríngeas que se recolectaron en un medio de transporte de virus. Los extractos de limpieza fueron titulados sobre células de riñon de conejo RK13 en placas de microtitulación. Los títulos fueron calculados utilizando la fórmula de Karber expresada en logio TCIP50 por 1 ml . 4. Resultados : No se observó ninguna reacción local o sistémica significativa luego de estas vacunaciones. Las respuestas de anticuerpos seroneutrali zantes SN (logio de la dilución comprendiendo 50% de neutralización) promedio son: Grupo título al PO título al P56 (antes de la prueba) A 1.69 1 0.49 1.93 + 0.15 B 1.69 1 0.47 2.61 1 0. 2 C 1.19 ± 0.30 2.47 ± 0.32 P 1.57 1 0.45 1.55 ± 0.37 Se observa con la vacuna vCP132 en carbómero un aumento significativo del título de anticuerpos. La totalidad de los 5 poneys testigos excretan virus por la nasofaringe. La excreción viral en estos poneys no vacunados continuó durante un promedio de 5 días, con un máximo de excreción viral 4 días postinfección . Todos los poneys de los grupos A, C, P excretan el virus después de la prueba. Por el contrario solo dos poneys de los 5 poneys del grupo B vacunados según la invención excretan virus. Además, la cantidad de virus excretada en el grupo B es significativamente inferior a la cantidad excretada por los otros grupos comprendido el grupo C. Igualmente, la duración de la excreción en los animales del grupo B es mucho más corta que en los otros grupos . Se puede hacer referencia a la figura l y a los valores de área bajo las curvas dadas a continuación que demuestran muy claramente la casi ausencia de excreción viral en los poneys vacunados por el vCP132 en presencia de carbómero. El resultado es muy significativo si se lo compara en particular con la vacuna comercial. Se constata una reducción significativa de la excreción viral en los animales del grupo B en relación con los testigos, mientras que no se constató diferencia significativa entre los animales del grupo C y los testigos. Esta reducción de un grado importante e inesperado de la excreción del virus es particularmente interesante para sus implicaciones muy favorables sobre la limitación de la transmisión del virus de caballo a caballo. Virus total por poney (área bajo la curva) : A: 17.1 B: 3.0 C: 9.7 P: 16.3 Ejemplo 10: Vacunación de caballos con ayuda del vector de la viruela del canario vCP1533 (ver ejemplo 5) recombinante que expresa la glucoproteína HA del virus de la Influenza A/equi 2 /Newmarket /2/93 en presencia de carbómero: 1. Protocolo de inmunización y prueba: Se utilizaron en este estudio 20 poneys (Welsch mountain ponies) de 7 a 8 meses de edad, que no presentaban anticuerpos detectables contra los virus H3N8 y H7N7, medidos por la prueba SRH (por "single radial hemolysis" o hemolisis radial simple) .

La condición negativa de los animales permite estudiar en las mejores condiciones la eficacia de las diferentes vacunas en términos de respuesta humoral. Los poneys fueron repartidos al azar en 4 grupos (A a P) de 5 a 6 poneys. Los poneys del grupo A fueron vacunados con ayuda de una viruela del canario recombinante (vCP 1533) que expresa la glucoproteína HA del virus de la influenza A/equi2 /Newmarket/2/93. Esta vacuna fue reconstituida en una solución que contenía 4 mg/ml de carbómero, Carbopol (R) 974P. El grupo B fue vacunado con una vacuna comercial que contenía, bajo un volumen de dosis de 1.5 ml una mezcla de 3 cepas inactivadas de influenza, a saber, Prague/56, Suffolk/89 y Miami/63, anatoxina tetánica, así como también carbómero (4 mg) e hidróxido de aluminio (2.2 mg) como adyuvantes. El grupo C fue vacunado con ayuda de una vacuna C que comprende 2 valencias inactivadas de influenza, a saber Prague/56, Newmarket/2 /93 , así como también anatoxina tetánica, en hidróxido de aluminio. El grupo P fue vacunado con ayuda de un vector de viruela del canario recombinante vCP132 visto más arriba y reconstituido con una solución que contenía 4 mg/ml de carbómero 974P. Este último grupo sirvió de testigo para la prueba. Las vacunas se describen en detalle en la Tabla II: Se administraron 2 dosis de 1 ml de cada vacuna a cada animal con 5 semanas de intervalo por inyección intramuscular profunda en el cuello. Pos semanas después de la segunda vacunación, cada poney fue infectado por exposición a un aerosol proveniente de aproximadamente 20 ml de fluido de alantoides por un total de 107'3 EIP50 de virus influenza A-equi-2/Sussex/89, utilizando un nebulizador modelo ULTRA 2000 (Pe Villbiss, Somerset PA) como describieron Mumford y col., Equine Vet. J. 22: 93-96, 1990. 2. Prueba serológica: Se recogieron muestras de sangre total en los siguientes días: 0 (el mismo día que y antes de la primera vacunación), 7, 14, 35 (el mismo día que y antes de la segunda vacunación), 49 (el mismo día que y antes de la prueba) , 56 y 63. El suero fue preparado y almacenado ' y conservado por congelamiento a -20°C hasta su utilización. Todos los sueros fueron aprobados con respecto a la presencia de anticuerpos SRH con respecto a la influenza A/equi- l/Prague/58 y la influenza A/equi-2/Newmarket/2 / 93 como describieron Wood y col., (J. Hyg., 90: 371-364, 1983). Los diámetros de las zonas de hemolisis fueron medidos en dos direcciones en ángulo recto utilizando un lector automático. La superficie de las zonas fue calculada y se consideró como significativo un aumento de 50%. Los títulos fueron expresados en mm2 de hemolisis . 3. Seguimiento virológico La excreción viral fue seguida cotidianamente durante 10 días recogiendo las limpiezas nasofaríngeas en un medio de transporte de virus. El exudado de cada limpieza fue diluido por diluciones a razón de 10 en PBS a pH 7.2 y 0.1 ml de cada dilución fue inoculado en el espacio alantoide de huevos embrionados de 10 días. El título viral (EIP5o/p?l) en los extractos de las limpiezas fue calculado a partir de la actividad hemaglutinante en los fluidos alantoides recogidos después de 72 horas de incubación de los huevos a 34°C. 4. Resultados : No se ha constatado reacción local o sistémica significativa luego de la primera vacunación con excepción de un caballo del grupo B. Pebe señalarse que las cepas Suffolk y Newmarket son similares (Paly y col., J. Gen. Virol. 1996, 77, 661-671) lo que perfectamente convalida la comparación con la vacuna comercial en las condiciones del ensayo. Ninguno de los poneys tenía anticuerpos SRH detectables contra la influenza A/equi-2/Newmarket/2/93 o la influenza A/equi- l/Prague/56 al principio del estudio. Los resultados serológicos semana después de la primera vacunación han demostrado que ninguno de los poneys había sido infectado previamente con influenza (ningún efecto de revacunación observable) . Pos semanas después de la primera vacunación, ninguno de los poneys desarrolló respuesta de anticuerpos detectable contra influenza A/equi-l/Prague/56. Además, no hubo anticuerpos SRH detectables contra influenza A/equi-2/Newmarket/ 93 en 5 animales sobre 6 vacunados con la vacuna C, en 4 animales sobre 5 vacunados con la vacuna comercial B y en el grupo testigo P. Por el contrario, un título de anticuerpos SRH muy fuerte se constató en el grupo de 5 poneys vacunados con la viruela del canario en presencia del adyuvante carbómero: promedio 155.4d ± 32.9. La tabla III siguiente presenta los resultados obtenidos animal por animal en lo que respecta a los títulos de anticuerpos SRH.

Tabla III Resultados SRH (mm2) La vacuna de acuerdo con la invención lleva a la aparición de un alto título de anticuerpos desde 14 días después de la primera vacunación aunque, globalmente, para las vacunas B y C, la primera vacunación no trae aparejada en esta fecha la aparición de anticuerpos a niveles detectables. La obtención tan precoz de un título como este es un resultado importante e inesperado, nunca constatado anteriormente.

E j emplo 11 : Vacunación de los caballos con ayuda del vector de la viruela de 1 canario VCP1502 (ver ejemplo 3) recombinant e que expresa 1 a glucoproteína HA del virus influenza A/equi-1/Prague 55 en presencia de car bómeros Los testigos del ejemplo, vacunados con vCP1502 también fueron seguidos en el plano serológico. La Tabla IV siguiente muestra los títulos IHA (inhibición de la hemaglutinación) obtenidos en los animales inmunizados con 108 pfu de VCP1502 con Carbopol (R) 974P a 0 (Ira. Inyección VI) y 35 (2da inyección V2 ) días.

Tabla IV Como en el ejemplo precedente, se constata que la inyección de viruela del canario-EIV (que expresa el gen HA del virus A equi- 1/Prague ) mezclado con carbómero permite la obtención de títulos IHA específicos elevados desde el P14 después de la vacunación. Pe manera importante, estos títulos elevados son aumentados aún de manera significativa después de revacunación para alcanzar un título promedio muy elevado, de un nivel nunca constatado anteriormente para el antígeno HA del virus EIV H7N7 en caballos no primo-estimulados.

Ejemplo 12: Aplicación en el gato El virus recombinado probado es un virus de la viruela del canario recombinado que expresa los genes gB, gC y gD del virus del herpes felino (Feline Herpesvirus = FHV) . Este virus recombinado es identificado vCP243 (ver e j emplo 7 ) . El protocolo de vacunación/prueba en el modelo FHV es el siguiente: Los gatos son vacunados el PO y el P2d por vía subcutánea . La vacuna CORIFELIN(R) es una vacuna FHV subunidades comercializada por Mérial, Lyon, Francia, que comprende por lo menos 200 unidades IPR de fracciones virales de FHV, 25 µg de antígeno purificado de calicivirus felino, 0.1 mg de tiomersal y del excipiente oleoso QSP 1 ml . La prueba se efectúa el P49, por vía oronasal de una cepa de prueba FHV. El seguimiento clínico se realiza durante 14 días después de la prueba anotando los síntomas clínicos (anotación de los síntomas clínicos según las reglas de la Farmacopea Europea) . La protección se aprecia después de la prueba sobre los siguientes criterios: resultados clínicos promedio de cada grupo, comparados entre sí y con el resultado clínico promedio del grupo testigo - nivel de exreción viral FHV después de la prueba (medición de la carga viral en las limpiezas faríngeas realizadas cotidianamente desde el P0 al PÍO después de la prueba) títulos de anticuerpos neutralizantes del virus FHV sobre tomas de sangre los días DO, D28, D49, D63.

Para todos estos criterios los valores medios de cada grupo son igualmente comparados entre sí y con el valor medio del grupo testigo.

Ejemplo 13: Aplicación en el perro El virus recombinado probado es un virus de la viruela del canario recombinado que expresa los genes HA y F del virus de la enfermedad de Carré (Canine Diste per Virus, CPV) . Este virus recombinado es identificado vCP258 (ver ejemplo 2) . El protocolo de vacunación/prueba en el modelo CPV es el siguiente.

Los perros son vacunados el PO y el P28 por vía subcutánea. La vacuna EURICAN(R) (CHPP12) es una vacuna viva comercializada por Mérial, Lyon, Francia. Una dosis comercial contiene como mínimo 104 pfu de la cepa vacunal CPV Onders teport .

La prueba se efectúa el dia 56, por administración intracraneana de una dilución al 1/10 de la cepa de prueba CPV "Snyder-Hill" (lote preparado y suministrado por la USPA) . El seguimiento clínico se realiza durante 21 días después de la prueba anotando los síntomas clínicos (anotación de los síntomas clínicos según las reglas de la Farmacopea Europea) . La protección se aprecia después de la prueba sobre los siguientes criterios: - resultados clínicos promedio de cada grupo, comparados entre sí y con el resultado clínico promedio del grupo testigo nivel de viremia CPV después de la prueba (medición de la carga viral en los linfocitos los días P56, P61, P63, P66, P70, P77) los títulos de anticuerpos neutralizantes del virus CPV los días PO, P14, P28, P42, P56, P63, P77. Para todos estos criterios los valores medios de cada grupo son igualmente comparados entre sí y con el valor medio del grupo testigo. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere. . >^^»tgsasMé?¡ág3?S»ji^.^?iya t^

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Vacuna viva recombinante, caracterizada porque comprende un vector viral que incorpora y expresa in vi vo una secuencia nucleotídica heteróloga, preferentemente un gen de un agente patógeno, y por lo menos un compuesto adyuvante elegido entre los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y de derivado alquenilo.
2. 2. Vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende como compuesto adyuvante un polímero de ácido acrílico o metacrílico reticulado por un éter polialcení lico de azúcar o de polialcohol .
3. 3. Vacuna de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el polímero es reticulado por una alil sacarosa o por alilpentaeritrita.
4. 4. Vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende como compuesto adyuvante un copolímero de anhídrido maleico y de etileno reticulado, por ejemplo, por éter divinílico.
5. 5. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el compuesto adyuvante está presente en la vacuna a razón de 0.01% a 2% P/V.
6. 6. Vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la concentración es de 0.06 a 1% en P/V, preferentemente de 0.1 a 0.6% en P/V.
7. 7. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque comprende un vector que incorpora y expresa por lo menos un gen de un virus del herpes animal.
8. 8. Vacuna de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el gen proviene de un virus del herpes elegido entre el grupo compuesto por virus del herpes equino EHV-1 y/o EHV-4, virus del herpes felino FHV, virus del herpes canino CHV, virus del herpes aviar ILTV o Marek, virus del herpes bovino BHV y virus del herpes porcino PRV.
9. 9. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque comprende un vector que incorpora y expresa por lo menos un gen de un virus de la influenza.
10. 10. Vacuna de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el vector incorporado expresa un gen de un virus de la influenza elegido entre el grupo compuesto por el virus de la gripe equina, de la gripe aviar y de la gripe porcina.
11. 11. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque comprende un vector que incorpora y expresa por lo menos un gen de un virus animal elegido entre el grupo compuesto por virus de la leucemia felina FeLV, virus de la enfermedad de Carré CDV o la toxina tetánica.
12. 12. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque el vector viral es elegido entre el grupo compuesto por virus de la viruela, adenovirus, virus del herpes.
13. 13. Vacuna de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el virus de la viruela es elegido entre el grupo compuesto por virus de la vacuna, viruela de las aves, viruela de los canarios, viruela de las palomas, viruela porcina.
14. 14. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque comprende una viruela del canario que incorpora y expresa los genes gB, gC y gP del virus del herpes equino EHV-1 o EHV-4.
15. 15. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque comprende dos o tres vectores de la viruela del canario que comprenden cada uno un gen HA del virus de la influenza equina, proveniendo cada gen HA de una cepa diferente.
16. 16. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque comprende un vector de la viruela del canario que comprende dos o tres genes HA de cepas diferentes del virus de la influenza equina.
17. 17. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque comprende un vector de la viruela del canario que comprende y expresa los genes gB, gC y gP del virus del herpes felino FHV. :-&e»t SwWiáa-fc
18. 18. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque comprende un vector de la viruela del canario que incorpora y expresa los genes HA y F del virus de la enfermedad de Carré CPV.
19. 19. Utilización de un compuesto elegido entre los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y de derivado alquenilo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la producción de una vacuna viva recombinada que incorpora y expresa in vivo una secuencia nucleotídica heteróloga.
20. 20. Kit de vacunación, caracterizado porque comprende, acondicionados separadamente, por una parte bajo la forma liofilizada, una vacuna viva rcombinante que comprene un vector viral que incorpora y expresa in vi vo una secuencia nucleotídica heteróloga preferentemente un gen de un agente patógeno y por otra parte una solución de por lo menos un compuesto adyuvante elegido entre los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y de derivado alquenilo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. .^jfe