JP2018529718A - イヌパルボウイルス(cpv)ウイルス様粒子(vlp)ワクチン及びその使用 - Google Patents
イヌパルボウイルス(cpv)ウイルス様粒子(vlp)ワクチン及びその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(配列表に関する記載)本出願に随伴する配列表はハードコピーに代わってテキスト形式で提供され、これによって本明細書に参照により含まれる。
(技術分野)
本発明は、ワクチン学分野、より具体的には母獣由来抗体(MDA)に打ち勝つという課題に関する。より具体的には、本発明は、ウイルス様粒子及び改変生ウイルス(MLV)の組合せを、同時組合せ、連続投与、又はプライム-ブースト投与レジメンにより動物(イヌを含む)に投与することによってMDAを圧倒することに関する。さらに具体的には、本発明は、イヌ及び仔犬にCPV MDAが存在するか否かに関係なく、イヌ及び仔犬においてパルボウイルスに対する防御免疫を惹起する組成物に関する。
生まれたばかりの仔犬は、疾患(例えばCPV感染)に対する受動免疫を、特に誕生後最初の2日間にその母親の授乳によって獲得する。乳を飲む仔犬は最初に生成される乳汁中の初乳を取り込み、当該初乳中の(MDA)が仔犬に渡される。イヌ(及び他の多くの哺乳動物)にとって、初乳によって提供される受動免疫のレベルは、MDAが代謝分解されるので徐々に低下する。したがって、仔犬がもはやMDAによって防御されなくなる齢は、仔犬の初乳の摂取、初乳に含まれる抗体の量、及び他のいくつかの要因にしたがって大きく変動する。
仔犬へのワクチン接種時の具体的な課題は、母獣抗体によって提供される防御と重複し、母獣抗体が弱まるにつれて開始する防御を提供する時間枠にしたがってワクチンを投与することである。これまでのところ、仔犬用ワクチンレジメンは典型的には約6週齢で開始し、その後ブースターが約3週間毎に、例えば9、12及び時に15週に提供される。しかしながら、このレジメンが完全な防御を提供するためには、最初のワクチン用量が直ちに防御免疫応答を引き出さねばならない。部分的には、仔犬の免疫系が未成熟であること及び免疫応答を立ち上げるために期間が必要であるため、この期待は完全に非現実的である。さらにまた、この状況は、残留MDA(約6週齢まで持続する)がMLVワクチンを中和するのでさらに複雑である。これまでのところ、市場で利用可能な全てのCPVワクチンがMLVワクチンである。
獣医医学におけるもう1つの課題は癌(例えばイヌの癌)の治療である。癌療法、特に老犬のための既存のツールには多くの制限が存在する。癌細胞を殺滅する腫瘍溶解性パルボウイルスの投与は、効果的な癌治療として極めて有望であることが示されている(Rommelaere et al, Cytokine & Growth Factor Reviews 21:185-195, 2010;及び; and U.S.Pat.No.7,179,456(Rommelaere et al)(前記文献の完全な内容は参照により本明細書に含まれる))。しかしながら、パルボウイルスは既存の抗体によって中和されるであろうから、パルボウイルスに対する既存の抗体が存在することは(例えばワクチン接種の結果として)この方法を無効にするであろう。加えてイヌの遺伝子療法は現時点ではほとんど実施されていないが、ただし適切な核酸ベクターが認定されればいくつかの疾患の治療に有望な方法となろう。したがって、既存抗体に打ち勝つ方法はワクチンを超えた適用に有用であろう。
上記の観点から、安全性が改善されかつ良好な有効性(MDAに打ち勝つ能力を含む)を有するワクチン(異種CPV株に対して防御を提供するワクチンを含む)が希求される。
抗原性CPVポリペプチド並びにそのフラグメント及び変種を含む組成物又はワクチンが提供される。当該CPV抗原並びにそのフラグメント及び変種は免疫原性及び防御性特性を保有する。CPV抗原は昆虫細胞でバキュロウイルス発現ベクターによって生成され、CPV空キャプシド又はCPV VLP(ウイルス様粒子)に組み立てられ得る。
抗原性ポリペプチド並びにそのフラグメント及び変種は、CPV改変生ウイルス含有又は非含有ワクチン及び/又は医薬組成物に処方され得る。そのようなワクチン又は組成物を用いて、動物をワクチン免疫して同種及び異種CPV株に対する防御を提供することができる。
重要なことには、本発明者らは、驚くべきことにかつ予期に反して、MLV及びVLPの両方(各々は同じ病原体に対応する抗原であるが、必ずしも遺伝子又はそのサブユニットの同じ部分をコード又は提供する必要は無い)を含む組成物の投与は、MDAを圧倒してその後の前記病原体による病毒性チャレンジに対する防御免疫を誘発し得ることを見出した。したがって、具体的な実施態様では、本発明はMLV CPV及びCPV VLPの両方を含む組合せワクチンを提供し、前記ワクチンは、CPVに対する循環MDAを有するか否かに関係なく仔犬で防御免疫を引き出す。
別の実施態様では、本発明は、MDA干渉の懸念が存在する場合において、他の病原体に対応するMLV及びVLPの両方を含む組合せワクチンを提供する。例えば、若いウシ類、ブタ類、ネコ類、ヤギ類、ヒツジ類、ウマ類及びその他の動物は多様な病原体に対する循環MDAを有する。それぞれの事例で、これらMDAの存在はワクチンの有効性に干渉することがある。本開示が明らかにされたところで、本発明者らは、MLV+VLPの両方の組合せを投与すれば病原体に無関係にMDAを圧倒するであろうと考える。病原体には、口蹄疫ウイルス(FMDV)、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)、イヌジステンパーウイルス(CDV)、ネコ汎白血球減少症(FPL)、及びウマインフルエンザウイルス(EIV)が含まれ得るが、ただしこれらに限定されない。このアプローチ(MLV+VLPの提供)はMDAによる干渉が問題となるいずれの事例にも適用できることは当業者には理解されよう。
少なくとも1つの抗原性ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種及び使用のための指示を含むキットもまた提供される。
動物で免疫原性応答を引き出すCPVポリペプチド、抗原、そのフラグメント及び変種を含む組成物が提供される。当該抗原性ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種は、昆虫細胞でバキュロウイルス発現ベクターによって生成される。抗原性ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種は、CPV改変生ウイルス含有若しくは非含有ワクチン又は医薬組成物に処方され、動物で防御応答を引き出し又は刺激するために用いられる。ある実施態様では、ポリペプチド抗原はCPVキャプシドポリペプチド又はその活性なフラグメント若しくは変種である。CPV抗原は、CPV空キャプシド又はCPV VLP(ウイルス様粒子)に組み立てることができる。
本発明の抗原性ポリペプチドは完全長ポリペプチドでも又はその活性なフラグメント若しくは変種でもよいことは理解される。“活性なフラグメント”又は“活性な変種”とは、当該フラグメント又は変種が当該ポリペプチドの抗原性の性質を保持することが意図される。したがって、本発明は、動物で免疫原性応答を引き出すいずれのCPVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原も包含する。当該CPVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原は、任意のCPVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原、例えば、動物(例えばヒツジ、ウシ、ヤギ又はブタ)で応答を引き出し、誘導し又は刺激するタンパク質、ペプチド又はそのフラグメント若しくは変種である(ただしこれらに限定されない)。
本発明は、有効量の組換えCPV抗原を含むことができるイヌワクチン又は組成物に関する。いくつかの実施態様では、ワクチン又は組成物はアジュバント非添加であり、医薬的又は獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルを含むことができる。
いくつかの実施態様では、動物の応答は防御免疫応答である。
特段の説明がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本開示が属する業界の業者の一人が通常理解する意味と同じ意味を有する。単数用語“a”、“an”及び“the”は、文脈が明瞭にそうでないことを示さないかぎり複数の対応語を含む。同様に、“or”という語は、文脈が明らかにそうでないことを示さないかぎり“and”を含むことが意図される。
本開示で、特に特許請求の範囲及び/又は項目で、例えば“comprises(含む)”、“comprised”、“comprising”などの用語は、米国特許法で当該用語に割り当てられた意味を有することができ、例えばそれらは、“includes(含む)”、“included”、“including”などを意味することができ、さらに例えば“consisting essentially of(本質的に〜から成る)”及び“consists essentially of”という用語は、米国特許法で当該用語に割り当てられた意味を有することができ、例えばそれらは、明確に記載されていない構成成分を許容するが、従来技術で見出されるか、又は当該発明の基本的或いは新規な特徴に影響する構成成分を排除する。
本明細書で用いられる“免疫原性タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド”という用語には、宿主に投与されると、当該タンパク質に対抗する液性及び/又は細胞性タイプの免疫応答を誘発することができるという意味で免疫学的に活性なポリペプチドが含まれる。好ましくは、タンパク質フラグメントは、全タンパク質と実質的に同じ免疫学的活性を有するものである。したがって、本発明のタンパク質フラグメントは、少なくとも1つのエピトープ又は抗原性決定基を含むか、又は本質的に前記から成るか、又は前記から成る。本明細書で用いられる“免疫原性”タンパク質又はポリペプチドには、当該タンパク質の完全長配列、そのアナログ、又はその免疫原性フラグメントが含まれる。“免疫原性フラグメント”とは、1つ以上のエピトープを含み、したがって上記に記載する免疫学的応答を引き出すタンパク質フラグメントを意味する。そのようなフラグメントは、当業界で周知の多数のエピトープマッピング技術を用いて認定され得る。例えば以下を参照されたい:Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, Glenn E.Morris, Ed., 1996。例えば、線形エピトープは、例えば多数のエピトープ(当該エピトープは当該タンパク質分子の複数の部分に対応するペプチドである)を固相上で同時合成し、さらに当該ペプチドが支持相になお固着している間に当該ペプチドを抗体と反応させることによって決定できる。そのような技術は当業界で公知であり、例えば以下に記載されている:U.S.Pat.No.4,708,871;Geysen et al., 1984;Geysen et al., 1986。同様に、立体構造エピトープは、アミノ酸の空間的配置を例えばx-線結晶学及び二次元核磁気共鳴によって決定することにより容易に認定される。例えば上掲書(Epitope Mapping Protocols)を参照されたい。特にT. パルバ(T.parva)のタンパク質に応用できる方法はPCT/US2004/022605に完全に記載されている(参照によりその全体が本明細書に含まれる)。
ある組成物又はワクチンに対する“免疫学的応答”は、当該宿主における問題の組成物又はワクチンに対する細胞性及び/又は抗体媒介性免疫応答の発生である。通常、“免疫学的応答”には以下の効果の1つ以上が含まれる(ただしこれらに限定されない):問題の組成物又はワクチンに含まれる1つの抗原又は複数の抗原に特異的に向かう抗体、B細胞、ヘルパーT細胞及び/又は細胞傷害性T細胞の産生。好ましくは、宿主は治療性又は防御性免疫学的応答のどちらかを示し、したがって新規な感染に対する抵抗性が強化されるか、及び/又は当該疾患の臨床的重篤性が軽減されるであろう。そのような防御は、感染宿主によって通常示される徴候の軽減又は欠如、より迅速な回復時間、及び/又は感染宿主におけるウイルス力価の低下によって示されるであろう。
合成抗原、例えばポリエピトープ、フランキングエピトープ、及び他の組換え体又は合成により誘導される抗原もまた本定義に含まれる。例えば以下を参照されたい:Bergmann et al., 1993;Bergmann et al., 1996;Suhrbier, 1997;Gardner et al., 1998。本発明の目的のためには、免疫原性フラグメントは、通常、当該分子の少なくとも約3アミノ酸、少なくとも約5アミノ酸、少なくとも約10−15アミノ酸、又は約15−25アミノ酸又はそれより大きいアミノ酸(ほぼ完全長のタンパク質配列又は当該タンパク質の少なくとも1つのエピトープを含む融合タンパク質さえも含むことがある)を含むであろう。
したがって、エピトープを発現するポリヌクレオチドの最小限の構造は、それが、CPVポリペプチドの1つのエピトープ又は抗原性決定基をコードするヌクレオチドを含むか、本質的に前記ヌクレオチドから成るか又は前記ヌクレオチドから成るというものである。CPVポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、当該ポリペプチドをコードする配列の連続する又は隣接する、最小限15ヌクレオチド、約30−45ヌクレオチド、約45−75、又は少なくとも57、87、又は150ヌクレオチドを含むか、本質的に前記ヌクレオチドから成るか又は前記ヌクレオチドから成り得る。エピトープ決定手順、例えばオーバーラップペプチドライブラリーの作製(Hemmer et al., 1998)、ペップスキャン(Geysen et al., 1984;Geysen et al., 1985;Van der Zee R.et al., 1989;Geysen, 1990;Multipin.RTM.Peptide Synthesis Kits de Chiron)及びアルゴリズム(De Groot et al., 1999;PCT/US2004/022605)を本発明の実施で用いることができる。
“遺伝子”という用語は、生物学的機能と密接に結びついたポリヌクレオチドの任意のセグメントを指すために広く用いられる。したがって、遺伝子は、ゲノム配列中にイントロン及びエクソンを含むか、又はcDNAのように単にコード配列を含むか、それら遺伝子の発現に必要な調節配列を含む。例えば、遺伝子はまた、mRNA若しくは機能性RNAを発現するか、又は具体的なタンパク質をコードする核酸フラグメント(調節配列を含む)を指す。
本発明はさらに、CPV抗原、エピトープ又は免疫原をコードするポリヌクレオチドの相補鎖を含む。相補鎖は、任意の長さのポリマーであり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及びアナログを任意の組合せで含むことができる。
“単離された”生物学的構成要素(例えば核酸又はタンパク質又は細胞小器官)は、当該成分が天然に存在する生物の細胞内の他の生物学的構成要素(例えば他の染色体及び染色体外DNA及びRNA、タンパク質及び細胞小器官)から実質的に分離されているか又は精製されている構成要素を指す。“単離された”核酸及びタンパク質には標準的精製方法によって精製された核酸及びタンパク質が含まれる。この用語はまた、組換え技術とともに化学合成によって調製された核酸及びタンパク質を包含する。
本明細書で用いられる“精製された”という用語は完全な精製を要求せず、相対的用語として意図される。したがって、例えば、精製されたポリペプチド調製物は、当該ポリペプチドがその天然の環境にある場合よりも濃縮されているものである。それは、当該ポリペプチドが細胞成分から分離されているということである。“実質的に精製された”とは、当該ポリペプチドが、細胞成分又は物質の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも98%以上が取り除かれたいくつかの様相を表すことを意図する。同様に、当該ポリペプチドは部分的に精製されることがある。“部分的に精製される”とは、細胞成分又は物質の60%未満が除去されることを意図する。同じことがポリヌクレオチドに適用される。本明細書に開示するポリペプチドは当業界で公知の手段のいずれかによって精製できる。
“変種”は実質的に類似する配列を意味することが意図される。ポリヌクレオチドについては、変種は、ネイティヴなポリヌクレオチド内の1つ以上の部位の1つ以上のヌクレオチドの欠失及び/又は付加、及び/又はネイティヴなポリヌクレオチドの1つ以上の部位の1つ以上のヌクレオチドの置換を含む。本明細書で用いられるように、“ネイティヴな”ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、天然に存在するヌクレオチド配列又はアミノ酸配列をそれぞれ含む。本発明の個々のポリヌクレオチド(すなわち参照ポリヌクレオチド)の変種はまた、変種ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間のパーセント配列同一性の比較によって評価され得る。“変種”タンパク質は、ネイティヴなタンパク質の1つ以上の部位の1つ以上のアミノ酸の欠失及び/又は付加、及び/又はネイティヴなタンパク質の1つ以上の部位の1つ以上のヌクレオチドの置換によってネイティヴなタンパク質から誘導されるタンパク質を意味することが意図される。本発明に包含される変種タンパク質は生物学的に活性であり、それは、それら変種タンパク質が免疫応答を引き出す能力を有するということである。
別の特徴では、本発明は、CPV空キャプシド又はCPV VLP(ウイルス様粒子)に関する。当該キャプシドはCPV VP2ポリペプチド又は変種(その末端切断短縮型変型を含む)を含むか、本質的にそれたから成るか又はそれらから成り得る。
さらにまた、CPVポリペプチドのホモログは本発明の範囲内であることが意図される。本明細書で用いられるように、“ホモログ”という用語はオーソログ、アナログ及びパラログを含む。“アナログ”という用語は、同じ又は類似機能を有するが無関係の生物で別々に進化した2つのポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。“オーソログ”という用語は、異なる種に由来するが種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した2つのポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。オーソログは通常同じ又は類似機能を有するポリペプチドをコードする。“パラログ”という用語は、ゲノム内重複によって関係する2つのポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。パラログは通常異なる機能を有するが、これらの機能は関連することがある。野生型CPVポリペプチドのアナログ、オーソログ、及びパラログは、翻訳後修飾によって、アミノ酸配列相違によって又はその両方によって野生型CPVポリペプチドと異なり得る。特に、本発明のホモログは一般的に、野生型CPVポリヌクレオチド配列の全部又は部分に関して少なくとも80−85%、85−90%、90−95%、又は95%、96%、97%、98%、99%配列同一性を示し、さらに類似の機能を示すであろう。変種には対立遺伝子変種が含まれる。“対立遺伝子変種”という用語は、タンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらす、天然の集団(例えばウイルスの種又は系統)内に存在する多型を含むポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。そのような天然の対立遺伝子変動は、典型的にはポリヌクレオチド又はポリペプチドで1−5%の多様性をもたらす。対立遺伝子変種は、多数の異なる種で問題の核酸配列の配列決定によって認定することができ、それらの種で同じ遺伝子の遺伝子座を認定するハイブリダイゼーションプローブを用いることによって容易に実行できる。天然の対立遺伝子変動の結果でありかつ問題の遺伝子の機能的活性を変化させない、いずれかの及び全てのそのような核酸変動並びにその結果のアミノ酸多形又は変動は、本発明の範囲内であることが意図される。
“保存的変動”という用語は、あるアミノ酸残基の別の生物学的に類似する残基による入替え、又はある核酸配列におけるヌクレオチドの入替え(コードされるアミノ酸残基は変化しないか又は別の生物学的に類似する残基である)を指す。これに関して、特に好ましい置換は、上記に記載したように概して本質的に保存的である。
開示のポリヌクレオチドは、特定の宿主のための遺伝暗号、例えば最適化コドン使用頻度の結果として縮重配列を含む。本明細書で用いられるように、“最適化”は、与えられた種でその発現を高めるために遺伝的に操作されたポリヌクレオチドを指す。CPVポリペプチドをコードする最適化ポリヌクレオチドを提供するために、CPVタンパク質の遺伝子のDNA配列は、1)個々の種で高度に発現される遺伝子が好むコドンを含むように、2)前記の種で実質的に見いだされるA+T又はG+C含量をヌクレオチド塩基組成に含むように、3)前記の種の開始配列を形成するように、4)不安定化、不適切なポリアデニル化、RNAの分解及び終了を引き起こす配列、又は二次構造ヘアピン又はRNAスプライス部位を形成する配列を排除するように改変できる。前記の種におけるCPVタンパク質の発現増加は、真核細胞及び原核細胞又は個々の種におけるコドン使用の分布頻度を利用することによって達成できる。“好ましいコドン使用頻度”という用語は、あるアミノ酸を指定するためにヌクレオチドコドンの使用で特定の宿主細胞によって示される優先性を指す。20の天然のアミノ酸が存在し、その大半が2つ以上のコドンによって指定される。したがって、当該ヌクレオチド配列によってコードされるCPVポリペプチドのアミノ酸配列が機能的変化を生じないかぎり、全ての縮重ヌクレオチド配列が本開示に含まれる。
配列に関して“同一性”は、2つの配列の短い方の配列のヌクレオチド数又はアミノ酸数で割った同一ヌクレオチド又はアミノ酸を有する位置の数ということができ、この場合、2つの配列のアラインメントは、WilburとLipmanのアルゴリズム(Wilbur and Lipman)にしたがい20ヌクレオチドのウインドウサイズ、4ヌクレオチドのワード長、及び4のギャップペナルティを用いて決定できる。さらにコンピュータを利用するアラインメントを含む分析及び配列データ解釈は、市販プログラム(例えばIntelligeneticsTM Suite, Intelligenetics Inc.CA)を用いて都合よく実施することができる。RNA配列がDNA配列と類似する、又はある程度の配列同一性若しくは相同性を有するというときは、DNA配列中のチミジン(T)はRNA配列中のウラシル(U)と等しいとみなされる。したがって、RNA配列は本発明の範囲内であり、RNA配列は、DNA配列のチミジン(T)をRNA配列のウラシル(U)と等しいとみなすことによってDNA配列から誘導することができる。
2つのアミノ酸配列の配列同一性又は配列類似性、或いは2つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、ベクターNTIソフトウェアパッケージ(Vector NTI software package(Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA))を用いて決定できる。
下記文献は配列の相対的同一性又は相同性の比較のためのアルゴリズムを提供し、さらに、上記記載に加えて或いは上記記載とは別に、それら参考文献の教示を用いてパーセント相同性又は同一性を決定することができる:Needleman SB and Wunsch CD;Smith TF and Waterman MS;Smith TF, Waterman MS and Sadler JR;Feng DF and Dolittle RF;Higgins DG and Sharp PM;Thompson JD, Higgins DG and Gibson TJ;及びDevereux J, Haeberlie P and Smithies O。さらに、必要以上の試験を行うことなく、当業者は、パーセント相同性の決定のために多くの他のプログラム又は参考文献から助言を得ることができる。
本発明はさらに、ベクター分子又は発現ベクターに含まれ、かつプロモータエレメント、場合によってエンハンサーに連結されたCPVポリヌクレオチドを包含する。
“ベクター”は、標的細胞にin vitro又はin vivoでデリバリーされるべき異種ポリヌクレオチドを含む組換えDNA若しくはRNAプラスミド又はウイルスを指す。異種ポリヌクレオチドは予防又は治療のために関心のある配列を含むことができ、場合によって発現カセットの形態で存在し得る。本明細書で用いられるように、ベクターは最終標的細胞又は対象で複製能力を有することを必要としない。前記用語にはクローニングベクター及びウイルスベクターが含まれる。
“組換え体”という用語は、天然に存在しないか、又は天然には見出されない編成で別のポリヌクレオチドに連結されている半合成又は合成起源のポリヌクレオチドを意味する。
“異種の”は、比較されている実体の残りの部分と遺伝学的に別個の実体に由来することを意味する。例えば、あるポリヌクレオチドは遺伝子操作技術によって異なる供給源に由来するプラスミド又はベクター中に配置でき、当該ポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである。そのネイティヴなコード配列から取り出され、当該ネイティヴな配列以外のコード配列に連結されたプロモータは異種プロモータである。
本明細書に記載する内容は、部分的には、バキュロウイルス/昆虫細胞発現系で調製されるCPV抗原に関連する組成物及び方法に向けられる。前記抗原は高度に免疫原性であり、同種及び異種CPV株によるチャレンジに対して動物を防御した。
本発明はCPVワクチン又は組成物に関し、前記CPVワクチン又は組成物は有効量の組換えCPV抗原及び医薬的又は獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルを含むことができる。ある実施態様では、CPV抗原はバキュロウイルス発現ベクターによって昆虫細胞で発現される。
本発明のある実施態様は、CPV空キャプシド又はCPV VLP(ウイルス様粒子)を含むワクチン又は組成物に関する。CPV空キャプシド又はCPV VLP(ウイルス様粒子)は、CPVキャプシドタンパク質の発現によって入手される。
本発明はまた、これらワクチンを調製するプロセス、これらワクチンを生成するための抗原の使用、及びそれらを使用してワクチン免疫する方法に関する。
本発明はまたヌクレオチド配列、特にcDNA及びアミノ酸配列に関し、前記配列は天然のウイルスの配列と比較して改変されている。本発明はまた、当該改変されたヌクレオチド配列の発現生成物、並びにこれら改変を取り込んでいるCPV抗原及びウイルスに関する。
本発明は、動物(例えばヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類)で免疫学的応答を引き出す任意のCPVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原を包含する。CPVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原は、任意のCPVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原、例えば、動物(例えばイヌ類)で応答を引き出し、誘導し又は刺激するタンパク質、ペプチド又はそのフラグメント(ただしこれらに限定されない)であり得る。
ある実施態様では、1つ以上のCPV抗原をコードする核酸分子はCPVキャプシドタンパク質をコードするcDNAである。別の実施態様では、1つ以上のCPV抗原をコードする核酸分子はCPVキャプシドタンパク質のフラグメントをコードするcDNAである。
別の実施態様では、CPV抗原はCPV 100869-1株から誘導され得る。
本発明は、有効量の組換えCPV抗原を含むことができるCPV組成物又はワクチンに関する。当該CPV組成物又はワクチンはアジュバントを含まない。当該CPV組成物又はワクチンは、場合によって医薬的又は獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルを含むことができる。
本発明はさらに、ベクター分子又は発現ベクターに含有され、場合によってプロモータエレメント及び場合によってエンハンサーに作動できるように連結されたCPVポリヌクレオチドを包含する。
ある特徴では、本発明は、配列番号:1、3、4、6又は8−10に示される配列を有するCPVポリペプチド及びその変種又はフラグメントを提供する。
別の特徴では、本発明は、本発明の抗原性ポリペプチド、特に配列番号:1、3、4、6又は8−10に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
変種は、配列番号:1、3、4、6又は8−10に示されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一性のアミノ酸配列を有する相同なポリペプチドである。
CPVポリペプチドの免疫原性フラグメントは、配列番号:1、3、4、6又は8−10に示される配列を有するCPVポリペプチド、又はその変種の連続する少なくとも8、10、15、又は20アミノ酸、少なくとも21アミノ酸、少なくとも23アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、又は少なくとも30アミノ酸を含む。別の実施態様では、CPVポリペプチドのフラグメントは、完全長CPVポリペプチドで見出される特異的な抗原性エピトープを含む。しかしながら、CPV VLPの形成を可能にするためにはCPVポリペプチドの十分な部分が存在せねばならないことは当業者には理解されるであろう。
別の特徴では、本発明は、CPVポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号:1、3、4、6又は8−10に示される配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに別の特徴では、本発明は、配列番号:1、3、4、6又は8−10に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチド、或いは保存的変種、対立遺伝子変種、ホモログ、又はこれらポリペプチドの1つの連続する少なくとも8アミノ酸若しくは10アミノ酸を含む免疫原性フラグメント、又はこれらポリペプチドの組合せをコードするポリヌクレオチドを提供する。
別の特徴では、本発明は、配列番号:2、5、7、11又は12に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド又はその変種を提供する。さらに別の特徴では、本発明は、配列番号:2、5、7、11又は12に示される配列を有するポリヌクレオチドの1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリヌクレオチド、又はその変種を提供する。
CPVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原の発現のためのエレメントが有利には本発明のベクターに存在する。最小限の態様では、このエレメントは、開始コドン(ATG)、終止コドン及びプロモータ、並びに場合によってはまたある種のベクター(例えばプラスミド)及びある種のウイルスベクター(例えばポックスウイルス以外のウイルスベクター)のためのポリアデニル化配列を含むか、本質的にこれらから成るか又はこれらから成る。ポリヌクレオチドがポリタンパク質フラグメント(例えばCPVペプチド)をコードするときは、有利にはベクターにATGがリーディングフレームの5’に配置され、終止コドンが3’に配置される。制御発現のための他のエレメント、例えばエンハンサー配列、安定化配列(例えばイントロン)及びタンパク質の分泌を許容するシグナル配列が存在し得る。
別の実施態様にしたがえば、調製物中の当該1つのベクター又は複数のベクターは、CPVポリペプチド、抗原、エピトープ若しくは免疫原の1つ以上のタンパク質又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むか、本質的に前記ポリヌクレオチドから成るか又は前記ポリヌクレオチドから成り、当該1つのベクター又は複数のベクターは前記ポリヌクレオチドを発現する。別の実施態様では、調製物は、CPVポリペプチド、抗原、融合タンパク質又は前記のエピトープをコードしこれを(有利にはin vivoで)発現するポリヌクレオチドを含む1つ、2つ又は3つ以上のベクターを含む。
プラスミドという用語は、任意のDNA転写ユニットをカバーし、本発明のポリヌクレオチド及び所望の宿主若しくは標的の1つの細胞又は複数の細胞での前記のin vivo発現に必要なエレメントを含む。これに関しては、スーパーコイル又は非スーパーコイルの環状プラスミドが直鎖型とともに本発明の範囲内に入ることが意図される。
より一般的な用語として、プロモータはウイルス、植物又は細胞起源である。本発明の実施で有用に利用できるCMV-IE以外の強力なウイルスプロモータは、SV40ウイルスの初期/後期プロモータ又はラウス肉腫ウイルスのLTRプロモータである。本発明の実施で有用に利用できる強力な細胞性プロモータは、細胞骨格遺伝子のプロモータ、例えばデスミンプロモータ(Kwissa et al., 2000)又はアクチンプロモータ(Miyazaki et al., 1989)である。
プラスミドは他の発現制御エレメントを含むことができる。安定化配列、例えばイントロン配列、例えばトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼイントロン(Callis et al.Genes & Dev.1(10):1183-1200, Dec.1987)、hCMV-IEの最初のイントロン(PCT出願WO1989/01036)、ウサギβ-グロビン遺伝子のイントロンII(van Ooyen et al., 1979)を取り込むことは特に有益である。別の実施態様では、プラスミドは3’UTRを含むことができる。3’UTRはアグロバクテリウムノパリンシンターゼ(Nos)3’UTRであり得るが、ただしこれらに限定されない(Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence.Depicker, A.et al.J.Mol.Appl.Genet., 1982; Bevan, NAR, 1984, 12(22): 8711-8721)。
プラスミド及びポックスウイルス以外のウイルスベクターのためのポリアデニル化シグナル(polyA)に関しては、ウシ成長ホルモン(bGH)遺伝子のポリ(A)シグナル(U.S.5,122,458参照)、又はウサギβ-グロビン遺伝子のポリ(A)シグナル、又はSV40ウイルスのポリ(A)シグナルがより有用であり得る。
“宿主細胞”は、外因性ポリヌクレオチド(例えば組換えプラスミド又はベクター)によって遺伝的に変化しているか、又は遺伝的に変化させることができる原核細胞又は真核細胞を指す。遺伝的に変化している細胞というとき、当該用語は、最初に変化させた細胞及びその子孫の両方を指す。
ある実施態様では、組換えCPV抗原は昆虫細胞で発現される。
ある具体的な実施態様では、CPV抗原はSF9細胞で発現される。
ある実施態様では、本明細書に開示される内容は、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類をワクチン免疫する方法に向けられ、前記方法は、当該ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類に有効量のワクチンを投与する工程を含み、当該ワクチンは、有効量の組換えCPV抗原及び医薬的又は獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルを含み得る。
本発明のある実施態様では、当該方法は、本発明の乳剤で処方されたワクチン組成物の単回投与を含む。例えば、ある実施態様では、免疫学的又はワクチン組成物は、バキュロウイルス発現CPV抗原(ポリペプチド及びVLP(ウイルス様粒子)又は空キャプシドを含む)を含む。電子顕微鏡検査により、バキュロウイルス発現ベクターで形質転換された昆虫細胞はCPV VLP又はCPV空キャプシドを生成することが示される。したがって、本発明の免疫学的又はワクチン組成物はCPV VLP又はCPV空キャプシドを含むものを包含する。
ある実施態様では、本明細書に開示される内容は、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類をワクチン免疫する方法に向けられ、前記方法は、当該ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類にバキュロウイルスベクターによって昆虫細胞で生成されたCPV抗原を投与する工程を含む。
ある実施態様では、本明細書に開示される内容は免疫応答を引き出す方法に向けられ、前記方法は、バキュロウイルスベクターによって昆虫細胞で生成されたCPV抗原を含むワクチンをヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類に投与する工程を含む。
ある実施態様では、本明細書に開示される内容はワクチン又は組成物を調製する方法に向けられ、前記方法は、バキュロウイルスベクターによって昆虫細胞で生成されたCPV抗原を単離する工程、及び場合によって医薬的又は獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルを混合する工程を含む。
同種及び異種CPV株の両方をチャレンジに用いてワクチンの有効性を試験する。投与は皮下でも又は筋肉内でもよい。投与は注射針不使用であり得る(例えばバイオジェクト(Bioject))。
本発明のプライム-ブーストは組換えウイルスベクターを含むことができ、ベクターはCPVコード配列、又はそのフラグメント(抗原性ポリペプチド又はフラグメントをコードする)、又はその変種の発現のために用いられる。具体的には、ウイルスベクターは、CPV遺伝子又は抗原性ポリペプチドをコードするそのフラグメントを発現することができる。本明細書で意図されるウイルスベクターには以下が含まれる(ただしこれらに限定されない):ポックスウイルス(例えばワクシニアウイルス又は弱毒ワクシニアウイルス、トリポックス又は弱毒トリポックス(例えばカナリアポックス、鶏痘、ハトポックス、ピジョンポックス、ウズラポックス、ALVAC、TROVAC(例えばUS 5,505,941、US 5,494,8070を参照されたい))、アライグマポックスウイルス、ブタポックスウイルスなど)、アデノウイルス(例えば、ヒトアデノウイルス、イヌアデノウイルス)、ヘルペスウイルス(例えば、イヌヘルペスウイルス、シチメンチョウヘルペスウイルス、マレック病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、ネコヘルペスウイルス、喉頭気管炎ウイルス(ILTV)、ウシヘルペスウイルス、ブタヘルペスウイルス)、バキュロウイルス、レトロウイルスなど。別の実施態様では、トリポックス発現ベクターはカナリアポックスベクター(例えばALVAC)であり得る。さらにまた別の実施態様では、トリポックス発現ベクターは鶏痘ベクター(例えばTROVAC)であり得る。発現されるべき本発明のCPV抗原は、特定のポックスウイルスプロモータの制御下に挿入される。前記プロモータは、とりわけ、例えばエントモポックスウイルスアムサクタ・モオレイ(Amsacta moorei)42Kプロモータ(Barcena, Lorenzo et al., 2000)、ワクシニアプロモータ7.5kDa(Cochran et al., 1985)、ワクシニアプロモータI3L(Riviere et al., 1992)、ワクシニアプロモータHA(Shida, 1986)、牛痘プロモータATI(Funahashi et al., 1988)、ワクシニアプロモータH6(Taylor et al., 1988b;Guo et al., 1989;Perkus et al., 1989)である。
プライム-ブーストプロトコルは少なくとも1回のプライム投与、及び、少なくとも1つの共通のポリペプチド及び/又はその変種若しくはフラグメントを用いた少なくとも1回のブースト投与を含む。プライム投与に用いられるワクチンは後のブースターワクチンとして用いられるものと異なり得る。プライム投与は1回以上の投与を含むことができる。同様に、ブースト投与は1回以上の投与を含むことができる。
哺乳動物標的種のウイルスベクター系組成物(例えば非ポックスウイルスベクター系組成物)の一用量体積は、概ね約0.1から約5.0mL、約0.1から約3.0mL、約0.5mLから約2.5mLである。
ワクチンの有効性は、最後の免疫後約2から4週で、動物(例えばネコ又はイヌ)をCPVの病毒株でチャレンジすることによって試験することができる。
プライム-ブースト投与は、有利には1から6週間離して、例えば約4週間離して実施できる。ある実施態様にしたがえば、半年に1回のブースター又は1年に1回のブースター(有利にはウイルスベクター系ワクチンを用いる)もまた想定される。動物は有利には最初の投与時に少なくとも6から8週齢である。
プライム-ブーストプロトコルで用いられる、本発明の組換え抗原性ポリペプチドを含む組成物はアジュバントを添加されず、場合によって医薬的又は獣医的に許容できるビヒクル、希釈剤又は賦形剤に含有され得る。本発明のプロトコルは動物をCPVから防御し、及び/又は感染動物における疾患の進行を予防する。
本発明は、本発明にしたがって生成された治療組成物の有効量を少なくとも1回動物へ投与することを意図する。動物は、雄、雌、妊娠雌及び新生仔であり得る。この投与は多様なルートによることが可能で、前記ルートには筋肉内(IM)、皮内(ID)若しくは皮下(SC)注射又は鼻内若しくは経口投与が含まれるが、ただしこれらに限定されない。本発明の治療組成物はまた例えば以下を用いる無注射針装置によって投与できる:ピグジェット(Pigjet)、デルモジェット(Dermojet)、バイオジェクター(Biojector)、アビジェット(Avijet(Merial, GA, USA))、ベトジェット(Vetjet)又はビタジェット(Vitajet)装置(Bioject, Oregon, USA)。プラスミド組成物を投与する別のアプローチはエレクトロポレーションの使用である(例えば以下を参照されたい:Tollefsen et al., 2002;Tollefsen et al., 2003;Babiuk et al., 2002;PCT出願WO99/01158)。別の実施態様では、治療組成物は遺伝子銃又は金粒子ボンバードメントによって動物にデリバリーされる。
ある実施態様では、本発明は、CPV抗原又はエピトープの標的細胞デリバリー及び発現のために治療的に有効な量の処方物の投与を提供する。治療的有効量の決定は当業者には日常的な作業である。ある実施態様では、処方物は、CPV抗原又はエピトープを発現するポリヌクレオチド及び医薬的又は獣医的に許容できる担体、ビヒクル又は賦形剤を含む発現ベクターを含む。別の実施態様では、医薬的又は獣医的に許容できる担体、ビヒクル又は賦形剤は、トランスフェクション又はポリヌクレオチドを宿主動物へ移転する他の手段を促進するか、及び/又は宿主での当該ベクター又はタンパク質の保存を改善する。
ある実施態様では、本明細書に開示される内容は、感染動物とワクチン接種動物との識別(DIVA)のための検出方法を提供する。
本発明のワクチン又は組成物の使用は動物のCPV感染の検出を可能にすることが本明細書で開示される。本発明のワクチン又は組成物の使用は、感染動物とワクチン接種動物とを識別(DIVA)することによって動物における感染の検出を可能にすることが本明細書で開示される。
ある実施態様では、本明細書に開示される内容は、免疫応答を引き出すか又は誘導する方法を実施するためのキットに向けられ、前記キットは、組換えCPV免疫学的組成物若しくはワクチン、又は不活化CPV免疫学的組成物若しくはワクチン、組換えCPVウイルス組成物若しくはワクチンのいずれか1つ、及び当該方法を実施するための指示を含むことができる。
本発明の別の実施態様は、動物においてCPVに対する免疫学的応答又は防御応答を誘導する方法を実施するためのキットであり、前記キットは、本発明のCPV抗原及び組換えCPVウイルス免疫学的組成物若しくはワクチンを含む組成物又はワクチン、並びに免疫応答を動物において引き出すために有効量でデリバリーする方法を実施するための指示を含む。
本発明の別の実施態様は、動物においてCPVに対する免疫学的応答又は防御応答を誘導する方法を実施するためのキットであり、前記キットは、本発明のCPV抗原及び不活化CPV免疫学的組成物若しくはワクチンを含む組成物又はワクチン、並びに免疫応答を動物において引き出すために有効量でデリバリーする方法を実施するための指示を含む。
本発明のさらにまた別の特徴は、上記に記載した本発明のプライム-ブーストワクチン免疫のためのキットに関する。当該キットは少なくとも2つのバイアルを含み、第一のバイアルは本発明のプライム-ワクチン免疫のためのワクチン若しくは組成物を含み、第二のバイアルは本発明のブースト-ワクチン免疫のためのワクチン若しくは組成物を含む。キットは有利には、追加の第一又は第二のバイアルを含み、前記バイアルは追加のプライム-ワクチン免疫又は追加のブースト-ワクチン免疫のためである。
以下の実施態様が本発明に包含される。ある実施態様では、CPV抗原又はそのフラグメント若しくは変種及び医薬的又は獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルを含む組成物が開示される。別の実施態様では、当該CPV抗原又はそのフラグメント若しくは変種がCPV抗原の少なくとも15アミノ酸を含む免疫原性フラグメントを含む、上記に記載の組成物が開示される。ある実施態様では、当該CPV抗原又はそのフラグメント若しくは変種が部分的に精製される上記の組成物が開示される。ある実施態様では、当該CPV抗原又はそのフラグメント若しくは変種が実質的に精製される上記の組成物が開示される。
第四級アンモニウム塩を含む陽イオン性脂質(プラスミドにとって適切であるがただし絶対にというわけではない)は、有利には下記の式を有するものである:
これらの陽イオン性脂質の中で、DMRIE (N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアンモニウム(WO96/34109)が好ましく、有利にはDMRIEは中性脂質(有利にはDOPE (ジオレオイル-ホスファチジル-エタノールアミン)(Behr, 1994))と結合してDMRIE-DOPEを形成する。
有利にはプラスミドとアジュバントとの混合物は下準備なく生成され、さらに有利には調製物の投与と同時に又は調製物の投与の少し前に(例えば投与の少し前又は投与に先立って)生成される。プラスミド-アジュバント混合物は、有利には混合物が複合体を形成するために十分な時間を投与前に提供するために、例えば投与の約10分から約60分前、例えば投与のほぼ30分前に生成される。
DOPEが存在するとき、DMRIE:DOPEモル比は、有利には約95:約5から約5:約95、より有利には約1:約1、例えば1:1であり得る。
DMRIE又はDMRIE-DOPEアジュバント:プラスミド重量比は、約50:約1から約1:約10、例えば約10:約1から約1:約5、及び約1:約1から約1:約2、例えば1:1から1:2である。
(3)の水中油乳剤(ウイルスベクターに対して特に適切である)は、以下を基剤とすることができる:軽質流動パラフィン油(欧州局方型)、イソプレノイド油(例えばスクアラン、スクアレン)、アルケンのオリゴマー化から得られる油(例えばイソブテン又はデセン)、直鎖アルキル基を有する酸又はアルコールのエステル(例えば植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコール、ジ(カプリレート/カプレート)、グリセロールトリ(カプリレート/カプレート)、及びジオレイン酸プロピレングリコール、又は分枝脂肪アルコール又は酸のエステル(特にイソステアリン酸エステル)。
乳剤を形成するために、油を乳化剤と組み合わせて用いる。乳化剤は非イオン性界面活性剤であり得る。非イオン性界面活性剤は例えば以下のものである:一方でソルビタン、マンニド(例えば無水オレイン酸マンニトール)、グリセロール、ポリグリセロール又はプロピレングリコールのエステルのエステル、及び他方でオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸又はヒドロキシステアリン酸のエステル(これらのエステルは場合によってエトキシル化される)、又はポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンコポリマーブロック(例えばプルロニック(Pluronic)、例えばL121。
無水マレイン酸-アルケニル誘導体コポリマーに関しては、EMA(Monsanto)が好ましい。EMAは直鎖又は架橋されたエチレン-無水マレイン酸コポリマーであり、それらは、例えばジビニルエーテルによって架橋される。以下の文献もまた参照されたい:J.Fields et al., 1960。
構造に関しては、アクリル酸又はメタクリル酸ポリマー及びEMAは、好ましくは下記式を有する基本ユニットによって形成される:
x=0又は1で、好ましくはx=1であり、
y=1又は2で、x+y=2である。
EMAについては、x=0でy=2であり、カルボマーについてはx=y=1である。
これらのポリマーは水又は生理学的塩類溶液(20g/LのNaCl)中で可溶性であり、pHは7.3から7.4に例えばソーダ(NaOH)によって調整して、発現ベクターを取り込むことができるアジュバント溶液を提供することができる。最終的な免疫学的又はワクチン組成物中のポリマー濃度は、約0.01から約1.5% w/v、約0.05から約1% w/v、及び約0.1から約0.4% w/vの範囲であり得る。
本発明は、例えば複数の活性成分を、有利には一緒にかつ担体、サイトカイン及び/又は希釈剤とともに混合することによりそのような組合せ組成物を調製することを包含する。
本発明で用いることができるサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターフェロンα(IFNα)、インターフェロンβ(IFNβ)、インターフェロンγ(IFNγ)、インターロイキン-1α(IL-1α)、インターロイキン-1β(IL-1β)、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-3(IL-3)、インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-5(IL-5)、インターロイキン-6(IL-6)、インターロイキン-7(IL-7)、インターロイキン-8(IL-8)、インターロイキン-9(IL-9)、インターロイキン-10(IL-10)、インターロイキン-11(IL-11)、インターロイキン-12(IL-12)、腫瘍壊死因子α(TNFα)、腫瘍壊死因子β(TNFβ)、ポリイノシン及びポリシチジン酸、シチジン-リン酸-グアノシンオリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)、並びに形質転換増殖因子β(TGFβ)が含まれるが、ただしこれらに限定されない。サイトカインは、本発明の免疫学的又はワクチン組成物と同時投与されるか、及び/又は連続的に投与され得ることは理解されるであろう。したがって、例えば、本発明のワクチンはまた、in vivoで適切なサイトカイン(例えばワクチンを接種される又は免疫学的応答が誘引される宿主に適合するサイトカイン(例えばウシに投与される調製物にはウシサイトカイン))を発現する外因性核酸分子を含むことができる。
バキュロウイルス/昆虫細胞発現ポリペプチド系の免疫学的組成物及び/又はワクチンの事例では、一用量は、約1μgから約2000μg、約50μgから約1000μg、及び約100μgから約500μgのCPV抗原、エピトープ又は免疫原を含むことができる。当該用量は、約102から約1020のVLP、約103から約1020、約104から約1020のVLPを含むことができる。一用量体積は約0.1から約10mL、約0.2から約5mLであり得る。一般的に、当業者は多くの用量決定手法を承知しており、非日常的作業を実施することなく用量を最適化することができるであろう。
いくつかの実施態様では、組合せワクチンは一回分用量で防御免疫を提供する。
いくつかの実施態様では、当該病原体又は疾患はイヌパルボウイルス(CPV)である。
いくつかの実施態様では、当該病原体又は疾患は口蹄疫ウイルス(FMDV)である。
いくつかの実施態様では、当該組合せのVLP成分は全タンパク質含有量の関数として少なくとも10%のCPV VLP(w/w)を含む。
いくつかの実施態様では、当該VLP成分は少なくとも20%のCPV VLP(w/w)を含む。
いくつかの実施態様では、当該CPV VLPは昆虫細胞でバキュロウイルスベクターによって発現される。
いくつかの実施態様では、当該CPV VLPは少なくとも1つのCPVキャプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施態様では、当該CPV VLPは、配列番号:1、3、4、6、8、9又は10に示される配列を有するCPVポリペプチドを含むか、又は当該CPV VLPは、配列番号:1、3、4、6、8、9又は10に示される配列と少なくとも90%同一性を有するCPVポリペプチドを含む。
いくつかの実施態様では、当該CPV VLPは、配列番号:2、5又は7に示される配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるCPVポリペプチドを含むか、又は当該CPV VLPは、配列番号:2、5又は7に示される配列と少なくとも90%同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるCPVポリペプチドを含む。
いくつかの実施態様では、当該組合せワクチンはアジュバント添加されず、かつ場合によって医薬的又は獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルを含む。
別の特徴では、本発明は、CPV VLPの生成に有用なプラスミドを提供し、前記プラスミドは、配列番号:1、3、4、6又は8−10に示される配列を有するCPV抗原をコードするポリヌクレオチド、又は配列番号:1、3、4、6又は8−10に示される配列と少なくとも90%同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施態様では、当該ポリヌクレオチドは、配列番号:2、5、7、11又は12に示される配列を含むか又は前記配列から成る。
いくつかの実施態様では、当該プラスミドは配列番号:11又は12に示される配列から成る。
いくつかの実施態様では、当該プラスミドは安定的に昆虫細胞を形質転換し、前記細胞はCPV VLPを発現する。
別の特徴では、本発明は、実質的に精製された昆虫細胞発現CPV空キャプシド又はCPV VLP提供し、当該CPV空キャプシド又はVLPは、配列番号:1、3、4、6又は8−10に示される配列を有するポリペプチドを含むか、或いは当該CPV空キャプシド又はVLPは、配列番号:1、3、4、6又は8−10に示される配列と少なくとも90%同一性を有するポリペプチドを含む。
いくつかの実施態様では、当該CPV空キャプシド又はVLPは、配列番号:1、3、4、6又は8−10に示される配列を有するポリペプチドから成る。
別の特徴では、本発明は動物においてCPVに対する免疫応答を引き出す方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示する組成物、ワクチン、組合せワクチン及びVLPを当該動物に投与する工程を含む。
いくつかの実施態様では、当該免疫応答は、後に続く病毒性CPVへの暴露に対してワクチン接種動物を防御する。当該暴露は自然的でも又は実験的でもよい。
いくつかの実施態様では、当該免疫応答は、ワクチン接種動物で前記動物におけるCPVに対する高レベルの母獣由来抗体(MDA)の存在に関係なく惹起される。“高レベル”は通常的な意味を有し、一般的には、従来技術のワクチンがMDA陽性動物において強力な防御応答を引き出す能力を妨げるMDAレベルを指す。
本発明は、これから以下の非限定的実施例の手段によってさらに説明されるであろう。
実施例
特段の記載がなければ、DNA挿入物、プラスミド、及び組換えウイルス又はバキュロウイルスベクターの構築は、以下の文献に記載されている標準的な分子生物学技術を用いて実施された:J.Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989。
目的:昆虫細胞に対して最適化されたCPV(イヌパルボウイルス、Souriou株血清型2c)のCPVキャプシドタンパク質をコードするpVL1393系トランスファープラスミドを作製し、さらにウイルス様粒子(VLP)を発現させるために組換えバキュロウイルスBacMEB072を生成すること。参照配列はSouriou 2c株(Merial)であり、呼称Genbank BAD34656/Swissprot P61826(配列番号:1)を有する。
CPVキャプシド遺伝子(1755bp)は584アミノ酸のポリペプチド(シグナルペプチドを含まない)をコードする。CPV VP2タンパク質をコードする配列(配列番号:1)をクローニングし、対応するDNA配列を昆虫細胞に対してコドンを最適化させた(配列番号:5)。潜在的機能性ドメインを下記の表1に示す。
(P61826についてのSwiss-prot注釈による)
表2:
予想サイズのバンドが、クマシー染色で認められるように、溶解して清澄化させた感染細胞ペレットで発現された。タンパク質は細胞中に蓄積されたが、溶解後の可溶性分画でも検出された。VP2タンパク質の実体は、CPVキャプシドに対する特異的モノクローナル抗体(CPV103B10A)を用いてドットブロットで確認した。
電子顕微鏡(EM)分析でキャプシドタンパク質のVLPへの正確な自己組み立てが確認された。前記VLPは25−30nmの直径及びパルボウイルス様ビリオンの正確な形態を有していた(図4)。VLP生成の最適な条件は、MOI=0.1の使用及び感染後5日での採集であった。他の条件も想定されるが、これらの特定の条件では1mL当たり約1011のVLP濃度が得られた。
目的は、哺乳動物に対して最適化されたCPV(イヌパルボウイルス、Souriou株血清型2c)の短縮VP2キャプシドタンパク質をコードするpVL1393系トランスファープラスミドを作製し、続いてVLPを発現する対応する組換えバキュロウイルスBacMEB073を作製することであった。VLP形成を妨げることなくVP2発現を強化しようと、9個のN-末端アミノ酸を欠失させた(-9AA)(Hurtado et al.Journal of Virology, August 1996)。さらにまた、キャプシド構造及び形成を改善しようと、3つのアミノ酸(M、L及びK)を付加した(Gilbert et al., Journal of Nanobiotechnology, 2006)。本開示の前には、この欠失及び挿入が、CPV VP2発現及びその後のキャプシド形成に対してどんな影響があるかは知られてなかった。
末端切断し哺乳動物のために最適化した(Geneart)VP2遺伝子(N-末端の9アミノ酸の欠失は追加のMLKによって入れ替えられた)を、さらにベクター及び挿入物の双方のBamHI及びXbaI部位を利用してプラスミドpVL1393中にクローン化した。
バキュロウイルスベクター作製及びタンパク質の発現。バキュロウイルスベクター:相同組換えによってのみレスキューされる(BaculoGold DNA, Pharmingen)、致死性欠失により改変されたAcNPV。
組換えバキュロウイルスBacMEB073の作製:プラスミドpMEB073を用いて相同組換えによって、ポリヘドリンプロモータの制御下でSouriou株血清型2cの短縮CPVキャプシド遺伝子をコードする組換えバキュロウイルスを生成した。ツマジロクサヨトウSf9昆虫細胞に、製造業者のプロトコル(Baculogold, Pharmingen)にしたがってプラスミドpMEB073及びBsu36I三重切断直線化AcNPV DNAをコトランスフェクトした。コトランスフェクション上清の組換えバキュロウイルスを2回プラーク精製した。5クローンを25cm2の単層培養フラスコスケールで28℃にて増幅した(継代1)。CPVキャプシド発現について感染細胞及び上清をドットプロットによって分析した(CPVキャプシド抗原特異的モノクローナル抗体(CPV103B10A)を用いた)。クローン1は正しいドットブロットプロフィールを示した。このクローンをエーレンマイヤー(Erlenmeyer)50mLスケールで28℃、105rpm(懸濁)でさらに増幅した(継代2)。200mLスケールの3回目の継代(継代3)を実施して、タンパク質発現に用いるウイルスストックを得た。続いて、このウイルスストックの力価をプラークアッセイによって決定した。ウイルスストックは、2%のFCSを補充したSF900II培地を用いて得られた。
力価決定後、組換えバキュロウイルスストック(継代3)を無血清培地でのタンパク質生成に用いた。
発現分析:
表3:予想される組換え体
昆虫細胞(Sf9)にBacMEB073をMOI=1 pfu/mLで感染させた。昆虫細胞をFCS非含有Sf900II培地で28℃、105rpmで4日間増殖させた。タンパク質生成は、全Sf9溶解物及び培養上清をSDS-PAGE(4−20%、Invitrogen)、続いてモノクローナル抗体(CPV103B10A)によるドットブロットに付すことによって分析した。
発現タンパク質の溶解性は、細胞ペレットを溶解緩衝液(50 mM Tris-HCl(pH8)、500 mM NaCl+抗プロテアーゼ)で溶解し、3回の音波破砕(能力の20%で15秒、30秒待機、能力の20%で15秒、氷上で5分間待機)によって調べた。可溶性タンパク質を不溶性材料から遠心分離(11,000rcf、4℃、30分)によって分離した。
結果及び結論:64kDaの予想サイズのバンドが、クマシー染色で認められるように、溶解して清澄化させた感染細胞の細胞ペレットで発現された。細胞に蓄積されたタンパク質はまた溶解後の可溶性分画で検出された。VP2タンパク質の実体は、CPVキャプシドに対する特異的モノクローナル抗体(CPV103B10A)を用いてドットブロットで確認した。
EM分析でキャプシドタンパク質のVLPへの正確な自己組み立てが確認された。前記VLPは25−30nmの直径とともに1012VLP/mLの濃度のパルボウイルス様ビリオンの正確な形態を有していた(図4)。VLP生成はMOI=0.1及び感染後5日での採集で最適であったが、他の条件でもまた高度レベルのVLPを得ることができる。
本研究の主要な目的は、CPV2c Souriou株の2つのウイルス様粒子(VLP)(すなわち、実施例1及び2に記載のBacMEB072及びBacMEB073)の安全性及び免疫原性を仔犬で査定及び比較することであった。二次的な目的は、BacMEB072及びBacMEB073によって生成されたVLPの免疫原性に対する水酸化アルミニウム/サポニン又はイスコマトリックスのアジュバント効果を評価することであった。8週齢の仔犬にワクチン接種し、表4に示すように調査した。
表4:末端切断短縮CPV VP2 VLP対完全長CPV VP2 MLV試験の実験設計
*ワクチン接種前
安全性に関しては、Al(OH)3/サポニンは、全身反応も他のいずれの徴候(局部発熱及び浮腫を除く)も誘導しなかった。軽度の浮腫が大半のイヌで各ワクチン接種後3から4日間観察された。免疫原性に関しては、VLP CPV2による仔犬のワクチン接種は液性及び細胞性免疫応答の双方を誘導でき、VLPと一緒にした短縮型VP2又は完全長VP2間で大きな違いはなかった。留意すべきことに、液性免疫応答の持続が、Al(OH)3/サポニン又はイスコマトリックスでVLPにアジュバント添加したときに延長され、調べた2つのアジュバント間で顕著な違いはなかった。さらにまた、イスコマトリックスアジュバントは、無アジュバントグループだけでなくAl(OH)3及びサポニングループと比較しても、IFNガンマ応答の規模を高めた。
この試験の目的は、CPV VLP、Souriou CPV MLV又はBari CPV MLVをワクチン接種した仔犬の免疫応答を比較することであった。第一の実験は、1.52log10 TCID50/mL(IFI)Souriou;1.0log10 TCID50/mL(HA)Bari;及びpMEB072 VLPを比較した(結果は図8)。第二の実験は、2.21log10 TCID50/mL(IFI)Souriou;2.0log10 TCID50/mL(HA)Bari;及びAl(OH)3+サポニンアジュバント入りpMEB073-生成VLPを比較した(結果は図9)。最後に第三の実験は、3.81log10 TCID50/mL(IFI)Souriou;3.0log10 TCID50/mL(HA)Bari;及びAl(OH)3+サポニンアジュバント入りpMEB072-生成VLPを比較した(結果は図10)。総合すれば、これらの結果は、本発明にしたがって作製されたCPV VLPは、例示的なCPV MLVと比較したとき匹敵し得る免疫応答を提供することを示した。重要なことに、当該VLPは、いずれのMLV株の低及び中間用量の双方と比較したときよりも迅速な免疫応答を誘導できた。
この試験の目的は、母獣抗体を有する仔犬に種々の用量で皮下に投与される種々のワクチン候補物の免疫原性を評価することであった。この実験以前には、CPV VLPが仔犬において母獣抗体に打ち勝って防御免疫を誘導するか否かは不明であった。
表5:CPV VLP対CPV MLV試験の実験設計
図11、図12及び表6に示すように、CPV抗体力価はMLV+VLPグループで有意に高かった。これらのデータは、ワクチン処方物へのCPV VLPの添加は母獣抗体に打ち勝つために十分であるという、驚くべきかつ予想に反する結果を示している。本発明者らは、VLPは循環CPV MDAの顕著な部分を捕捉し、このことは次にVLP及びCPV MLVが仔犬を能動的に免疫することを可能にすると考える。
表6:ワクチン接種後日数に対応する抗CPV抗体力価(IHA)
この試験の目的は、種々のルートで投与されたいくつかの用量の種々のワクチン候補物の免疫原性を評価することであった。当該種々の候補物は、CPV VLP、及びCPV又はCDP(イヌジステンパー)遺伝子を発現する組換えアデノウイルスとした。
表7:CPV VLP対アデノCPV対アデノCDV試験の実験設計
図13に示すように、グループA及びEは防御レベルのCPV抗体力価を仔犬で誘導した。
この試験の目的は、CPV MDAを有するイヌで多様な実験的多価ワクチン処方物の投与後の抗体応答を査定することであった。前記処方物には、通常のCPV-2 MLV又はバキュロウイルス発現CPV-2c組換えウイルス様粒子ワクチン(VLP)及び競合ワクチン/市販ワクチンが含まれていた。
以前にCPVについて妊娠中に免疫した雌犬に由来する、40匹の6−7週齢の母獣由来抗体(MDA)陽性ビーグル犬を、同腹仔及び抗体力価を用いて4つのグループ(n=10匹)にランダムに割り当てた。-27日目に収集した血液サンプルの力価を任意抽出に利用した。全てのイヌに下記表にしたがって割り当てたワクチンを21日離して2回接種した。仔犬はD0にCPV母獣由来Ab(MDA)を有する。
表8:CPV VLP対RECOMBITEK(商標)C4及びNOBIVAC(商標)試験の実験設計
*イヌパルボウイルスVP2のウイルス様粒子:VPL CPV-2c
**同時使用ワクチンと同じ側にほぼ3cm離して投与
***CDV-CAV-CPi-CPV2ワクチンをC4と称する
HA:0.5mLで血球凝集
血液を0、7、15、21、28、35及び42日目に全てのイヌから収集し、HAI及び血清中和抗体(SNA)アッセイによってCPV抗体について血清を試験した。
CPV HAI力価は血球凝集を妨げる最高希釈の逆数として示され、<20の値を陰性とみなした。
グループ3(C4)の2匹のイヌを除いて、各グループの全てのイヌが0日目のワクチン接種前にHAIでCPV陽性であった。ワクチン接種後の血清転換は0日目から4倍以上の力価の増加と定義した。最初のワクチン接種後、VLP-CPV2c(グループ1)をワクチン接種した10匹のうち6匹、及びVLP-CPV2c- C4(グループ2)をワクチン接種した10匹のイヌのうち6匹が7日目までに血清転換を示した。グループ3及び4(すなわちVLP非含有)では7日目に応答はなかった。21日目までに、グループ2(VLP-CPV2c- C4)の10匹のイヌのうち5匹、グループ1(VLP-CPV2c)の10匹のうち2匹、グループ4(NOBIVAC3(商標))の10匹のうち3匹、及びグループ3(C4)の10匹のうち2匹が血清転換を示した(図15)。
二回目のワクチン接種後、35日目(ワクチン接種後2週間)までに、血清転換が、グループ2(VLP-CPV2c- C4)及びグループ4(NOBIBAC3(商標))の全てのイヌで、続いてグループ3(C4)の9匹及びグループ1(VLP-CPV2c)の8匹で観察された。VLP+C4(グループ2)処置は、この試験を通じて最高の幾何平均抗体力価を誘導した。図17を参照されたい。V2から7日後(28日目)、このグループのGMTは、VLT単独(GMT=520)より-7.5倍高く、C4単独(GMT=422)より-9倍高く、NOBIVAC3(商標)グループ(GMT=139)より-28倍高かった。
*'<'の記号は要約統計量の計算のために除去した。
この試験の目的は、イヌパルボウイルス2c型のVP2キャプシドタンパク質から形成した実験的ウイルス様粒子を種々の力価で、CPV-2 MLV多価ワクチン処方物及び1つの市販ワクチンと組み合わせてCPV MDAを有するイヌに投与した後でCPV抗体応答を評価することであった。
以前にCPVについて妊娠中に免疫した雌犬に由来する、40匹の6−7週齢の母獣由来抗体(MDA)陽性ビーグル犬を、同腹仔及び抗体力価を用いて5つの処置グループ(n=10匹/グループ)にランダムに割り当てた。-15日目に収集した血液サンプルの力価を任意抽出に利用した。
ワクチンは希釈成分を用いて凍結乾燥成分を再水和することによって調製した。試験ワクチンとして用いた凍結乾燥シリーズ#1、#2、#3及び#5は同じ実験的4-ウエイ(C4)ワクチンであった。各成分の力価は以下の通りであった:CPV:6.1Log TCID50/mL(1X培養の約0.2mL)、CDV:7.3Log TCID50/mL、CPi:5.5Log TCID50/mL、及びCAV2:6.0Log TCID50/mL。全てのイヌに下記表11にしたがって割り当てたワクチンを21日離して2回接種した。
表11:CPV VLP対RECOMBITEK(商標)C4及びNOBIVAC(商標)試験の実験設計
血液を0、7、15、21、28、35及び42日目に全てのイヌから収集し、HAIアッセイによってCPV抗体について血清を試験した。
CPV HAI力価は血球凝集を妨げる最高希釈の逆数として示され、<20の値を陰性とみなした。試験した各グループの全てのイヌが0日目のワクチン接種前にHAIでCPV陽性であった(全てのグループのGMT平均力価は42.87から80の間であった)。ワクチン接種後の血清転換は0日目から4倍以上の力価の増加と定義した。血清転換を示したイヌを応答動物として分類した(図18)。最初のワクチン接種から7日後に、高用量のVLP-CPV2c-C4(グループ1)をワクチン接種した10匹のうち5匹、及び中用量のVLP-CPV2c-C4(グループ2)をワクチン接種した10匹のイヌのうち1匹が血清転換を示した。グループ3、4及び5(すなわち低VLP又は無VLPグループ)では7日目に応答はなかった。最初のワクチン接種から21日後に、グループ1(高用量VLP-CPV2c-C4)の全てのイヌ、グループ2(中用量VLP-CPV2c- C4)の10匹のイヌのうち3匹、グループ3(低用量VLP-CPV2c- C4)の10匹のうち1匹が血清転換した。グループ4及び5(すなわちVLPを含まないグループ)では応答はなかった(図18)。
34日目に(二回目のワクチン接種から13日後)、血清転換が、グループ1(高用量VLP-CPV2c-C4)及びグループ4(NOBIVAC3(商標))の全てのイヌで、続いてグループ2(中用量VLP-CPV2c- C4)の9匹、グループ3(低用量VLP-CPV2c- C4)の6匹、及びグループ5(VLPの無いC4)の1匹が血清転換した。
図19に示すように、高用量VLP+C4(グループ1)処置は、この試験を通して最高の幾何平均抗体力価を誘導した。V2後13日で(34日目)、このグループのGMTは4457.22で、その後に中用量VLP-CPV2c-C4及びNOBIVAC3(商標)グループ(GMT=1470.33)、低用量VLP-CPV2c-C4(GMT=298.57)、C4単独(GMT=45.95)が続いた。
したがって、CPV VLPは、MDA+の仔犬でMLV単独よりも早期の免疫開始(OOI)を促し、さらにCPV VLPはMDA+の仔犬でMLV C4と相乗的に働く。出願人らは、これらの結果は予想に反しかつ極めて有利であると提起する。母獣由来抗体に勝ることはワクチン研究者にとって長らく困難な課題であった。これらのデータは、本明細書に開示したVLP+MLVのアプローチは、MDA+の仔孫に防御免疫を提供するという課題に広範囲に適用可能であることを示している。
Claims (20)
- ウイルス様粒子(VLP)成分及び改変生ウイルス(MLV)成分を含む組合せワクチンであって、当該VLP及びMLVの両方が同じ病原体又は疾患に向けられ、当該組合せワクチンが母獣由来抗体(MDA)に打ち勝つ、前記組合せワクチン。
- 一回分用量で防御免疫を提供する、請求項1に記載の組合せワクチン。
- 病原体又は疾患がイヌパルボウイルス(CPV)である、請求項1に記載の組合せワクチン。
- 病原体又は疾患が口蹄疫ウイルス(FMDV)である、請求項1に記載の組合せワクチン。
- 組合せのVLP成分が全タンパク質含有量の関数として少なくとも10%のCPV VLP(w/w)を含む、請求項3に記載の組合せワクチン。
- VLP成分が少なくとも20%のCPV VLP(w/w)を含む、請求項5に記載の組合せワクチン。
- CPV VLPが昆虫細胞でバキュロウイルスベクターによって発現される、請求項3に記載の組合せワクチン。
- CPV VLPが少なくとも1つのCPVキャプシドタンパク質を含む、請求項3に記載の組合せワクチン。
- CPV VLPが、配列番号:1、3、4、6、8、9又は10に示される配列を有するCPVポリペプチドを含むか、又はCPV VLPが、配列番号:1、3、4、6、8、9又は10に示される配列と少なくとも90%同一性を有するCPVポリペプチドを含む、請求項3に記載の組合せワクチン。
- CPV VLPが、配列番号:2、5又は7に示される配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるCPVポリペプチドを含むか、又はCPV VLPが、配列番号:2、5又は7に示される配列と少なくとも90%同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるCPVポリペプチドを含む、請求項1に記載の組成物又はワクチン。
- 組成物又はワクチンがアジュバント添加されず、医薬的又は獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルを含んでいてもよい、請求項1に記載の組合せワクチン。
- 配列番号:1、3、4、6又は8−10に示される配列を有するCPV抗原をコードするポリヌクレオチド、又は配列番号:1、3、4、6又は8−10に示される配列と少なくとも90%同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、CPV VLPの生成に有用なプラスミド。
- ポリヌクレオチドが、配列番号:2、5、7、11又は12に示される配列を含むか又は前記配列から成る、請求項12に記載のプラスミド。
- プラスミドが配列番号:11又は12に示される配列から成る、請求項12に記載のプラスミド。
- 安定的に昆虫細胞を形質転換し、CPV VLPを発現する、請求項12に記載のプラスミド。
- 実質的に精製された、昆虫細胞発現CPV空キャプシド又はCPV VLPであって、当該CPV空キャプシド又はVLPが、配列番号:1、3、4、6又は8−10に示される配列を有するポリペプチドを含むか、又は
当該CPV空キャプシド又はVLPが、配列番号:1、3、4、6又は8−10に示される配列と少なくとも90%同一性を有するポリペプチドを含む、前記CPV空キャプシド又はCPV VLP。 - CPV空キャプシド又はVLPが、配列番号:1、3、4、6又は8−10に示される配列を有するポリペプチドから成る、請求項16に記載の精製されたCPV空キャプシド又はCPV VLP。
- 動物においてCPVに対する免疫応答を惹起する方法であって、請求項1−7のいずれか1項に記載の組成物、又は請求項16に記載のCPV空キャプシド又はVLPを動物に投与する工程を含む、前記方法。
- 免疫応答が防御性であり、当該防御免疫応答が、後に続く病毒性CPVへの暴露に対してワクチン接種動物を防御する、請求項18に記載の方法。
- ワクチン接種動物において、前記動物におけるCPVに対する高レベルの母獣由来抗体(MDA)の存在に関係なく防御免疫応答が惹起される、請求項19に記載の方法。
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