RS65084B1 - Vakcine čestica sličnih virusu (vlp) parvovirusa pasa (cpv) i njihova upotreba - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na oblast vakcinologije, a posebno, na izazov savladavanja antitela poreklom od majke (MDA). Tačnije, pronalazak se odnosi na savladavanje MDA primenom kod životinja, uključujući pse, kombinacije čestica sličnih virusu i modifikovanog živog virusa (MLV), bilo u simultanoj kombinaciji, sekvencijalnoj primeni, ili putem režima prve primene-busta. Još preciznije, pronalazak se odnosi na kompozicije za izazivanje zaštitnog imuniteta protiv parvovirusa (CPV) kod pasa i štenaca, bez obzira da li je CPV MDA prisutan ili ne kod pasa i štenaca.

STANJE TEHNIKE

[0002] Parvovirus pasa (CPV) je prvenstveno enterički patogen koji inficira pse, posebno mlade pse. Parvovirusnu infekciju karakteriše akutna dijareja, groznica i leukopenija kod pasa i štenaca starijih od 4 do 5 nedelja, a u retkim slučajevima i bolest miokarda kod mlađih štenaca. Stopa mortaliteta od bolesti kod nevakcinisanih pasa je veoma visoka. I dok postoji nekoliko CPV vakcina, prisustvo antitela dobijenih od majke (MDA) ima tendenciju da blokira sposobnost inače efikasnih vakcina da obezbede zaštitni imunitet.

[0003] Novorođeni štenci stiču pasivni imunitet protiv bolesti kao što je CPV infekcija dojenjem od svoje majke, posebno tokom prva dva dana života. Štene koje doji uzima kolostrum u mleku koje se prvo proizvodi i (MDA) u kolostrumu se prenosi na štene. Za pse -i mnoge druge sisare - nivo pasivnog imuniteta koji obezbeđuje kolostrum postepeno se smanjuje kako se MDA kataboliše. Kao takvo, starost u kojoj štene više nije zaštićeno MDA uveliko varira, u zavisnosti od unosa kolostruma od strane šteneta, količine antitela koja se u njemu nalaze i nekoliko drugih faktora.

[0004] Poseban izazov pri vakcinisanju štenaca je primena vakcina u skladu sa vremenskim okvirom koji obezbeđuje zaštitu koja se preklapa sa zaštitom koju pružaju majčina antitela i počinje kada se majčina antitela smanjuju. Trenutno, režimi vakcinacije za štenad obično počinju sa oko 6 nedelja starosti, a busteri se daju otprilike svake 3 nedelje nakon toga, npr. u 9, 12 i ponekad 15 nedelja. Međutim, da bi ovaj režim pružio punu zaštitu, prva doza vakcine bi morala odmah da izazove zaštitni imuni odgovor. Ovo očekivanje je potpuno nerealno zbog, delimično, nezrelosti imunološkog sistema šteneta i vremenskog perioda potrebnog da se uspostavi imuni odgovor. Pored toga, situacija je dodatno komplikovana jer rezidualni MDA, koji može da opstane do oko šest nedelja starosti, neutrališe MLV vakcine. Trenutno, sve komercijalno dostupne CPV vakcine su MLV vakcine.

[0005] Važno je da, iako štene sa CPV MDA možda neće reagovati ni na jednu MLV CPV vakcinu, i dalje može biti zaraženo virulentnim poljskim sojem CPV i razviti pseću parvovirozu. Zbog interferencije MDA, potpuna zaštita se obično ne razvija dok se ne sprovede ceo tok vakcinacije. Kao posledica toga, smrtnost zasnovana na uzrastu usled CPV infekcije dostiže vrhunac pre završetka protokola vakcinacije. Shodno tome, razvoj vakcine koja aktivno imunizuje štence nakon prve injekcije – i u prisustvu MDA - jedna je od najvažnijih nezadovoljenih potreba u kinološkoj medicini.

[0006] Još jedan izazov u veterinarskoj medicini je lečenje kancera, na primer, kod pasa. Postoje mnoga ograničenja u postojećim alatima za terapiju kancera, posebno za gerijatrijske pse. Primena onkolitičkih parvovirusa za ubijanje ćelija kancera pokazuje veliko obećanje kao efikasan tretman kancera (Rommelaere et al, Cytokine & Growth Factor Reviews 21:185-195, 2010; i U.S. Pat. br. 7,179,456 za Rommelaere et al,) i može se primeniti na pse. Međutim, postojanje već postojećih antitela na parvoviruse (npr. kao rezultat vakcinacije) učinilo bi ovaj postupak neefikasnim, pošto bi parvovirus bio neutralisan postojećim antitelima. Pored toga, genska terapija kod pasa se trenutno retko sprovodi, ali bi bila obećavajući postupak za lečenje nekoliko poremećaja, ako se identifikuju odgovarajući vektori nukleinske kiseline. Shodno tome, postupci za savladavanje postojećih antitela bili bi korisni za primene koje ne obuhvataju vakcinaciju.

[0007] U svetlu gore navedenog, postoji potreba za vakcinama sa poboljšanom bezbednošću i dobrom efikasnošću, uključujući sposobnost da se prevaziđe MDA, uključujući vakcine koje pružaju zaštitu od heterolognih sojeva CPV.

[0008] T. V. Nguyen et al: "High Titers of Circulating Maternal Antibodies Suppress Effector and Memory B-Cell Responses Induced by an Attenuated Rotavirus Priming and Rotavirus-Like Particle-lmmunostimulating Complex Boosting Vaccine Regimen", Clinical and Vaccine Immunology, vol. 13, no.4, 1 April 2006, opisuju efekte antitela dobijenih od majke na imuni odgovor na vakcine protiv rotavirusa.

[0009] M. P. Azevedo et al: "Human rotavirus virus-like particle vaccines evaluated in a neonatal gnotobiotic pig model of human rotavirus disease", Expert Review of Vaccines, vol.

12, no.2, 9 February 2013 (2013-02-09), pages 169-181, procenjuju efikasnost vakcina čestica sličnih virusu (VLP) rotavirusa u gnotobiotskom modelu svinja.

[0010] Xu Jin et al: "Self-assembly of virus-like particles of canine parvovirus capsid protein expressed from Escherichia coli and application as virus-like particle vaccine", Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 98, no. 8, 12 January 2014, opisuju proizvodnju VLP parvovirusa pasa iz CPV VP2 proizvedenog u E. coli, koji su sposobni da indukuju anti-CPV antitela kod miševa nakon potkožne vakcinacije.

[0011] H. Feng et al: "Canine Parvovirus VP2 Protein Expressed in Silkworm Pupae Self-Assembles into Virus-Like Particles with High Immunogenicity", PLoS ONE, vol.9, no.1, 17 January 2014, page e79575, opisuju ekspresiju CPV VP2 koji formira VLP u sistemu bakulovirusa, samosastavljanje VLP u ćelijama insekata i kukuljica, i indukciju imunog odgovora kod miševa i pasa.

[0012 Gilbert L. et al: "Truncated forms of viral VP2 proteins fused to EGFP assemble into fluorescent parvovirus-like particles", Journal of Nanobiotechnology, vol.4, no.1, 8 December 2006, opisuje rekombinantni CPV VP2 i njegove N-terminalne delecione mutante, spojene na C-terminus pojačanog zelenog fluorescentnog proteina i njihovu sposobnost da formiraju VLP.

[0013] Hurtado A. et al: "Identification of domains in canine parvovirus VP2 essential for the assembly of virus-like particles", Journal of Virology, vol. 70, no. 8, 1996, opisuju N-terminalne i površinske delecione mutante CPV VP2i njihovu sposobnost da formiraju VLP.

SUŠTINA PRONALASKA

[0014] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje kombinovanu vakcinu koja sadrži česticu nalik virusu parvovirusa pasa (CPV) i CPV modifikovani živi virus (MLV), pri čemu i VLP i MLV izazivaju imuni odgovor protiv CPV, i gde kombinovana vakcina savladava antitela dobijena od majke (MDA).

[0015] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje kombinovanu vakcinu za upotrebu u postupku izazivanja imunog odgovora kod životinje protiv CPV koji sadrži primenu na životinju pomenute kombinovane vakcine.

[0016] Ovde su opisane farmaceutske kompozicije koje sadrže antigene čestica sličnih CPV virusu (VLP), CPV modifikovane žive virusne vakcine (MLV), postupci vakcinacije protiv CPV i komplete za upotrebu sa takvim postupcima i kompozicijama.

[0017] Date su kompozicije ili vakcine koje sadrže antigeni CPV polipeptid i njihove fragmente i varijante. CPV antigeni i njihovi fragmenti i varijante poseduju imunogene i zaštitne osobine. CPV antigeni mogu biti proizvedeni ekspresionim vektorom bakulovirusa u ćelijama insekata i sastavljeni u CPV prazne kapside ili CPV VLP (čestice slične virusu).

[0018] Antigeni polipeptidi i njihovi fragmenti i varijante mogu se formulisati u vakcine sa ili bez CPV modifikovanih živih virusa i/ili farmaceutskih kompozicija. Takve vakcine ili kompozicije se mogu koristiti za vakcinaciju životinje i obezbeđivanje zaštite od homolognih i heterolognih CPV sojeva.

[0019] Važno je da su pronalazači iznenađujuće i neočekivano otkrili da je primena kompozicija koje sadrže i MLV i VLP (svaki antigen koji odgovara istom patogenu, ali ne mora nužno da kodira ili obezbeđuje isti deo ili gen ili podjedinicu) sposobna da prevaziđe MDA da izazove zaštitni imunitet protiv naknadnog virulentnog izazivanja navedenim patogenom. Shodno tome, u posebnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje kombinovane vakcine koje sadrže i MLV CPV i CPV VLP, koje izazivaju zaštitni imunitet kod štenaca bez obzira da li štenci imaju cirkulišuću MDA protiv CPV.

[0020] Otkrivanje pruža kombinovane vakcine koje sadrže i MLV i VLP koje odgovaraju drugim patogenima, gde interferencija MDA predstavlja problem. Na primer, mlada goveda, svinje, mačke, koze, ovce, konji i drugi imaju cirkulišući MDA protiv različitih patogena. U svakom slučaju, prisustvo ovih MDA može uticati na efikasnost vakcina.

[0021] Sada kada je ovo otkriće napravljeno, pronalazači predviđaju da će primena kombinacije oba MLV VLP prevazići MDA bez obzira na patogen. Patogeni mogu uključivati, ali nisu ograničeni na: virus slinavke i šapa (FMDV), virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRSV), virus pseće kuge (CDV), FPL mačje panleukopenije i virus gripa konja (EIV). Stručnjaku će biti jasno da se ovaj pristup, koji obezbeđuje MLV VLP, može primeniti u svakom slučaju gde je ometanje od strane MDA izazov.

[0022] Takođe su obezbeđeni kompleti koji sadrže najmanje jedan antigenski polipeptid ili njegov fragment ili varijantu i uputstva za upotrebu.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0023] Sledeći detaljan opis, dat kao primer, ali nije namenjen da ograniči pronalazak samo na specifične opisane primere izvođenja, može se najbolje razumeti u vezi sa pratećim crtežima, u kojima:

Sl. 1 prikazuje tabelu koja sumira sekvence DNK i proteina;

Sl. 2 prikazuje plazmidnu mapu pMEB072;

Sl. 3 prikazuje plazmidnu mapu pMEB073;

Sl. 4 je elektronska mikrografija CPV VLP, koja prikazuje ispravan oblik i morfologiju viriona sličnih parvovirusu;

Sl. 5 je Western Blot koji prikazuje nivoe CPV VLP i prateće podatke;

Sl. 6 je Western Blot koji prikazuje nivoe CPV VLP i prateće podatke;

Sl. 7 je grafikon koji prikazuje CPV titre nakon vakcinacije određene pomoću ELISA;

Sl. 8 je grafikon koji prikazuje CPV titre nakon vakcinacije određene pomoću ELISA sa Souriou & Bari sojevima (niska doza, bez ađuvansa) ili CPV VLP proizvedenim od pMEB072. Početak je brži u grupi koja prima VLP;

Sl. 9 je grafikon koji prikazuje CPV titre nakon vakcinacije određene pomoću ELISA sa Souriou & Bari sojevima (srednja doza, sa ađuvansom) ili CPV VLP proizvedenim od pMEB073 (sa Al(OH)3+saponin). Početak je još brži u grupi koja prima VLP;

Sl. 10 je grafikon koji prikazuje CPV titre nakon vakcinacije određene pomoću ELISA sa Souriou & Bari sojevima (visoke doze) ili pMEB073 proizvedenim CPV VLP (sa Al(OH)3+saponin). Početak je brz kod sve tri grupe;

Sl. 11 je ClustalW poravnanje SEQ ID NOs: 1, 3, 4 i 6;

Sl. 12 je grafikon koji prikazuje pojedinačne titre anti-CPV antitela (IHA) prema tretmanu (MLV ili MLV VLP na Do) i danu. Svaka linija odgovara jednoj individui, a veličina tačaka odgovara broju vrednosti na naznačenoj kombinaciji dana i titra. Prikazani su samo podaci za pse koji imaju D0 IHA titar ≥ 40;

Sl. 13 je grafikon koji prikazuje srednje titre anti-CPV antitela (IHA) prema tretmanu (MLV ili MLV VLP na Do) i danu. Kutije predstavljaju medijanu, 25. i 75. percentil, a krajevi linija predstavljaju vrednosti unutar 1.5 puta interkvartilnog opsega; svaki simbol predstavlja jednu vrednost;

Sl. 14 je grafikon koji prikazuje srednje titre anti-CPV antitela (određene pomoću ELISA log10 OD50) prema danu nakon vakcinacije i grupi (Gr A: VLP SC 500 µl; Gr D VLP oralno; Gr E Ad5 CPV 8.64 log10; Gr G Ad5 CDV). Psi su vakcinisani na D0 i D28. Srednje vrednosti su predstavljene /- jedna standardna greška srednje vrednosti; svaka tačka predstavlja jednu vrednost;

Sl. 15 je grafikon koji prikazuje procenat ispitanika koji su odgovorili za studiju otkrivenu u Primeru 7;

Sl. 16 je grafikon koji prikazuje titre HAI;

Sl. 17 je grafikon koji prikazuje srednji geometrijski titar antitela koja neutrališu CPV Sl. 18 je grafikon koji prikazuje procenat ispitanika prema grupi i danu;

Sl. 19 je grafikon koji prikazuje CPV geometrijski srednji titar antitela po grupi i danu.

DETALJAN OPIS

[0024] Sve reference u opisu na postupke lečenja odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu).

[0025] Date su kompozicije koje sadrže CPV polipeptid, antigen i njihove fragmente i varijante koje izazivaju imunogeni odgovor kod životinje. Antigeni polipeptidi ili njihovi fragmenti ili varijante su proizvedeni ekspresionim vektorom bakulovirusa u ćelijama insekata. Antigeni polipeptidi ili fragmenti ili varijante mogu se formulisati u vakcine sa ili bez CPV modifikovanih živih virusa ili farmaceutskih kompozicija i koristiti za izazivanje ili stimulisanje zaštitnog odgovora kod životinje. U jednom primeru izvođenja, polipeptidni antigen je CPV kapsidni polipeptid ili aktivni fragment ili njegova varijanta. CPV antigeni se mogu sastaviti u CPV prazne kapside ili CPV VLP (čestice slične virusu).

[0026] Prepoznato je da antigeni polipeptidi pronalaska mogu biti polipeptidi pune dužine ili aktivni fragmenti ili njihove varijante. Pod "aktivnim fragmentima" ili "aktivnim varijantama" podrazumeva se da fragmenti ili varijante zadrže antigenu prirodu polipeptida. Dakle, otkrivanje obuhvata bilo koji CPV polipeptid, antigen, epitop ili imunogen koji izaziva imunogeni odgovor kod životinje. CPV polipeptid, antigen, epitop ili imunogen može biti bilo koji CPV polipeptid, antigen, epitop ili imunogen, kao što je, ali ne ograničavajući se na, protein, peptid ili fragment ili njihova varijanta, koji izaziva, indukuje ili stimuliše odgovor kod životinje, kao što su ovce, goveda, koze ili svinje.

[0027] Ovde su opisane pseće vakcine ili kompozicije koje mogu da sadrže efikasnu količinu rekombinantnog CPV antigena. U nekim primerima izvođenja, vakcine ili kompozicije su bez ađuvansa i mogu da sadrže farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, ekscipijens ili vehikulum.

[0028] U nekim primerima izvođenja, odgovor kod životinje je zaštitni imuni odgovor.

[0029] Pod "životinjom" se podrazumevaju sisari, ptice i sl. Životinja ili domaćin uključuje sisare i čoveka. Životinja može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od konja (npr. konj), pasa (npr. psi, vukovi, lisice, kojoti, šakali), mačaka (npr. lavovi, tigrovi, domaće mačke, divlje mačke, druge velike mačke, i druge mačke, uključujući geparde i risove), ovaca (npr. ovce), goveda (npr. goveda), svinja (npr. svinje), koza (npr. koze), ptica (npr. pile, patka, guska, ćurka, prepelica, fazan, papagaj, zeba, jastreb, vrana, noj, emu i kazuar), primata (npr. prosimian, tarsier, majmun, gibon, majmun) i ribe. Termin "životinja" takođe uključuje pojedinačnu životinju u svim fazama razvoja, uključujući embrionalne i fetalne faze.

[0030] Osim ako nije drugačije objašnjeno, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju isto značenje koje obično razume stručnjak iz oblasti tehnike kojoj ovo otkriće pripada. Termini u jednini "a", "an" i "the" uključuju množinu, osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Slično, reč „ili“ treba da uključi „i“ osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije.

[0031] Primećeno je da u ovom otkriću, a posebno u zahtevima i/ili paragrafima, termini kao što su "sadrži", "sadržan", "koji sadrži" i slično mogu imati značenje koje im se pripisuje u zakonu o patentima SAD; npr. mogu značiti "uključuje", "uključen", "uključujući" i slično; i da termini kao što su „koji se sastoji u suštini od“ i „sastoji se u suštini od“ imaju značenje koje im je pripisano u zakonu o patentima SAD, na primer, dozvoljavaju elemente koji nisu eksplicitno navedeni, ali isključuju elemente koji se nalaze u prethodnom stanju tehnike ili koji utiču na osnovnu ili novu karakteristiku pronalaska.

[0032] Antigeni polipeptidi pronalaska su sposobni da štite od CPV. To jest, oni su sposobni da stimulišu imuni odgovor kod životinje. Pod "antigenom" ili "imunogenom" označava se supstanca koja indukuje specifičan imuni odgovor kod životinje domaćina. Antigen može sadržati ceo organizam, ubijen, atenuiran ili živ; podjedinicu ili deo organizma; rekombinantni vektor koji sadrži insert sa imunogenim svojstvima; deo ili fragment DNK sposoban da izazove imuni odgovor nakon prikaza životinji domaćinu; polipeptid, epitop, hapten ili bilo koja njihova kombinacija. Alternativno, imunogen ili antigen može da sadrži toksin ili antitoksin.

[0033] Termin "imunogeni protein, polipeptid ili peptid" kako se ovde koristi uključuje polipeptide koji su imunološki aktivni u smislu da kada se jednom primene na domaćina, on je u stanju da izazove imuni odgovor humoralnog i/ili ćelijskog tipa usmeren protiv proteina. Poželjno je da je proteinski fragment takav da ima suštinski istu imunološku aktivnost kao i ukupni protein. Dakle, proteinski fragment prema pronalasku sadrži ili se u suštini sastoji od ili se sastoji od najmanje jednog epitopa ili antigenske determinante. "Imunogeni" protein ili polipeptid, kako se ovde koristi, uključuje sekvencu pune dužine proteina, njegove analoge ili njihove imunogene fragmente. Pod "imunogenim fragmentom" se podrazumeva fragment proteina koji uključuje jedan ili više epitopa i na taj način izaziva imunološki odgovor opisan gore. Takvi fragmenti se mogu identifikovati korišćenjem bilo kog broja tehnika mapiranja epitopa, dobro poznatih u tehnici. Videti, npr. Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Na primer, linearni epitopi se mogu odrediti npr., istovremenom sintezom velikog broja peptida na čvrstim nosačima, peptida koji odgovaraju delovima proteinskog molekula, i reakcijom peptida sa antitelima dok su peptidi još uvek vezani za nosače. Takve tehnike su poznate u tehnici i opisane u, npr. U.S. Pat. br.

4,708,871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. Slično, konformacioni epitopi se lako identifikuju određivanjem prostorne konformacije aminokiselina kao što je, na primer, rendgenska kristalografija i 2-dimenzionalna nuklearna magnetna rezonanca. Videti, npr., Epitope Mapping Protocols, supra. Postupci posebno primenljivi na proteine T. parva su u potpunosti opisani u PCT/US2004/022605.

[0034] Kao što je diskutovano, pronalazak obuhvata aktivne fragmente i varijante antigenskog polipeptida. Prema tome, termin "imunogeni protein, polipeptid ili peptid" dalje razmatra delecije, adicije i supstitucije sekvenci, sve dok polipeptid funkcioniše da proizvodi imunološki odgovor kako je ovde definisan. Termin "konzervativna varijacija" označava zamenu aminokiselinskog ostatka drugim biološki sličnim ostatkom, ili zamenu nukleotida u sekvenci nukleinske kiseline tako da se kodirani aminokiselinski ostatak ne menja ili je drugi biološki sličan ostatak. U tom pogledu, posebno poželjne supstitucije će generalno biti konzervativne prirode, tj. one supstitucije koje se odvijaju unutar porodice aminokiselina. Na primer, aminokiseline se generalno dele u četiri porodice: (1) kisele - aspartat i glutamat; (2) baznelizin, arginin, histidin; (3) nepolarne - alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; i (4) nenaelektrisane polarne - glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. Fenilalanin, triptofan i tirozin se ponekad klasifikuju kao aromatične aminokiseline. Primeri konzervativnih varijacija uključuju supstituciju jednog hidrofobnog ostatka kao što je izoleucin, valin, leucin ili metionin za drugi hidrofobni ostatak, ili supstituciju jednog polarnog ostatka drugim polarnim ostatkom, kao što je supstitucija arginina za lizin, glutaminske kiseline za asparaginsku kiselinu ili glutamina za asparagin i slično; ili sličnu konzervativnu zamenu aminokiseline sa strukturno srodnom aminokiselinom koja neće imati veći uticaj na biološku aktivnost. Proteini koji imaju suštinski istu aminokiselinsku sekvencu kao referentni molekul, ali poseduju manje aminokiselinske supstitucije koje ne utiču suštinski na imunogenost proteina, stoga su u okviru definicije referentnog polipeptida. Svi polipeptidi proizvedeni ovim modifikacijama su uključeni ovde. Termin "konzervativna varijacija" takođe uključuje upotrebu supstituisane aminokiseline umesto nesupstituisane roditeljske aminokiseline pod uslovom da antitela pripremljena na supstituisanom polipeptidu takođe imunoreaguju sa nesupstituisanim polipeptidom.

[0035] Termin "epitop" se odnosi na mesto na antigenu ili haptenu na koje reaguju specifične B ćelije i/ili T ćelije. Termin se takođe koristi naizmenično sa "antigenom determinantom" ili "antigenim determinantnim mestom". Antitela koja prepoznaju isti epitop mogu se identifikovati jednostavnim imunološkim testom koji pokazuje sposobnost jednog antitela da blokira vezivanje drugog antitela za ciljni antigen.

[0036] "Imunološki odgovor" na kompoziciju ili vakcinu je razvoj u domaćinu ćelijskog i/ili antitelom posredovanog imunog odgovora na kompoziciju ili vakcinu od interesa. Obično „imunološki odgovor“ uključuje, ali nije ograničen na jedan ili više od sledećih efekata: proizvodnju antitela, B ćelija, pomoćnih T ćelija i/ili citotoksičnih T ćelija, usmerenih specifično na antigen ili antigene uključene u kompoziciju ili vakcinu od interesa. Poželjno, domaćin će pokazati ili terapeutski ili zaštitni imunološki odgovor tako da će otpornost na novu infekciju biti poboljšana i/ili smanjena klinička težina bolesti. Takva zaštita će se demonstrirati bilo smanjenjem ili nedostatkom simptoma koje obično pokazuje inficirani domaćin, bržim vremenom oporavka i/ili sniženim virusnim titrom kod inficiranog domaćina.

[0037] Sintetički antigeni su takođe uključeni u definiciju, na primer, poliepitopi, bočni epitopi i drugi rekombinantni ili sintetički izvedeni antigeni. Videti, npr., Bergmann et al., 1993; Bergmann et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998. Imunogeni fragmenti, za potrebe ovog pronalaska, obično će obuhvatati najmanje oko 3 aminokiseline, najmanje oko 5 aminokiselina, najmanje oko 10-15 aminokiselina ili oko 15-25 aminokiselina ili više aminokiselina u molekulu. Ne postoji kritična gornja granica za dužinu fragmenta, koji bi mogao da obuhvata skoro punu dužinu proteinske sekvence, ili čak fuzioni protein koji sadrži najmanje jedan epitop proteina.

[0038] Shodno tome, minimalna struktura polinukleotida koji eksprimira epitop je ta da se sastoji ili se suštinski sastoji od nukleotida koji kodiraju epitop ili antigensku determinantu CPV polipeptida. Polinukleotid koji kodira fragment CPV polipeptida može sadržati ili se u suštini sastojati od ili se sastojati od najmanje 15 nukleotida, oko 30-45 nukleotida, oko 45-75, ili najmanje 57, 87 ili 150 uzastopnih ili susednih nukleotida koji kodiraju polipeptid. Postupci određivanja epitopa, kao što je stvaranje preklapajućih peptidnih biblioteka (Hemmer et al., 1998), pepskena (Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1985; Van der Zee R. et al., 1989; Geysen, 1990; Multipin. RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) i algoritama (De Groot et al., 1999; PCT/US2004/022605) može se koristiti u praksi pronalaska.

[0039] Termin "nukleinska kiselina" i "polinukleotid" se odnose na RNK ili DNK koja je linearna ili razgranata, jednolančana ili dvolančana, ili njihov hibrid. Termin takođe obuhvata RNK/DNK hibride. Slede neograničavajući primeri polinukleotida: gen ili fragment gena, egzoni, introni, iRNK, tRNK, rRNK, ribozimi, cDNK, rekombinantni polinukleotidi, razgranati polinukleotidi, plazmidi, vektori, izolovana DNK bilo koje sekvence, izolovana RNK bilo koje sekvence, nukleinske kiseline i prajmeri. Polinukleotid može da sadrži modifikovane nukleotide, kao što su metilovani nukleotidi i analozi nukleotida, uracil, druge šećere i vezujuće grupe kao što su fluororiboza i tiolat, i nukleotidne grane. Sekvenca nukleotida može biti dalje modifikovana nakon polimerizacije, kao što je konjugacija, sa komponentom za obeležavanje. Druge vrste modifikacija uključene u ovu definiciju su kapice, supstitucija jednog ili više prirodnih nukleotida sa analogom, i uvođenje sredstava za vezivanje polinukleotida za proteine, metalne jone, komponente za obeležavanje, druge polinukleotide ili čvrstu podlogu. Polinukleotidi se mogu dobiti hemijskom sintezom ili su izvedeni iz mikroorganizma.

[0040] Termin "gen" se široko koristi za označavanje bilo kog segmenta polinukleotida koji je povezan sa biološkom funkcijom. Dakle, geni uključuju introne i egzone kao u genomskoj sekvenci, ili samo kodirajuće sekvence kao u cDNK i/ili regulatorne sekvence potrebne za njihovu ekspresiju. Na primer, gen se takođe odnosi na fragment nukleinske kiseline koji eksprimira iRNK ili funkcionalnu RNK, ili kodira određeni protein, i koji uključuje regulatorne sekvence.

[0041] Otkriće dalje sadrži komplementarni lanac polinukleotidu koji kodira CPV antigen, epitop ili imunogen. Komplementarni lanac može biti polimeran i bilo koje dužine i može sadržati deoksiribonukleotide, ribonukleotide i analoge u bilo kojoj kombinaciji.

[0042] Termin "protein", "peptid", "polipeptid" i "polipeptidni fragment" se ovde koriste naizmenično da se odnose na polimere aminokiselinskih ostataka bilo koje dužine. Polimer može biti linearan ili razgranat, može da sadrži modifikovane aminokiseline ili analoge aminokiselina i može biti prekinut hemijskim grupama koje nisu aminokiseline. Termini takođe obuhvataju polimer aminokiseline koji je modifikovan prirodnim putem ili intervencijom; na primer formiranje disulfidne veze, glikozilacija, lipidacija, acetilacija, fosforilacija, ili bilo koja druga manipulacija ili modifikacija, kao što je konjugacija sa obeležavanjem ili bioaktivnom komponentom.

[0043] „Izolovana“ biološka komponenta (kao što je nukleinska kiselina ili protein ili organela) se odnosi na komponentu koja je suštinski odvojena ili prečišćena od drugih bioloških komponenti u ćeliji organizma u kojoj se komponenta prirodno javlja, na primer, druge hromozomske i ekstrahromozomske DNK i RNK, proteini i organele. Nukleinske kiseline i proteini koji su "izolovani" uključuju nukleinske kiseline i proteine prečišćene standardnim postupcima prečišćavanja. Termin takođe obuhvata nukleinske kiseline i proteine pripremljene rekombinantnom tehnologijom, kao i hemijsku sintezu.

[0044] Termin "prečišćen" kako se ovde koristi ne zahteva apsolutnu čistoću; nego je zamišljen kao relativan pojam. Tako, na primer, prečišćeni polipeptidni preparat je onaj u kome je polipeptid više obogaćen nego što je polipeptid u svom prirodnom okruženju. To znači da je polipeptid odvojen od ćelijskih komponenti. Pod "značajno prečišćenim" podrazumeva se da tako da polipeptid predstavlja nekoliko primera izvođenja najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% ili više od ćelijskih komponenti ili materijala su uklonjeni. Slično, polipeptid može biti delimično prečišćen. Pod "delimično prečišćenim" se podrazumeva da se ukloni manje od 60% ćelijskih komponenti ili materijala. Isto važi i za polinukleotide. Polipeptidi koji su ovde otkriveni mogu se prečistiti na bilo koji od načina poznatih u tehnici.

[0045] Kao što je gore navedeno, antigeni polipeptidi ili njihovi fragmenti ili varijante su CPV antigeni polipeptidi koji su proizvedeni ekspresionim vektorom bakulovirusa u ćelijama insekata. Fragmenti i varijante otkrivenih polinukleotida i polipeptida koji su time kodirani takođe su obuhvaćeni ovim pronalaskom. Pod "fragmentom" se podrazumeva deo polinukleotida ili deo antigenske aminokiselinske sekvence koja je njime kodirana. Fragmenti polinukleotida mogu kodirati fragmente proteina koji zadržavaju biološku aktivnost prirodnog proteina i stoga imaju imunogenu aktivnost kao što je navedeno na drugom mestu. Fragmenti polipeptidne sekvence zadržavaju sposobnost da indukuju zaštitni imuni odgovor kod životinje.

[0046] "Varijante" su namenjene da označavaju suštinski slične sekvence. Za polinukleotide, varijanta sadrži deleciju i/ili adiciju jednog ili više nukleotida na jednom ili više mesta unutar prirodnog polinukleotida i/ili supstituciju jednog ili više nukleotida na jednom ili više mesta u prirodnom polinukleotidu. Kako se ovde koristi, "nativni" polinukleotid ili polipeptid sadrži prirodnu nukleotidnu sekvencu ili sekvencu aminokiselina, respektivno. Varijante određenog polinukleotida pronalaska (tj. referentnog polinukleotida) se takođe mogu proceniti poređenjem procenta identičnosti sekvence između polipeptida kodiranog varijantnim polinukleotidom i polipeptida kodiranog referentnim polinukleotidom. „Varijantni“ protein je namenjen da označava protein izveden iz prirodnog proteina delecijom ili adicijom jedne ili više aminokiselina na jednom ili više mesta u prirodnom proteinu i/ili supstitucijom jedne ili više aminokiselina na jednom ili više mesta u nativnom proteinu. Varijantni proteini obuhvaćeni ovim pronalaskom su biološki aktivni, odnosno imaju sposobnost da izazovu imuni odgovor.

[0047] U jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje CPV polipeptide iz CPV izolata. U sledećem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 8-10, i njegovu varijantu ili fragment.

[0048] U sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na CPV prazne kapside ili CPV VLP (čestice slične virusu). Kapsidi mogu da sadrže, da se sastoje u suštini od, ili da se sastoje od CPV VP2 polipeptida, ili varijanti, uključujući njihove skraćene verzije.

[0049] Pored toga, homolozi CPV polipeptida treba da budu u okviru ovog pronalaska. Kako se ovde koristi, termin "homologi" uključuje ortologe, analoge i paraloge. Termin "analozi" se odnosi na dva polinukleotida ili polipeptida koji imaju istu ili sličnu funkciju, ali koji su evoluirali odvojeno u nepovezanim organizmima. Termin "ortolozi" se odnosi na dva polinukleotida ili polipeptida iz različitih vrsta, ali koji su evoluirali od zajedničkog gena predaka specijacijom. Normalno, ortolozi kodiraju polipeptide koji imaju iste ili slične funkcije. Termin "paralog" se odnosi na dva polinukleotida ili polipeptida koji su povezani dupliranjem unutar genoma. Paralozi obično imaju različite funkcije, ali ove funkcije mogu biti povezane. Analozi, ortolozi i paralozi CPV polipeptida divljeg tipa mogu se razlikovati od CPV polipeptida divljeg tipa po post-translacionim modifikacijama, po razlikama u sekvenci aminokiselina ili po oba. Posebno, homolozi ovog otkrića će generalno pokazivati najmanje 80-85%, 85-90%, 90-95%, ili 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnost sekvence, sa celim ili delom CPV polinukleotidne sekvence divljeg tipa, i pokazaće sličnu funkciju. Varijante uključuju alelne varijante. Termin "alelna varijanta" odnosi se na polinukleotid ili polipeptid koji sadrži polimorfizme koji dovode do promena u aminokiselinskim sekvencama proteina i koji postoje u prirodnoj populaciji (npr. vrsta ili sorta virusa). Takve prirodne alelne varijacije mogu tipično da dovedu do varijanse od 1-5% u polinukleotidu ili polipeptidu. Alelne varijante se mogu identifikovati sekvenciranjem sekvence nukleinske kiseline od interesa u nizu različitih vrsta, što se može lako izvesti korišćenjem hibridizacionih proba za identifikaciju istog genetskog lokusa gena u tim vrstama. Bilo koja i sve takve varijacije nukleinske kiseline i rezultujući polimorfizmi aminokiselina ili varijacije koje su rezultat prirodnih alelnih varijacija i koje ne menjaju funkcionalnu aktivnost gena od interesa, treba da budu unutar obima otkrivanja.

[0050] Kako se ovde koristi, termin "derivat" ili "varijanta" se odnosi na polipeptid, ili nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid, koji ima jednu ili više konzervativnih varijacija aminokiselina ili drugih manjih modifikacija tako da (1) odgovarajući polipeptid ima suštinski ekvivalentnu funkciju u poređenju sa polipeptidom divljeg tipa ili (2) antitelo pripremljeno protiv polipeptida je imunoreaktivno sa polipeptidom divljeg tipa. Ove varijante ili derivati uključuju polipeptide koji imaju manje modifikacije primarnih aminokiselinskih sekvenci CPV polipeptida koje mogu da dovedu do peptida koji imaju suštinski ekvivalentnu aktivnost u poređenju sa nemodifikovanim ekvivalentnim polipeptidom. Takve modifikacije mogu biti namerne, kao putem mutageneze usmerene na mesto, ili mogu biti spontane. Termin "varijanta" dalje razmatra delecije, adicije i supstitucije sekvenci, sve dok polipeptid funkcioniše da proizvodi imunološki odgovor kako je ovde definisan.

[0051] Termin "konzervativna varijacija" označava zamenu aminokiselinskog ostatka drugim biološki sličnim ostatkom, ili zamenu nukleotida u sekvenci nukleinske kiseline tako da se kodirani aminokiselinski ostatak ne menja ili je drugi biološki sličan ostatak. U tom smislu, posebno poželjne supstitucije će generalno biti konzervativne prirode, kao što je gore opisano.

[0052] Polinukleotidi pronalaska uključuju sekvence koje su degenerisane kao rezultat genetskog koda, npr. upotreba optimizovanog kodona za specifičnog domaćina. Kako se ovde koristi, "optimizovani" se odnosi na polinukleotid koji je genetski modifikovan da poveća svoju ekspresiju u datoj vrsti. Da bi se obezbedili optimizovani polinukleotidi koji kodiraju CPV polipeptide, DNK sekvenca gena CPV proteina može biti modifikovana na 1) da sadrži kodone koje preferiraju visoko eksprimirani geni u određenoj vrsti; 2) sadrže A+T ili G+C sadržaj u sastavu nukleotidne baze u odnosu na sadržaj koji se suštinski nalazi u pomenutim vrstama; 3) formiraju inicijacionu sekvencu navedenih vrsta; ili 4) eliminišu sekvence koje izazivaju destabilizaciju, neodgovarajuću poliadenilaciju, degradaciju i terminaciju RNK, ili koje formiraju ukosnice sekundarne strukture ili mesta spajanja RNK. Povećana ekspresija CPV proteina kod navedenih vrsta može se postići korišćenjem učestalosti raspodele upotrebe kodona kod eukariota i prokariota, ili kod određene vrste. Termin "učestalost upotrebe poželjnog kodona" odnosi se na preferenciju koju pokazuje specifična ćelija domaćin u upotrebi nukleotidnih kodona za specifikaciju date aminokiseline. Postoji 20 prirodnih aminokiselina, od kojih je većina određena sa više od jednog kodona. Prema tome, sve degenerisane nukleotidne sekvence su uključene u otkriće sve dok je aminokiselinska sekvenca CPV polipeptida kodirana nukleotidnom sekvencom funkcionalno nepromenjena.

[0053] Identičnost sekvence između dve aminokiselinske sekvence može da se utvrdi pomoću NCBI (Nacionalnog centra za informacije o biotehnologiji) u paru i matrice blosum62, koristeći standardne parametre (pogledajte, na primer, BLAST ili BLASTX algoritam dostupan na "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, Md., USA) serveru, kao i u Altschul et al.; i na taj način, ovaj dokument govori o korišćenju algoritma ili BLAST ili BLASTX i BLOSUM62 matrice pod terminom „blastovi“).

[0054] „Identičnost“ u odnosu na sekvence može se odnositi na broj pozicija sa identičnim nukleotidima ili aminokiselinama podeljen brojem nukleotida ili aminokiselina u kraćoj od dve sekvence pri čemu se poravnanje dve sekvence može odrediti u skladu sa Wilbur i Lipmanovog algoritma (Wilbur i Lipman), na primer, korišćenjem veličine prozora od 20 nukleotida, dužine reči od 4 nukleotida i kazne razmaka od 4, i kompjuterski potpomognute analize i interpretacije podataka o sekvenci uključujući poravnanje mogu biti pogodno izvoditi pomoću komercijalno dostupnih programa (npr. Intelligenetics<™>Suite, Intelligenetics Inc. CA). Kada se kaže da su sekvence RNK slične, ili da imaju stepen identičnosti sekvence ili homologije sa sekvencama DNK, timidin (T) u DNK sekvenci se smatra jednakim uracilu (U) u sekvenci RNK. Prema tome, RNK sekvence su u okviru pronalaska i mogu biti izvedene iz DNK sekvenci, tako što se timidin (T) u DNK sekvenci smatra jednakim uracilu (U) u RNK sekvencama.

[0055] Identičnost sekvence ili sličnost sekvence dve aminokiselinske sekvence, ili identičnost sekvence između dve nukleotidne sekvence može se odrediti korišćenjem softverskog paketa Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).

[0056] Sledeći dokumenti daju algoritme za poređenje relativne identičnosti ili homologije sekvenci, a dodatno ili alternativno u odnosu na prethodno, učenja u ovim referencama mogu se koristiti za određivanje procenta homologije ili identičnosti: Needleman SB and Wunsch CD; Smith TF and Waterman MS; Smith TF, Waterman MS and Sadler JR; Feng DF and Dolittle RF; Higgins DG and Sharp PM; Thompson JD, Higgins DG and Gibson TJ; i Devereux J, Haeberlie P and Smithies O. I, bez nepotrebnog eksperimentisanja, vešt stručnjak može da se konsultuje sa mnogim drugim programima ili referencama za određivanje procenta homologije.

[0057] Reakcije hibridizacije se mogu izvoditi u uslovima različite "strogosti". Uslovi koji povećavaju strogost reakcije hibridizacije su dobro poznati. Vidi na primer, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989).

[0058] Otkriće dalje obuhvata CPV polinukleotide sadržane u vektorskom molekulu ili ekspresionom vektoru i operativno povezane sa promotorskim elementom i izborno sa pojačivačem.

[0059] "Vektor" se odnosi na rekombinantni DNK ili RNK plazmid ili virus koji sadrži heterologni polinukleotid koji se isporučuje u ciljnu ćeliju, bilo in vitro ili in vivo. Heterologni polinukleotid može da sadrži sekvencu od interesa za svrhe prevencije ili terapije, i može izborno biti u obliku ekspresione kasete. Kako se ovde koristi, vektor ne mora biti sposoban za replikaciju u krajnjoj ciljnoj ćeliji ili subjektu. Termin uključuje vektore za kloniranje i virusne vektore.

[0060] Termin "rekombinantni" označava polinukleotid polusintetičkog ili sintetičkog porekla koji se ili ne pojavljuje u prirodi ili je vezan za drugi polinukleotid u rasporedu koji se ne nalazi u prirodi.

[0061] „Heterolog“ znači izveden iz genetski različitog entiteta od ostatka entiteta sa kojim se poredi. Na primer, polinukleotid se može postaviti tehnikama genetskog inženjeringa u plazmid ili vektor dobijen iz drugog izvora, i predstavlja heterologni polinukleotid. Promotor koji je uklonjen iz njegove nativne kodirajuće sekvence i operativno vezan za kodirajuću sekvencu koja nije nativna sekvenca je heterologni promotor.

[0062] Ovaj pronalazak se odnosi na vakcine za ovce, goveda, koze i svinje ili na farmaceutske ili imunološke kompozicije koje mogu sadržati efikasnu količinu rekombinantnih CPV antigena i farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, pomoćno sredstvo, ekscipijens ili vehikulum.

[0063] Predmet koji je ovde opisan je delimično usmeren na kompozicije i postupke koji se odnose na CPV antigen pripremljen u sistemu ekspresije bakulovirusa/ćelija insekata koji je bio visoko imunogen i štitio životinje od izazivanja homolognih i heterolognih CPV sojeva.

Kompozicije

[0064] Ovaj pronalazak se odnosi na CPV vakcinu ili kompoziciju koja može da sadrži efikasnu količinu rekombinantnog CPV antigena i farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, ekscipijens ili vehikulum. U jednom primeru izvođenja, rekombinantni CPV antigen se eksprimira ekspresionim vektorom bakulovirusa u ćelijama insekata.

[0065] Ovde je opisana vakcina ili kompozicija koja sadrži CPV prazne kapside ili CPV VLP (čestice slične virusu). CPV prazni kapsidi ili CPV VLP (čestice slične virusu) se dobijaju ekspresijom CPV kapsidnog proteina.

[0066] Ovo otkriće se takođe odnosi na postupke za pripremu ovih vakcina, upotrebu antigena za proizvodnju ovih vakcina i postupke vakcinacije koje ih koriste.

[0067] Ovde su opisane nukleotidne sekvence, posebno cDNK, i sekvence aminokiselina, modifikovane u poređenju sa prirodnim sekvencama virusa. Otkriće se takođe odnosi na proizvode ekspresije modifikovanih nukleotidnih sekvenci i na CPV antigene i virus koji uključuju ove modifikacije.

[0068] Ovo otkriće se odnosi na bilo koji CPV polipeptid, antigen, epitop ili imunogen koji izaziva imunogeni odgovor kod životinje, kao što su ovce, goveda, koze ili svinje. CPV polipeptid, antigen, epitop ili imunogen može biti bilo koji CPV polipeptid, antigen, epitop ili imunogen, kao što je, ali bez ograničenja, protein, peptid ili njegov fragment, koji izaziva, indukuje ili stimuliše odgovor kod životinje, kao što je pas.

[0069] U primeru izvođenja u kome CPV imunološka kompozicija ili vakcina je rekombinantna imunološka kompozicija ili vakcina, kompozicija ili vakcina koja sadrži rekombinantni vektor i ne sadrži ađuvans, i može izborno da sadrži farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv ekscipijens, nosač ili vehikulum; rekombinantni vektor je vektor ekspresije bakulovirusa koji može da sadrži polinukleotid koji kodira CPV polipeptid, antigen, epitop ili imunogen. CPV polipeptid, antigen, epitop ili imunogen, može biti kapsidni protein i bilo koji njegov fragment.

[0070] Kao što je ovde opisan, molekul nukleinske kiseline koji kodira jedan ili više CPV antigena je cDNK koja kodira CPV kapsidni protein. Kao što je dalje opisano ovde, molekul nukleinske kiseline koji kodira jedan ili više CPV antigena je cDNK koja kodira fragment CPV kapsidnog proteina.

[0071] Kao što je ovde opisano, CPV antigen može biti izveden iz CPV soja 100869-1.

[0072] Ovaj pronalazak se odnosi na CPV kompoziciju ili vakcinu koja može da sadrži efikasnu količinu rekombinantnog CPV antigena. CPV kompozicija ili vakcina ne sadrži pomoćno sredstvo. CPV kompozicija ili vakcina mogu izborno da sadrže farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, ekscipijens ili vehikulum.

[0073] Ovde su opisani CPV polinukleotidi sadržani u vektorskom molekulu ili ekspresionom vektoru i operativno povezani sa promotorskim elementom i izborno sa pojačivačem.

[0074] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje CPV polipeptide koji imaju sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 ili 8-10, i njihove varijante ili fragmente.

[0075] U sledećem aspektu, otkrivanje obezbeđuje polipeptid koji ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa antigenskim polipeptidom pronalaska, posebno sa polipeptidima koji imaju sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 ili 8-10.

[0076] U sledećem aspektu, otkrivanje obezbeđuje fragmente i varijante CPV polipeptida identifikovanih gore (SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 ili 8-10) koje može lako da pripremi neko od stručnjaka u ovoj oblasti koristeći dobro-poznate tehnike molekularne biologije.

[0077] Varijante su homologni polipeptidi koji imaju sekvencu aminokiselina najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu sa sekvencom aminokiselina kako je navedena u SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 ili 8-10.

[0078] Imunogeni fragment CPV polipeptida uključuje najmanje 8, 10, 15 ili 20 uzastopnih aminokiselina, najmanje 21 aminokiselinu, najmanje 23 aminokiseline, najmanje 25 aminokiselina ili najmanje 30 aminokiselina CPV polipeptida koji imaju sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 ili 8-10, ili njihove varijante. Kao što je ovde opisano, fragment CPV polipeptida uključuje specifični antigeni epitop koji se nalazi na CPV polipeptidu pune dužine. Međutim, stručnjak će razumeti da dovoljan deo CPV polipeptida mora biti prisutan da bi se omogućilo formiranje CPV VLP.

[0079] U sledećem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji kodira CPV polipeptid, kao što je polinukleotid koji kodira polipeptid koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 ili 8-10. U sledećem aspektu, ovo otkriće obezbeđuje polinukleotid koji kodira polipeptid koji ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, 96%, 97% , 98% ili 99% identičnosti sekvence sa polipeptidom koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, ili 8-10, ili konzervativnu varijantu, alelnu varijantu, homolog ili imunogeni fragment koji sadrži najmanje osam ili najmanje deset uzastopnih aminokiselina jednog od ovih polipeptida, ili kombinaciju ovih polipeptida.

[0080] U sledećem aspektu, ovo otkriće obezbeđuje polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 2, 5, 7, 11 ili 12, ili njegove varijante. U sledećem aspektu, ovo otkriće obezbeđuje polinukleotid koji ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa jednim od polinukleotida koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 2, 5, 7, 11 ili 12, ili njegovu varijantu.

[0081] Polinukleotidi pronalaska mogu da sadrže dodatne sekvence, kao što su dodatne sekvence kodiranja unutar iste transkripcione jedinice, kontrolne elemente kao što su promotori, mesta vezivanja ribozoma, 5'UTR, 3'UTR, terminatori transkripcije, mesta poliadenilacije, dodatne transkripcione jedinice pod kontrolom istog ili različitog promotora, sekvence koje dozvoljavaju kloniranje, ekspresiju, homolognu rekombinaciju i transformaciju ćelije domaćina, i bilo koji takav konstrukt koji može biti poželjan za obezbeđivanje primera izvođenja ovog pronalaska.

[0082] Elementi za ekspresiju CPV polipeptida, antigena, epitopa ili imunogena su povoljno prisutni u inventivnom vektoru. Na minimalan način, ovo se sastoji, u suštini se sastoji od, ili se sastoji od inicijacionog kodona (ATG), stop kodona i promotora, i izborno takođe poliadenilacione sekvence za određene vektore kao što su plazmid i određeni virusni vektori, npr. virusni vektori osim poksvirusa. Kada polinukleotid kodira fragment poliproteina, npr. CPV peptid, poželjno, u vektoru, ATG je postavljen na 5' okvira čitanja, a stop kodon je postavljen na 3'. Mogu biti prisutni i drugi elementi za kontrolu ekspresije, kao što su pojačivačke sekvence, stabilizacijske sekvence, kao što su intron i signalne sekvence koje dozvoljavaju izlučivanje proteina.

[0083] Otkriće se takođe odnosi na preparate koji sadrže vektore, kao što su ekspresioni vektori, npr., terapeutske kompozicije. Preparati mogu da sadrže jedan ili više vektora, npr. ekspresionih vektora, kao što su in vivo ekspresioni vektori, koji sadrže i eksprimiraju jedan ili više CPV polipeptida, antigena, epitopa ili imunogena. Kao što je ovde opisano, vektor sadrži i eksprimira polinukleotid koji sadrži, sastoji se u suštini od, ili se sastoji od polinukleotida koji kodira (i poželjno eksprimira) CPV antigen, epitop ili imunogen, u farmaceutski ili veterinarski prihvatljivom nosaču, ekscipijensu ili vehikulumu. Prema tome, prema pronalasku, drugi vektor ili vektori u preparatu sadrže, u suštini se sastoje ili se sastoje od polinukleotida koji kodira, i pod odgovarajućim okolnostima vektora koji eksprimira jedan ili više drugih proteina CPV polipeptida, antigena, epitopa ili imunogena, ili njegovog fragmenta.

[0084] Kao što je ovde opisano, vektor ili vektori u preparatu sadrže, ili se u suštini sastoje od, ili se sastoje od polinukleotida (jednog ili više) koji kodiraju jedan ili više proteina ili njihovog fragmenta (njihovih fragmenata) CPV polipeptida, antigena, epitopa ili imunogena, jednog vektora ili više vektora koji eksprimiraju polinukleotid(e). Kao što je ovde dodatno opisano, preparat sadrži jedan, dva ili više vektora koji sadrže polinukleotide koji kodiraju i eksprimiraju, poželjno in vivo, CPV polipeptid, antigen, fuzioni protein ili njegov epitop.

[0085] Kao što je ovde opisan, ekspresioni vektor je plazmidni vektor ili DNK plazmidni vektor, posebno in vivo vektor ekspresije. U specifičnom, neograničavajućem primeru, plazmid pVR1020 ili 1012 (VICAL Inc.; Luke et al., 1997; Hartikka et al., 1996, videti, npr. U.S. Patente br. 5,846,946 i 6,451,769) može da se koristi kao vektor za inserciju polinukleotidne sekvence. PVR1020 plazmid je poreklom od pVR1012 i sadrži humanu tPA signalnu sekvencu. U jednom aspektu humani tPA signal sadrži od aminokiseline M(1) do aminokiseline S(23) u Genbank pod pristupnim brojem HUMTPA14. U drugom specifičnom, neograničavajućem primeru, plazmid koji se koristi kao vektor za inserciju polinukleotidne sekvence može sadržati signalnu peptidnu sekvencu konjskog IGF1 od aminokiseline M(24) do aminokiseline A(48) u Genbank pod pristupnim brojem U28070. Dodatne informacije o DNK plazmidima koje se mogu konsultovati ili koristiti u praksi nalaze se, na primer, u U.S. Patentima br. 6,852,705; 6,818,628; 6,586,412; 6,576,243; 6,558,674; 6,464,984; 6,451,770; 6,376,473 i 6,221,362.

[0086] Termin plazmid obuhvata bilo koju jedinicu za transkripciju DNK koja sadrži polinukleotid prema pronalasku i elemente neophodne za njegovu u vivo ekspresiju u ćeliji ili ćelijama željenog domaćina ili ciljnog mesta; i, s tim u vezi, primećuje se da su supernamotani ili nesupernamotani, kružni plazmid, kao i linearni oblik, predviđeni da budu unutar obima pronalaska.

[0087] Svaki plazmid sadrži ili obuhvata ili se u suštini sastoji od, pored polinukleotida koji kodira CPV antigen, epitopa ili imunogena, izborno fuzionisanog sa heterolognom peptidnom sekvencom, varijantom, analogom ili fragmentom, operativno vezan za promotor ili pod kontrolom promotora ili zavisi od promotora. Generalno, korisno je koristiti snažan promotor koji funkcioniše u eukariotskim ćelijama. Snažni promotor može biti, ali ne ograničavajući se na, neposredni rani promotor citomegalovirusa (CMV-IE) humanog ili mišjeg porekla, ili izborno drugog porekla kao što je pacov ili zamorac, Super promotor (Ni, M. et al., Plant J.7, 661-676, 1995.). CMV-IE promotor može da sadrži stvarni deo promotera, koji može, ali ne mora biti povezan sa delom pojačivača. Moguće je upućivati na EP-A-260148, EP-A-323597, U.S. Patente br. 5,168,062, 5,385,839, i 4,968,615, kao i na publikaciju br. WO87/03905. CMV-IE promotor je pogodno humani CMV-IE (Boshart et al., 1985) ili mišji CMV-IE.

[0088] U opštijim rečima, promotor ima virusno, biljno ili ćelijsko poreklo. Snažan virusni promotor osim CMV-IE koji može biti korisno korišćen u izvođenju pronalaska je rani/kasni promotor SV40 virusa ili LTR promotor Rous sarkoma virusa. Snažan ćelijski promotor koji može biti korisno korišćen u izvođenju pronalaska je promotor gena citoskeleta, kao što je npr. promotor desmina (Kwissa et al., 2000), ili promotor aktina (Miyazaki et al., 1989).

[0089] Plazmidi mogu da sadrže druge elemente kontrole ekspresije. Posebno je korisno ugraditi stabilizirajuću sekvencu(e), npr. sekvencu(e) introna, na primer, introna kukuruzne alkohol dehidrogenaze (Callis et al. Genes & Dev.1(10):1183-1200, dec.1987), prvog introna hCMV-IE (publikacija br. WO1989/01036), introna II zečjeg β-globinskog gena (van Ooyen et al., 1979). Kao što je ovde opisano, plazmidi mogu sadržati 3' UTR.3' UTR može biti, ali nije ograničeno na, agrobacterium nopalin sintaza (Nos) 3' UTR (Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Depicker, A. et al. J. Mol. Appl. Genet., 1982; Bevan, NAR, 1984, 12(22): 8711-8721).

[0090] Što se tiče signala poliadenilacije (poliA) za plazmide i virusne vektore osim poksvirusa, može se više koristiti poli(A) signal gena goveđeg hormona rasta (bGH) (videti U.S.5,122,458), ili poli(A) signal gena zečjeg β-globina ili poli(A) signal virusa SV40.

[0091] "Ćelija domaćin" označava prokariotsku ili eukariotsku ćeliju koja je genetski izmenjena, ili je sposobna da bude genetski izmenjena primenom egzogenog polinukleotida, kao što je rekombinantni plazmid ili vektor. Kada se odnosi na genetski izmenjene ćelije, termin se odnosi i na prvobitno izmenjenu ćeliju i na njeno potomstvo.

[0092] U jednom primeru izvođenja, rekombinantni CPV antigen je eksprimiran u ćelijama insekata.

[0093] U jednom posebnom primeru izvođenja, CPV antigen je eksprimiran u SF9 ćelijama.

Postupci upotrebe

[0094] U jednom primeru izvođenja, predmet koji je ovde otkriven je usmeren na postupak vakcinacije ovaca, goveda, koza ili svinja koji sadrži primenu na ovce, goveda, koze ili svinje efikasne količine vakcine koja može da sadrži efikasnu količinu rekombinantnog CPV antigena i farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, ekscipijens ili vehikulum.

[0095] U jednom primeru izvođenja predmetnog otkrića, postupak sadrži jednu primenu kompozicije vakcine formulisane sa emulzijom prema pronalasku. Na primer, kao što je ovde opisana, imunološka kompozicija ili kompozicija vakcine sadrži CPV antigene eksprimirane bakulovirusom, uključujući polipeptide i VLP (čestice slične virusu) ili prazne kapside. Elektronska mikroskopija ukazuje da ćelije insekata transformisane ekspresionim vektorima bakulovirusa proizvode CPV VLP ili CPV prazne kapside, i tako imunološke ili kompozicije vakcine prema ovom pronalasku obuhvataju one koje sadrže CPV VLP ili CPV prazne kapside.

[0096] U jednom primeru izvođenja, predmet koji je ovde otkriven je usmeren na postupak vakcinacije ovaca, goveda, koza ili svinja koji sadrži primenu na ovce, goveda, koze ili svinje CPV antigena koji proizvodi bakulovirusni vektor u ćelijama insekata.

[0097] U jednom primeru izvođenja, predmet koji je ovde otkriven je usmeren na postupak izazivanja imunog odgovora koji sadrži primenu na ovace, goveda, koze ili svinje vakcine koja sadrži CPV antigen koji proizvodi bakulovirusni vektor u ćelijama insekata.

[0098] Kao što je ovde opisan, predmet koji je ovde otkriven je usmeren na postupak pripreme vakcine ili kompozicije koja sadrži izolovanje CPV antigena proizvedenog bakulovirusnim vektorom u ćelijama insekata i izborno kombinovanje sa farmaceutski ili veterinarski prihvatljivim nosačem, ekscipijensom ili vehikulumom.

[0099] I homologni i heterologni CPV sojevi se koriste za izazivanje imunog odgovora da bi se testirala efikasnost vakcine. Primena može biti subkutana ili intramuskularna. Primena može biti bez igle (na primer, Bioject).

[0100] U jednom primeru izvođenja pronalaska, može se primeniti režim prajm-busta, koji se sastoji od najmanje jedne primarne primene i najmanje jedne buster primene korišćenjem najmanje jednog zajedničkog polipeptida, antigena, epitopa ili imunogena. Tipično, imunološka kompozicija ili vakcina koja se koristi u primarnoj primeni je drugačija po prirodi od onih koja se koriste kao buster. Međutim, primećuje se da se ista kompozicija može koristiti kao primarna primena i buster. Ovaj protokol primene se naziva "prajm-bust".

[0101] Prajm-bust prema ovom pronalasku može uključiti rekombinantni virusni vektor koji se koristi za ekspresiju sekvence koja kodira CPV ili njenih fragmenata koji kodiraju antigenski polipeptid ili njegov fragment ili varijantu. Posebno, virusni vektor može da eksprimira CPV gen ili njegov fragment koji kodira antigenski polipeptid. Virusni vektor koji je ovde razmatran uključuje, ali nije ograničen na, virus boginja [npr. virus vakcinije ili atenuirani virus vakcinije, avipoks virus ili atenuirani virus avipoksa (npr. kanarinske boginje, boginje živine, boginje golubice, boginje golubova, boginje prepelice, ALVAC; TOVAC; videti US 5,505,941, US 5,494,8070), virus boginja rakuna, virus svinjskih boginja, itd.], adenovirus (npr. humani adenovirus, pseći adenovirus), herpesvirus (npr. herpesvirus pasa, herpesvirus ćurki, virus Marek-ove bolesti, virus infektivnog laringotraheitisa, virus herpesheitisa mačaka, virus laringotraheitisa (ILTV), goveđi herpesvirus, svinjski herpesvirus), bakulovirus, retrovirus, itd. U sledećem primeru izvođenja, vektor ekspresije avipoksa može biti vektor boginja kanarinaca, kao što je ALVAC. U sledećem primeru izvođenja, vektor ekspresije avipoksa može biti vektor boginja ptica, kao što je TROVAC. CPV antigen pronalaska koji treba da bude eksprimiran je inseriran pod kontrolom specifičnog promotora poksvirusa, npr., 42K promotora entomopoksvirusa Amsacta moorei (Barcena, Lorenzo et al. 2000), promotora vakcinije 7.5 kDa (Cochran et al., 1985), promotora vakcinije I3L (Riviere et al., 1992), promotora vakcinije HA (Shida, 1986), promotora kravljih boginja ATI (Funahashi et al., 1988), promotora vakcinije H6 (Taylor et al., 1988b; Guo et al., 1989; Perkus et al., 1989), između ostalih.

[0102] U sledećem aspektu prajm-bust protokola prema pronalasku, primenjuje se kompozicija koja sadrži CPV antigen pronalaska praćena primenom vakcine ili kompozicije koja sadrži rekombinantni virusni vektor koji sadrži i eksprimira CPV antigen in vivo, ili inaktivisane virusne vakcine ili kompozicije koja sadrži CPV antigen, ili DNK plazmidne vakcine ili kompozicije koja sadrži ili ekspimira CPV antigen. Slično tome, protokol prajm-bust može da sadrži primenu vakcine ili kompozicije koja sadrži rekombinantni virusni vektor koji sadrži i eksprimira CPV antigen in vivo, ili inaktivisane virusne vakcine ili kompozicije koja sadrži CPV antigen, ili DNK plazmidnu vakcinu ili kompoziciju koja sadrži ili eksprimira CPV antigen, nakon čega sledi primena kompozicije koja sadrži CPV antigen pronalaska. Dalje je primećeno da i primarna i sekundarna primena mogu sadržati kompoziciju koja sadrži CPV antigen pronalaska.

[0103] Protokol prajm-bust sadrži najmanje jednu početnu primenu i najmanje jednu buster primenu koristeći najmanje jedan uobičajeni polipeptid i/ili njegove varijante ili fragmente. Vakcina koja se koristi u prvoj primeni može biti drugačija po prirodi od onih koje se koriste kao kasnija buster vakcina. Primarna primena može da sadrži jednu ili više primena. Slično, buster primena može da sadrži jednu ili više primena

[0104] Zapremina doze kompozicija za ciljne vrste koji su sisari zasnovane na virusnim vektorima, npr. kompozicije zasnovane na vektorima bez boginja virusa, je generalno između oko 0.1 do oko 5.0 ml, između oko 0.1 do oko 3.0 ml i između oko 0.5 ml do oko 2.5 ml.

[0105] Efikasnost vakcina se može testirati oko 2 do 4 nedelje nakon poslednje imunizacije putem izazivanja imunog odgovora kod životinja, kao što su mačke ili psi, sa virulentnim sojem CPV.

[0106] Dodatni detalji o ovim sojevima CPV mogu se naći na veb stranicama Evropske bioinformatičke informacije (EMBL-EBI). Pronalazači smatraju da bi svi sojevi CPV, kako ovde navedeni, tako i oni koji tek treba da budu identifikovani, mogli da se eksprimiraju u skladu sa učenjem ovog otkrića da bi se proizvele, na primer, efikasne kompozicije vakcine. I homologni i heterologni sojevi se koriste za izazivanje imunog odgovora da bi se testirala efikasnost vakcina. Životinja se može izložiti virusu intradermalno, subkutano, sprejom, intranazalno, intraokularno, intratrahealno i/ili oralno.

[0107] Primene prajm-bust mogu se povoljno sprovoditi u razmaku od 1 do 6 nedelja, na primer, u razmaku od oko 4 nedelje. U skladu sa jednim priemrom izvođenja, takođe je predviđen polugodišnji ili godišnji buster, uz povoljno korišćenje vakcine zasnovane na virusnom vektoru. Poželjno je da su životinje stare najmanje 6 do 8 nedelja u vreme prve primene.

[0108] Kompozicije koje sadrže rekombinantne antigene polipeptide pronalaska koji se koriste u protokolima prajm-bust nisu ađuvansi, i mogu izborno biti sadržani u farmaceutski ili veterinarski prihvatljivom nosaču, razblaživaču ili ekscipijensu. Protokoli prema pronalasku štite životinju od CPV i/ili sprečavaju napredovanje bolesti kod inficirane životinje.

[0109] Stručnjak u ovoj oblasti treba da razume da je ovo otkriće obezbeđeno kao primer i da ovaj pronalazak nije ograničen na to. Iz ovog otkrića i znanja u tehnici, verzirani stručnjak može da odredi broj primena, put primene i doze koje će se koristiti za svaki protokol injekcije, bez ikakvog nepotrebnog eksperimentisanja.

[0110] Ovaj pronalazak razmatra najmanje jednu primenu na životinju efikasne količine terapeutske kompozicije pripremljene prema pronalasku. Životinja može biti mužjak, ženka, trudna ženka i novorođenče. Ova primena može biti na različite načine uključujući, ali ne ograničavajući se na, intramuskularnu (IM), intradermalnu (ID) ili subkutanu (SC) injekciju ili putem intranazalne ili oralne primene. Terapeutska kompozicija prema pronalasku se takođe može primeniti aparatom bez igle (kao, na primer, sa Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, GA, USA), Vetjet ili Vitajet aparatom (Bioject, Oregon, USA)). Drugi pristup primeni plazmidnih kompozicija je upotreba elektroporacije (videti, npr. Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; publikacija br. WO99/01158). U sledećem primeru izvođenja, terapeutska kompozicija se isporučuje životinji pomoću genskog pištolja ili bombardovanja zlatnim česticama.

[0111] Kao što je ovde opisano, otkrivanje obezbeđuje primenu terapeutski efikasne količine formulacije za isporuku i ekspresiju CPV antigena ili epitopa u ciljnoj ćeliji. Određivanje terapeutski efikasne količine je rutinsko eksperimentisanje za prosečnog stručnjaka. Kao što je ovde opisano, formulacija sadrži ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid koji eksprimira CPV antigen ili epitop i farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, vehikulum ili ekscipijens. Kao što je dalje opisano ovde, farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, vehikulum ili ekscipijens olakšava transfekciju ili drugi način prenosa polinukleotida na životinju domaćina i/ili poboljšava očuvanje vektora ili proteina u domaćinu.

[0112] Kao što je ovde opisano, predmet otkriven ovde obezbeđuje postupak detekcije za diferencijaciju između inficiranih i vakcinisanih životinja (DIVA).

[0113] Ovde je otkriveno da upotreba vakcine ili kompozicije ovog pronalaska omogućava otkrivanje CPV infekcije kod životinje. Ovde je otkriveno da upotreba vakcine ili kompozicije ovog pronalaska omogućava otkrivanje infekcije kod životinja razlikovanjem između inficiranih i vakcinisanih životinja (DIVA).

Proizvodni artikl

[0114] Predmet koji je ovde otkriven je usmeren na komplet za izvođenje postupka izazivanja ili indukovanja imunog odgovora koji može da sadrži bilo koju od rekombinantnih CPV imunoloških kompozicija ili vakcina, ili inaktiviranih CPV imunoloških kompozicija ili vakcina, rekombinantnih CPV virusnih kompozicija ili vakcina, i uputstva za izvođenje postupka.

[0115] Ovde je opisan komplet za izvođenje postupka indukovanja imunološkog ili zaštitnog odgovora protiv CPV kod životinje koji sadrži kompoziciju ili vakcinu koja sadrži CPV antigen prema pronalasku i rekombinantnu CPV virusnu imunološku kompoziciju ili vakcinu, i uputstva za izvođenje postupka za isporuku u efikasnoj količini za izazivanje imunološkog odgovora kod životinje.

[0116] Ovde je opisan komplet za izvođenje postupka indukovanja imunološkog ili zaštitnog odgovora protiv CPV kod životinje koji sadrži kompoziciju ili vakcinu koja sadrži CPV antigen pronalaska i inaktiviranu CPV imunološku kompoziciju ili vakcinu, i uputstva za izvođenje postupka isporuke u efikasnoj količini za izazivanje imunološkog odgovora kod životinje.

[0117] Još jedan aspekt predmetnog otkrića se odnosi na komplet za prajm-bust vakcinaciju u skladu sa ovim pronalaskom kao što je gore opisano. Komplet može da sadrži najmanje dve bočice: prvu bočicu koja sadrži vakcinu ili kompoziciju za početnu vakcinaciju prema ovom pronalasku i drugu bočicu koja sadrži vakcinu ili kompoziciju za buster vakcinaciju prema ovom pronalasku. Komplet može povoljno da sadrži dodatne prve ili druge bočice za dodatne prajm-vakcinacije ili bust-vakcinacije.

[0118] Ovde je opisana kompozicija koja sadrži CPV antigen ili njegov fragment ili varijantu i farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, ekscipijens ili vehikulum. Dalje je otkrivena gore opisana kompozicija u kojoj CPV antigen ili njegov fragment ili varijanta sadrži imunogeni fragment koji sadrži najmanje 15 aminokiselina CPV antigena. Takođe su otkrivene gornje kompozicije u kojima je CPV antigen ili njegov fragment ili varijanta delimično prečišćen. Takođe su otkrivene gornje kompozicije u kojima je CPV antigen ili njegov fragment ili varijanta suštinski prečišćen.

[0119] Kao što je ovde opisano, opisane su gornje kompozicije u kojima CPV antigen ili njegov fragment ili varijanta je CPV polipeptid. U jednom primeru izvođenja, opisane su gornje kompozicije u kojima CPV polipeptid je kapsidni protein ili njegov fragment. Kao što je ovde opisano, opisane su gornje kompozicije u kojima CPV antigen ili fragment ili varijanta ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa sekvencom koja je navedena u SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 ili 8-10. Kao što je ovde opisano, opisane su gornje kompozicije u kojima je CPV antigen kodiran polinukleotidom koji ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa sekvencom kao što je navedena u SEQ ID NO: 2, 5, 7, 11 ili 12. U sledećoj varijanti, otkriven je postupak vakcinacije životinje osetljive na CPV koji se sastoji od primene gore navedenih kompozicija životinji. U jednom primeru izvođenja, otkriven je postupak vakcinacije životinje podložne na CPV koji sadrži režim prajm-bust. Ovde je opisan suštinski prečišćen antigenski polipeptid eksprimiran u ćelijama insekata, pri čemu polipeptid sadrži: aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa polipeptidom koji ima sekvencu kako je navedena u SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 , ili 8-10. U bilo kom primeru izvođenja, životinja je poželjno mačka ili pas. Kao što je ovde opisan je postupak dijagnostikovanja CPV infekcije kod životinje. Kao što je dalje opisano ovde je otkriven prajm-bust komplet za vakcinaciju koji sadrži najmanje dve bočice, pri čemu prva bočica sadrži kompoziciju ovog pronalaska i druga bočica sadrži kompoziciju za bust-vakcinaciju koja sadrži kompoziciju koja sadrži rekombinantni virusni vektor, ili kompozicija koja sadrži inaktiviranu virusnu kompoziciju, ili kompoziciju DNK plazmida koja sadrži ili eksprimira CPV antigen.

[0120] Farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi nosači ili vehikulumi ili ekscipijensi su dobro poznati stručnjacima. Na primer, farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač ili vehikulum ili ekscipijens može biti 0.9% rastvor NaCl (npr. fiziološki rastvor) ili fosfatni pufer. Drugi farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi nosač ili vehikulum ili ekscipijensi koji se mogu koristiti za postupke ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, poli-(L-glutamat) ili polivinilpirolidon. Farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi nosač ili vehikulum ili ekscipijensi mogu biti bilo koje jedinjenje ili kombinacija jedinjenja koja olakšavaju primenu vektora (ili proteina eksprimiranog iz inventivnog vektora in vitro); poželjno, nosač, vehikulum ili ekscipijens mogu olakšati transfekciju i/ili poboljšati očuvanje vektora (ili proteina). Doze i zapremine doze su ovde diskutovane u opštem opisu i takođe mogu da budu određene od strane kvalifikovanog stručnjaka iz ovog otkrića pročitanog u vezi sa znanjem u tehnici, bez ikakvog nepotrebnog eksperimentisanja.

[0121] Katjonski lipidi koji sadrže kvaternarnu amonijumovu so, koji su pogodni, ali ne isključivo, pogodni za plazmide, poželjno su oni koji imaju sledeću formulu:

pri čemu R1 je zasićeni ili nezasićeni alifatični radikal pravog lanca koji ima 12 do 18 atoma ugljenika, R2 je drugi alifatični radikal koji sadrži 2 ili 3 atoma ugljenika i X je amin ili hidroksilna grupa, npr. the DMRIE. U sledećem primeru izvođenja katjonski lipid može biti povezan sa neutralnim lipidom, npr. DOPE.

[0122] Među ovim katjonskim lipidima, prednost se daje DMRIE (N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloksi)-1-propan amonijumu; WO96/34109), pogodno vezanom sa neutralnim lipidom, pogodno DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanol amin; Behr, 1994), da bi se formirao DMRIE-DOPE.

[0123] Prednost je da se smeša plazmida sa ađuvansom formira istovremeno i poželjno istovremeno sa primenom preparata ili neposredno pre primene preparata; na primer, neposredno pre ili pre primene, smeša plazmida i ađuvansa se formira, poželjno tako da ima dovoljno vremena pre primene da smeša formira kompleks, npr. između oko 10 i oko 60 minuta pre primene, kao što je približno 30 minuta pre primene.

[0124] Kada je DOPE prisutan, molarni odnos DMRIE:DOPE je pogodno oko 95: oko 5 do oko 5: oko 95, još povoljnije oko 1: oko 1, npr.1:1.

[0125] Odnos težine DMRIE ili DMRIE-DOPE ađuvans:plazmid može biti između oko 50: oko 1 i oko 1: oko 10, kao što je oko 10: oko 1 i oko 1: oko 5, i oko 1: oko 1 i oko 1: oko 2, npr.1:1 i 1:2.

[0126] U sledećem primeru izvođenja, farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, ekscipijens, ađuvans ili vehikulum mogu biti emulzija voda u ulju. Primeri pogodnih emulzija voda u ulju uključuju vakcinalne emulzije vode u ulju na bazi ulja koje su stabilne i tečne na 4°C i sadrže: od 6 do 50 v/v% vodene faze koja sadrži antigen, poželjno od 12 do 25 v/v%, od 50 do 94 v/v% uljane faze koja u potpunosti ili delimično sadrži ulje koje se ne metaboliše (npr. mineralno ulje kao što je parafinsko ulje) i/ili ulje koje se može metabolizirati (npr. biljno ulje ili estri masnih kiselina, poliola ili alkohola), od 0.2 do 20 p/v% surfaktanata, poželjno od 3 do 8 p/v%, pri čemu su poslednji navedeni je u celini ili delimično, ili u mešavini bilo estara poliglicerola, pri čemu navedeni poliglicerol estri su poželjno poliglicerol (poli)ricinoleati, ili polioksietilen ricin ulja ili inače hidrogenizovana polioksietilen ricin ulja. Primeri surfaktanata koji se mogu koristiti u emulziji voda u ulju uključuju etoksilovane sorbitan estre (npr. polioksietilen (20) sorbitan monooleat (TWEEN 80<®>), dostupno od AppliChem, Inc., Cheshire, CT) i sorbitan estre (npr. sorbitan monooleat (SPAN 80<®>), dostupno od Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Pored toga, u pogledu emulzije voda u ulju, videti takođe US Patent br.6,919,084, npr., njihov primer 8. U nekim primerima izvođenja, vodena faza koja sadrži antigen sadrži fiziološki rastvor koji sadrži jedan ili više puferskih sredstava. Primer pogodnog rastvora za puferovanje je fiziološki rastvor puferovan fosfatom. U pogodnom primeru izvođenja, emulzija voda u ulju može biti trostruka emulzija voda/ulje/voda (W/O/W) (U.S. Patent br.6,358,500). Primeri drugih pogodnih emulzija su opisani u U.S. Patentu br.7,371,395.

[0127] Imunološke kompozicije i vakcine koje su ovde otkrivene mogu sadržati ili se u suštini sastojati od jednog ili više pomoćnih sredstava. Pogodni ađuvansi za upotrebu u izvođenju ovog pronalaska su (1) polimeri akrilne ili metakrilne kiseline, polimeri anhidrida maleinske kiseline i derivata alkenila, (2) imunostimulirajuće sekvence (ISS), kao što su oligodezoksiribonukleotidne sekvence koje imaju jednu ili više nemetiliranih CpG jedinica (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) emulzija ulje u vodi, kao što je SPT emulzija opisana na strani 147 " Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" published by M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, i opisana emulzija MF59 na strani 183 istog rada, (4) katjonski lipidi koji sadrže kvaternarnu amonijumovu so, npr. DDA (5) citokini, (6) aluminijum hidroksid ili aluminijum fosfat, (7) saponin ili (8) druge pomoćne supstance o kojima se govori u bilo kom citiranom dokumentu, ili (9) bilo koje njihove kombinacije ili smeše.

[0128] Emulzija ulje u vodi (3), koja je posebno pogodna za virusne vektore, može biti zasnovana na: svetlom tečnom parafinskom ulju (tip evropske farmakopeje), izoprenoidnom ulju kao što je skvalan, skvalen, ulje koje nastaje oligomerizacijom alkena, npr. izobuten ili decen, estri kiselina ili alkohola koji imaju alkil grupu pravog lanca, kao što su biljna ulja, etil oleat, propilen glikol, di(kaprilat/kaprat), glicerol tri(kaprilat/kaprat) i propilen glikol dioleat, ili estri razgranatih, masnih alkohola ili kiselina, posebno estri izostearinske kiseline.

[0129] Ulje se koristi u kombinaciji sa emulgatorima za formiranje emulzije. Emulgatori mogu biti nejonski surfaktanti, kao što su: estri s jedne strane sorbitana, manida (npr. anhidromanitol oleat), glicerola, poliglicerola ili propilen glikola, a sa druge strane oleinske, izostearinske, ricinolne ili hidroksistearinske kiseline kao opcija, kao i hidroksistearinske kiseline, pri čemu su navedeni estri izborno etoksilovani ili blokovi kopolimera polioksipropilena-polioksietilena, kao što je Pluronic, npr. L121.

[0130] Među ađuvantnim polimerima tipa (1), prednost se daje polimerima unakrno vezane akrilne ili metakrilne kiseline, posebno unakrsno vezanih polialkenil etara šećera ili polialkohola. Ova jedinjenja su poznata pod imenom karbomer (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996). Stručnjak u ovoj oblasti se takođe može pozvati na U.S. Patent br.2,909,462, koji obezbeđuje takve akrilne polimere unakrsno vezane polihidroksil jedinjenjem koje ima najmanje tri hidroksilne grupe, poželjno ne više od osam takvih grupa, pri čemu su atomi vodonika najmanje tri hidroksilne grupe zamenjeni nezasićenim, alifatičnim radikalima koji imaju najmanje dva atoma ugljenika. Poželjni radikali su oni koji sadrže 2 do 4 atoma ugljenika, npr. vinili, alili i druge etilenski nezasićene grupe. Nezasićeni radikali mogu takođe da sadrže druge supstituente, kao što je metil. Posebno su pogodni proizvodi koji se prodaju pod imenom Carbopol (BF Goodrich, Ohio, SAD). Oni su unakrsno vezani alil saharozom ili alil pentaeritritolom. Među njima se pominje Carbopol 974P, 934P i 971P.

[0131] Što se tiče kopolimera derivata maleinskog anhidrida i alkenila, prednost se daje EMA (Monsanto), koji su pravolančani ili umreženi kopolimeri etilen-maleinskog anhidrida i oni su, na primer, unakrsno vezani divinil etrom. Takođe se poziva na J. Fields et al., 1960.

[0132] Što se tiče strukture, polimeri akrilne ili metakrilne kiseline i EMA poželjno su formirani od baznih jedinica koje imaju sledeću formulu:

u kojoj: R1 i R2, koji mogu biti isti ili različiti, predstavljaju H ili CH3; x = 0 ili 1, poželjno x = 1; y = 1 ili 2, sa x y = 2.

Za EMA, x = 0 i y = 2 i za karbomere x = y = 1.

[0133] Ovi polimeri su rastvorljivi u vodi ili rastvoru fiziološke soli (20 g/l NaCl) i pH se može podesiti na 7.3 do 7.4, na primer, sodom (NaOH), da bi se obezbedio rastvor pomoćnog sredstva u kome ekspresioni vektor(i) može (mogu) biti ugrađen(i). Koncentracija polimera u konačnoj imunološkoj kompoziciji ili kompoziciji vakcine može da se kreće između oko 0.01 do oko 1.5% tež./v, oko 0.05 do oko 1% tež./v i oko 0.1 do oko 0.4% tež./v.

[0134] Citokin ili citokini (5) mogu biti u obliku proteina u imunološkoj ili kompoziciji vakcine, ili mogu biti ko-eksprimirani u domaćinu sa imunogenom ili imunogenima ili njihovim epitopom(ima). Prednost se daje ko-ekspresiji jednog ili više citokina, bilo istim vektorom kao onaj koji eksprimira imunogen ili imunogene ili epitop(e) istog, ili njihovim posebnim vektorom.

[0135] Pronalazak obuhvata pripremu takvih kombinovanih kompozicija; na primer mešanjem aktivnih komponenti, poželjno zajedno i sa nosačem, citokinom i/ili razblaživačem.

[0136] Citokini koji se mogu koristiti u ovom pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), faktor stimulacije kolonije granulocita/makrofaga (GM-CSF), interferon α (IFNa), interferon β (IFNβ), interferon γ, (IFNγ), interleukin-1α (IL-1α), interleukin-1β (IL-1β), interleukin-2 (IL-2), interleukin-3 (IL-3), interleukin-4 (IL-4), interleukin-5 (IL-5), interleukin-6 (IL-6), interleukin-7 (IL-7), interleukin-8 (IL-8), interleukin-9 (IL-9), interleukin-10 (IL-10), interleukin-11 (IL-11), interleukin-12 (IL-12), faktor nekroze tumora α (TNFa), faktor nekroze tumora β (TNFβ), poliinozinska i policitidilna kiselina, citidin-fosfat-guanozin oligodeoksinukleotide (CpG ODN) i transformišući faktor rasta β (TGFβ). Podrazumeva se da se citokini mogu koprimenjivati i/ili uzastopno primenjivati sa imunološkom ili kompozicijom vakcine ovog pronalaska. Tako, na primer, vakcina ovog pronalaska takođe može sadržati egzogeni molekul nukleinske kiseline koji in vivo eksprimira odgovarajući citokin, npr., citokin koji odgovara ovom domaćinu koji treba da se vakciniše ili u kome treba da se izazove imunološki odgovor (na primer, goveđi citokin za preparate koji se primenjuju na goveda).

[0137] U slučaju imunološke kompozicije i/ili vakcine na bazi polipeptida eksprimiranih od strane bakulovirusa/ćelija insekata, doza može uključivati, oko 1 µg do oko 2000 µg, oko 50 µg do oko 1000 µg, i od oko 100 µg do oko 500 µg CPV antigena, epitopa ili imunogena. Doza može uključivati oko 10<2>do oko 10<20>VLP, oko 10<3>do oko 10<20>, oko 10<4>do oko 10<20>. Zapremine doze mogu biti između oko 0.1 i oko 10 ml, između oko 0.2 i oko 5 ml. Generalno, stručnjak je svestan mnogih strategija doziranja i biće u stanju da optimizuje doziranje bez vežbanja neusmeravanja.

[0138] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje kombinovanu vakcinu koja sadrži komponentu čestica nalik virusu (VLP) i komponentu modifikovanog živog virusa (MLV), pri čemu su i VLP i MLV usmereni protiv istog patogena ili bolesti, i gde kombinovana vakcina savladava antitela dobijena od majke (MDA).

[0139] U nekim primerima izvođenja, kombinovana vakcina obezbeđuje zaštitni imunitet sa jednom dozom.

[0140] U nekim primerima izvođenja, patogen ili bolest je parvovirus pasa (CPV).

[0141] U nekim primerima izvođenja, patogen ili bolest je virus slinavke i šapa (FMDV).

[0142] U nekim primerima izvođenja, VLP komponenta kombinacije sadrži najmanje 10% CPV VLP (tež./tež.) kao funkciju ukupnog sadržaja proteina.

[0143] U nekim primerima izvođenja, komponenta VLP sadrži najmanje 20% CPV VLP (tež./tež.).

[0144] U nekim primerima izvođenja, CPV VLP se eksprimira bakulovirusnim vektorom u ćelijama insekata.

[0145] U nekim primerima izvođenja, CPV VLP sadrži najmanje jedan CPV kapsid protein.

[0146] U nekim primerima izvođenja, CPV VLP sadrži CPV polipeptid koji ima sekvencu koja je navedena u SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 9 ili 10; ili, CPV VLP sadrži CPV polipeptid koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence kao što je navedena u SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 9 ili 10.

[0147] U nekim primerima izvođenja, CPV VLP sadrži CPV polipeptid kodiran polinukleotidom koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 2, 5 ili 7; ili, CPV VLP sadrži CPV polipeptid koji je kodiran polinukleotidom koji ima najmanje 90% identičnosti sa sekvencom kako je navedena u SEQ ID NO: 2, 5 ili 7.

[0148] U nekim primerima izvođenja, kombinovana vakcina nije sa ađuvansom i izborno sadrži farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, ekscipijens ili vehikulum.

[0149] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje plazmid koristan za proizvodnju CPV VLP, koji sadrži polinukleotid koji kodira CPV antigen koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 ili 8-10, ili polinukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa sekvencom kako je navedena u SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 ili 8-10.

[0150] U nekim primerima izvođenja, polinukleotid sadrži ili se sastoji od sekvence koja je navedena u SEQ ID NO: 2, 5, 7, 11 ili 12.

[0151] U nekim primerima izvođenja, plazmid se sastoji od sekvence koja je navedena u SEQ ID NO: 11 ili 12.

[0152] U nekim primerima izvođenja, plazmid se stabilno transformiše u ćeliju insekata, koja eksprimira CPV VLP.

[0153] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje suštinski prečišćeni CPV prazan kapsid ili CPV VLP eksprimiran u ćelijama insekata, pri čemu CPV prazan kapsid ili VLP sadrži polipeptid koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, ili 8-10; ili, CPV prazan kapsid ili VLP sadrži polipeptid koji ima najmanje 90% identičnosti sa sekvencom kao što je navedena u SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 ili 8-10.

[0154] U nekim primerima izvođenja, CPV prazan kapsid ili VLP se sastoji od polipeptida koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 ili 8-10.

[0155] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak izazivanja imunog odgovora kod životinje protiv CPV koji se sastoji od primene na životinju kompozicija, vakcina, kombinovanih vakcina i VLPS koji su ovde otkriveni.

[0156] U nekim primerima izvođenja, imuni odgovor štiti vakcinisane od naknadnog izlaganja virulentnom CPV. Izlaganje može biti prirodno ili eksperimentalno.

[0157] U nekim primerima izvođenja, imuni odgovor se izaziva kod vakcinisanih životinja bez obzira na prisustvo visokih nivoa majčinskih antitela (MDA) protiv CPV kod navedenih životinja. "Visoki nivoi" imaju uobičajeno značenje i generalno se odnose na nivoe MDA koji ometaju sposobnost vakcina iz prethodnog stanja tehnike da izazovu jak zaštitni odgovor kod MDA pozitivnih životinja.

[0158] Pronalazak će sada biti dalje opisan pomoću sledećih neograničavajućih primera.

PRIMERI

[0159] Osim ako nije drugačije opisano, konstrukcija DNK inserta, plazmida i rekombinantnih virusnih ili bakulovirusnih vektora je izvedena korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije opisane od strane J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Primer 1 Konstrukcija i ekspresija CPV kapsidnih antigena u bakulovirusni/sistem ćelija insekata

[0160] Cilj: Stvoriti prenosni plazmid baziran na pVL1393 koji kodira CPV kapsid protein CPV (parvovirus pasa, soj Souriou serotip 2c) optimizovan za ćelije insekata i stvaranje rekombinantnog bakulovirusa BacMEB072 u cilju ekspresije virusu sličnih čestica (VLP). Referentna sekvenca je bila soj Souriou 2c (Merial), koji ima oznaku Genbank BAD34656 / Swissprot P61826 (SEQ ID NO: 1).

[0161] CPV kapsidni gen (1755 bp) kodira polipeptid od 584 aminokiselina (koji ne sadrži signalni peptid). Sekvenca koja kodira CPV VP2 protein (SEQ ID NO: 1) je klonirana i odgovarajuća DNK sekvenca je optimizovana kodonom (SEQ ID NO: 5) za ćelije insekata. Potencijalni funkcionalni domeni prikazani su u tabeli 1 ispod.

Tabela 1 Potencijalni funkcionalni domeni su sledeći (prema napomeni Swiss-prot na P61826)

[0162] Generisanje plazmida pMEB072. CPV kapsid optimizovan za ekspresiju insekata (SEQ ID NO: 1) je kloniran u komercijalni plazmid pVL1393 (Pharmingen) korišćenjem XbaI i Bam HI mesta i vektora i inserta da se generiše ekspresioni plazmid pMEB072.

[0163] Generisanje rekombinantnog bakulovirusa BacMEB072. Korišćeni bakulovirusni vektor je AcNPV modifikovan smrtonosnom delecijom koja se spasava samo homolognom rekombinacijom (BaculoGold DNA, Pharmingen). Plazmid pMEB072 je korišćen za generisanje rekombinantnog bakulovirusa, koji kodira soj CPV kapsidnog gena Souriou serotip 2c pod kontrolom promotora poliedrina, homolognom rekombinacijom. Ćelije insekata Spodoptera frugiperda (Sf) 9 ko-transfektovane su plazmidom pMEB072 i Bsu36I trostruko isečenom linearizovanom AcNPV DNK, prema protokolu proizvođača (Baculogold, Pharmingen). Rekombinantni bakulovirus iz supernatanta kotransfekcije je dva puta prečišćen plakom. Pet klonova je amplifikovano (pasaž 1) na 28°C na skali posude 25 cm<2>skale. Inficirane ćelije i supernatanti su analizirani na ekspresiju CPV kapsida pomoću Dot Blot-a korišćenjem monoklona specifičnih za CPV kapsid antigen (CPV103B10A). Klon 1 je pokazao ispravan Dot Blot profil. Ovaj klon je dalje amplifikovan (pasaž 2) na 28°C na skali od 50 mL u erlenmajer (suspenzija) na 105 rpm. Treći pasaž (pasaž 3) na skali od 200 mL je izveden da bi se dobila zaliha virusa koja se koristi za ekspresiju proteina. Ova zaliha virusa je zatim titrirana analizom plaka. Zaliha virusa je dobijena korišćenjem medijuma SF900II, dopunjenog sa 2% FCS. Posle titracije, za proizvodnju proteina u medijumu bez seruma korišćen je rekombinantni bakulovirus (pasaž 3).

Analiza ekspresije bakulovirusa BacMEB072

Tabela 2

[0165] Ćelije insekata (Sf9) su inficirane sa BacMEB072 pri multiplicitetu infekcije (MOI) od 1 pfu/ml. Ćelije insekata su uzgajane na 105 rpm u medijumu Sf900II bez FCS tokom 4 dana na 28°C. Proizvodnja proteina je analizirana podnošenjem celih Sf9 lizata i supernatanta kulture u SDS-PAGE (4-20%, Invitrogen), nakon čega je usledio Dot Blot sa monoklonskim antitelom (CPV103B10A). Rastvorljivost eksprimiranih proteina je proučavana lizom ćelijskih peleta u puferu za lizu (50 mM Tris-Hcl pH8, 500 mM NaCl anti proteaza), ultrazvukom 3X (15 sekundi pri 20% snage, 30 sekundi čekanja, 15 sekundi na 20% snage; 5 min lize na ledu). Rastvorljivi proteini su odvojeni od nerastvorljivog materijala centrifugiranjem (30 min na 11000 rcf na 4°C).

[0166] Traka očekivane veličine je eksprimirana u ćelijskom talogu inficiranih ćelija liziranih i razbistrenih, što je primećeno bojenjem pomoću coomassie. Protein se akumulirao u ćelijama, ali je takođe otkriven u rastvorljivoj frakciji nakon lize. Identitet VP2 proteina je potvrđen Dot Blot-om korišćenjem specifičnog monoklonskog antitela protiv CPV kapsida (CPV103B10A).

[0167] Analiza elektronskom mikroskopom (EM) potvrdila je ispravno auto-sklapanje kapsidnog proteina u VLP, koji su imali prečnik od 25-30 nm, i tačnu morfologiju viriona sličnih parvovirusu (Sl.4). Optimalni uslovi za proizvodnju VLP bili su korišćenje MOI=0.1 i sakupljanje 5 dana nakon infekcije. Iako su predviđeni drugi uslovi, ovi konkretni uslovi su proizveli koncentraciju od oko 10<11>VLP po ml.

Primer 2 - proizvodnja BacMEB073 koji sadrži skraćeni CPV VP2

[0168] Cilj je bio da se generiše transfer plazmid baziran na pVL1393 koji kodira skraćeni VP2 kapsid protein CPV (parvovirus pasa, soj Souriou serotip 2c) optimizovan za sisare, a zatim da se generiše odgovarajući rekombinantni bakulovirus BacMEB073, koji eksprimira VLP. 9 Nterminalnih amino kiselina (-9AA) je deletirano u nastojanju da se poboljša ekspresija VP2 bez sprečavanja formiranja VLP (Hurtado et al. Journal of Virology, August 1996). Pored toga, dodate su tri aminokiseline (M, L i K) u nastojanju da se poboljša struktura i formiranje kapsida (Gilbert et al., Journal of Nanobiotechnology, 2006). Pre ovog otkrivanja, bilo je nepoznato kakav će efekat imati uvođenje i delecije i insercija na ekspresiju CPV VP2 i naknadno formiranje kapsida.

[0169] Skraćeni VP2 gen (delecija 9 aminokiselina na N-terminalu zamenjeni dodatnim MLK) i optimizovan za sisare (Geneart) je dalje kloniran u plazmid pVL1393 korišćenjem Bam HI i Xba I mesta vektora i inserta.

[0170] Generisanje vektora bakulovirusa i ekspresija proteina. Vektor bakulovirusa: AcNPV modifikovan smrtonosnom delecijom koja se spasava samo homolognom rekombinacijom (BaculoGold DNK, Pharmingen).

[0171] Generisanje rekombinantnog bakulovirusa BacMEB073. Plazmid pMEB073 je korišćen za generisanje rekombinantnog bakulovirusa, koji kodira skraćeni CPV kapsid gen soja Souriou serotip 2c pod kontrolom promotora poliedrina, homolognom rekombinacijom. Spodoptera frugiperda (Sf) 9 ćelija insekata ko-transfektovane su plazmidom pMEB073 i Bsu36I trostruko isečenom linearizovanom AcNPV DNK, prema protokolu proizvođača (Baculogold, Pharmingen). Rekombinantni bakulovirus iz supernatanta kotransfekcije je dva puta prečišćen plakom. Pet klonova je amplifikovano (pasaž 1) na 28°C na skali posude 25 cm<2>monosloja. Inficirane ćelije i supernatanti su analizirani na ekspresiju CPV kapsida pomoću Dot Blot-a korišćenjem monoklona specifičnih za CPV kapsid antigen (CPV103B10A). Klon 1 je pokazao ispravan Dot Blot profil. Ovaj klon je dodatno amplifikovan (pasaž 2) na 28°C na skali od 50mL u Erlenmajeru (suspenzija) na 105 o/min. Treći pasaž (pasaž 3) na skali od 200 mL je izveden da bi se dobio virusni fond koji se koristi za ekspresiju proteina. Ova zaliha virusa je zatim titrirana analizom plaka. Zaliha virusa je dobijena korišćenjem medijuma SF900II, dopunjenog sa 2% FCS.

[0172] Posle titracije, za proizvodnju proteina u medijumu bez seruma korišćen je rekombinantni bakulovirus (pasaž 3).

Analiza ekspresije

[0173]

Tabela 3. Očekivani rekombinanti

[0174] Ćelije insekata (Sf9) su inficirane sa BacMEB073 pri MOI = 1 pfu/ml. Ćelije insekata su uzgajane na 105 rpm u medijumu Sf900II bez FCS tokom 4 dana na 28°C. Proizvodnja proteina je analizirana podnošenjem celih Sf9 lizata i supernatanta kulture u SDS-PAGE (4-20%, Invitrogen) nakon čega je usledio Dot Blot sa monoklonskim antitelom (CPV103B10A).

[0175] Rastvorljivost eksprimiranih proteina je proučavana lizom ćelijskih taloga u puferu za lizu (50 mM Tris-Hcl pH8, 500 mM NaCl anti proteaza), ultrazvučnom obradom 3X (15" na 20% potencije, 30" čekanja, 15" na 20% potentnosti, 5' razbijanje na ledu) Rastvorljivi proteini su odvojeni od nerastvorljivog materijala centrifugiranjem (30' min na 11000 rcf na 4°C).

[0176] Rezultati i zaključak. Traka očekivane veličine od 64 kDa je eksprimirana u ćelijskom talogu inficiranih ćelija liziranih i razbistrenih kao što je primećeno bojenjem pomoću coomasie. Protein se akumulirao u ćelijama, ali se mogao detektovati u rastvorljivoj frakciji nakon lize. Identitet VP2 proteina je potvrđen Dot Blot-om korišćenjem specifičnog CPV kapsidnog mAb (CPV103B10A).

[0177] EM analiza je potvrdila auto-sastavljanje kapsidnog proteina u VLP prečnika 25-30 nm, kao i ispravnu morfologiju parvovirusnih viriona u koncentraciji od 10<12>VLP po ml (Sl. 4). Proizvodnja VLP je bila optimalna pri MOI=0.1 sa sakupljanjem 5 dana nakon infekcije, iako drugi uslovi takođe mogu dovesti do visokih nivoa VLP.

Primer 3 Vakcinacija pasa sa Bakulovirusno eksprimiranim CPV kapsidnim proteinom

[0178] Primarni cilj studije je bio da se proceni i uporedi bezbednost i imunogenost 2 virusu slične čestice (VLP) CPV2c soja Souriou kod štenaca (tj. BacMEB072 i BacMEB073, opisanih u Primerima 1 i 2). Sekundarni cilj je bio da se procene ađuvansni efekti aluminijum hidroksida/saponina ili iskomatriksa na imunogenost VLP proizvedenih od strane BacMEB072 i BacMEB073. Štenci od osam nedelja su vakcinisani i ispitani kao što je prikazano u tabeli 4.

Tabela 4. Dizajn eksperimenta za studiju skraćenog CPV VP2 VLP u odnosu na CPV VP2

MLV pune dužine

Grupa Antigen: Ađuvans Vakcinacija Kliničko Serumi Puna krv

[0179] U pogledu bezbednosti, Al(OH)3/Saponin nije izazvao opšte reakcije niti bilo kakve druge znake osim lokalne toplote i otoka. Blagi otok je primećen 3 do 4 dana nakon svake vakcinacije kod većine pasa. Čini se da je Iscomatrix veoma bezbedan ađuvans. U pogledu imunogenosti, vakcinacija štenaca sa VLP CPV2 je bila u stanju da izazove i humoralni i ćelijski imuni odgovor bez većih razlika između skraćenog ili VP2 pune dužine povezanog sa VLP. Značajno je da je postojanost humoralnog imunološkog odgovora povećana kada su VLP dodavani ili sa Al(OH)3/saponin ili sa Iscomatrix-om bez značajne razlike između dva ispitivana ađuvansa. Pored toga, Iscomatrix ađuvans je povećao veličinu IFN gama odgovora ne samo u poređenju sa grupom bez ađuvansa, već i sa grupom Al(OH)3i Saponina.

Primer 4 Vakcinacija pasa Bakulovirusno eksprimiranim CPV VLP ili MLV CPV (sojevi Souriou ili Bari)

[0180] Cilj studije je bio da se uporedi imuni odgovor kod štenaca vakcinisanih CPV VLP, Souriou CPV MLV ili Bari CPV MLV. Prvi eksperiment je uporedio 1.52 log10 TCID50/mL (IFI) Souriou; 1.0 log10 TCID50/mL (HA) Bari; i pMEB072 VLP (rezultati na Sl. 8). Drugi eksperiment je uporedio 2.21 log10 TCID50/mL (IFI) Souriou; 2.0 log10 TCID50/mL (HA) Bari; i pMEB073-proizveden VLP u Al(OH)3+ saponin ađuvans (rezultati na Sl.9). Konačno, treći eksperiment je uporedio 3.81 logički TCID50/mL (IFI) Souriou; 3.0 log10 TCID50/mL (HA) Bari; i pMEB072 proizveden VLP u Al(OH)3+ saponin ađuvans (rezultati na Sl. 10). Uzeti zajedno, ovi rezultati su pokazali da CPV VLP, napravljen prema ovom otkriću, daje uporediv imuni odgovor u poređenju sa primerom CPV MLV. Važno je da su VLP bili u stanju da izazovu brži imuni odgovor u poređenju sa niskim i srednjim dozama bilo kog MLV soja.

Primer 5 Vakcinacija pasa sa CPV MLV ili Baulovirsno-eksprimiranim CPV kapsidnim proteinom MLV CPV

[0181] Cilj studije je bio da se proceni imunogenost različitih kandidata za vakcinu primenjenih u različitim dozama i subkutano kod štenaca sa majčinim antitelima. Pre ove studije, nije bilo poznato da li CPV VLP može da savlada antitela majke da indukuje zaštitni imunitet kod štenaca.

Tabela 5. Dizajn eksperimenta za studiju CPV VLP u odnosu na CPV MLV

[0182] Kao što je naznačeno na Sl.11, Sl.12 i Tabeli 6, titri CPV antitela su bili značajno veći u grupi koja je primala MLV VLP. Ovi podaci ukazuju da je dodavanje CPV VLP u formulaciju vakcine bilo dovoljno da se prevaziđu majčinska antitela, što je iznenađujući i neočekivani rezultat. Pronalazači predviđaju da VLP hvata značajan deo cirkulišućeg CPV MDA što zauzvrat omogućava VLP i CPV MLV da aktivno imunizuju štenad.

Tabela 6. Titri anti-CPV antitela (IHA) prema danima nakon vakcinacije

Primer 6 Vakcinacija pasa sa Bakulovirsno-eksprimiranom CPV kapsidnim proteinom, MLV CPV ili asdenovirusnim-vektorskim CDV

[0183] Cilj studije je bio da se proceni imunogenost nekoliko doza različitih kandidata za vakcinu primenjenih različitim putevima. Različiti kandidati bili su CPV VLP i rekombinantni adenovirusi koji eksprimiraju ili CPV ili CDV (pseća kuga) gene.

Tabela 7. Dizajn eksperimenta za studiju CPV VLP u odnosu na Adeno CPV u odnosu na Adeno CDV

Grupa Vakcina Uzeti uzorci Analize

[0184] Kao što je naznačeno na Sl.13, Grupe A i E indukovane kod štenaca zaštitnim nivoima titra CPV antitela.

Primer 7 Vakcinacija pasa sa Bakulovirsno-eksprimiranim CPV kapsidnim proteinom (VLP), VLP RECOMBITEK<®>C4, RECOMBITEK<®>C4 pojedinačno ili NOBIVAC<®>3

[0185] Cilj studije je bio da se proceni odgovor antitela nakon primene različitih eksperimentalnih multivalentnih formulacija vakcina koje sadrže konvencionalnu CPV-2 MLV ili bakulovirusno-eksprimiranu, CPV-2c rekombinantnu vakcinu čestica sličnih virusu (VLP) i jednu konkurentsku/komercijalnu vakcinu kod pasa sa CPV MDA.

[0186] Četrdeset pasa pasa bigl pozitivnih na antitela dobijena od majke (MDA) od kuja koje su prethodno imunizovane na CPV tokom trudnoće, nasumično je raspoređeno u četiri grupe za tretman (n=10 pasa) korišćenjem legla i titra antitela. Za randomizaciju su korišćene titracije uzoraka krvi sakupljenih 27. dana. Svi psi su vakcinisani dva puta, u razmaku od 21 dan, dodeljenom vakcinom prema tabeli 8 ispod. Štenci imaju Ab (MDA) poreklom iz CPV majke u Do.

Tabela 8. Dizajn eksperimenta za studiju CPV VLP u odnosu na RECOMBITEK<®>C4 i

NOBIVAC<®>

<∗∗>Primjenjeni na istoj strani kao i istovremena vakcina na udaljenosti od približno 3 cm

<∗∗∗>CDV-CAV-CPi-CPV2 vakcina se naziva C4

HA: Hemaglutinacija u 0.5 ml

[0187] Krv je sakupljena od svih pasa na dane 0, 7, 15, 21, 28, 35 i 42 i serumi su testirani na CPV antitela pomoću testova HAI i serum neutralizacionih antitela (SNA).

[0188] Titri CPV HAI su prijavljeni kao inverzni od najvećeg razblaženja koje sprečava hemaglutinaciju, a vrednost <20 smatrana je negativnom.

[0189] Osim za 2 psa u grupi 3 (C4), svi psi u svakoj grupi su bili pozitivni na CPV pomoću HAI dana 0, pre vakcinacije. Serokonverzija nakon vakcinacije je definisana kao povećanje titra za 4 puta ili više od dana 0. Nakon prve vakcinacije, 6 od 10 pasa vakcinisanih VLP-CPV2c (grupa 1) i 6 od 10 pasa vakcinisanih sa VLP-CPV2c-C4 (grupa 2) serokonvertovalo je do dana 7. U grupama 3 i 4 nije bilo odgovora (grupe koje ne sadrže VLP) na dan 7. Do dana 21, 5 od 10 pasa iz grupe 2 (VLP-CPV2c-C4), 4 od 10 iz grupe 1 (VLP-CPV2c), 3 od 10 pasa iz grupe 4 (NOBIVAC3<®>) i 2 od 10 iz Grupe 3 (C4) su serokonvertovani (Slika 15).

[0190] Nakon druge vakcinacije, do dana 35 (2 nedelje nakon vakcinacije) uočena je serokonverzija kod svih pasa iz Grupe 2 (VLP-CPV2c-C4) i 4 (NOBIVAC3<®>) zatim 9 u grupi 3 (C4) i 8 u grupi 1 (VLP-CPV2c). Tretman VLP C4 (Grupa 2) je indukovao najviši geometrijski srednji titar antitela tokom studije. Videti Sl. 17. Sedam dana nakon V2, na dan 28, GMT ove grupe je bio -7.5 puta veći od samog VLP (GMT= 520), -9 puta veći od samog C4 (GMT =422) i -28 puta veći od NOBIVAC3<®>grupe (GMT=139).

Tabela 9. IHA titri pomoću ID i dan za studiju CPV VLP u odnosu na RECOMBITEK<®>C4 i

Tabela 10. Rezime statistike za studiju CPV VLP u odnosu na RECOBITEK® C4 i NOBIVAC<®>

* Znaci „<“ su uklonjeni iz vredosti u cilju izračunavanja rezimea statistike.

Primer 8 Vakcinacija pasa sa Bakulovirsno-eksprimiranim CPV kapsidnim proteinom (VLP), VLP RECOMBITEK<®>C4, RECOMBITEK<®>C4 pojedinačno ili NOBIVAC<®>3

[0191] Cilj ove studije je bio da se proceni odgovor CPV antitela nakon primene eksperimentalnih čestica sličnih virusu napravljenih od VP2 kapsidnog proteina parvovirusa tipa 2c pasa (VLPs CPV-2c) u različitim titrima u kombinaciji sa CPV-2 MLV multivalentnom vakcinom formulacija i jednom komercijalnom vakcinom kod pasa sa CPV MDA.

[0192] Pedeset pasa bigl pozitivnih na antitela dobijena od majke (MDA) od kuja koje su prethodno imunizovane na CPV tokom trudnoće, nasumično je raspoređeno u pet grupa za lečenje (n=10 pasa po grupi) korišćenjem legla i titra antitela. Za randomizaciju su korišćene titracije uzoraka krvi sakupljenih na dan 15.

[0193] Vakcine su pripremljene rehidratacijom liofilizovane komponente sa komponentom razblaživača. Liofilizovana serija korišćena za test vakcine #1, #2, #3 i #5 bila je ista eksperimentalna četvorosmerna (C4) vakcina. Titri za svaku komponentu su bili sledeći: CPV:6.1 Log TCID50/ml (~0.2 ml 1X kulture), CDV: 7.3 Log TCID50/ml, CPi: 5.5 Log TCID50/ml i CAV2:6.0 Log TCID50/ml. Svi psi su vakcinisani dva puta, u razmaku od 21 dan, dodeljenom vakcinom prema tabeli 11 ispod.

Tabela 11. Eksperimentalni dizajn za studiju CPV VLP u odnosu na RECOMBITEK<®>C4 i NOBIVAC<®>

[0194] Krv je sakupljena od svih pasa na dane 0, 7, 15, 21, 28, 34 i 42 i serumi su testirani na CPV antitela HAI testom.

[0195] Titri CPV HAI su prijavljeni kao inverzni od najvećeg razblaženja koje sprečava hemaglutinaciju i vrednost <20 smatrana je negativnom. Svi psi u svakoj grupi su bili pozitivni na CPV od HAI na dan 0, pre vakcinacije (GMT prosečni titri za sve grupe između 42.87 i 80). Serokonverzija posle vakcinacije je definisana kao povećanje titra 4 puta ili više od dana 0. Psi koji su serokonvertovali su kategorisani kao reagujući (Sl. 18). Sedam dana nakon prve vakcinacije, 5 od 10 pasa vakcinisanih visokom dozom VLP-CPV2c-C4 (Grupa 1) i 1 od 10 pasa vakcinisanih srednjom dozom VLP-CPV2c-C4 (Grupa 2) su serokonvertovani. Nije bilo odgovora u grupama 3, 4 i 5 (tj. grupama koje sadrže niske ili nikakve VLP) na dan 7. Dvadeset jedan dan nakon prve vakcinacije, svi psi iz Grupe 1 (visoka doza VLP-CPV2c-C4), 3 od 10 iz Grupe 2 (srednja doza VLP-CPV2c-C4), 1 od 10 iz Grupe 3 (niska doza VLP-CPV2c-C4). Nije bilo odgovora u grupama 4 i 5 (tj. grupama koje ne sadrže VLP) (Sl.18).

[0196] Dana 34, 13 dana nakon druge vakcinacije, uočena je serokonverzija kod svih pasa iz Grupe 1 (visoka doza VLP-CPV2c-C4) i 4 (NOBIVAC3<®>) zatim 9 u grupi 2 (srednja doza VLP-CPV2c-C4), 6 u grupi 3 (niska doza VLP-CPV2c-C4) i 1 u grupi 5 (C4 bez VLP).

[0197] Kao što je prikazano na Sl.19, tretman visokom dozom VLP C4 (Grupa 1) indukovao je najviši geometrijski srednji titar antitela tokom studije. Trinaest dana nakon V2, na dan 34, GMT ove grupe je bio 4457.22, praćen srednjom dozom VLP-CPV2c-C4 i NOBIVAC3<®>grupe; (GMT=1470.33), mala doza VLP-CPV2c-C4 (GMT =298.57) i samo C4 (GMT =45.95).

Tabela 12. HI rezultati po grupi, ID i danu za drugu studiju CPV VLP u odnosu na RECOMBITEK<®>C4 i NOBIVAC<®>

*Za svrhu Primera 8, donji nazivi će biti korišćeni u sledećim tabelama i dijagramima.

*C4 visoka doza VLP-CPV2c = test vakcina #1

*C4 srednja doza VLP-CPV2c = test vakcina #2

*C4 niska doza VLP-CPV2c = test vakcina #3

*C4 bez VLP-CPV2c = test vakcina #5

Tabela 13. Rezime statistike* po grupi za drugu studiju CPV VLP u odnosu na RECOMBITEK<®>C4 i NOBIVAC<®>

Tabela 14. Broj subjekata koji su imali odgovor (serokonverziju) po grupi i danu; 1=da, 0=ne; Serokonverzija je definisana kao 4-struko ili veće povećanje u titru od početne vrednosti.

[0198] Shodno tome, CPV VLP su stimulisali raniji početak imuniteta (OOI) nego sam MLV kod MDA+ štenaca i CPV VLP sinergiju sa MLV C4 kod MDA+ štenaca. Prijavilac tvrdi da su ovi rezultati bili neočekivani i izuzetno povoljni. Savladavanje antitela dobijenih od majke dugo je predstavljalo izazov za biologe koji se bave vakcinama, a ovi podaci ukazuju na to da se pristup VLP MLV koji je ovde otkriven može široko primeniti na problem obezbeđivanja MDA+ potomstva sa zaštitnim imunitetom.

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Kombinovana vakcina koja sadrži česticu sličnu virusu (VLP) parvovirusa pasa (CPV) i CPV modifikovan živi virus (MLV), pri čemu i VLP i MLV izazivaju imuni odgovor protiv CPV, i pri čemu kombinovana vakcina savladava antitela poreklom od majke (MDA).

2. Kombinovana vakcina prema patentnom zahtevu 1, koja obezbeđuje zaštitni imunitet sa jednom dozom.

3. Kombinovana vakcina prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačena time što VLP kombinacije sadrži najmanje 10% CPV VLP (tež./tež.) kao funkciju ukupnog sadržaja proteina.

4. Kombinovana vakcina prema patentnom zahtevu 3, naznačena time što VLP sadrži najmanje 20% CPV VLP (tež./tež.).

5. Kombinovana vakcina prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačena time što je CPV VLP eksprimiran bakulovirusnim vektorom u ćelijama insekata.

6. Kombinovana vakcina prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačena time što CPV VLP sadrži najmanje jedan protein kapsida CPV.

7. Kombinovana vakcina prema patentnom zahtevu 6, naznačena time što protein kapsida CPV sadrži CPV VP2 polipeptide ili varijante, uključujući njihove skraćene verzije.

8. Kombinovana vakcina prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačena time što CPV VLP sadrži CPV polipeptid koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 9 ili 10; ili,

pri čemu CPV VLP sadrži CPV polipeptid koji ima najmanje 90% identičnosti sa sekvencom kao što je navedena u SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 9 ili 10.

9. Kombinovana vakcina prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačena time što CPV VLP sadrži CPV polipeptid kodiran polinukleotidom koji ima sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 5; ili,

pri čemu CPV VLP sadrži CPV polipeptid koji je kodiran polinukleotidom koji ima najmanje 90% identičnosti sa sekvencom kako je navedena u SEQ ID NO: 5.

10. Kombinovana vakcina prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, naznačena time što kombinovana vakcina nije sa ađuvansom i izborno sadrži farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, ekscipijens ili vehikulum.

11. Kombinovana vakcina prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10 za upotrebu u postupku izazivanja imunog odgovora kod životinje protiv CPV koji sadrži primenu na životinju pomenute kombinovane vakcine.

12. Kombinovana vakcina za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačena time što je imuni odgovor zaštitni, i pri čemu zaštitni imuni odgovor štiti vakcinisane od naknadnog izlaganja virulentnom CPV.

13. Kombinovana vakcina za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, naznačena time što je zaštitni imuni odgovor izazvan kod vakcinisanih životinja, bez obzira na prisustvo u pomenutim životinjama visokih nivoa antitela poreklom od majke (MDA) protiv CPV.