JP7038804B2 - パラミクソウイルス科の発現系 - Google Patents
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Description
本発明は、(ベクター)ワクチンの分野に関し、とりわけ、前記外因性遺伝子を含有するパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ウイルスを介して、目的の外因性遺伝子を発現させるための、ヌクレオチド配列の配置の増強に関する。本発明は、目的の遺伝子、とりわけ、抗原をコードする配列を発現させるのに適する、関連の発現カセットおよびベクターにさらに関する。本発明のウイルスベクターは、免疫原性組成物またはワクチンを生産するために有用である。
パラミクソウイルス科のパラミクソウイルスは、多くの蔓延する動物疾患およびヒト疾患の一因となる、マイナスセンスで、一本鎖のRNAウイルスである。パラミクソウイルスの例は、家禽および他の鳥類種に感染するニューカッスル病ウイルス、またはヒトにおいて疾患を引き起こす麻疹ウイルスである。これらのウイルスは、現在、7つの属に分けられる、49の種を含み、これらの中には、7つの種を伴うモルビリウイルス属がある。
イヌジステンパー(CD)は、イヌおよび他の動物の、高度に感染性の熱性疾患である。死亡率は、高く、30~80パーセントの間である。CDを生き延びたイヌは、恒久的な中枢神経系の損傷を有することが多い。CDの確立された病因は、CDウイルス(CDV)として公知の、パラミクソウイルス科、モルビリウイルス(Morbillivirus)属のメンバーによる感染である。一般に、パラミクソウイルスは、マイナスの極性を有する、18~20kbの一本鎖RNAゲノムを含有するエンベロープウイルスである。ゲノムは、融合(F)糖タンパク質、およびヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ(HN)糖タンパク質またはヘマグルチニン(H)糖タンパク質を含む、5~7つの構造タンパク質をコードする。膜糖タンパク質であるヘマグルチニン(H)は、ウイルスの、宿主細胞への接合の一因となり、融合糖タンパク質(F)は、ウイルスと、感染細胞との間の膜融合、または感染細胞と、隣接する非感染細胞との間の膜融合を引き起こす。
Wang et al.(Vaccine 30: 5067-5072 (2012))は、逆遺伝学を使用することにより、狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現させる、組換えCDVワクチン株を作出した。しかし、実施において見られる欠点は、このようなウイルス株が、おそらく、時間経過につれて、複製された非コード領域配列の間の相同組換えにより媒介されて、挿入された遺伝子を失うことである。
さらに、イヌジステンパーウイルスおよびイヌパルボウイルス(CPV)は、全世界に分布する、イヌ科イヌ属動物および他の肉食動物の、2つの主要な病原体である。肉食動物集団における、これらの2つのウイルスについての疫学、およびそれらのコントロールの成功は、易感染性宿主に対する能動的免疫化に依存する。ワクチン接種スキームは、とりわけ、弱毒化生イヌパルボウイルス成分およびイヌジステンパー成分を含有する多価ワクチンの使用を含むことが極めて多い。しかし、免疫化の成功は、生後齢類型、既往の免疫状態、および母体由来免疫の存在に依存する。イヌジステンパーウイルスおよびイヌパルボウイルスなど、イヌ科イヌ属動物の主要な病原体に対して防御する、改善されたワクチンを見出すことが、強く必要とされている。
上記の技術的問題に対する解決策は、特許請求の範囲において特徴づけられる記載および実施形態により達成される。
したがって、その異なる態様における本発明は、特許請求の範囲に従い実施される。
本発明は、CDVウイルスのヌクレオタンパク質(N)遺伝子の5’非コード領域が5’末端に隣接する外来遺伝子を含む発現カセットを、CDVウイルスゲノムのリンタンパク質(P)遺伝子とマトリックスタンパク質(M)遺伝子との間に挿入することにより(図1を参照されたい)、ウイルスベクターが、外来遺伝子を長時間にわたってもなお収容し、維持し、発現させることができるという知見に基づく。これは、CDVベースのベクターなど、遺伝的に安定なトランス遺伝子パラミクソウイルス科ベースのベクターの作出を可能とする。
したがって、第1の態様では、本発明は、第1の遺伝子(1)が発現カセットの3’方向に配置され、第2の遺伝子(2)が発現カセットの5’方向に配置されるような、パラミクソウイルス科ウイルスの2つの隣接する必須遺伝子(1;2)の間の挿入のための発現カセットであって、
・目的のヌクレオチド配列である第1のヌクレオチド配列、および
・第1のヌクレオチド配列の5’末端に隣接する第2のヌクレオチド配列であって、前記第2のヌクレオチド配列が遺伝子の5’非コード領域であり、前記遺伝子が、第1の遺伝子(1)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、第2のヌクレオチド配列
を含む発現カセット
を提供する。
本発明に従う発現カセットは、好ましくは、
・第1のヌクレオチド配列の3’末端に隣接する第3のヌクレオチド配列であって、前記第3のヌクレオチド配列が遺伝子の3’非コード領域であり、前記遺伝子が、第2の遺伝子(2)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、第3のヌクレオチド配列
をさらに含む。
図2におけるプラスミドマップは、例示的に、本発明に従うベクターを作出するためのDNA構築物を示す。
本発明に従うベクターは、特に、哺乳動物、特に、イノシシ科動物のワクチン接種に有用である。
本発明は、CDVおよび別のウイルス、とりわけ、CDVおよびCPVなど、別のイヌウイルスに対する二重免疫化のためのベクターにさらに関する。この二重免疫化ベクターは、ベクター骨格、およびトランス遺伝子として挿入されるCPV VP2など、他のイヌ抗原に由来するCDV抗原を発現させる。
したがって、本発明はまた、好ましくは、CDVのP遺伝子とM遺伝子との間に配置され、イヌ科動物パルボウイルス(CPV)VP2タンパク質をコードする、目的の異種RNA配列を含むイヌジステンパーウイルス(CDV)ベクターも提供する。
本発明は、このようなベクターを含む哺乳動物宿主細胞、および、このような宿主細胞を使用して、ベクターワクチンを作出する方法のほか、本発明のCDVベクターを含む、免疫原性組成物およびワクチンにさらに関する。
本発明は、先行技術に固有の問題を解決し、先端技術において、顕著に異なる進歩をもたらす。
本発明は、in vitroにおけるデータにより、本明細書で提示される教示に従い創出されたCDV組換体(すなわち、CDVベクター)であって、CPVの2b遺伝子型または2c遺伝子型に由来するVP2タンパク質をコードするCDV組換体についての探索を示す。ウイルスは、Vero細胞内の産生時に、良好な増殖動態を示し、ローラーボトル内の感染の6日間後に、ピーク力価に達した。組換体は、免疫蛍光法およびウェスタンブロットにより決定される通り、トランス遺伝子(VP2)の強い発現特徴を示し、この特徴は、組換体を、CDV-CPV二重ワクチン候補物質として適格とする。加えて、このようなウイルスを、Vero細胞上の、20代の細胞継代にわたり、遺伝子の安定性についても調べた。いずれのウイルスも、遺伝的安定性を、完全に維持したことから、ワクチンのためのバイオプロセシングに対して受容性であることが指し示される。
本発明は、in vivo結果により、本発明に従うCDVベクターが、イノシシ科動物宿主、標的リンパ細胞において複製されることをさらに裏付ける。多様な臓器について、サンプリングし、調べることにより、ウイルスは、ワクチン接種された動物の、リンパ節、脾臓、または扁桃腺において検出された。重要なことは、全ての歩哨動物が、研究の終了時まで、血清陰性を維持したことであり、ここから、ワクチン接種時に、組換えCDVウイルスが、動物から動物に伝播しなかったことが指し示される。
さらに、ブタインフルエンザウイルスのH3亜型ヘマグルチニン(H3)をコードする、本発明に従うCDVベクターの使用は、このような受動的に存在する母体免疫の存在にもかかわらず、H3N2母体由来抗体陽性(H3N2-MDA陽性)子ブタにおける、能動免疫の発生をもたらす。
さらに、ブタ伝染性下痢ウイルス(PEDV)のスパイクタンパク質をコードする、本発明に従うCDVベクターを、雌ブタに、鼻腔内投与したところ、次いで、抗体陽性初乳の摂取を介して、PEDVによる抗原投与の後における、臨床徴候、致死性、およびウイルス排出の発生率または重症度の低減により見られる、子ブタの受動免疫化が結果としてもたらされた。
・目的のヌクレオチド配列である第1のヌクレオチド配列、および
・第1のヌクレオチド配列の5’末端に隣接する第2のヌクレオチド配列であって、前記第2のヌクレオチド配列が遺伝子の5’非コード領域であり、前記遺伝子が、第1の遺伝子(1)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、第2のヌクレオチド配列、および
・第1のヌクレオチド配列の3’末端に隣接する第3のヌクレオチド配列であって、前記第3のヌクレオチド配列が遺伝子の3’非コード領域であり、前記遺伝子が、第2の遺伝子(2)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、第3のヌクレオチド配列
を含む発現カセットを提供する。
第2の遺伝子(2)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される遺伝子の3’非コード領域、および
前記3’非コード領域の5’末端に隣接する配列であって、前記3’非コード領域の5’末端に隣接する前記配列が、翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列をコードし、前記翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列が、Kozak配列であってもよい、配列
からなる。
別の好ましい態様に従い、本発明の発現カセットは、
・前記第1~第3のヌクレオチド配列、および
・第2のヌクレオチド配列の5’末端に隣接するか、または前記第3のヌクレオチド配列の3’末端に隣接するさらなるヌクレオチド配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子間配列であるさらなるヌクレオチド配列
からなる。
パラミクソウイルス科ウイルスの、前記2つの隣接する遺伝子(1;2)は、好ましくは、パラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択され、かつ/または
前記パラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子は、
・パラミクソウイルス科ウイルスのN、P、M、F、HおよびL遺伝子、もしくは
・パラミクソウイルス科ウイルスのN、P、M、F、HNおよびL遺伝子、もしくは
・パラミクソウイルス科ウイルスのN、P、M、F、G、およびL遺伝子である。
・第1の遺伝子(1)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのP遺伝子を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのN、M、F、HおよびL遺伝子からなる群から選択されてもよく、
・第2の遺伝子(2)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのM遺伝子を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのH、P、F、LおよびN遺伝子からなる群から選択されてもよい
発現カセットを提供する。
前記第3のヌクレオチド配列は、発現カセットの5’方向に配置され、第2の遺伝子(2)の3’非コード領域を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子の3’非コード領域を含むか、もしくはこれからなる。
別の好ましい態様に従い、本発明の発現カセットの、前記第1のヌクレオチド配列は、前記第3のヌクレオチド配列内に組み入れられた遺伝子開始(GS)配列、および/またはパラミクソウイルス科ウイルスのゲノムプロモーターに作動可能に連結されている。
本発明の発現カセットの、前記第1~第3のヌクレオチド配列、および前記さらなるヌクレオチド配列は、したがって、前記第1のヌクレオチド配列が、第1のRNA配列であり、前記第2のヌクレオチド配列が、第2のRNA配列であり、前記第3のヌクレオチド配列が、第3のRNA配列であり、前記さらなるヌクレオチド配列が、さらなるRNA配列であるように、好ましくは、RNA配列である。
・目的のRNA配列である、第1のRNA配列、ならびに
・第1のRNA配列の5’末端に隣接する第2のRNA配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスのN遺伝子の5’非コード領域である第2のRNA配列、ならびに
・第1のRNA配列の3’末端に隣接する第3のRNA配列であって、
・パラミクソウイルス科ウイルスのヘマグルチニン(hemagglutin)(H)遺伝子、パラミクソウイルス科ウイルスのリンタンパク質(P)遺伝子、パラミクソウイルス科ウイルスの融合タンパク質(F)遺伝子、パラミクソウイルス科ウイルスの大型ポリメラーゼタンパク質(L)遺伝子、およびパラミクソウイルス科ウイルスのヌクレオタンパク質(N)遺伝子からなる群から選択される遺伝子の3’非コード領域、ならびに
・Kozak配列をコードする、前記3’非コード領域の5’末端に隣接する配列
からなる第3のRNA配列、ならびに
・任意に、第2のヌクレオチド配列の5’末端に隣接するか、または前記第3のヌクレオチド配列の3’末端に隣接するさらなるRNA配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子間配列であるさらなるRNA配列
を含む。
好ましくは、本発明の発現カセットは、非自然発生であり、かつ/または単離パラミクソウイルス科ウイルスベクターのゲノム内に組み入れられる。
本明細書で言及されるパラミクソウイルス科ウイルスは、特に、モルビリウイルス属のウイルスであり、モルビリウイルス属のウイルスは、好ましくは、イヌジステンパーウイルス(CDV)、ネコモルビリウイルス(FeMV)、および小反芻獣疫ウイルス(PPRV)からなる群から選択され、モルビリウイルス属のウイルスは、最も好ましくは、イヌジステンパーウイルス(CDV)である。例えば、CDVが、パラミクソウイルス科ウイルスとして選ばれる場合、本明細書の後出で記載されるパラミクソウイルス科ウイルスベクターは、特に、CDVベクターである。
好ましい一態様では、本発明は、
・前記5’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのN遺伝子の5’非コード領域であり、かつ/もしくは
・前記3’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのH遺伝子の3’非コード領域であり、
かつ/または前記発現カセットが、パラミクソウイルス科ウイルスのP遺伝子とM遺伝子との間に挿入される、
前記パラミクソウイルス科ウイルスベクター、または本発明の発現カセットに関する。
・前記挿入されたRNA配列が、第1のRNA配列を含むか、またはこれからなり、前記第1のRNA配列が、目的のヌクレオチド配列であり、
・前記挿入されたRNA配列が、第1のRNA配列の5’末端に隣接する第2のRNA配列を含むか、またはこれからなり、前記第2のRNA配列が、遺伝子の5’非コード領域であり、前記遺伝子が、第1の遺伝子(1)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択され、
・前記挿入されたRNA配列が、第1のRNA配列の3’末端に隣接する第3のRNA配列を含むか、またはこれからなり、前記第3のRNA配列が、遺伝子の3’非コード領域を含むか、またはこれからなり、前記遺伝子が、第2の遺伝子(2)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、
パラミクソウイルス科ウイルスベクターにも関する。
好ましくは、前記第1のRNA配列は、前記第3のヌクレオチド配列内に組み入れられた遺伝子開始(GS)配列、および/またはパラミクソウイルス科ウイルスのゲノムプロモーターに作動可能に連結されている。
かつ/または前記パラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子は、
・パラミクソウイルス科ウイルスのN、P、M、F、HおよびL遺伝子、もしくは
・パラミクソウイルス科ウイルスのN、P、M、F、HNおよびL遺伝子、もしくは
・パラミクソウイルス科ウイルスのN、P、M、F、G、およびL遺伝子である。
さらに好ましい態様に従い、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターの前記第3のRNA配列は、
第2の遺伝子(2)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される遺伝子の3’非コード領域、および
前記3’非コード領域の5’末端に隣接する配列であって、前記3’非コード領域の5’末端に隣接する前記配列が、翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列をコードし、前記翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列が、Kozak配列であってもよい、配列
からなる。
・第1の遺伝子(1)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのP遺伝子を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのN、M、F、HおよびL遺伝子からなる群から選択されてもよく、
・第2の遺伝子(2)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのM遺伝子を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのH、P、F、LおよびN遺伝子からなる群から選択されてもよい。
・前記第2のヌクレオチド配列は、遺伝子の5’非コード領域であり、遺伝子は、発現カセットの3’方向に配置されたパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子であって、第1の遺伝子(1)を除外する必須遺伝子から選択され、これは、特に、第1の遺伝子(1)の5’非コード領域のそれぞれが選択されないことを意味し、かつ/または
・前記第3のヌクレオチド配列は、遺伝子の3’非コード領域を含むか、またはこれからなり、遺伝子は、発現カセットの5’方向に配置されたパラミクソウイルス科の必須遺伝子であって、第2の遺伝子(2)を除外する必須遺伝子から選択され、これは、特に、第2の遺伝子(2)の3’非コード領域のそれぞれが選択されないことを意味する。
本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターに関して、
・前記5’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのN遺伝子の5’非コード領域であり、かつ/または
・前記3’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのH遺伝子の3’非コード領域である
ことがさらに好ましい。
・目的のRNA配列である第1のRNA配列、ならびに
・第1のRNA配列の5’末端に隣接する第2のRNA配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスのヌクレオタンパク質(N)遺伝子の5’非コード領域である第2のRNA配列、ならびに
・第1のRNA配列の3’末端に隣接する第3のRNA配列であって、
パラミクソウイルス科ウイルスのH、HN、FまたはL遺伝子の3’非コード領域、および
Kozak配列をコードする、前記3’非コード領域の5’末端に隣接する配列
からなる第3のRNA配列
を含む。
・第2のRNA配列の5’末端に隣接する第4のRNA配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子間配列である第4のRNA配列、および/または
・第4のRNA配列の3’末端に隣接する第5のRNA配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子間配列である第5のRNA配列
をさらに含む。
好ましくは、本発明の発現カセット、または本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターの、前記第3のRNA配列は、パラミクソウイルス科ウイルスのH遺伝子の3’非コード領域を含むか、もしくはこれらからなり、かつ/または前記発現カセットは、好ましくは、パラミクソウイルス科ウイルスのP遺伝子とM遺伝子との間に挿入される。
(A)本発明の発現カセットであって、
・目的の異種または外因性のRNA配列である、第1のRNA配列、ならびに
・第1のRNA配列の5’末端に隣接する第2のRNA配列であって、CDVのN遺伝子の5’非コード領域である第2のRNA配列、ならびに
・第1のRNA配列の3’末端に隣接する第3のRNA配列であって、
パラミクソウイルス科ウイルスのH、HN、F、またはL遺伝子の3’非コード領域、および
Kozak配列をコードする、前記3’非コード領域の5’末端に隣接する配列
からなる第3のRNA配列
を含み、
好ましくは、
・第2のRNA配列の5’末端に隣接する第4のRNA配列であって、CDVの遺伝子間配列である第4のRNA配列、または
・第3のRNA配列の3’末端に隣接する第5のRNA配列であって、CDVの遺伝子間配列である第5のRNA配列
をさらに含む発現カセット
にも関し、
(B)本発明はまた、それぞれ、(A)の発現カセットを含む、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターにも関し、この場合、このベクターは、本明細書では「本発明のCDVベクター」とも称される。
好ましくは、配列番号1の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのN遺伝子の5’非コード領域、
好ましくは、配列番号2の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのP遺伝子の5’非コード領域、
好ましくは、配列番号3の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのM遺伝子の5’非コード領域、
好ましくは、配列番号4の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのF遺伝子の5’非コード領域、
好ましくは、配列番号5の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのH遺伝子の5’非コード領域、および、
好ましくは、配列番号6の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのL遺伝子の5’非コード領域
からなる群から選択される。
好ましくは、配列番号7の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのH遺伝子の3’非コード領域、
好ましくは、配列番号8の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのN遺伝子の3’非コード領域、
好ましくは、配列番号9の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのP遺伝子の3’非コード領域、
好ましくは、配列番号10の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのM遺伝子の3’非コード領域、
好ましくは、配列番号11の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのF遺伝子の3’非コード領域、および
好ましくは、配列番号12の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのL遺伝子の3’非コード領域
からなる群から選択される。
本発明の発現カセット、または本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターに関して、好ましくは
・前記第2の遺伝子(2)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される遺伝子の3’非コード領域は、CDVのH遺伝子の3’非コード領域であり、CDVのH遺伝子の前記3’非コード領域が、好ましくは、配列番号7の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるRNA配列からなるか、もしくはこれを含み、かつ/または
・前記3’非コード領域配列の5’末端に隣接する前記配列は、5~8ヌクレオチドの長さであるKozak配列をコードし、Kozak配列は、好ましくは、配列番号13の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるRNA配列からなるか、もしくはこれを含む。
好ましくは、本発明の発現カセット、または本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターの文脈において、本明細書で記載される、前記目的のヌクレオチド配列は、目的の遺伝子もしくは抗原をコードする配列であり、かつ/または前記目的のヌクレオチド配列は、好ましくは、非自然発生のヌクレオチド配列および/もしくは組換えヌクレオチド配列である。
前記目的のヌクレオチド配列は、好ましくは、疾患原因物質に由来する抗原をコードし、疾患原因物質は、好ましくは、イヌ科動物もしくはネコ科動物などの愛玩動物、および/または他の任意の肉食家畜もしくは野生の肉食動物に感染することが可能であり、あるいはイノシシ科動物またはウシなどの食料生産動物に感染することが可能な疾患原因物質である。
本発明の好ましい一態様に従い、パラミクソウイルス科ウイルスは、第1の生物科の動物に感染することが可能な、パラミクソウイルス科ウイルスであり、目的のヌクレオチド配列は、前記第1の生物科の動物に感染することが可能な、疾患原因物質に由来する抗原をコードし、前記疾患原因物質は、好ましくは、前記パラミクソウイルス科ウイルスと異なる。
任意に、第1の生物科の動物に感染することが可能な、前記パラミクソウイルス科ウイルスは、CDVであり、前記第1の生物科の動物に感染することが可能な、前記疾患原因物質が、イヌ科動物パルボウイルス(CPV)であるか、または
任意に、第1の生物科の動物に感染することが可能な、前記パラミクソウイルス科ウイルスは、LPMV(La Piedad Michoacan Mexico virus)ウイルスであり、前記第1の生物科の動物に感染することが可能な、前記疾患原因物質は、ブタインフルエンザウイルス(SwIV)である。
別の好ましい選択肢として、第1の生物科の動物に感染することが可能な、前記パラミクソウイルス科ウイルスは、LPMV(La Piedad Michoacan Mexico virus)ウイルスであり、前記第1の生物科の動物に感染することが可能な、前記疾患原因物質は、ブタ伝染性下痢ウイルス(PEDV)である。
別の好ましい選択肢として、前記目的のヌクレオチド配列は、好ましくは、ブタ伝染性下痢ウイルス(PEDV)に由来する抗原をコードする。
好ましくは、
・前記目的のヌクレオチド配列は、プロトパルボウイルスカプシドタンパク質をコードし、前記プロトパルボウイルスカプシドタンパク質は、好ましくは、肉食動物プロトパルボウイルス1(CPVまたはFPV)カプシドタンパク質、霊長動物プロトパルボウイルス1カプシドタンパク質、齧歯動物プロトパルボウイルス1カプシドタンパク質、齧歯動物プロトパルボウイルス2カプシドタンパク質、有蹄動物パルボウイルス1(PPV)カプシドタンパク質からなる群から選択されるか、または
・前記目的のヌクレオチド配列は、インフルエンザウイルスエンベロープタンパク質をコードし、前記エンベロープタンパク質は、ヘマグルチニンであってもよく、かつ/または前記インフルエンザウイルスは、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、およびC型インフルエンザウイルスからなる群から選択されてもよく、A型インフルエンザウイルスは、好ましくは、インフルエンザウイルスH3N2、H3N1、H1N1、H1N2、H2N1、H2N3、およびH911の群から選択される。
特に、
前記目的のヌクレオチド配列は、イヌパルボウイルス(CPV)VP2タンパク質をコードし、前記CPV VP2タンパク質が、好ましくは、配列番号35の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むか、もしくはこれからなるか;または
前記目的のヌクレオチド配列は、H3亜型ヘマグルチニン(H3)、特に、ブタインフルエンザウイルスのH3をコードし、前記H3が、好ましくは、配列番号36の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、もしくはこれからなる。
より好ましくは、
・前記目的のヌクレオチド配列は、イヌパルボウイルス(CPV)VP2タンパク質をコードし、CPV VP2タンパク質をコードする前記配列は、特に、配列番号15の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるRNA配列からなるか、もしくはこれを含むか;または
・前記目的のヌクレオチド配列は、H3亜型ヘマグルチニン(H3)、好ましくは、ブタインフルエンザウイルスのH3をコードし、H3をコードする前記配列が、好ましくは、配列番号16の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、もしくはこれを含む。
本発明に従う、別の好ましい態様に従い、前記発現カセットは、
・配列番号17もしくは配列番号18の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるRNA配列を有するポリヌクレオチド、または
・配列番号19もしくは配列番号20の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるRNA配列を有するポリヌクレオチド
からなるか、あるいは前記パラミクソウイルス科ウイルスベクターはこれを含む。
好ましくは、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターは、
・配列番号21の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるRNA配列;または
・配列番号22の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列
を含む。
別の好ましい選択肢として、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターは、配列番号41の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列を含む。
・第4のRNA配列の5’末端に隣接する第6のRNA配列であって、配列番号23の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるRNA配列からなるか、もしくはこれを含む第6のRNA配列、および/または
・第5のRNA配列の3’末端に隣接する第7のRNA配列であって、配列番号24の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるRNA配列からなるか、もしくはこれを含む第7のRNA配列
をさらに含む。
好ましくは、前記異種RNA配列の3’方向に配置された遺伝子開始(GS)配列であって、最も好ましくは、CDVのH遺伝子の、外因性3’非コード領域内に組み入れられたGS配列、および/またはCDVのゲノムプロモーターに作動可能に連結されている、
目的の異種RNA配列を含むベクターをさらに提供する。
別の好ましい選択肢として、前記目的の異種RNA配列は、好ましくは、配列番号35の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるCPV VP2タンパク質をコードする。
・好ましくは、CPV VP2タンパク質をコードする、前記目的の異種RNA配列の3’末端に隣接する、CDVのH遺伝子の外因性3’非コード領域、特に、その中に組み入れられたGS配列、および/または
・CDVのゲノムプロモーター
に作動可能に連結されている。
本発明は、本発明の発現カセット、または本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターをコードする核酸分子であって、好ましくはDNA分子であり、好ましくは単離核酸分子である核酸分子をさらに提供する。
加えて、本発明は、本明細書の後出ではまた、「本発明のDNA分子」とも称されるDNA分子であって、
(i)目的のポリペプチドをコードするDNA配列、
(ii)(i)の配列の3’末端に隣接し、配列番号25の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるDNA配列、
(iii)(i)の配列の5’末端に隣接し、配列番号26の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるDNA配列、および
(iv)(iii)の配列の5’末端に隣接し、配列番号27の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるDNA配列
を含む分子を提供する。
(v)(ii)の配列の5’末端に隣接し、配列番号28の配列と少なくとも66%同一であるDNA配列、および/または
(vi)(iv)の配列の3’末端に隣接し、配列番号28の配列と少なくとも66%同一であるDNA配列
をさらに含む。
好ましくは、本発明のDNA分子は、単離DNA分子である。
別の好ましい態様に従い、本発明のDNA分子は、
(vii)(v)の配列の3’末端に隣接する配列番号29の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるDNA配列、および/または
(viii)(vi)の配列の5’末端に隣接する配列番号30の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるDNA配列
をさらに含む。
・(i)の配列は、イヌパルボウイルス(CPV)VP2タンパク質をコードするDNA配列であり、前記配列は、好ましくは、配列番号31の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるDNA配列であるか、または
・(i)の配列は、H3亜型ヘマグルチニン(H3)、好ましくは、ブタインフルエンザウイルスのH3をコードするDNA配列であり、前記配列は、好ましくは、配列番号32の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるDNA配列である。
別の好ましい選択肢として、(i)の配列は、PEDV Sタンパク質をコードするDNA配列であり、前記配列は、好ましくは、配列番号42または配列番号43の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるDNA配列である。
・配列番号33の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるDNA配列、または
・配列番号34の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるDNA配列
を含む。
別の好ましい選択肢として、本発明のDNA分子は、配列番号44の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるDNA配列を含む。
本発明は、
・本発明の発現カセット、
・本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクター、もしくは本明細書で記載される、CDV-CPV二重免疫化のためのベクター、または
・本発明のDNA分子
を含有し、好ましくは、単離哺乳動物宿主細胞である、哺乳動物宿主細胞をさらに提供する。
・本発明の発現カセット、
・本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクター、または
・本発明のDNA分子
も提供する。
加えて、本発明の文脈では、本発明のDNA分子を含み、特に、プラスミドなどのDNAベクターであるDNA構築物が提供される。本発明のDNA分子が挿入されうる、DNAベクターまたはプラスミドは、当業者により認知されているであろう。本明細書で記載されるDNA構築物は、好ましくは、単離DNA構築物である。本明細書で使用される「DNA分子を含むこと」という用語は、特に、「DNA分子の配列を含むこと」という用語と同義であることが理解される。
さらに、本発明は、本明細書で記載されるDNA構築物のRNA転写物であって、好ましくは、単離RNA転写物であるRNA転写物を提供する。
さらに、本発明は、本明細書で言及されるRNA転写物をトランスフェクトされた細胞であって、好ましくは、単離細胞である細胞を提供する。
好ましくは、細胞または哺乳動物宿主細胞は、それぞれ、Vero細胞である。
さらに、本発明の文脈では、異種遺伝子を含有する感染性パラミクソウイルス科ウイルスを調製するための方法、特に、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターを調製するための方法であって、
a.異種RNAポリメラーゼを発現させる宿主細胞を用意するステップ;
b.宿主細胞に、本明細書で記載されるDNA構築物をトランスフェクトし、DNA構築物内に含まれた本発明のDNA分子が、異種RNAポリメラーゼにより転写されるステップ、および
c.細胞により産生されるウイルスを単離するステップ
を含む方法が提供される。
別の態様に従い、本発明は、免疫原性組成物またはワクチンの製造のための、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクター、または本明細書で記載される細胞の使用をさらに提供する。
a.感染性ウイルスおよび/もしくは弱毒化ウイルスであってもよく、または弱毒化ウイルスおよび/もしくは改変生ウイルスであってもよい、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクター、ならびに
b.前記ベクターにより発現される組換えタンパク質、および/または前記ベクターにより発現される複数の組換えタンパク質を含むウイルス様粒子、ならびに
c.任意に、薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤
を含み、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適する、免疫原性組成物も提供する。
好ましくは、ベクターにより発現される前記組換えタンパク質は、
・CPV VP2タンパク質など、パルボウイルスVP2抗原であるか、または
・インフルエンザウイルスエンベロープタンパク質であり、前記エンベロープタンパク質が、H3などのヘマグルチニンであってもよい。
別の好ましい態様に従い、
a.本発明の免疫原性組成物は、CPV VP2タンパク質をコードする、上記で言及されたベクターのうちのいずれかを含むか、またはこれからなり、前記ベクターが、好ましくは、CDVベクター、特に、本発明のCDVベクター、または本明細書で記載される、CDV-CPV二重免疫化のためのベクターであり、
b.本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、配列番号35の配列または配列番号36と、少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドを含むか、またはこれからなり、前記ポリペプチドが、好ましくは、前記ベクターにより発現される組換えタンパク質であり、
c.本発明の免疫原性組成物は、薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤を含むか、またはこれからなってもよく、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適する。
本発明はまた、本明細書の後出ではまた、「本発明のワクチンまたは医薬組成物」とも称される、ワクチンまたは医薬組成物であって、
a.本発明の文脈において、本明細書で記載されるベクターのうちのいずれか、ならびに
b.前記ベクターにより発現される組換えタンパク質、および/または前記ベクターにより発現される複数の組換えタンパク質を含むウイルス様粒子、ならびに
c.薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤
を含み、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適し、
d.前記ワクチンが、アジュバントをさらに含んでもよく、
ベクターにより発現される前記組換えタンパク質が、好ましくは、
・CPV VP2タンパク質など、パルボウイルスVP2抗原であるか、または
・インフルエンザウイルスエンベロープタンパク質であり、前記エンベロープタンパク質が、H3などのヘマグルチニンであってもよい、
ワクチンまたは医薬組成物も提供する。
a.本発明のワクチンまたは医薬組成物は、CPV VP2タンパク質をコードする、上記で言及されたベクターのうちのいずれかまたはインフルエンザウイルスのヘマグルチニンを含むか、またはこれからなり、前記ベクターは、好ましくは、CDVベクター、特に、本発明のCDVベクター、または本明細書で記載される、CDV-CPV二重免疫化のためのベクターであり、
b.本発明のワクチンまたは医薬組成物は、好ましくは、配列番号35の配列または配列番号36と、少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドを含むか、またはこれからなり、前記ポリペプチドが、好ましくは、前記ベクターにより発現される組換えタンパク質であり、
c.本発明のワクチンまたは医薬組成物は、薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤を含むか、またはこれからなり、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適し、
d.本発明のワクチンまたは医薬組成物は、アジュバントを含むか、またはこれからなってもよい。
a.哺乳動物宿主細胞に、本発明の文脈において、本明細書で記載されるベクターのうちのいずれかを感染させるステップ、
b.感染細胞を、適切な条件下で培養するステップ、
c.感染細胞培養物を回収するステップ、
d.任意に、ステップc)の、回収された感染細胞培養物を精製するステップ、
e.任意に、前記回収された感染細胞培養物を、薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含み、
免疫原性組成物またはワクチンが、好ましくは、
・CDVおよびCPVの感染、または
・A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、およびC型インフルエンザウイルスからなる群から選択されてもよく、A型インフルエンザウイルスが、好ましくは、インフルエンザウイルスH3N2、H3N1、H1N1、H1N2、H2N1、H2N3、およびH911の群から選択されるインフルエンザウイルスの感染
と関連するか、またはこれにより引き起こされる、1つまたは複数の臨床徴候の重症度を軽減する免疫原性組成物またはワクチンである
方法をさらに提供する。
・少なくとも1つの病原体の前記感染が、好ましくは、CDVおよび/もしくはCPVの感染であり、前記感染が、最も好ましくは、CDVおよび/もしくはCPVの感染であるか、または
・少なくとも1つの病原体の前記感染が、好ましくは、ブタインフルエンザウイルスの感染であり、ブタインフルエンザウイルスが、H3亜型のインフルエンザウイルスであってもよく、前記H3亜型のインフルエンザウイルスが、好ましくは、H3N2亜型またはH3N1亜型のブタインフルエンザウイルスである
方法における使用のための、
・本発明の免疫原性組成物、または
・本発明のワクチンまたは医薬組成物
にも関する。
別の好ましい選択肢として、少なくとも1つの病原体の前記感染は、PEDVの感染である。
特に、本発明はまた、
動物、好ましくは、イヌ科動物において、CPVおよびCDVに対する免疫応答を誘導するための方法、または
ブタにおいて、ブタインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための方法であって、ブタインフルエンザウイルスが、H3亜型のインフルエンザウイルスであってもよく、前記H3亜型のインフルエンザウイルスが、好ましくは、H3N2亜型またはH3N1亜型のブタインフルエンザウイルスである方法
における使用のための、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチン、または本発明の医薬組成物にも関する。
一態様では、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチン、または本発明の医薬組成物は、子ブタが、免疫原性組成物が投与された雌ブタにより授乳され、前記雌ブタが、特に、前記子ブタを妊娠している間に/妊娠したときに、好ましくは、免疫原性組成物が投与された雌ブタである、子ブタにおける、PEDVの感染により引き起こされる臨床徴候または疾患を軽減または防止する方法における使用のための、免疫原性組成物もしくはワクチン、または医薬組成物である。
本発明の特定の好ましい態様に従い、このような使用において、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチン、または本発明の医薬組成物は、前記雌ブタに投与されるなど、経粘膜投与、好ましくは、鼻腔内投与されるものとする。
本発明は、雌ブタにおける、PEDVに特異的な抗体の産生を誘導するための方法であって、特に、好ましくは、配列番号45の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるPEDV Sタンパク質をコードする、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターを含む、本発明の免疫原性組成物、または本発明のワクチンもしくは医薬組成物を、前記雌ブタに投与するステップを含む方法をさらに提供する。
・特に、好ましくは、配列番号45の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるPEDV Sタンパク質をコードする、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターを含む、本発明の免疫原性組成物、または本発明のワクチンもしくは医薬組成物を、雌ブタに投与するステップ、および
・前記子ブタが、前記雌ブタにより授乳されることを可能とするステップ
を含む方法を提供する。
好ましくは、前記雌ブタは、特に、前記子ブタを妊娠している雌ブタである。
・特に、好ましくは、配列番号45の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるPEDV Sタンパク質をコードする、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターを含む、本発明の免疫原性組成物、または本発明のワクチンもしくは医薬組成物を、前記子ブタを妊娠している雌ブタに投与するステップ、
・前記雌ブタが、前記子ブタを出産することを可能とするステップ、および
・前記子ブタが、前記雌ブタにより授乳されることを可能とするステップ
を含む。
好ましくは、本発明の免疫原性組成物、または本発明のワクチンもしくは医薬組成物は、動物に筋内投与されるか、または鼻腔内投与によるなど、経粘膜投与される。
最も好ましくは、このような、子ブタにおける、PEDVの感染により引き起こされる臨床徴候または疾患を軽減または防止する方法では、前記免疫原性組成物または前記ワクチンまたは医薬組成物は、前記雌ブタに経粘膜投与され、好ましくは、鼻腔内投与される。
a)前記動物にワクチンを投与することが可能なシリンジまたは分注器;および
b)本発明の免疫原性組成物、または本発明のワクチンもしくは医薬組成物、および
c)任意に、指示書の小冊子
を含み、
前記少なくとも1つの病原体が、好ましくは、CDVもしくはCPV、またはSwIVもしくはPEDVであり、前記少なくとも1つの病原体が、最も好ましくは、CDVおよびCPVである、キットも提供する。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、出願時に本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。用語の意味および範囲は、明確なはずであるが、万一、なんらかの潜在的な曖昧さが生じた場合、本明細書で提示される定義が、任意の辞書または外部の定義に対して優先される。さらに、文脈により、そうでないことが要請されない限りにおいて、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は、単数形を含むものとする。本明細書では、そうでないことが言明されない限りにおいて、「または」の使用は、「および/または」を意味する。さらに、「含む(including)」という用語のほか、「含む(includes)」および「含まれる」など、他の形態の使用は、限定的ではない。本明細書で参照される、全ての特許および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
特に、本明細書で使用される「パラミクソウイルス科ウイルス」という用語は、パラミクソウイルス科のウイルスの文脈で、頻繁に使用される「パラミクソウイルス」という用語と同義であることが理解される。
本明細書で使用される「パラミクソウイルス科ウイルスのN遺伝子の5’非コード領域」という用語は、特に、好ましくは、感染性パラミクソウイルス科ウイルスの、発現可能なN遺伝子のRNA配列であって、コード配列の5’末端に隣接し、前記遺伝子の遺伝子(すなわち、終止コドンと相補的なRNAトリプレットの5’末端)配列を含むRNA配列に関する。したがって、より特定すると、本明細書で言及される「5’非コード領域配列」とは、好ましくは、感染性パラミクソウイルス科ウイルスの発現可能なN遺伝子の5’非コード配列の全体と同一なRNA配列である。さらにより特定すると、本明細書で言及される「5’非コード領域配列」とは、パラミクソウイルス科ウイルスのN遺伝子の非コード配列と同一なRNA配列であり、この場合、前記非コード配列は、(a)コード配列と、(b)前記N遺伝子をP遺伝子と接続する遺伝子間配列とにより挟まれる。
本明細書で使用される「遺伝子間領域」という用語は、特に、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子の5’末端を、パラミクソウイルス科ウイルスの5’方向において、隣接する遺伝子の3’始点と接続するRNA配列を指す。
それぞれ、本明細書で使用される「パラミクソウイルス科ウイルスのゲノムプロモーター」という用語は、「パラミクソウイルス科ウイルスのゲノムリーダー配列」という用語と同義であり、「CDVのゲノムプロモーター」という用語は、「CDVのゲノムリーダー配列」という用語と同義であることが理解される。
分子生物学についての定義
本明細書で記載される「~の5’末端に隣接する配列」という語句は、特に、「~の5’末端と共有結合によって連結された配列」という語句、または「その3’末端ヌクレオチドが、~の5’末端ヌクレオチドと共有結合によって連結された配列」という語句のそれぞれと同義であり、この場合、特に、前記2つの末端ヌクレオチドが、ペントースの5’炭素に接合させたリン酸基と、隣接するペントースの3’炭素原子との間で、共有結合によって連結されることが理解される。
本発明の文脈で使用される「Kozak配列」という用語は、特に、リボソームによる翻訳開始部位の認識に参与する、mRNA配列をコードするヌクレオチド配列に関することが理解される。好ましくは、本発明の文脈における、Kozak配列をコードするRNA配列とは、開始コドン(AUG)の5’末端に隣接するRNA分子の配列に転写される可能性があり、翻訳過程の開始において役割を果たすRNA配列である。
ウイルスベクターは、任意の公知の生物のゲノムに由来する配列を組み込みうる。配列は、それらの天然形態で組み込むこともでき、所望の活性を得るように、任意の形で修飾することもできる。例えば、配列は、挿入、欠失、または置換を含みうる。
本明細書で使用される「構築物」という用語は、プラスミド、BAC、または組換えウイルスなど、人工的に作出された組換え核酸を指す。
「プラスミド」という用語は、細菌宿主細胞内の細菌染色体と独立に複製される、細胞質DNAを指す。本発明の具体的態様では、「プラスミド」および/または「導入プラスミド」という用語は、例えば、ウイルスベクターへの挿入のための発現カセットの構築に有用な、組換えDNA技術の要素を指す。別の具体的態様では、「プラスミド」という用語は、DNAワクチン接種の目的に有用なプラスミドを指定するのに使用されうる。
本明細書で使用される「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的であり、任意の核酸を指す。「核酸配列」という用語は、「ヌクレオチド配列」という用語と同義であることが理解される。「ヌクレオチド配列」という用語は、「ポリヌクレオチド配列」という用語と同義であることが理解される。
本明細書で使用される「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「RNA配列」、または「DNA配列」という用語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、ならびにこれらの断片および部分を指し、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す、ゲノムまたは合成由来のDNAまたはRNAを指す。配列は、非コード配列の場合もあり、コード配列の場合もあり、両方の混合物の場合もある。本発明の核酸配列は、当業者に周知の標準的技法を使用して調製することができる。
本明細書で使用される「プロモーター」または「プロモーター配列」という用語は、RNAポリメラーゼの結合を可能とし、遺伝子の転写を方向付けるヌクレオチド配列を意味する。典型的に、プロモーターは、遺伝子の転写開始部位に対して近位である、遺伝子の5’非コード領域内に配置される。転写の開始において機能する、プロモーター内の配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴づけられることが多い。プロモーターの例は、細菌、酵母、植物、ウイルス、および哺乳動物(ウマ、ブタ、ウシ、およびヒトを含む)、鳥類、または昆虫などの動物に由来するプロモーターを含むがこれらに限定されない。プロモーターは、誘導的プロモーターの場合もあり、抑制的プロモーターの場合もあり、かつ/または構成的プロモーターの場合もある。誘導的プロモーターは、温度の変化など、培養条件の何らかの変化に応答して、それらの制御下における、DNAからの転写レベルの上昇を誘発する(Ptashne, 2014)。当業者に周知のプロモーターの例は、例えば、SV40大型Tプロモーター、HCMVおよびMCMVの即初期遺伝子1プロモーター、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイルス多角体プロモーターである。
本明細書で使用される「目的のヌクレオチド配列」という用語は、必ずしも、遺伝子を含まず、遺伝子または他の遺伝情報のエレメントまたは一部、例えば、ori(複製起点)を含みうるので、目的の遺伝子より一般的な用語である。目的のヌクレオチド配列は、コード配列を含むのかどうかに依存しない、任意のDNA配列またはRNA配列でありうる。
「転写」という用語は、細胞内の、mRNAの生合成について記載する。
本明細書で使用される「発現」という用語は、宿主細胞内の核酸配列の転写および/または翻訳を指す。本発明の具体的態様に従い、「発現」という用語は、宿主細胞内の異種核酸配列および/または外因性核酸配列の転写および/または翻訳を指す。宿主細胞内の所望の産物の発現のレベルは、細胞内に存在する、対応するRNAまたはmRNAの量、または選択された配列によりコードされる所望のポリペプチドの量に基づき決定されうる。例えば、選択された配列から転写されるmRNAは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼに対するRNA保護、細胞内RNAに対するin situハイブリダイゼーション、またはRT qPCR(逆転写に続く、定量的PCR)により定量されうる。選択された配列から発現されるタンパク質は、多様な方法により、例えば、ELISAにより、ウェスタンブロット法により、ラジオイムノアッセイにより、免疫沈降により、タンパク質の生物学的活性についてアッセイすることにより、またはタンパク質の免疫染色に続くFACS解析により定量されうる。
「転写調節エレメント」は、通常、発現される遺伝子配列、転写開始部位および転写終結部位、ならびにポリアデニル化シグナルの上流におけるプロモーターを含む。
「転写開始部位」という用語は、一次転写物、すなわち、mRNA前駆体に組み込まれる第1の核酸に対応する、構築物中の核酸を指す。転写開始部位は、プロモーター配列と重複しうる。
「翻訳調節エレメント」は、発現される各個別のポリペプチドのための、翻訳開始部位(AUG)、終止コドン、およびポリAシグナルを含む。一部の構築物には、内部リボソーム侵入部位(IRES)が含まれうる。発現を最適化するために、発現される核酸配列の5’非翻訳領域および/または3’非翻訳領域を除去、添加、または変更して、転写または翻訳のレベルで、発現に干渉する場合もあり、これを低減する場合もある、任意の、潜在的に余剰で不適切な、代替的翻訳開始コドンまたは他の配列を消失させることが推奨されうる。コンセンサスのリボソーム結合部位(Kozak配列)を、開始コドンのすぐ上流に挿入して、翻訳を増強し、したがって、発現を増強することができる。このリボソーム結合部位近傍のA/U含量の増大は、より効率的なリボソーム結合を推し進める。
「組換え」という用語は、本発明についての本明細書を通して、「非自然発生の」、「異種」、および「外因性」という用語と互換的に使用される。したがって、「組換え」タンパク質は、異種ポリヌクレオチド配列または外因性ポリヌクレオチド配列から発現されるタンパク質である。ウイルスに関して使用される組換えという用語は、ウイルスゲノムの人工操作により作製されるウイルスを意味する。外因性抗原をコードする配列など、異種配列または外因性配列を含むウイルスは、組換えウイルスである。組換えウイルスという用語と、非自然発生のウイルスという用語とは、互換的に使用される。
したがって、「異種ベクター」という用語は、異種ポリヌクレオチド配列または外因性ポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。「組換えベクター」という用語は、異種ポリヌクレオチド配列または組換えポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。
特に、本発明の文脈では、「配列と、・・・同一であること」という用語は、「配列と、・・・の配列同一性を有すること」という用語と同義であることが理解される。
本明細書で記載される「少なくとも99%同一であること」という用語はまた(範囲の1つの端点において)、「100%同一であること」または「配列と同一であること」という用語のそれぞれも含み、これらにも関することがさらに理解される。
当業者は、2つの配列の間の相同性を決定するのに、いくつかの、異なるコンピュータプログラムが利用可能である事実を承知しているであろう。例えば、数学的アルゴリズムを使用して、2つの配列の間の、配列の比較および同一性パーセントの決定を達することができる。好ましい実施形態では、2つのアミノ酸配列または核酸配列の間の同一性パーセントは、Blosum 62マトリックスまたはPAM250マトリックス、ならびに16、14、12、10、8、6、または4のギャップ重み、および1、2、3、4、5、または6の長さ重みを使用する、Accelrys GCGソフトウェアパッケージ(http://www.accelrys.com/products/gcg/において入手可能である)内のGAPプログラムに組み込まれた、NeedlemanおよびWunsch(J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970))によるアルゴリズムを使用して決定される。当業者は、全てのこれらの異なるパラメータは、異なる結果をもたらすが、異なるアルゴリズムを使用しても、2つの配列の、全体的な同一性百分率は、著明に変更されないことを察知するであろう。
「免疫原性組成物または免疫学的組成物」とは、少なくとも1つの抗原またはこの免疫原性部分を含み、宿主において、組成物に対する、細胞性免疫応答または抗体媒介性免疫応答である、免疫応答を誘発する組成物を指す。
当技術分野では、本明細書で使用される「抗原」という用語が十分に理解されており、免疫原性である物質、すなわち、免疫原のほか、免疫学的非応答性、またはアネルギー、すなわち、外来物質に対する生体の防御機構による反応の欠如を誘導する物質を含む。本明細書で使用される「抗原」という用語は、全長タンパク質のほか、エピトープを含有するか、またはこれを含む、そのペプチド断片を意味することが意図される。
「DNAワクチン接種」または「ポリヌクレオチドワクチン接種」という用語は、適切な医薬組成物を使用する、遺伝子素材の直接的接種を意味する。
当技術分野では、多様な物理的不活化法および化学的不活化法が公知である。「不活化させた」という用語は、その免疫原性を保持しながら、このようなウイルスまたは細菌を不活化さまたは死滅させるように、照射される(紫外線(UV)、X線、電子ビーム、またはガンマ放射線)か、加熱されるか、または化学的に処理された、かつて毒性または非毒性であった、ウイルスまたは細菌を指す。適切な不活化剤は、ベータ-プロピオラクトン、二元エチレンイミンまたはベータ-エチレンイミンまたはアセチルエチレンイミン、グルタルアルデヒド、オゾン、およびホルマリン(ホルムアルデヒド)を含む。
より特定すると、ウイルスの文脈における、「不活化させた」という用語は、in vivoまたはin vitroのそれぞれにおいて、ウイルスが、複製が不可能であることを意味し、細菌の文脈における、「不活化させた」という用語は、in vivoまたはin vitroにおいて、細菌が、生殖が不可能であることを意味する。例えば、「不活化させた」という用語は、in vitroにおいて繁殖させ、次いで、複製することがもはや可能とならないように、化学的手段または物理的手段を使用して不活化させたウイルスを指す場合がある。別の例では、「不活化させた」という用語は、繁殖させ、次いで、化学的手段または物理的手段を使用して不活化させる結果として、細菌の懸濁液、細菌の断片、またはワクチンの成分として使用されうる、バクテリンなど、細菌の成分をもたらす細菌を指す場合がある。
「生ワクチン」という用語は、生存する生物または複製コンピテントウイルスまたはウイルスベクターを含むワクチンを指す。
「医薬組成物」は、それが投与される生物、または生物内もしくは生物表面に生存する生物の生理的機能、例えば、免疫機能を改変することが可能な、1つまたは複数の成分から本質的になる。用語は、抗生剤または駆虫剤のほか、プロセシング特徴、滅菌性、安定性、経口経路、鼻腔内経路、静脈内経路、筋内経路、皮下経路、皮内経路、もしくは他の適切な経路など、腸内経路もしくは非経口経路を介して組成物を投与する実現可能性、投与後の忍容性、または制御放出特性などであるがこれらに限定されない、ある特定の他の目的を達成するのに一般に使用される、他の構成要素を含むがこれらに限定されない。実演だけを目的として示される、このような医薬組成物の非限定的な一例は、以下の通りに調製されうるであろう:感染細胞培養物の細胞培養物上清を、安定化剤(例えば、スペルミジンおよび/またはウシ血清アルブミン(BSA))と混合し、その後、混合物を、他の方法により凍結乾燥または脱水させる。次いで、ワクチン接種の前に、混合物を、水溶液(例えば、生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液(PBS))中で再水和させるか、または非水溶液(例えば、油エマルジョン、アルミニウムベースのアジュバント)中で再溶媒和させた。
アジュバントは、投与1回当たり約100μg~約10mgの量、好ましくは、投与1回当たり約100μg~約10mgの量、より好ましくは、投与1回当たり約500μg~約5mgの量、なおより好ましくは、投与1回当たり約750μg~約2.5mgの量で添加することができ、最も好ましくは、投与1回当たり約1mgの量で添加しうることが予測される。代替的に、アジュバントは、最終生成物の容量で、約0.01%~50%の濃度、好ましくは、約2%~30%の濃度、より好ましくは、約5%~25%の濃度、さらにより好ましくは、約7%~22%の濃度であることが可能であり、最も好ましくは、10%~20%の濃度でありうる。
「単離された」とは、「人為により」、その天然の状態から変更されたことを意味する、すなわち、「単離される」ことが、天然において生じる場合、「単離された」ものは、その元の環境から変化しているか、もしくは取り出されているか、またはこれらの両方である。例えば、この用語が、本明細書で援用される通り、生存する生物において、天然で存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、その天然状態の共存材料から分離された、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いる。
本明細書で使用される「有効量」という用語は、組成物の文脈では、動物における感染または疾患の事象の発生率を低減するか、または重症度を軽減する、免疫応答を誘導することが可能な、免疫原性組成物の量を意味する。特に、有効量は、投与1回当たりのコロニー形成単位(CFU)を指す。代替的に、治療の文脈では、「有効量」という用語は、疾患もしくは障害、またはこれらの1つもしくは複数の症状の重症度または持続時間を軽減または短縮するか、疾患または障害の進行を防止するか、疾患または障害の退縮を引き起こすか、疾患または障害と関連する、1つまたは複数の症状の再発、発生、発症、または進行を防止するか、あるいは別の治療または治療剤による予防または処置を増強または改善するのに十分な治療の量を指す。
「疾患に対する防御」、「防御性免疫」、「機能的免疫」、「臨床症状の軽減」、「中和抗体および/またはセロコンバージョンの誘導/産生」、および同様の語句は、疾患または感染に曝露された、非免疫化対象において予測されるより、わずかな有害作用を結果としてもたらす、1つまたは複数の、本発明の治療用組成物またはこの組合せの投与により作り出される、疾患または状態に対する部分的または完全な応答を意味する。すなわち、ワクチン接種された対象では、感染の有害作用の重症度が低下する。ワクチン接種された対象では、感染は、軽減される場合もあり、緩徐化される場合もあり、おそらくは、完全に防止される場合もある。本明細書では、感染の完全な防止が意図される場合、それが具体的に言明される。完全な防止が言明されない場合、用語は、部分的防止を含む。
本明細書で互換的に使用される、「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、全抗体、およびこの任意の抗原結合性断片(抗原結合性部分)または単鎖コグネートを含む。「抗体」は、少なくとも1つの重(H)鎖および1つの軽(L)鎖を含む。例えば、自然発生のIgGでは、これらの重鎖および軽鎖は、ジスルフィド結合により相互接続され、これらの2つもまた、ジスルフィド結合により相互接続された、2つの対合した重鎖および軽鎖が存在する。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書では、VHと略記される)と、重鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域は、3つのドメインである、CH1、CH2、およびCH3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書では、VLと略記される)と、軽鎖定常領域とから構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメインである、CLを含む。VH領域およびVL領域は、フレームワーク領域(FR)または接合(J)領域(重鎖内および軽鎖内の、それぞれ、JHまたはJL)と称する、より保存的な領域を散在させた、相補性決定領域(CDR)と称する、超可変性の領域にさらに細分されうる。各VHおよびVLは、アミノ末端から、カルボキシ末端に、以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、Jで配置された、3つのCDR、3つのFR、およびJドメインから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と結合する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の多様な細胞(例えば、エフェクター細胞)または古典的補体系の第1成分(Clq)などの体液因子を含む、宿主組織または因子への結合を媒介しうる。
ウイルスにより誘導される「ウイルス血の低減」という用語は、動物の血流に侵入するウイルスの低減であって、ウイルス血レベル、すなわち、血清1mL当たりのウイルスDNAコピーもしくはRNAコピーの数、または血清1デシリットル当たりのプラーク形成コロニーの数が、本発明の組成物を施される動物の血清中で、組成物を施されず、感染しうる動物と比較して、少なくとも50%低減される低減を意味するがこれらに限定されない。より好ましくは、ウイルス血レベルは、本発明の組成物を施される動物において、少なくとも90%、好ましくは、少なくとも99.9%、より好ましくは、少なくとも99.99%低減され、なおより好ましくは、少なくとも99.999%低減される。
本明細書で使用される「ウイルス血」という用語は、特に、動物、特に、哺乳動物、鳥類、または昆虫の血流中で、ウイルス粒子が、再生され、かつ/または循環する状態として理解される。
本明細書で使用される「ワクチン接種」または「ワクチン接種すること」という用語、またはこれらの変化形は、動物に投与されると、前記動物において、免疫応答を誘発する(直接的に、または間接的に)か、またはこれを誘発することが可能な、本発明の免疫原性組成物の投与を含む工程を意味するがこれらに限定されない。
本発明の文脈における「死亡率」とは、感染により引き起こされる死亡を指し、感染が、極めて重度であるため、動物を安楽死させて、苦痛を防止し、その生涯に人道的な終わりをもたらす状況を含む。
組成物が投与される対象は、好ましくは、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽(例えば、ニワトリ)、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウス、およびラットを含むがこれらに限定されない動物であり、最も好ましくは、哺乳動物は、イノシシ科動物である。
本発明の製剤は、有効免疫化量の、1つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容される媒体を含む。媒体は、有効免疫化量の、1つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容される媒体を含む。製剤は、投与方式に適するものとする。
免疫原性組成物は、所望の場合、少量の保湿剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤もまた含有する。免疫原性組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、持続放出製剤、または粉剤でありうる。経口製剤は、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体を含みうる。
好ましい投与経路は、鼻腔内経路、経口経路、皮内経路、および筋内経路を含むがこれらに限定されない。最も好ましくは、単回投与の飲用水中の投与が、所望である。当業者は、本発明の組成物はまた、1、2回、またはこれを超える投与によっても投与されうるほか、他の投与経路によっても投与されうることを認識するであろう。例えば、このような他の経路は、皮下経路、皮内経路、腹腔内経路、皮内経路を含み、所望される処置の持続時間および有効性に応じて、本発明に従う組成物は、1回または数回にわたり投与される場合もあり、また、間欠的に、例えば、数日間、数週間、または数カ月間にわたり、毎日のベースで投与される場合もあり、約103~10TCID50(上記のウイルス力価を参照されたい)など、異なる投与量で投与される場合もある。本発明の具体的態様では、投与量は、とりわけ、生ウイルス/生ワクチンについて、約103~108TCID50である。
組成物は、所望の場合、有効成分を含有する、1つまたは複数の単位剤形を含有しうる、パックまたは分注器により提示されうる。パックは、例えば、金属ホイルまたはブリスターパックなど、プラスチックホイルを含みうる。パックまたは分注器は、投与、好ましくは、哺乳動物、とりわけ、ブタへの投与のための指示書を伴いうる。このような容器には、医薬または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により規定された形態における注意書きであって、ヒト投与のための製造、使用、または販売についての機関による承認を反映する注意書きが付随しうる。
以下の配列は、本明細書で詳述および開示される、本発明における配列であり、配列表内の配列は、左から右に、5’末端から3’末端の方向で提示される:
配列番号1(RNA)は、CDVのN遺伝子の5’非コード領域に対応し、
配列番号2(RNA)は、CDVのP遺伝子の5’非コード領域に対応し、
配列番号3(RNA)は、CDVのM遺伝子の5’非コード領域に対応し、
配列番号4(RNA)は、CDVのF遺伝子の5’非コード領域に対応し、
配列番号5(RNA)は、CDVのH遺伝子の5’非コード領域に対応し、
配列番号6(RNA)は、CDVのL遺伝子の5’非コード領域に対応し、
配列番号7(RNA)は、CDVのH遺伝子の3’非コード領域に対応し、
配列番号8(RNA)は、CDVのN遺伝子の3’非コード領域に対応し、
配列番号9(RNA)は、CDVのP遺伝子の3’非コード領域に対応し、
配列番号10(RNA)は、CDVのM遺伝子の3’非コード領域に対応し、
配列番号11(RNA)は、CDVのF遺伝子の3’非コード領域に対応し、
配列番号13(RNA)は、Kozak配列をコードする配列に対応し、
配列番号14(RNA)は、CDVの遺伝子間配列に対応し、
配列番号15(RNA)は、CPVのVP2タンパク質をコードする配列に対応し、
配列番号16(RNA)は、H3亜型ヘマグルチニンをコードする配列に対応し、
配列番号17(RNA)は、配列番号14、1、15、13、および7の組合せに対応し、
配列番号18(RNA)は、配列番号1、15、13、7、および14の組合せに対応し、
配列番号19(RNA)は、配列番号14、1、16、13、および7の組合せに対応し、
配列番号20(RNA)は、配列番号1、16、13、7、および14の組合せに対応し、
配列番号21(RNA)は、配列番号14、1、15、13、7、および14の組合せに対応し、
配列番号22(RNA)は、配列番号14、1、16、13、7、および14の組合せに対応し、
配列番号24(RNA)は、CDVのNおよびP遺伝子を含む配列に対応し、
配列番号25は、配列番号1のDNA逆相補体に対応し、
配列番号26は、配列番号13のDNA逆相補体に対応し、
配列番号27は、配列番号7のDNA逆相補体に対応し、
配列番号28は、配列番号14のDNA逆相補体に対応し、
配列番号29は、配列番号23のDNA逆相補体に対応し、
配列番号30は、配列番号24のDNA逆相補体に対応し、
配列番号31は、配列番号15のDNA逆相補体に対応し、
配列番号32は、配列番号16のDNA逆相補体に対応し、
配列番号33は、配列番号21のDNA逆相補体に対応し、
配列番号34は、配列番号22のDNA逆相補体に対応し、
配列番号35は、CPV VP2のアミノ酸配列に対応し、
配列番号36は、H3亜型ヘマグルチニンのアミノ酸配列に対応し、
配列番号37(RNA)は、PEDV Sタンパク質をコードする配列に対応し、
配列番号38(RNA)は、PEDV Sタンパク質をコードする配列に対応し、
配列番号39(RNA)は、配列番号14、1、38、13、および7の組合せに対応し、
配列番号40(RNA)は、配列番号1、38、13、7、および14の組合せに対応し、
配列番号41(RNA)は、配列番号14、1、38、13、7、および14の組合せに対応し、
配列番号42は、配列番号37のDNA逆相補体に対応し、
配列番号43は、配列番号38のDNA逆相補体に対応し、
配列番号44は、配列番号41のDNA逆相補体に対応し、
配列番号45は、PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列に対応する。
A)CDVベクターによる、CPV-VP2の発現
P遺伝子とM遺伝子との間(したがって、配列番号21の配列を含むベクター)に、配列番号17の配列を挿入した、Lederleワクチン株に由来するCDV骨格を使用するin vitro研究において、イヌパルボウイルス(2b型)VP2タンパク質の細胞内発現を、CDVと関連する蛍光焦点において示すことが可能であった。それぞれの結果はまた、2c型イヌパルボウイルス(CPV-2c)VP2タンパク質をコードする、対応するCDVベクター(すなわち、CPV VP2をコードする配列だけが異なる)についても達成された。免疫蛍光法により、両方のベクターについて得られた結果は、全てのCDVを感染させた合胞体内の、CPVのVP2タンパク質の強い発現を指し示す。VP2は、CDV抗原とは対照的に、感染細胞の核内に蓄積し、部分的に、感染細胞の細胞質内に蓄積し、これは、合胞体発生の経過中に変動したが、推定核局在化配列は、VP2遺伝子内の規定の探索によって検出されてもおらず、学術文献により公表されてもいないが、CPV-VP2が、一過性の核トラフィッキングを示すことを指し示しうるであろう。
実施例1A)の、両方のCDVベクターを、Vero細胞系(すなわち、CDV産生細胞系)内の、各継代の終了時において、凍結融解サイクルを伴う、連続継代により査定した。組換体の遺伝子の安定性を評価するために、Vero細胞上における、連続20代の細胞継代を実施した。組換えクローンのシーケンシングは、挿入されるCPV VP2配列およびフランキング領域の遺伝子安定性を明らかにした。両方のタンパク質をコードする配列(突然変異を含む)(アミノ酸レベルにおける)は、不変を維持した。加えて、免疫蛍光法(IF)およびウェスタンブロット法(WB)を使用して、全ての継代レベルにおいて、CDV-VP2組換体を感染させた細胞内に、強いVP2発現が存在することを裏付けることが可能であった。
実施例1A)およびB)において記載した、両方のCDVベクターを、Vero細胞内で増殖させた。ローラーボトルシステムにおける、両方の組換体のピーク力価は、感染の144時間後において達成され、力価は、凍結/融解サイクルの後で、劇的に上昇したことから、細胞内のウイルスの会合(親CDVウイルスと同様の)が指し示される。古典的な親CDV-MLVと比較して、作出されたCDV組換えワクチン候補物質は、バイオプロセシングに許容可能な、極めて近似する終点力価を有する。
結論として述べると、いずれのCDVベクターも、Vero細胞内で産生させたところ、良好な増殖動態を示し、ローラーボトル内の感染の6日後において、ピーク力価に達した。いずれのベクターも、IFおよびWBにより決定される通り、それらを二重CDV-CPVワクチン候補物質として適格とする、トランス遺伝子(VP2)の強い発現特徴を示した。加えて、いずれのウイルスも、Vero細胞上の、20代の細胞継代にわたり、遺伝子の安定性について調べた。いずれのウイルスも、遺伝的安定性を維持したことから、ワクチンのためのバイオプロセシングに対して受容性であることが指し示される。
イノシシ科動物のin vivoにおける有効性研究:
この実験の目的で、研究0日目(SD)において、6匹の子ブタの群に、実施例1のCPV-2b VP2(CDV-VP2-2b)をコードする、1×105 TCID50の組換えCDVベクターをワクチン接種し、SD21において、2×104 TCID50を追加投与した。両方の適用は、頸部の筋内(IM)において実施した(投与1回当たり2mLの容量)。
4匹の動物は、陰性対照として用いられ、Vero細胞のホモジネート(2mL)を、頸部に接種された。3匹の動物は、歩哨動物として用いられ、処置を施されなかった。
組入れ基準:
・臨床的に健康であり、生後齢に応じて正常に発育したブタ
除外基準:
・試験責任医師または指定代行者により、研究に干渉すると評価された、損傷、先天性異常、または疾患の臨床徴候を伴うブタ
・身体状態が弱った(体重が<5kgの)ブタ
飼育室は、生物安全性の理由で、陰圧(-75Pa)下に置いた。飼育室温度は、動物の生後齢の要請に従った。換気回数は、1時間あたり約9回であった。動物は、12時間にわたる、>80ルクスの明期と、12時間にわたる暗期とを過ごした。動物のための環境強化が施された。適切な品質の不断給水および不断給餌が可能であり、それらの生後齢におけるブタの要請、および標準的手順に従い管理した。
さらに、血清ウイルス中和試験を実施して、被験動物におけるCDVおよびCPVのそれぞれに対する中和抗体を測定した。
以下に、CDVについての血清中和試験のプロトコールを示す:
中和試験の1日前における細胞の調製
・コンフルエンシーの大きなVero細胞をトリプシン化し、それらを、5%FCSを含有する、適切な容量のMEMアール培地中に再懸濁させる
・懸濁液中の細胞をカウントし、96ウェルプレート1枚10mL当たりの細胞7×105個に調整する
・1枚のプレートは、試料4例に十分である。
・ウェル1つ当たりの細胞懸濁液100μLを、96ウェルプレートの全てのウェルに播種する
・プレートを、37℃のCO2インキュベーター内で、16~24時間にわたりインキュベートする
・試料を、滅菌PBSで、1:4に前希釈する
・前希釈された血清を、56℃で、30分間にわたり不活化する
・1%の100倍濃度Pen/Strepを補充したMEMアール培地60μLを、空の96ウェルプレートの、1~11列目の各ウェルに添加する
・1%の100倍濃度Pen/Strepを補充した、さらなるMEMアール培地36μLを、1列目(A1~H1)に添加する
・熱不活化させた血清試料24μLを、1列目に添加する(1:5の希釈率に対応する)(各血清試料について、24μLずつを、1列目の3つのウェルに添加して、血清について、三連で調べる)
・60μLを、列から列に移すことにより、血清の、2倍の系列希釈を実施する
・11列目まで繰り返す(1:5120の希釈率に対応する)
・最後の列から、60μLを廃棄する
CDVウイルスの希釈
・CDVウイルスを、1%の100倍濃度Pen/Strepを補充した、MEMアール培地中、100μL当たり200 TCID50に希釈し、96ウェルプレート1枚当たり6mLを計算する。
血清試料の、CDVウイルスを伴うインキュベーション
・希釈されたウイルス60μLを、血清希釈液を含有する96ウェルプレートの1~11列目の全てのウェルに添加する。11列目におけるウイルスの添加を開始する。
・プレートを静かに攪拌し、37℃、5%CO2で、2時間にわたりインキュベートする
血清試料±CDVウイルスの、v.d.s細胞上のインキュベーション
・培地60μLを、96ウェルプレート内の、1日齢のv.d.s細胞から除去する
・2時間にわたるインキュベーション時間が完了した後で、各ウェル100μLずつを、血清ウイルス混合物から、1~11列目のv.d.s細胞プレートの対応するウェルに移す
・1%の100倍濃度Pen/Strepを含有するMEMアール培地100μLを、12列目の全てのウェル(=細胞だけの対照)に添加する
・プレートを、37℃、5%CO2で、3日間にわたりインキュベートする
・光学顕微鏡により、ウイルス誘導性の細胞変性作用を観察しながら、結果を読み取る
重要なことは、全ての歩哨動物が、研究の終了時まで、CDVおよびCPVについて、血清陰性を維持したことであり、ここから、ワクチン接種時に、組換えCDVウイルスが、ワクチン接種された動物から、ワクチン接種されなかった動物に伝播しなかったことが指し示される。
H3N2-MDA陽性子ブタにおける免疫原性:
本研究では、SwIVのH3をコードするCDVベクターをワクチン接種された、ブタインフルエンザ母体由来抗体(MDA)陽性動物の体液性免疫応答および細胞性免疫応答について探索するために、ヘマグルチニン(HA)特異的IgG ELISAアッセイおよびIFNγ-ELISpotアッセイを援用した。
動物へのワクチン接種は、実施例2に従い実施したが、CDV骨格内に組み入れられたインサートが、配列番号19の配列を有し(したがって、ベクターは、SwIVのH3をコードする、配列番号22の配列を含み)、ベクター(以下では、CDV-H3と名指される)を、H3N2-MDA陽性(MDA+動物)である、5匹の子ブタに投与したところ、1匹の子ブタが、(ほぼ)H3N2血清陰性である(または、それぞれ、低MDAを有する)と考えられ、3匹の子ブタが、陰性対照として用いられた点で異なった。
以下に、使用されるELISAのプロトコールを提示する:
平底96ウェルプレート(Nunc MaxiSorp;型番:44-2404-21)を、炭酸緩衝液、pH9.6中に、1μg/mLの組換えインフルエンザヘマグルチニンタンパク質(Tr酵素)により、4℃で、一晩にわたりコーティングする。翌日、コーティング抗原を廃棄し、プレートを、洗浄緩衝液で、5回にわたり洗浄し(50mMのトリス/0.14MのNaCl/0.05%のTween20、pH8.0)、その後、ウェル1つ当たりのブロッキング緩衝液(50mMのトリス/0.14MのNaCl/1%のBSA、pH8.0)200μLと共に、飼育室温度で、1時間にわたりインキュベートする。試料希釈液は、試料/コンジュゲート希釈液(50mMのトリス/0.14MのNaCl/0.05%のTween20/1%のBSA)中で調製する。次いで、ウェル1つ当たり100μlの試料および対照(二連の)を、指定のウェルに分注し、カバーを掛けたプレートを、RTで、1時間にわたりインキュベートする。プレートを、洗浄緩衝液で、5回にわたり洗浄する。その後、1:100.00に希釈されたHRPコンジュゲートヤギ抗ブタIgG-H+L検出抗体(Southern Biotech、型番:6050-05)100μlを、各ウェルに添加し、カバーを掛けたプレートを、暗所、RTで、1時間にわたりインキュベートする。洗浄ステップ(洗浄緩衝液により、5回にわたる)の後、ウェル1つ当たり100μlのTMB基質溶液(POD;使用準備ができた;Sigma;型番:T4444)を、添加し、プレートを、暗所、RTで、5~15分間にわたりインキュベートする。反応は、ウェル1つ当たり50μlの停止溶液(2Nの硫酸)を添加することにより停止させ、450nmのELISAリーダー(Synergy 2、Biotek)で、吸光度を測定する。
加えて、ELISPOTを使用して、CDV-H3ワクチン接種動物による細胞性免疫応答を測定した。
以下に、使用されたELISpotアッセイのプロトコールを提示する:
ELISpotプレート(96ウェル)を、精製抗IFN-γ抗体で、少なくとも12時間にわたりコーティングする。PBMCを融解させ、PBS(カルシウムなし、マグネシウムなし)中で、2回にわたり洗浄し、トリパンブルーを使用してカウントし、ウェル1つ当たりの細胞3×105個に分注するように、RPMI培地中で調整した。コーティング抗体を含有するプレートの、PBSによる十分な洗浄の後、プレートを、少なくとも、37℃および5%CO2で、1時間にわたりブロッキングする。3μg/mlのポリクローナル活性化因子であるConA(IFNγ放出の陽性対照)を含有するか、または異なる濃度の抗原を伴う細胞培養物培地を添加するのに続き、PBMCを播種する。培地だけまたは非刺激細胞を含有するウェルは、陰性対照として用いられる。48時間にわたる刺激の後、プレートを、最初の2時間にわたり、水で、次いで、PBS/0.01%のTween20で洗浄する。検出用ビオチニル化抗IFNγ抗体を使用して、プレートを、室温で、1.5時間にわたりインキュベートし、PBS/0.01%のTween20/0.1%のBSA中で希釈する。その後、PBS/0.01%のTween20/0.1%のBSA中で希釈された、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ酵素を、プレート(暗所で、45分間にわたりインキュベーション)に添加する。最後に、NBTおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイルホスフェートを、アルカリホスファターゼの基質として使用する(現像相もまた、暗所で行う)。これらの基質系は、色が青~紫であり、プレートリーダーで測定されうる、不溶性のNBTジホルマザン終末産物をもたらす。流水の水道水による十分な洗浄の後、プレートを、一晩にわたり放置して、完全な乾燥を確保する。C.T.L.ELISpotリーダーを使用して、スポットカウンティングを実施する。
ワクチン有効性研究
ブタ伝染性下痢(PED)は、おびただしい経済的影響を及ぼしうる、高度に接触伝染性のイノシシ科動物疾患である。全ての生後齢クラスのブタが、易感染性であるが、重度の臨床徴候および死亡率は、主に、哺乳期子ブタにおいて見られる。原因物質は、コロナウイルス科(Coronaviridae)内のアルファコロナウイルス(Alphacoronavirus)属の、エンベロープのある、一本鎖でプラス鎖のRNAウイルスである、PEDウイルス(PEDV)である。欧州では、PEDVは、1970年代後半に、英国で、最初に発生した。その後、PEDVは、全欧州中に広がり、散発的な流行を引き起こしている。1990年代後半に、PEDVは、極めて低度の血清有病率および疾患報告の非存在により証拠立てられている通り、欧州の養豚場から消滅した。疾患が、産業化された養豚場の生産性に対して、大きな影響を及ぼすアジアからは、流行および地域感染が、依然として報告された。2005年以後、欧州、すなわち、イタリアから、再びPED症例が報告された。2013年における、見かけ上高毒性のPEDVの、米国への導入の後、ドイツおよび近隣諸国を含む、中欧からもまた、症例が報告された。後者の症例は、類縁であるが、顕著に異なるPEDV株(いわゆる、S-INDEL株)により引き起こされた。ドイツでは、2014年5月から、哺乳期ブタにおいて、高罹患率および可変的な死亡率を伴う症例が報告された。
全ての動物を、S遺伝子をターゲティングするRT-qPCRにより、PEDVについて点検し、PEDV特異的抗体についても点検した。陰性動物だけを、研究に登録した。
3つの処置群(下記を参照されたい)は、無作為に割り付けられた動物を受け入れた:
・群1(陰性対照):2匹の雌ブタ(雌ブタ1および雌ブタ2と称する)、非ワクチン接種
・群2(陽性対照):2匹の雌ブタ(雌ブタ3および雌ブタ4と称する)、非ワクチン接種
・群3(CDV_PEDV-スパイク):2匹の雌ブタ(雌ブタ5および雌ブタ6と称する)、CDV_PEDV-スパイクベクターワクチンをワクチン接種された
分娩予定日の9週間前:2匹の雌ブタの各々は、4mlのワクチンを鼻腔内に施される(各鼻腔内に2mlずつ);
分娩予定日の6週間前:2匹の雌ブタの各々は、4mlのワクチンを鼻腔内に施される(各鼻腔内に2mlずつ);
分娩予定日の3週間前:2匹の雌ブタの各々は、4mlのそれぞれのワクチンを鼻腔内に施され(各鼻腔内に2mlずつ)、加えて、2mlを、筋内に施される。
群1の雌ブタに生まれた子ブタ(雌ブタ1の13匹の子ブタおよび雌ブタ2の12匹の子ブタ)に、経口モック接種した。生後4日齢において、群2(雌ブタ3の12匹の子ブタおよび雌ブタ4の14匹の子ブタ)、および群3(雌ブタ5の5匹の子ブタおよび雌ブタ6の15匹の子ブタ)の雌ブタに生まれた子ブタに、PEDV野外株(本明細書の後出では、「PEDV EU」と名指される)を、経口抗原投与した。
2mlのシリンジ内の細胞培養物培地1mlを使用して、群1の子ブタに、経口モック接種した。
RT-qPCR解析のために、全試験期間中に、全ての動物の、接種日、および接種後(pi)1~10日目のほか、接種後14、17、および20/21日目に、直腸内スワブ(COPAN製の、培地を伴わない単純スワブ)を採取した。細菌学的検討のために、さらなる直腸内スワブを、各雌ブタの、4匹ずつの子ブタから、接種前、抗原投与の2日後に採取した。さらに、確立された、標準化されたスコアシステム(下記を参照されたい)を使用して、PEDを示す臨床徴候を、毎日記録した。血液試料は、接種日、ならびに接種後14および20/21日目(試験の終了時)、またはそれぞれの動物の安楽死もしくは死の日に採取した。
直腸内スワブを、1mlのダルベッコ改変イーグル培地中に浸漬し、室温で、1時間にわたりインキュベートした。KingFisher抽出プラットフォームと組み合わせた、QIAmp ViralRNA Mini Kit(Qiagen)またはNucleoMagVet-Kitを使用して、ウイルスRNAを抽出した。RNAは、さらなる使用まで、-20℃で保管した。
血液試料を、室温、2031×gで、20分間にわたり遠心分離して、血清を得た。結果として得られる血清をアリコート分割し、-20℃で保管した。
PEDVの排出を検出するために、既に記載されている(Stadler et al., BMC Vet Res. 11:142 (2015))、PEDVのS遺伝子をターゲティングするRT-qPCRシステムを使用した。接種後0~7日目、および接種後10および20/21日目において採取された試料を、PEDV-ゲノムについて調べた。社内標準物質を使用して、1μl当たりのゲノムコピー量を計算した。
抗体の検出
製造元のマニュアルに従い、全ての血清により、市販の間接的ELISA(INgezim PEDV、INGENASA、Madrid、Spain)を実施した。
細菌学
示差的細菌学のために、同腹仔当たり、4匹ずつの子ブタの糞便スワブを、接種後0および2日目において採取した。
統計学
正規性検定のために、シャピロ-ウィルク検定を使用し、ソフトウェアパッケージ内で実行される通りにマン-ホイットニー順位和検定を行った。SigmaPlotソフトウェアを使用して、統計学的有意性を調べた。
血清中の抗体の検出:
CDV群の全ての子ブタが、抗体陽性の初乳摂取に起因して、抗原投与による接種の前のELISA(抗体に対するPEDVスパイクタンパク質を検出する)において、陽性結果を示したのに対し、陽性対照群および陰性対照群の全ての動物は、明らかに、陰性の結果を示した。
接種後14日目に、陽性対照群内の、3匹を除く全ての子ブタが、セロコンバージョンを示したのに対し、ワクチン群内の全ての動物は、血清試料中に、依然として高量のPEDV特異的IgGを示した。
研究の終了時に、CDV群および陽性対照群の全ての子ブタは、ELISAにおいて、強い陽性結果を示した。陰性対照の動物はいずれも、全試験期間中に、セロコンバージョンを示さなかった。
さらなる研究において、母雌ブタだけが、鼻腔内経路を介して、2回にわたりワクチン接種される場合も同様にまた、それぞれの抗体結果が達成されることが見られた。
接種後0および2日目に採取された糞便スワブは、病原性細菌を示さなかった。細菌フローラは、感染時に、著明な変化を受けなかった。
臨床徴候:
陽性対照群(群2)の子ブタは明らかに、PEDVを示す臨床徴候であって、接種の24時間後における嘔吐に続く下痢の臨床徴候を、7日間にわたり示した。26匹中8匹の子ブタは、重度の脱水および6を超える臨床スコア値(人道的エンドポイント)に起因して、安楽死させなければならなかった。PEDVを示す、最初の臨床徴候は、接種の36時間後において、検出可能であった。
総じて、CDVベクターをワクチン接種され、PEDVを抗原投与された子ブタ(群3)の臨床徴候は、一般的な挙動に関して良好であり、群3のブタで、重度の脱水および6を超える臨床スコア値に起因して安楽死させなければならなかったのは、20匹中2匹(10%)だけであった(群2の子ブタのうちの31%と比較して)。
陰性対照の動物は、全試験期間中において、健康を維持した。
抗原投与群の間では、ウイルス排出の明らかな差違を検出することができた。接種後1日目において、全ての抗原投与子ブタは、直腸内スワブにおけるウイルスゲノムについて陽性であったが、CDV-PEDVワクチン接種群内の動物は、抗原投与群内の動物(平均値CT値:26.65)より、著明に少数のPEDVゲノムコピー数(平均値CT値:32.79)を示した。
また、接種後次の5日間にわたり、CDV群の直腸内スワブ内のゲノム負荷は、陽性対照と、極めて同様であったが、接種後7日目以後、ワクチン接種された雌ブタにより保護された子ブタでは、検出可能なウイルスゲノムの量が、カットオフレベルを下回って低下したのに対し、陽性対照群内の全ての動物は、依然としてPEDVを排出した。
陰性対照群のスワブでは、PEDVゲノムを検出することができなかった。
結論として述べると、研究の転帰は、CDV PEDV-スパイク組換えワクチンをワクチン接種された雌ブタに生まれた子ブタが、陽性対照と比較して、臨床徴候の軽減を示したことであり、特に、子ブタの死亡率(mortality/lethality)に関して、大きな改善が見られた。さらに、PEDVの抗原投与後におけるウイルス排出も、著明に低減された。
1.第1の遺伝子(1)が発現カセットの3’方向に配置され、第2の遺伝子(2)が発現カセットの5’方向に配置されるような、パラミクソウイルス科ウイルスの2つの隣接する必須遺伝子(1;2)の間の挿入のための発現カセットであって、
・目的のヌクレオチド配列である第1のヌクレオチド配列、および
・第1のヌクレオチド配列の5’末端に隣接する第2のヌクレオチド配列であって、前記第2のヌクレオチド配列が遺伝子の5’非コード領域であり、前記遺伝子が、第1の遺伝子(1)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、第2のヌクレオチド配列、および
・第1のヌクレオチド配列の3’末端に隣接する第3のヌクレオチド配列であって、前記第3のヌクレオチド配列が遺伝子の3’非コード領域であり、前記遺伝子が、第2の遺伝子(2)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、第3のヌクレオチド配列
を含む発現カセット。
2.・前記第1のヌクレオチド配列、および
・前記第2のヌクレオチド配列、および
・前記第3のヌクレオチド配列、および
・前記第2のヌクレオチド配列の5’末端に隣接するか、または前記第3のヌクレオチド配列の3’末端に隣接するさらなるヌクレオチド配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子間配列であるさらなるヌクレオチド配列
からなる、項1に記載の発現カセット。
第2の遺伝子(2)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される遺伝子の3’非コード領域、および
前記3’非コード領域の5’末端に隣接する配列であって、前記3’非コード領域の5’末端に隣接する前記配列が、翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列をコードし、前記翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列が、Kozak配列であってもよい、配列
からなる、項1または2に記載の発現カセット。
4.パラミクソウイルス科ウイルスの前記2つの隣接する遺伝子(1;2)が、パラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択され、かつ/または
前記パラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子が、
・パラミクソウイルス科ウイルスのN、P、M、F、HおよびL遺伝子、もしくは
・パラミクソウイルス科ウイルスのN、P、M、F、HNおよびL遺伝子、もしくは
・パラミクソウイルス科ウイルスのN、P、M、F、G、およびL遺伝子
である、項1から3のいずれか1項に記載の発現カセット。
・第2の遺伝子(2)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのM遺伝子を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのH、P、F、LおよびN遺伝子からなる群から選択されてもよい、
パラミクソウイルス科ウイルスのP遺伝子とM遺伝子との間の挿入のための、項1から4のいずれか1項に記載の発現カセット。
・前記第3のヌクレオチド配列が、発現カセットの5’方向に配置され、第2の遺伝子(2)の3’非コード領域を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子の3’非コード領域を含むか、もしくはこれからなる、
項1から5のいずれか1項に記載の発現カセット。
7.前記第1のヌクレオチド配列が、前記第3のヌクレオチド配列内に組み入れられた遺伝子開始(GS)配列、および/またはパラミクソウイルス科ウイルスのゲノムプロモーターに作動可能に連結されている、項1から6のいずれか1項に記載の発現カセット。
8.前記ヌクレオチド配列が、RNA配列である、項1から7のいずれか1項に記載の発現カセット。
9.項1から8のいずれか1項に記載の発現カセットを含む、パラミクソウイルス科ウイルスベクター。
・前記3’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのH遺伝子の3’非コード領域であり、
かつ/または前記発現カセットが、パラミクソウイルス科ウイルスのP遺伝子とM遺伝子との間に挿入される、
項1から8のいずれか1項に記載の発現カセット、または項9に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
11.第1の遺伝子(1)が3’方向に配置され、第2の遺伝子(2)が5’方向に配置されるような、パラミクソウイルス科ウイルスの2つの隣接する必須遺伝子(1;2)の間に挿入されるRNA配列を含み、
・前記挿入されたRNA配列が、第1のRNA配列を含むか、またはこれからなり、前記第1のRNA配列が、目的のヌクレオチド配列であり、
・前記挿入されたRNA配列が、第1のRNA配列の5’末端に隣接する第2のRNA配列を含むか、またはこれからなり、前記第2のRNA配列が遺伝子の5’非コード領域であり、前記遺伝子が、第1の遺伝子(1)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択され、
・前記挿入されたRNA配列が、第1のRNA配列の3’末端に隣接する第3のRNA配列を含むか、またはこれからなり、前記第3のRNA配列が遺伝子の3’非コード領域を含むか、またはこれからなり、前記遺伝子が、第2の遺伝子(2)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、パラミクソウイルス科ウイルスベクター。
第2の遺伝子(2)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される遺伝子の3’非コード領域、および
前記3’非コード領域の5’末端に隣接する配列であって、前記3’非コード領域の5’末端に隣接する前記配列が、翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列をコードし、前記翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列が、Kozak配列であってもよい、配列
からなる、項11に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
13.・第2のRNA配列の5’末端に隣接する第4のRNA配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子間配列である第4のRNA配列、および/または
・第4のRNA配列の3’末端に隣接する第5のRNA配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子間配列である第5のRNA配列
をさらに含む、項11または12に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
前記パラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子が、
・パラミクソウイルス科ウイルスのN、P、M、F、HおよびL遺伝子、もしくは
・パラミクソウイルス科ウイルスのN、P、M、F、HNおよびL遺伝子、もしくは
・パラミクソウイルス科ウイルスのN、P、M、F、G、およびL遺伝子
である、項11から13のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
・第1の遺伝子(1)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのP遺伝子を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのN、M、F、HおよびL遺伝子からなる群から選択されてもよく、
・第2の遺伝子(2)を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのM遺伝子を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのH、P、F、LおよびN遺伝子からなる群から選択されてもよい、
項11から14のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
・前記第3のヌクレオチド配列が、発現カセットの5’方向に配置され、第2の遺伝子(2)の3’非コード領域を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子の3’非コード領域を含むか、もしくはこれからなる、
項11から15のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
17.・前記5’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのN遺伝子の5’非コード領域であり、かつ/または
・前記3’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのH遺伝子の3’非コード領域である、
項11から16のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
項11から17のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
19.前記パラミクソウイルス科ウイルスが、モルビリウイルス属のウイルスであり、モルビリウイルス属のウイルスが、好ましくは、イヌジステンパーウイルス(CDV)、ネコモルビリウイルス(FeMV)、および小反芻獣疫ウイルス(PPRV)からなる群から選択され、モルビリウイルス属のウイルスが、最も好ましくは、イヌジステンパーウイルス(CDV)である、項1から18のいずれか1項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
好ましくは、配列番号1の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのN遺伝子の5’非コード領域、
好ましくは、配列番号2の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのP遺伝子の5’非コード領域、
好ましくは、配列番号3の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのM遺伝子の5’非コード領域、
好ましくは、配列番号4の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのF遺伝子の5’非コード領域、
好ましくは、配列番号5の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのH遺伝子の5’非コード領域、および、
好ましくは、配列番号6の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのL遺伝子の5’非コード領域
からなる群から選択される、項1から19のいずれか1項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
好ましくは、配列番号7の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのH遺伝子の3’非コード領域、
好ましくは、配列番号8の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのN遺伝子の3’非コード領域、
好ましくは、配列番号9の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのP遺伝子の3’非コード領域、
好ましくは、配列番号10の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのM遺伝子の3’非コード領域、
好ましくは、配列番号11の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのF遺伝子の3’非コード領域、および
好ましくは、配列番号12の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、CDVのL遺伝子の3’非コード領域
からなる群から選択される、項1から20のいずれか1項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
・前記3’非コード領域配列の5’末端に隣接する前記配列が、5~8ヌクレオチドの長さであるKozak配列をコードし、Kozak配列が、好ましくは、配列番号13の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、項1から22のいずれか1項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
24.パラミクソウイルス科ウイルスの前記遺伝子間配列が、CDVの遺伝子間配列であり、CDVの前記遺伝子間配列が、好ましくは、配列番号14の配列と少なくとも66%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、項2から8および19から23のいずれか1項に記載の発現カセット、または項9および13から23のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
25.前記目的のヌクレオチド配列が、目的の遺伝子もしくは抗原をコードする配列であり、かつ/または前記目的のヌクレオチド配列が、非自然発生のヌクレオチド配列および/もしくは組換えヌクレオチド配列である、項1から24のいずれか1項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
27.前記目的のヌクレオチド配列が、疾患原因物質に由来する抗原をコードし、疾患原因物質が、好ましくは、イヌ科動物もしくはネコ科動物などの愛玩動物、および/または他の任意の肉食家畜もしくは野生の肉食動物に感染することが可能であり、あるいはイノシシ科動物またはウシなどの食料生産動物に感染することが可能な疾患原因物質である、項1から26のいずれか1項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
・目的のヌクレオチド配列が、前記第1の生物科の動物に感染することが可能な、疾患原因物質に由来する抗原をコードし、前記疾患原因物質が、好ましくは、前記パラミクソウイルス科ウイルスと異なり、
前記第1の生物科の前記動物が、好ましくは、イヌ科の動物、ネコ科の動物、およびイノシシ科の動物からなる群から選択され、前記第1の生物科の前記動物が、最も好ましくは、イヌ、ネコ、またはブタなど、イヌ科動物、ネコ科動物、またはイノシシ科動物である、
項1から27のいずれか1項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
29.・第1の生物科の動物に感染することが可能な、前記パラミクソウイルス科ウイルスが、CDVであり、
・前記第1の生物科の動物に感染することが可能な、前記疾患原因物質が、イヌ科動物パルボウイルス(CPV)であるか、
または
・第1の生物科の動物に感染することが可能な、前記パラミクソウイルス科ウイルスが、LPMV(La Piedad Michoacan Mexico virus)ウイルスであり、
・前記第1の生物科の動物に感染することが可能な、前記疾患原因物質が、ブタインフルエンザウイルス(SwIV)またはブタ伝染性下痢ウイルス(PEDV)である、
項28に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
31.・前記目的のヌクレオチド配列が、プロトパルボウイルスカプシドタンパク質をコードし、前記プロトパルボウイルスカプシドタンパク質が、好ましくは、肉食動物プロトパルボウイルス1(CPVまたはFPV)カプシドタンパク質、霊長動物プロトパルボウイルス1カプシドタンパク質、齧歯動物プロトパルボウイルス1カプシドタンパク質、齧歯動物プロトパルボウイルス2カプシドタンパク質、有蹄動物パルボウイルス1(PPV)カプシドタンパク質からなる群から選択されるか;または
・前記目的のヌクレオチド配列が、インフルエンザウイルスエンベロープタンパク質をコードし、前記エンベロープタンパク質が、ヘマグルチニンであってもよく、かつ/または前記インフルエンザウイルスが、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、およびC型インフルエンザウイルスからなる群から選択されてもよく、A型インフルエンザウイルスが、好ましくは、インフルエンザウイルスH3N2、H3N1、H1N1、H1N2、H2N1、H2N3、およびH911の群から選択されるか;または
・前記目的のヌクレオチド配列が、コロナウイルススパイク(S)タンパク質をコードし、前記コロナウイルスSタンパク質が、好ましくは、アルパカコロナウイルスSタンパク質、アルファコロナウイルス1 Sタンパク質、ヒトコロナウイルス229E Sタンパク質、ヒトコロナウイルスNL63 Sタンパク質、ブタ伝染性下痢ウイルス(PEDV)Sタンパク質、ヒトコロナウイルスOC43 Sタンパク質、ヒトコロナウイルスHKU1 Sタンパク質、マウスコロナウイルスSタンパク質、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS-CoV)Sタンパク質、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス(MERS-CoV)Sタンパク質、およびトリ感染性気管支炎ウイルス(IBV)Sタンパク質からなる群から選択される、
項1から30のいずれか1項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
・前記目的のヌクレオチド配列が、H3亜型ヘマグルチニン(H3)、特に、ブタインフルエンザウイルスのH3をコードし、前記H3が、好ましくは、配列番号36の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含むか、もしくはこれからなるか;または
・前記目的のヌクレオチド配列が、ブタ伝染性下痢ウイルス(PEDV)スパイク(S)タンパク質をコードし、前記PEDV Sタンパク質が、好ましくは、配列番号45の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、もしくはこれからなる、
項1から31のいずれか1項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
・前記目的のヌクレオチド配列が、H3亜型ヘマグルチニン(H3)、好ましくは、ブタインフルエンザウイルスのH3をコードし、H3をコードする前記配列が、好ましくは、配列番号16の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるRNA配列からなるか、もしくはこれを含むか;または
・前記目的のヌクレオチド配列が、ブタ伝染性下痢ウイルス(PEDV)スパイク(S)タンパク質をコードし、PEDV Sタンパク質をコードする前記配列が、好ましくは、配列番号37または配列番号38の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、もしくはこれを含む
項1から32のいずれか1項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
・配列番号17もしくは配列番号18の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるRNA配列を有するポリヌクレオチド;または
・配列番号19もしくは配列番号20の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるRNA配列を有するポリヌクレオチド;または
・配列番号39もしくは配列番号40の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるRNA配列を有するポリヌクレオチド
からなるか、あるいは前記パラミクソウイルス科ウイルスベクターがこれを含む、項1から33のいずれか1項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
・配列番号22の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるRNA配列;または
・配列番号41の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列
を含む、項11から34のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
36.・第4のRNA配列の5’末端に隣接する第6のRNA配列であって、配列番号23の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるRNA配列からなるか、もしくはこれを含む、第6のRNA配列、および/または
・第5のRNA配列の3’末端に隣接する第7のRNA配列であって、配列番号24の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるRNA配列からなるか、もしくはこれを含む、第7のRNA配列
をさらに含む、項13から35のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
38.CPV VP2タンパク質をコードする、前記目的の異種ヌクレオチド配列が、配列番号15の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、項37に記載のCDVベクター。
39.前記CPV VP2タンパク質が、好ましくは、配列番号35の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、項37または38に記載のCDVベクター。
・前記目的の異種ヌクレオチド配列が、前記異種RNA配列の3’方向に配置された遺伝子開始(GS)配列、および/またはCDVのゲノムプロモーターに作動可能に連結されている、
項37または39に記載のCDVベクター。
41.前記GS配列が、CDVの遺伝子の、外因性3’非コード領域に組み入れられ、CDVの遺伝子の、前記外因性3’非コード領域は、好ましくは、目的の異種ヌクレオチド配列の3’末端に隣接し、かつ/または
前記目的の異種ヌクレオチド配列が、目的のRNA配列である、項40に記載のCDVベクター。
42.項1から41のいずれか1項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクターをコードし、好ましくは、DNA分子である核酸分子。
(ii)(i)の配列の3’末端に隣接し、配列番号25の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるDNA配列、
(iii)(i)の配列の5’末端に隣接し、配列番号26の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるDNA配列、および
(iv)(iii)の配列の5’末端に隣接し、配列番号27の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるDNA配列
を含むDNA分子、特に、項42に記載のDNA分子。
44.(v)(ii)の配列の5’末端に隣接し、配列番号28の配列と少なくとも66%同一であるDNA配列、および/または
(vi)(iv)の配列の3’末端に隣接し、配列番号28の配列と少なくとも66%同一であるDNA配列
をさらに含む、項43に記載のDNA分子。
(viii)(vi)の配列の5’末端に隣接し、配列番号30の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるDNA配列
をさらに含む、項44に記載のDNA分子。
46.・(i)の配列が、イヌパルボウイルス(CPV)VP2タンパク質をコードするDNA配列であり、前記配列が、好ましくは、配列番号31の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるDNA配列であるか、または
・(i)の配列が、H3亜型ヘマグルチニン(H3)、好ましくは、ブタインフルエンザウイルスのH3をコードするDNA配列であり、前記配列が、好ましくは、配列番号32の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるDNA配列であるか;または
・(i)の配列が、PEDV Sタンパク質をコードするDNA配列であり、前記配列が、好ましくは、配列番号42または配列番号43の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるDNA配列である、
項42から45のいずれか1項に記載のDNA分子。
・配列番号34の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一であるDNA配列;または
・配列番号44の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるDNA配列
を含む、項42から46のいずれか1項に記載のDNA分子。
48.項1から47のいずれか1項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクターまたはDNA分子を含有する哺乳動物宿主細胞。
50.項42から47のいずれか1項に記載のDNA分子を含むDNA構築物。
51.項50に記載のDNA構築物のRNA転写物。
52.項50に記載のDNA構築物をトランスフェクトされた細胞。
53.項51に記載のRNA転写物をトランスフェクトされた細胞。
54.異種遺伝子を含有する感染性パラミクソウイルス科ウイルスを調製するための方法、特に、項9から41のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクターを調製するための方法であって、
a.異種RNAポリメラーゼを発現させる宿主細胞を用意するステップ;
b.宿主細胞に、項50に記載のDNA構築物をトランスフェクトし、DNA分子が、異種RNAポリメラーゼにより転写されるステップ、および
c.細胞により産生されるウイルスを単離するステップ
を含む方法。
55.免疫原性組成物またはワクチンの製造のための、項9から41のいずれか1項に記載のベクター、または項48、52、および53のいずれか1項に記載の細胞の使用。
感染性ウイルスおよび/または弱毒化ウイルスであってもよく、または弱毒化ウイルスおよび/または改変生ウイルスであってもよい、項9から41のいずれか1項に記載のベクター、ならびに任意に
前記ベクターにより発現される組換えタンパク質、および/または前記ベクターにより発現される複数の組換えタンパク質を含むウイルス様粒子、ならびに任意に
薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤
を含み、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適する、免疫原性組成物。
57.ベクターにより発現される前記組換えタンパク質が、
・CPV VP2タンパク質など、パルボウイルスVP2抗原であるか、または
・インフルエンザウイルスエンベロープタンパク質であり、前記エンベロープタンパク質が、H3などのヘマグルチニンであってもよい、
項56に記載の免疫原性組成物。
58.項37または41に記載のCDVベクターを含むか、またはこれからなり、前記ベクターが、好ましくは、項19から36のいずれか1項に記載のベクターであり、
配列番号35または配列番号36の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドまたは組換えタンパク質を含むか、またはこれからなってもよく、
薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤を含むか、またはこれからなってもよく、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適する、
項56または57に記載の免疫原性組成物。
前記ベクターにより発現される組換えタンパク質を含むか、またはこれからなってもよく、前記組換えタンパク質が、配列番号35または配列番号36の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなり、
薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤を含むか、またはこれからなってもよく、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適する、
項56または57に記載の免疫原性組成物。
61.前記ベクターにより発現される前記組換えタンパク質が、好ましくは、配列番号45の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるPEDV Sタンパク質である、項56または60に記載の免疫原性組成物。
62.ワクチンまたは医薬組成物であって、
a.項9から41のいずれか1項に記載のベクター、
b.前記ベクターにより発現される組換えタンパク質、および/または前記ベクターにより発現される複数の組換えタンパク質を含むウイルス様粒子、
c.薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤
を含み、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適し、
d.前記ワクチンが、アジュバントをさらに含んでもよい、
ワクチンまたは医薬組成物。
・CPV VP2タンパク質など、パルボウイルスVP2抗原であるか、または
・インフルエンザウイルスエンベロープタンパク質であり、前記エンベロープタンパク質が、H3などのヘマグルチニンであってもよい、
項62に記載のワクチンまたは医薬組成物。
64.a.項37または41に記載のCDVベクターを含むか、またはこれからなり、前記ベクターが、好ましくは、項19から36のいずれか1項に記載のベクターであり、
b.配列番号35または配列番号36の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなポリペプチドまたは組換えタンパク質を含むか、またはこれからなり、
c.薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤を含むか、またはこれからなり、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適し、
d.アジュバントを含むか、またはこれからなってもよい、
項62または63に記載のワクチンまたは医薬組成物。
b.前記ベクターにより発現される組換えタンパク質を含むか、またはこれからなり、前記組換えタンパク質が、配列番号35または配列番号36の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなり、
c.薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤を含むか、またはこれからなり、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適し、
d.アジュバントを含むか、またはこれからなってもよい、
項62または63に記載のワクチンまたは医薬組成物。
67.前記ベクターにより発現される前記組換えタンパク質が、好ましくは、配列番号45の配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるPEDV Sタンパク質である、項62または66に記載のワクチンまたは医薬組成物。
68.前記ベクターが、項27に記載のベクターである、項56から61のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、または項62から67のいずれか1項に記載のワクチンもしくは医薬組成物。
69.前記ベクターが、項28に記載のベクターである、項56から61のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、または項62から67のいずれか1項に記載のワクチンもしくは医薬組成物。
71.感染と関連するか、またはこれにより引き起こされる、1つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を軽減するための免疫原性組成物またはワクチンを調製するための方法であって、
a.哺乳動物宿主細胞に、項9から41のいずれか1項に記載のベクターを感染させるステップ、
b.感染細胞を、適切な条件下で培養するステップ、
c.感染細胞培養物を回収するステップ、
d.任意に、ステップc)の、回収された感染細胞培養物を精製するステップ、
e.任意に、前記回収された感染細胞培養物を、薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含む方法。
・イヌジステンパーウイルス(CDV)および/もしくはイヌパルボウイルス(CPV)の感染、または
・A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、およびC型インフルエンザウイルスからなる群から選択されてもよく、A型インフルエンザウイルスが、好ましくは、インフルエンザウイルスH3N2、H3N1、H1N1、H1N2、H2N1、H2N3、およびH911の群から選択されるインフルエンザウイルスの感染、または
・アルパカコロナウイルス、アルファコロナウイルス1、ヒトコロナウイルス229E、ヒトコロナウイルスNL63、ブタ伝染性下痢ウイルス(PEDV)、ヒトコロナウイルスOC43、ヒトコロナウイルスHKU1、マウスコロナウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス(SARS-CoV)、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス(MERS-CoV)、およびトリ感染性気管支炎ウイルス(IBV)からなる群から選択されてもよいコロナウイルスの感染
と関連するか、またはこれにより引き起こされる、1つまたは複数の臨床徴候の重症度を軽減する、項71に記載の方法。
74.・少なくとも1つの病原体の前記感染が、CDVおよび/もしくはCPVの感染であってもよいか、
・少なくとも1つの病原体の前記感染が、ブタインフルエンザウイルスの感染であってもよく、ブタインフルエンザウイルスが、H3亜型のインフルエンザウイルスであってもよく、前記H3亜型のインフルエンザウイルスが、好ましくは、H3N2亜型もしくはH3N1亜型のブタインフルエンザウイルスであるか、または
・少なくとも1つの病原体の前記感染がPEDVの感染であってもよい、
項73に記載の使用のための、項56から61のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、または項62から67のいずれか1項に記載のワクチンもしくは医薬組成物。
ブタにおいて、ブタインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための方法であって、ブタインフルエンザウイルスが、H3亜型のインフルエンザウイルスであってもよく、前記H3亜型のインフルエンザウイルスが、好ましくは、H3N2亜型またはH3N1亜型のブタインフルエンザウイルスである方法、または
ブタ、特に、好ましくは、妊娠した雌ブタにおいて、PEDVに対する免疫応答を誘導するための方法
における使用のための、項56から61のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、または項62から67のいずれか1項に記載のワクチンもしくは医薬組成物。
76.免疫原性組成物が投与された雌ブタにより授乳される子ブタにおける、PEDVの感染により引き起こされる臨床徴候または疾患を軽減または防止する方法における使用のための、項56、60、および61のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、または項62、66、および67のいずれか1項に記載のワクチンもしくは医薬組成物。
77.項76に記載の使用のための免疫原性組成物であって、前記雌ブタが、特に、前記子ブタを妊娠している間に、免疫原性組成物が投与された雌ブタである免疫原性組成物。
78.前記免疫原性組成物または前記ワクチンまたは医薬組成物が、経粘膜投与、好ましくは、鼻腔内投与される、項73から77のいずれか1項に記載の使用のための、項56から61のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、または項62から67のいずれか1項に記載のワクチンもしくは医薬組成物。
80.イヌ科動物もしくはネコ科動物などの愛玩動物、および/または他の任意の肉食家畜もしくは野生の肉食動物、あるいはイノシシ科動物を含む食料生産動物などの動物を、動物における少なくとも1つの病原体により引き起こされる臨床疾患に対して免疫化する方法であって、動物に、項56から61のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、または項62から67のいずれか1項に記載のワクチンもしくは医薬組成物を投与するステップを含み、前記免疫原性組成物またはワクチンが、感染の臨床徴候を引き起こさず、動物を、前記少なくとも1つの病原体の病原性形態に対して免疫化する免疫応答を誘導することが可能である方法。
81.前記少なくとも1つの病原体が、CDVもしくはCPV、またはSwIVもしくはPEDVであるか、あるいは
前記少なくとも1つの病原体が、CDVおよびCPVである、
項80に記載の方法。
83.子ブタにおける、PEDVの感染により引き起こされる臨床徴候または疾患を軽減または防止する方法であって、
・項56、60、および61のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、または項62、66、および67のいずれか1項に記載のワクチンもしくは医薬組成物を、雌ブタに投与するステップ、および
・前記子ブタが、前記雌ブタにより授乳されることを可能とするステップ
を含む方法。
84.前記雌ブタが、特に、前記ブタを妊娠している雌ブタである、項83に記載の方法。
・前記雌ブタが、前記子ブタを出産することを可能とするステップ、および
・前記子ブタが、前記雌ブタにより授乳されることを可能とするステップ
を含む、
項83または84に記載の方法。
86.前記免疫原性組成物または前記ワクチンまたは医薬組成物が、前記雌ブタに、経粘膜投与、好ましくは、鼻腔内投与される、項82から85のいずれか1項に記載の方法。
87.動物における少なくとも1つの病原体と関連する疾患に対する免疫応答を誘導するか、あるいは動物における少なくとも1つの病原体と関連する疾患に対して、動物、好ましくは、イヌ科動物もしくはネコ科動物などの愛玩動物、および/または他の任意の肉食家畜もしくは野生の肉食動物、あるいはイノシシ科動物またはウシなどの食料生産動物にワクチン接種し、かつ/あるいは前記病原体と関連するか、またはこれらにより引き起こされる、1つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を軽減するためのキットであって、
a)前記動物にワクチンを投与することが可能なシリンジまたは分注器;および
b)項56から61のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、または項62から67のいずれか1項に記載のワクチン、および
c)任意に、指示書の小冊子
を含み、
前記少なくとも1つの病原体が、好ましくは、CDVおよび/もしくはCPVであるか、
または前記少なくとも1つの病原体が、SwIVもしくはPEDVであってもよい、キット。
89.前記免疫原性組成物が、項69に記載の免疫原性組成物であり、前記少なくとも1つの病原体が、前記パラミクソウイルス科ウイルス、および目的のヌクレオチド配列によりコードされるその抗原が由来する、前記疾患原因物質である、項71または72に記載の方法、項73から79のいずれか1項に記載の使用のための免疫原性組成物またはワクチンもしくは医薬組成物、項80から86のいずれか1項に記載の方法、あるいは項87に記載のキット。
91.前記免疫原性組成物が、項70に記載の免疫原性組成物であり、前記少なくとも1つの病原体が、CDVおよびCPVである、項71または72に記載の方法、項73から79のいずれか1項に記載の使用のための免疫原性組成物またはワクチンもしくは医薬組成物、項80から86のいずれか1項に記載の方法、あるいは項87に記載のキット。
92.前記動物が、イヌ科動物であり、前記イヌ科動物が、好ましくは、イヌである、項72、80、81、および88から91のいずれか1項に記載の方法。
93.前記動物が、ネコ科動物であり、前記ネコ科動物が、好ましくは、ネコである、項72、80、81、および88から91のいずれか1項に記載の方法。
95.前記動物が、ネコ科動物であり、前記ネコ科動物が、好ましくは、ネコである、項73から75および88から91のいずれか1項に記載の使用のための免疫原性組成物またはワクチンもしくは医薬組成物。
96.前記動物が、イヌ科動物であり、前記イヌ科動物が、好ましくは、イヌである、項87および88から91のいずれか1項に記載のキット。
97.前記動物が、ネコ科動物であり、前記ネコ科動物が、好ましくは、ネコである、項87および88から91のいずれか1項に記載のキット。
Claims (22)
- 第1の遺伝子(1)が発現カセットの3’方向に配置され、第2の遺伝子(2)が発現カセットの5’方向に配置されるように、パラミクソウイルス科ウイルスの2つの隣接する必須遺伝子(1;2)の間に挿入するための発現カセットであって、
・目的の異種または外因性のヌクレオチド配列である第1のヌクレオチド配列、および
・第1のヌクレオチド配列の5’末端に隣接する第2のヌクレオチド配列であって、前記第2のヌクレオチド配列が遺伝子の5’非コード領域であり、前記遺伝子が、第1の遺伝子(1)以外のパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、第2のヌクレオチド配列、および
・第1のヌクレオチド配列の3’末端に隣接する第3のヌクレオチド配列であって、前記第3のヌクレオチド配列が遺伝子の3’非コード領域を含むかそれからなり、前記遺伝子が、第2の遺伝子(2)以外のパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択され、かつ前記第3のヌクレオチド配列が第2の遺伝子(2)の3’非コード領域を含まない、第3のヌクレオチド配列
を含む発現カセットを含むパラミクソウイルス科ウイルスベクター。 - 前記発現カセットが、
・前記第1のヌクレオチド配列、および
・前記第2のヌクレオチド配列、および
・前記第3のヌクレオチド配列、および
・前記第2のヌクレオチド配列の5’末端に隣接するか、または前記第3のヌクレオチド配列の3’末端に隣接するさらなるヌクレオチド配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子間配列であるさらなるヌクレオチド配列
からなる、請求項1に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。 - 前記第3のヌクレオチド配列が、
・第2の遺伝子(2)以外のパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される遺伝子の3’非コード領域、および
・前記3’非コード領域の5’末端に隣接する配列であって、前記3’非コード領域の5’末端に隣接する前記配列が、翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列をコードし、前記翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列が、Kozak配列であってもよい、配列
からなる、請求項1または2に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。 - 前記発現カセットが、パラミクソウイルス科ウイルスのP遺伝子とM遺伝子との間の挿入のための発現カセットであり、
・第1の遺伝子(1)以外のパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのP遺伝子以外のパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、及び前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのN、M、F、HおよびL遺伝子からなる群から選択されてもよく、
・第2の遺伝子(2)以外のパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのM遺伝子以外のパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、及び前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのH、P、F、LおよびN遺伝子からなる群から選択されてもよい、
請求項1から3のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。 - 前記ヌクレオチド配列が、RNA配列であり、ならびに/または
前記第1のヌクレオチド配列が、前記第3のヌクレオチド配列内に組み入れられた遺伝子開始(GS)配列、および/もしくはパラミクソウイルス科ウイルスのゲノムプロモーターに作動可能に連結されている、請求項1から4のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。 - パラミクソウイルス科ウイルスが、モルビリウイルス属のウイルスであり、好ましくはモルビリウイルス属のウイルスが、イヌジステンパーウイルス(CDV)、ネコモルビリウイルス(FeMV)、および小反芻獣疫ウイルス(PPRV)からなる群から選択され、最も好ましくはモルビリウイルス属のウイルスがイヌジステンパーウイルス(CDV)である、請求項1から5のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
- ・前記5’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのN遺伝子の5’非コード領域であり、および/もしくは
・前記3’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのH遺伝子の3’非コード領域であり、
ならびに/または前記発現カセットが、パラミクソウイルス科ウイルスのP遺伝子とM遺伝子との間に挿入される、請求項1から6のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。 - 前記パラミクソウイルス科ウイルスが、CDVであり、CDVの遺伝子の5’非コード領域が、
CDVのN遺伝子の5’非コード領域、好ましくは、CDVのN遺伝子の前記5’非コード領域は、配列番号1の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、
CDVのP遺伝子の5’非コード領域、好ましくは、CDVのP遺伝子の前記5’非コード領域は、配列番号2の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、
CDVのM遺伝子の5’非コード領域、好ましくは、CDVのM遺伝子の前記5’非コード領域は、配列番号3の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、
CDVのF遺伝子の5’非コード領域、好ましくは、CDVのF遺伝子の前記5’非コード領域は、配列番号4の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、
CDVのH遺伝子の5’非コード領域、好ましくは、CDVのH遺伝子の前記5’非コード領域は、配列番号5の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、および、
CDVのL遺伝子の5’非コード領域、好ましくは、CDVのL遺伝子の前記5’非コード領域は、配列番号6の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、
からなる群から選択され、
ならびに/または
CDVの遺伝子の前記3’非コード領域が、
CDVのH遺伝子の3’非コード領域、好ましくは、CDVのH遺伝子の前記3’非コード領域は、配列番号7の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、
CDVのN遺伝子の3’非コード領域、好ましくは、CDVのN遺伝子の前記3’非コード領域は、配列番号8の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、
CDVのP遺伝子の3’非コード領域、好ましくは、CDVのP遺伝子の前記3’非コード領域は、配列番号9の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、
CDVのM遺伝子の3’非コード領域、好ましくは、CDVのM遺伝子の前記3’非コード領域は、配列番号10の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、
CDVのF遺伝子の3’非コード領域、好ましくは、CDVのF遺伝子の前記3’非コード領域は、配列番号11の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、および
CDVのL遺伝子の3’非コード領域、好ましくは、CDVのL遺伝子の前記3’非コード領域は、配列番号12の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、またはこれを含む、
からなる群から選択される、請求項1から7のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。 - ・前記第2のヌクレオチド配列が、CDVのN遺伝子の5’非コード領域であり、CDVのN遺伝子の前記5’非コード領域が、好ましくは、配列番号1の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、もしくはこれを含み、および/または
・前記第2の遺伝子(2)以外のパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される遺伝子の3’非コード領域が、CDVのH遺伝子の3’非コード領域であり、CDVのH遺伝子の前記3’非コード領域が、好ましくは、配列番号7の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、もしくはこれを含み、および/または
・前記3’非コード領域配列の5’末端に隣接する前記配列が、5~8ヌクレオチドの長さであるKozak配列をコードし、前記Kozak配列が、好ましくは、配列番号13の配列と90%同一であるRNA配列からなるか、もしくはこれを含む、請求項1から8のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。 - パラミクソウイルス科ウイルスの前記遺伝子間配列が、CDVの遺伝子間配列である、請求項2~9のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
- ・前記第2のヌクレオチド配列の5’末端に隣接する遺伝子間配列の5’末端に隣接するRNA配列であって、配列番号23の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、もしくはこれを含むRNA配列、および/または
・前記第3のヌクレオチド配列の3’末端に隣接する遺伝子間配列の3’末端に隣接するRNA配列であって、配列番号24の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、もしくはこれを含むRNA配列
をさらに含む、請求項1から10のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。 - ・前記目的のヌクレオチド配列が、イヌパルボウイルス(CPV)VP2タンパク質をコードし、CPV VP2タンパク質をコードする前記配列が、好ましくは、配列番号15の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、もしくはこれを含むか;または
・前記目的のヌクレオチド配列が、H3亜型ヘマグルチニン(H3)、好ましくは、ブタインフルエンザウイルスのH3をコードし、H3をコードする前記配列が、好ましくは、配列番号16の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列からなるか、もしくはこれを含むか;または
・前記目的のヌクレオチド配列が、イヌパルボウイルス(CPV)VP2タンパク質をコードし、前記CPV VP2タンパク質が、好ましくは、配列番号35の配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むか、もしくはこれからなるか;または
・前記目的のヌクレオチド配列が、H3亜型ヘマグルチニン(H3)、特に、ブタインフルエンザウイルスのH3をコードし、前記H3が、好ましくは、配列番号36の配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むか、もしくはこれからなり、および/または
前記発現カセットが、
・配列番号17もしくは配列番号18の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列を有するポリヌクレオチド;または
・配列番号19もしくは配列番号20の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列を有するポリヌクレオチド
からなるか、あるいは前記パラミクソウイルス科ウイルスベクターがこれを含む、請求項1から11のいずれか1項に記載パラミクソウイルス科ウイルスベクター。 - ・配列番号21の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列;または
・配列番号22の配列と少なくとも90%同一であるRNA配列
を含む、請求項1から12のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。 - 請求項1から13のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクターをコードする核酸分子であり、好ましくは、DNA分子である核酸分子。
- 請求項1から14のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクターまたは核酸分子を含む医薬、好ましくはワクチン。
- 請求項14に記載のDNA分子を含むDNA構築物。
- 異種遺伝子を含有する感染性パラミクソウイルス科ウイルスベクターを調製するための方法、特に、請求項1から13のいずれか1項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクターを調製するための方法であって、
a.異種RNAポリメラーゼを発現させる宿主細胞を用意するステップ;
b.宿主細胞に、請求項16に記載のDNA構築物をトランスフェクトし、DNA分子が、異種RNAポリメラーゼにより転写されるステップ、および
c.細胞により産生されるウイルスを単離するステップ
を含む方法。 - ワクチンまたは医薬組成物であって、
d.請求項1から13のいずれか1項に記載のベクター、ならびに
e.前記ベクターにより発現される組換えタンパク質、および/または前記ベクターにより発現される複数の組換えタンパク質を含むウイルス様粒子、ならびに
f.薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤
を含み、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適し、
g.前記ワクチンが、アジュバントをさらに含んでもよい、
ワクチンまたは医薬組成物。 - ベクターにより発現される前記組換えタンパク質が、
・CPV VP2タンパク質など、パルボウイルスVP2抗原であるか、または
・インフルエンザウイルスエンベロープタンパク質であり、前記エンベロープタンパク質が、H3などのヘマグルチニンであってもよい、
請求項18に記載のワクチンまたは医薬組成物。 - h.請求項12から14のいずれか1項に記載のCDVベクター、
i.配列番号35または配列番号36の配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドまたは組換えタンパク質、
j.薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤であって、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適する、薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤、
k.さらに任意に含まれていてもよいアジュバント、
を含むかまたはこれらからなる、請求項18または19に記載のワクチンまたは医薬組成物。 - 動物における少なくとも1つの病原体の感染により引き起こされる臨床徴候または疾患を軽減または防止する方法であって、
・少なくとも1つの病原体の前記感染が、CDVおよび/もしくはCPVの感染であるか、または
・少なくとも1つの病原体の前記感染が、ブタインフルエンザウイルスの感染であり、前記ブタインフルエンザウイルスが、H3亜型のインフルエンザウイルスであってもよく、前記H3亜型のインフルエンザウイルスが、好ましくは、H3N2亜型またはH3N1亜型のブタインフルエンザウイルスである、
方法における使用のための、請求項18から20のいずれか1項に記載のワクチンまたは医薬組成物。 - 動物における少なくとも1つの病原体と関連する疾患に対して、動物、好ましくは、イヌ科動物もしくはネコ科動物などの愛玩動物、および/または他の任意の肉食家畜もしくは野生の肉食動物、あるいはイノシシ科動物もしくはウシなどの食料生産動物にワクチン接種するための、かつ/あるいは、前記少なくとも1つの病原体と関連するか、またはこれらにより引き起こされる、1つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を軽減するためのキットであって、
a)前記動物にワクチンを投与することが可能なシリンジまたは分注器;および
b)請求項18から20のいずれか1項に記載のワクチンまたは医薬組成物、および
c)任意に、指示書の小冊子
を含み、
前記少なくとも1つの病原体が、CDVおよび/もしくはCPVであるか、
または前記少なくとも1つの病原体が、SwIVである、キット。
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EP4126036A4 (en) * | 2020-03-27 | 2024-05-15 | Xuping Xie | REVERSE GENETIC SYSTEM FOR SARS-COV-2 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009529889A (ja) | 2006-03-15 | 2009-08-27 | インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー | 組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター |
JP2010539093A (ja) | 2007-09-10 | 2010-12-16 | インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー | イヌ、ネコ及びウマにおけるインフルエンザ感染を予防するための組成物及び方法 |
WO2016071306A1 (en) | 2014-11-04 | 2016-05-12 | Crucell Holland B.V. | Therapeutic hpv16 vaccines |
WO2017029360A1 (en) | 2015-08-20 | 2017-02-23 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Therapeutic hpv18 vaccines |
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---|---|---|---|---|
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US4769331A (en) | 1981-09-16 | 1988-09-06 | University Patents, Inc. | Recombinant methods and materials |
US4722848A (en) | 1982-12-08 | 1988-02-02 | Health Research, Incorporated | Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus |
US5364773A (en) | 1991-03-07 | 1994-11-15 | Virogenetics Corporation | Genetically engineered vaccine strain |
US5338683A (en) | 1981-12-24 | 1994-08-16 | Health Research Incorporated | Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins |
US4603112A (en) | 1981-12-24 | 1986-07-29 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus |
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US4708871A (en) | 1983-03-08 | 1987-11-24 | Commonwealth Serum Laboratories Commission | Antigenically active amino acid sequences |
US4745051A (en) | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
DE3584341D1 (de) | 1984-08-24 | 1991-11-14 | Upjohn Co | Rekombinante dna-verbindungen und expression von polypeptiden wie tpa. |
US4945050A (en) | 1984-11-13 | 1990-07-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
IE872748L (en) | 1986-10-16 | 1988-04-16 | Arjomari Europ | Polypeptides derived from the evvelope gene of human¹immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected¹insect cells |
GB8717430D0 (en) | 1987-07-23 | 1987-08-26 | Celltech Ltd | Recombinant dna product |
WO1990001543A1 (fr) | 1988-07-29 | 1990-02-22 | Intracel Corporation | Procede d'expression genetique de proteines heterologues par des cellules transfectees in vivo |
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US5756102A (en) | 1990-11-20 | 1998-05-26 | Virogenetics Corporation | Poxvirus-canine distemper virus (CDV) recombinants and compositions and methods employing the recombinants |
JP3602530B2 (ja) | 1991-03-07 | 2004-12-15 | ヴァイロジェネティクス コーポレイション | 遺伝子操作したワクチン菌株 |
US5997878A (en) | 1991-03-07 | 1999-12-07 | Connaught Laboratories | Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses |
US5643578A (en) | 1992-03-23 | 1997-07-01 | University Of Massachusetts Medical Center | Immunization by inoculation of DNA transcription unit |
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IL108915A0 (en) | 1993-03-18 | 1994-06-24 | Merck & Co Inc | Polynucleotide vaccine against influenza virus |
FR2711670B1 (fr) | 1993-10-22 | 1996-01-12 | Pasteur Institut | Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite. |
EP0740704A1 (en) | 1994-01-27 | 1996-11-06 | University Of Massachusetts Medical Center | Immunization by inoculation of dna transcription unit |
ES2243937T3 (es) | 1994-04-29 | 2005-12-01 | Baxter Healthcare S.A. | Poxvirus recombinados en regiones esenciales con la ayuda de polinucleotidos extraños. |
EP0871755A1 (en) | 1995-03-23 | 1998-10-21 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Vectors for gene delivery |
AU737243B2 (en) | 1996-07-03 | 2001-08-16 | Merial, Inc. | Recombinant canine adenovirus (CAV) containing exogenous DNA |
US6183752B1 (en) | 1997-02-05 | 2001-02-06 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy |
US20030224017A1 (en) * | 2002-03-06 | 2003-12-04 | Samal Siba K. | Recombinant Newcastle disease viruses useful as vaccines or vaccine vectors |
BR0112384A (pt) | 2000-06-23 | 2003-09-23 | American Cyanamid Co | Recuperação do vìrus da cinomose partindo do cdna |
ES2358849T3 (es) | 2006-03-15 | 2011-05-16 | Intervet International Bv | Vectores de virus mononegavirales recombinantes. |
CA2724908C (en) | 2008-07-23 | 2017-03-14 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | Hgh polyadenylation signal |
WO2010036948A2 (en) * | 2008-09-26 | 2010-04-01 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Dna prime/inactivated vaccine boost immunization to influenza virus |
EP3353192A4 (en) | 2015-09-21 | 2019-05-15 | Oregon Health and Science University | DESIGN AND CHARACTERIZATION OF INFLUENZA VACCINES |
PT3355915T (pt) | 2015-09-29 | 2023-12-19 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Vacinas de partículas pseudovirais (vlp) de parvovírus canino (cpv) e suas utilizações |
EP3675903A1 (en) * | 2017-09-23 | 2020-07-08 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Paramyxoviridae expression system |
TW202026010A (zh) * | 2018-09-20 | 2020-07-16 | 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司 | 抗豬流行性下痢之鼻內載體疫苗 |
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JP2010539093A (ja) | 2007-09-10 | 2010-12-16 | インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー | イヌ、ネコ及びウマにおけるインフルエンザ感染を予防するための組成物及び方法 |
WO2016071306A1 (en) | 2014-11-04 | 2016-05-12 | Crucell Holland B.V. | Therapeutic hpv16 vaccines |
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WO2017053851A1 (en) | 2015-09-23 | 2017-03-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions and methods for modified dendrimer nanoparticle vaccine delivery |
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