TW201923084A - 副黏液病毒科(paramyxoviridae)表現系統 - Google Patents

副黏液病毒科(paramyxoviridae)表現系統 Download PDF

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Abstract

本發明係關於(載體)疫苗領域，且特定言之係關於表現含有所關注外源性基因之副黏液病毒科(Paramyxoviridae)病毒之核苷酸序列之增強配置。本發明另外係關於適於表現所關注基因，尤指抗原編碼序列之相關表現盒及載體。本發明之該等病毒載體可用於產生免疫原性組合物或疫苗。

Description

副黏液病毒科(PARAMYXOVIRIDAE)表現系統
本發明係關於(載體)疫苗領域，且特定言之係關於用於藉助含有所關注外源性基因之副黏液病毒科(Paramyxoviridae )病毒來表現該外源性基因之核苷酸序列之增強配置。本發明另外係關於適於表現所關注基因，尤指抗原編碼序列之相關表現盒及載體。本發明之該等病毒載體可用於產生免疫原性組合物或疫苗。
副黏液病毒科之副黏液病毒係造成許多流行動物及人類疾病之負義、單鏈、RNA病毒。副黏液病毒之實例係感染家禽及其他禽類物種之新城雞瘟病毒(Newcastle disease virus)或引起人類疾病之麻疹病毒。該等病毒當前包括49個物種且分成7個屬，其中麻疹病毒(Morbillivirus )屬具有7個物種。
犬瘟熱(CD)係狗及其他動物之高度感染性發熱疾病。其死亡率較高，介於30%與80%之間。患有CD之狗通常具有永久性中樞神經系統損害。CD之確立病因係感染副黏液病毒科之成員-麻疹病毒屬(稱為CD病毒(CDV))。一般而言，副黏液病毒係含有18-20 kb單鏈負極性RNA基因體之套膜病毒。該基因體編碼5至7個結構蛋白，該等結構蛋白包含融合(F)及血球凝集素-神經胺酸酶(HN)或血球凝集素(H)醣蛋白。膜醣蛋白血球凝集素(H)負責將病毒附接至宿主細胞，且融合醣蛋白(F)引起病毒與感染細胞之間或感染細胞與毗鄰未感染細胞之間之膜融合。
副黏液病毒科成員之基因體末端由基因外區域(稱為3′-前導體及5′-尾隨體)組成：3′-前導體區域含有基因體啟動子，且尾隨體編碼反基因體(其係全長正義複製中間體)之3′端且含有反基因體啟動子。每一基因始於保守基因起始(GS)序列且止於保守基因末端(GE)序列。轉錄始於3′-前導體區域且以依序方式藉由起止機制繼續進行，個別基因藉由該機制轉錄成個別、單獨mRNA。藉由非編碼基因間序列(IGS)來分離基因，該等序列對於一些屬(呼吸道病毒(Respirovirus )、麻疹病毒及亨尼病毒(Henipavirus ))而言在不同基因接頭處長度及序列保守且對於其他屬(腮腺炎病毒(Rubulavirus )、禽腮腺炎病毒(Avulavirus )、肺炎病毒(Pneumovirus )及間質肺炎病毒(Metapneumovirus ))而言序列或長度不保守。
對於CDV而言，發現F及H醣蛋白存在於病毒套膜中及感染細胞表面上。藉由自使用其他麻疹病毒成員之分析進行推斷，CDV F及 H醣蛋白似乎對於CDV感染及其免疫生物學較為重要。已研發基於痘病毒之重組CDV疫苗來保護及治療狗(US 5,756,102)。美國專利申請案USSN 09/587,964揭示基於DNA質體之表現CDV抗原之疫苗。
Wang等人(Vaccine 30: 5067–5072 (2012))已藉由使用反向基因學生成表現狂犬病毒醣蛋白之重組CDV疫苗菌株。 然而，實踐中可見之缺點在於，此一病毒菌株(可能藉由重複非編碼區序列之間之同源重組介導)可隨時間失去插入基因。
因此，強烈需要容許將外來基因穩定插入副黏液病毒科病毒基因體之表現系統。
另外，犬瘟熱病毒及犬細小病毒(CPV)係犬科動物及其他肉食性動物中具有全球分佈之兩種主要病原體。該兩種病毒在肉食性動物群體中之流行病學及其成功控制高度取決於易感宿主之主動免疫化。接種疫苗方案最通常包括使用尤其含有減毒活犬細小病毒及犬瘟熱病毒組分之多價疫苗。然而，成功免疫化取決於年齡類別、先前免疫狀態及母源免疫性之存在。強烈需要尋找抵抗犬科動物之主要病原體(例如犬瘟熱病毒及犬細小病毒)之改良疫苗。
藉由說明及申請專利範圍中所描述之實施例來達成上述技術問題之解決方案。
因此，根據申請專利範圍來實施不同態樣之發明。
本發明係基於以下令人吃驚之發現，將包括在5´端側接有CDV病毒中核蛋白(N)基因之5´非編碼區之外來基因之表現盒插入CDV病毒基因體之磷蛋白(P)基因與基質蛋白(M)基因之間(參見圖 1 )會產生容許即使在長時間段內亦容納、維持及表現外來基因的病毒載體。此容許生成基因穩定之基於轉基因副黏液病毒科之載體(例如基於CDV之載體)。
在第一態樣中，本發明由此提供用於插入副黏液病毒科病毒之兩個毗鄰必需基因(1；2)之間之表現盒，該插入使得第一基因(1)位於表現盒之3´方向上且第二基因(2)位於5´方向上，其中該表現盒包括 -第一核苷酸序列，其中該第一核苷酸序列係所關注核苷酸序列，及 -第二核苷酸序列，其側接於第一核苷酸序列之5´端，其中該第二核苷酸序列係基因之5´非編碼區，其中該基因係選自由副黏液病毒科病毒中除第一基因(1)外之必需基因組成之群。
本發明表現盒較佳係RNA分子。較佳地，該表現盒係經分離表現盒。
本發明表現盒較佳地進一步包括 -第三核苷酸序列，其側接於第一核苷酸序列之3´端，其中該第三核苷酸序列包括基因之3´非編碼區或由其組成，其中該基因係選自由副黏液病毒科病毒中除第二基因(2)外之必需基因組成之群。
在一具體態樣中，本發明使用CDV之萊德利 (Lederle) 疫苗菌株 (以登錄號VR-128寄存於ATCC)作為骨架(由基因庫登錄號DQ903854.1、AY288311或AY286480代表之基因型)或使用其至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之一致序列(例如來自藉由其其他傳代衍生之病毒(例如犬瘟熱病毒，萊德利無毒，目錄號NR-3845，Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository, P.O. Box 4137, Manassas, VA 20108-4137, USA)。
圖2 中之質體圖例示性展示用以生成本發明載體之DNA構築體。
本發明載體尤其可用於對哺乳動物，尤指豬接種疫苗。
本發明另外係關於用於針對CDV及另一病毒(尤其CDV及另一犬病毒(例如CPV))進行雙重免疫化之載體。此雙重免疫化載體表現來自載體骨架之CDV抗原及作為轉基因插入之其他犬抗原(例如CPV VP2)。
本發明由此亦提供包括所關注異源性RNA序列之犬瘟熱病毒(CDV)載體，該所關注異源性RNA序列較佳地位於CDV之P基因與M基因之間，且其中該所關注異源性RNA序列編碼犬細小病毒(CPV) VP2蛋白。
另外，本發明涵蓋用於在豬中誘導針對豬流感病毒或豬流行性腹瀉病毒之免疫反應之載體。因此，在本發明之上下文中，亦提供包括具有異源性RNA序列之表現盒之副黏液病毒科病毒載體，該異源性RNA序列編碼豬流感病毒之H3-亞型血球凝集素或豬流行性腹瀉病毒之纖突蛋白(Spike protein)。
本發明另外係關於包括該等載體之哺乳動物宿主細胞及使用該等宿主細胞生成載體疫苗之方法以及包括本發明之CDV載體的免疫原性組合物及疫苗。
本發明解決了先前技術中之固有問題且提供最新技術之顯著進步。
本發明藉由活體外數據展示根據本文提供之教示內容所產生編碼2b或2c CPV基因型VP2蛋白之CDV重組體(亦即CDV載體)之探究。該等病毒關於Vero細胞中之產生展示良好生長動力學，且在滾瓶中於感染後6天達到峰效價。該等重組體展示轉基因(VP2)之強表現特性，如藉由免疫螢光及西方印漬所測定，此特性將該等重組體量化為雙重CDV-CPV疫苗候選物。另外，在Vero細胞中針對20個細胞傳代測試該等病毒之基因穩定性。兩種病毒保持完全基因穩定，從而指示其易於進行疫苗生物處理。
本發明藉由活體內結果進一步證實，本發明CDV載體可複製於豬宿主中，從而靶向淋巴細胞。藉由對各種器官採樣並測試，在接種疫苗動物之淋巴結之脾或扁桃體中檢測病毒。重要的是，所有前哨動物皆保持血清陰性直至研究結束，從而指示重組CDV病毒在接種疫苗後並不在動物之間擴散。
關於效能，使用針對犬細小病毒2血清轉化之CDV-VP2 (如藉由CPV病毒中和測試所量測)對所有動物接種疫苗。在第2接種疫苗之後檢測到中和抗體效價之特定增加(參見圖 6 )。中和抗體在第二免疫化之後21天之含量達到1:40至1:400之值，根據文獻，此含量代表真實宿主(犬科動物)中之保護效價範圍(Glover等人，2012；Taguchi等人，2011)。
另外，使用編碼豬流感病毒之H3-亞型血球凝集素(H3)之本發明CDV載體使得在H3N2-母源抗體陽性(H3N2-MDA陽性)仔豬中產生活性免疫性，儘管存在該被動存在之母體免疫性。
另外，將編碼豬流行性腹瀉病毒(PEDV)之纖突蛋白之本發明CDV載體經鼻內投與母豬，然後經由抗體陽性初乳攝入仔豬發生被動免疫化，如藉由在使用PEDV攻擊之後臨床體徵、致命性及病毒脫落之發生率或嚴重程度有所減小可見。
通常，本發明提供用於插入副黏液病毒科病毒之兩個毗鄰必需基因(1；2)之間之表現盒(在下文中亦稱為「本發明表現盒」)，該插入使得第一基因(1)位於表現盒之3´方向上且第二基因(2)位於5´方向上，其中該表現盒包括 -第一核苷酸序列，其中該第一核苷酸序列係所關注核苷酸序列，及 -第二核苷酸序列，其側接於第一核苷酸序列之5´端，其中該第二核苷酸序列係基因之5´非編碼區，其中該基因係選自由副黏液病毒科病毒中除第一基因(1)外之必需基因組成之群，及 -第三核苷酸序列，其側接於第一核苷酸序列之3´端，其中該第三核苷酸序列包括基因之3´非編碼區或由其組成，其中該基因係選自由副黏液病毒科病毒中除第二基因(2)外之必需基因組成之群。
較佳地，該第三核苷酸序列由以下組成： - 選自由副黏液病毒科病毒中除第二基因(2)外之必需基因組成之群之基因之3´非編碼區，及 - 側接於該3´非編碼區之5´端之序列，其中側接於該3´非編碼區之5´端之該序列編碼用於開始或增強轉譯之共有序列，且其中該用於開始或增強轉譯之共有序列視情況係Kozak序列。
根據另一較佳態樣，本發明表現盒由以下組成： -該第一至第三核苷酸序列，及 -側接於第二核苷酸序列之5´端或側接於該第三核苷酸序列之3´端之另一核苷酸序列，其中該另一核苷酸序列係副黏液病毒科病毒之基因間序列。
副黏液病毒科病毒之該兩個毗鄰基因(1；2)較佳地選自由副黏液病毒科病毒之必需基因組成之群，且/或 副黏液病毒科病毒之該等必需基因係 - 副黏液病毒科病毒之N、P、M、F、H及L基因，或 - 副黏液病毒科病毒之N、P、M、F、HN及L基因，或 - 副黏液病毒科病毒之N、P、M、F、G及L基因。
根據一實例性實施例，本發明提供用於插入副黏液病毒科病毒之P基因與M基因之間之表現盒，其中 - 該由副黏液病毒科病毒中除第一基因(1)外之必需基因組成之群係由副黏液病毒科病毒中除副黏液病毒科病毒之P基因外之必需基因組成的群，且其中該基因視情況選自由副黏液病毒科病毒之N、M、F、H及L基因組成之群，且 - 該由副黏液病毒科病毒中除第二基因(2)外之必需基因組成之群係由副黏液病毒科病毒中除副黏液病毒科病毒之M基因外之必需基因組成的群，且其中該基因視情況選自由副黏液病毒科病毒之H、P、F、L及N基因組成之群。
較佳地，該第二核苷酸序列係選自副黏液病毒科病毒中位於表現盒之3´方向上之必需基因之基因的5´非編碼區，並包含第一基因(1)之5´非編碼區，且/或 該第三核苷酸序列包括副黏液病毒科病毒中位於表現盒之5´方向上之必需基因之3´非編碼區或由其組成，不包含第二基因(2)之3´非編碼區。
根據另一較佳態樣，本發明表現盒之該第一核苷酸序列可操作地連接至該第三核苷酸序列中所包含之基因起始(GS)序列及/或副黏液病毒科病毒之基因體啟動子。
本發明表現盒之該第一至第三核苷酸序列及該另一核苷酸序列較佳係RNA序列，從而該第一核苷酸序列然後係第一RNA序列，該第二核苷酸序列係第二RNA序列，該第三核苷酸序列係第三RNA序列，且該另一核苷酸序列係另一RNA序列。
在一實例中，本發明表現盒包括 -第一RNA序列，其中該第一RNA序列係所關注RNA序列，及 -第二RNA序列，其側接於第一RNA序列之5´端，其中該第二RNA序列係副黏液病毒科病毒之N基因之5´非編碼區，及 -第三RNA序列，其側接於第一RNA序列之3´端，其中該第三RNA序列由以下組成： - 選自由以下組成之群之基因之3´非編碼區：副黏液病毒科病毒之血球凝集素(H)基因、副黏液病毒科病毒之磷蛋白(P)基因、副黏液病毒科病毒之融合蛋白(F)基因、副黏液病毒科病毒之大聚合酶蛋白(L)基因及副黏液病毒科病毒之核蛋白(N)基因，及 - 側接於該3´非編碼區之5´端之序列，其中該側接於該3´非編碼區之5´端之序列編碼Kozak序列，及 - 視情況另一側接於第二核苷酸序列之5´端或側接於該第三核苷酸序列之3´端之RNA序列，其中該另一核苷酸序列係副黏液病毒科病毒之基因間序列。
出於闡釋目的，如本文結合本文所提供之實例性具體序列所闡述RNA序列之配置之示意圖示在圖 3 中給出。
較佳地，本發明表現盒係非天然的且/或包含於經分離副黏液病毒科病毒載體之基因中。
如本文所提及之副黏液病毒科病毒尤其係麻疹病毒屬病毒，且其中麻疹病毒屬病毒較佳地選自由以下組成之群：犬瘟熱病毒(CDV)、貓麻疹病毒(FeMV)及小反芻獸疫病毒(PPRV)，且其中麻疹病毒屬病毒最佳地係犬瘟熱病毒(CDV)。舉例而言，在CDV選擇為副黏液病毒科病毒之情形下，則下文所闡述之副黏液病毒科病毒載體尤其係CDV載體。
根據另一態樣，本發明另外係關於包括本發明表現盒之副黏液病毒科病毒載體，且其中該副黏液病毒科病毒載體亦在本文中稱為「本發明之副黏液病毒科病毒載體」。本發明之副黏液病毒科病毒載體較佳係經分離副黏液病毒科病毒載體。
在一較佳態樣中，本發明係關於該副黏液病毒科病毒載體或本發明表現盒，其中 - 該5´非編碼區係副黏液病毒科病毒之N基因之5´非編碼區，且/或 - 該3´非編碼區係副黏液病毒科病毒之H基因之3´非編碼區， 且/或其中該表現盒插入副黏液病毒科病毒之P基因與M基因之間。
因此，本發明亦係關於包括插入副黏液病毒科病毒之兩個毗鄰必需基因(1；2)之間之RNA序列之副黏液病毒科病毒載體，該插入使得第一基因(1)位於該插入RNA序列之3´方向上且第二基因(2)位於5´方向上，且其中該插入RNA序列包括以下或由其組成： -第一RNA序列，其中該第一RNA序列係所關注核苷酸序列，及 -第二RNA序列，其側接於第一RNA序列之5´端，其中該第二RNA序列係基因之5´非編碼區，其中該基因係選自由副黏液病毒科病毒中除第一基因(1)外之必需基因組成之群，及 -第三RNA序列，其側接於第一RNA序列之3´端，其中該第三RNA序列包括基因之3´非編碼區或由其組成，其中該基因係選自由副黏液病毒科病毒中除第二基因(2)外之必需基因組成之群。
較佳地，該第一RNA序列可操作地連接至該第三RNA序列中所包含之基因起始(GS)序列及/或副黏液病毒科病毒之基因體啟動子。
根據一尤佳態樣，副黏液病毒科病毒之該兩個毗鄰基因(1；2)係選自由副黏液病毒科病毒之必需基因組成之群： 且/或副黏液病毒科病毒之該等必需基因係 - 副黏液病毒科病毒之N、P、M、F、H及L基因，或 - 副黏液病毒科病毒之N、P、M、F、HN及L基因，或 - 副黏液病毒科病毒之N、P、M、F、G及L基因。
根據另一較佳態樣，本發明之副黏液病毒科病毒載體之該第三RNA序列由以下組成： - 選自由副黏液病毒科病毒中除第二基因(2)外之必需基因組成之群之基因之3´非編碼區，及 - 側接於該3´非編碼區之5´端之序列，其中側接於該3´非編碼區之5´端之該序列編碼用於開始或增強轉譯之共有序列，且其中該用於開始或增強轉譯之共有序列視情況係Kozak序列。
在一實例中，其中副黏液病毒科病毒之該兩個毗鄰必需基因(1；2)係副黏液病毒科病毒之P基因及M基因，且 - 該由副黏液病毒科病毒中除第一基因(1)外之必需基因組成之群係由副黏液病毒科病毒中除副黏液病毒科病毒之P基因外之必需基因組成的群，且其中該基因視情況選自由副黏液病毒科病毒之N、M、F、H及L基因組成之群，且 - 該由副黏液病毒科病毒中除第二基因(2)外之必需基因組成之群係由副黏液病毒科病毒中除副黏液病毒科病毒之M基因外之必需基因組成的群，且其中該基因視情況選自由副黏液病毒科病毒之H、P、F、L及N基因組成之群。
在本發明之副黏液病毒科病毒載體之背景中，較佳地 - 該第二核苷酸序列係基因之5´非編碼區，其中該基因係選自副黏液病毒科病毒中位於表現盒之3´方向上且除第一基因(1)外之必需基因，此特定而言意指並不個別地選擇第一基因(1)之5´非編碼區，且/或 - 該第三核苷酸序列包括基因之3´非編碼區或由其組成，其中該基因係選自副黏液病毒科中位於表現盒之5´方向上且除第二基因(2)外之必需基因，此特定而言意指並不個別地選擇第二基因(2)之3´非編碼區。
另外較佳地，就本發明之副黏液病毒科病毒載體而言， -該5´非編碼區係副黏液病毒科病毒之N基因之5´非編碼區，且/或 -該3´非編碼區係副黏液病毒科病毒之H基因之3´非編碼區。
較佳地，本發明之表現盒或副黏液病毒科病毒載體特定而言包括 -第一RNA序列，其中該第一RNA序列係所關注RNA序列，及 -第二RNA序列，其側接於第一RNA序列之5´端，其中該第二RNA序列係副黏液病毒科病毒之核蛋白(N)基因之5´非編碼區，及 -第三RNA序列，其側接於第一RNA序列之3´端，其中該第三RNA序列由以下組成： 副黏液病毒科病毒之H、HN、F或L基因之3´非編碼區，及 側接於該3´非編碼區之5´端之序列，其中該側接於該3´非編碼區之5´端之序列編碼Kozak序列。
根據另一較佳態樣，本發明之副黏液病毒科病毒載體進一步包括 -側接於第二RNA序列之5´端之第四RNA序列，其中該第四RNA序列係副黏液病毒科病毒之基因間序列，及/或 -側接於第四RNA序列之3´端之第五RNA序列，其中該第五RNA序列係副黏液病毒科病毒之基因間序列。
較佳地，本發明表現盒或本發明之副黏液病毒科病毒載體之該第三RNA序列包括副黏液病毒科病毒之H基因的3´非編碼區或由其組成，且/或該表現盒較佳地插入副黏液病毒科病毒之P基因與M基因之間。
根據一尤佳態樣，本發明亦係關於 (A)本發明表現盒，其包括 -第一RNA序列，其中該第一RNA序列係異源性或外源性所關注RNA序列，及 -第二RNA序列，其側接於第一RNA序列之5´端，其中該第二RNA序列係CDV之N基因之5´非編碼區，及 -第三RNA序列，其側接於第一RNA序列之3´端，其中該第三RNA序列由以下組成： 副黏液病毒科病毒之H、HN、F或L基因之3´非編碼區，及 側接於該3´非編碼區之5´端之序列，其中該側接於該3´非編碼區之5´端之序列編碼Kozak序列， 且其中該表現盒較佳地進一步包括 -第四RNA序列，其側接於第二RNA序列之5´端，其中該第四RNA序列係CDV之基因間序列，或 -第五RNA序列，側接於第三RNA序列之3´端，其中該第五RNA序列係CDV之基因間序列， 且個別地，本發明亦係關於 (B)本發明之副黏液病毒科病毒載體包括(A)之表現盒，其中此載體亦在本文中稱為「本發明CDV載體」。
較佳地，本發明表現盒或本發明之副黏液病毒科病毒載體之該第一核酸序列可操作地連接至該第三RNA序列中所包含之基因起始(GS)序列及/或副黏液病毒科病毒之基因體啟動子。
在本發明表現盒或本發明之副黏液病毒科病毒載體之背景中，該副黏液病毒科病毒較佳係CDV且CDV基因之該5´非編碼區係選自由以下組成之群： CDV之N基因之5´非編碼區，其中CDV之N基因之5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:1之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之P基因之5´非編碼區，其中CDV之P基因之5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:2之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之M基因之5´非編碼區，其中CDV之M基因之5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:3之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之F基因之5´非編碼區，其中CDV之F基因之5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:4之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之H基因之5´非編碼區，其中CDV之H基因之5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:5之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列，及 CDV之L基因之5´非編碼區，其中CDV之F基因之5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:6之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。
在本發明表現盒或本發明之副黏液病毒科病毒載體之背景內，該副黏液病毒科病毒較佳係CDV且CDV基因之該3´非編碼區係選自由以下組成之群： CDV之H基因之3´非編碼區，其中CDV之H基因之3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:7之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之N基因之3´非編碼區，其中CDV之N基因之3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:8之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之P基因之3´非編碼區，其中CDV之P基因之3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:9之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之M基因之3´非編碼區，其中CDV之M基因之3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:10之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之F基因之3´非編碼區，其中CDV之F基因之3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:11之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列，及 CDV之L基因之3´非編碼區，其中CDV之F基因之3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:12之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。
較佳地，本發明表現盒或本發明之副黏液病毒科病毒載體之該第二核苷酸序列或該第二RNA序列係CDV之N基因之5´非編碼區，且其中CDV之N基因之該5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:1之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。 就本發明表現盒或本發明之副黏液病毒科病毒載體而言，較佳地 -選自由副黏液病毒科病毒中除第二基因(2)外之必需基因組成之群之基因之該3´非編碼區係CDV之H基因的3´非編碼區，且其中CDV之H基因之該3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:7之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列，且/或 -該側接於該3´非編碼區序列之5´端之序列編碼長5至8個核苷酸之Kozak序列，且其中Kozak序列較佳地由與SEQ ID NO:13之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。
較佳地，本發明表現盒或本發明之副黏液病毒科病毒載體之該基因間序列係CDV之基因間序列，且其中CDV之該基因間序列較佳地由與SEQ ID NO:14之序列至少66%一致之RNA序列組成或包括該序列。
較佳地，如本文在本發明表現盒或本發明之副黏液病毒科病毒載體之背景中所闡述之該所關注核苷酸序列係所關注基因或抗原編碼序列，且/或該所關注核苷酸序列較佳係非天然及/或重組序列。
特定而言，該所關注核苷酸序列較佳係重組及/或異源性及/或外源性序列。
該所關注核苷酸序列較佳地編碼來自致病原之抗原，其中致病原較佳係能夠感染寵物動物(例如犬或貓及/或任一其他家畜或野生肉食性動物)或能夠感染產食性動物(例如豬或牛)之致病原。
根據本發明之一較佳態樣，副黏液病毒科病毒係能夠感染第一生物科之動物之副黏液病毒科病毒且所關注核苷酸序列編碼來自能夠感染該第一生物科之動物之致病原的抗原，且其中該致病原較佳地不同於該副黏液病毒科病毒。
該第一生物科之該動物較佳地選自由以下組成之群：犬科動物、貓科動物及豬科動物，且其中該第一生物科之該動物最佳係犬類、貓類或豬類(例如狗、貓或豬)。
視情況，該能夠感染第一生物科動物之副黏液病毒科病毒係CDV且該能夠感染該第一生物科之動物之致病原係犬細小病毒(CPV)或， 視情況該能夠感染第一生物科動物之副黏液病毒科病毒係拉帕丹密考克墨西哥病毒(La Piedad Michoacán Mexico virus) (LPMV)且該能夠感染該第一生物科之動物之致病原係豬流感病毒(SwIV)。
作為另一較佳選擇，該能夠感染第一生物科動物之副黏液病毒科病毒係拉帕丹密考克墨西哥病毒(LPMV)且該能夠感染該第一生物科之動物之致病原係豬流行性腹瀉病毒(PEDV)。
根據一尤佳態樣，該所關注核苷酸序列編碼來自犬細小病毒(CPV)、貓細小病毒(FPV)或豬流感病毒(SwIV)之抗原。
作為另一較佳選擇，該所關注核苷酸序列較佳地編碼來自豬流行性腹瀉病毒(PEDV)之抗原。
該所關注核苷酸序列較佳地編碼- 原小病毒(Protoparvovirus )衣殼蛋白，且其中該原小病毒衣殼蛋白較佳地選自由以下組成之群：肉食性動物原小病毒1 (CPV或FPV)衣殼蛋白、 靈長類動物原小病毒1衣殼蛋白、 齧齒類動物原小病毒1衣殼蛋白、齧齒類動物原小病毒2衣殼蛋白、 有蹄動物細小病毒1(PPV) 衣殼蛋白，或 -流感病毒套膜蛋白，其中該套膜蛋白視情況係血球凝集素且/或其中該流感病毒視情況選自由以下組成之群：流感A病毒、流感B病毒及流感C病毒，且其中流感A病毒較佳地選自流感病毒H3N2、H3N1、H1N1、H1N2、H2N1、H2N3及H911之群。
作為另一較佳選擇，該所關注核苷酸序列編碼冠狀病毒纖突(S)蛋白，且其中該冠狀病毒S蛋白較佳地選自由以下組成之群：羊駝冠狀病毒(Alpaca coronavirus ) S蛋白、α冠狀病毒(Alphacoronavirus ) 1 S蛋白、人類冠狀病毒(Human coronavirus ) 229E S蛋白、人類冠狀病毒NL63 S蛋白、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus ，PEDV) S蛋白、人類冠狀病毒OC43 S蛋白、人類冠狀病毒HKU1 S蛋白、鼠類冠狀病毒(Murine coronavirus ) S蛋白、嚴重急性呼吸症候群相關冠狀病毒(Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus ，SARS-CoV) S蛋白、中東呼吸症候群相關冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome-related coronavirus ，MERS-CoV) S蛋白及禽感染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus ，IBV) S蛋白。
特定而言，該所關注核苷酸序列編碼 - 犬細小病毒(CPV) VP2蛋白，且其中該CPV VP2蛋白較佳地包括與SEQ ID NO:35之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成；或 - H3-亞型血球凝集素(H3)，尤指豬流感病毒之H3，且其中該H3較佳地包括與SEQ ID NO:36之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成；或
作為另一較佳選擇，該所關注核苷酸序列編碼豬流行性腹瀉病毒(PEDV)纖突(S)蛋白，且其中該PEDV S蛋白較佳地包括與SEQ ID NO:45之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成。
更佳地，該所關注核苷酸序列編碼 -犬細小病毒(CPV) VP2蛋白，且其中該編碼CPV VP2蛋白之序列特定而言由與SEQ ID NO:15之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列；或 -H3-亞型血球凝集素(H3)，較佳地豬流感病毒之H3，且其中該編碼H3之序列較佳地由與SEQ ID NO:16之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。
作為另一較佳選擇，該所關注核苷酸序列編碼豬流行性腹瀉病毒(PEDV)纖突(S)蛋白，且其中該編碼PEDV S蛋白之序列較佳地由與SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。
根據本發明之另一較佳態樣，該表現盒由以下組成或該副黏液病毒科病毒載體包括以下： -具有與SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列之聚核苷酸，或 -具有與SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列之聚核苷酸。
作為另一較佳選擇，該表現盒由具有與SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列之聚核苷酸組成或該副黏液病毒科病毒載體包括該聚核苷酸。
較佳地，本發明之副黏液病毒科病毒載體包括 -與SEQ ID NO:21之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列；或 -與SEQ ID NO:22之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列。
作為另一較佳選擇，本發明之副黏液病毒科病毒載體包括與SEQ ID NO:41之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列。
根據另一較佳態樣，本發明之副黏液病毒科病毒載體進一步包括 -第六RNA序列，其側接於第四RNA序列之5´端，其中該第六RNA序列由與SEQ ID NO:23之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列，及/或 -第七RNA序列，其側接於第五RNA序列之3´端，其中該第七RNA序列由與SEQ ID NO:24之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。
本發明另外提供犬瘟熱病毒載體，其在本文中亦稱為「雙重CDV-CPV免疫化載體」，其中該載體包括所關注異源性RNA序列，其中該所關注異源性RNA序列較佳地位於CDV之P基因與M基因之間， 且其中該所關注異源性RNA序列編碼犬細小病毒(CPV) VP2蛋白，且其中該編碼CPV VP2蛋白之序列視情況由與SEQ ID NO:15之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， 且其中較佳地該所關注異源性RNA序列可操作地連接至位於該異源性RNA序列之3´方向上之基因起始(GS)序列，其中該GS序列最佳地包含於CDV之H基因之外源性3´非編碼區中；且及/或連接至CDV之基因體啟動子。
作為另一較佳選擇，該所關注異源性RNA序列編碼包括與SEQ ID NO:35之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成之CPV VP2蛋白。
特定而言，雙重CDV-CPV免疫化載體中之該所關注異源性RNA序列可操作地連接至 - CDV之H基因之外源性3´非編碼區，尤指其中所包含之GS序列，其中CDV之H基因之該外源性3´非編碼區較佳地側接於該編碼CPV VP2蛋白之所關注異源性RNA序列之3´端，及/或 - CDV之基因體啟動子。
本發明另外提供編碼本發明表現盒或本發明之副黏液病毒科病毒載體之核酸分子，其中該核酸分子較佳係DNA分子，且其中該核酸分子較佳係經分離核酸分子。
另外，本發明提供DNA分子，在下文中亦稱為「本發明DNA分子」，其中該分子包括 (i) 編碼所關注多肽之DNA序列， (ii) 側接於(i)中序列之3´端且與SEQ ID NO:25之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列， (iii) 側接於(i)中序列之5´端且與SEQ ID NO:26之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列，及 (iv) 側接於(iii)中序列之5´端且與SEQ ID NO:27之所選序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列。
本發明DNA分子較佳地進一步包括 (v)側接於(ii)中序列之5´端且與SEQ ID NO:28之序列至少66%一致之DNA序列，及/或 (vi)側接於(iv)中序列之3´端且與SEQ ID NO:28之序列至少66%一致之DNA序列。
較佳地，本發明DNA分子係經分離DNA分子。
根據另一較佳態樣，本發明DNA分子進一步包括 (vii) 側接於(v)中序列之3´端且與SEQ ID NO:29之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列，及/或 (viii) 側接於(vi)中序列之5´端且與SEQ ID NO:30之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列。
較佳地，(i)之序列係 -編碼犬細小病毒(CPV) VP2蛋白之DNA序列，且其中該序列較佳係與SEQ ID NO:31之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列，或 -編碼H3-亞型血球凝集素(H3)，較佳地豬流感病毒之H3之DNA序列，且其中該序列較佳係與SEQ ID NO:32之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列。
作為另一較佳選擇，(i)之序列係編碼PEDV S蛋白之DNA序列，且其中該序列較佳係與SEQ ID NO:41之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列。
根據另一較佳態樣，本發明DNA分子包括 -與SEQ ID NO:33之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列，或 -與SEQ ID NO:34之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列。
作為另一較佳選擇，本發明DNA分子包括與SEQ ID NO:42之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列。
本發明另外提供哺乳動物宿主細胞，其含有 - 本發明表現盒， - 本發明之副黏液病毒科病毒載體或本文所闡述之雙重CDV-CPV免疫化載體，或 - 本發明DNA分子， 且其中該哺乳動物宿主細胞較佳係經分離哺乳動物宿主細胞。
本發明亦提供 - 本發明表現盒， - 本發明之副黏液病毒科病毒載體，或 - 本發明DNA分子 其用作藥劑，較佳地疫苗。
另外，在本發明之上下文中，提供包括本發明DNA分子之DNA構築體，其中該DNA構築體尤其係DNA載體(例如質體)。本發明DNA分子可插入其中之DNA載體或質體為熟習此項技術者所瞭解。如本文所闡述之DNA構築體較佳係經分離DNA構築體。如本文中所使用，術語「包括DNA分子」特定而言理解為等效於術語「包括DNA分子序列」。
另外，本發明提供本文所闡述DNA構築體之RNA轉錄物，其中該RNA轉錄物較佳係經分離RNA轉錄物。
本發明亦提供經本文所闡述之DNA構築體轉染之細胞，其中該細胞較佳係經分離細胞。
另外，本發明提供經本文所提及之RNA轉錄物轉染之細胞，其中該細胞較佳係經分離細胞。
較佳地，細胞或哺乳動物宿主細胞分別係Vero細胞。
另外，在本發明之上下文中，提供製備含有異源性基因之感染性副黏液病毒科病毒，尤指用於製備本發明之副黏液病毒科病毒載體之方法，其中該方法包括以下步驟： a. 提供表現異源性RNA聚合酶之宿主細胞； b. 使用本文所闡述之DNA構築體轉染宿主細胞，且其中藉由異源性RNA聚合酶轉錄DNA構築體中所包含之本發明DNA分子，及 c. 分離該等細胞所產生之病毒。
因副黏液病毒科病毒具有負鏈RNA基因體，故需要在經轉染細胞中存在RNA聚合酶，較佳地T7 RNA聚合酶或由副黏液病毒科病毒編碼之RNA聚合酶。最佳使用T7 RNA聚合酶。可(例如)藉由共轉染編碼及表現RNA聚合酶之質體或藉由使用RNA聚合酶蛋白滲透細胞來提供存在於經轉染細胞中之RNA聚合酶。根據本發明，就此而言，使用產生RNA聚合酶之轉基因細胞尤佳，例如將DNA構築體轉染至表現T7聚合酶之BHK-21細胞中或轉染至BSR-T7/5細胞中。或者，亦可使用編碼RNA聚合酶且在轉染至宿主細胞中時轉譯成RNA聚合酶之mRNA來轉染細胞。
根據另一態樣，本發明另外提供本發明之副黏液病毒科病毒載體或本文所闡述細胞之用途，其用於製造免疫原性組合物或疫苗。
在再一態樣中，本發明亦提供免疫原性組合物，其在本文中亦稱為「本發明之免疫原性組合物」，其中該免疫原性組合物包括 a. 本發明之副黏液病毒科病毒載體，其中該載體視情況係感染性及/或減毒病毒或其中該載體視情況係減毒及/或經修飾活病毒，及 b. 由該載體表現之重組蛋白及/或包括複數個由該載體表現之重組蛋白之病毒樣顆粒，及 c. 視情況醫藥或獸醫學可接受之載劑或賦形劑，較佳地該載劑適於口服、真皮內、肌內或鼻內施用。
較佳地，該由載體表現之重組蛋白係 -細小病毒VP2抗原，例如CPV VP2蛋白，或 -流感病毒套膜蛋白，其中該套膜蛋白視情況係血球凝集素(例如H3)。
特定而言，應理解，本文所用之片語「由該載體表現」或「由載體表現」分別尤其等效於「表現於感染載體之細胞中」或「表現於感染該載體之細胞中」。
根據另一較佳態樣，本發明之免疫原性組合物包括以下或由其組成： a. 任一上文所提及編碼CPV VP2蛋白之載體，且其中該載體較佳係CDV載體，尤指本發明CDV載體或如本文所闡述之雙重CDV-CPV免疫化載體，及 b. 包括與SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成之多肽，其中該多肽較佳係由該載體表現之重組蛋白， c. 及視情況醫藥或獸醫學可接受之載劑或賦形劑，其中該載劑較佳地適於口服、真皮內、肌內或鼻內施用。
作為另一較佳選擇，該由該載體表現之重組蛋白係冠狀病毒S蛋白，且其中該冠狀病毒S蛋白視情況係尤其包括與SEQ ID NO:45之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成之PEDV S蛋白。
本發明亦提供疫苗或醫藥組合物，其在下文中亦稱為「本發明之疫苗或醫藥組合物」，其中該疫苗或醫藥組合物包括 a. 本發明之上下文中之本文所闡述之任一載體，及 b. 由該載體表現之重組蛋白及/或包括複數個由該載體表現之重組蛋白之病毒樣顆粒，及 c. 醫藥或獸醫學可接受之載劑或賦形劑，其中該載劑較佳地適於口服、真皮內、肌內或鼻內施用，且 d. 視情況該疫苗進一步包括佐劑， 且其中該由載體表現之重組蛋白較佳係 -細小病毒VP2抗原，例如CPV VP2蛋白，或 -流感病毒套膜蛋白，其中該套膜蛋白視情況係血球凝集素(例如H3)。
較佳地，本發明之疫苗或醫藥組合物包括以下或由其組成： a. 任一上文所提及編碼CPV VP2蛋白或流感病毒血球凝集素之載體，且其中該載體較佳係CDV載體，尤指本發明CDV載體或如本文所闡述之雙重CDV-CPV免疫化載體，及 b. 包括與SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成之多肽，其中該多肽較佳係由該載體表現之重組蛋白，及 c. 醫藥或獸醫學可接受之載劑或賦形劑，較佳地該載劑適於口服、真皮內、肌內或鼻內施用， d. 及視情況選用之佐劑。
作為另一較佳選擇，該本發明之疫苗或醫藥組合物中所包含由該載體表現之重組蛋白係冠狀病毒S蛋白，且其中該冠狀病毒S蛋白視情況係尤其包括與SEQ ID NO:45之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成之PEDV S蛋白。
本發明另外提供製備用於減小一或多種與感染有關或由其引起之臨床體徵之發生率或嚴重程度之免疫原性組合物或疫苗的方法，其包括下列步驟： a. 使用本發明之上下文中之任一本文所闡述載體感染哺乳動物宿主細胞， a. 在適宜條件下培養感染細胞， b. 收集感染細胞培養物， c. 視情況純化步驟c)之所收集感染細胞培養物 d. 視情況混合該所收集感染細胞培養物與醫藥上可接受之載劑， 且其中該免疫原性組合物或疫苗較佳地減小一或多種與以下感染有關或由其引起之臨床體徵之嚴重程度： - CDV及CPV之感染，或 - 流感病毒之感染，其中該流感病毒視情況選自由以下組成之群：流感A病毒、流感B病毒及流感C病毒，且其中流感A病毒較佳地選自流感病毒H3N2、H3N1、H1N1、H1N2、H2N1、H2N3及H911之群。
作為另一較佳選擇，該免疫原性組合物或疫苗會減小一或多種與冠狀病毒感染有關或由其引起之臨床體徵之嚴重程度，其中該冠狀病毒視情況選自由以下組成之群：羊駝冠狀病毒、α冠狀病毒1、人類冠狀病毒229E、人類冠狀病毒NL63、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、人類冠狀病毒OC43、人類冠狀病毒HKU1、鼠類冠狀病毒、嚴重急性呼吸症候群相關冠狀病毒(SARS-CoV)、中東呼吸症候群相關冠狀病毒(MERS-CoV)及禽感染性支氣管炎病毒(IBV)。
本發明亦係關於 -本發明之免疫原性組合物或 -本發明之疫苗或醫藥組合物 其用於減小或預防動物中由至少一種病原體之感染引起之臨床體徵或疾病之方法中或用於治療或預防動物中至少一種病原體之感染的方法中，較佳地該動物係寵物動物(例如犬或貓及/或任一其他家畜或野生肉食性動物)或產食性動物(例如豬)，且其中至少一種病原體之該感染較佳係 - CDV及/或CPV之感染，其中該感染最佳係CDV及/或CPV之感染，或 - 豬流感病毒之感染，其中豬流感病毒視情況係亞型H3流感病毒，且其中該亞型H3流感病毒較佳係亞型H3N2或H3N1之豬流感病毒。
作為另一較佳選擇，至少一種病原體之該感染係PEDV感染。
特定而言，本發明亦係關於用於以下方法中之本發明之免疫原性組合物或疫苗或本發明之醫藥組合物： - 誘導動物，較佳地犬中之針對CPV及CDV之免疫反應，或 - 誘導豬中之針對豬流感病毒之免疫反應，其中豬流感病毒視情況係亞型H3流感病毒，且其中該亞型H3流感病毒較佳係亞型H3N2或H3N1之豬流感病毒。
作為另一較佳選擇，本發明之免疫原性組合物或疫苗或本發明之醫藥組合物係用於在豬、尤佳地懷孕母豬中誘導針對PEDV之免疫反應的方法中。
在一態樣中，本發明之免疫原性組合物或疫苗或本發明之醫藥組合物係用於減少或預防仔豬中由PEDV感染引起之臨床體徵或疾病的方法中，其中仔豬擬藉由已投與免疫原性組合物之母豬來哺乳，且其中該母豬較佳係在該母豬已懷孕，尤指懷有該仔豬的同時已投與免疫原性組合物之母豬。
根據本發明之一尤佳態樣，在該用途中，本發明之免疫原性組合物或疫苗或本發明之醫藥組合物擬經黏膜，較佳地經鼻內(例如)投與該母豬。
另外，本發明提供對動物(例如寵物動物，例如犬或貓及/或任一其他家畜或野生肉食性動物；或產食性動物，包含豬)針對由該動物中之至少一種病原體引起之臨床疾病實施免疫之方法，該方法包括向動物投與本發明之免疫原性組合物或本發明之疫苗或醫藥組合物之步驟，其中該免疫原性組合物或疫苗不會引起感染臨床體徵，但能夠誘導針對病原性形式之該至少一種病原體使動物免疫化之免疫反應，且其中該至少一種病原體較佳係CDV或CPV或SwIV或最佳地CDV及CPV。
本發明另外提供在母豬中誘導產生PEDV特異性抗體之方法，其中該方法包括向該母豬投與本發明之免疫原性組合物或本發明之疫苗或醫藥組合物，該等組合物或疫苗尤其包括編碼包括與SEQ ID NO:45之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成之PEDV S蛋白之本發明副黏液病毒科病毒載體。
另外，本發明尤其提供減少或預防仔豬中由PEDV感染引起之臨床體徵或疾病之方法，其中該方法包括 -向母豬投與本發明之免疫原性組合物或本發明之疫苗或醫藥組合物，該等組合物或疫苗尤其包括編碼包括與SEQ ID NO:45之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成之PEDV S蛋白之本發明副黏液病毒科病毒載體，及 -使該仔豬由該母豬哺乳。
較佳地，該母豬係正懷孕，尤指懷有該仔豬之母豬。
更佳地，該減少或預防仔豬中由PEDV感染引起之臨床體徵或疾病之方法包括以下步驟： - 向懷有該仔豬之母豬投與本發明之免疫原性組合物或本發明之疫苗或醫藥組合物，該等組合物或疫苗尤其包括編碼包括與SEQ ID NO:45之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成之PEDV S蛋白之本發明副黏液病毒科病毒載體， - 使該母豬生下該仔豬，及 - 使該仔豬由該母豬哺乳。
較佳地，將本發明之免疫原性組合物或本發明之疫苗或醫藥組合物經肌內或經黏膜(例如藉由鼻內投與)投與動物。
最佳地，在該減少或預防仔豬中由PEDV感染引起之臨床體徵或疾病之方法中，將該免疫原性組合物或該疫苗或醫藥組合物經黏膜，較佳地經鼻內投與該母豬。
根據再一較佳態樣，本發明亦提供一種套組，其用於在動物中針對至少一種病原體誘導免疫反應，或用於針對與至少一種病原體有關之疾病對動物(較佳地寵物動物，例如犬或貓及/或任一其他家畜或野生肉食性動物；或產食性動物，例如豬或牛)接種疫苗及/或減小動物中與至少一種病原體有關或由其引起之一或多種臨床體徵之發生率或嚴重程度，該套組包括： a) 注射器或分配器，其能夠向該動物投與疫苗；及 b) 本發明之免疫原性組合物或本發明之疫苗或醫藥組合物，及 c) 視情況選用之說明書， 其中該至少一種病原體較佳地係CDV或CPV或SwIV或PEDV，且其中該至少一種病原體最佳係CDV及CPV。定義
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與申請時熟習本發明所屬技術領域者通常所理解含義相同之含義。術語之含義及範圍應清楚；然而，倘若存在任何潛在歧義，則本文所提供之定義優先於任一字典或外在之定義。另外，除非上下文另外需要，否則單數術語包含複數形式且複數術語包含單數。在本文中，除非另外陳述，否則使用「或」意指「及/或」。另外，使用術語「包含(including)」以及其他形式(例如「包含(includes)」及「包含(included)」)不具有限制意義。本文所提及之所有專利及出版物皆以引用方式併入本文中。
除非另外指示，否則本發明之實踐將採用病毒學、分子生物學、微生物學、重組DNA技術、蛋白質化學及免疫學之習用技術，其皆在本領域之技術範圍內。該等技術充分闡釋於文獻中。例如參見Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第I、II及III卷，第二版(1989)；DNA Cloning，第I及II卷(D. N. Glover編輯，1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編輯，1984)；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames及S. J. Higgins編輯，1984)；Animal Cell Culture (R. K. Freshney編輯，1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986)；Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；叢書Methods In Enzymology (S. Colowick及N. Kaplan編輯，Academic Press, Inc.)；Protein purification methods – a practical approach (E.L.V. Harris及S. Angal編輯，IRL Press，Oxford University Press)；及Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷(D. M. Weir及C. C. Blackwell編輯，1986, Blackwell Scientific Publications)。
在詳細闡述本發明之前，應理解，本發明並不限於特定DNA、多肽序列或製程參數，此乃因該等項當然可有所變化。亦應理解，本文所用之術語僅係出於闡述本發明特定實施例之目的，而非意欲為限制性。必須注意，除非內容另外明確指出，否則本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包含複數個指涉對象。因此，舉例而言，所提及之「一種抗原」包含兩種或更多種抗原之混合物，所提及之「一種賦形劑」包含兩種或更多種賦形劑之混合物及諸如此類。副黏液病毒科定義
特定而言，應理解，本文所用之術語「副黏液病毒科病毒」等效於如通常用於副黏液病毒科病毒之背景中之術語「副黏液病毒」。
本文所用之術語「副黏液病毒科病毒之N基因之5´非編碼區」特定言之係關於較佳指感染性副黏液病毒科病毒之可表現N基因之RNA序列，該RNA序列側接於編碼序列之5´端(亦即與終止密碼子互補之RNA三聯體之5´端)且包括該基因之基因端序列。因此，更特定而言，本文所提及之「5´非編碼區序列」係與較佳指感染性副黏液病毒科病毒之可表現N基因之整個5´非編碼序列一致之RNA序列。亦更特定而言，本文所提及之「5´非編碼區」係與副黏液病毒科病毒之N基因之非編碼序列一致之RNA序列，其中該非編碼序列側接(a)編碼序列及(b)連結該N基因與P基因之基因間序列。
如本文中所使用，術語副黏液病毒科病毒之特定基因(例如H基因)之「3´非編碼區」特定言之係關於較佳指感染性副黏液病毒科病毒之可表現特定基因(例如H基因)的RNA序列，該RNA序列側接於編碼序列之3´端(亦即與起始密碼子互補之RNA三聯體之3´端)且包括該基因之基因起始序列。因此，更特定而言，本文所提及之「3´非編碼區序列」係與較佳指感染性副黏液病毒科病毒之可表現特定基因(例如H基因)之整個3´非編碼序列一致之RNA序列。亦更特定而言，本文所提及之「3´非編碼區」係與副黏液病毒科病毒之特定基因(例如H基因)之非編碼序列一致之RNA序列，其中該非編碼序列側接(a)編碼序列及(b)連結該基因與3´方向上之下一個基因之基因間序列。
如本文中所使用，術語「基因間區域」特定言之係指連結副黏液病毒科病毒基因之5´端與副黏液病毒科病毒5´方向上之毗鄰基因之3´起點的RNA序列。
本文所用之術語「基因起始序列」特定言之係等同術語「基因起始信號」。
應理解，如本文中分別使用之術語「副黏液病毒科病毒之基因體啟動子」等同術語「副黏液病毒科病毒之基因體前導序列」，且術語「CDV之基因體啟動子」等同術語「CDV之基因體前導序列」。分子生物學定義
如本文所闡述之片語「側接於……之5´端之序列」尤其等效於片語「與……之5´端共價連接之序列」或個別地片語「其中其3'末端核苷酸與……之5´末端核苷酸共價連接之序列」，且其中尤其應理解，該兩個末端核苷酸共價連接於附接至戊醣之5'碳之磷酸根基與毗鄰戊醣之3'碳原子之間。
如本文所闡述之片語「側接於……之3´端之序列」尤其等效於片語「與……之3´端共價連接之序列」或個別地片語「其中其5'末端核苷酸與……之3´末端核苷酸共價連接之序列」，且其中尤其應理解，該兩個末端核苷酸共價連接於戊醣之3'碳原子與附接至毗鄰戊醣之5'碳之磷酸根基之間。
應理解，如本發明之上下文中所使用，術語「Kozak序列」特定言之係關於編碼參與藉由核糖體識別轉譯起始位點之mRNA序列之核苷酸序列。較佳地，在本發明之上下文中，編碼Kozak序列之RNA序列係可轉錄成側接於其中起始密碼子(AUG)之5´端之mRNA分子序列且用於引發轉譯過程的RNA序列。
業內已知之術語「載體」係指用於將遺傳物質傳遞至宿主細胞中之聚核苷酸構築體、通常質體或細菌人工染色體。載體可為(例如)細菌、病毒、噬菌體、細菌人工染色體、黏粒或質體。本文所用之載體可由DNA或RNA構成或含有二者。在一些實施例中，載體係由DNA構成。在一些實施例中，載體係感染性病毒。此一病毒載體含有以攜載外來基因之方式操縱之病毒基因體，該外來基因在細胞培養物或宿主動物中皆無病毒載體複製功能。根據本發明之特定態樣，載體可用於各種態樣，例如僅傳遞遺傳物質、用於轉染宿主細胞或生物體、用作疫苗(例如DNA疫苗)或用於基因表現目的。基因表現係闡述蛋白質在細胞中之生物合成(如藉由稱為基因之特定聚核苷酸序列所引導)之術語。在一具體態樣中，載體可為「表現載體」，其係在存在於適當環境中時能夠引導表現由藉由載體攜載之一或多種基因編碼之蛋白質之載體。
載體及製備及/或使用表現載體(或重組體)之方法可尤其根據或類似於關於DNA表現載體揭示於以下文獻中之方法：美國專利第4,603,112號、第4,769,330號、第5,174,993號、第5,505,941號、第5,338,683號、第5,494,807號、第4,722,848號、第5,942,235號、第5,364,773號、第5,762,938號、第5,770,212號、第5,942,235號、第382,425號、PCT公開案WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti, 「Applications of pox virus vectors to vaccination: An update」, PNAS USA 93: 11349-11353，1996年10月；Moss, 「Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety」, PNAS USA 93: 11341-11348，1996年10月；Smith等人，美國專利第4,745,051號(重組桿狀病毒)；Richardson, C. D. (編者), Methods in Molecular Biology 39, 「Baculovirus Expression Protocols」 (1995 Humana Press Inc.)；Smith等人，「Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector」, Molecular and Cellular Biology，1983年12月，第3卷，第12期，p. 2156-2165；Pennock等人，「Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector」, Molecular and Cellular Biology，1984年3月，第4卷，第3期，p. 406；EPA0 370 573；1986年10月16日提出申請之美國申請案第920,197號；歐洲專利申請案第265785號；美國專利第4,769,331號(重組皰疹病毒)；Roizman, 「The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors」, PNAS USA 93:11307-11312，1996年10月；Andreansky等人，「The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors」, PNAS USA 93: 11313-11318，1996年10月；Robertson等人，「Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes」, PNAS USA 93: 11334-11340，1996年10月；Frolov等人，「Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications」, PNAS USA 93: 11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；美國專利第5,591,439號、第5,552,143號；WO 98/00166；1996年7月3日提出申請之允許美國申請案第08/675,556號及第08/675,566號(重組腺病毒)；Grunhaus等人，1992, 「Adenovirus as cloning vectors」, Seminars in Virology (第3卷) p. 237-52, 1993；Ballay等人，EMBO Journal，第4卷，p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87，1990年4月；Prevec等人，J. Gen Virol. 70, 42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；及McClements等人，「Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease」, PNAS USA 93: 11414-11420，1996年10月；及美國專利第5,591,639號、第5,589,466號及第5,580,859號以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人，Nature；及Furth等人，Analytical Biochemistry。亦參見WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (慢病毒表現系統)；Sanford等人，美國專利第4,945,050號；Fischbach等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人，Seminars in Immunology，第9卷，pp. 271-283 (1997), (DNA載體系統)；Szoka等人，美國專利第4,394,448號(將DNA插入活細胞中之方法)；McCormick等人，美國專利第5,677,178號(致細胞病變病毒之用途)；及美國專利第5,928,913號(用於基因遞送之載體)；以及本文中所引用之其他文件。
術語「病毒載體」闡述藉由重組DNA技術以其進入宿主細胞中會產生特定生物活性(例如表現由載體攜載之轉基因)之方式操縱之基因修飾病毒。在一具體態樣中，轉基因係抗原。病毒載體可或可不在靶細胞、組織或生物體中為複製競爭性。特定而言，應理解，本文所用之術語「病毒載體(viral vector)」等效於術語「病毒載體(virus vector)」。
可使用業內熟知之任何適宜基因改造技術來生成病毒載體，包含(但不限於)細胞培養物中之限制性內核酸酶消解、連接、轉變、質體純化、DNA測序、轉染之標準技術，例如如Sambrook等人(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989))或K.Maramorosch及H. Koprowski (Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc. London, UK (2014))中所闡述。
病毒載體可納入來自任一已知生物體之基因體之序列。該等序列可以其天然形式納入或可以任一方式進行改質以獲得期望活性。舉例而言，序列可包括插入、缺失或取代。
病毒載體可包含用於所關注兩種或更多種蛋白質之編碼區。舉例而言，病毒載體可包含用於第一所關注蛋白之編碼區及用於第二所關注蛋白之編碼區。第一所關注蛋白及第二所關注蛋白可相同或不同。在一些實施例中，病毒載體可包含用於所關注第三蛋白或第四蛋白之編碼區。所關注第三蛋白及第四蛋白可相同或不同。由一種病毒載體編碼之所關注兩種或更多種蛋白質之總長度可有所變化。舉例而言，兩種或更多種蛋白質之總長度可為至少約200個胺基酸。至少約250個胺基酸、至少約300個胺基酸、至少約350個胺基酸、至少約400個胺基酸、至少約450個胺基酸、至少約500個胺基酸、至少約550個胺基酸、至少約600個胺基酸、至少約650個胺基酸、至少約700個胺基酸、至少約750個胺基酸、至少約800個胺基酸或更長。
術語「病毒載體」及「病毒構築體」可互換使用。
本文所用之術語「構築體」係指重組核酸(例如質體)、BAC或人工生成之重組病毒。
術語「質體」係指獨立於細菌宿主細胞內之細菌染色體複製之細胞質DNA。在本發明之一具體態樣中，術語「質體」及/或「轉移質體」係指可用於構築(例如)用於插入病毒載體中之表現盒之重組DNA技術之元件。在另一具體態樣中，術語「質體」可用於指示可用於DNA接種疫苗目的之質體。
如本文中所使用，術語「核酸」及「聚核苷酸」可互換使用且係指任一核酸。術語「核酸序列」應理解為等效於術語「核苷酸序列」。術語「核苷酸序列」應理解為等效於術語「聚核苷酸序列」。
本文所用之術語「核酸」、「核酸序列」、「核苷酸序列」、「聚核苷酸」、「聚核苷酸序列」、「RNA序列」或「DNA序列」係指寡核苷酸、核苷酸或聚核苷酸及其片段及部分且係指基因體或合成起源之DNA或RNA，其可為單鏈或雙鏈且代表有義或反義鏈。序列可為非編碼序列、編碼序列或二者之混合物。本發明核酸序列可使用熟習此項技術者熟知之標準技術製得。
術語「核酸」及「聚核苷酸」亦特定而言包含由除5個生物鹼基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)外之鹼基構成之核酸。
如本文中所使用，術語「啟動子」或「啟動子序列」意指允許結合RNA聚合酶且引導轉錄基因之核苷酸序列。通常，啟動子位於基因中鄰近基因之轉錄起始位點之5'非編碼區中。啟動子內用於引發轉錄之序列元件之特徵通常在於共有核苷酸序列。啟動子之實例包含(但不限於)來自細菌、酵母、植物、病毒及動物(例如哺乳動物(包含馬、豬、牛及人類)、鳥或昆蟲)之啟動子。啟動子可為誘導型、抑制型及/或組成型。誘導型啟動子引發在其控制下因應於培養條件之一定變化(例如溫度變化)增加來自DNA之轉錄程度(Ptashne, 2014)。熟習此項技術者熟知之啟動子之實例係(例如) SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人類延長因子α啟動子、桿狀病毒多角體蛋白啟動子。
術語「互補核苷酸序列」闡述聚核苷酸(例如DNA或RNA)之兩條配對鏈之一條鏈。互補鏈之核苷酸序列映現其配對鏈之核苷酸序列，從而對於每一腺苷而言其含有胸腺嘧啶(或對於RNA而言含有尿嘧啶)，對於每一鳥嘌呤而言其含有胞嘧啶，且反之亦然。舉例而言，5’-GCATAC-3’之互補核苷酸序列係3’-CGTATG-5’或對於RNA而言係3’-CGUAUG-5’。
本文所用之術語「基因」、「所關注基因」具有相同含義且係指編碼所關注產物之任一長度之聚核苷酸序列。基因可進一步包括位於編碼序列之前(5´非編碼或未轉譯序列)及之後(3´非編碼或未轉譯序列)之調控序列。所選序列可為全長或截短、融合或加標籤基因，且可為cDNA、基因體DNA或DNA片段。通常應理解，編碼多肽或RNA之基因體DNA可包含自成熟信使RNA (mRNA)剪接且由此不存在於編碼相同多肽或RNA之cDNA中之非編碼區(亦即內含子)。其可為天然序列、亦即天然形式，或可經突變，或包括衍生自不同來源之序列或另外視需要經修飾。該等修飾包含密碼子最佳化以最佳化在所選宿主細胞中之密碼子使用或最佳化加標籤。另外，其可包含去除或添加順式作用位點(例如(隱性)剪接供體、受體位點及分支點、多聚腺苷酸化信號、TATA-盒、chi位點、核糖體進入位點、重複序列、二級結構(例如莖環)、用於轉錄因子或其他調控因子之結合位點、限制酶位點等)以得到僅少數(但不限於)實例。所選序列可編碼分泌、細胞質、細胞核、膜結合或細胞表面多肽。
本文所用之「必需基因(essential gene)」或「必需基因(essential genes)」分別尤其意欲涵蓋專用於宿主細胞中之複製之基因。
本文所用之術語「所關注核苷酸序列」係較所關注基因更一般之術語，此乃因其未必包括基因，但可包括基因之要素或部分或其他基因資訊(例如ori (複製起點))。所關注核苷酸序列可為任一DNA或RNA序列，不論其是否包括編碼序列。
術語「轉錄」闡述mRNA在細胞中之生物合成。
本文所用之術語「表現」係指在宿主細胞內轉錄及/或轉譯核酸序列。根據本發明之具體態樣，術語「表現」係指在宿主細胞內轉錄及/或轉譯異源性及/或外源性核酸序列。可基於存在於細胞中之相應RNA或mRNA之量或由所選序列所編碼期望多肽之量來測定期望產物在宿主細胞中的表現程度。舉例而言，可藉由北方印漬雜交(Northern blot hybridization)、核糖核酸酶RNA保護、原位雜交至細胞RNA或藉由RTqPCR (逆轉錄且隨後定量PCR)來量化自所選序列轉錄之mRNA。可藉由各種方法來量化自所選序列表現之蛋白質，例如藉由ELISA、藉由西方印漬、藉由放射免疫分析、藉由免疫沈澱、藉由分析蛋白質之生物活性或藉由免疫染色蛋白質且隨後進行FACS分析。
術語「表現盒」或「轉錄單元」或「表現單元」定義載體、構築體或聚核苷酸序列內含有一或多種擬轉錄基因之區域，其中編碼轉錄基因之核苷酸序列以及含有含於表現盒內之調控元件之聚核苷酸序列彼此可操作地連接。其係轉錄自啟動子且藉由至少一個多聚腺苷酸化信號來終止轉錄。在一具體態樣中，其係轉錄自一個單一啟動子。因此，不同基因至少以轉錄方式連接。可轉錄一種以上蛋白質或產物且自每一轉錄單元(多順反子轉錄單元)表現。每一轉錄單元包括轉錄及轉譯任一含於該單元內之所選序列所需之調控元件。另外，每一轉錄單元可含有相同或不同之調控元件。舉例而言，每一轉錄單元可含有可用於轉錄單元內基因之功能連接之相同終止子、IRES元件或內含子。載體或聚核苷酸序列可含有一個以上之轉錄。
術語「病毒效價」係每一體積病毒製劑中之感染性單元之量度。病毒效價係生物程序中之終點且定義為平行實施之某一比例測試展示效應之稀釋度(Reed及Muench, 1938)。具體而言，組織培養感染劑量50/毫升(TCID50/ml)給出病毒製劑之如下稀釋度：以該稀釋度平行接種之諸多細胞培養物中之50%發生感染。
「轉錄調控元件」通常包括擬表現基因序列上游之啟動子、轉錄起始及終止位點及多聚腺苷酸化信號。
術語「轉錄起始位點」係指構築體中對應於納入一級轉錄物(亦即mRNA前體)中之第一核酸之核酸。轉錄起始位點可與啟動子序列重疊。
「終止信號」或「終止子」或「多聚腺苷酸化信號」或「polyA」或「轉錄終止位點」或「轉錄終止元件」係如下信號序列：其在真核mRNA之3'端之特定位點處引起裂解且在經裂解3'端轉錄後納入約100 - 200腺嘌呤核苷酸之序列(polyA尾部)，且由此使得RNA聚合酶終止轉錄。多聚腺苷酸化信號包括裂解位點上游之約10-30個核苷酸之序列AATAAA及位於下游之序列。已知各種多聚腺苷酸化元件，例如tk polyA、SV40晚期及早期polyA、BGH polyA (例如闡述於美國專利第5,122,458號中)或倉鼠生長激素polyA (WO2010010107)。
「轉譯調控元件」包括用於每一擬表現個別多肽之轉譯起始位點(AUG)、終止密碼子及polyA信號。內核糖體進入位點(IRES)可包含於一些構築體中。為最佳化表現，可設計去除、添加或改變擬表現核酸序列之5'-及/或3'-未轉譯區以消除任何潛在額外不適當替代轉譯起始密碼子或其他可在轉錄或轉譯層面上干擾或減小表現之序列。可將共有核糖體結合位點(Kozak序列)插入緊鄰起始密碼子之上游處以增強轉譯且由此增強表現。增加此核糖體結合位點周圍之A/U含量可增進更有效之核糖體結合。
根據定義，在來自不同(病毒)物種時，插入宿主細胞中之每一聚核苷酸序列或每一基因及由此編碼之各別蛋白質或RNA稱為關於宿主細胞之「外源性」、「外源性序列」、「外源性基因」、「外源性編碼序列」。如本文針對所關注序列或基因(例如抗原)所使用，術語「外源性」意指，該所關注序列或基因、具體而言該抗原表現於其天然物種背景之外。因此，CPV VP2抗原係關於副黏液病毒科病毒載體之外源性抗原之一種實例(參見實例2)。如本文中所使用，術語「外源性RNA」或「外源性核酸序列」特定言之係指自外部來源(例如自重組序列)引入副黏液病毒科病毒之基因體中之核酸序列。該外部來源之實例包括副黏液病毒科病毒序列以及非副黏液病毒科病毒衍生序列。更特定而言，引入外源性核酸序列使得基因體或基因分別具有非天然部分。如本文中所使用，術語「外源性RNA」由此特定言之係指非天然地發現於副黏液病毒科病毒基因體中之核苷酸序列。該非天然部分或非天然發現序列分別亦可源自將一個天然核苷酸序列插入另一天然核苷酸序列中。
根據定義，插入宿主細胞中之每一聚核苷酸序列或每一基因及由此編碼之各別蛋白質或RNA關於宿主細胞稱為「異源」、「異源序列」、「異源基因」、「異源編碼序列」、「轉基因」或「異源蛋白」。即使擬引入序列或擬引入基因與宿主細胞之內源性序列或內源性基因一致，此定義亦適用。舉例而言，根據定義，較副黏液病毒科野生型病毒以不同位點或修飾形式引入副黏液病毒科病毒載體中之副黏液病毒科病毒之N基因之5´非編碼區係異源性序列。如本文針對所關注序列或基因(例如抗原)所使用，術語「異源性」意指，該所關注序列或基因、具體而言該抗原表現於其天然亞物種背景之外。
術語「非天然」意指並不天然出現於此背景中之任一所關注序列或基因(例如抗原)，例如來自不同物種之混合序列或所關注序列或基因(例如抗原)或因人工突變、插入、缺失或諸如此類而並非天然產物之所關注序列或基因(例如抗原)。
在本發明之整個說明書中，術語「重組」可與術語「非天然」、「異源性」及「外源性」互換使用。因此，「重組」蛋白係自異源性或外源性聚核苷酸序列表現之蛋白質。如針對病毒所用之術語重組體意指藉由人工操縱病毒基因體產生之病毒。包括異源性或外源性序列(例如外源性抗原編碼序列)之病毒係重組病毒。術語重組病毒及術語非天然病毒可互換使用。
因此，術語「異源性載體」意指包括異源性或外源性聚核苷酸序列之載體。術語「重組載體」意指包括異源性或重組聚核苷酸序列之載體。
如本文中所使用，術語「可操作地連接」用於闡述調控元件與基因或其編碼區之間之連結。通常，基因表現係在一或多種調控元件(例如(但不限於)組成型或可誘導啟動子、組織特異性調控元件及增強子)之控制下進行。基因或編碼區可視為與調控元件「可操作地連接」或「操作性連接」或「可操作地締合」，此意味著該基因或編碼區由調控元件控制或影響。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接至編碼序列。
特定而言，應理解，在本發明之上下文中，術語「與序列[……]一致」等效於術語「與序列具有[……]序列一致性」。
如本文中所使用，特定而言，應理解，術語「與SEQ ID NO:Y之序列至少X%一致」分別等效於術語「在SEQ ID NO:Y之長度上與SEQ ID NO:Y之序列至少X%一致」或術語「在SEQ ID NO:Y之整個長度上與SEQ ID NO:Y之序列至少X%一致」。在此背景中，「X」係66至100之任一數量，尤指選自66至100之任一整數，從而「X%序列一致性」代表本文所提及序列一致性百分比中之任一者。個別地，此背景中之「Y」係選自1至36Z任一整數，從而「SEQ ID NO:Y」代表所本文提及之任一SEQ ID NO。
另外應理解，如本文所闡述，術語「與至少99%一致」亦(在該範圍之一個極端)分別包括且係關於術語「100%一致」或「與序列一致」。
業內已知之「序列一致性」係指兩個或更多個多肽序列或兩個或更多個聚核苷酸序列、亦即參考序列與擬與參考序列進行比較之給定序列之間之關係。藉由在將序列最佳地比對以產生最高序列相似性程度之後比較給定序列與參考序列來測定序列一致性，如藉由該等序列串之間之匹配所測定。在該比對時，基於逐個位置來確定序列一致性，舉例而言，若在一個位置處核苷酸或胺基酸殘基一致，則該等序列在該位置處「一致」。然後將該等位置一致性之總數除以參考序列中之核苷酸或殘基之總數以得到序列一致性%。序列一致性可易於藉由已知方法來計算，包含(但不限於)闡述於以下文獻中之方法：Computational Molecular Biology, Lesk, A. N.編輯，Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編輯，Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.及Griffin, H. G.編輯，Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編輯，M. Stockton Press, New York (1991)；及Carillo, H.及Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)，其教示內容以引用方式併入本文中。設計用於測定序列一致性之較佳方法以得到所測試序列之間之最大匹配。將測定序列一致性之方法編成測定給定序列間之序列一致性之公開獲得之電腦程式。該等程式之實例包含(但不限於) GCG程式包(Devereux, J.等人，Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA (Altschul, S. F.等人，J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)。BLASTX程式可自NCBI及其他來源公開獲得(BLAST Manual, Altschul, S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F.等人，J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)，其教示內容以引用方式併入本文中)。該等程式最佳地使用默認空位權重比對序列以在給定序列與參考序列之間產生最高序列一致性程度。作為闡釋，對於聚核苷酸具有與參考核苷酸序列具有至少(例如) 85%，較佳地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%、99.9% 「序列一致性」之核苷酸序列而言，預計給定聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致，只是給定聚核苷酸序列可包含最高15，較佳地最高10、甚至更佳地最高5個點突變/參考核苷酸序列之100個核苷酸。換言之，在具有相對於參考核苷酸序列具有至少85%，較佳地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%、99.9%一致性之核苷酸序列之聚核苷酸中，參考序列中最高15%，較佳地10%、9%、8%、7%、6%、甚至更佳地5%、4%、3%、2%、1%、0.1%之核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或參考序列中全部核苷酸中最高15%，較佳地10%、9%、8%、7%、6%、甚至更佳地5%、4%、3%、2%、1%、0.1%數量之核苷酸可插入參考序列中。參考序列之該等突變可發生在參考核苷酸序列之5’或3’末端位置或在彼等末端位置之間之任何位置，其係個別地散佈在參考序列中之各核苷酸之間或在參考序列內呈一或多個鄰接基團形式。類似地，對於多肽具有與參考胺基酸序列具有至少(例如) 85%，較佳地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之給定胺基酸序列而言，預計多肽之給定胺基酸序列與參考序列一致，只是給定多肽序列可包含最高15，較佳地最高10、9、8、7、6、甚至更佳地最高5、4、3、2、1個胺基酸改變/參考胺基酸序列之100個胺基酸。換言之，為獲得與參考胺基酸序列具有至少85%，較佳地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之給定多肽序列，參考序列中最高15%，較佳地最高10%、9%、8%、7%、甚至更佳地最高5%、4%、3%、2%、1%之胺基酸殘基可缺失或經另一胺基酸取代，或可將佔參考序列中之總胺基酸殘基數之最高15%，較佳地最高10%、9%、8%、7%、甚至更佳地最高5%、4%、3%、2%、1%之數量的胺基酸插入參考序列中。參考序列之該等改變可發生在參考胺基酸序列之胺基或羧基末端位置或在彼等末端位置之間之任何位置，其係個別地散佈在參考序列中之各殘基之間或在參考序列內呈一或多個鄰接基團形式。較佳地，不同殘基位置因保守胺基酸取代而不同。然而，在測定序列一致性時，並不包含保守取代作為匹配。
術語「序列一致性」或「一致性百分比」可在本文中互換使用。出於本發明目的，在本文中應明確，為測定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之百分比一致性，出於最佳對比目的對比該等序列(舉例而言，可將間隙引入第一胺基酸或核酸之序列中以用於與第二胺基或核酸序列進行最佳對比)。然後比較相應胺基酸或核苷酸位置之胺基酸或核苷酸殘基。在第一序列中之位置被與第二序列中之相應位置相同之胺基酸或核苷酸殘基佔據時，則該等分子在該位置一致。兩個序列之間之一致性%係該等序列所共用之一致位置數之函數(亦即，一致性% =一致位置數/總位置(亦即重疊位置)數×100)。較佳地，兩個序列具有相同長度。
可在兩個所比較序列之整個長度中或在兩個序列之片段中實施序列對比。通常，在兩個所比較序列之全長中實施對比。然而，可在(例如) 20、50、100或更多個鄰接胺基酸殘基之區域中實施序列一致性測定。
熟習此項技術者應知曉，實際上，可利用若干不同電腦程式來測定兩個序列之間之一致性。舉例而言，兩個序列之間之序列對比及一致性百分比之測定可使用數學算法來達成。在一較佳實施例中，使用Needleman及Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970))算法(其已納入Accelrys GCG軟體包(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/處獲得)中之GAP程式中)、使用Blosum 62矩陣或PAM250矩陣及空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6)來測定兩個胺基酸或核酸序列之間之百分比一致性。熟習此項技術者應瞭解，所有該等不同參數將產生略微不同之結果，但在使用不同算法時兩個序列之整體百分比一致性並不顯著改變。
可進一步使用本發明之蛋白質序列及核酸序列作為「詢問序列」來實施針對公共資料庫之檢索，以例如鑒定其他家族成員或相關序列。可使用Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10之BLASTN及BLASTP程式(2.0版)實施該等檢索。可使用BLASTP程式、評分=50、字長=3實施BLAST蛋白質檢索以獲得本發明之蛋白質分子之同源胺基酸序列。為獲得用於對比目的之空位比對，可如Altschul等人(1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402中所闡述來利用空位BLAST。在利用BLAST及空位BLAST程式時，可使用各別程式(例如BLASTP及BLASTN)之預設參數。參見國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 處之主頁。疫苗定義
「免疫原性或免疫組合物」係指包括至少一種抗原或其免疫原性部分之物質之組合物，其在宿主中引發細胞或抗體調介之對組合物之免疫反應的免疫學反應。
本文使用之術語「抗原」在業內已眾所周知，且包含具有免疫原性之物質(亦即免疫原)以及誘導免疫學不反應性或無反應性(亦即身體之防禦機制對外來物質無反應)之物質。如本文中所使用，術語「抗原」欲指含有或包括表位之全長蛋白質以及其肽片段。
術語「產食性動物」意指用於人類消費之動物，例如豬、牛、家禽、魚及諸如此類，較佳地產食性動物意指豬及牛、最佳地豬。
本文所用之「免疫原性組合物」可係指多肽或蛋白質，例如引發如本文所闡述之免疫學反應之病毒表面蛋白。術語「免疫原性片段」或「免疫原性部分」係指蛋白質或多肽之片段或截短及/或取代形式，其包含一或多個表位且由此引發本文所闡述之免疫學反應。一般而言，該等截短及/或取代之形式或片段將包括來自全長蛋白質之至少六個鄰接胺基酸。該等片段可使用任一數量之業內熟知之表位定位技術來鑑別。例如參見Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E. Morris編輯，1996) Humana Press, Totowa, New Jersey。舉例而言，線性表位可藉由在固體載體上同時合成大量肽(該等肽對應於蛋白質分子之部分)且使肽與抗體反應同時肽仍附接至載體來測定。業內已知且闡述該等技術，例如參見美國專利第4,708,871號；Geysen等人(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :3998-4002；及Geysen等人(1986) Molec. Immunol. 23:709-715。類似地，藉由使用(例如) x射線結晶學及二維核磁共振測定胺基酸之空間構形來容易地鑑別構形表位。參見Epitope Mapping Protocols (見上文)。該定義內亦包含合成抗原，例如多表位、側接表位及其他重組或合成源抗原。例如參見Bergmann等人(1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781；Bergmann等人(1996), J. Immunol. 157:3242-3249；Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408；及Gardner等人，(1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 1998年6月28日至7月3日。(其教示及內容皆以引用方式併入本文中。)
本文所用之術語「疫苗」係指包括至少一種在動物中誘導免疫學反應之免疫活性組分且可能但不一定包括一或多種增強活性組分之免疫學活性之額外組分的醫藥組合物。疫苗可另外包括醫藥組合物之其他典型組分。藉由區別，疫苗之免疫學活性組分可包括呈其原始形式之完整病毒顆粒或所謂經修飾活疫苗(MLV)中之減毒顆粒或藉由適當方法在所謂死疫苗(KV)中不活化之顆粒。在另一形式中，疫苗之免疫學活性組分可包括生物體之適當元件(亞單位疫苗)，其中該等元件係藉由以下方式生成：藉由破壞整個顆粒或含有該等顆粒之生長培養物及視情況隨後之純化步驟以產生期望結構，或藉由合成方法，包含使用基於(例如)細菌、昆蟲、哺乳動物或其他物種之適宜系統的適當操縱加上視情況隨後之分離及純化程序，或藉由使用適宜醫藥組合物直接納入遺傳物質來誘導需要疫苗之動物中之合成過程(聚核苷酸疫苗接種)。疫苗可包括一種或同時一種以上之上述元件。如在本發明之具體態樣中所使用，「疫苗」係指活疫苗或活病毒，亦稱為重組疫苗。在本發明之另一具體態樣中，「疫苗」係指包含類病毒顆粒(VLP)之不活化或死病毒。因此，疫苗可為亞單位疫苗或死(KV)或不活化疫苗。
術語感染複數「(M.O.I.)」闡述多少感染單位，例如，每個細胞使用病毒製劑之TCID50以感染培養之細胞。舉例而言，0.01之M.O.I.意指對於培養容器中之每100個細胞，接種一個感染單位。
術語「DNA接種疫苗」或「聚核苷酸接種疫苗」意指使用適宜醫藥組合物直接接種遺傳物質。
不活化之各種物理及化學方法為業內已知。術語「不活化」係指先前有毒力或無毒力之病毒或細菌經輻照(紫外線(UV)、X射線、電子束或γ輻射)、加熱或化學處理以不活化或殺死該病毒或細菌，同時保留其免疫原性。適宜不活化劑包含β-丙內酯、二元或β-或乙醯基-次乙亞胺、戊二醛、臭氧及福馬林(formalin) (甲醛)。
對於由福馬林或甲醛不活化，通常將甲醛與水及甲醇混合以產生福馬林。添加甲醇可防止不活化過程中之降解或交叉反應。一個實施例使用約0.1%至1%之37%甲醛溶液來不活化病毒或細菌。至關重要的是，調節福馬林之量以確保材料不活化，但不會多至發生高劑量之副效應。
更特定而言，術語「不活化」在病毒之上下文中意指該病毒不能在活體內或活體外複製，且分別，術語「不活化」在細菌之上下文中意指細菌不能在活體內或活體外複製。舉例而言，術語「不活化」可係指已經在活體外繁殖且然後使用化學或物理方式使其不活化以使其不再能夠複製之病毒。在另一實例中，術語「不活化」可以指已經繁殖且然後使用化學或物理方式使其不活化之細菌，從而產生細菌、細菌之片段或組分之懸浮液，例如產生可用作疫苗之組份之菌苗。
如本文中所使用，術語「不活化」、「殺死」或「KV」可互換使用。
術語「活疫苗」係指包括活生物體或複製勝任病毒或病毒載體之疫苗。
「醫藥組合物」基本上由一或多種能夠改變其所投與之生物體或生物體中或上面存活之生物體之生理學(例如免疫學)功能之成分組成。該術語包含(但不限於)抗生素或抗寄生蟲劑以及通常用於實現某些其他目的(例如但不限於處理性狀、不孕性、穩定性、經腸或非經腸途徑(例如經口、鼻內、靜脈內、肌內、皮下、真皮內或其他適宜途徑)投與組合物之可行性、投與後耐受性或受控釋放性質)之其他成分。該醫藥組合物之一個非限制性實例僅僅係用於顯示目的給出，可如下所述來製備：將經感染細胞培養物之細胞培養物上清液與穩定劑(例如亞精胺及/或牛血清白蛋白(BSA))混合且隨後將混合物藉由其他方法進行凍乾或去水。在疫苗接種之前，然後將混合物在水溶液(例如鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS))或非水溶液(例如油乳液、基於鋁之佐劑)中再水化。
如本文中所使用，「醫藥或獸醫學可接受之載劑」包含任何及全部溶劑、分散介質、塗覆劑、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑及諸如此類。在一些較佳實施例及尤其包含凍乾之免疫原性組合物之彼等中，用於本發明之穩定劑包含用於凍乾或冷凍乾燥之穩定劑。
在一些實施例中，本發明之免疫原性組合物含有佐劑。本文所用之「佐劑」可包含氫氧化鋁及磷酸鋁、皂素，例如Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA)、GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL)、油包水型乳液、水包油型乳液、水包油包水型乳液。特定而言，乳液可基於輕質液體石蠟油(歐洲藥典(European Pharmacopea)型)；類異戊二烯油，例如角鯊烷或角鯊烯；由烯烴(特定而言異丁烯或癸烯)寡聚產生之油；酸或含有直鏈烷基之醇之酯，更特定而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、三-(辛酸甘油酯/癸酸甘油酯)或丙二醇二油酸酯；具支鏈脂肪酸或醇之酯，特定而言異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑較佳係非離子表面活性劑，特定而言係以下之酯：山梨醇酐、二縮甘露醇(例如無水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇及油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸(其視情況經乙氧基化)及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特定而言Pluronic產品，尤其L121。參見Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants (Stewart-Tull編輯，D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY，第51-94頁(1995)及Todd等人，Vaccine 15:564-570 (1997)。實例性佐劑係由M. Powell及M. Newman編輯之「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach」，Plenum Press, 1995之第147頁上闡述之SPT乳液及同一本書第183頁上闡述之乳液MF59。
佐劑之另一實例係選自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物的化合物。有利佐劑化合物係丙烯酸或甲基丙烯酸尤其與醣或多元醇之聚烯基醚交聯之聚合物。該等化合物以術語卡波姆(carbomer)為人所知(Phameuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。熟習此項技術者亦可參照美國專利第2,909,462號，其闡述與具有至少3個，較佳地不超過8個羥基之多羥基化化合物交聯之該等丙烯酸聚合物，至少三個羥基之氫原子由具有至少2個碳原子之不飽和脂肪族基團代替。較佳基團係含有2至4個碳原子之基團，例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不飽和基團。不飽和基團可自身含有其他取代基，例如甲基。以名稱CARBOPOL®; (BF Goodrich, Ohio, USA)銷售之產品尤其適合。其與烯丙基蔗糖或烯丙基新戊四醇交聯。其中，可提及Carbopol 974P、934P及971P。最佳係使用CARBOPOL® 971P。在馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物中，尤其係共聚物EMA (Monsanto)，其係馬來酸酐與乙烯之共聚物。該等聚合物在水中之溶解產生酸溶液，其將被中和，較佳地中和至生理學pH以產生將引入免疫原性、免疫學或疫苗組合物本身之佐劑溶液。
其他適宜佐劑包含(但不限於)尤其RIBI佐劑系統(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx, Atlanta GA)、SAF-M (Chiron, Emeryville CA)、單磷醯脂質A、阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑、來自大腸桿菌(E. coli) (重組或其他)之熱不穩定腸毒素、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁醯二肽或其天然或重組細胞介素或其類似物或內源細胞介素釋放之刺激劑等。
預計佐劑可以每劑量約100 μg至約10 mg之量，較佳地以每劑量約100 μg至約10 mg之量、更佳地以每劑量約500 μg至約5 mg之量、甚至更佳地以每劑量約750 µg至約2.5 mg之量及最佳地以每劑量約1 mg之量添加。或者，以最終產物之體積計，佐劑可為約0.01%至50%之濃度，較佳為約2%至30%之濃度，更佳為約5%至25%之濃度，仍更佳為約7%至22%之濃度，且最佳為10%至20%之濃度。
「稀釋劑」可包含水、鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及諸如此類。等滲劑可尤其包含氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。穩定劑尤其包含白蛋白及乙二胺四乙酸之鹼金屬鹽。
「分離」意指自其天然狀態「由人手」改變，亦即若其在自然界中存在，則其已經改變或自其初始環境中取出，或兩者兼而有之。舉例而言，天然存在於活生物體中之聚核苷酸或多肽並非「分離的」，但自其天然狀態之共存物質分離之相同聚核苷酸或多肽係「分離的」，如本文所用之術語。
「減毒」意指降低病原體之毒性。在本發明中，「減毒」與「無毒」同義。在本發明中，減毒病毒係毒性已降低從而不會引起感染之臨床體徵但能夠在目標哺乳動物中誘導免疫反應者，但亦可意指與感染非減毒病毒或病原體且未接受減毒病毒之動物之「對照組」相比在感染減毒病毒，尤指所主張之EHV-1 RacH病毒載體之動物中臨床體徵之發生率或嚴重程度有所降低。在此上下文中，術語「減小(reduce/reduced)」意指與如上文所定義之對照組相比減小至少10%，較佳地25%、甚至更佳地50%、仍更佳地60%、甚至更佳地70%、仍更佳地80%、甚至更佳地90%及最佳地100%。因此，減毒之無毒病原體(例如所主張之減毒之病毒載體，尤指所主張之EHV-1 (較佳地RacH)病毒載體)適於產生經修飾之活疫苗(MLV)或經修飾之活免疫原性組合物。
在本文中，「有效劑量」意指(但不限於)引起或能夠引發免疫反應且在投與抗原之動物中使得減少臨床症狀之量。
如本文中所使用，術語「有效量」在組合物之背景中意指能夠誘導免疫反應且降低動物之疾病之感染或事件之嚴重程度之免疫原性組合物的量。特定而言，有效量係指每劑量之菌落形成單位(CFU)。或者，在療法之背景中，術語「有效量」係指足以減輕或改善疾病或病症或其一或多種症狀之嚴重程度或持續時間、防止疾病或病症進展、引起疾病或病症消退、防止與疾病或病症相關之一或多種症狀之復發、發展、發作或進展或增強或改良另一療法之預防或治療的療法之量。
「免疫反應」或「免疫學反應」意指(但不限於)對所關注之(免疫原性)組合物或疫苗發生細胞及/或抗體介導之免疫反應。通常，免疫或免疫學反應包含(但不限於)以下效應中之一或多者：產生或活化特異性針對所關注組合物中所包含之一或多種抗原之抗體、B細胞、輔助性T細胞、阻抑性T細胞及/或細胞毒性T細胞。較佳地，宿主將展示治療性或保護性免疫(記憶)反應，從而對新感染之抗性將增強及/或疾病之臨床嚴重程度降低。該保護將藉由症狀數量之減少、症狀嚴重程度之降低或無與病原體感染有關之一或多種症狀、病毒血症發作之延遲、病毒持久性降低、整體病毒負荷之降低及/或病毒排泄之降低來展現。
「保護抵抗疾病」、「保護免疫性」、「功能免疫性」、「臨床症狀之減少」、「中和抗體之誘導/產生及/或血清轉化」及類似片語意指藉由投與本發明之一或多種治療性組合物或其組合而產生之針對疾病或病狀之部分或完全反應，其導致比已暴露於疾病或感染之未經免疫個體所預計較不有害的效應。亦即，在經疫苗接種之個體中，感染之有害效應的嚴重程度減輕。在經疫苗接種之個體中，感染可經減輕、減緩或可能完全預防。在本文中，若意指完全預防感染，則對其進行具體說明。若未陳述完全預防，則該術語包含部分預防。
術語「中和抗體」係關於能夠藉由中和或抑制傳染原(通常係病毒，例如CDV或CPV)之生物效應來防止其感染細胞之抗體。中和可發生於抗體結合至特定病毒抗原以阻斷病原體進入其宿主細胞時。在一實例中，其防止病毒結合至其受體且使其遺傳物質進入細胞內部。
術語「抗體」或「免疫球蛋白」可在本文中互換使用，其包含全抗體及其任一抗原結合片段(抗原結合部分)或單鏈同族物。「抗體」包括至少一條重(H)鏈及一條輕(L)鏈。在天然IgG中，舉例而言，該等重鏈及輕鏈由二硫鍵互連且存在兩個配對之重鏈及輕鏈，該兩個鏈亦由二硫鍵互連。每一重鏈包括重鏈可變區(在本文中縮寫為VH )及重鏈恆定區。重鏈恆定區包括三個結構域CH1、CH2及CH3。每一輕鏈包括輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL )及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括一個結構域CL。VH 及VL 區域可進一步再分成超變區(稱為互補決定區(CDR))及更保守之區域(稱為框架區(FR)或接合(J)區(在重鏈及輕鏈中分別為JH或JL))，二者間雜排列。每一VH 及VL 由三個CDR、三個FR及J結構域構成，該等區域自胺基-末端至羧基-末端以下列順序配置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、J。重鏈及輕鏈之可變區與抗原結合。抗體之恆定區可調介免疫球蛋白與宿主組織或因子(包含免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)或體液因子(例如經典補體系統之第一組分(Clq)))之結合。
在本文中，「臨床體徵之發生率及/或嚴重程度之降低」或「臨床症狀之減少」意指(但不限於)與野生型感染相比，減少組中感染個體之數量、減少或消除展現感染之臨床體徵之個體之數量或降低一或多個個體中存在之任何臨床體徵之嚴重程度。舉例而言，其應係指病原體負荷之任何減少、病原體脫落、病原體傳播減少或瘧疾之症狀之任何臨床體徵減少。較佳地，與未接受組合物且被感染之個體相比，接受本發明之治療性組合物之一或多個個體之該等臨床體徵減少至少10%。更佳地，接受本發明組合物之個體之臨床體徵減少至少20%，較佳至少30%、更佳至少40%且甚至更佳至少50%。
術語「增加之保護」在本文中意指(但不限於)相對於未經疫苗接種之個體對照組，經疫苗接種之個體組之一或多種與由傳染原感染相關之臨床症狀在統計學上顯著減輕。術語「臨床症狀之統計學顯著減輕」意指(但不限於)經疫苗接種之個體組之至少一種臨床症狀的發病頻率比在攻擊傳染原後未經疫苗接種之對照組中低至少10%，較佳20%、更佳30%、甚至更佳50%且甚至更佳70%。
「持久保護」應係指持續至少3週、但更佳地至少3個月、仍更佳地至少6個月之改良之效能。在牲畜之情形下，最佳地，持久保護應持續直至動物出售用於肉類之平均年齡。
術語由病毒誘導之「病毒血症之減輕」意指(但不限於)進入動物血流之病毒減少，其中與未接受本發明組合物且可被感染之動物相比，接受該組合物之動物之血清中的病毒血症程度、即每毫升血清之病毒DNA或RNA拷貝數或每公合血清之噬菌斑形成菌落數減少至少50%。更佳地，接受本發明組合物之動物之病毒血症程度降低至少90%，較佳至少99.9%、更佳至少99.99%、且甚至更佳至少99.999%。
如本文中所使用，術語「病毒血症」特定而言應理解為病毒顆粒在動物、特定而言哺乳動物、鳥或昆蟲之血流中複製及/或循環之病狀。
「安全性」係指在疫苗接種後，在經疫苗接種之動物中不存在不良後果，包含(但不限於)：基於病毒之疫苗潛在地逆轉成有毒力、臨床上顯著之副效應，例如持久性、全身性疾病或在疫苗投與位點不可接受之發炎。
本文所用之術語「接種疫苗(vaccination或vaccinating)」或其變化形式意指(但不限於)包含投與本發明之免疫原性組合物之過程，在投與動物時，其引發或能夠引發(直接或間接)該動物之免疫反應。
在本發明之上下文中，「死亡率」係指由感染引起之死亡，且包含感染如此嚴重以致於將動物安樂死以防止痛苦並為其生命提供人道結局之情況。 調配物
投與組合物之個體較佳係動物，包含(但不限於)牛、馬、綿羊、豬、家禽(例如雞)、山羊、貓、狗、倉鼠、小鼠及大鼠，最佳哺乳動物係豬。
本發明調配物包括有效免疫量之一或多種免疫原性組合物及生理上可接受之媒劑。疫苗包括有效免疫量之一或多種免疫原性組合物及生理上可接受之媒劑。調配物應適用於投與方式。
免疫原性組合物(若需要)亦可含有極少量之潤濕劑或乳化劑或pH緩衝劑。免疫原性組合物可為液體溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或粉劑。口服調配物可包含標準載劑，例如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。 治療方法
較佳投與途徑包含(但不限於)鼻內、經口、真皮內及肌內。期望在飲用水中、最佳以單一劑量投與。熟習此項技術者將認識到，本發明組合物亦可以一個、兩個或更多個劑量藉由其他投與途徑來投與。舉例而言，該等其他途徑包含皮下、皮內、腹膜內、皮內，且根據治療之期望持續時間及有效性，本發明組合物可以例如每日計一次或若干次、亦間歇地以不同劑量(例如約103 至108 TCID50 (參見上述病毒效價))投與若干天、若干週或若干月。在本發明之一具體態樣中，劑量係約103 至108 TCID50，尤其對於活病毒/活疫苗。
若期望，組合物可提供於可包含含有活性成分之一或多種單位劑型的包裝或分配器裝置中。包裝可(例如)包括金屬或塑膠箔，例如泡罩包。包裝或分配器裝置可帶有用於投與，較佳地投與哺乳動物，尤指豬之說明書。該(等)容器可附帶有監管醫藥或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式之公告，該公告顯示該機構已批准用於人類投與之製造、使用或銷售。序列概述
本發明由此詳述及揭示下列序列，其中序列表中之序列係以5’-端至3’-端方向自左向右呈現，且其中： SEQ ID NO: 1 (RNA)對應於CDV之N基因之5´非編碼區， SEQ ID NO: 2 (RNA)對應於CDV之R基因之5´非編碼區， SEQ ID NO: 3 (RNA)對應於CDV之M基因之5´非編碼區， SEQ ID NO: 4 (RNA)對應於CDV之F基因之5´非編碼區， SEQ ID NO: 5 (RNA)對應於CDV之H基因之5´非編碼區， SEQ ID NO: 6 (RNA)對應於CDV之L基因之5´非編碼區， SEQ ID NO: 7 (RNA)對應於CDV之H基因之3´非編碼區， SEQ ID NO: 8 (RNA)對應於CDV之N基因之3´非編碼區， SEQ ID NO: 9 (RNA)對應於CDV之P基因之3´非編碼區， SEQ ID NO:10 (RNA)對應於CDV之M基因之3´非編碼區， SEQ ID NO:11 (RNA)對應於CDV之F基因之3´非編碼區， SEQ ID NO:12 (RNA)對應於CDV之L基因之3´非編碼區， SEQ ID NO:13 (RNA)對應於編碼Kozak序列之序列， SEQ ID NO:14 (RNA)對應於CDV之基因間序列， SEQ ID NO:15 (RNA)對應於編碼CPV之VP2蛋白之序列， SEQ ID NO:16 (RNA)對應於編碼H3-亞型血球凝集素之序列， SEQ ID NO:17 (RNA)對應於SEQ ID No: 14、1、15、13及7之組合， SEQ ID NO:18 (RNA)對應於SEQ ID No: 1、15、13、7及14之組合， SEQ ID NO:19 (RNA)對應於SEQ ID No: 14、1、16、13及7之組合， SEQ ID NO:20 (RNA)對應於SEQ ID No: 1、16、13、7及14之組合， SEQ ID NO:21 (RNA)對應於SEQ ID No: 14、1、15、13、7及14之組合， SEQ ID NO:22 (RNA)對應於SEQ ID No: 14、1、16、13、7及14之組合， SEQ ID NO:23 (RNA)對應於包括CDV之M、F、H及L基因之序列， SEQ ID NO:24 (RNA)對應於包括CDV之N及P基因之序列， SEQ ID NO:25對應於SEQ ID NO:1之DNA反向補體， SEQ ID NO:26對應於SEQ ID NO:13之DNA反向補體， SEQ ID NO:27對應於SEQ ID NO:7之DNA反向補體， SEQ ID NO:28對應於SEQ ID NO:14之DNA反向補體， SEQ ID NO:29對應於SEQ ID NO:23之DNA反向補體， SEQ ID NO:30對應於SEQ ID NO:24之DNA反向補體， SEQ ID NO:31對應於SEQ ID NO:15之DNA反向補體， SEQ ID NO:32對應於SEQ ID NO:16之DNA反向補體， SEQ ID NO:33對應於SEQ ID NO:21之DNA反向補體， SEQ ID NO:34對應於SEQ ID NO:22之DNA反向補體， SEQ ID NO:35對應於CPV VP2之胺基酸序列， SEQ ID NO:36對應於H3-亞型血球凝集素之胺基酸序列， SEQ ID NO:37 (RNA)對應於編碼PEDV S蛋白之序列， SEQ ID NO:38 (RNA)對應於編碼PEDV S蛋白之序列， SEQ ID NO:39 (RNA)對應於SEQ ID No: 14、1、38、13及7之組合， SEQ ID NO:40 (RNA)對應於SEQ ID No: 1、38、13、7及14之組合， SEQ ID NO:41 (RNA)對應於SEQ ID No: 14、1、38、13、7及14之組合， SEQ ID NO:42對應於SEQ ID NO:37之DNA反向補體， SEQ ID NO:43對應於SEQ ID NO:38之DNA反向補體， SEQ ID NO:44對應於SEQ ID NO:41之DNA反向補體， SEQ ID NO:45對應於PEDV S蛋白之胺基酸序列。 實例
本發明包含下列實例以證實本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，下列實例中所揭示之技術代表本發明者發現在實踐本發明中運行良好之技術，且由此可認為構成其實踐之較佳方式。然而，熟習此項技術者借助於本揭示內容應瞭解，可對所揭示特定實施例作出多種改變且仍獲得相同或類似結果，此並不背離本發明之精神及範圍。 實例1：A) 藉由 CDV 載體之 CPV-VP2 表現
在使用衍生自萊德利疫苗菌株且在P基因與M基因之間插入SEQ ID NO:17之序列之CDV骨架(該載體由此包括SEQ ID NO:21之序列)之活體外研究中，可展示犬細小病毒(類型2b) VP2蛋白在CDV相關螢光焦點中之細胞內表現。亦達成編碼犬細小病毒類型2c (CPV-2c) VP2蛋白之相應CDV載體(亦即位於區別在於該序列編碼CPV VP2)之各別結果。藉由免疫螢光針對兩種載體所獲得之結果指示，CPV之VP2蛋白強烈表現於所有CDV感染合胞體中。與CDV抗原不同，VP2累積於感染細胞之細胞核中且部分地累積於細胞質中，其在合胞體發育過程期間有所變化且可指示，CPV-VP2具有瞬時核輸送，但藉由常規搜索在VP2基因內檢測到並無假定核局部化序列，且亦未公開於科學文獻中。 B) 基因穩定性
藉由涉及冷凍-解凍循環之連續傳代在每一傳代結束時於Vero細胞系(亦即CDV產生細胞系)中評估實例1 A)之兩個CDV載體。為評價重組體之基因穩定性，在Vero細胞中實施20個連續細胞傳代。重組純系之測序揭示所插入 CPV VP2 序列及側接區之全基因穩定性 。編碼兩種蛋白質(在胺基酸層面上)之序列(incl.突變)保留不變。另外，使用免疫螢光(IF) 及西方印漬(WB) 可證實 ， 強VP2 表現 在所有傳代數期間存在於感染CDV-VP2重組體之細胞中。 C)活體外生長
在Vero細胞中生長實例1 A)及B)中所闡述之兩種CDV載體。在感染後144小時達到兩個重組體在滾瓶系統中之峰效價且效價在冷凍/解凍循環之後顯著增加，從而指示細胞與病毒發生締合(類似於親代CDV病毒)。在與親代經典CDV-MLV比較時，所生成CDV重組疫苗候選物具有生物處理可接受之極類似端效價。 總而言之，兩種CDV載體皆在Vero細胞中展示良好生長產生動力學，且在感染後6天於滾瓶中達到峰效價。兩種載體皆展示轉基因(VP2)之強表現特性，如藉由IF及WB所測定，且將其量化為雙重CDV-CPV疫苗候選者。另外，在Vero細胞中針對20個細胞傳代來測試兩種病毒之基因穩定性。兩種病毒皆保持完全基因穩定，從而指示其易於進行疫苗生物處理。 實例2：豬中之活體內效能研究 ：
出於此實驗之目的，在研究第0天(SD)使用1×105 TCID50 之實例1編碼CPV-2b VP2 (CDV-VP2-2b)之重組CDV載體，對一組6隻仔豬接種疫苗，並在SD21使用2×104 TCID50 追加接種。這兩次接種均在頸部肌內(IM)進行(每一劑量2 mL體積)。
4隻動物用作陰性對照且在頸中接種Vero細胞均質物(2 mL)。3隻動物用作前哨且不接受任一治療。
納入準則： • 臨床上健康且就年齡而言發育正常之豬
排除準則： • 具有如藉由研究負責人或指定人員所評價干擾研究之損傷、先天性異常或臨床疾病體徵之豬 • 具有弱身體條件(體重＜5 kg)之豬
將所有研究動物飼養於適用於其年齡之設施中且保持於相同控制條件下。該屋具有適用於動物年齡之平坦地板或替代地部分地多孔性地板且具有4個各自大約20 m2 之圍欄。在接種疫苗之前，自該組取出前哨動物，飼養於單獨圍欄中，且在接種疫苗之後12 h再分組。
出於生物安全原因，屋處於負壓(-75 Pa)下。根據動物年齡之需求使用室溫。通風速率大約為9/h。動物接受12 h之＞80 lux光且在12 h內無光。提供用於動物之環境豐富化。隨意提供適當品質之水及飼料且根據豬在其年齡及標準程序下之需求來進行管控。
結果展示，CDV載體在豬宿主中以受限方式進行複製，從而靶向淋巴細胞。主要在淋巴結、脾或扁桃體中檢測病毒。
另外，實施血清病毒中和測試以在測試動物中分別量測CDV及CPV之中和抗體。
在下文中，給出CDV之血清中和測試之方案：在中和測試之前 1 天之細胞製備 •胰蛋白酶化高度鋪滿之Vero細胞並將其再懸浮於適當體積之含有5% FCS之MEM鷹氏培養基(Earle’s media)中 •對懸浮液中之細胞進行計數並調節至7×105 個細胞/10mL/96孔板 • 一個板足以用於4個試樣。 •將100µL細胞懸浮液/孔接種至96孔板之所有孔中 •將板在37℃下於CO2 培育器中培育16 – 24 h血清試樣之極限稀釋 •使用無菌PBS以1:4預稀釋試樣 •將預稀釋血清在56℃下不活化30分鐘 •向來自第1-11行之空96孔板之每一孔中添加60µL補充有1% 100× Pen/Strep之MEM鷹氏培養基 •向第1行(A1-H1)中再添加36µL補充有1% 100× Pen/Strep之MEM鷹氏培養基 •向第1行中添加24µL熱滅活血清試樣(對應於1:5稀釋) (對於每一血清試樣而言，將24µL添加至第1行之3個孔中以一式三份測試血清) •藉由在管柱間轉移60µL來對血清實施兩倍連續稀釋 •重複該過程直至第11行(對應於1:5120稀釋) •自最後一行棄除60µLCDV- 病毒之稀釋 • 將CDV-病毒在補充有1% 100× Pen/Strep之MEM鷹氏培養基中稀釋至200 TCID50 /100µL，計算6 mL/96孔板。血清試樣與 CDV- 病毒之一起培育 • 向96孔板之第1-11行中含有血清稀釋液之所有孔中添加60µL經稀釋病毒。在第11行中開始添加病毒。 • 輕微攪動板並在37℃、5% CO2 下培育2小時在 v.d.s 細胞中培育血清試樣 +/- CDV- 病毒 • 自96孔板中之1天齡v.d.s細胞去除60 µL培養基 • 在完成2小時培育時間之後，將每一孔之100µL血清-病毒混合物轉移至v.d.s 細胞板第1-11行之相應孔中 • 向第12行之所有孔中添加100µL含有1% 100× Pen/Strep之MEM鷹氏培養基(=僅含細胞之對照 ) • 將板在37℃、5% CO2 下培育3天 • 光顯微術讀數結果可觀察到病毒誘導之致細胞病變效應。
CDV血清中和測試之結果呈現於圖 5 中。 所有動物在研究開始時皆並無CDV中和抗體(SD0)。在第一免疫化之後三週(SD21，在第二免疫化時)，一隻動物具有針對CDV之中和抗體。在第二免疫化之後21天(SD42)，所有經CDV-VP2接種疫苗之動物(一隻除外)皆產生顯著含量之針對犬瘟熱病毒之中和抗體。結合CPV血清中和測試結果(其中所有動物皆對接種疫苗具有強烈反應，包含在SD42時並無CDV中和抗體之動物)及另一正交系列測試(參照實例3)可推斷出，此一種動物成功地接種疫苗，但關於CDV之免疫反應已轉變為細胞反應。
分別實施關於CPV之血清中和測試，其結果呈現於圖 6 中。就效能而言，所有使用CDV-VP2接種疫苗之動物皆針對犬細小病毒2發生血清轉化。在第2接種疫苗之後檢測到中和Ab效價之特定增加(參見圖 6 )。中和抗體在第二免疫化之後21天(SD42)之含量達到1:40至1:400之值，根據文獻，此含量代表真實宿主(犬科動物)中之保護效價範圍(Glover等人，2012；Taguchi等人，2011)。
重要的是，所有前哨動物皆保持CDV及CPV血清陰性直至研究結束，從而指示重組CDV病毒並不在接種疫苗後自接種疫苗動物擴散至未接種疫苗動物。 實例3：H3N2-MDA 陽性仔豬中之免疫原性
在此研究中，採用血球凝集素(HA)特異性IgG ELISA及IFNγ-ELISpot分析來探究經編碼SwIV H3之CDV載體接種疫苗之豬流感母源抗體(MDA)陽性動物之體液及細胞免疫反應。
根據實例2，對動物接種疫苗，不同之處在於：包含於CDV骨架中之嵌段具有SEQ ID NO:19之序列(因此，載體包括編碼SwIV之H3之SEQ ID NO:22之序列)，將載體(在下文中稱為CDV-H3)投與5隻H3N2-MDA陽性仔豬(MDA+動物))及一隻視為(幾乎) H3N2血清陰性(或分別具有低MDA)之仔豬，及使用三隻仔豬作為陰性對照。A) HA 特異性 IgG ELISA
在下文中，所用ELISA方案提供如下：
使用含於pH 9.6碳酸鹽緩衝液中之1μg/mL重組流感血球凝集素蛋白(Trenzyme)塗覆平底96孔板(Nunc MaxiSorp 44-2404-21號)，在4℃下過夜。第二天，棄除塗層抗原，使用洗滌緩衝液(50mM Tris/0.14M NaCl/0.05% Tween20, pH 8.0)將板洗滌5次，隨後每孔使用200 μL阻斷緩衝液(50mM Tris/0.14M NaCl/1% BSA, pH 8.0)在室溫下培育1h。在試樣/偶聯物稀釋劑(50mM Tris/0.14M NaCl/0.05% Tween20 /1% BSA)中製備試樣稀釋液。然後將100μl/孔之試樣及對照物(一式兩份)分配至指定孔中，將覆蓋板在室溫下培育1小時。使用洗滌緩衝液將板洗滌5次。然後，向每一孔中添加100μl 1:100.00稀釋之HRP-偶聯山羊α-豬IgG-H+L檢測抗體(Southern Biotech，目錄號6050-05 )，且將覆蓋板在室溫下於暗處培育1小時。在洗滌步驟(使用洗滌緩衝液洗滌5次)之後，添加100μl/孔之TMB受質溶液(POD，現成即用；Sigma T4444號)，分析板在室溫下於暗處培育5-15 min。藉由添加50μl/孔之終止溶液(2N硫酸)來停止反應且在450 nm下於ELISA讀數儀(Synergy 2, Biotek)上量測吸光度。
使用此ELISA，藉助自研究第45天(SD45)之動物獲取之試樣看到，若MDA之基線含量為中等(＜ OD 1.0且＞ OD 0.2)，則動物針對接種疫苗具有中等反應性(動物1及5，參見圖 7 )，但動物2除外，其主要具有細胞介導之免疫反應(請參見下文)。具有低MDA (＜ OD 0.2)之動物4展示高抗體反應。與之相比，具有高於OD 1.0之高MDA含量之兩隻動物(動物3及6)並不展示在接種疫苗時特異性H3抗體之增加。B) IFN γ -ELISpot
另外，使用ELISPOT量測來自CDV-H3接種疫苗動物之細胞免疫反應。
在下文中，所用ELISpot分析之方案提供如下：
使用經純化抗IFN-ɣ抗體將ELISpot板(96孔)塗覆至少12 h。將PBMC解凍，在PBS (無鈣，無鎂)洗滌兩次，使用台盼藍計數，並在RPMI培養基中調節以分配為3×105個細胞/孔。在使用PBS深度洗滌含有塗層抗體之板之後，將板在37℃及5% CO2下阻斷至少1小時。添加含有3 μg/ml多株活化劑ConA (IFNɣ釋放之陽性對照)或含有不同濃度抗原之細胞培養基，隨後接種PBMC。將僅含培養基或未刺激細胞之孔用作陰性對照。在刺激48 h之後，使用水將板洗滌前兩次，然後使用PBS/0.01% Tween20洗滌。使用檢測生物素化抗IFNɣ抗體將板在室溫下培育1,5 h，稀釋於PBS/0.01% Tween20/0.1%BSA中。隨後，將稀釋於PBS/0.01% Tween20/0.1%BSA中之鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)-鹼性磷酸酶添加至板中(在暗處，培育45 min)。最後，使用NBT及磷酸5-溴-4-氯-3-吲哚基酯作為鹼性磷酸酶之受質(顯影期亦發生於暗處)。該等受質系統產生藍色至紫色不溶性NBT雙甲騰端產物且可在讀板儀中量測。在使用自來水深度洗滌之後，將板過夜以確保完全乾燥。使用C.T.L. ELISpot讀數儀實施斑點計數。
在分析中，使用重組H3蛋白來刺激來自使用CDV-H3重組體接種疫苗之動物之經分離PBMC。如圖 8 中所展示，在使用兩個注射接種疫苗之動物之試樣(在研究第28天(SD28)獲取之試樣)中，檢測到顯著多於非接種疫苗動物之PBMC中之IFNγ產生細胞。細胞免疫性之該誘導已知可改良疫苗效能及病原體在感染後之更迅速清除。另外，經重組表現豬流感病毒之血球凝集素(H3)之CDV接種疫苗之動物生成顯著T細胞反應，儘管在接種疫苗動物中存在強(豬流感)母體免疫性。在幼小動物中預先存在之母體免疫性的存在通常會干擾主動免疫且係幼年動物中疫苗失敗之主要病因。該等發現重要地暗示了接種疫苗生物體中之CDV生物學特性，儘管存在被動存在之母體免疫性，但仍產生主動免疫性。 實例4：疫苗效能研究
豬流行性腹瀉(PED)係可具有巨大經濟影響之高度傳染性豬疾病。儘管所有年齡種類之豬皆易於感染，但嚴重臨床體徵及死亡主要見於哺乳仔豬中。致病因子係PED病毒(PEDV)，該病毒係冠狀病毒科(Coronaviridae )病毒家族內之α冠狀病毒(Alphacoronavirus )屬之套膜、單鏈陽性RNA病毒。在歐洲，PEDV首次在英格蘭出現於1970ies後期。然後，其擴散至整個歐洲而引起偶發性爆發。在1990ies後期，PEDV已自歐洲養豬場消失，如藉由極低血清盛行率及不存在疾病報導所證實。爆發性及地方性感染仍報導於亞洲，其中該疾病高度影響工業化養豬場之生產力。自2005開始，PED病例再次報導於歐洲(亦即意大利)。在2013年極高毒性PEDV引入美國之後，病例亦報導於中歐(包含德國及周邊國家)。後續病例係由相關但不同之PEDV菌株(所謂的S-INDEL菌株)引起。在德國，自2014年5月開始在哺乳豬中報導高發病率及可變致死性之病例。
在此研究中，以載體疫苗(在下文中分別稱為「CDV_PEDV-纖突疫苗」或「CDV PEDV-纖突載體疫苗」)形式測試衍生自萊德利疫苗菌株(參照實例1)且在P基因與M基因之間插入SEQ ID NO:38之序列(編碼PEDV纖突蛋白)之CDV骨架(載體由此包括SEQ ID NO:41之序列)，該研究包含6頭母豬及其後代。
藉由靶向S-基因之RT-qPCR檢查所有動物之PEDV及PEDV特異性抗體。在研究中僅招募陰性動物。
三個治療組(參見下文)接收隨機分配之動物：組 1 ( 陰性對照 ) ： 兩頭母豬(指定為1號及2號)，未接種疫苗組 2 ( 陽性對照 ) ： 兩頭母豬(指定為3號及4號)，未接種疫苗組 3 (CDV_PEDV- 纖突 ) ： 兩頭母豬(指定為5號及6號)，使用CDV_PEDV-纖突載體疫苗接種疫苗 組3之兩頭母豬之接種疫苗係根據下列方案進行，其中藉由終點滴定定義之CDV_PEDV-纖突疫苗之儲積液效價(stock titer)為7,94 × 104 TCID50/ml： 在預計分娩日期之前9週：使兩頭母豬中之每一者經鼻內接受4 ml疫苗(每一鼻孔2 ml) 在預計分娩日期之前6週：使兩頭母豬中之每一者經鼻內接受4 ml疫苗(每一鼻孔2 ml) 在預計分娩日期之前3週：使兩頭母豬中之每一者經鼻內接受4 ml各別疫苗(每一鼻孔2 mll)且另外經肌內接受2 ml。
對組1之母豬所生育之仔豬(1號母豬之13頭仔豬及2號母豬之12頭仔豬)經口模擬接種。使用PEDV領域菌株(在下文中稱為「PEDV EU」)在生命之4天齡時經口攻擊組2 (3號母豬之12頭仔豬及4號母豬之14頭仔豬)及組3 (5號母豬之5頭仔豬及6號母豬之15頭仔豬)之母豬所生育之仔豬。
為接種組2及3之仔豬，使用細胞培養適應性PEDV EU。效價為2.15 ×105 TCID50/ml。經口接種組2及3之仔豬。在此情形下，使用2 ml注射器使每一仔豬接受1 ml 1:10經稀釋病毒儲備液(效價為2.15 ×104 TCID50)。
使用1 ml細胞培養基以2 ml注射器經口模擬接種組1之仔豬。
在整個試驗期間，在RT-qPCR分析中，在接種當天及在接種後(pi)第1至10天以及在接種後第14、17及20/21天獲取所有動物之直腸拭子(不含培養基之COPAN普通拭子)。在接種之前及攻擊後兩天自每一母豬之4頭仔豬獲取其他直腸拭子以用於細菌學檢驗。此外，使用確立之標準化累積評分系統每天記錄指示PED之臨床體徵(參見下文)。在接種之日及接種後第14及20/21天(試驗末日)或在各別動物之安樂死或死亡之日獲取血樣。臨床監測
使用確立之累積臨床評分來每天監測指示PED之臨床體徵(參見下表)。 表1：指示PED之臨床體徵之累積臨床評分試樣製備及核酸萃取
將直腸拭子浸沒於1 ml達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)中並在室溫下培育1小時。使用QIAmp ViralRNA Mini套組(Qiagen)或NucleoMagVet-Kit與KingFisher萃取平臺之組合萃取病毒RNA。將RNA儲存於-20℃下直至進一步使用。
將試樣在室溫下以2031 × g離心20 min以獲得血清。等分所得血清並儲存於-20℃下。病毒檢測
為檢測PEDV脫落，使用靶向PEDV之S-基因之RT-qPCR-系統，如先前所闡述(Stadler等人，BMC Vet Res. 11:142 (2015))。測試獲取於接種後第0至7天及接種後第10及20/21天之試樣之PEDV-基因體。使用內部標準來計算基因體拷貝量/μl。抗體檢測
使用所有血清根據生產商手冊來實施商業間接ELISA (INgezim PEDV, INGENASA, Madrid, Spain)。細菌學
在接種後第0及2天獲取每窩4頭仔豬之糞便拭子以用於差異細菌學分析。統計學
使用Shapiro-Wilk測試來進行常態性測試且實施Mann-Whitney秩和測試(如在軟體包裝中所實施)。使用SigmaPlot軟體測試統計學顯著性。結論 血清中之抗體檢測 ：
CDV組之所有仔豬皆在攻擊接種之前因抗體陽性初乳攝入而在ELISA (檢測針對PEDV纖突蛋白之抗體)中展示陽性結果，而陽性及陰性對照組之所有動物皆展示明確陰性結果。
在接種後第14天，陽性對照組中之所有仔豬(三頭除外)發生血清轉化，而疫苗組中之所有動物皆在血清試樣中展示較高量之PEDV特異性IgG。
在研究結束時，CDV組及陽性對照組之所有仔豬皆在ELISA中展示強烈陽性結果。陰性對照中之動物在整個試驗期間皆不發生血清轉化。
在另一研究中亦可看到，在經由鼻內途徑僅向母豬接種疫苗兩次時，同樣達成各別抗體結果。細菌學 ：
獲取於接種後第0及2天之糞便拭子不展示任一病原性細菌。細菌菌群在感染時並不發生顯著變化。臨床體徵 ：
陽性對照組(組2)之仔豬在7天內明確展示指示PEDV之臨床體徵，其中首先在24 hpi時發生嘔吐且隨後發生腹瀉。因嚴重脫水及臨床評分值超過6 (人道終點)，26頭仔豬中之8頭必須實施安樂死。可在36 hpi時檢測到指示PEDV之第一臨床體徵。
總而言之，CDV載體接種疫苗及PEDV攻擊仔豬(組3)關於一般行為之臨床體徵較佳，且組3中之20豬中僅2頭(10%)因嚴重脫水及臨床評分值超過6必須實施安樂死(與之相比，組2之仔豬為31%)。
陰性對照中之動物在整個試驗期間保持健康。病毒脫落 ：
可在攻擊組之間檢測到病毒脫落之明確差異。在接種後第1天，所有經攻擊仔豬針對直腸拭子中之病毒基因體皆為陽性，但與陽性對照相比CDV組中之陽性程度極低。同樣，而在接種後接下來5天，CDV組之直腸拭子中之基因體負荷極類似於陽性對照，自接種後第7天開始，藉由接種疫苗母豬保護之仔豬中之病毒基因體之可檢測量明顯下降。僅單一動物發現針對病毒脫落係陽性，而陽性對照組中之所有動物仍脫落PEDV。在陰性對照組之拭子中不能檢測到PEDV基因體。
總而言之，研究結果表明，與陽性對照相比，由經CDV PEDV-纖突疫苗接種疫苗之母豬所生之仔豬展示減少之臨床體徵，且特定而言，發現可在PEDV攻擊之後大大改良仔豬之死亡率/致命性及病毒脫落。
根據本揭示內容無需過多實驗即可獲得並實施本文所揭示及主張之所有組合物及方法。儘管本發明之組合物及方法已根據較佳實施例予以闡述，但熟習此項技術者應明瞭，可改變該等組合物及方法及本文所闡述方法之步驟或步驟之順序，此並不背離本發明之概念、精神及範圍。更特定而言，應明瞭，某些在化學及生理上皆相關之試劑可代替本文所闡述試劑且同時可達成相同或類似結果。熟習此項技術者顯而易見之所有該等類似替代物及修改皆視為涵蓋於由隨附申請專利範圍所界定之本發明之精神、範圍及概念內。
本文亦揭示下列條款 ： 1. 一種表現盒，其用於插入副黏液病毒科(Paramyxoviridae )病毒之兩個毗鄰必需基因(1；2)之間，從而該第一基因(1)位於該表現盒之3´方向上且該第二基因(2)位於5´方向上，其中該表現盒包括 -第一核苷酸序列，其中該第一核苷酸序列係所關注核苷酸序列，及 -第二核苷酸序列，其側接於該第一核苷酸序列之5´端，其中該第二核苷酸序列係基因之5´非編碼區，其中該基因係選自由副黏液病毒科病毒中除該第一基因(1)外之必需基因組成之群，及 -第三核苷酸序列，其側接於該第一核苷酸序列之3´端，其中該第三核苷酸序列包括基因之3´非編碼區或由其組成，其中該基因係選自由副黏液病毒科病毒中除該第二基因(2)外之必需基因組成之群。 2. 如條款1之表現盒，其中該表現盒由以下組成： -該第一核苷酸序列，及 -該第二核苷酸序列，及 -該第三核苷酸序列，及 -另一核苷酸序列，其側接於該第二核苷酸序列之5´端或側接於該第三核苷酸序列之3´端，其中該另一核苷酸序列係副黏液病毒科病毒之基因間序列。 3. 如條款1或2之表現盒，其中該第三核苷酸序列由以下組成： - 選自由副黏液病毒科病毒中除該第二基因(2)外之必需基因組成之群之基因之3´非編碼區，及 - 側接於該3´非編碼區之5´端之序列，其中側接於該3´非編碼區之該5´端之該序列編碼用於開始或增強轉譯之共有序列，且其中該用於開始或增強轉譯之共有序列視情況係Kozak序列。 4. 如條款1至3中任一項之表現盒，其中副黏液病毒科病毒之該兩個毗鄰基因(1；2)係選自由副黏液病毒科病毒之必需基因組成之群，且/或 其中副黏液病毒科病毒之該等必需基因係 - 副黏液病毒科病毒之N、P、M、F、H及L基因，或 - 副黏液病毒科病毒之N、P、M、F、HN及L基因，或 - 副黏液病毒科病毒之N、P、M、F、G及L基因。 5. 如條款1至4中任一項之表現盒，其用於插入副黏液病毒科病毒之該P基因與該M基因之間，其中 - 該由副黏液病毒科病毒中除該第一基因(1)外之必需基因組成之群係由副黏液病毒科病毒中除副黏液病毒科病毒之該P基因外之必需基因組成的群，且其中該基因視情況選自由副黏液病毒科病毒之N、M、F、H及L基因組成之群，且 - 該由副黏液病毒科病毒中除該第二基因(2)外之必需基因組成之群係由副黏液病毒科病毒中除副黏液病毒科病毒之該M基因外之必需基因組成的群，且其中該基因視情況選自由副黏液病毒科病毒之H、P、F、L及N基因組成之群。 6. 如條款1至5中任一項之表現盒，其中 -該第二核苷酸序列係選自副黏液病毒科病毒中位於該表現盒之3´方向上之必需基因之基因的5´非編碼區，包含該第一基因(1)之5´非編碼區，且/或 -該第三核苷酸序列包括副黏液病毒科病毒中位於該表現盒之5´方向上之必需基因之3´非編碼區或由其組成，不包含該第二基因(2)之3´非編碼區。 7. 如條款1至6中任一項之表現盒，其中該第一核苷酸序列可操作地連接至該第三核苷酸序列中所包含之基因起始(GS)序列及/或副黏液病毒科病毒之基因體啟動子。 8. 如條款1至7中任一項之表現盒，其中該核苷酸序列係RNA序列。 9. 一種副黏液病毒科病毒載體，其包括如條款1至8中任一項之表現盒。 10. 如條款1至8中任一項之表現盒或如條款9之副黏液病毒科病毒載體，其中 - 該5´非編碼區係副黏液病毒科病毒之N基因之5´非編碼區，且/或 - 該3´非編碼區係副黏液病毒科病毒之H基因之3´非編碼區， 且/或其中該表現盒插入副黏液病毒科病毒之P基因與M基因之間。 11. 一種副黏液病毒科病毒載體，其包括插入副黏液病毒科病毒之兩個毗鄰必需基因(1；2)之間之RNA序列，該插入使得該第一基因(1)位於該插入RNA序列之3´方向上且該第二基因(2)位於5´方向上，且其中該插入RNA序列包括以下或由其組成： -第一RNA序列，其中該第一RNA序列係所關注核苷酸序列，及 -第二RNA序列，其側接於該第一RNA序列之5´端，其中該第二RNA序列係基因之5´非編碼區，其中該基因係選自由副黏液病毒科病毒中除該第一基因(1)外之必需基因組成之群，及 -第三RNA序列，其側接於該第一RNA序列之3´端，其中該第三RNA序列包括基因之3´非編碼區或由其組成，其中該基因係選自由副黏液病毒科病毒中除該第二基因(2)外之必需基因組成之群。 12. 如條款11之副黏液病毒科病毒載體，其中該第三RNA序列由以下組成： - 選自由副黏液病毒科病毒中除該第二基因(2)外之必需基因組成之群之基因之3´非編碼區，及 - 側接於該3´非編碼區之5´端之序列，其中側接於該3´非編碼區之該5´端之該序列編碼用於開始或增強轉譯之共有序列，且其中該用於開始或增強轉譯之共有序列視情況係Kozak序列。 13. 如條款11或12之副黏液病毒科病毒載體，其進一步包括 -第四RNA序列，其側接於該第二RNA序列之5´端，其中該第四RNA序列係副黏液病毒科病毒之基因間序列，及/或 -第五RNA序列，其側接於該第四RNA序列之3´端，其中該第五RNA序列係副黏液病毒科病毒之基因間序列。 14. 如條款11至13中任一項之副黏液病毒科病毒載體，其中副黏液病毒科病毒之該兩個毗鄰基因(1；2)係選自由副黏液病毒科病毒之必需基因組成之群，且/或 其中副黏液病毒科病毒之該等必需基因係 - 副黏液病毒科病毒之N、P、M、F、H及L基因，或 - 副黏液病毒科病毒之N、P、M、F、HN及L基因，或 - 副黏液病毒科病毒之N、P、M、F、G及L基因。 15. 如條款11至14中任一項之副黏液病毒科病毒載體，其中副黏液病毒科病毒之該兩個毗鄰必需基因(1；2)係副黏液病毒科病毒之該P基因及該M基因，且其中 - 該由副黏液病毒科病毒中除該第一基因(1)外之必需基因組成之群係由副黏液病毒科病毒中除副黏液病毒科病毒之該P基因外之必需基因組成的群，且其中該基因視情況選自由副黏液病毒科病毒之N、M、F、H及L基因組成之群，且 - 該由副黏液病毒科病毒中除該第二基因(2)外之必需基因組成之群係由副黏液病毒科病毒中除副黏液病毒科病毒之該M基因外之必需基因組成的群，且其中該基因視情況選自由副黏液病毒科病毒之H、P、F、L及N基因組成之群。 16. 如條款11至15中任一項之副黏液病毒科病毒載體，其中 -該第二核苷酸序列係選自副黏液病毒科病毒中位於該表現盒之3´方向上之必需基因之基因的5´非編碼區，包含該第一基因(1)之5´非編碼區，且/或 -該第三核苷酸序列包括副黏液病毒科病毒中位於該表現盒之5´方向上之必需基因之3´非編碼區或由其組成，不包含該第二基因(2)之3´非編碼區。 17. 如條款11至16中任一項之副黏液病毒科病毒載體，其中 - 該5´非編碼區係副黏液病毒科病毒之N基因之5´非編碼區，且/或 - 該3´非編碼區係副黏液病毒科病毒之H基因之3´非編碼區。 18. 如條款11至17中任一項之副黏液病毒科病毒載體，其中 該第一RNA序列可操作地連接至該第三RNA序列中所包含之基因起始(GS)序列及/或副黏液病毒科病毒之基因體啟動子。 19. 如前述條款中任一項之表現盒或副黏液病毒科病毒載體，其中該副黏液病毒科病毒係麻疹病毒(Morbillivirus )屬病毒，且其中該麻疹病毒病屬毒較佳地選自由以下組成之群：犬瘟熱病毒(CDV)、貓麻疹病毒(FeMV)及小反芻獸疫病毒(PPRV)，且其中該麻疹病毒屬病毒最佳係犬瘟熱病毒(CDV)。 20. 如前述條款中任一項之表現盒或副黏液病毒科病毒載體，其中該副黏液病毒科病毒係CDV，且其中CDV基因之該5´非編碼區係選自由以下組成之群： CDV之N基因之5´非編碼區，其中CDV之N基因之該5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:1之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之P基因之5´非編碼區，其中CDV之P基因之該5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:2之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之M基因之5´非編碼區，其中CDV之M基因之該5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:3之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之F基因之5´非編碼區，其中CDV之F基因之該5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:4之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之H基因之5´非編碼區，其中CDV之H基因之該5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:5之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列，及 CDV之L基因之5´非編碼區，其中CDV之F基因之該5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:6之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。 21. 如前述條款中任一項之表現盒或副黏液病毒科病毒載體，其中該副黏液病毒科病毒係CDV，且其中CDV基因之該3´非編碼區係選自由以下組成之群： CDV之H基因之3´非編碼區，其中CDV之H基因之該3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:7之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之N基因之3´非編碼區，其中CDV之N基因之該3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:8之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之P基因之3´非編碼區，其中CDV之P基因之該3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:9之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之M基因之3´非編碼區，其中CDV之M基因之該3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:10之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之F基因之3´非編碼區，其中CDV之F基因之該3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:11之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列，及 CDV之L基因之3´非編碼區，其中CDV之F基因之該3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:12之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。 22. 如前述條款中任一項之表現盒或副黏液病毒科病毒載體，其中該第二核苷酸序列或該第二RNA序列係CDV之N基因之該5´非編碼區，且其中CDV之N基因之該5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:1之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。 23. 如前述條款中任一項之表現盒或副黏液病毒科病毒載體，其中 -選自由副黏液病毒科病毒中除該第二基因(2)外之必需基因組成之群之基因之該3´非編碼區係CDV之H基因的該3´非編碼區，且其中CDV之H基因之該3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:7之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列，且/或 -該側接於該3´非編碼區序列之該5´端之序列編碼長5至8個核苷酸之Kozak序列，且其中該Kozak序列較佳地由與SEQ ID NO:13之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致RNA序列組成或包括該序列。 24. 如條款2至8及19至23中任一項之表現盒或如條款9及13至23中任一項之副黏液病毒科病毒載體，其中副黏液病毒科病毒之該基因間序列係CDV之基因間序列，且CDV之其中該基因間序列較佳地由與SEQ ID NO:14之序列至少66%一致之RNA序列組成或包括該序列。 25. 如前述條款中任一項之表現盒或副黏液病毒科病毒載體，其中該所關注核苷酸序列係所關注基因或抗原編碼序列，且/或其中該所關注核苷酸序列係非天然及/或重組序列。 26. 如前述條款中任一項之表現盒或副黏液病毒科病毒載體，其中該所關注核苷酸序列係重組及/或異源性及/或外源性序列。 27. 如前述條款中任一項之表現盒或副黏液病毒科病毒載體，其中該所關注核苷酸序列編碼來自致病原之抗原，其中該致病原較佳係能夠感染寵物動物、例如犬或貓及/或任一其他家畜或野生肉食性動物或能夠感染產食性動物、例如豬或牛之致病原。 28. 如前述條款中任一項之表現盒或副黏液病毒科病毒載體，其中 - 該副黏液病毒科病毒係能夠感染第一生物科動物之副黏液病毒科病毒，且 - 該所關注核苷酸序列編碼來自能夠感染該第一生物科之動物之致病原之抗原，且其中該致病原較佳地不同於該副黏液病毒科病毒， 且其中該第一生物科之該動物較佳地選自由以下組成之群：犬科動物、貓科動物及豬科動物，且其中該第一生物科之該動物最佳係犬類、貓類或豬類，例如狗、貓或豬。 29. 如條款28之表現盒或副黏液病毒科病毒載體，其中 -該能夠感染第一生物科動物之副黏液病毒科病毒係CDV且 –該能夠感染該第一生物科之動物之致病原係犬細小病毒(CPV)， 或其中 - 該能夠感染第一生物科動物之副黏液病毒科病毒係拉帕丹密考克墨西哥病毒(La Piedad Michoacán Mexico virus，LPMV)且 - 該能夠感染該第一生物科之動物之致病原係豬流感病毒(SwIV)或豬流行性腹瀉病毒(PEDV)。 30. 如前述條款中任一項之表現盒或副黏液病毒科病毒載體，其中該所關注核苷酸序列編碼來自犬細小病毒(CPV)、貓細小病毒(FPV)、豬流感病毒(SwIV)或豬流行性腹瀉病毒(PEDV)之抗原。 31. 如前述條款中任一項之表現盒或副黏液病毒科病毒載體，其中該所關注核苷酸序列編碼 - 原小病毒(Protoparvovirus )衣殼蛋白，且其中該原小病毒衣殼蛋白較佳地選自由以下組成之群：肉食性動物原小病毒1 (CPV或FPV)衣殼蛋白、 靈長類動物原小病毒1衣殼蛋白、 齧齒類動物原小病毒1衣殼蛋白、齧齒類動物原小病毒2衣殼蛋白、 有蹄動物細小病毒1(PPV) 衣殼蛋白；或 - -流感病毒套膜蛋白，其中該套膜蛋白視情況係血球凝集素且/或其中該流感病毒視情況選自由以下組成之群：流感A病毒、流感B病毒及流感C病毒，且其中該流感A病毒較佳地選自流感病毒H3N2、H3N1、H1N1、H1N2、H2N1、H2N3及H911之群；或 - 冠狀病毒纖突(S)蛋白，且其中該冠狀病毒S蛋白較佳地選自由以下組成之群：羊駝冠狀病毒(Alpaca coronavirus ) S蛋白、α冠狀病毒(Alphacoronavirus ) 1 S蛋白、人類冠狀病毒(Human coronavirus ) 229E S蛋白、人類冠狀病毒NL63 S蛋白、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus ，PEDV) S蛋白、人類冠狀病毒OC43 S蛋白、人類冠狀病毒HKU1 S蛋白、鼠類冠狀病毒(Murine coronavirus ) S蛋白、嚴重急性呼吸症候群相關冠狀病毒(Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus ，SARS-CoV) S蛋白、中東呼吸症候群相關冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome-related coronavirus ，MERS-CoV) S蛋白及禽感染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus ，IBV) S蛋白。 32. 如前述條款中任一項之表現盒或副黏液病毒科病毒載體，其中該所關注核苷酸序列編碼 - 犬細小病毒(CPV) VP2蛋白，且其中該CPV VP2蛋白較佳地包括與SEQ ID NO:35之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成；或 - H3-亞型血球凝集素(H3)，尤指豬流感病毒之H3，且其中該H3較佳地包括與SEQ ID NO:36之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成；或 - 豬流行性腹瀉病毒(PEDV)纖突(S)蛋白，且其中該PEDV S蛋白較佳地包括與SEQ ID NO:45之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成。 33. 如前述條款中任一項之表現盒或副黏液病毒科病毒載體，其中該所關注核苷酸序列編碼 - 犬細小病毒(CPV) VP2蛋白，且其中該編碼CPV VP2蛋白之序列較佳地由與SEQ ID NO:15之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列；或 - H3-亞型血球凝集素(H3)，較佳地豬流感病毒之H3，且其中該編碼H3之序列較佳地由與SEQ ID NO:16之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列；或 - 豬流行性腹瀉病毒(PEDV)纖突(S)蛋白，且其中該編碼PEDV S蛋白之序列較佳地由與SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。 34. 如前述條款中任一項之表現盒或副黏液病毒科病毒載體，其中該表現盒由以下組成或該副黏液病毒科病毒載體包括以下： - 具有與SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列之聚核苷酸；或 - 具有與SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列之聚核苷酸；或 - 具有與SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列之聚核苷酸。 35. 如前述條款中任一項之副黏液病毒科病毒載體，其包括 - 與SEQ ID NO:21之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列；或 - 與SEQ ID NO:22之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列；或 - 與SEQ ID NO:41之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列。 36. 如條款13至35中任一項之副黏液病毒科病毒載體，其進一步包括 - 第六RNA序列，其側接於該第四RNA序列之5´端，其中該第六RNA序列由與SEQ ID NO:23之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列，及/或 - 第七RNA序列，其側接於該第五RNA序列之3´端，其中該第七RNA序列由與SEQ ID NO:24之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。 37. 一種CDV載體，其包括所關注異源性核苷酸序列， 其中該所關注異源性核苷酸序列編碼犬細小病毒(CPV) VP2蛋白。 38. 如條款37之CDV載體，其中該編碼CPV VP2蛋白之所關注異源性核苷酸序列由與SEQ ID NO:15之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98 %或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。 39. 如條款37或38之CDV載體，其中該CPV VP2蛋白包括與SEQ ID NO:35之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成。 40. 如條款37至39中任一項之CDV載體，其中 - 該所關注異源性核苷酸序列位於CDV之P基因與M基因之間；及/或 - 該所關注異源性核苷酸序列可操作地連接至位於該異源性RNA序列之3´方向上之基因起始(GS)序列及/或CDV之基因體啟動子。 41. 如條款40之CDV載體，其中該GS序列包含於CDV基因之外源性3´非編碼區中，且其中CDV基因之該外源性3´非編碼區較佳地側接於該所關注異源性核苷酸序列之3´端，且/或 其中該所關注異源性核苷酸序列係所關注RNA序列。 42. 一種核酸分子，其編碼如前述條款中任一項之表現盒或副黏液病毒科病毒載體，且其中該核酸分子較佳係DNA分子。 43. 如條款42之DNA分子，尤指DNA分子，其中該分子包括 (i) 編碼所關注多肽之DNA序列， (ii) 側接於(i)中序列之3´端且與SEQ ID NO:25之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列， (iii) 側接於(i)中序列之5´端且與SEQ ID NO:26之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列，及 (iv) 側接於(iii)中序列之5´端且與SEQ ID NO:27之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列。 44. 如條款43之DNA分子，其進一步包括 (v)側接於(ii)中序列之5´端且與SEQ ID NO:28之序列至少66%一致之DNA序列，及/或 (vi)側接於(iv)中序列之3´端且與SEQ ID NO:28之序列至少66%一致之DNA序列。 45. 如條款44之DNA酸分子，其進一步包括 (vii) 側接於(v)中序列之3´端且與SEQ ID NO:29之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列，及/或 (viii) 側接於(vi)中序列之5´端且與SEQ ID NO:30之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列。 46. 如條款42至45中任一項之DNA分子，其中(i)之該序列係 - 編碼犬細小病毒(CPV) VP2蛋白之DNA序列，且其中該序列較佳係與SEQ ID NO:31之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列，或 - 編碼H3-亞型血球凝集素(H3)，較佳地豬流感病毒之H3之DNA序列，且其中該序列較佳係與SEQ ID NO:32之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列；或 - 編碼PEDV S蛋白之DNA序列，且其中該序列較佳係與SEQ ID NO:41之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列。 47. 如條款42至46中任一項之DNA分子，其中該DNA分子包括 - 與SEQ ID NO:33之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列；或 - 與SEQ ID NO:34之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列；或 - 與SEQ ID NO:42之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之DNA序列。 48. 一種哺乳動物宿主細胞，其含有如前述條款中任一項之表現盒或副黏液病毒科病毒載體或DNA酸分子。 49. 如前述條款中任一項之表現盒或副黏液病毒科病毒載體或核酸分子，其用作藥劑，較佳地作為疫苗。 50. 一種DNA構築體，其包括如條款42至47中任一項之DNA分子。 51. 一種RNA轉錄物，其係如條款50之DNA構築體之RNA轉錄物。 52. 一種細胞，其經如條款50之DNA構築體轉染。 53. 一種細胞，其經如條款51之DNA轉錄物轉染。 54. 一種製備含有異源性基因之感染性副黏液病毒科病毒，尤指製備如條款9至41中任一項之副黏液病毒科病毒載體之方法，其中該方法包括以下步驟： a. 提供表現異源性RNA聚合酶之宿主細胞； b. 使用如條款50之DNA構築體轉染該宿主細胞，且其中該DNA分子係藉由異源性RNA聚合酶轉錄，及 c. 分離該等細胞所產生之病毒。 55. 一種如條款9至41中任一項之載體或如條款48、52及53中任一項之細胞，其用於製造免疫原性組合物或疫苗。 56. 一種免疫原性組合物，其包括： 如條款9至41中任一項之載體，其中該載體視情況係感染性及/或減毒病毒或該載體視情況係減毒及/或經修飾活病毒，及視情況 由該載體表現之重組蛋白及/或包括複數個由該載體表現之重組蛋白之病毒樣顆粒，及視情況 醫藥或獸醫學可接受之載劑或賦形劑，其中該載劑較佳地適於口服、真皮內、肌內或鼻內施加。 57. 如條款56之免疫原性組合物，其中由該載體表現之該重組蛋白係 - 細小病毒VP2抗原，例如CPV VP2蛋白，或 - 流感病毒套膜蛋白，其中該套膜蛋白視情況係血球凝集素，例如H3。 58. 如條款56或57之免疫原性組合物，其包括以下或由其組成： 如條款37至41中任一項之CDV載體，且其中該載體較佳係如條款19至36中任一項之載體，及視情況 多肽或重組蛋白，其包括與SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成，及視情況 醫藥或獸醫學可接受之載劑或賦形劑，其中該載劑較佳地適於口服、真皮內、肌內或鼻內施加。 59. 如條款56或57之免疫原性組合物，其包括以下或由其組成： 如條款19至36中任一項之載體，且其中該CDV載體較佳係如條款37至41中任一項之載體，及視情況 由該載體表現之重組蛋白，其中該重組蛋白包括與SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98 %或99%一致之胺基酸序列或由其組成，及視情況 醫藥或獸醫學可接受之載劑或賦形劑，其中該載劑較佳地適於口服、真皮內、肌內或鼻內施加。 60. 如條款56之免疫原性組合物，其中由該載體表現之該重組蛋白係冠狀病毒S蛋白，且其中該冠狀病毒S蛋白視情況係PEDV S蛋白。 61. 如條款56或60之免疫原性組合物，其中由該載體表現之該重組蛋白係包括與SEQ ID NO:45之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成之PEDV S蛋白。 62. 一種疫苗或醫藥組合物，其包括 a. 如條款9至41中任一項之載體，及 b. 由該載體表現之重組蛋白及/或包括複數個由該載體表現之重組蛋白之病毒樣顆粒，及 c. 醫藥或獸醫學可接受之載劑或賦形劑，較佳地該載劑適於口服、真皮內、肌內或鼻內施加，且 d. 視情況該疫苗進一步包括佐劑。 63. 如條款62之疫苗或醫藥組合物，其中由該載體表現之該重組蛋白係 - 細小病毒VP2抗原，例如CPV VP2蛋白，或 - 流感病毒套膜蛋白，其中該套膜蛋白視情況係血球凝集素，例如H3。 64. 如條款62或63之疫苗或醫藥組合物，其包括以下或由其組成： a. 如條款37至41中任一項之CDV載體，且其中該載體較佳係如條款19至36中任一項之載體，及 b. 多肽或重組蛋白，其包括與SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成，及 c. 醫藥或獸醫學可接受之載劑或賦形劑，較佳地該載劑適於口服、真皮內、肌內或鼻內施加， d. 及視情況選用之佐劑。 65. 如條款62或63之疫苗或醫藥組合物，其包括以下或由其組成： a. 如條款19至41中任一項之CDV載體，且其中該載體較佳係如條款37至41中任一項之載體，及 b. 由該載體表現之重組蛋白，其中該重組蛋白包括與SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成，及 c. 醫藥或獸醫學可接受之載劑或賦形劑，較佳地該載劑適於口服、真皮內、肌內或鼻內施加， d. 及視情況選用之佐劑。 66. 如條款62之疫苗或醫藥組合物，其中由該載體表現之該重組蛋白係冠狀病毒S蛋白，且其中該冠狀病毒S蛋白視情況係PEDV S蛋白。 67. 如條款62或66之疫苗或醫藥組合物，其中由該載體表現之該重組蛋白係包括與SEQ ID NO:45之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成之PEDV S蛋白。 68. 如條款56至61中任一項之免疫原性組合物或如條款62至67中任一項之疫苗或醫藥組合物，其中該載體係如條款27之載體。 69. 如條款56至61中任一項之免疫原性組合物或如條款62至67中任一項之疫苗或醫藥組合物，其中該載體係如條款28之載體。 70. 如條款56至61中任一項之免疫原性組合物或如條款62至67中任一項之疫苗或醫藥組合物，其中該載體係如條款29之載體。 71. 一種製備用於減小一或多種與感染有關或由其引起之臨床體徵之發生率或嚴重程度之免疫原性組合物或疫苗的方法，其包括下列步驟： a. 使用如條款9至41中任一項之載體感染哺乳動物宿主細胞， b. 在適宜條件下培養該等感染細胞， c. 收集感染細胞培養物， d. 視情況純化步驟c)之該等所收集感染細胞培養物， e. 視情況混合該所收集感染細胞培養物與醫藥上可接受之載劑。 72. 如條款71之方法，其中該免疫原性組合物或該疫苗減小了一或多種與以下因素有關或由其引起之臨床體徵之嚴重程度： - 犬瘟熱病毒(CDV)及/或犬細小病毒(CPV)之感染，或 - 流感病毒之感染，其中該流感病毒視情況選自由以下組成之群：流感A病毒、流感B病毒及流感C病毒，且其中該流感A病毒較佳地選自流感病毒H3N2、H3N1、H1N1、H1N2、H2N1、H2N3及H911之群，或 - 冠狀病毒感染，其中該冠狀病毒視情況選自由以下組成之群：羊駝冠狀病毒、α冠狀病毒1、人類冠狀病毒229E、人類冠狀病毒NL63、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、人類冠狀病毒OC43、人類冠狀病毒HKU1、鼠類冠狀病毒、嚴重急性呼吸症候群相關冠狀病毒(SARS-CoV)、中東呼吸症候群相關冠狀病毒(MERS-CoV)及禽感染性支氣管炎病毒(IBV)。 73. 如條款56至61中任一項之免疫原性組合物或如62至67條款中任一項之疫苗或醫藥組合物，其用於減少或預防動物中藉由至少一種病原體之感染引起之臨床體徵或疾病之方法中，或用於治療或預防動物之至少一種病原體感染之方法中，較佳地該動物係寵物動物、例如犬或貓及/或任一其他家畜或野生肉食性動物或產食性動物、例如豬。 74. 如條款56至61中任一項之免疫原性組合物或如條款62至67中任一項之疫苗或醫藥組合物，其用於條款73，其中至少一種病原體之該感染係 - CDV及/或CPV之感染，或 - 豬流感病毒之感染，其中該豬流感病毒視情況係亞型H3流感病毒，且其中該亞型H3流感病毒較佳係亞型H3N2或H3N1之豬流感病毒，或 - PEDV感染。 75. 如條款56至61中任一項之免疫原性組合物或疫苗或如條款62至67中任一項之醫藥組合物，其用於以下方法中： 誘導動物，較佳地犬中之針對CPV及CDV之免疫反應，或 誘導豬中之針對豬流感病毒之免疫反應，其中該豬流感病毒視情況係亞型H3流感病毒，且其中該亞型H3流感病毒較佳係亞型H3N2或H3N1之豬流感病毒，或 誘導豬、尤佳地懷孕母豬中之針對PEDV之免疫反應。 76. 如條款56、60及61中任一項之免疫原性組合物或如條款62、66及67中任一項之疫苗或醫藥組合物，其用於減少或預防仔豬中由PEDV感染引起之臨床體徵或疾病之方法中，其中該仔豬擬藉由已投與免疫原性組合物之母豬來哺乳。 77. 如條款76之免疫原性組合物，其中該已投與免疫原性組合物之母豬係在該母豬已懷孕，尤指懷有該仔豬的同時已投與免疫原性組合物之母豬。 78. 如條款56至61中任一項之免疫原性組合物或如條款62至67中任一項之疫苗或醫藥組合物，其用於條款73至77中之任一者，其中該免疫原性組合物或該疫苗或醫藥組合物擬經黏膜，較佳地經鼻內來投與。 79. 如條款56至61中任一項之免疫原性組合物或如條款62至67中任一項之疫苗或醫藥組合物，其用於條款75至77中之任一者，其中該免疫原性組合物或該疫苗或醫藥組合物擬經黏膜，較佳地經鼻內投與該母豬。 80. 一種針對動物中由至少一種病原體引起之臨床疾病對該動物實施免疫之方法，該動物係例如寵物動物、例如犬或貓及/或任一其他家畜或野生肉食性動物或產食性動物、包含豬，該方法包括向該動物投與如條款56至61中任一項之免疫原性組合物或如條款62至67中任一項之疫苗或醫藥組合物之步驟，其中該免疫原性組合物或疫苗不會引起感染之臨床體徵，但能夠誘導針對病原性形式之該至少一種病原體使該動物免疫化之免疫反應。 81. 如條款80之方法， 其中該至少一種病原體係CDV或CPV或SwIV或PEDV，或 其中該至少一種病原體係CDV及CPV。 82. 一種在母豬中誘導產生PEDV特異性抗體之方法，其中該方法向該母豬包括投與如條款56、60及61中任一項之免疫原性組合物或如條款62、66及67中任一項之疫苗或醫藥組合物。 83. 一種減少或預防仔豬中由PEDV感染引起之臨床體徵或疾病之方法，其中該方法包括 -向母豬投與如條款56、60及61中任一項之免疫原性組合物或如條款62、66及67中任一項之疫苗或醫藥組合物，及 -使該仔豬由該母豬哺乳。 84. 如條款83之方法，其中該母豬係正懷孕，尤指懷有該豬之母豬。 85. 如條款83或84之方法，其包括以下步驟： - 向懷有該仔豬之母豬投與如條款56、60及61中任一項之免疫原性組合物或如條款62、66及67中任一項之疫苗或醫藥組合物， - 使該母豬生下該仔豬，及 - 使該仔豬由該母豬哺乳。 86. 如條款82至85中任一項之方法，其中將該免疫原性組合物或該疫苗或醫藥組合物經黏膜，較佳地經鼻內投與該母豬。 87. 一種套組，其用於在動物中針對至少一種病原體誘導免疫反應，或用於針對與至少一種病原體有關之疾病對動物，較佳地寵物動物、例如犬或貓及/或任一其他家畜或野生肉食性動物或食用動物、例如豬或牛接種疫苗及/或減小動物中與至少一種病原體有關或由其引起之一或多種臨床體徵之發生率或嚴重程度，該套組包括： d) 注射器或分配器，其能夠向該動物投與疫苗；及 e) 如條款56至61之免疫原性組合物或如條款62至67之疫苗，及 f) 視情況選用之說明書， 且其中該至少一種病原體較佳係CDV及/或CPV 或其中該至少一種病原體視情況係SwIV或PEDV。 88. 如條款71或72之方法、如條款73至79中任一項之免疫原性組合物或疫苗或醫藥組合物、如條款80至86中任一項之方法或如條款87之套組，其中該免疫原性組合物係如條款68之免疫原性組合物，且其中該至少一種病原體係由該所關注核苷酸序列編碼之抗原所來自之該致病原。 89. 如條款71或72之方法、如條款73至79中任一項之免疫原性組合物或疫苗或醫藥組合物、如條款80至86中任一項之方法或如條款87之套組，其中該免疫原性組合物係如條款69之免疫原性組合物，且其中該至少一種病原體係該副黏液病毒科病毒且由該所關注核苷酸序列編碼之抗原係來自該致病原。 90. 如條款71或72之方法、如條款73至79中任一項之免疫原性組合物或疫苗或醫藥組合物、如條款80至86中任一項之方法或如條款87之套組，其中該免疫原性組合物係如條款70之免疫原性組合物，且其中該至少一種病原體係該副黏液病毒科病毒且由該所關注核苷酸序列編碼之抗原係來自該致病原。 91. 如條款71或72之方法、如條款73至79中任一項之免疫原性組合物或疫苗或醫藥組合物、如條款80至86中任一項之方法或如條款87之套組，其中該免疫原性組合物係如條款70之免疫原性組合物，且其中該至少一種病原體係CDV及CPV。 92. 如條款72、80、81及88至91中任一項之方法，其中該動物係犬，且其中該犬較佳係狗。 93. 如條款72、80、81及88至91中任一項之方法，其中該動物係貓類，且其中該貓類較佳係貓。 94. 如條款74、75及88至91中任一項之免疫原性組合物或疫苗或醫藥組合物，其中該動物係犬，且其中該犬較佳係狗。 95. 如條款74、75及88至91中任一項之免疫原性組合物或疫苗或醫藥組合物，其中該動物係貓類，且其中該貓類較佳係貓。 96. 如條款87及88至91中任一項之套組，其中該動物係犬，且其中該犬較佳係狗。 97. 如條款87及88至91中任一項之套組，其中該動物係貓類，且其中該貓類較佳係貓。 參考文獻
下列參考文獻以提供實例性程序或其他補充本文所闡述者之細節的程度明確地以引用方式併入本文中。 1. Parks CL, Wang HP, Kovacs GR, Vasilakis N, Kowalski J, Nowak RM, Lerch RA, Walpita P, Sidhu MS, Udem SA. 2002. Expression of a foreign gene by recombinant canine distemper virus recovered from cloned DNAs. Virus Res;83(1-2):131-47。 2. von Messling V, Milosevic D, Devaux P, Cattaneo R. 2004. Canine distemper virus and measles virus fusion glycoprotein trimers: partial membrane-proximal ectodomain cleavage enhances function. J Virol. 78(15):7894-903。 3. Wang X, Feng N, Ge J, Shuai L, Peng L, Gao Y, Yang S, Xia X, Bu Z. 2012 Recombinant canine distemper virus serves as bivalent live vaccine against rabies and canine distemper. Vaccine 30(34):5067-72. doi: 10.1016/j.vaccine.2012.06.001. Epub 2012 Jun 12。 4. Glover S, Anderson C, Piontkowski M, Terry N (2012) Canine Parvovirus (CPV) type 2b vaccine protect puppies with maternal antibodies to CPV when challenged with virulent CPV 2 C virus. International Journal of Applied Research in Veterinary Medicine 10: 217-224 5. Taguchi M, Namikawa K, Maruo T, Orito K, Lynch J, Sahara H. Antibody titers for canine parvovirus type-2, canine distemper virus, and canine adenovirus type-1 in adult household dogs. The Canadian Veterinary Journal. 2011;52(9):983-986。
下列圖式形成本說明書之一部分且包含其以進一步闡釋本發明之某些態樣。可藉由參照該等圖式中之一或多者結合本文所呈現具體實施例之詳細說明來更佳地理解本發明。
圖1 . 攜載犬細小病毒VP2轉基因之犬瘟熱病毒(CDV)載體基因體之組織之示意圖式。
圖2. 用於生成(拯救)具有外源性RNA序列配置之CDV重組載體之DNA構築體(質體)圖，其中各別質體DNA序列稱為「H基因起始UTR」、「Kozak序列」、「CPV-VP2」及「N基因UTR」。
圖3. RNA序列在5’端至3’端方向上自左至右之實例性配置之示意圖式：(A. )潛在主要方案，(B .)副黏液病毒科病毒載體中之配置，(C. )編碼犬細小病毒(CPV) VP2之CDV載體中之配置，且其中(D. )及(E. )圖解說明如由序列表之SEQ ID NO所指示之序列之各別配置。
圖4. 在上清液部分 中量測之病毒效價(TCID50 )。 效價代表在感染後6天期間自感染後第1天開始每24小時採樣之上清液中之病毒生長；「SD」 = 「研究日期」。
圖5 . 在研究過程期間使用CDV-VP2重組體接種疫苗之動物之CDV中和效價。Y軸指示中和分析中之病毒(衍生自萊德利菌株之CDV菌株)之血清之最大稀釋度。在研究第0天(SD0)於第1接種疫苗之前、在研究第21天(SD21)於第2接種疫苗之前及在研究第42天(SD42)於第二接種疫苗之後三週量測中和效價(VNT [病毒中和測試]效價)。個別動物以代號指定。
圖6 . 在研究過程期間使用CDV-VP2重組體接種疫苗之動物之犬細小病毒中和抗體效價。Y軸指示中和分析中之病毒(CPV)之血清之最大稀釋度。在研究第0天(SD0)於第1接種疫苗之前、在研究第21天(SD21)於第2接種疫苗之前及在研究第42天(SD42)於第二接種疫苗之後三週量測中和效價(VNT [病毒中和測試]效價)。個別動物以代號指定。
圖7 . 如藉由來自使用CDV-H3重組體接種疫苗之動物之試樣之H3-亞型血球凝集素(H3)特異性ELISA測試所測定的抗體含量。Y軸指示在兩個時間點1:500試樣稀釋液之OD值所代表之讀出，該兩個時間點亦即在研究第0天(SD0)於第1接種疫苗之前及在研究第45天(SD45)於第二接種疫苗之後自動物獲取試樣。
圖 8. 在使用CDV-H3重組體對H3N2-MDA陽性仔豬接種疫苗之後之IFNγ-ELISpot分析之結果。Y軸指示接種疫苗動物(左側條，代表6隻動物之平均值)及非接種疫苗動物(右側條，代表三隻動物之平均值)中之IFNγ產生細胞數/百萬PBMC (Y軸)。

Claims (29)

  1. 一種表現盒，其用於插入副黏液病毒科(Paramyxoviridae )病毒之兩個毗鄰必需基因(1；2)之間，從而該第一基因(1)位於該表現盒之3´方向上且該第二基因(2)位於5´方向上，其中該表現盒包括 第一核苷酸序列，其中該第一核苷酸序列係所關注之異源性或外源性核苷酸序列，及 第二核苷酸序列，其側接於該第一核苷酸序列之5´端，其中該第二核苷酸序列係基因之5´非編碼區，其中該基因係選自由副黏液病毒科病毒中除該第一基因(1)外之該等必需基因組成之群，及 第三核苷酸序列，其側接於該第一核苷酸序列之3´端，其中該第三核苷酸序列包括基因之3´非編碼區或由其組成，其中該基因係選自由副黏液病毒科病毒中除該第二基因(2)外之該等必需基因組成之群。
  2. 如請求項1之表現盒，其中該表現盒由以下組成： 該第一核苷酸序列，及 該第二核苷酸序列，及 該第三核苷酸序列，及 另一核苷酸序列，其側接於該第二核苷酸序列之5´端或側接於該第三核苷酸序列之3´端，其中該另一核苷酸序列係副黏液病毒科病毒之基因間序列。
  3. 如請求項1或2之表現盒，其中該第三核苷酸序列由以下組成： 選自由副黏液病毒科病毒中除該第二基因(2)外之該等必需基因組成之群之基因之該3´非編碼區，及 側接於該3´非編碼區之5´端之序列，其中側接於該3´非編碼區之該5´端之該序列編碼用於開始或增強轉譯之共有序列，且其中該用於開始或增強轉譯之共有序列視情況係Kozak序列。
  4. 如請求項1或2之表現盒，其用於插入副黏液病毒科病毒之P基因與M基因之間，其中 該由副黏液病毒科病毒中除該第一基因(1)外之該等必需基因組成之群係由副黏液病毒科病毒中除副黏液病毒科病毒之該P基因外之該等必需基因組成的群，且其中該基因視情況選自由副黏液病毒科病毒之N、M、F、H及L基因組成之群，且 該由副黏液病毒科病毒中除該第二基因(2)外之該等必需基因組成之群係由副黏液病毒科病毒中除副黏液病毒科病毒之該M基因外之該等必需基因組成的群，且其中該基因視情況選自由副黏液病毒科病毒之H、P、F、L及N基因組成之群。
  5. 如請求項1或2之表現盒，其中該核苷酸序列係RNA序列，及/或 其中該第一核苷酸序列可操作地連接至該第三核苷酸序列中所包含之基因起始(GS)序列及/或副黏液病毒科病毒之基因體啟動子。
  6. 如請求項1或2之表現盒，其中 該5´非編碼區係副黏液病毒科病毒之N基因之5´非編碼區，及/或 該3´非編碼區係副黏液病毒科病毒之H基因之3´非編碼區， 及/或其中該表現盒插入副黏液病毒科病毒之P基因與M基因之間。
  7. 如請求項1或2之表現盒，其中該副黏液病毒科病毒係CDV，且其中CDV基因之該5´非編碼區係選自由以下組成之群： CDV之N基因之5´非編碼區，其中CDV之N基因之該5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:1之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之P基因之5´非編碼區，其中CDV之P基因之該5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:2之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之M基因之5´非編碼區，其中CDV之M基因之該5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:3之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之F基因之5´非編碼區，其中CDV之F基因之該5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:4之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之H基因之5´非編碼區，其中CDV之H基因之該5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:5之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列，及 CDV之L基因之5´非編碼區，其中CDV之F基因之該5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:6之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。
  8. 如請求項1或2之表現盒，其中該副黏液病毒科病毒係CDV，且其中CDV基因之該3´非編碼區係選自由以下組成之群： CDV之H基因之3´非編碼區，其中CDV之H基因之該3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:7之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之N基因之3´非編碼區，其中CDV之N基因之該3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:8之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之P基因之3´非編碼區，其中CDV之P基因之該3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:9之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之M基因之3´非編碼區，其中CDV之M基因之該3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:10之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列， CDV之F基因之3´非編碼區，其中CDV之F基因之該3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:11之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列，及 CDV之L基因之3´非編碼區，其中CDV之F基因之該3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:12之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。
  9. 如請求項1或2之表現盒，其中該第二核苷酸序列係CDV之N基因之5´非編碼區，且其中CDV之N基因之該5´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:1之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。
  10. 如請求項1或2之表現盒，其中 選自由副黏液病毒科病毒中除該第二基因(2)外之該等必需基因組成之群之基因之該3´非編碼區係CDV之H基因的該3´非編碼區，且其中CDV之H基因之該3´非編碼區較佳地由與SEQ ID NO:7之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列，及/或 該側接於該3´非編碼區序列之該5´端之序列編碼長度為5至8個核苷酸之Kozak序列，且其中該Kozak序列較佳地由與SEQ ID NO:13之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。
  11. 如請求項2之表現盒，其中副黏液病毒科病毒之該基因間序列係CDV之基因間序列，且其中CDV之該基因間序列較佳地由與SEQ ID NO:14之序列至少66%一致之RNA序列組成或包括該序列。
  12. 如請求項1或2之表現盒，其中該所關注核苷酸序列編碼 犬細小病毒(CPV) VP2蛋白，且其中該編碼CPV VP2蛋白之序列較佳地由與SEQ ID NO:15之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列；或 H3-亞型血球凝集素(H3)，較佳係豬流感病毒之H3，且其中該編碼H3之序列較佳地由與SEQ ID NO:16之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列；或 犬細小病毒(CPV) VP2蛋白，且其中該CPV VP2蛋白較佳地包括與SEQ ID NO:35之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成；或 H3-亞型血球凝集素(H3)，尤指豬流感病毒之H3，且其中該H3較佳地包括與SEQ ID NO:36之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成。
  13. 如請求項1或2之表現盒，其中該表現盒由以下組成： 具有與SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列之聚核苷酸；或 具有與SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列之聚核苷酸。
  14. 如請求項1或2之表現盒，其用作藥劑，較佳地作為疫苗。
  15. 一種副黏液病毒科病毒載體，其包括如請求項1至13中任一項之表現盒。
  16. 如請求項15之副黏液病毒科病毒載體，其進一步包括 側接於基因間序列之5´端之RNA序列，該基因間序列側接於該第二核苷酸序列之該5´端，其中該RNA序列由與SEQ ID NO:23之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列，及/或 側接於該基因間序列之3´端之RNA序列，該基因間序列側接於該第三核苷酸序列之該3´端，其中該RNA序列由與SEQ ID NO:24之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列組成或包括該序列。
  17. 如請求項15或16之副黏液病毒科病毒載體，其包括 與SEQ ID NO:21之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列；或 與SEQ ID NO:22之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之RNA序列。
  18. 如請求項15或16之副黏液病毒科病毒載體，其用作藥劑，較佳地作為疫苗。
  19. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至13中任一項之表現盒或如請求項15至17中任一項之副黏液病毒科病毒載體，且其中該核酸分子較佳係DNA分子。
  20. 一種哺乳動物宿主細胞，其含有如請求項1至13中任一項之表現盒或如請求項15至17中任一項之副黏液病毒科病毒載體或如請求項19之核酸分子。
  21. 如請求項19之核酸分子，其用作藥劑，較佳地作為疫苗。
  22. 一種DNA構築體，其包括如請求項19之核酸分子。
  23. 一種製備含有異源性基因之感染性副黏液病毒科病毒，特定言之製備如請求項15至17中任一項之副黏液病毒科病毒載體之方法，其中該方法包括以下步驟： a. 提供表現異源性RNA聚合酶之宿主細胞； b. 使用如請求項22之DNA構築體轉染該宿主細胞，且其中該DNA分子係藉由異源性RNA聚合酶轉錄，及 c. 分離該等細胞所產生之病毒。
  24. 一種疫苗或醫藥組合物，其包括 a. 如請求項15至17中任一項之載體，及 b. 由該載體表現之重組蛋白及/或包括複數個由該載體表現之重組蛋白之病毒樣顆粒，及 c. 醫藥或獸醫學可接受之載劑或賦形劑，較佳地該載劑適於口服、真皮內、肌內或鼻內施用，且 d. 視情況該疫苗進一步包括佐劑。
  25. 如請求項24之疫苗或醫藥組合物，其中由該載體表現之該重組蛋白係 細小病毒VP2抗原，如：CPV VP2蛋白，或 流感病毒套膜蛋白，其中該套膜蛋白視情況係血球凝集素，如：H3。
  26. 如請求項24或25之疫苗或醫藥組合物，其包括以下或由其組成： a. 如請求項15至17中任一項之副黏液病毒科病毒載體，及 b. 多肽或重組蛋白，其包括與SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36之序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列或由其組成，及 c. 醫藥或獸醫學可接受之載劑或賦形劑，較佳地該載劑適於口服、真皮內、肌內或鼻內施用， d. 及視情況選用之佐劑。
  27. 如請求項24或25之疫苗或醫藥組合物，其用於減少或預防動物中由至少一種病原體之感染引起之臨床體徵或疾病之方法中，且其中至少一種病原體之該感染視情況係 CDV及/或CPV之感染，或 豬流感病毒之感染，其中該豬流感病毒視情況係亞型H3流感病毒，且其中該亞型H3流感病毒較佳係亞型H3N2或H3N1之豬流感病毒。
  28. 一種對動物接種疫苗之套組，較佳係寵物動物，例如犬或貓及/或任何其他家畜或野生肉食性動物，或食用動物(如：豬或牛)，以對抗動物中與至少一種病原體有關之疾病及/或減小與該至少一種病原體有關或由其引起之一或多種臨床體徵之發生率或嚴重程度，該套組包括： g) 注射器或分配器，其能夠向該動物投與疫苗；及 h) 如請求項24至26中任一項之疫苗或醫藥組合物，及 i) 視情況選用之說明書， 且其中該至少一種病原體較佳係CDV及/或CPV 或其中該至少一種病原體視情況係SwIV。
  29. 一種如請求項24至26中任一項之疫苗或醫藥組合物之用途，其用以製造用於減少或預防動物中由至少一種病原體之感染引起之臨床體徵或疾病之藥劑，且其中至少一種病原體之該感染視情況係 CDV及/或CPV之感染，或 豬流感病毒之感染，其中該豬流感病毒視情況係亞型H3流感病毒，且其中該亞型H3流感病毒較佳係亞型H3N2或H3N1之豬流感病毒。
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