CN108273055A

CN108273055A - 犬细小病毒疫苗组合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN108273055A
Application number: CN201810004453.XA
Authority: CN
Inventors: 吕红; 陈蕾; 周峻岗; 余垚
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2018-01-03
Filing date: 2018-01-03
Publication date: 2018-07-13

Abstract

本发明公开了一种犬细小病毒疫苗组合物注射制剂和口服制剂，其包含以下a)和b)、基本上由以下a)和b)组成、或者由以下a)和b)组成：a)、由马克斯克鲁维酵母重组工程菌表达的犬细小病毒VP2蛋白自组装形成的类病毒颗粒；b)、药学上或兽医学上可接受的用于注射/口服制剂的辅料。本发明还公开了上述疫苗组合物的制备方法和应用。本发明提供的犬细小病毒类病毒颗粒疫苗免疫可获得高水平血清IgG抗体，具有良好的免疫原性，能够减少和预防犬细小病毒感染所引起相关性疾病，并具有安全性高、生产成本低并可放大规模生产、操作简单等优点，可应用于预防和减少CPV感染所引起相关性临床症状。

Description

犬细小病毒疫苗组合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术和兽医领域，具体涉及犬细小病毒疫苗组合物及其制备方法与应用。

背景技术

犬细小病毒病是一种急性高度接触性传染性疾病，可引起成年犬出血性肠胃炎及小狗的心肌炎，该病症于1977年由Eugster发现。犬细小病毒病由犬细小病毒(CanineParvovirus,CPV)引起，该病毒主要引起病犬呕吐、出血性腹泻，并伴有白细胞大量减少等病征。该病一年四季均可发生，具有发病急、病程短、传染性强、死亡率高等特点。不同品种、不同年龄的犬均易感，幼犬易感性高，发病率为50％-100％，死亡率为10％-50％。该病严重影响家养宠物的健康，同时对养犬业造成了巨大的经济损失，是犬的烈性传染病之一。

1978年美国实验室首次从患肠炎犬的粪便中分离得到一株犬细小病毒。为了与犬微小病毒(MVC即CPV-1)相区别，将其命名为CPV-2。通过序列分析发现，该病毒与猫细小病毒(FPV)有很近的亲缘性。遗传进化分析显示，所有的CPV突变株均来源于十九世纪七十年代出现的一个病毒，该病毒与FPV有很近的亲缘性。

在十九世纪八十年代，应用单克隆抗体技术检测出CPV-2的两株突变株CPV-2a和CPV-2b。现在，CPV的抗原变异株己经完全取代了CPV-2，大量的分布于世界各地的犬群中。现在，犬细小病毒已经成为研究病毒进化的重要模型，最近在检测CPV-2时常常出现，但不引起抗原性的改变，他们被称为“新CPV-2a”和“新CPV-2b”。最近，新的CPV变异株接连出现，1997年在越南豹中分离到的CPV-2c(a)和CPV-2c(b)，这两株病毒是在自然条件下，由新CPV-2a和新CPV-2b中VP2的300Gly→Asp得到的。CPV-2c(a)已经从韩国的犬中分离得到，暗示了此病毒已经在家养犬中传播开来。2000年，一株新CPV-2b变异株在意大利的南部被发现，它是由VP2基因的426Asp→Glu形成的，2002年，相似的病毒在越南犬中也分离得到，并用做单克隆抗体的研究，检测到它是一株CPV的抗原变异株。接下来，通过Nakamura等人研制的单克隆抗体21C3确定，意大利的426Glu与越南分离株相比有相似的抗原性，欧洲将其称为CPV-2c。

随着CPV不断进化，目前己经存在多个亚型。尽管传统的减毒CPV疫苗一直非常成功地减少了疾病暴发的数量，当前临床上使用的弱毒疫苗与灭活疫苗在免疫效果上已有所下降，同时随着人们的认识不断加深，传统疫苗的局限性也日益显露出来，例如:①容易受母源抗体影响，导致免疫失败；②疫苗在生产过程中有可能没有被完全杀死或者充分致弱，从而危害动物健康：③弱毒株可能发生突变、毒力返强现象。这些都给预防该病带来了困难，因此基因工程疫苗逐渐成为疫苗研究的热点，目前，国内外学者已经在基因工程亚单位疫苗、DNA疫苗和重组活载体疫苗等方面对犬细小病毒的新型疫苗进行了尝试。

CPV基因主要编码4种蛋白(VP1，VP2，NS1，NS2)，其中VP1和VP2为结构蛋白，NS1和NS2为非结构蛋白。病毒空衣壳中只含有VP1和VP2两种蛋白，VP2是构成衣壳蛋白的主要成分，位于VP1的C端，VP1蛋白的C端氨基酸和VP2蛋白的N端氨基酸序列相互重叠，且二者终止于同一密码子。研究较多的主要是VP2结构蛋白，CPV的中和抗原位点位于VP2上，VP2蛋白是CPV的免疫原性蛋白，编码CPV的主要抗原决定簇，可诱导机体产生中和抗体。VP2基因的N端以及该基因上的蛋白转角结构区loop1和loop3是重要的B细胞抗原表位区，可诱导机体产生中和抗体。VP2基因全长1755nt，编码584个氨基酸，VP2上的几个关键碱基和氨基酸的变化就会改变抗原特性和宿主范围。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种免疫效果好、生产成本低、工艺简单以及更安全的新型犬细小病毒疫苗，并提供了其制备方法与应用。其具体技术方案如下：

本发明在第一方面提供了一种犬细小病毒疫苗组合物，其包含以下a)和b)、基本上由以下a)和b)组成、或者由以下a)和b)组成：

a)、由马克斯克鲁维酵母重组工程菌表达的犬细小病毒VP2蛋白自组装形成的类病毒颗粒；

b)、药学上或兽医学上可接受的用于注射制剂的辅料；

其中，上述马克斯克鲁维酵母重组工程菌是由编码上述犬细小病毒VP2蛋白的基因序列插入马克斯克鲁维酵母表达载体所构成的重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株构建得到；上述重组表达载体编码上述犬细小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明在第二方面提供了另一种犬细小病毒疫苗组合物，其包含以下a)和c)、基本上由以下a)和c)组成、或者由以下a)和c)组成：

c)、药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料；

优选地，上述重组表达载体包括马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子基因序列、编码上述犬细小病毒VP2蛋白的基因序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶终止子基因序列，且不含有无抗性基因序列及大肠杆菌起始复制序列。

更优选地，上述重组表达载体还包括马克斯克鲁维酵母自主复制序列、营养缺陷筛选标记基因序列和克鲁维酵母起始复制序列。

优选地，上述马克斯克鲁维酵母表达载体包含如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。

优选地，上述马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株为马克斯克鲁维酵母菌敲除部分或全部特定营养基因所得。

更优选地，上述特定营养基因为URA3基因。

在较优实施例中，上述马克斯克鲁维酵母菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10621(保藏单位代码：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年3月13日，检测结果：存活，分类命名：马克斯克鲁维酵母Kluyveromycesmarxianus)。

优选地，编码上述犬细小病毒VP2蛋白的基因序列，包括

1)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

2)、编码取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有犬细小病毒VP2蛋白活性的氨基酸、且由SEQ ID No.1所衍生的核苷酸序列。

优选地，上述药学上或兽医学上可接受的用于注射制剂的辅料至少包括佐剂。

更优选地，上述佐剂选自水包油、油包水、水包油包水佐剂中的任意一种或几种。

优选地，上述药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料至少包括淀粉。

本发明在第三方面提供了上述犬细小病毒疫苗组合物注射制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、将编码犬细小病毒VP2蛋白的核苷酸插入到马克斯克鲁维酵母表达载体中，构建重组表达载体；

步骤2、用上述重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株，构建马克斯克鲁维酵母重组工程菌株；

步骤3、使上述马克斯克鲁维酵母重组工程菌株发酵表达上述犬细小病毒VP2蛋白，上述犬细小病毒VP2蛋白在酵母细胞内自组装成猪细小病毒类病毒颗粒；

步骤4、分离纯化获得上述犬细小病毒类病毒颗粒；

步骤5、以上述犬细小病毒类病毒颗粒为活性成分或活性成分之一，与药学上或兽医学上可接受的用于注射制剂的辅料按比例混合均匀，制备得到上述犬细小病毒疫苗组合物。

本发明在第四方面提供了上述犬细小病毒疫苗组合物口服制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤4、分离纯化获得上述犬细小病毒类病毒颗粒；

步骤5、以上述犬细小病毒类病毒颗粒为活性成分或活性成分之一，与药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料按比例混合均匀，制备得到上述犬细小病毒疫苗组合物。

优选地，上述步骤1还包括上述编码犬细小病毒VP2蛋白的核苷酸的密码子优化步骤，优化后的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在较优实施例中，制备得到的上述犬细小病毒疫苗组合物类病毒免疫小鼠的平均滴度到达11000以上，最高可达25600以上。

本发明在第五方面提供了上述犬细小病毒疫苗组合物注射制剂在制备预防和/或治疗由犬细小病毒引发的疾病的药物和/或疫苗中的应用。

优选地，上述犬细小病毒疫苗组合物的应用包括用作液体注射剂、注射粉剂、注射片剂中的一种或几种。

优选地，上述疫苗组合物的应用包括用作液体注射剂。

本发明在第六方面提供了上述犬细小病毒疫苗组合物口服制剂在制备预防和/或治疗由犬细小病毒引发的疾病的药物和/或疫苗中的应用。

优选地，上述由犬细小病毒引发的疾病包括剧烈呕吐、白细胞显著减少、急性出血性肠炎和心肌炎中的任意一种或几种。

本发明提供的犬细小病毒类病毒颗粒疫苗注射免疫可获得高水平血清IgG抗体，具有良好的免疫原性，能够减少和预防犬细小病毒感染所引起相关性疾病。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1示出了本发明较优实施例中犬细小病毒VP2基因的PCR扩增产物DNA电泳图；

图2示出了本发明较优实施例中犬细小病毒VP2蛋白的马克斯克鲁维酵母重组表达载体pUKD-N125/VP2示意图；

图3示出了本发明较优实施例中SDS-PAGE电泳(A)和免疫印迹Western blot(B)检测犬细小病毒VP2蛋白在马克斯克鲁维酵母中的表达，其中泳道1为马克斯克鲁维酵母表达宿主Fim-1ura3Δ细胞裂解液，泳道2为VP2蛋白马克斯克鲁维酵母工程菌Fim-1BH-pUKD-N125/VP2细胞裂解液；

图4示出了本发明较优实施例中马克斯克鲁维酵母表达犬细小病毒衣壳VP2蛋白形成的类病毒颗粒的电子显微镜图；

图5示出了本发明较优实施例中犬细小病毒马克斯克鲁维酵母基因工程菌的高密度发酵制备犬细小病毒类病毒颗粒的发酵生长曲线图；

图6示出了本发明较优实施例中SDS-PAGE电泳(A)和免疫印迹Western blot(B)检测重组犬细小病毒VP2蛋白的分离纯化，其中泳道1为对照菌株马克斯克鲁维酵母Fim-1ura3Δ细胞裂解液；泳道2为重组马克斯克鲁维酵母基因工程菌Fim-1-pUKD-N125/VP2全细胞裂解液；泳道3为细胞裂解液离心后的上清液；泳道为Sephacryl S-500凝胶层析后纯化的CPV类病毒颗粒；

图7示出了本发明较优实施例中犬细小病毒口服疫苗中的类病毒颗粒的电子显微镜图；

图8示出了本发明较优实施例中小鼠口服免疫犬细小病毒类病毒颗粒疫苗在血清中产生的IgG抗体；

图9示出了本发明较优实施例中制备的重组犬细小病毒类病毒颗粒疫苗注射免疫小鼠产生的血清IgG抗体滴度。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1犬细小病毒VP2蛋白马克斯克鲁维酵母重组表达载体的构建

编码犬细小病毒衣壳蛋白VP2的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，根据马克斯克鲁维酵母的密码子偏好性，在不改变氨基酸序列的前提下，对VP2的基因序列进行密码子优化，优化后的序列如SEQ IDNo.2所示。将优化后的VP2基因序列，插入到马克斯克鲁维酵母表达载体pUKD-N125中，构建重组表达载体-PUKD-N125/VP2，具体过程如下：

以特异性引物

VP2-N125-F(SEQ IDNo.3)

5’TTTTTTTGTT AGATCCGCGGATGAGTGACGGCGCAGTTC 3’

VP2-N125-R(SEQ IDNo.4)

5’AGCTTGCGGCCTTAACTAGTTTAGTACAACTTTCTAGGTG 3’

PCR扩增VP2基因，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收1755kb的片段，如图1所示；将表达载体pUKD-N125用限制性酶Spe I和Sac II酶切，以去除氨苄青霉素抗性基因以及大肠杆菌起始复制序列，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收8.2kb左右的载体片段；采用Gibson Assembly的方法，用NEB公司的Gibson Assembly无痕连接系统(产品编号E2611S/L)，将VP2基因片段与载体片段的连接，构建重组表达载体pUKD-N125/VP2，如图2所示，重组表达载体内还包括菊粉酶启动子、菊粉酶终止子、以及缺陷筛选标记基因URA3及其启动子。

实施例2马克斯克鲁维酵母基因工程菌Fim-1-pUKD-N125/VP2的构建

本发明采用的酵母表达宿主菌株为马克斯克鲁维酵母Fim-1ura3Δ，该菌株的制备方法可采用中国专利公布文件CN105112313A实施例1公开的营养缺陷型菌Fim-1ura3Δ的方法构建。猪细小病毒VP2蛋白马克斯克鲁维酵母基因工程菌Fim-1-pUKD-N125/VP2是通过将重组表达载体pUKD-N125/VP2转化将Fim-1ura3Δ菌株构建获得的，实施过程如下：马克斯克鲁维酵母Fim-1ura3Δ接种于含3mL YEPD培养基的玻璃试管中，30℃摇床过夜培养至OD600为12-15。收集菌体，LiAc-TE溶液(100mM LiAc，10mM Tris-HCl pH 7.5,1mM EDTA)洗涤。在菌体中依次加入carrier DNA，重组表达载体pUKD-N125/VP2，PEG溶液(40％PEG4000、100mM LiAc、10mM Tris-HCl pH 7.5、1mM EDTA)和终浓度为10mM DTT，充分混匀后，30℃水浴15min，47℃水浴15min，8000rpm瞬离，弃上清，加100μL无菌水悬浮菌体，涂SD平板(0.67％无氨基酵母氮源YNB、2％葡萄糖、2％琼脂)，30℃培养2-4天直至克隆形成。

利用PCR的方法进行阳性转化子的筛选，从选择培养基平板挑取单克隆于3mLYEPD培养基的试管中30℃摇床过夜培养，采用常规酵母基因组提取方法提取转化子基因组，用上述VP2-N125-F和VP2-N125-R引物进行PCR验证，若PCR扩增出1750bp左右的条带既为转入重组表达载体pUKD-N125/VP2的克隆，既为表达犬细小病毒VP2蛋白马克斯克鲁维酵母工程菌株Fim-1-pUKD-N125/VP2。

实施例3犬细小病毒VP2蛋白在马克斯克鲁维酵母中的表达

重组工程菌Fim-1-pUKD-N125/VP2与对照菌Fim-1ura3Δ分别接种于装有50ml的YD培养基(1％酵母抽提物，2％葡萄糖)中，30℃、220rpm培养66h后离心收集细胞，细胞用10mM Tris-HCl(pH7.5)重悬后经高压均质破碎。取100μl细胞裂解液加入蛋白质电泳上样缓冲液混合，沸水5min后进行蛋白电泳SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)和CPV-VP2抗体免疫印迹Western Blot检测VP2蛋白的表达水平。用于Western Blot检测的CPV-VP2抗体是由大肠杆菌重组表达的PPV-VP2蛋白免疫小鼠后分离的多抗血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠多抗。

细胞裂解液SDS-PAGE检测结果表明，工程菌Fim-1-pUKD-N125/VP2的全细胞裂解液在55-70kD之间多了一条蛋白条带，如图3所示，其大小与犬细小病毒的VP2蛋白的理论分子量65kDa基本一致，由此推测该蛋白条带是犬细小病毒的VP2蛋白。

进一步用Western Blot进行了验证，将细胞裂解液样品经SDS-PAGE蛋白质电泳后经Bio-Rad公司的Trans-Blot转印槽将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，然后将膜在含5％的脱脂奶粉的TBST缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0、137mMNaCI、0.1％Tween20)中的室温孵育2h，接着用1:200稀释小鼠血清PPV-VP2多抗4℃孵育过夜。一抗结合后用TBST洗3次，然后用1:5000稀释的羊抗鼠二抗室温孵育1h，TBST洗3遍后，加入显色液进行显示。结果如图3所示，表明55-70kD之间的蛋白条带为VP2蛋白，说明犬细小病毒VP2蛋白在克鲁维酵母中获得高效表达。

通过电子显微镜观察发现马克斯克鲁维酵母表达的犬细小病毒VP2蛋白能够在细胞内自我组装类病毒颗粒(virus-like particles，VLPs)，如图4所示，形成的类病毒颗粒大小约为20-26nm。

实施例4重组马克斯克鲁维酵母工程菌的高密度发酵

马克斯克鲁维酵母基因工程菌Fim-1-pUKD-N125/VP2接种于YEPD固体培养基上30℃培养2天进行活化。然后转接到含有葡萄糖(或蔗糖)、硫酸铵、磷酸二氢钾和硫酸镁等成份的合成培养基中，30℃，220rpm培养18-24h。种子液按照10％的比例接种到装有2L培养基的5升发酵罐进行高密度发酵，发酵过程中通风并搅拌，补料采用全料流加方式，溶解氧控制在20-30％，同时控制温度在30℃，pH值控制在5.5左右，发酵时间控制在72h以内。结果表明，重组菌株在5L发酵罐中发酵72h后，细胞密度OD₆₀₀达600，细胞干重达120g/L以上，如图5所示，而犬细小病毒VP2蛋白产量达2-3g/L。

实施例5犬细小病毒类病毒颗粒(VLPs)的纯化

马克斯克鲁维酵母工程菌Fim-1-pUKD-N125/VP2发酵液经5，000rpm离心5min收集菌体，溶液用去离子水重悬后离心，重复3次，获得菌体重悬于PBS(135mM NaCl,2.7mM KCl,1.5mM KH₂PO₄,8mM K₂HPO₄)缓冲液中，利用广州聚能公司的JN3000高压均质机破碎，1，800bar破碎两次，14，000rpm离心60min后取上清液。离心后的上清液经HiPrep 16/60Sephacryl S-500HR分子筛凝胶层析进行犬细小病毒类病毒颗粒的纯化，按体积收集的洗脱液进行SDS-PAGE和Western Blot检测，结果表明犬细小病毒类病毒颗粒洗脱体积在60-90ml之间，经Sephacryl S-500分子筛凝胶层析纯化的猪细小病毒类病毒颗粒的纯度达90％以上，如图6所示。

实施例6马克斯克鲁维酵母制备的犬细小病毒类病毒颗粒疫苗口服制剂免疫效果

马克斯克鲁维酵母工程菌Fim-1-pUKD-N125/VP2发酵液经5000rpm离心5min收集菌体，溶液用去离子水重悬后离心，重复3次。用去离子水重悬，菌体密度OD600调节至600左右。菌悬液用广州聚能公司的JN3000高压均质机1500bar破碎两次，从而制备犬细小病毒类病毒颗粒(VLPs)悬液。按1：2(V：M)加入玉米淀粉保护剂混料，搅拌混匀后用螺杆式造粒机进行造粒。造粒后的口服型犬细小病毒类病毒颗粒(VLPs)疫苗在沸腾干燥机上37℃干燥1-2h，含水量控制在5％左后，干燥后的口服疫苗经分装和真空包装制成成品。

通过透射电镜进行进一步观察犬细小病毒口服疫苗中的类病毒颗粒(VLPs)，发现其经制粒、干燥后，犬细小病毒VP2蛋白依然以类病毒颗粒形式存在，如图7所示。

以小鼠作为靶动物进行口服型犬细小病毒类病毒颗粒(VLP)疫苗的免疫效果分析，选用6周龄健康雌性SPF级Balb/c小鼠，随机分组，每组各6只。第一组为空白组，喂食PBS(PBS)不做免疫；第二组为免疫组：喂食本发明提供的犬细小病毒类病毒颗口服疫苗，每只小鼠喂食剂量250μg蛋白/次，首免1周后，按相同途径和剂量重复喂食4次，喂食时间分别：0天、7天、14天、21天、28天。

喂食前小鼠面颊取血，采取的血液放到37度培养箱中lh，然后4℃3000rpm离心4min，用10ml的移液器吸取血清到新的EP内，放入-20℃冰箱保存。

免疫至第56天，对小鼠血清中抗CPV-VP2IgG抗体的含量进行检测，采用原核表达VP2蛋白包被96孔板进行ELISA检测。

犬细小病毒口服疫苗免疫小鼠后血清中的抗CPV-VP2IgG抗体采用ELISA方法检测。面颊取血的血清样品用稀释液PBS稀释100倍后，取100μL加入到抗原包被板中，37℃孵育50min，TBST洗涤5次，加1:8000稀释的二抗，37℃孵育50min后TBST洗涤5次；每孔加入100μl TMB显色液，常温避光显色10min，加入50μl 2M硫酸终止液后，使用酶标仪检测450nm处的吸光值。

分析结果表明小鼠口服免疫犬细小病毒类病毒颗粒疫苗56天时血清中产生IgG抗体，与空白组相比，有显著性差异(P值<0.05)，结果如图8所示。

实施例7马克斯克鲁维酵母制备的犬细小病毒类病毒颗粒疫苗注射剂免疫效果

将分子筛凝胶层析纯化的重组犬细小病毒类病毒颗粒样品，加入体积比为10％的水溶性纳米佐剂进行乳化，制备乳化后混合溶液犬细小病毒类病毒颗粒疫苗。

选用6周龄健康雌性SPF级Balb/c小鼠，随机分组，每组各6只。第一组为空白组，注射PBS不做免疫；第二组为免疫组，每只小鼠注射剂量40μg犬细小病毒类病毒颗粒疫苗，免疫一次。免疫后7天进行小鼠面颊取血，采取的血液放到37度培养箱中孵育l h，然后3，000rpm，4℃离心4min，用移液器吸取血清至1.5ml eppendorf管内，-20℃冰箱保存。

小鼠血清中犬细小病毒IgG的抗体酶联免疫吸附测定方法(ELISA)的建立如下：

1)抗原包被：大肠杆菌重组表达CPV-VP2蛋白经纯化后，用pH 9.8碳酸盐包被液分别稀释至0.75μg/mL、1.5μg/mL、3μg/mL、6μg/mL,取100μl加入到Corning公司的抗原包被96孔板中，4℃过夜孵育。

2)清洗：TBST洗涤5次。

3)封闭：用含10％脱脂奶粉的TBST溶液37℃封闭2h。

4)清洗：TBST洗涤5次。

5)检测血清：每孔中加入100μl经PBS梯度稀释的血清样品，4℃过夜。

6)清洗：TBST洗涤5次；

7)加羊抗鼠IgG酶标二抗：二抗的稀释浓度分别为1:8000和1:12000，每孔100μL，37℃孵育50min，TBST洗涤5次；

8)显色：每孔加入100μl TMB显色液，常温避光显色10min。

9)终止：每孔加入50μl 2M硫酸终止液后，使用酶标仪检测450nm处的吸光值。

通过检测结果，综合阴、阳性值、P/N值等方面的因素，初步确定抗原最佳包被浓度为抗原浓度为3μg/mL，二抗浓度为1:8000。

犬细小病毒类病毒颗粒疫苗免疫小鼠后血清中的抗CPV-VP2IgG抗体检测采用3μg/mL抗原包被板中，用ELISA进行检测。血清样品用稀释液稀释后，取100μL加入到抗原包被板中，37℃孵育50min，TBST洗涤5次，加1:4000稀释的二抗，37℃孵育50min后TBST洗涤5次；每孔加入100μl TMB显色液，常温避光显色10min，加入50μl 2M硫酸终止液后，使用酶标仪检测450nm处的吸光值。分析结果表明小鼠注射免疫犬细小病毒类病毒颗粒疫苗2周血清中产生IgG抗体，6周后鼠血清中的IgG抗体滴度达到峰值，平均滴度达到10000-30000，如图9所示。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 犬细小病毒疫苗组合物及其制备方法与应用

<130> 2017

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 584

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg

1 5 10 15

Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln

35 40 45

Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn

50 55 60

Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg

65 70 75 80

Arg Val Val Val Asn Asn Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met

85 90 95

Ala Leu Asp Asp Thr His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val

100 105 110

Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu

115 120 125

Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu

130 135 140

Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro

145 150 155 160

Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala

165 170 175

Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser

180 185 190

Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp

195 200 205

Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly

210 215 220

Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp

225 230 235 240

Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg

245 250 255

Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Tyr Phe Asp Cys Lys Pro

260 265 270

Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro

275 280 285

Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly

290 295 300

Tyr Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly

305 310 315 320

Asn Thr Asn Ile Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val

325 330 335

Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro

340 345 350

Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu

355 360 365

Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His

370 375 380

Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr

385 390 395 400

Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln

405 410 415

Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Asn Asp Asn Val Leu Leu Pro

420 425 430

Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Ala Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe

435 440 445

Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr

450 455 460

Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro

465 470 475 480

Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly

485 490 495

Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro

500 505 510

Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp

515 520 525

Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr

530 535 540

Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn

545 550 555 560

Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser

565 570 575

Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr

580

<210> 2

<211> 1755

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgagtgacg gcgcagttca accagacggt ggccagcctg ctgtcagaaa cgaaagagct 60

accggctctg gcaacggctc tggtggcggt ggcggaggtg gctccggtgg cgttggtatt 120

tccacgggta ctttcaacaa ccaaacggaa ttcaagttct tggaaaacgg ctgggtggaa 180

atcaccgcaa actccagcag acttgtccac ttgaacatgc cagaatccga aaactacaga 240

agagtggttg tcaacaactt ggacaagact gcagttaacg gcaacatggc tttggacgac 300

acccacgcac aaattgttac tccttggtca ttggttgacg caaacgcttg gggcgtttgg 360

ttcaacccag gcgactggca actaattgtt aacaccatgt ccgagttgca cttggtttcc 420

ttcgaacaag aaattttcaa cgtggttttg aagactgttt cagaatctgc tactcaacca 480

ccaaccaagg tttacaacaa cgacttgact gcatcattga tggttgcatt ggacagtaac 540

aacactatgc cattcacccc agcagctatg agatccgaga ccttgggttt ctacccttgg 600

aagccaacca taccaactcc ttggagatac tacttccaat gggacagaac cttgatccca 660

tctcacactg gcacttccgg cactccaacc aacatatacc acggtaccga tccagatgat 720

gttcaattct acactattga aaactctgtg ccagtccact tgctaagaac cggtgacgaa 780

ttcgctactg gcaccttcta cttcgactgc aagccatgca gactaactca cacctggcaa 840

actaacagag cattgggctt gccaccattc ctaaactcct tgcctcaagc agagggcggt 900

actaacttcg gctacatagg agttcaacag gacaagagac gtggtgtcac tcaaatgggt 960

aacaccaaca tcatcactga ggctactatt atgagaccag ctgaggttgg ctactccgca 1020

ccatactact ctttcgaggc gtctacccaa ggcccattca agacccctat tgcagcaggc 1080

cggggtggcg cacaaaccga cgagaacaga gcagctgacg gtgacccaag atacgcattc 1140

ggtagacaac acggtcaaaa gactaccaca accggcgaaa ccccagagag attcacctac 1200

atagcacacc aagatacagg cagataccca gaaggcgatt ggatccaaaa catcaacttc 1260

aaccttccag ttacagaaga caacgttttg ctaccaacag acccaatcgg cggtaagacc 1320

ggcattaact acactaacat attcaacacc tacggtccat tgactgcatt gaacaacgtt 1380

ccacctgttt acccaaacgg tcaaatctgg gacaaggaat tcgacactga cttgaagcca 1440

agacttcacg ttaacgcacc attcgtttgc caaaacaact gccctggtca attgttcgtc 1500

aaggttgcgc ctaacttgac taacgaatac gaccctgacg catctgctaa catgtcaaga 1560

atcgtcacct actcagactt ctggtggaag ggtaagttgg tcttcaaggc taagctaaga 1620

gcctctcaca cctggaaccc aattcaacag atgagtatca acgtcgataa ccaattcaac 1680

tacgtcccaa gtaacattgg cggtatgaag atcgtctacg aaaagtctca actagcacct 1740

agaaagttgt actaa 1755

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tttttttgtt agatccgcgg atgagtgacg gcgcagttc 39

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

agcttgcggc cttaactagt ttagtacaac tttctaggtg 40

<210> 5

<211> 10025

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gcatgcatca ctaatgaaaa gcatacgacg cctgcgtctg acatgcactc attctgaaga 60

agattctggg cgcgtttcgt tctcgttttc ctctgtatat tgtactctgg tggacaattt 120

gaacataacg tctttcacct cgccattctc aataatgggt tccaattcta tccaggtagc 180

ggttaattga cggtgcttaa gccgtatgct cactctaacg ctaccgttgt ccaaacaacg 240

gacccctttg tgacgggtgt aagacccatc atgaagtaaa acatctctaa cggtatggaa 300

aagagtggta cggtcaagtt tcctggcacg agtcaatttt ccctcttcgt gtagatcaga 360

ggctatatac atgccgaggt attcgatcac tctacgatga cggtctgtta gctcaacaac 420

ttcttctaaa tgctccataa ccgtaacgta agaagcataa ctgtcaatac tgaagtcatc 480

ccagtttatt ggtgctcctg ttgaacagtc atccactata tgttcgaata gcccaggatc 540

acgaggaggt cctacaaacg gatacggtac agtcttcttt ttatagtctg caaattctag 600

aatagcattt tttatccaat agtgtcgaat cgtcctggcc gttctaccga taaaggatcc 660

aatgtgatta ttagctccac tacacgatat gttaagtttg atcgatgtct tgttaacaaa 720

cgctaaactc aagttcggca tttccaacag cgagaagaaa tcatcaattc catcggctat 780

ctcttgataa gtcattagat catatacctt ctcgggatgt cgttgagtta ctttatgact 840

agaaatcttc aggttatcat caacgtaatt gttctccaat agctctggag agggacataa 900

caatactttg attttttcca tggcctggac ttgtttccgt aggaaatact tgttcttttg 960

tagacgttcc atgatgagtt tgtatacctc tgctggagat atccattcta gatctttgat 1020

ataagtttgg tatggtaaag agttgatttt gtaggacacg taaatctgcg ctagataagt 1080

acattgtgca aatgcctctg gtacttcgta agacccatgc tgcgtaatta tagtattatt 1140

gagtggatca taagcgttgt actcgttttt gaatttaaaa ctgtctaata aggccctgta 1200

aatctctctg acttgttgta cacctttctg ctcttcggga ctgagatcgg atagcaatgg 1260

agcagcagtt tctgagcttt ctgatggggc tgacatggca gatgcctatt caatgctgcc 1320

ttttgtttgg gaggttatga aatgcatctg tttacattgt atgtaatacc cttactaggc 1380

aatgttataa gcaaaaatcc tttgatcaca tggaatatca ctttatacgt gttgaaatat 1440

gcaaaaaaac agtccccctg agctcagggg gtggtttacg cttttgaggc tcagcagcgc 1500

gaattctctc ttggggctga agtgaaattt aaaaaagtcg cttgaggctc agccggaatt 1560

ataaaacatc acctgagtct tgagagcgct ttcactcacc tgaggctcag ctgaaatttc 1620

aaaaagtcac ttgagcccag aaggagtgtt tcaccccctg aggctataac gttcgttatt 1680

ttaataccta aataaacaaa aatatatggt acaggaacgc gaggcaacgc gccgatacag 1740

ggtcaatggg tacacgagag ggtgacacta ggcgtagaaa gtcattagta taaaatacag 1800

tggtatatag tagatattta gtttgttttc cttttctttt tctccaaaac gatatcagac 1860

atttgtctga taatgaagca ttatcagaca aatgtctgat atcgtttttc aataataata 1920

tacatcatca caaaacaaac aaacatagca tcgcaagccc catcatgcca ccaccgtccg 1980

ctgtgatcgc aactcatgtt tccggcggta ttctgcaatg aattggagaa cctcgtctga 2040

gataattcca tgccattgtt cgaacaactg gaggctagga tgagctgaga aggattgagc 2100

gaccaagcgc ggacttgacg gtgggctgag tggtgggcta ccagggctgt taccctcctc 2160

ttcaagtagc tcctcgcgag ataaaggttt attagaagga tccttcaaaa catatatttc 2220

actgcccaat ggggcttcct tgtaaaaacc tgatataaag gcaaatacac ggtcatctac 2280

agtcacacta ccatgactgt agtgtgatct agccactgca ctttgaattt cacggtcccc 2340

agcccaattg cccagtgagg agacatattt tcccttctca gatctcgata aaaaggtcgc 2400

cattaaatgt cttccaaaat gagacttcgg gccgttccag atcttgaaga ctggttcatc 2460

gacatgctgg gtaagaaacc tagagaacgt tctggccaat gactctggta aaaactgatg 2520

agtttgatta gttggtctat tactggatac tgttttttca ataggcgagc aaacacgcaa 2580

atagtcgtat aatgatatca gaagatcgca atcaccattc acaggataga agttaacgta 2640

ccgttcagtt ctgcttttcg tttctgtcac agtagcacgc acaattgggc ccagaaatga 2700

attgttgtag atctcaaaag tccttggatc tagattcttc agatcgctgt atctgcagca 2760

atttccaaca gctcccagaa gtagcaatcg gtattccgct cgttttgtag tggttacgca 2820

ggactgatcg aagaagcagg caatcctgga gacaatcttc caaatatctt tttcttttga 2880

cagaatatta gtgaattgta atccaaccat agaagcatcg tatttatgtg tttcctcgta 2940

gcgatcaaac aaggaaactt cttgattttt aaatgggcta acaacaacct tgtaagaagg 3000

caatgctgat tcgatatcct tttgcagaga ctctgtcttt cttagtctaa cagtgaattt 3060

gataattttg tcatccttat caaaagacag agatttgcca attgcgctct tgtaagagcg 3120

gtaggtattg attttcatct cgcgtcggat agatagcgac tgcattgtca agatagagaa 3180

tagggacgcc agcttatttc taatttcttt cgcatttata ttaaaggtgt cagattccag 3240

aatttcatta atttcattag cacactgatg aggtgtgagg tgagcagcct ccgcaaaggt 3300

agacataggg gcattggttg gaggcctttg aggtaccact agagtgctgc aaacatagca 3360

ccgttcgaga ctttaaaatc ttcagtttta aaattatgaa aaaaaacatc gtcctgagtt 3420

gaaacggtcg tttcaacctc cgtgtacaga aagatacata gcatatggca agctgcacgc 3480

agcgtaaaca tgccggacaa ctgtcatttc gtcagatcag ttgatctact ctctgtgata 3540

ctgcttcgtt tgtccacgga ggtcggacta actctcacca cgcttccacg gcattcgaaa 3600

gaactaatat tgtatcattg tacatatgag gaacacgcag ttgaactgag caaaccagga 3660

ctcaggaaag caggaggtaa gtgctcgctt ttcgtggatc cagaggaacg tgaaaattcg 3720

ccttctcctc ctataccgcc gtatcagata tcagagatgc cccttcatga acttctcgag 3780

tcaggcaatg ctaaattggt tccaaatccc gagtttgatc taactgatcc agacgacttt 3840

cataagtgtt tctcggtcac ctattcagca ttatctttaa tggtaccata tctgcccaga 3900

gctgctctaa aggctgctcg agtgttttgt aaagatcatt caatattaac aacggatatg 3960

cttgatttga attatcttga agagctaatt gagttctcaa aggaaactgt gaacaaaatc 4020

ccagctagaa tccctataga ggacatgctt ctcgagcggg gatatgtgct accatgggtt 4080

catggtggta cagtgaaggg aggaaagcta ctgaccccca acgattgatt ctttaccgaa 4140

tcattgcata attcattgca taattcattg cagaataccg ccggaaacat gagttgcgat 4200

cacagcggac ggtggtggca tgatggggct tgcgatgcta tgtttgtttg ttttgtgatg 4260

atgtatatta ttattgaaaa acgatatcag acatttgtct gataatgctt cattatcaga 4320

caaatgtctg atatcgtttt ggagaaaaag aaaaggaaaa caaactaaat atctactata 4380

taccactgta ttttatacta atgactttct acgcctagtg tcaccctctc gtgtacccat 4440

tgaccctgta tcggcgcgtt gcctcgcgtt cctgtaccat atatttttgt ttatttaggt 4500

attaaaattt actttcctca tacaaatatt aaattcacca aacttctcaa aaactaatta 4560

ttcgtagtta caaactctat tttacaatca cgtttattca accattctac atccaataac 4620

caaaatgccc atgtacctct cagcgaagtc caacggtact gtccaatatt ctcattaaat 4680

agtctttcat ctatatatca gaaggtaatt ataattagag atttcgaatc attaccgtgc 4740

cgattcgcac gctgcaacgg catgccgatc cgaaaaggta aacagacaca aaaacgacaa 4800

gagaagcaaa cacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaacaaaaa aaaaaaacac aaacacaaac 4860

acaaacacaa aaacgctaaa ttatgcacac aagggccggc ggggctgccg gaaaaaaaaa 4920

gggaaaaata cacagacgag cgcgcacaga tggggttacc actgcaagtt acaagttgca 4980

agttgcacgc tggaatcaga attggaatca gaattggaat tggaattaga attagaatta 5040

aacttggggt agccacggga acgggataac tcaggaatcg ctcgcaggcg tctccgtcta 5100

ggcaatccca aggtaagcct aggcactccc acaggggaaa gaacggttga aggcaaagta 5160

gtgctaacaa ttggtaacga atggtaacaa gtgtgtccgt ctccacctga catttgctag 5220

agctggggat tccacattct tgtgctctga attctcaaac cgaaatgggg cgttgttacc 5280

ccaggtatcc ggttgtagtt ggcactgggg atggaaaaaa atgatgttga tgttgagtta 5340

gttgggttga gtcaattagt gcgtgaaagt atcaccactt ttgtcatccg gcgtttctgt 5400

gcgaatcaca cacacacaca cagtttattg gagcacttgt ttctggcgta ttcgtaattg 5460

ttctgcggtg cggttctgtg tgcatttttc ctggggtgtc tgccgcacct actcatcacc 5520

cacgccgtgg gtttgagcca tggcggaggt acgactgact ggctgcctgc ctgcctgact 5580

gactgcctga ctgcaggaaa agagggtttc gaaggaaaaa cttttcctgt gttaatccgg 5640

ccgtgcgccg ctgctccaaa atccaccttc atgagaagga gtttgaaaaa acaaaaaaat 5700

tcacatataa aaagcgtatc tcgagatctc aaagtctccc ttgaatcgtg tttgccagtt 5760

gtaactcatc ctttattctt ctattctatc tctctctttc cttcccctaa tcagcaatta 5820

aatccggggt aaggaagaat tactactgtg tgtaacggtt atatttcgtt ttttattttt 5880

tttttccatt gccatagaga aagaaaaaaa aaaaaaagag agtttgtgaa gatcttccat 5940

tcgaatccca taagtgacac atttaatttt ttttttgtta gatccgcgga tgagtgacgg 6000

cgcagttcaa ccagacggtg gccagcctgc tgtcagaaac gaaagagcta ccggctctgg 6060

caacggctct ggtggcggtg gcggaggtgg ctccggtggc gttggtattt ccacgggtac 6120

tttcaacaac caaacggaat tcaagttctt ggaaaacggc tgggtggaaa tcaccgcaaa 6180

ctccagcaga cttgtccact tgaacatgcc agaatccgaa aactacagaa gagtggttgt 6240

caacaacttg gacaagactg cagttaacgg caacatggct ttggacgaca cccacgcaca 6300

aattgttact ccttggtcat tggttgacgc aaacgcttgg ggcgtttggt tcaacccagg 6360

cgactggcaa ctaattgtta acaccatgtc cgagttgcac ttggtttcct tcgaacaaga 6420

aattttcaac gtggttttga agactgtttc agaatctgct actcaaccac caaccaaggt 6480

ttacaacaac gacttgactg catcattgat ggttgcattg gacagtaaca acactatgcc 6540

attcacccca gcagctatga gatccgagac cttgggtttc tacccttgga agccaaccat 6600

accaactcct tggagatact acttccaatg ggacagaacc ttgatcccat ctcacactgg 6660

cacttccggc actccaacca acatatacca cggtaccgat ccagatgatg ttcaattcta 6720

cactattgaa aactctgtgc cagtccactt gctaagaacc ggtgacgaat tcgctactgg 6780

caccttctac ttcgactgca agccatgcag actaactcac acctggcaaa ctaacagagc 6840

attgggcttg ccaccattcc taaactcctt gcctcaagca gagggcggta ctaacttcgg 6900

ctacatagga gttcaacagg acaagagacg tggtgtcact caaatgggta acaccaacat 6960

catcactgag gctactatta tgagaccagc tgaggttggc tactccgcac catactactc 7020

tttcgaggcg tctacccaag gcccattcaa gacccctatt gcagcaggcc ggggtggcgc 7080

acaaaccgac gagaacagag cagctgacgg tgacccaaga tacgcattcg gtagacaaca 7140

cggtcaaaag actaccacaa ccggcgaaac cccagagaga ttcacctaca tagcacacca 7200

agatacaggc agatacccag aaggcgattg gatccaaaac atcaacttca accttccagt 7260

tacagaagac aacgttttgc taccaacaga cccaatcggc ggtaagaccg gcattaacta 7320

cactaacata ttcaacacct acggtccatt gactgcattg aacaacgttc cacctgttta 7380

cccaaacggt caaatctggg acaaggaatt cgacactgac ttgaagccaa gacttcacgt 7440

taacgcacca ttcgtttgcc aaaacaactg ccctggtcaa ttgttcgtca aggttgcgcc 7500

taacttgact aacgaatacg accctgacgc atctgctaac atgtcaagaa tcgtcaccta 7560

ctcagacttc tggtggaagg gtaagttggt cttcaaggct aagctaagag cctctcacac 7620

ctggaaccca attcaacaga tgagtatcaa cgtcgataac caattcaact acgtcccaag 7680

taacattggc ggtatgaaga tcgtctacga aaagtctcaa ctagcaccta gaaagttgta 7740

ctaaactagt taaggccgca agctttgatc tgatctgctt actttactaa cgacaaaaaa 7800

aaatcaaaaa aaaaaaaaca atcagtcctt ctcttcttac gatatgatat gattaaatga 7860

tgctatgaaa tcatcttctt cttaactttc ttaaatctta cgcgtcactt actctatata 7920

cccgtttagc tttgcctggt cacagcgaca ttttatataa gtgtacgtat tttctttttt 7980

tttttaaaaa tttctattct aaccttagaa aagtgccctt taaaccagct gtcctggcac 8040

tatatcttta tcatgtgccg gtcgctttcc ctttccgttt cccttttcct ttcaattggt 8100

ggcctggaat tccgaactca ttttcgcatc tgaaactaat tctcgaaacc tttaacatca 8160

aacaattgaa aagatcatca tcaccagaaa taagaaaaag atcaacacaa cagctaataa 8220

cagtacgaaa gaaagatcgc tcgagtgaaa aggcagccaa gaaaggtcat tcgatttggg 8280

tctagactga ttatagacat accaattgca ctcagtaaga aaatgagttt caaatttgac 8340

gatgacggtg tggtaaaaga atttcacggc aacaccatca tatgccatat tcctcaacaa 8400

accgaattct tcaacaaatt gttggacttc taccgttttg cgaaacgact ttccttctac 8460

gacaagatca ccctacttcc tccttcaagc taccacgtta cgatcatgaa ttgctgccac 8520

gaacacgatc gttctgaggg ccactggccc aaaggaatcg atccggacac aagcatgctg 8580

cggtgtacat cacatctgac caacattcta ggatcggtcg aattctgatt ggaaagacca 8640

ttctgcttta cttttagagc atcttggtct tctgagctca ttatacctca atcaaaactg 8700

aaattaggtg cctgtcacgg ctcttttttt actgtacctt tgacttcctt tcttatttcc 8760

aaggatgctc atcacaatac gcttctagat ctattatgca ttataattaa tagttgtagc 8820

tacaaaaggt aaaagaaagt ccggggcagg caacaataga aatcggcaaa aaaaactaca 8880

gaaatactaa gagcttcttc cccattcagt catcgcattt cgaaacaaga ggggaatggc 8940

tctggctagg gaactaacca ccatcgactg actctatgca ctaaccacgt gactacatat 9000

atgtgatcgt ttttaacatt tttcaaaggc tgtgtgtctg gctgtttcca ttaattttca 9060

ctgattaagc agtcatattg aatctgagct catcaccaac aagaaattct accgtaaaag 9120

tgtaaaagtt cgtttaaatc atttgtaaac tggaacagca agaggaagta tcatcagcta 9180

gccccataaa ctaatcaaag gaggatgtcg actaagagtt actcggaaag agcagctgct 9240

catagaagtc cagttgctgc caagctttta aacttgatgg aagagaagaa gtcaaactta 9300

tgtgcttctc ttgatgttcg taaaacagca gagttgttaa gattagttga ggttttgggt 9360

ccatatatct gtctattgaa gacacatgta gatatcttgg aggatttcag ctttgagaat 9420

accattgtgc cgttgaagca attagcagag aaacacaagt ttttgatatt tgaagacagg 9480

aagtttgccg acattgggaa cactgttaaa ttacaataca cgtctggtgt ataccgtatc 9540

gccgaatggt ctgatatcac caatgcacac ggtgtgactg gtgcgggcat tgttgctggt 9600

ttgaagcaag gtgccgagga agttacaaaa gaacctagag ggttgttaat gcttgccgag 9660

ttatcgtcca aggggtctct agcgcacggt gaatacactc gtgggaccgt ggaaattgcc 9720

aagagtgata aggactttgt tattggattt attgctcaaa acgatatggg tggaagagaa 9780

gagggctacg attggttgat catgacgcca ggtgttggtc ttgatgacaa aggtgatgct 9840

ttgggacaac aatacagaac tgtggatgaa gttgttgccg gtggatcaga catcattatt 9900

gttggtagag gtcttttcgc aaagggaaga gatcctgtag tggaaggtga gagatacaga 9960

aaggcgggat gggacgctta cttgaagaga gtaggcagat ccgcttaaga ggggtaccga 10020

gctcg 10025

Claims

1.一种犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述犬细小病毒疫苗组合物包含以下a)和b)、基本上由以下a)和b)组成、或者由以下a)和b)组成：

b)、药学上或兽医学上可接受的用于注射制剂的辅料；

其中，所述马克斯克鲁维酵母重组工程菌是由编码所述犬细小病毒VP2蛋白的基因序列插入马克斯克鲁维酵母表达载体所构成的重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株构建得到；所述重组表达载体编码所述犬细小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQID No.1所示。

2.一种犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述犬细小病毒疫苗组合物包含以下a)和c)、基本上由以下a)和c)组成、或者由以下a)和c)组成：

c)、药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料；

3.根据权利要求1或2所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述重组表达载体包括马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子基因序列、编码所述犬细小病毒VP2蛋白的基因序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶终止子基因序列，且不含有无抗性基因序列及大肠杆菌起始复制序列。

4.根据权利要求1或2所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述重组表达载体还包括马克斯克鲁维酵母自主复制序列、营养缺陷筛选标记基因序列和克鲁维酵母起始复制序列。

5.根据权利要求1或2所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母表达载体包含如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求1或2所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株为马克斯克鲁维酵母菌敲除部分或全部特定营养基因所得。

7.根据权利要求6所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述特定营养基因为URA3基因。

8.根据权利要求6所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10621。

9.根据权利要求1或2所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，编码所述犬细小病毒VP2蛋白的基因序列，包括

1)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

10.根据权利要求1所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述药学上或兽医学上可接受的用于注射制剂的辅料至少包括佐剂。

11.根据权利要求10所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂选自水包油、油包水、水包油包水佐剂中的任意一种或几种。

12.根据权利要求2所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料至少包括淀粉。

13.根据权利要求1所述的犬细小病毒疫苗组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤2、用所述重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株，构建马克斯克鲁维酵母重组工程菌株；

步骤3、使所述马克斯克鲁维酵母重组工程菌株发酵表达所述犬细小病毒VP2蛋白，所述犬细小病毒VP2蛋白在酵母细胞内自组装成猪细小病毒类病毒颗粒；

步骤4、分离纯化获得所述犬细小病毒类病毒颗粒；

步骤5、以所述犬细小病毒类病毒颗粒为活性成分或活性成分之一，与药学上或兽医学上可接受的用于注射制剂的辅料按比例混合均匀，制备得到所述犬细小病毒疫苗组合物。

14.根据权利要求2所述的犬细小病毒疫苗组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤4、分离纯化获得所述犬细小病毒类病毒颗粒；

步骤5、以所述犬细小病毒类病毒颗粒为活性成分或活性成分之一，与药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料按比例混合均匀，制备得到所述犬细小病毒疫苗组合物。

15.根据权利要求13或14所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1还包括所述编码犬细小病毒VP2蛋白的核苷酸的密码子优化步骤，优化后的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

16.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，制备得到的所述犬细小病毒疫苗组合物类病毒免疫小鼠的平均滴度到达11000以上，最高可达25600以上。

17.根据权利要求1所述的犬细小病毒疫苗组合物在制备预防和/或治疗由犬细小病毒引发的疾病的药物和/或疫苗中的应用。

18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述犬细小病毒疫苗组合物的应用包括用作液体注射剂、注射粉剂、注射片剂中的一种或几种。

19.根据权利要求17或18所述的应用，其特征在于，所述疫苗组合物的应用包括用作液体注射剂。

20.根据权利要求2所述的犬细小病毒疫苗组合物在制备预防和/或治疗由犬细小病毒引发的疾病的药物和/或疫苗中的应用。

21.根据权利要求17或20所述的应用，其特征在于，所述由犬细小病毒引发的疾病包括剧烈呕吐、白细胞显著减少、急性出血性肠炎和心肌炎中的任意一种或几种。