CN109294987A - 一种非治疗目的的恢复浸润性t淋巴细胞免疫功能的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞免疫功能的方法，属于T淋巴细胞受体技术领域，包括：将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液与阻断剂混合，得到含有阻断剂的溶液；所述阻断剂包括anti‑Tim‑3阻断抗体和/或anti‑PD‑1阻断抗体；含有阻断剂的溶液与anti‑CD3抗体、anti‑CD28抗体混合后进行培养，得到培养物；将培养物与布雷非德菌素A混合、孵育，得到免疫功能恢复的浸润性T淋巴细胞。采用本发明提供的方法能够将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能恢复。
Description
技术领域
本发明属于T淋巴细胞受体技术领域，具体涉及一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞免疫功能的方法。
背景技术
目前，我国大部分原发性肝癌患者的病因均为乙肝病毒感染，现有技术中记载了原发性肝癌(HCC)组织中浸润性T淋巴细胞(TIL)表达大量衰老分子，浸润性淋巴细胞处于免疫无能和衰老状态。浸润性T淋巴细胞较早即可在慢性肝炎病毒感染中被诱导耐受，原发性肝癌发生后浸润性T淋巴细胞在肿瘤微环境中更进一步被诱导无能和衰老，加上肝脏特有的免疫耐受器官环境，原发性肝癌中的浸润性T淋巴细胞较其它肿瘤的浸润性细胞更难以激活扩增。原发性肝癌中的浸润性T淋巴细胞对CD3单抗等刺激仅能扩增20倍，很难恢复免疫活力。传统方法很难对衰老的浸润性T淋巴细胞进行恢复，如用抗体阻断KLRG1、LAG3等其他众多衰老分子，很难恢复。因此，突破上述传统方法，寻找恢复浸润性T淋巴细胞的免疫活性的方法至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞免疫功能的方法，采用本发明提供的方法能够使免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能得到恢复。
本发明提供了一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞免疫功能的方法，包括：
1)将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液与阻断剂混合，得到含有阻断剂的溶液；
所述阻断剂包括anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体；
2)将所述步骤1)得到的含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后进行培养，得到培养物；
3)将所述步骤2)得到的培养物与布雷非德菌素A混合、孵育，得到免疫功能恢复的浸润性T淋巴细胞。
优选的，所述步骤1)中，当所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体时，所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体的浓度为8～12μg/ml。
优选的，所述步骤1)中，当所述阻断剂为anti-PD-1阻断抗体时，所述含有阻断剂的溶液中anti-PD-1阻断抗体的浓度为8～12μg/ml。
优选的，所述步骤1)中，当所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体时，所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体的浓度独立的为8～12μg/ml。
优选的，所述步骤1)免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液的细胞数量为4.5～5.5×105/200μl。
优选的，所述步骤2)含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后，所述anti-CD3抗体的终浓度为2～3μg/ml。
优选的，所述步骤2)含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后，所述anti-CD28抗体的终浓度为1～1.5μg/ml。
优选的，所述步骤2)培养的时间为4～6d。
优选的，所述步骤3)培养物与布雷非德菌素A混合后，所述布雷非德菌素A的终浓度为8～12μg/ml。
优选的，所述步骤3)孵育的时间为5～7h。
本发明提供了一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞的免疫功能的方法，所述阻断剂anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体能够阻断免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞表面Tim-3和/或PD-1的表达，进而能够恢复免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能。
本发明实施例的结果显示：本发明利用流式细胞术检测了肿瘤及癌旁部位浸润的CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例情况，检测了原发性肝癌患者血液、肿瘤部位及癌旁部位的CD4+和CD8+T淋巴细胞表面Tim-3和PD-1的表达情况，并且体外阻断这两种受体后，CD4+和CD8+T淋巴细胞分泌的细胞因子的量及细胞增殖情况。发现肿瘤部位浸润的CD8+T淋巴细胞的数量少于癌旁部位，原发性肝癌患者血液、肿瘤组织和癌旁组织中浸润的T淋巴细胞表面均表达抑制型受体Tim-3和PD-1，但肿瘤组织中其表达量高于癌旁，但两部位其表达量没有统计学差异。Tim-3+和PD-1+的T淋巴细胞分泌细胞因子的能力受损。体外阻断后T淋巴细胞的功能及其体外增殖能力得到一定程度的提高。从而找到一种逆转肝癌组织TIL的免疫无能状态并恢复其免疫功能的新方法。
附图说明
图1为流式细胞仪结果，其中A为流式细胞仪结果原图，B为流式细胞仪结果的分析图；
图2为流式细胞仪结果原图及数据分析图；
图3为激光共聚焦显微镜检测结果；
图4为CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子结果
图5为CD8+T淋巴细胞分泌的细胞因子结果；
图6为阻断两种表面标记物后CD4+和CD8+细胞的比例结果；
图7为阻断两种标记物后CD4+T淋巴细胞的分泌的细胞因子结果；
图8为阻断两种标记物后CD8+T淋巴细胞的分泌的细胞因子结果；
图9为阻断两种标记物后各组上清液中细胞因子的量的结果。
具体实施方式
本发明提供了一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞的免疫功能的方法，包括：
1)将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液与阻断剂混合，得到含有阻断剂的溶液；
所述阻断剂包括anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体；
2)将所述步骤2)得到的含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后进行培养，得到培养物；
3)将所述步骤2)得到的培养物与布雷非德菌素A混合、孵育，得到免疫功能恢复的浸润性T淋巴细胞。
本发明将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液与阻断剂混合，得到含有阻断剂的溶液。
在本发明中，所述免疫功能受损的浸润性T细胞的来源优选为原发性肝癌患者的外周血，本发明对所述分离得到免疫功能受损的浸润性T细胞的方法没有特殊限定，采用本领域常规分离方法即可。
在本发明中，所述免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液的细胞数量为4.5～5.5×105/200μl，更优选为4.8～5.2×105/200μl，最优选为5×105/200μl。
在本发明中，所述阻断剂包括anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体，当所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体时，所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体的浓度优选为8～12μg/ml，更优选为9～11μg/ml，最优选为10μg/ml。在本发明中，所述anti-Tim-3阻断抗体能够阻断免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞表面的Tim-3的表达，进而能够恢复免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能。
在本发明中，当所述阻断剂为anti-PD-1阻断抗体时，所述含有阻断剂的溶液中anti-PD-1阻断抗体的浓度优选为8～12μg/ml，更优选为9～11μg/ml，最优选为10μg/ml。在本发明中，所述anti-PD-1阻断抗体能够阻断免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞表面的PD-1的表达，进而能够恢复免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能。
在本发明中，当所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体时，所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体的浓度独立的优选为8～12μg/ml，更优选为9～11μg/ml，最优选为10μg/ml。在本发明中，所述anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体能够阻断免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞表面的Tim-3和PD-1的表达，进而能够恢复免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能。本发明对所述anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
本发明将含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后进行培养，得到培养物。
在本发明中，所述含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后，所述anti-CD3抗体的终浓度优选为2～3μg/ml，更优选为2.2～2.8μg/ml，最优选为2.5μg/ml。本发明对所述anti-CD3抗体的来源没有特殊限定，采用常规市售的即可。在本发明中，所述anti-CD3抗体上调T淋巴细胞白细胞介素2受体(interleukine-2receptor,IL-2R)表达，刺激T细胞增殖与活化。
本发明中，所述含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后，所述anti-CD28抗体的终浓度优选为1～1.5μg/ml，更优选为1.2～1.3μg/ml，最优选为1.25μg/ml。本发明对所述anti-CD28抗体的来源没有特殊限定，采用常规市售的即可。在本发明中，所述anti-CD28抗体与其配体B7相互作用，可以为T淋巴细胞活化提供必要的第二信号途径。本发明对所述anti-CD3抗体和anti-CD28抗体的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
在本发明中，所述培养的时间优选为4～6d，更优选为5d；所述培养的温度优选为37℃，所述培养优选在5％CO2的环境下进行。
本发明将得到的培养物与布雷非德菌素A混合、孵育，得到免疫功能恢复的浸润性T淋巴细胞。
在本发明中，所述培养物与布雷非德菌素A混合后，所述布雷非德菌素A的终浓度优选为8～12μg/ml，更优选为9～11μg/ml，最优选为10μg/ml。本发明对所述布雷非德菌素A的来源没有特殊限定，采用常规市售的产品即可。在本发明中，所述布雷非德菌素A的作用是阻断细胞因子向细胞外分泌。
在本发明中，所述孵育的时间优选为5～7h，更优选为5.5～6.5h，最优选为6h；所述孵育的温度优选为37℃；所述孵育优选在5％CO2的环境下进行。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞的免疫功能的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1、采集原发性肝癌患者外周血于肝素锂抗凝的采血管中，采用Ficoll-PaquePlus密度梯度离心的方法迅速分离外周血单个核细胞，操作步骤如下：
1)采用与全血等量的PBS稀释血液；
2)往离心管中加入与稀释全血等量的Ficoll分离液，将稀释后的血液沿着管壁缓慢地加在Ficoll分离液的上层，不与Ficoll分离液混匀，室温1500rpm，离心20min；离心速度采用慢升慢降，上升速度设置为1，下降速度设置为0；
3)离心后，可看到离心管中由上而下细胞分为四层，第一层为血浆层，第二层为环状白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层；收集第二层细胞放入含pH值为7.4PBS(GIBCO)7ml的离心管中，充分混匀，室温1500rpm，离心5min；将得到的沉淀重复洗一次；
4)弃上清，用PBMC培养基或者PBS重悬沉淀(沉淀即为细胞)，以进行下一步实验，用96孔板培养时，每孔5*106个细胞(细胞为外周血单个核细胞)。
2、提取原发性肝癌患者的肿瘤组织和癌旁组织中的单个核细胞：
于无菌条件下取原发性肝癌患者的肿瘤和癌旁组织(距离肿瘤组织1㎝左右)标本3*3*3㎝，于生物安全柜中用无菌小剪刀剪碎，加入含双抗的10％FBS-RPMI164010ml，加入胶原酶(终浓度为1mg/ml)，加入DNase I(终浓度为20ug/ml)于37℃恒温摇床中孵育2小时，间隔半小时摇晃一次，2小时后用70μm筛网过滤，然后参照外周血淋巴细胞分离方法采用Ficoll-Paque Plus密度梯度离心分离出组织中单个核细胞。
3、细胞表面标记物及核内因子染色与流式细胞检测分析
上述步骤分离的外周血单个核细胞和组织中单个核细胞，在体外培养24小时细胞状态恢复后进行细胞表面标记物或核内因子染色，染色步骤如下：
1)收集96孔板中的细胞于装有3ml含2％FBS的PBS(以下统称洗液)的流式管中，1500rpm离心5min，弃上清；
2)用200μl洗液重悬细胞，按表面抗体说明书的使用量加入对应量的抗体，进行细胞表面标志物的染色，同时加入同型对照IgG抗体进行染色，以保证抗体染色的特异性，4℃避光孵育30min；
3)4℃冰箱中取出加入4ml洗液，1500rpm 5min离心；
4)倒去上清，加入250ul的(cytofix/toperm)破膜固定剂，混匀，置于4℃冰箱避光反应30min；
5)取出，加入3ml 1X的perm/washbuffer(跟cytofix/toperm配套的)，1500rpm，5min离心；
6)倒去上清，残留200ul的洗液，振荡重悬，根据细胞数和说明书，加入所需的流式抗体量(胞内标记抗体)；
7)轻微混匀后，置于4℃冰箱避光反应30min；
8)4℃冰箱取出标本，加入4ml的2％多聚甲醛的PBS，1500rpm，5min离心，倒去上清，残留200ul的buffer，振荡重悬，用Beckman Coulter Gallios10色分析型流式细胞仪进行检测(注:用等量PBS稀释4％多聚甲醛为2％的浓度)；
9)流式数据采用Kaluza 1.2软件进行分析。
4、人CD3磁珠分选CD3阳性细胞及荧光染色
1)用70μm孔径的尼龙滤网过滤组织中分离出的单个核细胞，彻底振荡CD3磁珠颗粒，加入50ul磁珠于每107细胞EP管中；
2)将EP管放于摇床上彻底混匀，室温下孵育30min；
3)将EP管中细胞转移到BD流式管中，将BD流式管置于BD磁力架上，孵育10min；
4)沿BD流式管外侧壁吸取上清并弃去，上清中即为CD3阴性细胞或碎片；
5)从磁力架上取下BD流式管加入2ml PBS，吹吸混匀后再次放于BD磁力架上4min；
6)重复步骤4)，如果要进一步提高CD3阳性细胞的纯度，再次重复步骤4)和5)；
7)将得到的细胞种于96孔板中，200ul/孔，培养24小时后进行荧光染色。
8)24小时后收集细胞，按上述细胞表面标记染色方法染CD3阳性细胞表面CD4，CD8，Tim-3，PD-1后，于BD流式管中加入3ml双蒸水，1500rpm，5min，弃上清，重悬；
9)重复步骤8)三次，剩余200ul细胞液，铺片，加入40ul细胞液于盖玻片中央，置于生物安全柜中静置晾干，加3ul DAPI于载玻片中央，将盖玻片盖上(注意不要有气泡)，将其置于4℃冰箱中保存待激光共聚焦显微镜下拍片。
5、原发性肝癌T淋巴细胞的体外阻断实验
将用CD3磁珠分选出来的CD3阳性T淋巴细胞体外培养24小时待细胞表面抗原标记恢复后，将细胞分为4组，每组三个复孔，每孔5*105细胞，200ul/孔，只加anti-Tim-3阻断抗体(终浓度为10ug/ml)组、只加anti-PD-1阻断抗体(终浓度为10ug/ml)组、加anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体(浓度比为1:1)组、只加同型对照抗体IgG组(终浓度为10ug/ml)，每孔中加入anti-CD3抗体(终浓度为2.5ug/ml)、anti-CD28抗体(终浓度为1.25ug/ml)共刺激，体外培养5天后，每孔中加入BrefeldinA(终浓度为10ug/ml)，再次孵育6小时后，各组收集上清120ul用于CBA实验检测上清中的细胞因子的量，收集细胞用于流式检测。
6、人Th1/Th2细胞因子CBA试剂盒检测
阻断实验中收集的四个组的上清120ul，用于上清中细胞因子的检测，详细实验步骤如下：
6.1制备人Th1/Th2/Th17细胞因子标准品
重悬和梯度稀释标准品：
1)打开一管冻干的人Th1/Th2标准品，将标准品小球转移到一支15mL锥形离心管中，并标记该管为最高浓度标准品；
2)用2mL实验稀释液重悬标准品；
3)重悬后的标准品溶液需室温下平衡至少15分钟；
4)用吸头轻轻混匀标准品，切勿剧烈震荡；
5)取出9根12×75mm流式上样管，分别标记梯度稀释的倍数1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256；
6)每管各加300μl实验稀释液；
7)梯度稀释标准品：
A.从最高浓度标准品管取300μl液体到1:2管，吹打混匀；
B.从1:2管取300μl液体到1:4管，吹打混匀，依此类推，直到1:256管；
C.仅可用枪吹打混匀，不可涡旋。
6.2混合人Th1/Th2细胞因子捕获微球
1)确定实验管数(包括标准品和对照管)，如8个待测样本、9个标准品、1个阴性对照，共18管；
2)混合前每种捕获微球需充分涡旋5秒(注意:微球易沉积，吸出前必须充分混匀)；
3)为保证每个实验管都含有6种微球，每种捕获微球需各取10μl，如实验管为18个，需要每种微球的量是180μl，将所有6种捕获微球都装入一根流式管中，标记为“混合微球”；
4)充分涡旋混匀；
5)将混匀的微球加入待测样本、标准品和阴性对照管中，每管60ul，然后每管加入50ulPE检测试剂，避光室温孵育3小时后，每管中加入1ml洗液离心200g，5min；
6)离心完毕弃上清，加300ul洗液，待上机。
7、数据分析
采用GraphPadPrism(5.0版本)对数据进行统计学分析，采用paired t test及独立t检验，P<0.05差异有统计学意义，误差棒代表SEM。
实验结果如下：
1肿瘤、癌旁及血液中T淋巴细胞分化及功能的比较
由于肿瘤部位和癌旁部位的微环境恶性程度不同，为了检测上述微环境中T淋巴细胞种类及功能的差异，比较了肿瘤和癌旁两个部位浸润的CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例及各自抑制型分子Tim3和PD-1的表达情况，同时利用血液中T细胞作为正常对照组。结果发现肿瘤部位的CD8+T淋巴细胞的比例明显低于癌旁部位的CD8+T淋巴细胞的比例，而该部位CD4+T淋巴细胞的比例明显高于癌旁(见图1)，肿瘤部位和癌旁部位CD4+T和CD8+T淋巴细胞表面抑制型受体Tim-3和PD-1表达量差异无统计学意义，但均高于血液中CD4+和CD8+T淋巴细胞表面抑制型受体Tim-3和PD-1的表达(见图2)。
2激光共聚焦显微镜检测T淋巴细胞表面受体Tim-3和PD-1
从原发性肝癌肿瘤组织中分离出单个核细胞，用CD3磁珠将CD3+的T淋巴细胞分选出来，染CD4，CD8，Tim-3，PD-1，DAPI染核共定位，通过共聚焦显微镜检测发现CD4+和CD8+T淋巴细胞表面均有Tim-3和PD-1的表达，结果见图3。
3Tim-3+与Tim-3-、PD-1+与PD-1-T淋巴细胞分泌的细胞因子的比较
在抗肿瘤免疫中，最重要的是T淋巴细胞分泌的IFN-γ、TNF-α的量，经检测肿瘤组织部位浸润的T淋巴细胞数量较少，为更好的比较Tim-3+与Tim-3-、PD-1+与PD-1-T淋巴细胞分泌的细胞因子的量，选取癌旁部位浸润的T淋巴细胞来做进一步的比较。研究发现Tim-3+或PD-1+的CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子均比Tim-3-或PD-1-的CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子量少，结果见图4，CD8+T淋巴细胞也显示了同样的结果，见图5。
4体外T淋巴细胞表面受体Tim-3和PD-1的阻断实验
体外将肿瘤或癌旁组织中T淋巴细胞表面标记Tim-3或PD-1阻断5天后，单独Tim-3或PD-1或同时阻断Tim-3和PD-1组CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例均较未处理组高，结果见图6，并且，Tim-3和PD-1同时阻断组CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例最高。同型对照组CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的比例最低。四个不同处理组分泌的细胞因子IFN-γ、TNF-α及细胞增殖标记Ki67的表达量也显示了同样的差异。并且同时阻断组分泌的细胞因子IFN-γ、TNF-α及细胞增殖标记Ki67的量与未处理组相比差异有统计学意义，结果见图7和8。
5CBA检测各个不同处理组上清中细胞因子的量
收集阻断实验中各个处理组的细胞培养上清，用多因子检测试剂盒Th1/Th2CBA试剂盒检测各处理组上清中IFN-γ、TNF-α的量，经检测发现T淋巴细胞表面受体Tim-3、PD-1单独阻断组和Tim-3、PD-1同时阻断组的细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、TNF-α的量与同型对照组相比均增多，结果见图9。
由以上实施例可以得出，本发明利用流式细胞术检测了肿瘤及癌旁部位浸润的CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例情况，检测了原发性肝癌患者血液、肿瘤部位及癌旁部位的CD4+和CD8+T淋巴细胞表面Tim-3和PD-1的表达情况，并且体外阻断这两种受体后，CD4+和CD8+T淋巴细胞分泌的细胞因子的量及细胞增殖情况。发现肿瘤部位浸润的CD8+T淋巴细胞的数量少于癌旁部位，原发性肝癌患者血液、肿瘤组织和癌旁组织中浸润的T淋巴细胞表面均表达抑制型受体Tim-3和PD-1，但肿瘤组织中其表达量高于癌旁，但两部位其表达量没有统计学差异。Tim-3+和PD-1+的T淋巴细胞分泌细胞因子的能力受损。体外阻断后T淋巴细胞的功能及其体外增殖能力得到一定程度的提高。从而找到一种逆转肝癌组织TIL的免疫无能状态并恢复其免疫功能的新方法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞的免疫功能的方法，包括：
1)将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液与阻断剂混合，得到含有阻断剂的溶液；
所述阻断剂包括anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体；
2)将所述步骤1)得到的含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后进行培养，得到培养物；
3)将所述步骤2)得到的培养物与布雷非德菌素A混合、孵育，得到免疫功能恢复的浸润性T淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，当所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体时，所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体的浓度为8～12μg/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，当所述阻断剂为anti-PD-1阻断抗体时，所述含有阻断剂的溶液中anti-PD-1阻断抗体的浓度为8～12μg/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，当所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体时，所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体的浓度独立的为8～12μg/ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液的细胞数量为4.5～5.5×105/200μl。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后，所述anti-CD3抗体的终浓度为2～3μg/ml。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后，所述anti-CD28抗体的终浓度为1～1.5μg/ml。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)培养的时间为4～6d。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)培养物与布雷非德菌素A混合后，所述布雷非德菌素A的终浓度为8～12μg/ml。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)孵育的时间为5～7h。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190201 |
|
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